Séquençage de génome

Guide d’utilisation du matériel de la

plateforme séquençage de génome de la cité
d’innovation de Marrakech

Par : IKIKI YOUNES le 20/11/2021

Séquençage de génome

GUIDE D’UTILISATION SeqStudio Genetic Analyzer

SeqStudio Genetic Analyzer

La dernière innovation pour le séquençage
Sanger et l'analyse des fragments

Dans ce guide d'utilisation, nous démontrons:

• L’applications de séquençage et d'analyse de fragments à

l'aide du dernier analyseur génétique SeqStudio™.

• L'intuitive run setup et le monitoring en temps réel

des résultats du contrôle de la qualité.

• Une connectivité des instruments qui permet une

intégration transparente dans le portefeuille d'applications
de séquençage existant dans Connect, (une plateforme
gratuite basée sur le cloud).

• Les points forts de plusieurs applications puissantes de

séquençage et d'analyse de fragments, notamment: Introduction:

– Séquençage du plasmide L'analyseur génétique SeqStudio est le dernier né de la

– Recherche en oncologie, next-generation confirmation
– Identification d'espèces
– CRISPR-Cas9 analyse de modification du génome
– Authentification de la lignée cellulaire humaine
– Applied Biosystems™ SNaPshot™ génotypage
– Amplification multiplex par sonde
dépendante de la ligature (MLPA)de la
variation du nombre de copies (CNV)
chez l'humain.
gamme d'instruments d'analyse génétique par
électrophorèse capillaire (EC) d'Applied Biosystems. Il a
été conçu pour être facile à utiliser, facile à entretenir, et
facile à accéder et à partager les données. Dans ce guide
d'application, nous présentons les caractéristiques de
pointe qui combinent la fiabilité du séquençage Sanger et
de l'analyse des fragments avec la commodité du contrôle
à distance des applications basées sur le cloud.

Cartouche tout-en-un :
L'analyseur génétique SeqStudio utilise une
cartouche tout-en-un qui contient la matrice capillaire,
le réservoir de polymère et le tampon anodique. La
cartouche est amovible et peut être stockée sur
l'instrument pendant 4 à 6 mois, selon la taille de la
réaction de la cartouche.
Chaque cartouche contient un polymère unique au
système SeqStudio qui permet d'effectuer le
séquençage Sanger et l'analyse des fragments sans
reconfiguration. La cartouche comporte quatre
capillaires et peut traiter des échantillons provenant
de plaques standard à 96 puits ou de tubes à bandes
à 8 puits.
La cartouche et le conteneur de tampon cathodique
comportent des étiquettes d'identification par
radiofréquence (RFID) qui permettent de suivre le
nombre d'injections et la durée de présence sur
l'instrument (conteneur de tampon cathodique). Cela
permet aux scientifiques qui utilisent le même
instrument de conserver leurs propres cartouches et
de ne les utiliser qu'en cas de besoin, ce qui offre un
autre niveau de flexibilité. Enfin, la maintenance de
l'analyseur génétique SeqStudio a également été
simplifiée. Les étalonnages de l'instrument sont tous
gérés automatiquement en tirant parti des avancées en
matière d'imagerie et d'outils algorithmiques.
Conception compacte de l'instrument
L'instrument SeqStudio a un faible encombrement, avec
un ordinateur embarqué et un écran tactile intégré qui
rend la configuration de l'analyse rapide, intuitive et
flexible (figure 1).Le logiciel d'exécution a été configuré
pour que les expériences de séquençage et d'analyse de
fragments puissent être configurées sur la même plaque
et exécutées sur l'instrument sans interruption entre les
méthodes. Cela ouvre de nouvelles possibilités pour
rationaliser les analyses, par exemple, en combinant un
test de mutation basé sur la séquence et l'analyse de
locus avec un test CNV basé sur l'analyse de fragments
dans la même execution.

