Fonctions et régulations des protéines Crumbs

dans la morphogenèse des tissus épithéliaux

Thèse

Kévin Sollier

Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire

Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada
© Kévin Sollier, 2016
Fonctions et régulations des protéines Crumbs
dans la morphogenèse des tissus épithéliaux

Thèse

Kévin Sollier

Directeur de recherche : Patrick Laprise

Résumé

Les tissus épithéliaux recouvrent les surfaces et les cavités du corps et

fonctionnent comme des barrières sélectives capables d’échanges entre les différents
compartiments de l’organisme. La fonctionnalité de ces tissus repose notamment sur
la mise en place et le maintien d’une asymétrie structurale des cellules épithéliales,
aussi appelée « polarité épithéliale ». La modulation des mécanismes orchestrant
l’asymétrie membranaire est centrale dans la formation et le maintien de
l’architecture des tissus épithéliaux. Ainsi, des défauts de polarité épithéliale
provoquent des anomalies morphologiques et fonctionnelles des tissus épithéliaux,
qui peuvent contribuer au cancer chez l’Homme. C’est pourquoi, la compréhension
des processus liés à la polarité épithéliale constitue des objectifs cruciaux dans la
biologie des épithéliums et dans la santé humaine, pour assurer le développement de
nouvelles thérapies liées au rétablissement des fonctions soutenues par une asymétrie
membranaire. Les mécanismes de polarité épithéliale et leurs fonctions signalétiques
dans la morphogenèse des tissus épithéliaux jouent un rôle central dans ma thèse et
font l’objet de mon introduction.

Mon projet de doctorat a consisté à caractériser la fonction et la régulation de

Crumbs, un acteur clé dans la mise en place du domaine apical, dans le contrôle de la
morphologie cellulaire et dans la morphogenèse des tissus épithéliaux. C’est
pourquoi, l’étude de la régulation de la fonction de Crb au sein de la cellule
épithéliale revêt un rôle capital dans la compréhension de la biologie des épithéliums.
Dans ce cadre, nous avons d’abord permis d’approfondir les modalités d’une
éventuelle fonction du domaine extracellulaire de CRB3A. De plus, nous montrons
que la GTPase Rac1 permet de contrôler Crumbs dans un contexte tridimensionnel.
Ainsi, nous proposons un modèle fonctionnel de Crumbs, soutenu par des approches
in vitro et in vivo, dans le contrôle de la morphologie cellulaire et la morphogenèse
des tissus tridimensionnels.

iii
Table des matières

RÉSUMÉ .................................................................................................................................. III

TABLE DES MATIÈRES ......................................................................................................... IV
LISTE DES FIGURES .............................................................................................................. VI
LISTE DES ABRÉVIATIONS ................................................................................................. VII
REMERCIEMENTS................................................................................................................... X

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION .............................................................................................. 1

1.1 ORGANISATION ET FONCTIONS DES ÉPITHÉLIUMS .............................................. 2
1.2 ORGANISATION CELLULAIRE DES ÉPITHÉLIUMS. ................................................. 5
1.2.1 Les jonctions cellulaires ............................................................................ 5
1.2.2 Le cytosquelette et le trafic vésiculaire ..................................................... 8
1.3 ORGANISATION MOLÉCULAIRE DE LA CELLULE ÉPITHÉLIALE .............................. 15
1.3.1 Le module Crumbs .................................................................................. 15
1.3.2 Régulation du module Crumbs dans la polarité épithéliale .................... 19
1.4 FONCTION ET RÉGULATION DE CRB DANS LA MORPHOLOGIE CELLULAIRE ET
TISSULAIRE. 29
1.4.1 Fonction de Crb dans la morphologie cellulaire et tissulaire. ........................................ 29
1.4.2 Régulation de Crb dans la morphologie cellulaire et tissulaire. ..................................... 30
1.4.3 Modulation de la fonction de Crb dans la morphogenèse des tissus épithéliaux. ......... 31
1.5 UN MODÈLE DE MORPHOGENÈSE DES TUBULES ÉPITHÉLIAUX, LE DÉVELOPPEMENT
DE LA TRACHÉE EMBRYONNAIRE DE DROSOPHILE .................................................................... 35
1.5.1 Généralités sur le modèle de la drosophile ............................................ 35
1.5.2 Anatomie de la trachée embryonnaire de drosophile ............................. 37
1.5.3 Morphogénèse initiale de la trachée de drosophile ................................ 38
1.5.4 Contrôle du diamètre de la trachée embryonnaire ................................. 40
1.5.5 Contrôle de la longueur de la trachée embryonnaire.............................. 40

OBJECTIFS ............................................................................................................................ 42

CHAPITRE 2 : ......................................................................................................................... 44
2.1 AVANT-PROPOS .................................................................................................. 45
2.2 RÉSUMÉ ............................................................................................................. 45
2.3 ABSTRACT .......................................................................................................... 46
2.4 INTRODUCTION ................................................................................................... 46
2.5 RESULTS AND DISCUSSION .................................................................................. 47
2.5.1 Rac1 limits Crb activity to define dorsal trunk length ..................................................... 47
2.5.2 Rac1 promotes Crb endocytosis, which prevents over-elongation of dorsal trunks ...... 50
2.5.3 Rac1 is required for SJ functions as well as for Verm and Serp secretion .................... 54
2.5.4 Rac1 and Cora are involved in a positive feedback loop ............................................... 56
2.6 MATERIALS AND METHODS................................................................................... 60

CHAPITRE 3 : ......................................................................................................................... 62
3.1 AVANT-PROPOS .................................................................................................. 63
3.2 CONTRÔLE DE LA TUBULOGENÈSE PAR LES PARTENAIRES FONCTIONNELS DE CRB . 63
3.3 ÉTUDE DE L’INTERACTION HOMOTYPIQUE CRB3A/CRB3A DANS LES CELLULES DE
MAMMIFÈRES ......................................................................................................................... 67
3.3.1 Étude structure-fonction des domaines intracytoplasmique et extracellulaire de la
protéine CRB3A dans la compaction cellulaire ....................................................................... 67
3.3.2 Étude du domaine extracellulaire de CRB3A dans la promotion des forces adhésives
intercellulaires ................................................................................................................ 69

iv
3.3.3 Étude de l’interaction homotypique entre les protéines CRB3A par une approche
biochimique ................................................................................................................ 70
3.3.4 Étude de l’interaction homotypique entre les protéines CRB3A par une approche
chimique ................................................................................................................ 72
3.4 MATÉRIELS ET MÉTHODES : ................................................................................. 75
3.4.1 Contrôle de la tubulogenèse par les partenaires fonctionnels de Crb. .......................... 75
3.4.2 Étude de l’interaction homotypique CRB3A/CRB3A dans les cellules de mammifères 76

CHAPITRE 4 : DISCUSSION ................................................................................................. 82

4.1 ÉTUDE DE L’INTERACTION HOMOTYPIQUE CRB3A/CRB3A DANS LES CELLULES
DE MAMMIFÈRES .................................................................................................................... 83
4.2 FONCTIONS DE CRB3A DANS LE CONTRÔLE DE LA MORPHOLOGIE CELLULAIRE ET
DE LA RÉPRESSION TUMORALE. .............................................................................................. 87
4.2.1 CRB3A contrôle un module contractile via l’activité RhoA ..................... 87
4.2.2 Crumbs, un chef d’orchestre de la morphologie apicale ? ..................... 88
4.2.3 CRB3A réprime l’agressivité des cellules tumorales en modifiant la
morphologie cellulaire ? .......................................................................................................... 91
4.3 RÉGULATION DE CRUMBS DANS LE CONTRÔLE DE LA TUBULOGENÈSE. ............. 93
4.3.1 Rac1, un régulateur négatif des fonctions apicales de Crb .................... 93
4.3.2 Rac1, un chef d’orchestre du trafic vésiculaire dans la signalisation liée
aux jonctions septées ?........................................................................................................... 95
4.3.3 Rac1 et Cora coopèrent dans l’inhibition des fonctions de Crb .............. 97
4.4 FONCTIONS DE CRB DANS LE CONTRÔLE DE LA TUBULOGENÈSE. ...................... 98
4.5 CONCLUSIONS .................................................................................................. 104

BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................................. 105

ANNEXES ............................................................................................................................. 126

ANNEXE 1 : CRB3A CONTROLS THE MORPHOLOGY AND COHESION OF CANCER CELLS
THROUGH EHM2/P114RHOGEF-DEPENDENT SIGNALING. ..................................................... 127
ANNEXE 2 : RAC1 CONTROLS EPITHELIAL TUBE LENGTH THROUGH THE APICAL SECRETION
AND POLARITY PATHWAYS. ................................................................................................... 141

v
Liste des figures

Figure 1.1. Diversité morphologique et fonctionnelle des épithéliums. ....................... 4

Figure 1.2. Organisation spatiale de la cellule épithéliale ............................................ 7
Figure 1.3. Schéma des modes de régulation d’une GTPase ........................................ 9
Figure 1.4. Schéma de l’intégration des GTPases, Rac1 et Rab5 dans le maintien de
l’architecture polarisée ................................................................................................ 14
Figure 1.5. Schéma de la structure du module Crumbs. ............................................. 19
Figure 1.6. Schéma de la structure du module Par-6/aPKC/Cdc42. ........................... 20
Figure 1.7. Coopération et antagonisme des modules de polarité dans la mise en place
de la polarité épithéliale .............................................................................................. 23
Figure 1.8. Régulation des fonctions de Crb par les protéines Yrt et Cora................. 26
Figure 1.9. Régulation réciproque du module de Crumbs par le métabolisme des
phosphoinositides ........................................................................................................ 28
Figure 1.10. Le programme de polarité épithéliale limite les propriétés invasives des
cellules épithéliales ..................................................................................................... 31
Figure 1.11. Régulation de la fonction des protéines Crb par interaction homotypique ...... 34
Figure 1.12. Schéma du système UAS-GAL4 ............................................................ 37
Figure 1.13. Anatomie et morphogenèse de la trachée de drosophile. ....................... 39
Figure 1.14. Schéma de description du projet. ............................................................ 42
Figure 2.1. Rac1 promotes Rab5-dependent endocytosis of Crb ................................ 53
Figure 2.2. Rac1 promotes Rab5-dependent endocytosis of Crb ................................ 54
Figure 2.3. Rac1 controls SJ permeability and luminal accumulation of chitin-
modifying enzymes. .................................................................................................... 55
Figure 2.4. Rac1 and Cora act in a positive feedback loop ......................................... 57
Figure 2.5. Model of Rac1 activation and function in the control of tracheal tube
length ........................................................................................................................... 59
Figure 3.1 : L’activité Rac1 est nécessaire à l’intégrité physique de la taenidia ........ 65
Figure 3.2 : L’activation de la Moésine promeut l’allongement de la trachée ........... 66
Figure 3.3 :Expression et localisation des constructions de CRB3A utilisées ............ 68
Figure 3.4 : La surexpression de CRB3A ne modifie pas l’agrégation cellulaire. ..... 69
Figure 3.5. Co-immunoprécipitation ectopique de CRB3A. ...................................... 71
Figure 3.6. Absence d’interaction homotypique par l’utilisation de peptide
synthétique. ................................................................................................................. 74
Figure 4.1. Modèle des fonctions bimodales de Crb dans le maintien de la
morphologie cellulaire ................................................................................................ 91
Figure 4.2. Modèle du contrôle de la tubulogenèse par Crb ..................................... 101

vi
Liste des abréviations

α-cat : α-caténine

β-cat : β-caténine

AJ : Jonction adhérente (Adherens junctions)

aPKC : atypical Protein Kinase C

Arm : Armadillo

Arp2/3 : Actin-related proteins 2/3

Baz : Bazooka

BCA : Bicinchoninic acid Assay

Bd : Branche dorsale

Bl : Branche latérale

BSA : Bovin serum albumin

Btl (promoteur) : Breathless

C. elegans : Caenorhabditis elegans

Cdc42 : Cell division control protein 42 homolog

Cora : Coracle

Crb : Crumbs

Da (promoteur) : Daughterless

D. rerio : Danio rerio

DAPI : 4',6'-diamidino-2-phénylindole

Dlg : Discs large

Ehm2 : Expressed in high metastatic cells 2

ERM : Ezrin, Radixin, Moesin

FA : FERM-Adjacent

FBM : FERM-Binding Motif

vii
FERM : band 4.1, Ezrin, Radixin, Moesin

FITC : Isothiocyanate de fluorescéine (Fluorescein isothiocyanate)

GAP : GTPase-activating protein

GDP : Guanosine biphosphate

GEF : Guanine nucleotide exchange factor

GTP : Guanosine triphosphate

Lgl : Lethal giant larvae

MAGUK : Membrane-associated guanylate kinase

MDCK : Madin-Darby canine kidney

NGS : Normal Goat Serum

Nrx-IV : Neurexine-IV

Pak : p21 activated kinases

PALS1 : Protein associated with Lin-7

PAR3 : Partition defective 3

Par-6 : Partition defective 6

PATJ : Pals1-associated tight junction protein

PBM : PDZ-Binging Motif

PBS : Phosphate buffered saline

PDZ : PSD95, Dlg1, ZO-1

PI3K : Phosphoinositide 3-kinase

PIP2 : Phosphatidylinositol-4,5-diphosphate

PIP3 : Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate

PTEN : Phosphatase and Tensin homolog

Pyd : Polychaetoid

Rab5 : Ras-related in brain 5

viii
Rac1 : Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1

RIPA : Radioimmunoprecipitation assay

ROCK : Rho-associated protein kinase

Scrib : Scribble

Sdt : Stardust

Sp : spiracle

SJ : Jonctions septées (Septate junctions)

Tc : Tronc connectif

Td : Tronc dorsal

TJ : Jonctions serrées (Tight junctions)

TP : Tracheal Pit

UAS (promoteur) : Upstream Activator Sequence

Yrt : Yurt

ZA : Zonula adherens

ZO : Zonula occludens

ix
Remerciements

Je tiens d’abord à remercier mon directeur de recherche Patrick Laprise,

d’abord pour m’avoir fait confiance et confié un projet de recherche dans son
laboratoire, ensuite pour m’avoir permis d’acquérir toutes mes connaissances dans
le domaine de la polarité épithéliale et, enfin, de m’avoir conseillé et guidé tout au
long de cette thèse.

