Chromatographie Calibration

Calibration
Pourquoi et comment ?
Club Lyonnais de Chromatographie Liquide (AFSEP)
29 Janvier 2004
Serge Rudaz
Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique
Université de Genèv e - Suisse

Université de Genève
Mise au point d’une méthode d’analyse

Problématique
Problématique
Développement
Développement
Prévalidation
Prévalidation
Validation
Validation
Robustesse
Robustesse Application
Application
Contrôle
Contrôle
Connaissance des
Connaissance des limites
limites etet
des performances
performances de
de la
la méthode
méthode Ajustement
Ajustement
des
développée
ée
développ Transfert
Transfert
Calibration = Modélisation
Modéliser: :utiliser
Modéliser utiliserdes
desdonnées
donnéesexpérimentales
expérimentalespour
pour prévoir
prévoir une
uneinformation
information
quantitativeinconnue
quantitative inconnueYY ààpartir
partir de
de mesures
mesures de viaune
deXX via unecertaine
certaine «« fonction
fonction
mathématique»»: :
mathématique
Le modèle mathématique postulé peut être :
Y Ajustement liné aire Y Ajustement polynomial
Modèle Y = f(X) avec un

polynôme de degré
Modèle Y= b1X + b0 convenable
X X
Une droite si Y varie Sinon un polynôme de
linéairement avec X. degré convenable.

1
Modèle linéaire
Avec une seule variable X le modèle s ’écrit : Y = β0 + β1 X + r
Y Y5
Y4
Y2
Y3
Y1
X1 X2 X3 X4 X5 X
Modèle linéaire
Les données
Les donnéesdisponibles
disponiblessontsonttoujours
toujoursenen Y = β0 + β1 X + r
nombrelimit
nombre limité,é, on
on obtient
obtient uniquement
uniquement uneune
« estimation
Y estimation
« » des coefficients b et b
» des coefficients b11 et b00 du du
Yèle
5 linéaire postulé.
modèle
mod linéaire postulé.
Y4
Y2
Y3
Y1
X1 X2 X3 X4 X5 X
Mode de calcul : la régression linéaire
Avec les moindres carr ées : Y i = b1 X i + b0

Y Y5 r5
r4
Y4
r2
Y2
r3 On mesure la somme des
Y3 carr és des écarts ri (r ésidus)
^
Y1 entre la valeur vraie et la
r1
Y1 valeur estim ée
Faire un ajustement:
c’est minimiser la quantit é :
S ri2 = S( Y i – Y i)
X1 X2 X3 X4 X5 X
2
Estimation des coefficients, moindre carrés
Dansce
Dans cesystème
systèmeles
lesßißi sont
sontles
lesinconnues
inconnues: :on onobtient
obtientles
lesestimateurs
estimateursbb0etetbb1
0 1
deßß0etetßß1au
de ausens
sensdes
desmoindres
moindrescarrés
carrés(b(best
i estl’estimation
l’estimationcalculée
calculéede
deßß)i ): :
0 1 i i
^ß = b = S(yi - y)(x i - x)
0 1 et ^
ß0 = b0 = y - b1 X
S (x i - x)2
Exemple :
Droite d ’étalonnage
Unit é de fluorescence
La droite des moindres carrés

30
correspondant aux données a
20
donc pour équation :
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7
nM Y = 5,139 X – 0,418
Analyse de la régression linéaire

Les variations observ ées pour Y sont- elles dues globalement, aux
variations de X ou bien ne sont- elles que du bruit exp érimental ?
Quelle confiance peut-on avoir : Y i = b1 X i + b0
d’une part individuellement pour les estimateurs ?

