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ELISA direct

Avantages

Plus rapide que les autres ELISA - la technique comporte moins d'étapes.

Moins de risques d'erreur, car moins de réactifs et d'étapes sont nécessaires.

Inconvénients

L'immobilisation de l'antigène n'est pas spécifique - peut provoquer un bruit de

fond plus important que le test ELISA indirect. Principalement parce que toutes
les protéines de l'échantillon, y compris la protéine cible, se lieront à la plaque.

Moins flexible : chaque protéine cible nécessite un anticorps primaire conjugué

spécifique.

Pas d'amplification du signal - réduit la sensibilité de l'essai

Idéal pour : l'analyse de la réponse immunitaire à un antigène.

ELISA indirect

La figure 3 montre comment un ELISA indirect est mis en place, l'antigène est
adsorbé sur un puits dans une plaque ELISA. La détection est un processus en
deux étapes. Premièrement, un anticorps primaire non marqué se lie à l'antigène
spécifique. Ensuite, un anticorps secondaire conjugué à une enzyme, dirigé
contre l'espèce hôte de l'anticorps primaire, est appliqué.

La méthode ELISA indirecte est plus sensible que la méthode ELISA directe car
plusieurs anticorps secondaires marqués peuvent se lier à l'anticorps primaire.
Elle est également plus économique que la méthode ELISA directe, car moins
d'anticorps marqués sont nécessaires. La méthode ELISA indirecte offre une
plus grande flexibilité puisque différents anticorps primaires peuvent être
utilisés avec un seul anticorps secondaire marqué. Parmi ses inconvénients figure
la possibilité d'une réactivité croisée de l'anticorps secondaire à l'antigène
adsorbé, ce qui pourrait augmenter le bruit de fond. En outre, les tests ELISA
indirects sont plus longs à réaliser que les tests ELISA directs, car une étape
supplémentaire d'incubation de l'anticorps secondaire est nécessaire. Le test
ELISA indirect est le plus approprié pour déterminer la concentration totale
d'anticorps dans les échantillons.

Avantages

Économique : moins d'anticorps marqués sont nécessaires.

Une plus grande flexibilité : différents anticorps primaires peuvent être utilisés
avec un seul anticorps secondaire marqué.

Inconvénients

Haute sensibilité - plus d'un anticorps secondaire marqué peut se lier à

l'anticorps primaire.

Possibilité de bruit de fond - le secondaire peut être un anticorps à réaction

croisée.

Procédure plus longue que la technique ELISA directe - une étape

supplémentaire d'incubation de l'anticorps secondaire est nécessaire.

Idéal pour : déterminer la concentration totale d'anticorps dans les échantillons.

Sandwich ELISA

Les tests ELISA sandwich nécessitent l'utilisation de paires d'anticorps appariés

(anticorps de capture et de détection), comme le montre la figure 4. Chaque
anticorps est donc spécifique d'une région ou d'un épitope différent et non
chevauchant de l'antigène. Il est important que les paires d'anticorps appariés
soient testées spécifiquement en ELISA sandwich pour s'assurer qu'elles
détectent des épitopes différents, afin d'obtenir des résultats précis. L'anticorps
de capture, comme son nom l'indique, fixe l'antigène qui peut ensuite être
détecté dans une configuration ELISA directe ou indirecte.

La procédure d'un ELISA sandwich nécessite tout d'abord que le puits d'une
plaque ELISA soit recouvert d'un anticorps de capture. L'analyte ou
l'échantillon est ensuite ajouté, suivi d'un anticorps de détection. L'anticorps de
détection peut être conjugué à une enzyme, auquel cas il s'agit d'un test ELISA
sandwich direct. Si l'anticorps de détection utilisé n'est pas marqué, un anticorps
de détection secondaire conjugué à une enzyme est nécessaire. On parle alors
d'un ELISA sandwich indirect. Le principal avantage d'un ELISA sandwich est
sa grande sensibilité, qui est 2 à 5 fois plus sensible que les ELISA directs ou
indirects. Il offre également une grande spécificité, puisque deux anticorps sont
utilisés pour détecter l'antigène, et une grande flexibilité puisque les méthodes
directe et indirecte peuvent être utilisées. Ces avantages s'accompagnent de
quelques inconvénients ; si un kit ELISA standardisé ou une paire d'anticorps
testés n'est pas disponible, il faudra optimiser les anticorps pour choisir une
paire d'anticorps qui se lient à différents épitopes sur l'antigène.

Si un anticorps secondaire est utilisé, il est important de s'assurer que les

anticorps de capture et de détection ont des espèces hôtes différentes pour éviter
une réactivité croisée de l'anticorps secondaire. L'anticorps secondaire choisi
doit aussi idéalement avoir été testé pour sa réactivité croisée avec les IgG de
l'espèce hôte de l'anticorps de capture. Il est possible d'utiliser des anticorps de
capture et de détection qui ont la même espèce hôte, à condition qu'ils soient de
différents isotypes d'IgG. Cependant, un anticorps secondaire qui cible
spécifiquement l'isotype de l'anticorps de détection est nécessaire.

Les tests ELISA sandwich sont particulièrement adaptés à l'analyse

d'échantillons complexes, car l'antigène n'a pas besoin d'être purifié avant le
test, tout en offrant une sensibilité et une spécificité élevées (par exemple, la
mesure des niveaux de cytokines dans une réponse immunitaire).
Avantages

Haute sensibilité : 2 à 5 fois plus sensible que le test ELISA direct ou indirect.

Haute spécificité : deux anticorps sont impliqués dans la capture et la détection.

Flexibilité - il est possible d'utiliser la détection directe et indirecte.

Inconvénients

L'optimisation des anticorps peut être difficile - une réactivité croisée peut se
produire entre les anticorps de capture et de détection. Nécessite un kit ELISA
normalisé ou une paire d'anticorps testés.

Idéal pour : l'analyse d'échantillons complexes, car l'antigène ne doit pas être
purifié avant la mesure.

ELISA compétitif

Dans cet exemple, un antigène connu est utilisé pour recouvrir une plaque
multipuits. Après les étapes standard de blocage et de lavage, des échantillons
contenant un antigène inconnu sont ajoutés. L'anticorps de détection marqué est
ensuite appliqué pour la détection à l'aide de substrats appropriés (par exemple,
la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine ou TMB). S'il y a une forte concentration
d'antigène dans l'échantillon, une réduction significative du signal sera observée.
En revanche, s'il y a très peu d'antigène dans l'échantillon, la réduction du signal
attendu sera très faible. Dans l'exemple illustré à la figure 5, on observe une
réduction du signal de sortie.

Avantages

Principal avantage : aucun traitement de l'échantillon n'est nécessaire et des

échantillons bruts ou impurs peuvent être utilisés.
Plus robuste - moins sensible à la dilution de l'échantillon et aux effets de matrice
de l'échantillon que le test ELISA en sandwich.

Plus cohérente - moins de variabilité entre les échantillons et les tests en double
Flexibilité maximale - elle peut être basée sur l'ELISA direct, indirect ou en
sandwich.

Inconvénients

Mêmes limites que l'ELISA de base - car chaque technique ELISA peut être
adaptée à un format compétitif

Convient pour : couramment utilisé lorsqu'un seul anticorps est disponible pour
l'antigène d'intérêt. Il convient également à la détection de petits antigènes qui ne
peuvent être liés par deux anticorps différents, comme dans la technique ELISA
en sandwich.