Je remercie également tous les anciens membres du laboratoire, notamment François

Chartier et Emilie Hardy, pour toutes les discussions scientifiques (ou plus légères !)
dans la fly room, ainsi que pour l’aide technique apportée qui m’a été très précieuse
pour certaines expériences. Je remercie également les autres membres du
laboratoire, Clémence Gamblin, Elise Houssin, Lucie Charrier, Elise Loie et Hélori
Gaudé, pour leur soutien et leur bonne humeur tout au long de cette thèse.

Enfin, je tiens à remercier ma famille et mes amis pour leur patience témoignée
pendant cette thèse, et plus spécialement Amélie, dont le soutien inconditionnel a été
déterminant pendant le déroulement de cette thèse.

x
Chapitre 1 : Introduction

1
 1.1 Organisation et fonctions des épithéliums

Le maintien de l’homéostasie d’un organisme pluricellulaire requiert une

compartimentation du milieu intérieur du milieu extérieur. Chez les métazoaires, cette
fonction est remplie par les tissus épithéliaux. Ces tissus sont constitués de cellules
épithéliales qui tapissent l’ensemble du corps et des cavités de l’organisme. De plus,
ces cellules s’agencent histologiquement de manière compacte et reposent sur une
lame basale (Eroschenko, 2008). Néanmoins, la dénomination d’épithélium regroupe
des tissus aux formes et aux fonctions très différentes au sein d’un même organisme.
Ainsi, les différents épithéliums peuvent d’abord être classés empiriquement selon la
morphologie globale de leurs cellules (morphologie squameuse, cubique ou
cylindrique). On peut également distinguer les épithéliums selon le nombre de strates
du tissu. On peut alors observer des épithéliums stratifiés (ex : épiderme), constitués
de plusieurs couches cellulaires empilées, des épithéliums pseudo-stratifiés (ex :
épithélium de la trachée) et des épithéliums simples, constitués d’une couche unique
de cellules épithéliales faisant face à la lumière (ex : épithélium du jéjunum). Dans ce
manuscrit, je ne traiterai que des épithéliums simples.

En plus de leurs rôles de revêtement, les épithéliums assurent des échanges sélectifs
et dirigés entre différents compartiments de l’organisme (ex : l’absorption de
nutriments par les entérocytes, la réabsorption tubulaire du sodium et du glucose dans
les tubes proximaux du rein, la sécrétion d’acide chlorhydrique par les cellules
pariétales de l’estomac). Dans ce cadre fonctionnel, les cellules épithéliales peuvent
mettre en place des structures spécifiques additionnelles, comme des microvillosités
(ex : épithélium intestinal), des cils vibratiles (ex : épithélium bronchique) ou des
stéréocils (ex : cellules de l’oreille interne).

Toutefois, malgré cette diversité morphologique et fonctionnelle des épithéliums

simples, toutes les cellules épithéliales ont pour point commun une distribution
spatiale asymétrique de leurs composants physico-chimiques (Figure 1.1). Cette
organisation polarisée de la cellule permet de distinguer histologiquement un pôle
apical, faisant face à la lumière, et un pôle basolateral. Cette «polarité épithéliale» est

2
centrale dans la biologie des épithéliums. En effet, sa mise en place précède et est
requise à la morphogenèse (des mots grecs : « Morphê» –forme- et «Génésis» –
origine-) des tissus épithéliaux et au maintien de leur homéostasie.

Cependant, les processus orchestrant la formation de tissus aux fonctions polarisées à

partir de la mise en place d’une asymétrie cellulaire sont encore largement inconnus.
C’est pourquoi, la compréhension de la morphologie et des propriétés fonctionnelles
des épithéliums nécessitent l’étude des mécanismes cellulaires assurant une
polarisation des fonctions de la cellule épithéliale dans l’espace.

3
Figure 1.1 : Diversité morphologique et fonctionnelle des épithéliums. Les
cellules des tissus épithéliaux forment des tissus aux formes et aux fonctions très
variées au sein d’un même organisme. Néanmoins, celles-ci nécessitent que les
cellules épithéliales se polarisent au préalable dans un axe apicobasal.

4
 1.2 Organisation cellulaire des épithéliums.

La topologie compacte et la fonctionnalité d’un épithélium requièrent un

contrôle de la morphologie des cellules épithéliales pour assurer leurs cohésions au
sein du tissu. Dans ce cadre, les cellules épithéliales mettent en place des structures
mécaniques sur la membrane latérale (Lecuit and Yap, 2015). Ainsi, à l’interface du
domaine apical et basolatéral des cellules épithéliales, on retrouve notamment les
jonctions adhérentes et les jonctions étanches. De manière intrigante, ces jonctions
cellulaires permettent également d’assurer la morphogenèse tridimensionnelle des
tissus épithéliaux en coordonnant les forces mécaniques générées par les cellules
épithéliales au niveau du tissu (Hannezo et al., 2014).

1.2.1 Les jonctions cellulaires

1.2.1.1 Les jonctions adhérentes

L’observation en microscopie électronique des épithéliums permet de

distinguer une zonula adherens (ZA), une structure dense aux électrons qui ceinture
la membrane latérale de chaque cellule épithéliale (Kanno et al., 2000). Ainsi, au
niveau moléculaire, la ZA est une plate-forme moléculaire complexe, enrichie en
protéines transmembranaires (ex : E-cadhérine), pouvant établir des interactions
homotypiques à l’interface de deux cellules adjacentes (Chappuis-Flament et al.,
2001). Du côté cytoplasmique, ces protéines s’associent directement et indirectement
à des adaptateurs (ex : β- et α-caténine) qui se connectent mécaniquement au
cytosquelette d’actine (Buckley et al., 2014). Ainsi, ces complexes moléculaires
participent localement à la formation des jonctions adhérentes (Adherens Junction,
AJ) sur la membrane latérale, qui permettent de lier mécaniquement le cytosquelette
des cellules épithéliales entre-elles et de générer les forces nécessaires au maintien de
l’intégrité physique du tissu épithélial.

De manière intéressante, les cellules épithéliales isolées en culture ne possèdent pas

de ZA. La formation de la ZA et le maintien de son intégrité sont dynamiques et
dépendent de la densité cellulaire. En effet, le contact physique entre deux cellules

5
épithéliales promeut la stabilisation membranaire des complexes jonctionnels de la
ZA. Dans un environnement cellulaire dense, ces derniers coalescent en une structure
circulaire unique d’où émerge les propriétés adhésives de la ZA (Andersen et al.,
1996, Adams et al., 1998). Les jonctions adhérentes sont des structures évolutives
anciennes partagées chez tous les métazoaires, suggérant que les machineries
mécaniques permettant de maintenir l’intégrité physique du tissu épithélial sont
conservées à travers les espèces (Harris and Tepass, 2010). En effet, la drosophile
possède notamment un complexe DE-cadhérine/Armadillo/α-caténine, orthologue au
complexe E-cadhérine/β-caténine/α-caténine des mammifères (Oda et al., 1994, Cox
et al., 1996, Desai et al., 2013) (Figure 1.2).

1.2.1.2 Les jonctions étanches

Les épithéliums bâtissent également une zonula occludens (ZO). Cette

architecture protéique forme une barrière physique au passage des ions et des fluides,
qui permet de cloisonner l’organisme en compartiments étanches. Chez les vertébrés,
cette fonction d’étanchéité est remplie par les jonctions serrées (Tight Junction, TJ).
À l’image des jonctions adhérentes, cette structure se compose de protéines
transmembranaires (ex : Claudine), associées à des adaptateurs cytoplasmiques (ex :
ZO-1) reliés au cytosquelette d’actine de la cellule. Chez les vertébrés, ces jonctions
se forment du côté apical des jonctions adhérentes (Figure 1.2).

Les invertébrés ne possèdent pas de jonctions serrées. En effet, la fonction

d’étanchéité de leurs tissus épithéliaux est réalisée par des jonctions septées (Septate
Junction, SJ) qui sont considérées comme les structures analogues aux jonctions
serrées. Néanmoins, les mécanismes cellulaires en amont et en aval de ces jonctions
ont divergé durant l’évolution (Matter and Balda, 2003) (Figure 1.2). En effet, la
localisation et la composition chimique des jonctions septées diffèrent des jonctions
serrées (Tepass and Hartenstein, 1994, Wood, 1990, Fehon et al., 1994). De plus, les
jonctions septées sont localisées du côté basal des jonctions adhérentes. Enfin,
certaines protéines, associées uniquement aux TJs chez les mammifères, présentent
des localisations jonctionnelles différentes chez la drosophile (ex : Polychaetoid,
l’orthologue drosophile de ZO-1, s’associe à la fois aux SJs et aux AJs (Takahisa et

6
al., 1996)). Les jonctions septées sont néanmoins constituées de protéines
transmembranaires conservées à travers les espèces (ex : Neurexine-IV; Kune-Kune,
un orthologue des claudines vertébrées), qui s’associent à des adaptateurs
cytoplasmiques (ex : Coracle).

Figure 1.2 : Organisation spatiale de la cellule épithéliale. Les cellules épithéliales

vertébrées et invertébrées forment des structures fonctionnelles latérales homologues
(Jonction adhérente) et analogues (Jonction serrée/septée) entre-elles. Ces jonctions
cellulaires sont formées de protéines transmembranaires qui s’associent à des
adaptateurs cytoplasmiques connectés mécaniquement au cytosquelette d’actine. Les
protéines et les fonctions associées aux jonctions septées se sont arrangées de manière
différentielle dans l’évolution. Légende : α-cat:α-caténine ; β-cat :β-caténine ; ZO-
1 :Zonula Occludens-1 ; Arm:Armadillo ; Pyd: Polychaetoid; Cora:Coracle; Nrx-
IV:Neurexine-IV.

7
 1.2.2 Le cytosquelette et le trafic vésiculaire

La mise en place d’une asymétrie apicobasale et la formation des structures

jonctionnelles sont progressives et s’accompagnent d’un ajustement morphologique
des cellules épithéliales (Hannezo et al., 2014). En effet, la mise en place de la
polarité épithéliale et la formation des jonctions sont étroitement couplées au contrôle
de la morphologie cellulaire. Ainsi, les cellules épithéliales, isolées en culture ou
pendant le processus de cicatrisation chez l’animal, forment de nombreuses
extensions membranaires, qui disparaissent concomitamment à la mise en place de la
polarité épithéliale et la formation des jonctions cellulaires. Dans ce cadre, la
compaction de la morphologie cellulaire est notamment soutenue par une
réorganisation dynamique du cytosquelette qui charpente la cellule (Georgiou and
Baum, 2010), et par la mise en place d’un trafic vésiculaire polarisé au sein de la
cellule épithéliale (van Ijzendoorn et al., 2003). Ainsi, l’étude de leurs mécanismes
est important dans la compréhension du contrôle de la morphologie cellulaire.

Le remodelage du cytosquelette et le trafic vésiculaire sont contrôlés par des petites

GTPases, qui agissent comme des interrupteurs moléculaires au sein de la cellule (Sit
and Manser, 2011, Fromme and Segev, 2014). En effet, les GTPases peuvent adopter
une conformation active (liée au GTP) ou inactive (liée au GDP), permettant de
contrôler l’activation de manière spécifique d’un vaste panel d’effecteurs en aval
(Figure 1.3) (Etienne-Manneville and Hall, 2002).

Dans cette section, je décrirais essentiellement le rôle des GTPases Rac1, RhoA et
Rab5 dans les processus de polarité épithéliale, qui tiennent un rôle central dans les
projets présentés dans les chapitres 2 et 4.

8
Figure 1.3 : Schéma des modes de régulation d’une GTPase. La structure
tridimensionnelle d’une GTPase cycle entre une conformation inactive (liée au GDP)
et une conformation active (liée au GTP). Les changements de conformation sont
contrôlés par des GTPase Activating Proteins (GAP), qui stimulent l’hydrolyse du
GTP par la GTPase et favorisent la conformation inactive, et des Guanine Exchange
Factor (GEF), qui échangent le GDP lié par un GTP. Ainsi, l’activité et la
localisation des GAP et des GEF jouent un rôle central dans la fonction de la GTPase.
En effet, seule la GTPase dans sa conformation active (liée au GTP) est capable de se
lier à ses effecteurs et d’assurer ainsi la transduction d’un signal en aval.