- Simplification du modèle
- Pertinence quadratique (global)
d’autre part globalement pour la r égression,

- Analyse de variance / coefficients
- Examen des r ésidus
- Manque d’ ajustement ( Lack of fit)

Significativité des coefficients

bb1 estimation de ß1 bb00estimation
estimationde
deßß0
1 estimation de ß1 0
sontdistribu
distribuésésselon
selonuneunedistribution
distributionnormale
normaleetetsont
sontégalement
égalementdes
des
sont
variablesalaléatoires
éatoiresqui
quiont
ontleurs
leurspropres
propresvariances.
variances.
variables
de
de moyenne
moyenne ßß11 etet de
de de moyenne
de moyenne ßß0 et et de
de
variance
variancevar(b
var(b1)1) var(b)00)
variancevar(b
variance 0
La significativit é va être d étermin ée en prenant

ßi0 = 0 d’o ù :
bi
t=
é.type (bi)

3
Simplification du modèle de calibration
Jour 3 Jour 3
rdf60 - 140 %
rdf60 - 140 %
Droite Droite
std 60 - 140 % o.o - 100 %
Étalonnage externe Étalon externe

Significativité terme carré

Principe = D éterminer si une modélisation par un polynôme de degré 2 ne
serait pas mieux adaptée.
y = b0 + b1x + b2x2 b2
t=
é.type (b2)
Comment ? En testant si b2 = 0.
Terme carré = 0 ⇒ régression linéaire adaptée
Terme carré ≠ 0 ⇒ régression linéaire inadaptée
Évaluation sp écifique et globale du modèle

Analyse de la régression linéaire

Les variations observ ées pour Y sont- elles dues globalement, aux
variations de X ou bien ne sont- elles que du bruit exp érimental ?
Quelle confiance peut-on avoir :
d’une part individuellement pour les estimateurs ?

- Simplification du modèle
- Pertinence quadratique (global)
d’autre part globalement pour la r égression,

- Analyse de variance / coefficients
- Manque d’ ajustement ( Lack of fit)
- Examen des r ésidus

4
Analyse globale
SCET = SCEL + SCER
Variation totale Variation due à la liaison Variation résiduelle
Σ(yi - y)2 Σ(y

^i - ^y)2 = Σ(y
^ i - y)2 Σ(yi - ^yi )2
r5
r4
-
Y
r2 r3
r1

R2: Analyse globale

La mesure de l'efficacité de l'ajustement peut être exprimée par un
coefficient appelé “coefficient de détermination” ou “coefficient de
régression multiple”.
Si le modèle expliquait “idéalement” les résultats expérimentaux,

alors SCET = SCEL
ou sous une autre forme SCE L/SCE T =1
R2 est la part de la dispersion expliquée

par le modèle.
SCER
R2 = 1 - Pour un modèle parfait, R2 = 1 car SCER = 0
SCET (il n'y a pas de différence entre valeurs
expérimentales et valeurs calculées).
R2: Analyse globale

1.8 3
1.6
1.4
R2R ==0.820
20.820 2.5 R2 = 0.820
1.2 2
1
1.5
0.8 2
R = 0.820
0.6 1
0.4 0.5
0.2
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14
1.4 1.8
2
2 1.6 R = 0.820
1.2 RR2 ==0.820
0.820 1.4 R2 = 0.820
1 1.2
0.8 1
0.6 0.8
0.6
0.4
0.4
0.2 0.2
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14
0 2 4 6 8 10 12 14

5
Analyse de la variance
Sources Degrés Sommes des Carrés
de variation de lib. Carrés des Ecarts moyens Fcalc Signif.
Régression 2-1=1 SCEL = 739,56 739,56 598,8 2,12.10-6

Résidus 7-2=5 SCER = 6,175 1,235 F 1;5;0,05 = 6,608
Total 7-1=6 SCET = 745,72
SCET = SCEL + SCER

Variation totale Variation due à la liaison Variation r ésiduelle
Σ(yi - y)2 Σ(y y)2 = Σ(^yi - y) 2

^i - ^ Σ (yi - ^
y i)2
r5
Testde
Test deF1:
F1:
r4 Existenced’une
Existence d’une
-
Y pentesignificative
pente significative
r2 r3
(SFSTP 92)
(SFSTP 92)
r1
Peu informatif
Peu informatif

