METHODES SPECTROPHOTOMETRIQUES D'ANALYSE

INTRODUCTION
En spectrophotométrie ultraviolette (UV) et visible (VIS), un échantillon d'une
substance se trouvant en solution dans une cellule (cuvette) est exposé à un
rayonnement lumineux d'une longueur d'onde fixe ou variable. Une partie de cette
lumière incidente est absorbée par la substance provoquant des
changements dans la molécule et l'autre partie est transmise. La quantité
d'énergie absorbée est proportionnelle à la concentration de la substance.

SPECTRE ELECTROMAGNETIQUE
Le rayonnement électromagnétique est une forme d'énergie transmise à travers
l'espace à très grande vitesse. Une onde est décrite en termes de longueur d'onde
et la fréquence est donnée par la relation:
λν = c

λ est la longueur d'onde en cm, ν est la fréquence en sec -1 et c est la vitesse de la

lumière dans le vide (3 x 10 10 cm/sec). L'unité de longueur d'onde utilisée est le
nanomètre (nm) égal à 10-9 m.
Selon la théorie corpusculaire, un faisceau de radiation est considéré comme un
flux de particules (paquets d'énergie) appelées photons ou quanta qui sont
absorbés par les substances chimiques en solution selon la relation suivante:
ΔE = hν

E : énergie en joules (J), v : fréquence en sec-1 et h est la constante de Planck.
Le spectre électromagnétique couvre une gamme très vaste de longueur d'ondes et
d'énergies.
 La gamme de longueur d'onde perceptible par l'œil humain ne représente qu’une
infime partie (380-780nm) de ce vaste ensemble. La gamme de longueur d'ondes qui
représente un intérêt dans ce chapitre est la gamme qui s'étend de 200 à 780 nm. L'UV
s'étend de 10 à 380 nm mais la région présentant un intérêt analytique est de 200 à 380
nm qu'on appelle le proche UV. En dessous de 200 nm l'air absorbe sensiblement.

COULEUR ET PROCESSUS D'ABSORPTION MOLECULAIRE

Le processus d'absorption d'un rayonnement électromagnétique peut être illustré en
considérant l'absorption de lumière dans la région du visible. Une substance qui
apparaît colorée absorbe dans le visible. Un objet n'est perceptible que parce qu’il
transmet ou réfléchit une portion de la lumière dans cette région. Quand une lumière
polychromatique (lumière visible) contenant toutes les longueurs d'onde du spectre
traverse un objet, l'objet absorbera certaines longueurs d'onde et laissera passer le
reste. Ce sont ces longueurs d'onde transmises qui feront apparaître la couleur de l'objet.

Remarque: La couleur transmise et la couleur absorbée sont complémentaires. Par

exemple: une substance qui apparaît jaune absorbe dans le bleu (à l’opposé sur le cercle
chromatique).

Si une substance chimique est traversée par un rayonnement électromagnétique,

l'énergie des photons incidents peut être transférée aux atomes et aux molécules
tout en les élevant de l'état fondamental à un état excité. Le processus
d’absorption est accompagné d'une atténuation de la radiation incidente et ne
peut avoir lieu que si la différence d'énergie entre les deux états correspond
exactement à l'énergie des photons. La fréquence de la radiation est donnée par:

ΔE = E2 - E1 = hν

E2 et E1 sont les énergies des deux niveaux et ΔE leur différence.

L'énergie absorbée est rapidement perdu par collisions sous forme de chaleur
permettant au système de retourner à l'état fondamental. Il arrive quelquefois que
l'énergie soit réémise quelques millisecondes plus tard sous forme de radiation
luminescente.
LOI DE BEER OU BEER- LAMBERT.
Si un flux de lumière monochromatique d'intensité I0 frappe une substance, une
partie de ce flux est absorbée et une partie I traverse la couche. La quantité de
lumière absorbée par les espèces en solution dépend de la concentration (c), de la
nature de la substance absorbante (a) et de l'épaisseur l de la couche de la solution
traversée par la lumière. Cette dépendance peut être représentée par la loi de Beer.
log (I0/I) = a x c x l = A

A qui caractérise le degré de diminution de l’intensité est l’absorbance. L'épaisseur l

est exprimée en cm. L'absorptivité (a) est une constante qui dépend de la nature de
la substance absorbante et de la longueur d'onde (λ) de la lumière. Si λ change, la
valeur de a change également. Si la concentration est exprimée en moles/l,la
constante a devient l'absorptivité molaire ε. Elle est exprimée en L moles-1 cm-1
A=εxcxl

SPECTRE ELECTRONIQUE ET STRUCTURE MOLECULAIRE

ORIGINE DE L’ABSORPTION
L’absorption dans le domaine UV/Visible est due au passage d'un électron d’une
orbitale moléculaire à une autre d’énergie supérieure.