9
 1.2.2.1 La GTPase Rac1

Plusieurs mécanismes de remodelage du cytosquelette sont intimement liés à

la morphologie cellulaire et font intervenir la famille des GTPases Rho (Hall, 1998).
Dans cette famille, on peut distinguer la sous-famille Rac (Ras-related C3 botulinum
toxin substrate) qui comporte chez les mammifères 3 membres partageant plus de
90% d’identité : Rac1, Rac2 et Rac3 (Malosio et al., 1997). La GTPase Rac1 est
l’isoforme majeure et ubiquitaire des GTPases Rac dans les tissus de mammifères
(Didsbury et al., 1989). En effet, Rac2 est exprimée spécifiquement dans les cellules
hématopoïétiques (Shirsat et al., 1990) et l’expression de Rac3 est restreinte au
système nerveux embryonnaire et adulte (Haataja et al., 1997). Le génome de la
drosophile contient trois gènes rac (rac1, rac2 et mtl) dont les fonctions sont
partiellement redondantes (Ng et al., 2002, Hakeda-Suzuki et al., 2002). Il est à noter
que l’expression d’un dominant négatif de Rac1 (Rac1N17) suffit à récapituler
plusieurs défauts morphogénétiques liés à la perte des gènes rac chez la drosophile
(Harden et al., 1995, Luo et al., 1994, Fanto et al., 2000, Hakeda-Suzuki et al., 2002).

Dans les cellules épithéliales de mammifères et de drosophile, l’activité de la GTPase

Rac1 est régulée de manière asymétrique le long de l’axe apicobasal, en étant enrichie
au domaine basolatéral et désactivée au domaine apical (Mack et al., 2012, O'Brien et
al., 2001, Chartier et al., 2011). Plus de 70 effecteurs fonctionnels de Rac1 ont été
identifiés (Bustelo et al., 2007). Parmi eux, Rac1 peut notamment activer localement
le complexe nucléateur d’actine Arp2/3 (Actin-Related Proteins 2/3). Ainsi, l’activité
Rac1 stimule la formation de protrusions membranaires (Yamazaki et al., 2007,
Galbraith et al., 2007) qui favorisent les étapes précoces de formation des jonctions
adhérentes (DeMali and Burridge, 2003). En retour, ces jonctions cellulaires activent
localement l’activité Rac1 (Nakagawa et al., 2001, Noritake et al., 2004), créant ainsi
une boucle de rétroaction positive au domaine latéral entre l’activation de Rac1 et la
promotion de l’adhésion cellulaire. Cependant, Rac1 peut, de manière concomitante,
stimuler l’endocytose de la E-cadhérine (Akhtar and Hotchin, 2001), induisant ainsi
le désassemblage des jonctions adhérentes (Braga et al., 2000). De plus, l’expression
d’un dominant actif de Rac1 (Rac1V12) mène au désassemblage des jonctions

10
cellulaires (Braga et al., 2000). Ainsi, il a été suggéré que Rac1 puisse jouer un rôle
de tenseur membranaire, pouvant moduler l’adhésion cellulaire en contrôlant la
quantité jonctionnelle des cadhérines (Daneshjou et al., 2015). L’enrichissement
basolatéral de l’activité Rac1 est également essentiel pour la fonction des jonctions
serrées chez les mammifères (Mack et al., 2012, Chen and Macara, 2005).

L’activité Rac joue un rôle crucial dans la morphogenèse des tissus épithéliaux in
vivo. Son rôle a surtout été étudié chez la drosophile puisque les embryons de souris
knock-out pour Rac1 montrent des défauts dès la gastrulation, avec une absence de
mise en place des trois feuillets embryonnaires (Sugihara et al., 1998), qui pourrait
être expliquée par un défaut de mouvements collectifs des cellules de l’épiblaste
(Migeotte et al., 2010). Les embryons de drosophiles déficients pour l’activité Rac1
montrent également des défauts de migration collective des cellules épithéliales, qui
ont été reliés à des défauts d’organisation du cytosquelette ou de la plasticité des
jonctions cellulaires. En effet, ces embryons montrent d’abord une absence de
fermeture dorsale (Harden et al., 1995), un évènement développemental impliquant la
migration et la fusion coordonnées de deux feuillets d’ectoderme sur la partie dorsale
de l’embryon. Ainsi, l’activité Rac1 est nécessaire à la migration des cellules des
deux feuillets ectodermiques en assurant le remodelage de leur cytosquelette
(Woolner et al., 2005). Ensuite, les défauts de l’activité Rac1 entraînent des
anomalies de tubulogenèse chez la drosophile. La tubulogenèse est un processus
developpemental complexe, orchestrant la formation d’un tube à partir d’un tissu
bidimensionnel (ex : tube neural chez les mammifères, trachée et glandes salivaires
embryonnaires chez la drosophile) (Hogan and Kolodziej, 2002). Dans ce cadre,
l’activité Rac1 module l’adhésion entre les cellules épithéliales pour assurer la
morphogenèse de la trachée embryonnaire (Chihara et al., 2003) et des glandes
salivaires de drosophile (Pirraglia et al., 2006).

1.2.2.2 La GTPase RhoA

La GTPase RhoA (Ras homolog gene family, member A) joue également un

rôle capital dans le maintien de la morphologie épithéliale. En effet, l’activité RhoA
est nécessaire à la maintenance des jonctions adhérentes (Ratheesh et al., 2012), des

11
jonctions serrées (Terry et al., 2011) et de l’intégrité physique des structures apicales
(Pan et al., 2007). Dans ce contexte, RhoA peut s’associer à plusieurs machineries
impliquées dans le remodelage du cytosquelette (Sahai and Marshall, 2002). Parmi
elles, l’activité RhoA stimule la fonction des ROCK (Rho-associated protein kinase),
des sérines/thréonines kinases qui assurent la phosphorylation de la chaîne légère
régulatrice de la myosine-II (Watanabe et al., 2007). La myosine-II est un moteur
moléculaire capable de s’associer au cytosquelette d’actine et de générer des tensions
corticales, qui assurent la contractilité et la stabilisation du cytosquelette apical des
cellules épithéliales (Terry et al., 2011, Nakajima and Tanoue, 2010). Néanmoins, les
mécanismes moléculaires permettant de contrôler en amont l’activité RhoA au
domaine apical d’une cellule épithéliale restent largement méconnus.

Le contrôle de l’activité RhoA joue également un rôle crucial pendant la

morphogenèse tridimensionnelle des tissus épithéliaux. En effet, la modulation de son
activité permet d’assurer une constriction corticale des cellules épithéliales, une
modification morphologique cellulaire qui peut promouvoir, selon le contexte,
l’élongation (Schock and Perrimon, 2002) ou l’invagination d’un tissu épithélial (He
et al., 2014, Martin et al., 2009).

Le contrôle des machineries cytosquelettiques par les GTPases au niveau de la cellule

est essentiel pour le maintien de l’homéostasie des épithéliums. Ainsi, les fonctions
de RhoA et de Rac1 s’inscrivent dans un réseau signalétique cellulaire polarisé,
permettant de contrôler la morphologie cellulaire et la morphogenèse des tissus
épithéliaux (Chauhan et al., 2011). En effet, les fonctions de Rac1 et de RhoA
s’antagonisent réciproquement (Moorman et al., 1999, Chauhan et al., 2011, Lee and
Thomas, 2011, Jou and Nelson, 1998) par des mécanismes qui restent à définir. Ces
GTPases semblent établir des gradients d’activation mutuellement exclusifs le long
de la membrane apicobasale et participent à la fonctionnalité de machineries de
remodelage du cytosquelette distinctes (Figure 1.4), de manière analogue à la
polarisation avant-arrière des cellules en migration (Rottner et al., 1999).

12
 1.2.2.3 La GTPase Rab5

La formation des jonctions cellulaires est concomitante à la mise en place

d’un trafic vésiculaire polarisé au sein de la cellule épithéliale, qui permet d’assurer
un contrôle quantitatif des composants délivrés dans les différents compartiments
membranaires (Rodriguez-Boulan et al., 2005, Rodriguez-Boulan and Macara, 2014).
Le trafic vésiculaire joue un rôle crucial dans la morphogenèse des épithéliums
puisque son altération entraîne des défauts de polarité épithéliale chez la drosophile et
les mammifères (Lu and Bilder, 2005, Shaye et al., 2008, Zeigerer et al., 2012). Le
contrôle du trafic vésiculaire s’articule autour de la famille des GTPases Rab (Ras-
related in brain), qui assure l’acheminement et le recyclage des composants apicaux
et basolatéraux (Zerial and McBride, 2001). Dans cette famille, la GTPase Rab5 est
impliquée dans les étapes précoces de l’endocytose de protéines transmembranaires
(Stenmark et al., 1994) en stimulant la fusion des vésicules décorées de clathrine avec
les endosomes précoces (Bucci et al., 1994). De manière intéressante, Rab5 exerce un
contrôle sur l’état d’activation et la localisation de la GTPase Rac1, qui démontre
l’existence d’un système intégré entre les mécanismes de remodelage du
cytosquelette et du trafic vésiculaire (Ramel et al., 2013, Palamidessi et al.,
2008)(Figure 1.4).

L’étude des mécanismes d’activation de ces GTPases est ainsi déterminante dans la
compréhension de la mise en place et le maintien de la polarité épithéliale, des
jonctions cellulaires, de la morphologie cellulaire et du contrôle de la morphogenèse
des tissus.

13
Figure 1.4 : Schéma de l’intégration des GTPases, Rac1 et Rab5 dans le
maintien de l’architecture polarisée. Les machineries de remodelage du
cytosquelette liées aux GTPases Rac1 (jaune) et RhoA (bleu) ont des fonctions
mutuellement exclusives pour maintenir l’intégrité des jonctions cellulaires (bleu), du
domaine apical (vert) et du domaine basolatéral (noir). Les mécanismes de contrôle
du trafic vésiculaire, notamment par la GTPase Rab5, permettent d’assurer un
contrôle quantitatif des composants membranaires le long de l’axe apicobasal et
s’inscrivent dans la polarisation des fonctions des GTPases le long de l’axe
apicobasal.

14
 1.3 Organisation moléculaire de la cellule épithéliale

L’état d’activation et la fonction des différentes GTPases sont intrinsèquement

couplés au recrutement local de leurs GEFs, GAPs et de leurs effecteurs (Pertz, 2010)
(Figure 1.3). Il est important de noter que la localisation de ces acteurs est
spatialement restreinte à un domaine membranaire par un programme de polarité
épithéliale (Georgiou and Baum, 2010). Ce programme de polarité épithéliale permet
de créer une asymétrie cellulaire qui permet de localiser correctement les machineries
de remodelage du cytosquelette et les composants des structures jonctionnelles à la
membrane. Ce mécanisme s’articule autour de plusieurs modules moléculaires, qui
font l’objet de régulations réciproques (Fletcher et al., 2012). Ainsi, l’analyse
structurale et fonctionnelle de ces modules revêt une importance capitale dans la
compréhension de la mise en place d’une asymétrie membranaire, de la morphologie
cellulaire et de la morphogenèse des épithéliums.

La localisation et la fonction des modules du programme de polarité épithéliale sont

dynamiques pendant l’établissement de la polarité épithéliale et l’embryogenèse. Pour
simplifier la nomenclature, ces modules sont classés selon leur localisation
subcellulaire finale. Ainsi, on distingue des modules dits « apicaux », qui participent
à la formation du pôle apical, et des modules « basolatéraux » qui assurent la
formation du pôle basolatéral. Dans cette section, je décrirais les mécanismes
communs de mise en place de polarité épithéliale chez la drosophile et les
mammifères qui seront particulièrement importantes pour la compréhension des
chapitres 2 et 4.

1.3.1 Le module Crumbs

Chez la drosophile, les protéines Crumbs (Crb), Stardust (Sdt) et Patj forment
le module Crumbs, qui joue un rôle fondamental dans la mise en place du pôle apical
de la cellule épithéliale.

15
 1.3.1.1 Crumbs/CRB3A

Le gène crb a d’abord été caractérisé chez l’embryon de drosophile pour son
rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité des tissus épithéliaux. En effet, la perte
de crb s’associe à une désorganisation majeure de la structure de l’ectoderme de
l’embryon de drosophile , associée à de larges plages d’apoptose des cellules
épithéliales, ne laissant que des « miettes de cuticule » visibles en microscopie
optique (Jürgens et al., 1984).

Au niveau moléculaire, la protéine Crb est une protéine transmembranaire d’environ

230 kDa, qui possède un très court domaine intracellulaire de 37 acides aminés. Crb
se localise exclusivement dans la portion membranaire apicale à la ZA (également
appelée « zone marginale ») des cellules de la plupart des tissus dérivés de
l’ectoderme (Tepass et al., 1990). Le contrôle quantitatif de Crb à la membrane est
crucial pour l’intégrité physique des épithéliums. En effet, la surexpression de Crb
suffit à entraîner une expansion du domaine apical au dépend du domaine basolatéral
dans la plupart des tissus ectodermiques (Wodarz et al., 1995), alors que la perte de
Crb empêche la formation de la ZA (Tepass, 1996) et s’associe à une perte de
l’organisation en monocouche des tissus embryonnaires.

De manière intrigante, les fonctions de Crb semblent intégralement encodées dans

son court domaine intracellulaire. En effet, l’expression d’une version de Crb
tronquée de son domaine extracellulaire mime la surexpression de la protéine Crb
pleine longueur et suffit à restaurer la plupart des défauts physiques des tissus
épithéliaux observés chez les embryons mutant pour crb (Wodarz et al., 1995). De
plus, la surexpression de la portion extracellulaire de la protéine n’induit pas de
phénotype apparent dans la plupart des tissus embryonnaires et adultes (Tepass et al.,
1990).