Manque d’ajustement
Tableau X Test de validité de la droite de régression (rdf)
Test de Fisher (F2 ) comparant les erreurs d'ajustement et expérimentales
Variations DDL Somme carré Variance F2 calculé
Erreur de la régression 3 4.07E+00 1.36E+00
4.560
Erreur expérimentale 10 2.97E+00 2.97E-01
F(0.05;3;10) 3.708 Test -
STD / RDF Point parfaitement aligné

Modèle linéaire acceptable
160.0
140.0
Diagnostique
120.0
Une seule solution mère ayant
100.0
servi à l’établissement des
Réponse
80.0
différents niveaux de
60.0
STD
concentration
40.0
RDF
20.0
Travail « trop » précis
0.0
0.0% 20.0% 40.0% 60.0% 80.0% 100.0% 120.0% 140.0% Problème de l’hypothèse H0
Concentration

Examen des résidus

2.5
régression linéaire
Surf.DHA/Surf.SI
2.0
1.5
y = 0.0013x + 0.0374
1.0
R2 = 0.996
0.5
0.0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Analyse des résidus
0.15
0.1
Variances 0.05
Résidus
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
non homogènes -0.05
-0.1
-0.15
Concentration [n g/ m l ]

6
Tests sur les variances
La simple r égression nécessite l’homog énéit é des variances
erreur sur la réponse est indépendante du niveau
Conditions non respectée en cas de domaine de concentrations étendu
(àméthodes bioanalytiques )
Diagnostic : tests sur les variances
1) Test de F
(variance max)
2) Test de Cochran
(variance max)
3) Bartlett
(homogénéité de la dispersion)
4) Levène
Présence d’aberrants possible

Régression pond érée

Régression pondérée
0.70
S ri2 = Sw (y – y)2
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
Facteur de pond ération w
0.10
0.00
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
1/x0.5 , 1/x, 1/x2 , 1/y0.5 , 1/y, 1/y2 , etc.
0.006
Choix de w
0.005
1) Modélisation de la variance (N élevé)

0.004
0.003
Prévalidation – approche SFSTP 1997 w = 1/x?
avec log(var) = · log(conc) + o.o.
0.002
0
1 2 3 4 5
Ex. ? = 2
0.001
y = 1.7231x - 8.4095
1-
-2
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
-3
2) Utilisation des performances -4
de recalcul : S biais relatifs 5-
-6

Changement de variables
ICH
Il peut être n écessaire dans certains cas, pour obtenir une
relation linéaire entre les résultats du dosage et la
concentration, d’appliquer une transformation
mathé matique aux résultats d’essai avant d’effectuer
l’analyse de régression”
Type de changement de variable considérés

Logarithme (Log. / Ln) – Racine, etc.
Combinaison possible :
Changement de variable et pondération
Contraintes de régression identiques (homoscédasicité)

7
Fonction réponse
2.5
2.0
1.5 régression linéaire

y = 0.0013x + 0.0374
Surf.
1.0 2
R = 0.996
0.5 Sans transformation
de variable
0.0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Conc. [ppb]
1.6
1.4
Avec transformation 1.2
de variable y =f( x ) 1.0

y = 0.0354x + 0.0515
0.8
0.6 R2 = 0.9976
Sqr
0.4
0.2
0.0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Sqr (Conc.)
Analyse des résidus

Sans modification des Avec transformation de variable
données
0.15 0.15
0.1 0.1
0.05 0.05
Résidus
Résidus
0 0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 5 10 15 20 25 30 35 40 45
-0.05 -0.05
-0.1 -0.1
-0.15 -0.15
Concentration [ ng/ml] Concentration transformée [ ng/ml]
Variances Test de Variances

non homogènes Cochran homogènes

Calibration des méthodes analytiques

• Le but de la validation d'une procédure analytique est
de démontrer qu'elle correspond à l'usage pour
lequel elle est prévue.
• Le but de la calibration d'une procédure analytique est

de démontrer qu'elle correspond à l'usage pour
lequel elle est prévue.
Aspect explicatif vs Aspect prédictif

En phase de validation (routine), la calibration doit si
possible être simple pour être maîtrisée.
Étalonnage inverse