A B

C D

Figure 1. monitoring en temps réel des RUNs sur l'analyseur génétique SeqStudio. (A) L'instrument SeqStudio affiche les résultats de chaque
capillaire en temps réel. (B) Une fois l'injection terminée, un certain nombre de contrôles de qualité sont calculés et affichés. Si une injection produit de
mauvaises traces ou de mauvaises valeurs CQ, ces échantillons peuvent être réinjectés, avec des paramètres d'injection modifiés, si désiré. (C)
Screenshot from an off-site computer monitoring shows the progress of a run. (D) Les séries configurées dans PlateManager peuvent être téléchargées
directement sur l'instrument. PlateManager permet aux chercheurs d'attribuer des cycles de séquençage et d'analyse de fragments sur la même plaque en
tirant parti du polymère universel de la cartouche.
Expérience connectée
Un autre niveau de commodité a été ajouté en intégrant la
connectivité sans fil à l'instrument (figure 2). L'instrument
SeqStudio est ainsi accessible via l'interface embarquée, un
ordinateur distant ou une application d'un appareil mobile.
Les analyses peuvent être configurées à l'aide de
l'ordinateur embarqué ou de PlateManager, le logiciel
autonome qui fonctionne dans la plateforme Connect basée
sur le cloud ou sur un ordinateur séparé (figure 2). En
utilisant le logiciel basé sur un navigateur Web, l'accès à la
configuration de l'analyse, les cartes de plaques, les
conditions d'exécution et les paramètres d'analyse sont tous
immédiatement disponibles, quel que soit l'endroit où vous
avez accès à Internet. Les conditions d'injection, des
réinjections et la réorganisation des injections peuvent
toutes être modifiées pendant l'analyse, ce qui maximise la
capacité à collecter des données de qualité à partir de
chaque plaque. Après la collecte des données, la suite
d'applications basée sur un navigateur Web (Sanger
Quality Check, Sanger Variant
1 Configurer et exécuter
• Enregistrer l'instrument
protocole d'exécution
• Configurer et exécuter
• données vers Connect
4 Partager
• partage du protocols
• Donnée et résultats
• Collaborer avec d e s
collègues
Facile à utiliser
Figure 2 : L'analyseur génétique SeqStudio s'intègre de manière transparente à Connect par cloud. En enregistrant votre instrument et en vous
connectant à votre compte cloud, les fonctions à distance sont accessibles, notamment la surveillance de l'instrument, l'analyse des données à l'aide
d'applications cloud et le partage des données avec vos collègues.
Analysis, Peak Scanner, Microsatellite Analysis, and
Next-Generation Confirmation (NGC)) rend l'analyse
facile et accessible. La détermination des variantes de
séquences d'ADN, les alignements et l'analyse des
fragments sont tous disponibles immédiatement après
la fin d'une analyse. Enfin, la connectivité au cloud
permet à des collaborateurs situés dans des endroits
différents de surveiller, d'accéder, de partager des
informations sur les données et d'analyser rapidement
les mêmes ensembles de données.
Dans ce guide d'applications, nous démontrons
comment l'analyseur génétique SeqStudio s'intègre
parfaitement à certaines des applications de
séquençage Sanger et d'analyse de fragments les
plus couramment utilisées. La facilité d'utilisation et
d'analyse des données offerte par l'analyseur
génétique SeqStudio donne aux chercheurs une
flexibilité maximale et en fait un système idéal à
ajouter à la boîte à outils de l'analyse génétique.
2 Monitor
Monitor à partir de n'importe quel appareil
• Voir les résultats
3 Analyser
• Accéder / partager les données
• Analyzer les données en cloud
• enregistrer les données
Connectez au cloud par différents appareils
Fiable
 A
Séquençage de plasmide