La protéine Crb est conservée à travers les espèces. En effet, trois homologues ont été
caractérisés chez Caenorhabditis elegans (C. elegans), dénotés CeCrb1 -aussi appelé
CRB-1 (Segbert et al., 2004)-, CeCrb2 -aussi appelé EAT-20 (Shibata et al., 2000)-
(Klebes and Knust, 2000) et CRB-3 (Waaijers et al., 2015). Chez les vertébrés, cinq

16
homologues ont été identifiés chez Danio rerio (D. rerio), dénotés crb1, crb2a, crb2b,
crb3a et crb3b (Omori and Malicki, 2006) et trois homologues ont été caractérisés
chez les mammifères, dénotés CRB1 (den Hollander et al., 1999), CRB2 (van den
Hurk et al., 2005, Lemmers et al., 2002) et CRB3 (Makarova et al., 2003).

L’analyse des séquences des protéines CRB a permis d’identifier deux motifs dans la
portion cytoplasmique remarquablement conservés à travers les espèces. Le premier
domaine est constitué des quatre résidus d’acides aminés C-teminaux de Crb (E-R-L-
I), qui forment un motif « PBM » (PDZ-Binding Motif), impliqué dans l’interaction
avec des protéines à domaine PDZ (PSD-95, Discs Large, ZO-1). Le second domaine
conservé forme un motif « FBM » (FERM-Binding Motif) qui permet le recrutement à
la membrane de protéines à domaine FERM (band 4.1 Ezrin Radixin Moesin) (Figure
1.5). Ces deux motifs d’interaction protéine-protéine sont essentiels aux fonctions de
Crb chez la drosophile (Klebes and Knust, 2000, Medina et al., 2002) et chez les
mammifères (Fogg et al., 2005). Néanmoins, le domaine extracellulaire de Crb
(Crbextra) peut coopérer en partie avec le domaine intracellulaire dans le maintien de la
polarité apicobasale dans l’ectoderme dorsal et les placodes trachéales (Letizia et al.,
2013). De plus, Crbextra est nécessaire à la stabilisation membranaire de Crb durant la
morphogenèse de plusieurs structures embryonnaires et adultes chez la drosophile
(Roper, 2012, Letizia et al., 2011, Pellikka et al., 2002). Chez le poisson zèbre, la
morphogenèse de la rétine nécessite une interaction homotypique des orthologues
crb2 et crb3 (Zou et al., 2012), qui semble conservée chez la drosophile puisque la
surexpression de Crbextra suffit à promouvoir l’agrégation de cellules in vitro (Letizia
et al., 2013).

L’humain possède trois orthologues de Crb, nommés CRB1, CRB2 et CRB3

(Bazellieres et al., 2009). La protéine CRB3 est exprimée dans la plupart des tissus
épithéliaux, contrairement à CRB1 et CRB2 (van den Hurk et al., 2005, den
Hollander et al., 1999) et semble fonctionner comme l’orthologue de Crb dans le
maintien de la polarité épithéliale (Fogg et al., 2005). CRB3 possède deux variants
d’épissage aux fonctions différentes. CRB3A se localise aux jonctions serrées et
soutient leurs formations (Makarova et al., 2003, Lemmers et al., 2004) alors que

17
CRB3B soutient la cytokinèse et la ciliogenèse en se localisant respectivement aux
pôles du fuseau mitotique et à la membrane du cil. Au niveau moléculaire, la
séquence de CRB3B diverge de celle de CRB3A dans la portion C-terminale et
n’encode notamment pas de motif PBM (Fan et al., 2007). Ainsi, ces données ont
suggéré le rôle prédominant de l’isoforme CRB3A dans le maintien de la polarité
épithéliale chez les mammifères (Fogg et al., 2005).

1.3.1.2 Stardust/PALS1

Les embryons de drosophile portant une mutation dans le gène stardust (sdt)
montrent une perte d’intégrité de la ZA associée à une mauvaise distribution
d’Armadillo et de la DE-cadhérine, un phénotype similaire aux embryons mutants
pour crb (Bachmann et al., 2001). Chez les mammifères, cette fonction est remplie
par PALS1 (Protein Associated with Lin Seven)(Kamberov et al., 2000, Roh et al.,
2003) qui est l’orthologue de Sdt. Sdt/PALS1 sont des protéines cytoplasmiques de la
famille MAGUK (Membrane-Associated GUanylate Kinase). Les protéines de la
famille MAGUK comportent de nombreux motifs d’interactions et fonctionnent
comme des structures d’échaffaudage cytoplasmique permettant notamment le
recrutement de protéines à la membrane apicale (Straight et al., 2001).

Dans ce cadre, Sdt/PALS1 contient un domaine PDZ qui peut interagir au domaine
PBM des protéines Crumbs (Bachmann et al., 2001, Hong et al., 2001)(Figure 1.5).
Sdt/PALS1 fonctionne au sein d’un module moléculaire avec Crumbs. En effet, chez
la drosophile, bien que des spécificités tissulaires existent dans la coopération
fonctionnelle entre ces deux protéines (Kumichel and Knust, 2014), les localisations
au pôle apical de Crb et de Sdt sont interdépendantes et essentielles au maintien de la
polarité épithéliale dans la plupart des épithéliums (Tepass and Knust, 1993, Hong et
al., 2001).

1.3.1.3 Patj/PATJ

Chez les mammifères, PATJ (Protein Associated with Tight Junctions) est une
protéine d’échaffaudage contenant un domaine L27 qui s’hétéro-oligomérise avec

18
celui de PALS1 (Lemmers et al., 2002). La protéine PATJ possède également 10
domaines PDZ qui permettent de lier directement certaines protéines des jonctions
serrées (Roh et al., 2002a)(Figure 1.5). PALS1 permet le recrutement apical de PATJ
(Roh et al., 2002b), qui promeut en retour la maturation des jonctions serrées (Shin et
al., 2005, Michel et al., 2005). Il est à noter que Patj (l’orthologue drosophile de
PATJ (Pielage et al., 2003)) est classée dans le module Crumbs, bien que ses
fonctions soient tissus-spécifiques dans les mécanismes de polarité épithéliale. En
effet, chez la drosophile, Patj n’est pas nécessaire à la mise en place de la polarité
épithéliale de l’ectoderme. De plus, les individus mutants pour Patj dépassent le stade
embryonnaire et se developpent jusqu’au stade de pupe. Néanmoins, chez l’adulte,
Patj est nécessaire à la mise en place et au maintien de la ZA dans les rétines de
drosophile, en régulant la localisation de Crb et de Sdt (Nam and Choi, 2006). Enfin,
dans l’épithélium foliculaire, la perte de Patj limite la croissance du domaine apical
induite par Crb (Penalva and Mirouse, 2012).

Figure 1.5 : Schéma de la structure du module Crumbs.

1.3.2 Régulation du module Crumbs dans la polarité
épithéliale

L’activité du module Crumbs est régulée spatialement par plusieurs modules

moléculaires permettant de confiner son activité au domaine apical. Ainsi, le module
Crumbs est au cœur d’une connexion signalétique avec d’autres modules de polarité
épithéliale (le module apical Par-6/aPKC/Cdc42 et le module basolatéral Scribble),
avec des protéines à domaine FERM-FA (Yurt et Coracle) et avec le métabolisme des
phosphoinositides. Ensemble, ces différentes régulations spatiales permettent, au
niveau cellulaire, de maintenir la polarité épithéliale (Fletcher et al., 2012).

19
 1.3.2.1 Le module apical Par-6/aPKC/Cdc42

Le module apical Par-6/aPKC/Cdc42 coopère avec le module Crumbs dans

l’établissement et le maintien de la polarité épithéliale (Nam and Choi, 2003).

Par-6 (Partitioning defective-6) est au cœur du module Par-6/aPKC/Cdc42. En effet,

Par-6 est une protéine d’échafaudage interagissant au domaine apical avec la GTPase
Cdc42 (Hung and Kemphues, 1999, Hutterer et al., 2004) et s’hétéro-oligomérise par
son domaine PB1 avec aPKC (atypical Protein Kinase C)(Hirano et al., 2005). Cette
interaction permet de contrôler les fonctions de la kinase aPKC (Graybill et al., 2012,
Yamanaka et al., 2001)(Figure 1.6).

Figure 1.6 : Schéma de la structure du module Par-6/aPKC/Cdc42.

aPKC est une sérine/thréonine kinase conservée parmi les espèces (Tabuse et al.,
1998, Wodarz et al., 2000, Joberty et al., 2000). Le contrôle spatiotemporel de
l’activité aPKC par la cellule épithéliale est crucial puisqu’il permet de réguler un
programme séquentiel dans la création de l’asymétrie membranaire (Hutterer et al.,
2004, Betschinger et al., 2003). Ainsi, aPKC possède de nombreux substrats au sein
de la cellule et participe à maintenir la localisation des modules de polarité épithéliale
à un domaine membranaire, en modifiant leurs affinités d’interactions par
phosphorylation (Horikoshi et al., 2009, Morais-de-Sa et al., 2010, Zhu et al., 2014,
Hurov et al., 2004, Gamblin et al., 2014).

Le module Crumbs permet de localiser et de restreindre l’activité aPKC au domaine

apical. En effet, chez la drosophile, les étapes précoces de la mise en place de la
polarité épithéliale nécessite d’abord le recrutement membranaire de Bazooka (Baz,
l’orthologue drosophile de PAR3 mammifère) au niveau des régions pré-

20
jonctionnelles lors de l’établissement de la formation des jonctions adhérentes
(Muller and Wieschaus, 1996, Harris and Peifer, 2004). Baz recrute en retour le
complexe Par-6/aPKC pour former le complexe jonctionnel transitoire Baz/Par-
6/aPKC, nécessaire à la maturation épithéliale. Cette association est ensuite
déstabilisée par Crb, qui entre en compétition avec la liaison Baz/Par-6 qui favorise la
phosphorylation de Baz par aPKC. Cette phosphorylation entraîne la dissociation du
complexe Baz/Par-6/aPKC (Morais-de-Sa et al., 2010) et l’exclusion de Baz du
domaine apical (Walther and Pichaud, 2010, Gula et al., 2010), favorisant ainsi le
recrutement et la restriction du complexe Par-6/aPKC au domaine apical par Crb
(Figure 1.7). Des processus similaires sont retrouvés chez C. elegans (Aceto et al.,
2006) et les mammifères, avec l’exclusion apicale de PAR-3 par CRB3 et le
complexe Par-6/aPKC (Lin et al., 2000, Joberty et al., 2000, Suzuki et al., 2001,
Horikoshi et al., 2009, Hurd et al., 2003, Izumi et al., 1998). Il est à noter que ce
processus d’exclusion de Baz/PAR3 nécessite le recrutement concomitant et
l’activation de la GTPase Cdc42 dans le complexe Par-6/aPKC, chez la drosophile
(Hutterer et al., 2004) et les mammifères (Martin-Belmonte et al., 2007, Wu et al.,
2007b, Lin et al., 2000).

La coopération entre le module Par-6/aPKC et le module Crumbs joue ultérieurement

un rôle fondamental dans la croissance du domaine apical et la morphogenèse des
tissus épithéliaux. En effet, aPKC est capable de phosphoryler Crb, permettant ainsi
en retour de stabiliser le module Crumbs au domaine apical (Sotillos et al., 2004).
Cette coopération modulaire entre aPKC et Crumbs est également essentielle dans la
morphogenèse des cellules photoréceptrices (Nam and Choi, 2003) et celle de la
trachée de drosophile (Letizia et al., 2011).

1.3.2.2 Le module basolatéral Scribble

Le module Scribble (Scrib) constitue un régulateur central de l’identité du

domaine basolatéral. Chez la drosophile, ce complexe comporte les protéines latérales
Scrib, Discs-large (Dlg) et Lethal giant larvae (Lgl). Ces trois composants agissent de
manière concertée puisqu’ils montrent une forte interaction génétique et que leurs
localisations subcellulaires sont mutuellement dépendantes (Bilder and Perrimon,

21
2000). Le module Scrib est conservé à travers les espèces puisqu’il a été identifié
chez l’humain un homologue de Scrib (hSCRIB1), 4 homologues de Dlg (hDlg,
SAP97; Dlg2, Chapsyn-110, PSD-93 ; Dlg3, NE-Dlg, SAP102 ; Dlg4, PSD-95,
SAP90) et 2 homologues de Lgl (Hugl1; Hugl2) (Assemat et al., 2008).
Fonctionnellement, la perte de scrib suffit à entraîner une délocalisation des protéines
apicales à la membrane basolatérale et une fragmentation des jonctions adhérentes,
empêchant la mise en place des jonctions septées. Ces trois protéines contiennent de
nombreux domaines d’interactions protéine-protéine qui permettent de restreindre la
localisation de Crb à la membrane apicale par un mécanisme encore incompris
(Bilder and Perrimon, 2000, Tanentzapf and Tepass, 2003, Bilder et al., 2003).

Bien qu’il n’existe pas d’interactions physiques caractérisées chez la drosophile entre
les trois membres du module, la localisation et la fonctionnalité de la protéine Lgl
dépendent de sa phosphorylation par aPKC et requiert l’exclusion de Par-6 du
domaine basolatéral (Betschinger et al., 2003, Hutterer et al., 2004, Betschinger et al.,
2005)(Figure 1.7). La phosphorylation de Lgl par aPKC permettrait son interaction
avec Dlg chez les mammifères (Zhu et al., 2014) ce qui suggère que les mécanismes
fonctionnels du module Scrib sont conservés à travers les espèces.