Les orbitales moléculaires (OM) construites à partir des orbitales atomiques (OA)
s et p sont de différents types :
- s construites à partir d'OA ayant un recouvrement axial ;
- p construites à partir d'OA ayant un recouvrement latéral ;
- n OM non liantes correspondent aux doublets électroniques des atomes O, N, S, Cl
- p* OM anti-liantes
- s* OM anti-liantes
Il y a quatre groupes de transitions électroniques dans une molécule :

1) Electrons internes ne participant pas aux liaisons. Une très grande énergie
d'excitation est nécessaire.

2) Electrons formant des liaisons covalentes simples (électrons σ). Ils possèdent
aussi une très grande énergie d'excitation pour pouvoir contribuer à l'absorption de
radiations UV ou VIS (hydrocarbures saturés).

3) Doublet d'électrons de valence non-liants (électrons n) que l'on trouve sur N,

O, P, S et les halogènes. Ils nécessitent une moins grande énergie que les électrons
σ et peuvent donc être excités par la lumière UV ou VIS.

4) Electrons dans les orbitales pi ou σ se trouvant dans les liaisons doubles ou

triples. Ce sont les plus facilement excitables et sont donc responsables de la
majorité des spectres électroniques dans les régions de l'UV et VIS.
En plus de ces orbitales électroniques, une molécule possède des orbitales
inoccupées appelées orbitales anti-liantes. Elles correspondent à des niveaux
d'énergies d'états excités et sont représentées par σ* et π*. Les transitions
électroniques les plus fréquentes ont lieu d'orbitales π ou n vers des orbitales π*.

Types de transitions

Transitions - * Les OM sont des orbitales très stables. La différence d'énergie
entre les OM et *est relativement élevée. La transition - * est située dans le
lointain UV vers 130 nm(éthane 135 nm). Ainsi, les hydrocarbures saturés qui ne
renferment que les OM de ce type tels l'hexane ou le cyclohexane sont
pratiquement transparents dans le proche UV.

Transitions n - * Les composés constitués d’un ou plusieurs atomes (O, N, S, Cl)

porteurs de doublets électroniques libres (niveaux n) présentent ce type de
transitions. Les énergies mises en jeu sont généralement inférieures à celles des
transitions ->*. Elles correspondent à des longueurs d’onde entre 150 et 250 nm.

Transitions n - * On rencontre ce type de transitions peu intense dans le cas de

molécules qui comporte un atome porteur de doublets électroniques libres (présence
de niveaux n) appartenant à un système insaturé (présence de niveaux *). La plus
connue est celle qui correspond à la bande carbonyle ; elle se situe entre 270 et 290
nm.

Transitions - * Les composés qui possèdent une double liaison éthylénique isolée
conduisent à une forte bande d'absorption vers 170 nm avec un ε allant de 1000
à plus de 10 000 L mol-1 cm-1. Exemple : 165 nm pour l’éthylène avec = 16 000 L
mol-1 cm-1.

Composés inorganiques
L'absorption de rayonnement UV ou VIS par un complexe métallique a pour
origine trois types de transition :
- transition d ---->d au sein d'un ion métallique. Elles sont généralement de faible
intensité‚ et donc inexploitable en analyse courante.
- excitation au sein du ligand organique. Ce sont des transitions de types
n ---->π* et π---->π* et sont surtout affectées par la présence du métal.
- transitions entraînant un transfert de charge. Elles sont responsables de la couleur
intense des chélates métalliques. Ceci provient du mouvement des électrons de l'ion
métallique vers le ligand ou vice versa. Ces transferts de charge proviennent de
transitions entre les orbitales σ ou π du ligand avec les orbitales non liantes ou
inoccupés du métal. Quand ces transitions se passent, une réaction d'oxydo-
réduction a généralement lieu entre l'ion métallique et le ligand. Ces transferts sont
extrêmement intenses, avec ε de l'ordre de 104-105. L'intensité (facilité du transfert
de charge) augmente avec le degré de conjugaison du ligand.