L'une des applications les plus courantes du

séquençage Sanger est l'analyse des inserts subcloned
dans les plasmides. Les chimies Applied Biosystems™
BigDye™ sont largement utilisées pour le séquençage
de Sanger et font partie intégrante des flux de travail de
séquençage de plasmides. Plusieurs fonctionnalités de
la plateforme SeqStudio offrent des avantages aux
chercheurs qui réalisent des méthodes de séquençage
de base des plasmides. L'instrument est préchargé avec
des modules de séquençage optimisés pour les
longueurs de lecture courtes (<300 pb), moyennes (500
pb) et longues (>600 pb), et peut également être
personnalisé sur l'instrument pour répondre à des
besoins spécifiques. Les cartouches interchangeables B
peuvent être associées à des projets et des utilisateurs
individuels. L'application Sanger sequencing Quality
Check basée sur le cloud fournit un ensemble d'outils
intuitifs pour analyser les traces de séquençage. Enfin, la
connectivité en cloud pour la surveillance, l'accès et le
partage à distance des informations de séquençage peut
aider les collaborateurs à analyser rapidement les
mêmes ensembles de données.
Les performances de l'instrument SeqStudio pour le
séquençage des plasmides ont été déterminées en
séquençant le plasmide pGEM7zf+ avec les amorces M13
et le Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Figure 3. Analyse de la qualité du séquençage à l'aide de
chemistry. Les résultats ont été obtenus en analysant les l'application Sanger sequencing Quality Check Connect. (A) Une
traces de séquençage à l'aide du module Sanger Quality fois l'exécution terminée, l'instrument SeqStudio affiche le fichier
Check sur Connect (figure 3). Dans l'exemple présenté, le de séquence résultant ainsi que les scores de qualité pour chaque
même plasmide a été séquencé dans 16 puits et analysé base. (B) Seize réactions de séquençage pGEM7zf+ distinctes ont
sur l'analyseur génétique SeqStudio en quatre injections été exécutées sur l'instrument SeqStudio, et les fichiers .ab1 ont
différentes. Notez que le score de trace, les valeurs de pic été téléchargés sur le cloud et analysés. Notez que les mesures
sous pic (PUP), la longueur de lecture contiguë (LCR) et de séquençage étaient très similaires dans les seize réactions
QV20+ (longueur avec des valeurs de qualité >20) sont différentes. LCR = longueur de lecture contiguë,
similaires pour chaque échantillon. Des résultats similaires QV20+ = nombre de nucléotides avec une valeur de qualité >20.
ont été obtenus dans les traces sur l'autre brin, et dans
d'autres expériences en utilisant le Applied Biosystems™
BigDye™ Terminator v1.1 chemistry. Ces données
démontrent que la plateforme SeqStudio peut générer des
résultats de séquençage de plasmides de très haute
qualité.
Recherche en oncologie, next-generation confirmation
80
L'analyseur génétique SeqStudio peut être utilisé par les
chercheurs afin de détecter et vérifier la présence d'allèles 70

Sanger sequencing and MVF (%)

R² = 0.96697
mutants dans les tissus tumoraux. Le système SeqStudio
60
s'intègre aux outils suivants pour simplifier les flux de

Allele frequency—
travail de séquençage Sanger : 50

• L'analyseur génétique SeqStudio est livré

40
préchargé avec des modules d'exécution
optimisés pour l'ADN fragmenté extrait de 30

formalin-fixed et du paraffin-embedded tissue.

20

• Le module NGC, basé sur le cloud, permet aux 10

enquêteurs de vérifier rapidement les variants
0
identifiés dans les fichiers .vcf du séquençage 0 10 20 30 40 50 60 70
de nouvelle génération (NGS) à l'aide des traces Allele frequency—Oncomine Oncology Focus panel (%)
de séquençage Sanger.
Figure 4. Analysis of FFPE samples using the SeqStudio instrument
• Les variants alléliques à des fréquences allant jusqu'à at allele frequency of 9–70%. Ten different tumor samples were analyzed
for mutations at four different hotspots by Ion Torrent™ sequencing and
5 % peuvent être détectés à l'aide du logiciel Applied Sanger sequencing on the SeqStudio instrument. The mutant allele
Biosystems™ Minor Variant Finder (MVF) et des frequency correlated extremely well between the two methods across a
traces Sanger générées par l'instrument SeqStudio. wide range of allele frequencies.