22
Figure 1.7 Coopération et antagonisme des modules de polarité dans la mise en
place de la polarité épithéliale. Inspiré de (Rodriguez-Boulan and Macara, 2014).
Gauche : Les protéines d’un même module se stabilisent mutuellement. De plus, le
module Crumbs (bleu) permet de stabiliser le module Par-6/aPKC/Cdc42 (vert) au
domaine apical et réciproquement (flèches vertes). En revanche, le module Par-
6/aPKC/Cdc42 exclut du domaine apical (flèches rouges) PAR3 (jaune) et le module
Scribble (violet). Droite : Résumé des structures et des interactions des différents
modules de polarité épithéliale chez la drosophile et les mammifères.

23
 1.3.2.3 Les protéines à domaine FERM

Le module Crumbs interagit également fonctionnellement avec des protéines à

domaine FERM. Les protéines à domaine FERM sont des adaptateurs cytoplasmiques
de protéines transmembranaires et constituent une famille aux fonctions hétérogènes,
et sont notamment impliquées dans la régulation de la polarité épithéliale (Tepass,
2009).

1.3.2.3.1 La protéine Yurt

Yurt (Yrt) est une protéine cytoplasmique à domaine FERM impliquée dans la
mise en place et le maintien de la polarité épithéliale (Laprise et al., 2006). En effet,
Yrt s’associe à la membrane latérale et participe au maintien de l’identité basolatérale
en inhibant localement l’activité de la kinase aPKC (Gamblin et al., 2014). Ainsi, les
embryons mutants pour yrt montrent en milieu d’embryogenèse un phénotype
similaire obtenu par une surexpression de Crb, dû à une perte d’inhibition de
l’activité aPKC au domaine latéral, avec une délocalisation des protéines apicales à la
membrane latérale (Laprise et al., 2006). Néanmoins, les fonctions de Yrt sur Crb en
fin d’embryogenèse restent incertaines dans le contrôle de la taille du domaine apical.
En effet, les embryos mutants pour yrt parviennent ensuite à ségréger à nouveau les
marqueurs apicaux à la membrane apicale (Laprise et al., 2009). Dans ce cadre, Yrt
s’enrichie aux jonctions septées et participe à leurs fonctionnalités mais colocalise
également avec Crb dans la zone marginale au domaine apical (Figure 1.8). Chez les
mammifères, les orthologues humains de Yrt, notamment Ehm2 (Expressed in high
metastatic cells 2), interagissent in vitro via leurs domaines FERM avec les protéines
CRB (Laprise et al., 2006) mais le rôle fonctionnel de cette interaction dans le
maintien de la polarité épithéliale n’est pas déterminé.

1.3.2.3.2 La protéine Coracle

Coracle (Cora) est une protéine cytoplasmique à domaine FERM enrichie au

domaine basolatéral (Fehon et al., 1994) et joue le rôle de protéine adaptatrice
cytoplasmique de la Neurexine-IV (Nrx-IV) (Ward et al., 1998), une protéine

24
transmembranaire impliquée dans la morphogénèse des jonctions septées
(Baumgartner et al., 1996). Dans ce cadre, la localisation de la Nrx-IV et de Cora sont
interdépendantes et permettent d’orchestrer la formation des jonctions septées
(Genova and Fehon, 2003). En plus de ses fonctions structurales, Cora est impliqué
dans l’inhibition de la machinerie apicale de manière redondante avec Yrt en milieu
d’embryogenèse (Laprise et al., 2009). La compréhension des fonctions de Cora en
relation avec sa structure est limitée. En effet, Cora fait partie de la famille des
protéines à domaine FERM, caractérisée par un domaine FERM dans sa partie N-
terminale et un domaine de liaison à l’actine dans sa partie C-terminale. Cependant,
Cora ne possède pas de domaine de liaison à l’actine, suggérant que cette protéine ne
peut pas interagir avec le cytosquelette d’actine (Fehon et al., 1994). Ainsi, les
mécanismes en aval de Cora permettant de soutenir l’inhibition de Crb et la formation
des jonctions septées, ainsi que ses fonctions dans la morphogenèse des tissus
épithéliaux ne sont pas identifiés (Figure 1.8).

25
Figure 1.8 : Régulation des fonctions de Crb par les protéines Yrt et Cora. Yrt et
Cora participent à la fonctionnalité des jonctions septées et participent au maintien de
la polarité épithéliale en inhibant de manière redondante les fonctions de Crb au
domaine apical en milieu d’embryogenèse. En fin d’embryogenèse, Yrt colocalise
avec Crb, mais le rôle de cette interaction sur les fonctions de Crb n’est pas
déterminé. La protéine Cora se localise exclusivement aux jonctions septées et inhibe
les fonctions de Crb par un mécanisme inconnu.

26
 1.3.2.4 Le métabolisme des phosphoinositides

Le module Crumbs contrôle également le métabolisme des phosphoinositides.

Les phosphoinositides sont des phospholipides impliqués dans le contrôle de
nombreux processus cellulaires, notamment le trafic vésiculaire et le remodelage du
cytosquelette, en participant à définir une identité membranaire (Di Paolo and De
Camilli, 2006). La cellule épithéliale présente une composition lipidique
membranaire asymétrique, avec notamment un domaine apical enrichi en
phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) et un domaine basolatéral enrichi en
phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PIP3) (Shewan et al., 2011).
Fonctionnellement, la phosphorylation des phosphoinositides crée des motifs
d’interactions lipide-protéine capables de recruter des protéines cytoplasmiques à la
membrane. Ainsi, le maintien de l’asymétrie lipidique joue un rôle crucial dans
l’identité membranaire, puisque l’introduction exogène de PIP3 à la membrane
apicale suffit à initier la relocalisation de protéines basolatérales au pôle apical
(Gassama-Diagne et al., 2006).

De manière intéressante, la phosphatase PTEN (Phosphatase and TENsin homolog),

catalysant la formation de PIP2 à partir de PIP3, est recrutée à la membrane par Baz
dans les étapes précoces de la mise en place de la polarité épithéliale et permet de
limiter la quantité de PIP3 au pôle apical (von Stein et al., 2005). Ce processus est
essentiel à la mise en place de l’asymétrie cellulaire puisqu’il permet d’activer en aval
la GTPase Cdc42 et de stimuler l’activation du complexe Par-6/aPKC (Martin-
Belmonte et al., 2007). D’autre part, la formation de PIP3 est catalysée par la
phosphoinositide 3-kinase (PI3K), dont les fonctions sont promues au domaine
basolatéral par l’activité de la GTPase Rac1 et Akt (Watton and Downward, 1999). Il
est important de noter que l’activité Rac1 est inhibée au domaine apical par le module
Crb dans l’ectoderme de drosophile, limitant ainsi la formation de PIP3 au domaine
apical et permettant de ce fait d’affiner l’identité membranaire de la cellule épithéliale
(Figure 1.9)(Chartier et al., 2011). Néanmoins, les mécanismes moléculaires
permettant l’inhibition réciproque spatiale de Crb sur Rac1 n’ont pas été identifiés.

27
Figure 1.9 : Régulation réciproque du module de Crumbs par le métabolisme
des phosphoinositides. Le module PI3K/Rac1 permet l’enrichissement en PIP3
(violet) de la membrane basolatérale, qui participe à raffiner l’identité du domaine
basolatéral. La fonction de ce module est inhibée au domaine apical par le module
Crumbs, qui participe à l’identité du domaine apical, enrichi en PIP2 (bleu).

28
 1.4 Fonction et régulation de Crb dans la morphologie
cellulaire et tissulaire.

Nous avons vu que Crb est un acteur central dans la mise en place d’une
asymétrie cellulaire, soutenue essentiellement par son domaine PBM (Wodarz et al.,
1995). De plus, Crb possède un domaine FBM qui permet ensuite de garantir la
formation et le maintien architectural des épithéliums. Ainsi, la modulation des
fonctions de Crb devient cruciale pour la morphogenèse des tissus épithéliaux.

1.4.1 Fonction de Crb dans la morphologie cellulaire et

tissulaire.

Crb permet de contrôler directement la morphologie des cellules et des tissus

par l’intermédiaire de son domaine FBM. En effet, ce domaine est capable de recruter
au domaine apical plusieurs régulateurs de la morphologie cellulaire, notamment des
protéines à domaine FERM (Laprise et al., 2006, Medina et al., 2002, Robinson et al.,
2010). Parmi elles, on retrouve d’abord les protéines de la famille ERM (Ezrin,
Radizin, Moesin). Ces protéines sont des adaptateurs cytoplasmiques qui permettent
de lier mécaniquement des protéines transmembranaires au cytosquelette sous-jacent.
Néanmoins, les mécanismes leur permettant de modifier la morphologie épithéliale ne
sont pas définis. Cependant, il a été suggéré que ces protéines permettraient de
réorganiser localement le cytosquelette en modulant l’activité de GTPases (Fehon et
al., 2010). Parmi les protéines de la famille ERM, la drosophile encode uniquement la
Moésine (Tepass, 2009), qui coopère avec Crb dans l’organisation du cytosquelette
apical (Medina et al., 2002, Letizia et al., 2011).

La coopération des protéines Crb et des protéines ERM est essentielle pour la
morphogenèse des tissus épithéliaux. En effet, la perte de la Moésine chez la
drosophile désorganise l’architecture des cellules photoreceptrices sans affecter de
manière drastique la polarité épithéliale de ces cellules (Pellikka et al., 2002,
Karagiosis and Ready, 2004) et entraîne des défauts de formation de la trachée
(Letizia et al., 2011) et des glandes salivaires embryonnaires (Kerman et al., 2008). Il
est intrigant de noter que la coopération fonctionnelle entre Crb et les protéines ERM

29
est retrouvée chez les mammifères, puisque les défauts tissulaires observés chez les
souris knock-out pour Crb3 phénocopient en partie ceux de la perte de l’Ezrine
(Whiteman et al., 2014). Néanmoins, la fonction exacte de la Moésine sur le
cytosquelette reste énigmatique puisque la régulation de ses fonctions sur les
GTPases est contextuelle. En effet, chez la drosophile, l’activité de la Moésine et
celle de la GTPase RhoA sont impliquées dans une inhibition fonctionnelle
réciproque (Speck et al., 2003) alors que chez les mammifères, l’activité de la
GTPase RhoA promeut l’activation des protéines ERM (Matsui et al., 1999).

1.4.2 Régulation de Crb dans la morphologie cellulaire et

tissulaire.

Les régulateurs moléculaires des fonctions de Crb dans la polarité épithéliale

ont également des fonctions dans le maintien de la morphologie cellulaire et
tissulaire.

La perte de la protéine Cora suffit à provoquer des anomalies de fermeture dorsale, de

maturation des glandes salivaires et de la trachée (Lamb et al., 1998, Ward et al.,
2001). Similairement, la perte de Yrt chez la drosophile produit des défauts de
morphogenèse des tissus épithéliaux (Hoover and Bryant, 2002) qui peuvent être
corrigés en partie dans l’ectoderme en diminuant les fonctions de Crb (Laprise et al.,
2006). Chez les mammifères, la surexpression d’Ehm2, un des deux orthologues de
Yrt, suffit à promouvoir l’activation de la p114RhoGEF, une GEF de RhoA recrutée
aux jonctions serrées par PATJ, et à induire une constriction apicale des cellules
épithéliales (Nakajima and Tanoue, 2012). De manière intéressante, CRB3 interagit
avec Ehm2 (Laprise et al., 2006). Cependant, le rôle de cette interaction dans le
contrôle de la morphologie cellulaire n’a pas été établi.

On retrouve également l’implication du dialogue réciproque entre le module Crumbs

et l’activité Rac1 dans le contrôle de la morphogenèse des tissus épithéliaux. En effet,
celui-ci permet de garantir l’intégrité structurale des cellules photoréceptrices
(Chartier et al., 2012, Pinal et al., 2006) et la morphogenèse de l’amnioserosa chez la
drosophile (Harden et al., 2002).

30
 1.4.3 Modulation de la fonction de Crb dans la
morphogenèse des tissus épithéliaux.

Les protéines de polarité épithéliale assurent la fonction et le maintien de

l’architecture du tissu épithélial. Néanmoins, dans certaines étapes du développement,
comme pendant la gastrulation, ou la réparation des tissus adultes, les cellules
épithéliales doivent perdre de manière transitoire leurs caractéristiques épithéliales,
pour assurer leurs migrations dans un autre compartiment anatomique de l’organisme.
Dans ce cadre, la cellule épithéliale polarisée peut physiologiquement réprimer
l’activité de ses modules de polarité épithéliale en réponse à l’activation de
programmes développementaux (Figure 1.10). Ainsi, des défauts de contrôle de ce
processus sont à l’origine de pathologies chez l’Homme, notamment le cancer.

Figure 1.10 : Le programme de polarité épithéliale limite les propriétés invasives

des cellules épithéliales. La polarité épithéliale assure le maintien de l’architecture
cellulaire et inhibe la migration et la prolifération des cellules épithéliales. La perte
des caractéristiques épithéliales s’accompagne d’une augmentation des capacités
invasives des cellules épithéliales. Dans certains cancers, ce processus est détourné
par les cellules tumorales pour promouvoir leurs agressivités.