APPAREILLAGE
Un spectrophotomètre est essentiellement utilisé en analyse quantitative. Dans ce
cas l'absorbance des solutions étalons et des solutions inconnues mesurées à une
longueur d'onde est utilisée pour déterminer la concentration d'une substance.
- en enregistrant le spectre d'absorption d'une substance donnée on peut obtenir
une identification qualitative de cette substance avec sa longueur d’onde
d’absorption maximale.
Les composants sont qualité et de complexité très variés. Ils sont
essentiellement
- une source de rayonnement
- un système de sélection de longueur d'onde
- une cuvette ou cellule
- un détecteur
- un système de traitement de signal avec lecture

Source de rayonnement UV – VIS

La source de radiation est parfois un filament de tungstène, une lampe à arc
de deuterium dans la région ultraviolette, et plus récemment des lampes à arc
au xénon utilisables dans toute la région UV-VIS et des diodes électro-
luminescentes (DEL) pour les longueurs d'onde du visible.  Les lampes à W et D
sont considérablement moins efficaces dans la mesure où il leur faut deux lampes
pour couvrir le spectre UV/Vis et elles doivent rester allumées pendant toute la durée
de fonctionnement de l'instrument. Donc des durées de vie plus courtes et des
coûts de maintenance plus élevés. Les lampes au xénon, quant à elles, couvrent
un spectre semblable avec une seule lampe. Dans ce cas, ce type de source
lumineuse d'instrument ne fonctionne que pendant la durée de la mesure à
proprement parler et permet d'atteindre une durée de vie de dix ans au moins.

Système de sélection de longueur d'onde

Ce sont des éléments qui permettent de séparer ou disperser les différentes
longueurs d'onde d'un faisceau polychromatique pour sélectionner uniquement les
fréquences permettant les transitions électroniques. Pour cela on utilise soit des filtres
optiques soit un dispositif dispersant. Les filtres optiques sont utilisés dans les
colorimètres ou photomètres à filtres. Ce sont des appareils de qualité moyenne
où la sélectivité‚ n'est pas primordiale.
Les monochromateurs utilisés dans des appareils appelés spectrophotomètres sont
de deux types:
- le prisme, en verre pour la zone visible du spectre et en quartz dés qu'on
descend en-dessous de 300 nm
- le réseau est formé d'une surface plane ou sphérique où est tracée une série
de traits rectilignes parallèles et équidistants (jusqu'à 1200 par mm). L'espace
compris entre deux traits opaques, successifs, constitue une fente très étroite..
L'avantage d'un réseau est une bande passante qui peut descendre en-
dessous du nanomètre (jusqu'à 0,2 nm).

Cuvette ou cellule
Elles sont de forme rectangulaire avec une épaisseur de 1 cm. Les cuvettes
employées dans le visible sont en verre); elles peuvent être utilisées jusqu'à 310 nm.
En-dessous de cette longueur d'onde il faut utiliser les cuvettes en quartz.

Détecteurs
Plusieurs types ont été utilisés. Le plus simple est la photodiode. Il y a deux
classes de photodiode : le phototube ou cellule photoélectrique. Il y a également
des détecteurs plus sophistiqués comme le photomultiplicateur d'électrons

Phototube
Il contient une cathode qui joue le rôle de système photosensible. Elle est
constituée d'un métal ou d'un sel ayant la propriété d'émettre des électrons quand
elle est éclairée. Lorsqu'un faisceau de photons traverse la cuvette et vient frapper la
surface interne de la cathode, un certain nombre de ces photons ionisent la cathode
et délogent les électrons qui sont ensuite collectés par une anode et ceci constitue
un courant proportionnel à l'intensité de la radiation.
Photomultiplicateur
Une meilleure sensibilité est obtenue à partir d'un photomultiplicateur qui peut
contenir jusqu'à 16 électrodes (dynodes). Chaque électron primaire éjecté de la
photocathode par le faisceau incident collecté par la première dynode déloge deux
ou plusieurs électrons de cette dernière. Ces électrons sont collectés par la
deuxième dynode où le même processus a lieu. Il en résulte une cascade
d'électrons avec une amplification de l'ordre de 10 6 au moment où les électrons
atteignent l'anode.

Détecteurs à barrette de diodes.

Contrairement à un détecteur classique capable d’analyser une seule longueur
d’onde, le détecteur UV à barrette de diodes, composée d’une multitude de diodes
miniatures sensibles à la lumière, est capable d’analyser en simultané une large
gamme de longueurs d’onde allant souvent de 190 à 400 nm.
Le rayonnement est décomposé par le monochromateur et chaque diode recevra
un rayonnement d’une longueur d’onde bien précise. Ce système permet l'acquisition
du spectre de l'échantillon en temps réel, une représentation en 3 dimensions
(temps, absorbance, longueur d'onde) et une caractérisation des composés par leur
spectre.