• Applied Biosystems™ BigDye™ Direct et BigDye
XTerminator™ chemistries simplifient le flux de travail du
séquençage Sanger en permettant le séquençage et le
nettoyage en un seul tube.
Les performances de l'analyseur génétique SeqStudio pour
la détection d'allèles mutants dans des échantillons de
tumeurs ont été déterminées en analysant l'ADN
génomique extrait de 10 échantillons de tumeurs différents
fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) et en
déterminant les fréquences de variants dans quatre
régions différentes. La fréquence des allèles mutants a été
déterminée par NGS en utilisant le panel Ion Torrent™
Oncomine™ Oncology Focus Panel, et par séquençage
Sanger en utilisant le BigDye Direct/BigDye XTerminator
chemistries et le logiciel MVF. La corrélation entre les
fréquences mesurées par l'analyseur génétique SeqStudio
était excellente par rapport à la NGS au niveau des
fréquences d'allèles - d'environ 9 % à environ 70 %.
La capacité de l'analyseur génétique SeqStudio à analyser
les fréquences des variantes a également été déterminée
à l'aide d'une plaque à 96 puits contenant des amorces de
séquençage Sanger qui interrogent les mutations
tumorigènes les plus courantes de KRAS et NRAS.
L'analyse de la fréquence des allèles mineurs de
l’instrument SeqStudio a mesuré avec précision les
fréquences des allèles dans 1 ng d'ADN dilué extrait de
FFPE . Par conséquent, les chercheurs qui ont besoin de
détecter des allèles rares peuvent être sûrs que l'analyseur
génétique SeqStudio produira des résultats précis sur les
tissus FFPE.
Enfin, l'application NGC basée sur le cloud simplifie la
confirmation des variants identifiés par NGS en organisant
les traces de séquençage Sanger par amplicons et
spécimens, et en les alignant dans la bonne orientation sur
les séquences des variants candidats dans un fichier .vcf.
Pour montrer l'utilité de l'application NGC dans un flux de
travail en oncologie, nous avons confirmé la présence
d'une mutation NRAS identifiée à l'aide du panel
Oncomine Oncology Focus par séquençage Sanger. Les
résultats de SeqStudio ont vérifié la présence de la
mutation NRAS (p.Ala59Thr). Par conséquent, l'examen
ciblé et rapide des parties les plus significatives des traces
de séquençage par l'application NGC facilite la
confirmation des variantes NGS.