8
Principe de l’étalonnage inverse
signal
Fonction réponse
Intervalle de dosage

Recalcul des QC – Fonction de transfert

valeur calculée en retour pour QC
x u1 u2 u3
J1 25
25
32.7
29.9
22.3
16.7
28.8
27.5
25 32.4 26.0 29.0
25 31.4 28.6 31.5
50 55.3 55.2 46.8
J2 50 57.7 46.7 45.2
50 60.4 49.5 52.4
50 57.3 48.4 43.3
250 262.8 245.0 255.8
250 265.2 249.7 238.4
250 251.0 241.2 224.4
J3 250 268.5 243.0 267.9
400 409.2 429.2 372.8
400 382.3 414.3 411.2
400 392.0 421.8 392.8
400 394.8 426.6 413.2
Concentrations Concentration
théorique obtenues

Protocoles SFSTP 1997 et 2003

Approchebiologique
biologique Domaineétendu
Domaine étendu
Approche
Pasde
Pas devaleurs
valeurscibles
cibles
Effetde
Effet dematrice
matrice
Limitede
Limite dequantification
quantification
signal
OBJECTIF Générique
Simulation du travail de
routine à l'aide d' échantillons
de concentrations connues
domaine
(Standard de validation : QC)
Standards de calibration:
Fonction réponse à 2003
Contrôle qualité: Linéarité, répétabilité, Toutes m éthodes confondues
fidélité intermédiaire, exactitude

9
Tramadol
Fluorescence
UV
Design de Validation : 8 jours (Massart et al.)

Standards de calibration k=3, n=2 (SFSTP 2003)
Standards de validation k=3, n=2 (ICH, FDA, etc.)
Total N = 96 (8 ddl rép étabilit é, 7 fidélit é)

Modèle de calibration testés
Régression linéaire simple (OLS) : Lin

Etalon externe : 1 – Level
Régression linéaire pond ér ée (WLS) : W – Lin
Transformation Logarithme (OLS): Log
Transformation racine carr ée (OLS): Squared
Transformation Logarithme (WLS) : W – Log
Transformation racine carr ée (WLS): W – Squared
Quadratique: Quadra
Quadratique pondéré: W- Quadra
Calculs effectués :
Disposition expérimentale ?
6 standards de calibration
Design de Calibration 1 : k=6 / n=1
signal
Designde
Design decalibration
calibration
Normatif(Ex.
Normatif (Ex.FDA
FDA 2001)
2001)
Cal 12.5%
CalX :
Standard de calibration
Cal 2-3LOQ
Cal LOQ Cal 25% Cal 50% Cal 100%

10
signal
Linéaire
Linéaire
k=2,n=3
k=2, n=3
CalX :
Cal LOQ Cal 100%

signal
QuadratiqueDD––Optimal
Quadratique Optimal
k=3,n=2
k=3, n=2
SFSTP 2003
SFSTP 2003
CalX :
Cal LOQ Cal 50% Cal 100%

Données de Calibration
Modèle de calibration #
Données de Validation
Recalcul des QC
Résultats Modèle #
Concentrations Concentration obtenues

théorique
11
Régression lin éaire simple (OLS)
Etalon externe
Régression lin éaire pond ér ée (WLS)
Transformation Logarithme (OLS)
Transformation Racine carr ée (OLS)
Transformation Logarithme (WLS)
Concentrations
théoriqueTransformation Racine
8 jours, carr
k=3,
Concentration n=2ée (WLS)
obtenues
Concentrations
théoriqueQuadratique Concentration
(OLS) obtenues
théorique
Concentrations
Quadratique Concentration obtenues
pond ér é (WLS)
Concentrations
théorique Concentration obtenues
théorique
théorique
théorique
théorique
théorique

Exactitude - Liné arité
500 concobtenue Linéarité :

400 Capacité à obtenir
des ré sultats
300
directement
200 proportionnels à la
concentration
concobtenue= f( conc théorique)
100
concthéorique
0
0 100 200 300 400
Idéal :
Pente = 1
Calcul d’un intervalle de
confiance à 90%sur les pentes Ordonnée origine = 0
p −1
LC b = b ± t 0. 1 s b
2 LC inf SFSTP
LC sup 0.85 - 1.15 Estimateur : R2
Linéarité