1.4.3.1 Modulation transcriptionnelle des fonctions de Crb

Il existe un lien étroit entre la régulation transcriptionnelle des modules de

polarité épithéliale et la morphogenèse des tissus épithéliaux. En effet, de la
drosophile à l’humain, pendant la gastrulation, un programme développemental
déclenche une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) des cellules épithéliales

31
dans une région contrôlée de l’embryon. Ce processus modifie la morphologie et le
« comportement épithélial » de ces cellules et permet d’aboutir à l’établissement des
trois feuillets embryonnaires (El-Mallawany et al., 2012). Ce mécanisme repose sur
un ensemble de facteurs de transcription conservés à travers les espèces, notamment
Snail (Alberga et al., 1991, Carver et al., 2001). Chez les mammifères, Snail réprime
notamment la transcription du gène CRB3, qui engendre en retour une perte de la
morphologie épithéliale (Whiteman et al., 2008).

L’étude de la modulation transcriptionnelle des protéines de polarité est

particulièrement importante pour la santé humaine. En effet, l’expression des
protéines de polarité est souvent dérégulée dans les cancers, un phénomène qui peut
être attribué à une activation ectopique de l’EMT (Moreno-Bueno et al., 2008). De
plus, la progression tumorale s’associe à une perte des caractéristiques épithéliales et
à une augmentation des propriétés invasives et métastatiques des cellules (Wodarz
and Komarova, 2007). Ainsi, certaines cellules tumorales régulent négativement
l’activité des promoteurs de gènes de la E-cadhérine, CRB3 et PATJ (Aigner et al.,
2007) et la réintroduction de l’expression de ces acteurs clé de la polarité épithéliale,
notamment CRB3 (Karp et al., 2008), est capable de limiter les propriétés
mésenchymateuses acquises par les cellules tumorales (Whiteman et al., 2008). Ainsi,
le module Crb joue un rôle décisif dans le maintien de l’homéostasie des épithéliaux
en limitant l’EMT. C’est pourquoi, la caractérisation des sentiers signalétiques en
aval du module Crb dans le contrôle de la morphogenèse des tissus est cruciale dans
la compréhension des processus cellulaires épithéliaux dérégulés dans les carcinomes.

1.4.3.2 Modulation contextuelle des fonctions de Crb

Plusieurs régulateurs de la polarité épithéliale sont des suppresseurs de

tumeurs et sont étroitement liés à la régulation de voies contrôlant la prolifération et
la croissance cellulaire, telles que JNK ou Hippo (Bunker et al., 2015). Ainsi, des
défauts de la polarisation apicobasale peuvent s’associer à une modulation des
sentiers de différenciation ou d’apoptose (Andersen et al., 2015). Les protéines
Crumbs sont directement en amont de plusieurs voies de signalisation impliquées
dans le développement et le renouvèlement des tissus adultes, notamment Notch et

32
Hippo (Herranz et al., 2006, Chen et al., 2010, Ling et al., 2010, Robinson et al.,
2010, Richardson and Pichaud, 2010). De manière surprenante, bien que le domaine
extracellulaire de Crb ne semble pas avoir de fonction dans le maintien de la polarité
épithéliale, il pourrait jouer un rôle décisif dans la morphogenèse des tissus
épithéliaux. En effet, chez la drosophile, le contrôle de la voie Notch nécessite le
domaine extracellulaire de Crb pour réguler la croissance et l’organisation des tissus
épithéliaux en prolifération (Herranz et al., 2006), une fonction qui semble conservée
pour l’orthologue humain CRB2 (Mitsuishi et al., 2010). D’autre part, Crb est
également en amont de la voie Hippo (Grzeschik et al., 2010), une voie de
signalisation anti-proliférative régulée par la densité cellulaire (Gumbiner and Kim,
2014), une fonction qui semble remplie par CRB3A chez les mammifères (Varelas et
al., 2010).

Ces observations ont proposé l’existence d’un mécanisme sensitif membranaire

permettant de limiter la prolifération des cellules épithéliales polarisées. Il a
notamment été suggéré que la protéine Crb, correctement localisée au domaine apical
par le programme de polarité épithéliale, pourrait transduire un signal de densité
cellulaire par l’intermédiaire de son domaine extracellulaire. En effet, chez la
drosophile, Crb est capable de s’enrichir sur les bordures membranaires riches en Crb
(Hafezi et al., 2012, Roper, 2012). Cette localisation hétérogène requiert le domaine
extracellulaire de Crb (Letizia et al., 2013) et semble jouer un rôle crucial dans la
morphologie des cellules photoréceptrices de la drosophile (Pellikka et al., 2002) et
pourrait prévenir leurs dégénérescences (Johnson et al., 2002). Ainsi, Crb pourrait
être impliquée dans une interaction homotypique contrôlant la morphogenèse des
tissus épithéliaux (Figure 1.11).

Chez les vertébrés, le domaine extracellulaire des protéines CRB pourrait également
jouer un rôle fondamental dans le contrôle de leurs fonctions. En effet, les isoformes
crb2 et crb3 sont impliqués dans une interaction homotypique chez le poisson-zèbre
(Zou et al., 2012). Néanmoins, aucune interaction homotypique des protéines CRB
n’a encore été mis en évidence chez les mammifères. En effet, le domaine
extracellulaire de CRB3A est très court et n’est pas conservé à travers les espèces

33
(Makarova et al., 2003). Ainsi, aucun domaine fonctionnel n’a pu être caractérisé sur
la portion extracellulaire de CRB3A sauf un site de N-glycosylation dont la fonction
reste encore indéterminée (Makarova et al., 2003).

Figure 1.11 : Régulation de la fonction des protéines Crb par interaction

homotypique. Les domaines extracellulaires des protéines Crb pourraient interagir de
manière homotypique au domaine apical pour réguler la prolifération cellulaire et
participer à la morphogenèse des tissus épithéliaux.

34
 1.5 Un modèle de morphogenèse des tubules
épithéliaux, le développement de la trachée
embryonnaire de drosophile

L’intrication des signalisations des modules de polarité épithéliale permet une

régulation fine de leurs activités respectives et permet de moduler la morphologie
épithéliale pendant le développement. Les tissus épithéliaux sont capables de bâtir
des structures tridimensionnelles en forme de tubes (ex : tubules rénaux, bronchioles
pulmonaires, duodénum) dont les paramètres morphométriques (ex : longueur,
diamètre) doivent être contrôlés pour assurer leurs fonctions. Cependant, la
compréhension des mécanismes cellulaires permettant de définir ces paramètres
tissulaires reste peu étendue.

Chez les vertébrés, l’analyse de ces phénomènes tissulaires est complexe. En effet,
leurs génomes comportent de nombreuses duplications de gènes, nécessitant
d’évaluer la contribution de chaque paralogue dans la morphogenèse d’un tissu. C’est
pourquoi, l’utilisation d’un modèle génétique simple comme la drosophile est
justifiée. En effet, nous avons vu que la structure et la fonction de ces acteurs sont
conservées à travers les espèces, et que le développement des épithéliums de la
drosophile et de l’humain partage de nombreux processus communs. Parmi eux,
l’embryon de drosophile forme des architectures épithéliales complexes, notamment
des tubes épithéliaux, dont les paramètres morphologiques doivent être contrôlés pour
assurer leurs fonctionnalités. Dans cette section, je présenterais le modèle de la
trachée embryonnaire de la drosophile et les mécanismes liés à sa morphogenèse,
dont la compréhension est importante pour le projet présenté dans les chapitres 2 et
3 de ce manuscrit.

1.5.1 Généralités sur le modèle de la drosophile

La drosophile est un diptère à métamorphose complète qui se distingue par un

stade larvaire et un stade pupe. Le cycle de vie de la drosophile est dépendant de la
température et dure environ 3 semaines à 18˚C et 10 jours à 25˚C. La drosophile

35
femelle adulte de 4-7 jours peut déjà pondre 50 à 70 œufs/jour. Les œufs sont enrobés
d’un chorion qui recouvre une membrane vitelline, directement adjacente à la
membrane de l’oocyte. Les œufs fécondés vont progresser à travers 17 stades
embryonnaires puis 3 stades larvaires, avec des évènements morphogénétiques
associés pour chacun d’entre eux.

Succinctement, après la fécondation, le noyau subit 9 divisions synchrones au centre

de l’embryon qui donne lieu à un syncytium (stade 1-3). Ces noyaux vont ensuite
migrer en périphérie de l’embryon et subir 4 nouvelles divisions pour former le
blastoderme syncytial (stade 4). La cellularisation (stade 5) est un phénomène
complexe qui consiste en l’invagination synchrone de la membrane plasmique autour
de chaque noyau périphérique du syncytium, permettant ainsi l’apparition de cellules
individualisées à un seul noyau. Ce processus est suivi de la gastrulation (stades 6 à
10) qui met en place les 3 feuillets embryonnaires. L’organogénèse (stades 11 à 13)
englobe les étapes du développement permettant d’ébaucher les structures larvaires.
Enfin, la différenciation terminale (stades 14 à 17) achève la morphogenèse des tissus
embryonnaires et se conclut avec l’éclosion. La larve va ensuite progresser à travers
trois stades pendant lesquels des populations cellulaires épithéliales se structurent en
saccules appelés disques imaginaux. À la fin du 3e stade larvaire, la larve entame sa
pupation. Pendant cette dernière phase, l’insecte va se débarrasser de la majeure
partie de ses structures larvaires puisque les structures anatomiques adultes émergent
de la différenciation de l’ensemble des disques imaginaux (ex : disque imaginal de
l’œil, disque imaginal de l’aile) développés pendant le stade larvaire de l’animal.

La drosophile est un modèle animal dont les manipulations génétiques sont rendues
aisées par le développement d’outils, comme le système UAS-GAL4 (Figure 1.12).
Ce procédé permet l’expression d’un transgène dans un tissu spécifique (Brand and
Perrimon, 1993). Il repose sur le croisement de deux lignées de mouches
transgéniques. La première lignée apporte le driver, c’est-à-dire un transgène
encodant le facteur de transcription de levure GAL4 sous le contrôle d’un promoteur
drosophile tissu-spécifique. La seconde lignée porte un transgène contenant le gène à
exprimer, sous le contrôle d’une séquence activatrice UAS (Upstream Activation

36
Sequence). Ainsi, la descendance des deux lignées exprime dans un tissu spécifique,
sélectionné par le driver, le facteur GAL4 qui lie la séquence UAS et active
l’expression du transgène. Ce système est particulièrement puissant pour étudier la
fonction de gènes dans le développement.

Figure 1.12 : Schéma du système UAS-GAL4. L’expression tissu-spécifique de la

protéine X (Prot X) est obtenue chez la descendance d’un croisement de deux
lignées : 1) une lignée encodant le facteur de transcription Gal4 (G4) sous le contrôle
d’un promoteur de drosophile tissu-spécifique (Promot) et de 2) une lignée encodant
le transgène à exprimer (Gène X) sous le contrôle des séquences UAS.

1.5.2 Anatomie de la trachée embryonnaire de drosophile

L’arbre respiratoire de la drosophile est constitué en fin d’embryogénèse d’un

réseau élaboré de tubes épithéliaux permettant d’effectuer les échanges gazeux chez
la larve (Figure 1.13). Il est formé principalement de deux tubes parallèles qui suivent
l’axe antéropostérieur dans la partie dorsale de l’embryon. Ces troncs dorsaux
débouchent sur le milieu extérieur dans la partie postérieure de l’animal au niveau des
spiracles. Ces troncs dorsaux se segmentent perpendiculairement à deux types de
branches secondaires, les branches dorsales -qui parcourent la partie dorsale de
l’embryon- et les troncs connectifs dans la partie ventrale, qui se scindent à leur tour
en branches viscérales et en branches latérales. À l’extrémité de ces branches
secondaires, des cellules terminales se ramifient ultimement dans l’ensemble du corps
de l’embryon.

37
La nature de la structure des tubes épithéliaux varient selon le type de branche
considéré. Les troncs dorsaux sont formés de plusieurs cellules épithéliales qui
partagent une lumière commune. Les branches secondaires sont constituées de
plusieurs cellules placées de manière adjacente qui établissent chacune des jonctions
autocellulaires. Enfin, les cellules terminales sont caractérisées par de longues
protrusions cytoplasmiques contenant de nombreux tubes intracellulaires. Ensemble,
cette structure ramifiée permet d’acheminer l’oxygène dans l’ensemble du corps de la
larve.

1.5.3 Morphogénèse initiale de la trachée de drosophile

La morphogénèse de la trachée résulte d’un ensemble coordonné de processus

génétique, signalétique et mécanique. Elle débute en fin de gastrulation (Stade 10)
avec la mise en place de 10 paires de fosses trachéales (« tracheal pits ») dans les
parties latérales de l’embryon (Figure 1.13). Ces fosses trachéales sont des plaques
ectodermiques d’environ 80 cellules qui s’invaginent de manière synchrone le long de
la bande germinale par un phénomène de constriction apicale (Llimargas and
Casanova, 1999) pour former des cavités sphériques au stade 11. Au stade 12, ces
structures sont exposées à plusieurs gradients signalétiques diffus, notamment le
ligand Branchless reconnu par le récepteur trachée-spécifique Breathless (Btl)
(Reichman-Fried et al., 1994), qui initient la formation des différentes branches au
sein du sac épithélial (Sutherland et al., 1996, Llimargas, 2000, Chihara and Hayashi,
2000, Vincent et al., 1997). On distingue ainsi l’apparition d’un bourgeon dorsal et
ventral au sein de la fosse trachéale, les structures précurseurs des branches dorsales
et des troncs dorsaux ainsi que des branches viscérales et latérales respectivement.
Les ébauches des troncs dorsaux élaborées par les fosses trachéales s’allongent et
fusionnent en un tube unique sur l’axe antéropostérieur au stade 13 en faisant appel à
un processus d’intercalation des cellules (Samakovlis et al., 1996) (Figure 1.13),
permis par un réarrangement dynamique des jonctions cellulaires (Tanaka-Matakatsu
et al., 1996, Lee and Kolodziej, 2002, Shaye et al., 2008). Les fosses trachéales se
referment au stade 14 ce qui permet la mise en place d’un réseau interne de tubes qui
continuent de se ramifier jusqu’à la fin de l’embryogénèse.