ECARTS DE LA LOI DE BEER

Quand la loi de BEER est respectée on obtient obligatoirement une droite.
Cependant, on peut observer des écarts ou déviations qui sont soit d'origine
instrumentale soit d'origine chimique.

Ecart instrumental: Puisqu'il est presque impossible d'obtenir une lumière

monochromatique à partir d'une source continue et que, l'absorptivité peut changer
sensiblement avec la longueur d’onde, l'utilisation de radiation polychromatique peut
provoquer un écart à la loi de BEER.
Ecart chimique: Ce sont les plus fréquentes, elles proviennent généralement d'une
variation de la nature et de la concentration des espèces absorbantes présentes
dans une solution sous différentes formes chimiques. La proportion relative des
différentes formes variant avec la concentration. Par exemple la formation d’un ion
complexe tel que Fe(SCN)2+ peut prédominer aux faibles concentrations mais au fur
et à mesure que la concentration du fer augmente la quantité du SCN - nécessaire
pour la formation du complexe diminue et Fe(SCN)2+ prédomine.
D'autres écarts peuvent provenir d'interactions moléculaires d'association ou de
dissociation de molécules ou complexes en fonction de la concentration ou de
réaction avec les solvants ou les ions H+. La présence simultanée des ions
chromates et des ions dichromates en est un exemple type.

Cr2O7= + H2O <=======> 2CrO4= + 2H+

Si les solutions étalons contenant ces deux espèces absorbantes ne sont pas
tamponnées, les proportions relatives des deux ions varient d'une solution étalon à
l'autre et ceci résultera en un écart la loi de BEER. Cet effet peut être contrôlé en
tamponnant les ions dichromates avec un acide fort.

DEVELOPPEMENT D'UNE PROCEDURE DANS LE VISIBLE.

Plusieurs approches pour doser des espèces qui absorbent très peu de lumière.

1) Complexation: Cette étape est nécessaire pour déterminer la plupart des métaux
sauf les métaux alcalins. Ceci se fait soit en utilisant:
-un ligand simple comme SCN- ou un ligand organique tel que 1,10-
phénanthroline. Par exemple
Fe 2+ + 3Phen <=====> Fe(Phen)32+

2) Oxydation: L'oxydation permet de transformer un ion métallique en une

substance stable et hautement colorée. Le passage d'un état d'oxydation inférieur à
un état d'oxydation élevé permet de convertir des métaux tels que Mn 2+ et Cr3+ qui
sont presque incolores en tant qu'aquo complexes en MnO 4- et CrO4=
respectivement.

3) Spectrophotométrie indirecte: Cette approche est surtout utilisée pour

déterminer des oléfines possédant une double liaison non conjuguée. La méthode
est basée sur la mesure de la diminution de l'absorbance d'une substance colorée,
suite à sa réaction avec l'oléfine.

Exemple: une solution de brome en présence d'une oléfine produit un composé

incolore. La mesure de l'oléfine est basée sur la diminution de l'absorbance de la
solution de brome à 410 nm.
Br2 + >C===C< ---------> >CBrBrC<
4) Analyse d'un mélange. Il est possible d'analyser un mélange de deux
substances si on trouve deux longueurs d'onde (1 et 2) auxquelles la différence
d'absorbance des deux substances est appréciable. L'exemple type est l'analyse
d'un mélange des deux formes (x et y) acides et basiques d'un indicateur contenues
dans une solution. La concentration des deux formes (x et y) est obtenue selon le
système d'équations.
A = Xbcx + YbcY
A = Xbcx + YbcY

Exemple :
Dans un mélange, on veut mesurer les concentrations de Fe 3+ et de Cu2+ selon
leur réaction avec l'hexacyanoruthenate (II), Ru(CN) 64-, qui forme des ions complexes
bleu-violet avec Fe3+ (max = 550 nm)), et vert pâle avec Cu2+ (max = 396 nm). Les
absorptivités molaires (M-1 cm-1) des ions complexes métalliques aux deux longueurs
d'onde sont résumées dans le tableau suivant.
(nm) 550 396
Fe3+ 9970 84
Cu2+ 34 856

Quand on analyse un échantillon contenant du Fe 3+ et du Cu2+ dans une cellule de

1,00 cm, l'absorbance à 550 nm est de 0,183, et l'absorbance à 396 nm est 0.109.
Quelles sont les concentrations molaires de Fe 3+ et de Cu2+ dans l'échantillon ?