Extraction ADN pattes Triatomes

1. Utiliser les pattes (disponibles dans le tube et noter le nombre)

2. Couper les pattes en petits morceaux et les mettre dans un tube de 1.5 ml
3. Réduire le plus possible en poudre en ajoutant de l’azote liquide dans le tube
pour broyer et ceci plusieurs fois (on peut aussi mettre un peu de tampon de
lyse (20 µl) avant de broyer.
4. Ajouter 1 ml de Tp de lyse
5. Ajouter protéinase K 2 mg/ml final (faire solution mère aliquotée à 2
mg/100µl et congelée –20°C soit pour 25 mg, 1.250 ml d’H2O)
6. incubation 3h à 56°C ou la nuit.
7. le lendemain extraction ADN après transfert dans microtubes de 2 ml
8. Then, DNA was extracted sequentially with equal volumes of Phenol, Phenol –
Chloroform – Isoamyl alcohol and Chloroform – Isoamyl alcohol (SIGMA) by
gently shaking in each step. In each step, after centrifuged (7000g, 2 min), the
upper aqueous phase was carefully isolated and transferred to a different
microcentrifuge tube.
9. The DNA was then precipitated on ice with 2.5 volumes of ethanol in sodium
acetate 0.3 M, during approximately 30 min.
10. Finally, the mixture was centrifuged again at 7000g (4°C for 15 min)
11. retirer le surnageant
12. the DNA pellet was washed with 70% (v/v) ethanol (500µl verser sur le culot
et réaspirer tout de suite les 500 µland.
13. Laisser sécher le culot à l’air libre (plusieurs heures).
14. Resuspendre le culot sec avec 100 µl d’H2O milli Q, délicatement en grattant
bien les bords
15. laisser une nuit à 4°C
16. remélanger à la pipette l’ADN
17. Digestion RNAse A à raison de 1µg/ml et 2h à 37°C

Tp Lyse : 50 mM NaCl, 50 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM Tris HCl pH 8,0

Solutions mères Volume total 50 ml

NaCl : 1M = 2.92g dans 50 ml 2.5 ml Pour le tris

EDTA 1M = 18.6 g dans 50 ml 2.5 ml Peser 3.02 g et mettre
Tris 500 mM pH 8 = 3.02 g dans 50 ml 5 ml 35 ml
SDS 10% = 2g dans 20 ml (masque pour peser) 5 ml Ajuster pH 8 avec HCl
Completer QSP 50 ml
 DNA quantification

To quantify the amount of DNA, readings should be taken at wavelengths of 260 nm

and 280 nm. The reading at 260nm allows calculation of the concentration of nucleic acids in
the sample. An O.D. of 1 corresponds to approximately 50 µg/ml for double-stranded DNA.
The ratio between the readings at 260 nm and 280 nm (O.D.260/O.D.280) provides an
estimate of purity of the nucleic acid. Pure preparations of DNA have ratios equal or superior
to 1.8 (Maniatis et al., 1989)
Before readings, the samples were diluted 1/50 (QSP 1 ml) and read in a CE 2021 –
CECIL spectrophotometer.
Manipulation spectro:
1. Mettre en route et laisser chauffer 10 min
2. bouton Quant
3. Bouton E (enter)
4. Choisir ratio a deux longueurs d’onde
5. bouton E
6. afficher 260
7. bouton E
8. choisir 280
9. bouton E
10. mettre le blanc
11. bouton E
12. mettre echantillon
13. bouton run