38
Alors que les étapes précoces de la morphogénèse de la trachée reposent sur une
signalisation cellulaire « classique », basée sur le chimiotactisme associé à un
remodelage des jonctions cellulaires des cellules trachéales, le contrôle du diamètre et
de la longueur de la trachée repose de manière importante sur le contenu moléculaire
de la lumière formée. En effet, les protéines Piopio et Dumpy commencent à être
exprimées et secrétées dès le stade 11 et participent - depuis la lumière trachéale- à la
ramification des troncs dorsaux en contrôlant la formation des jonctions
autocellulaires (Jazwinska et al., 2003). Il est à noter que l’élongation des troncs
dorsaux est continue tout au long de l’embryogénèse alors que l’augmentation du
diamètre de la trachée s’effectue uniquement pendant le stade 15, ce qui suggère que
les contrôles de la longueur et du diamètre de la trachée obéissent à des évènements
morphogénétiques distincts.

Figure 1.13 : Anatomie et morphogenèse de la trachée de drosophile.

Immunofluorescence d’embryons de drosophile marqués par Crumbs (Crb) et Chitin-
Binding Protein (CBP). Voir le texte pour l’explication des étapes de la
morphogenèse de la trachée. Légende : TP: Tracheal Pits, TC : Tronc connectif, TD :
Tronc dorsal, BD : Branche dorsale, Bv : Branche viscérale, Bl : Branche latérale, sp :
spiracle. Par simplicité, il est à noter qu’on acquiert en microscopie confocale
uniquement une des deux parties latérales de l’embryon, ne laissant ainsi transparaître
en imagerie qu’un seul tronc dorsal associé à ses différentes ramifications.

39
 1.5.4 Contrôle du diamètre de la trachée embryonnaire

L’extension du diamètre de la trachée réalisée lors du stade 15 est précédée de

l’organisation d’un réseau moléculaire complexe dans la lumière trachéale jouxtant la
membrane apicale des cellules trachéales, la taenidia. Le dépôt des constituants de
cette architecture extracellulaire est réalisé par les cellules trachéales qui
entretiennent une forte activité exocytique pendant le stade 14 (Tsarouhas et al.,
2007). Ces facteurs protéiques permettent l’assemblage d’un réseau extracellulaire
apical, basé sur la chitine, essentiel au processus d’extension du diamètre de la
trachée (Tonning et al., 2005, Araujo et al., 2005, Moussian et al., 2006). Plusieurs
facteurs sécrétés à domaines de liaison à la chitine ont été identifiés, notamment
Obst-A (également appelé « 2A12 ») et leurs défauts de sécrétion entraînent des
défauts d’extension de la trachée (Tiklova et al., 2013). Cependant, le mécanisme
d’action de la chitine et de ses ligands sur le contrôle du diamètre de la trachée reste
discuté.

La mise en place de la taenidia s’accompagne d’un réarrangement du cytosquelette

des cellules trachéales (Tonning et al., 2005). Pendant la dilatation du tube,
l’épaisseur des cellules trachéales au sein du tube diminue et permet de multiplier le
diamètre de la lumière par 3 sans modifier le diamètre total de la trachée. Ce
changement morphologique cellulaire est concomitant à un remodelage du pôle apical
des cellules trachéales (Beitel and Krasnow, 2000) et soutient l’idée d’un couplage
entre la croissance du domaine apical et les propriétés mécaniques de la matrice
extracellulaire de chitine (Dong et al., 2014).

1.5.5 Contrôle de la longueur de la trachée embryonnaire

L’élongation de la trachée est continue durant l’embryogénèse et est régulée

par au moins deux voies de contrôles distinctes.

La première voie fait intervenir la matrice extracellulaire apicale. En effet, au stade

15, les cellules trachéales sécrètent dans la lumière trachéale deux enzymes,
Vermiform (Verm) et Serpentine (Serp) qui pourraient moduler les propriétés

40
mécaniques de la chitine en la convertissant en chitosan par N-désacétylation
(Christodoulidou et al., 1999). La sécrétion de ces enzymes limite l’élongation de la
trachée par un mécanisme qui reste à être élucidé (Luschnig et al., 2006, Dong et al.,
2014). De manière surprenante, la sécrétion apicale de ces deux désacétylases requiert
l’intégrité fonctionnelle des jonctions septées (Wang et al., 2006b). En effet, des
défauts des composants structurels de ces structures (Lamb et al., 1998, Paul et al.,
2003, Genova and Fehon, 2003, Llimargas et al., 2004, Wu et al., 2004, Wu et al.,
2007a, Behr et al., 2003, Nelson et al., 2010, Laprise et al., 2010), ou des composants
signalétiques nécessaires à leur formation (Nilton et al., 2010) mènent à des défauts
de sécrétion de ces deux facteurs et allongent la trachée embryonnaire. Cependant, les
mécanismes reliant l’intégrité structurale des jonctions septées et la sécrétion apicale
de ces deux facteurs ne sont pas connus.

La seconde voie est indépendante de la sécrétion des facteurs extracellulaires Verm et

Serp et fait intervenir le contrôle de la polarité épithéliale. En effet, la surexpression
de Crb ou la réduction de Yrt dans les cellules trachéales suffit à promouvoir
l’élongation de la trachée (Laprise et al., 2010). Ces données suggèrent que la
régulation de l’activité du module Crb tient un rôle central dans la tubulogenèse
épithéliale, en contrôlant la taille du domaine apical des cellules trachéales.

41
 Objectifs

Parmi les machineries moléculaires soutenant la polarité épithéliale, la

protéine Crb a été caractérisée pour son rôle essentiel dans la mise en place du
domaine apical dans les cellules épithéliales. De plus, Crb joue un rôle majeur dans le
contrôle de la morphologie cellulaire et des tissus épithéliaux. Néanmoins, les
mécanismes signalétiques impliqués en aval dans ces deux phénomènes restent peu
définis. C’est pourquoi, la caractérisation moléculaire des fonctions de Crb, et de
leurs régulations au niveau cellulaire et tissulaire, est d’abord centrale dans le
raffinement de nos connaissances en biologie développementale, sur le rôle de la
polarité épithéliale associée au développement des tissus épithéliaux, puis en santé
humaine, pour définir de nouveaux axes thérapeutiques dans les pathologies liées à
des dysfonctionnements de ces processus, notamment le cancer.

Ainsi, l’objectif central de mon doctorat est de poursuivre la caractérisation du

couplage entre l’activité Crb et le contrôle de la morphologie des tissus épithéliaux
(Figure 1.14).

Figure 1.14 : Schéma de description du projet.

42
Le contrôle des fonctions de Crb est déterminant pour l’homéostasie des tissus
épithéliaux et la morphogenèse des tubes épithéliaux. C’est pourquoi, la
caractérisation de la régulation des fonctions de Crb dans un contexte tridimensionnel
est fondamentale dans la compréhension des mécanismes de morphogenèse des tissus
épithéliaux. Le module Crb participe à l’allongement des tubules épithéliaux chez la
drosophile. Lors de la mise en place de la polarité épithéliale, Crb est régulée
négativement par la GTPase Rac1 par un mécanisme inconnu. Ainsi, l’antagonisme
fonctionnel cellulaire de ces deux modules pourrait être fondamental dans les
mécanismes de tubulogenèse.

Chez les mammifères, les cellules tumorales d’origine épithéliale subissent des
changements morphologiques liés à la répression du programme épithélial. De plus,
la ré-expression de la protéine CRB3A dans les cellules tumorales permet de limiter
leurs propriétés mésenchymateuses par un mécanisme qui reste à être identifié. Dans
ce cadre, la réintroduction de CRB3A pourrait stimuler les sentiers signalétiques
impliqués dans la morphologie épithéliale soutenus in vivo par CRB3A. La fonction
du domaine extracellulaire de CRB3A est inconnue. Ainsi, le domaine extracellulaire
de CRB3A pourrait être impliqué dans une interaction homotypique qui pourrait être
déterminante pour les fonctions de CRB3A dans le contrôle de la prolifération d’un
épithélium.

Ainsi, nous nous sommes fixés plusieurs objectifs :

1) Caractériser le rôle de la GTPase Rac1 dans le contrôle des fonctions de Crb

dans la trachée de drosophile (Chapitre 2).
2) Mettre en évidence une interaction homotypique du domaine extracellulaire
de CRB3A (Chapitre 3).
3) Définir les mécanismes cellulaires stimulés par la réintroduction de la protéine
CRB3A dans des cellules tumorales humaines d’origine épithéliale (Chapitre
4 et Annexe 1).

43
 Chapitre 2 :

Rac1 controls epithelial tube length through the apical

secretion and polarity pathways

44
 2.1 Avant-propos

Ce chapitre traite des mécanismes signalétiques contrôlés par Crb dans la

morphogenèse des tissus en trois dimensions. François Chartier a réalisé les
expériences préliminaires en notant un allongement de la trachée chez les embryons
exprimant le dominant négatif Rac1N17, qui peut être corrigé en partie par la
diminution du dosage de crb. J’ai pu confirmer ces expériences et conduire ensuite
l’intégralité des expériences présentées dans ce chapitre. Helori-Mael Gaudé a produit
et validé l’anticorps Crb qui a été utilisé en immunofluorescence dans les figures 2.2
et 2.3. Enfin, j’ai réalisé l’ensemble des figures de cette section et fourni la première
version du manuscrit. Patrick Laprise a supervisé l’ensemble des travaux et finalisé
l’article présenté dans ce chapitre.

Ces travaux ont fait l’objet d’une publication acceptée le 27 novembre 2015 dans la
revue Biology Open, dans laquelle je suis le premier auteur et disponible en annexe 2.

2.2 Résumé

Les paramètres morphométriques des tubes épithéliaux sont fondamentaux

pour la physiologie et le maintien de l’homéostasie des organes. De plus, des défauts
de taille des tubes biologiques sont à l’origine de nombreuses pathologies humaines.
Dans ce cadre, nous montrons que Rac1 limite l’élongation de la trachée
embryonnaire de drosophile en promouvant l’endocytose Rab5-dépendante du
déterminant apical Crumbs (Crb). Rac1 est également impliqué dans une boucle de
rétro-action positive avec la protéine de jonctions septées (SJ) Coracle (Cora). Ainsi,
Rac1 contribue au contrôle de la sécrétion par les SJ des enzymes modificatrices de
chitine Vermiform (Verm) et Serpentine (Serp), qui restreignent la longueur du tube
épithélial indépendamment de Crb. En définitive, Rac1 est un composant majeur de
deux sentiers signalétiques contrôlant la morphogenèse des tubes épithéliaux.

45
 2.3 Abstract

The morphometric parameters of epithelial tubes are critical to the physiology and
homeostasis of most organs. In addition, many human diseases are associated with
tube-size defects. Here, we show that Rac1 limits epithelial tube elongation in the
developing fly trachea by promoting Rab5-dependent endocytosis of the apical
determinant Crumbs. Rac1 is also involved in a positive feedback loop with the
septate junction protein Coracle. Thereby, Rac1 precludes paracellular diffusion and
contributes to the septate junction-dependent secretion of the chitin-modifying
enzymes Vermiform and Serpentine, which restrict epithelial tube length
independently of Crumbs. Thus, Rac1 is a critical component of two important
pathways controlling epithelial tube morphogenesis.

2.4 Introduction

Epithelial tubes sustain gas, nutrient and waste exchange to maintain the
homeostasis of metazoan tissues. Elucidating the molecular mechanisms specifying
tube dimension is essential, as several human pathologies result from tube-size
defects. The dorsal trunks of the Drosophila tracheal system have emerged as a key in
vivo model to study size control in multicellular tubular structures (Zuo et al., 2013).
Development of dorsal trunks with a precise length and caliber require the assembly
of a transient chitin-based luminal extracellular (Tonning et al., 2005, Tsarouhas et
al., 2007, Zuo et al., 2013). The secreted chitin-modifying enzymes Vermiform
(Verm) and Serpentine (Serp) modulate the mechanical properties of this matrix,
thereby preventing tube over-elongation (Devine et al., 2005, Dong et al., 2014,
Wang et al., 2006b, Luschnig et al., 2006). Mutations affecting many components of
the septate junction (SJ—a ladder-like structure precluding transepithelial diffusion)
prevent secretion of Verm and Serp, and result in dorsal trunk lengthening (Wu et al.,
2007a, Wang et al., 2006b). Hence, identification of the pathways controlling Verm
and Serp trafficking downstream of SJ is an outstanding puzzle to be solved in
delineating the molecular mechanisms regulating epithelial tube morphogenesis.