Ion Reporter Primer Designer Next-Generation Confirmation

NGS Sange
Identification des espèces
La disponibilité immédiate des données génomiques
ouvre la possibilité d'identifier les espèces dans un
échantillon inconnu en séquençant l'ADN "empreintes
digitales ". Dans la famille des kits Applied
Biosystems™, par exemple, les kits MicroSEQ™ ont
simplifié l'identification des procaryotes et des
champignons par le séquençage Sanger des
séquences d'ADN ribosomal (ADNr). De même, les
organismes eucaryotes peuvent être identifiés en
utilisant les loci spécifiques des mitochondries comme
locus d'identification. Cette stratégie a été exploitée
dans le cadre du projet Barcode of Life
(barcodeoflife.org), qui permet d'établir rapidement
l'identité d'échantillons eucaryotes inconnus.
Pour illustrer les performances de l'analyseur génétique
SeqStudio pour l'identification microbienne, nous avons
obtenu des échantillons d'ADN génomique de l'ATCC
pour une variété de micro-organismes, et les avons
séquencés à l'aide du kit PCR Applied Biosystems™
MicroSEQ™ 500 et de l'instrument SeqStudio. Les
séquences obtenues ont été recherchées dans la base de
données BLAST. Pour chaque réaction de séquençage,
l'organisme correct a été identifié avec la confiance
BLAST la plus élevée. De même, en utilisant des
amorces pour les séquences mitochondriales de poisson
(gène CO1) et des échantillons de poisson, l'espèce de
poisson a été correctement identifiée en tant que résultat
BLAST le plus élevé. L'identification précise de l'espèce
interrogée avec BLAST illustre à quel point la plateforme
SeqStudio peut être utilisée pour l'identification des
espèces.
Modification du génome
Les technologies de modification du génome, y compris les
événements de modification médiés par CRISPR-Cas9,
deviennent rapidement accessibles à une majorité de
chercheurs en sciences de la vie et sont sur le point de
révolutionner tous les domaines de la biologie et des soins
de santé.
les fonctionnalités de l'analyseur génétique SeqStudio
facilitent les analyses de séquençage Sanger et s'intègrent
parfaitement dans un flux de travail de modification du
génome. En particulier, les données générées sont
compatibles avec le logiciel Tracking of Indels by
Decomposition (TIDE) [4], un outil largement disponible
pour analyser l'efficacité des événements de modification
du génome.
Authentification de la lignée cellulaire humaine
L'étude du développement des maladies humaines repose
en grande partie sur l'analyse de lignées cellulaires
humaines dissociées et cultivées. Cependant, un
problème de plus en plus reconnu est que les cellules
cultivées in vitro peuvent être mal identifiées ou
contaminées par d'autres lignées cellulaires non
apparentées. L'identité des lignées cellulaires peut être
vérifiée par l'analyse d'une "empreinte" génétique
hautement spécifique, composée de cellules en tandem
courtes (STR) très variables. La plateforme SeqStudio
s'intègre bien à la solution d'authentification des lignées
cellulaires de Thermo Fisher Scientific.
Les kits Applied Biosystems™ CLA Identifiler™ Plus et
CLA Identifiler™ Direct peuvent être utilisés sur des
préparations d'ADN purifié et brut, respectivement, pour
analyser 16 loci STR humains hautement variables
couramment utilisés pour vérifier l'authenticité des lignées
cellulaires. Le logiciel Applied Biosystems™
GeneMapper™ et le logiciel d'analyse des microsatellites
(MSA) basé sur le cloud, utilisés pour analyser les allèles
identifiés par les kits CLA Identifiler, sont compatibles
avec les données produites par l'instrument SeqStudio, et
les résultats peuvent être utilisés pour interroger l'ATCC
ou d'autres bases de données STR afin de vérifier
l'authenticité.
Le système SNaPshot Multipex
La capacité à détecter les polymorphismes
mononucléotidiques (SNP) joue un rôle essentiel dans la
compréhension de l'influence du génome sur les
phénotypes biologiques. Pour analyser les variants SNP, le
système Applied Biosystems™ SNaPshot™ Multiplex a été
développé [7]. Des fragments personnalisables, codés par
couleur et de tailles différentes, correspondant à des
allèles spécifiques, sont analysés par analyse de
fragments. Le système SeqStudio comprend des fonctions
qui facilitent l'analyse SNaPshot, notamment un rapport
intégré des résultats de l'analyse des fragments de la taille
et de la surface du pic. De plus, la possibilité de mélanger
les réactions d'analyse de fragments et de séquençage sur
une même plaque permet aux chercheurs de réaliser le
profilage SNP et le séquençage Sanger en une seule fois.
Amplification multiplex par sonde dépendante de la ligature (MLPA)

Une méthode largement utilisée pour étudier les maladies humaines héréditaires résultant de variations du nombre de
copies d'un locus est l'amplification multiplex par sonde dépendante de la ligature [8]. Cette méthode, développée et
commercialisée par le MRC Holland, peut analyser jusqu'à 50 paires multiplexées de sondes situées de façon adjacente et
s'hybridant aux loci d'intérêt. La gamme dynamique élevée, la précision de la taille et la fidélité de la hauteur de pic
nécessaires à l'analyse des amplicons de sondes MLPA font du système SeqStudio une plateforme idéale pour effectuer
des analyses MLPA. Les résultats obtenus sur l'instrument SeqStudio sont compatibles avec le logiciel Coffalyzer.Net de
MRC Holland pour l'analyse des données MLPA.

La conception de la cartouche tout-en-un permet :

• Quatre à six mois de stockage sur l'instrument, en fonction de la taille de la réaction de la cartouche

• Enlèvement facile

• POP-1 polymére

• Séquençage Sanger et analyse des fragments à effectuer sans reconfiguration.

• Compatible avec standard 96-well plates et 8-wellstrip tubes

• Quatre capillaires

• Des étiquettes d'identification par radiofréquence (RFID) qui permettent de suivre le nombre d'injections (cartouche)
et la durée d'utilisation de l'instrument (conteneur tampon cathodique).