12
Justesse - Biais
La justesse peut être

exprimée en termes de :
A) Pourcentage de Evaluation graphique
recouvrement Profil d’exactitude (SFSTP)
B) Biais absolu
Bon recouvrement = 100 %
C) Biais relatif

Impact du modèle sur la justesse

M1 – impact du modèle sur la justesse
100

13
Impact du modèle sur la précision

Impact du modèle sur la LOD estimée
Utilisation de la variance résiduelle de régression

Discussion
A partir d’une certaine concentration, tous les modèles sont
équivalents en terme de prédiction sur des standards de
validation (analyte dépendant).
Pour la justesse, les concentrations les plus basses sont les
plus sensibles. Pour la précision, l’impact du choix du
modèle est relatif.
Le 1-level (étalon externe) est le moins bon. Il ne doit être
utiliser que dans des problématique bien précises.
Les régressions pondérées sont performantes et
correspondent à la réalité du phénomène (domaine étendu)
Ne pas sur-modéliser pour éviter des problèmes
en routine

14
Discussion
Démontrer que le modèle choisi est convenable pour

l’usage pour lequel il est prévu (Validation).
Traitement à posteriori permet le choix du meilleur

compromis complexité – facilité
Approche SFSTP 97/03 permet d’éviter certaines difficultés

statistiques (ex. SFSTP 92: Lack of fit) mais nécessite une
maîtrise des concentrations introduites.

Remerciements
Prof. Jean-Luc Veuthey

LCAP (Universit é de Genève, Suisse)
Prof. Pierre Lant éri

Dr Jean-Yves Gauvrit
Laboratoire de Chimiométrie (Universit é de Lyon, France)
Dr Philippe Hubert
Service d'Analyse des M édicaments, Institut de Pharmacie
(Universit é de Liège, Belgique) – Commission SFSTP

15

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Mise au point d’une méthode d’analyse

Le modèle mathématique postulé peut être :

Y Ajustement liné aire Y Ajustement polynomial

Modèle Y = f(X) avec un

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Mode de calcul : la régression linéaire

Avec les moindres carr ées : Y i = b1 X i + b0

La droite des moindres carrés

Analyse de la régression linéaire

Quelle confiance peut-on avoir : Y i = b1 X i + b0

d’une part individuellement pour les estimateurs ?

d’autre part globalement pour la r égression,

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Significativité des coefficients

La significativit é va être d étermin ée en prenant

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Étalonnage externe Étalon externe

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Significativité terme carré

Terme carré = 0 ⇒ régression linéaire adaptée

Terme carré ≠ 0 ⇒ régression linéaire inadaptée

Évaluation sp écifique et globale du modèle

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Analyse de la régression linéaire

Quelle confiance peut-on avoir :

d’une part individuellement pour les estimateurs ?

d’autre part globalement pour la r égression,

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Σ(yi - y)2 Σ(y

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

R2: Analyse globale

Si le modèle expliquait “idéalement” les résultats expérimentaux,

ou sous une autre forme SCE L/SCE T =1

R2 est la part de la dispersion expliquée

R2: Analyse globale

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Régression 2-1=1 SCEL = 739,56 739,56 598,8 2,12.10-6

Total 7-1=6 SCET = 745,72

SCET = SCEL + SCER

Σ(yi - y)2 Σ(y y)2 = Σ(^yi - y) 2

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

STD / RDF Point parfaitement aligné

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Examen des résidus

non homogènes -0.05

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Diagnostic : tests sur les variances

Présence d’aberrants possible

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

1) Modélisation de la variance (N élevé)

2) Utilisation des performances -4

de recalcul : S biais relatifs 5-

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Type de changement de variable considérés

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

1.5 régression linéaire

de variable y =f( x ) 1.0

Analyse des résidus

Variances Test de Variances

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique

Calibration des méthodes analytiques