• L'étalonnage préalable est effectué automatiquement

• Recyclage

Cache-poussière

Protecteur capillaire intégré

POP-1 polymères

Tampon anodique Système de distribution de polymères

 Le guide d'utilisation :

Préparez les échantillons comme vous en avez l'habitude, ouvrez la porte et insérez la plaque d'échantillon à base
de (standard 96-well plates ou de 8-well strip tubes), insérez le tampon cathodique, et la cartouche. Cette dernière
comprend tout ce dont vous avez besoin, les capillaires, le tampon anodique, un polymère et son système de livraison.
Fermer la porte et configurer l’exécution soit à distance ou directement sur l'instrument, vous pouvez choisir soit le
séquençage sanger ou l'analyse de fragments, ou les deux sur la même plaque en même temps, et appuyez sur "start
run".
Sur l’application mobile de votre téléphone vous pouvez vérifier et visualiser les données de séquençage sanger ou
d'analyse de fragments en temps réel. Une fois l’exécution est terminée vous pouvez analyser les données ou bien utiliser
les logiciels de thermo fisher Connect sur Cloud.

specifications Technique

Specifications de l’ Instrument
Number of capillaries 4
Number of dyes 6
Sample format 96-well standard plate and standard 8-well strip tubes
Applications Sanger sequencing (resequencing for NGS confirmation, indels, heterozygote detection, minor variant detection,
microbial identification, genome editing validation)
Fragment analysis (microsatellite analysis, compatible with MLPA, cell line authentication, SNaPshot applications)
Dimensions (W x D x H) 49.5 x 64.8 x 44.2 cm
Weight 53.6 kg
Power input 100–240 V
Internal hard-drive storage 128 GB, approximately 3,500 injections or 14,000 reactions
On-instrument tracking Radio-frequency identification (RFID)
Secondary analysis • Sequence Analysis Software
• SeqScape Software
• Variant Reporter Software
• GeneMapper Software
• Minor Variant Finder Software
• Sequencing Analysis Modules (QC, VA, and NGC) on Connect
• Fragment Analysis Modules (PS and MSA) on Connect
Warranty 1-year instrument warranty included, extended warranty available
SmartStart Orientation (includes a 1-day, on-site field application scientist training and setup with the Connect
Training
platform and online instrument management)
Communication interface Connect platform with cloud-enabled systems, Wi-Fi, and RJ-45 Ethernet ports
Configuration Stand-alone, optional desktop or laptop computer
Specifications de la cartouche
Maximum number of injections/reactions Up to 125 injections/500 reactions or samples (SeqStudio Cartridge v1)
Up to 250 injections/1,000 reactions or samples (SeqStudio Cartridge v2)
Polymer type POP-1 (for performing sequencing and fragment analysis)
On-instrument shelf life 4 months (SeqStudio Cartridge v1) or 6 months (SeqStudio Cartridge v2) after opening
Storage 2–8°C
On-instrument tracking RFID
Recycling For more details, go to thermofisher.com/seqstudiorecycling

Conclusion :

L'électrophorèse capillaire reste une méthode puissante pour caractériser l'information génétique. Le séquençage Sanger
et l'analyse de fragments restent les méthodes de référence pour le séquençage et l'analyse de l'ADN. Dans ce guide
d'application, nous avons décrit comment l'analyseur génétique SeqStudio produit des données totalement compatibles
avec les applications d'EC les plus courantes. Nous avons également décrit comment les nouvelles fonctionnalités de
l'analyseur génétique SeqStudio facilitent l'exécution des expériences d'EC avec un minimum de temps de manipulation,
facilitent la collaboration grâce au partage et aux applications basées sur le cloud et offrent de nouvelles possibilités pour
d'exécuter des échantillons de séquençage et d'analyse de fragments en une seule fois. Ensemble, la nouvelle conception
et les améliorations apportées par l'analyseur génétique SeqStudio offrent de nouvelles possibilités intéressantes pour
l'utilisation des méthodes de référence de l'électrophorèse capillaire dans un écosystème intégré.