46
 In the fly respiratory system, tube size is defined mainly by the surface area of
the apical membrane of tracheal cells (Beitel and Krasnow, 2000, Zuo et al., 2013).
The apical transmembrane protein Crumbs (Crb) acts as a crucial apical determinant
(Tepass et al., 1990, Wodarz et al., 1995, Laprise and Tepass, 2011). Crb promotes
apical membrane growth and elongation of dorsal trunks independently of, and in
parallel to, the luminal extracellular matrix pathway (Laprise et al., 2010).
Deciphering how Crb activity is controlled in the developing trachea is thus
instrumental to further understanding tube-size regulation. The mutually antagonistic
relationship between Crb and the small GTPase Rac1 defines apical membrane length
in epidermal cells at late stages of Drosophila embryogenesis (Chartier et al., 2011,
Chartier et al., 2012). However, it is unknown whether this functional interplay takes
place in tracheal cells, and the role of Rac1 in tubulogenesis remains elusive. Here,
we show that Rac1 defines the length of multicellular epithelial tubes by supporting
Verm and Serp secretion, and by promoting Crb endocytosis.

2.5 Results and discussion

2.5.1 Rac1 limits Crb activity to define dorsal trunk length

To explore the role of Rac1 in tubulogenesis, we expressed a dominant

negative form of Rac1 (Rac1N17) using the tracheal-specific btl-GAL4 driver.
Embryos expressing Rac1N17 established a branched tracheal network similar to
control animals (Fig. 2.1A,B). However, dorsal trunks were over-elongated and
convoluted in Rac1N17-expressing embryos compared to dorsal trunks seen in control
specimens (Fig. 2.1A-B, E). We observed a similar ectopic lengthening of dorsal
trunks in a mutant background with reduced cellular Rac activity [rac1, rac2, mtl
zygotic mutants (Ng et al., 2002); Fig. 2.1C,E], thus confirming the specificity of the
Rac1N17-induced phenotype. These data establish that Rac1 is essential to restrict
dorsal trunk elongation, thereby contributing to tube-size specification during
development. In addition, it was shown previously that a strong expression of
Rac1N17 (using two copies of the btl-GAL4 driver) alters cell-cell adhesion and cell
intercalation in the developing tracheal tree (Chihara et al., 2003). Thus, Rac1 plays a

47
broad role in epithelial tube morphogenesis. To investigate whether the enlargement
of dorsal trunks associated with altered Rac1 signaling results from an increase in cell
number or from an enlargement of the surface area of individual cells, we quantified
the number of tracheal cells. This analysis reveals that there was no significant
variation in dorsal trunk cell numbers in control, Rac1N17-expressing or rac mutant
embryos (Fig. 2.1F). This implies that reducing Rac1 activity increases the dimension
of the apical membrane that faces the lumen and plays a critical role in determining
the size of multicellular tubes in the fly trachea (Beitel and Krasnow, 2000, Laprise et
al., 2010).

Rac1 is known to limit apical membrane growth by restricting Crb functions

in epidermal cells (Chartier et al., 2011). This raises the intriguing possibility that this
functional interaction also exists in tracheal cells, and that Crb-dependent apical
membrane growth is responsible for tube-size defects upon alteration of Rac1
activity. Accordingly, reduction of crb dosage by introducing one copy of a crb null
allele suppressed dorsal trunk over-elongation in Rac1N17-expressing embryos (Fig.
2.1D,E). Together, these results indicate that Rac1 participates in the apical polarity
pathway to limit Crb activity and specify epithelial tube size in vivo.

48
Figure 2.1 : Impaired Rac1 signaling leads to Crb-dependent over-elongation of dorsal
trunks. (A-D) Immunostaining of the luminal antigen 2A12, which highlights the tracheal
tree of embryos (stage 16) of the following genotypes: Control (A: btl-GAL4, driver line used
to express transgenes in the trachea), Rac1N17 (B: btl-GAL4; UAS-Rac1N17), rac (C: rac1j11,
rac2Δ, mtlΔ), Rac1N17, crb/+ (D: btl-GAL4; UAS-Rac1N17, crb11A22/+). In each panel, arrow
points to a dorsal trunk. Scale bar in A represents 100 µm and also applies to B-D. (E)
Histogram showing the length of dorsal trunks in embryos with altered Rac1 signaling
relative to the length of dorsal trunks in control specimens. (F) The number of cells in
tracheal segments 7 and 8 was quantified and plotted as a histogram. (F, G) n = 15 embryos
for each genotype (taken from at least three independent experiments). Bars represent mean
+/- standard deviation. A two-tailed t-test was used to evaluate the statistical significance
(p<0.05 *, p<0.001 ***).

49
 2.5.2 Rac1 promotes Crb endocytosis, which prevents over-
elongation of dorsal trunks

Crb protein levels at the apical membrane reflect the balance between Crb
delivery, endocytosis and recycling (Pocha et al., 2011, Blankenship et al., 2007, Lu
and Bilder, 2005). Expression of a constitutively active form of Rac1 (Rac1V12) led to
an almost complete loss of Crb, whereas the adherens junction protein Armadillo
(Arm) partially remained at the plasma membrane [Fig. 2.2A, B and see (Chartier et
al., 2011, Chihara et al., 2003)]. It is thus possible that Rac1 modulates Crb
trafficking and promotes its degradation. Accordingly, treatment of Rac1V12-
expressing embryos with the lysosomal proteolysis inhibitor leupeptin resulted in an
accumulation of Crb in cytoplasmic puncta in the epidermis (Fig. 2.2C, arrows and
2.3A-B). This shows that Crb is normally degraded in the presence of Rac1V12. The
increased degradation of Crb caused by ectopic Rac1 activity may reflect an
excessive endocytosis of Crb. To investigate this hypothesis, we blocked endocytosis
using the dynamin inhibitor dynasore or by expressing a dominant negative form of
the early endosome-associated protein Rab5 (Rab5S43N) (Entchev et al., 2000).
Strikingly, both dynasore and Rab5S43N attenuated the Rac1V12-induced loss of Crb
(Fig. 2.2D, E and 2.3). Importantly, Crb remained associated with the plasma
membrane in Rac1V12-expressing embryos with impaired endocytic capacities (Fig.
2.2D-E, arrows). These results demonstrate that Rac1 controls Crb levels in the
epidermis by promoting its endocytosis and degradation. As both the epidermis and
the tracheal tree originate from the ectoderm, it is tempting to propose that Rab5 also
controls Crb endocytosis in tracheal cells, thereby contributing to tube-size
specification.

To investigate the role of Rab5-dependent endocytosis in epithelial tube

morphogenesis, we expressed Rab5S43N in tracheal cells. We observed that reduction
of Rab5 activity resulted in an over-growth of dorsal trunks without compromising
the secretion of Verm and Serp (Fig. 2.2F-H, J). This confirms previous findings
suggesting that Rab5 is required to limit the elongation of multicellular epithelial
tubes during development, but is dispensable for formation of SJ (Tsarouhas et al.,

50
2007). Crb is known to be endocytosed through a Rab5-dependent pathway (Lu and
Bilder, 2005, Harris and Tepass, 2008). It is thus plausible that Crb accumulation at
the apical membrane is responsible for the tube-size defects in embryos with
compromised Rab5 activity in the trachea. Indeed, reduction of crb dosage in
embryos expressing Rab5S43N suppressed over-elongation of dorsal trunks (Fig.
2.2I,J). Rab5 is thus necessary to prevent the accumulation of Crb at the apical
membrane and ectopic growth of dorsal trunks. Rab5 is also required to clear the
luminal content at the end of embryogenesis (Tsarouhas et al., 2007), thereby
sustaining the liquid-air transition that is essential for the gas exchange function of
tracheal tubes. Thus, Rab5-mediated apical endocytosis plays a multifaceted role in
the morphogenesis and physiology of the larval respiratory system. Altogether, these
data support a model in which Rac1 controls epithelial tube length by promoting
Rab5-dependent endocytosis of Crb.

51
52
Figure 15 : Rac1 promotes Rab5-dependent endocytosis of Crb. (A-E) Embryos
were co-stained for Crb (red in the merged images) and Arm (green). Panels depict a
surface view of the ventral ectoderm of the following embryos: Control (A: da-GAL4
embryo incubated in DMSO), Rac1V12 (B: da-GAL4/UAS-Rac1V12 embryo incubated
in DMSO), Rac1V12 Leupeptin (C: da-GAL4/UAS-Rac1V12 embryo treated with the
lysosomal proteolysis inhibitor leupeptin), Rac1V12 Dynasore (D: da-GAL4/UAS-
Rac1V12 embryo treated with the dynamin inhibitor dynasore), Rac1V12 Rab5S43N (da-
GAL4/UAS-Rac1V12, UAS-Rab5S43N). Images are representative results of three
independent experiments. Scale bar in A represents 10 µm and also applies to B-E. In
B, arrows point to intracellular puncta, whereas arrows indicate cell-cell borders in D
and E. (F-H) Stage 16 Rab5S43N-expressing embryos stained for 2A12 (F), Serp (G)
or Verm (H). (I) Panel shows 2A12 staining performed on an embryo expressing
Rab5S43N in the trachea and heterozygous for the null allele crb11A22 (btl-GAL4; UAS-
Rab5S43N/crb11A22). Scale bar in F represents 100 µm and also applies to G-I. (J)
Histogram showing the quantification of the dorsal trunk length in Rab5S43N (btl-
GAL4; UAS-Rab5S43N) and Rab5S43N, crb/+ (btl-GAL4; UAS-Rab5S43N, crb11A22/+)
embryos relative to dorsal trunk length of control animals (btl-GAL4). n = 15
embryos for each genotype (taken from at least three independent experiments). Bars
represent mean +/- standard deviation. A two-tailed t-test was used to evaluate the
statistical significance (p<0.01 **, p<0.001 ***).

53
Figure 16 : Rac1 promotes Rab5-dependent endocytosis of Crb. (A-D) Embryos
were co-stained for Crb (red in the merged images) and Arm (green). Panels depict a
surface view of the ventral ectoderm of the following embryos: Control (A: da-GAL4
embryo incubated in DMSO), Control Leupeptin (B: da-GAL4 embryo incubated
with the lysosomal proteolysis inhibitor leupeptin), Control Dynasore (C: da-GAL4
embryo treated with the dynamin inhibitor dynasore), Rab5S43N (D: da-GAL4/UAS-
Rab5S43N embryo incubated in DMSO).

2.5.3 Rac1 is required for SJ functions as well as for Verm and

Serp secretion

The SJ-dependent secretion of Verm and Serp plays a critical role in

restricting tracheal tube length (Wang et al., 2006b). This pathway acts independently
of Crb (Laprise et al., 2010). To investigate whether Rac1 also contributes to the SJ-
apical secretion pathway, we performed a dye diffusion assay in living embryos. In
control animals, the paracellular barrier created by SJ precluded the entry of
fluorescent dextran within the dorsal trunk lumen (Fig. 2.4A, arrow). In contrast, we
observed a luminal accumulation of dextran in embryos deficient for the SJ protein
Coracle (Cora) (Fig. 2.4B, arrow), as previously reported (Lamb et al., 1998).
Similarly, the dextran clearly leaked within dorsal trunks in rac mutant and Rac1N17-
expressing embryos (Fig. 2.4C,D), indicating that Rac1 is required for the
establishment of a functional SJ. We next examined whether Rac1 is involved in

54
apical secretion of Verm and Serp. While stage 16 control embryos showed strong
levels of Verm and Serp in the lumen of tracheal tubes, these enzymes were absent in
embryos with altered Rac1 signaling (Fig. 2.4E-J). However, the level of the luminal
antigen 2A12 was normal in rac mutant and Rac1N17-expressing embryos (Fig. 2.4G-
J). Thus, our data identify Rac1 as a novel regulator of SJ permeability and suggest
that Rac1 sustains the apical secretion of selected cargoes, including Verm and Serp.

Figure 17 : Rac1 controls SJ permeability and luminal accumulation of chitin-

modifying enzymes. SJ permeability was assessed by injection of fluorescently
labeled dextran in control embryos (A: btl-GAL4), cora mutant embryos (B), rac
mutant embryos (C: rac1j11, rac2Δ, mtlΔ) or Rac1N17-expressing embryos (D: btl-
GAL4; UAS-Rac1N17). In each panel, arrow points to the tracheal lumen. (E-J) Co-
staining of Verm and 2A12 (upper panels) or Serp and 2A12 (lower panels) in control
(E, F: btl-GAL4), rac (G, H: rac1j11, rac2Δ, mtlΔ) and Rac1N17 (I, J: btl-GAL4; UAS-
Rac1N17) embryos. Scale bar in A represents 30 µm and also applies to B-J. (A-J) Six
embryos from three independent experiments were analyzed for each genotype.

55
 2.5.4 Rac1 and Cora are involved in a positive feedback loop

So far, our results demonstrate that Rac1 controls both the Crb-polarity and
the SJ-apical secretion pathways. Although this is unusual, it is not unique: indeed,
Cora controls the permeability of SJ and supports the luminal accumulation of Verm
and Serp (Lamb et al., 1998, Laprise et al., 2010). In addition, Cora regulates apical-
basal polarity and limits apical membrane growth by restricting Crb functions
through unknown mechanisms (Laprise et al., 2009). Reduction of crb dosage rescues
dorsal trunk defects in cora mutant embryos (Laprise et al., 2010), showing that Crb
overactivation is the primary cause of dorsal trunk lengthening in the absence of
Cora. These observations led us to propose that Rac1 and Cora are functionally
linked. Comparison of active Rac1 levels in control and cora mutant embryos
revealed a decreased amount of GTP-bound Rac1 in Cora-deficient embryos (Fig.
2.5A), showing that Cora promotes Rac1 activation. Although we haven’t directly
demonstrated that Cora activates Rac1 in tracheal cells, the similarities between the
tracheal phenotypes observed in cora mutant and Rac1-deficient embryos argue that
Rac1 is a downstream effector of Cora in this tissue. In return, Rac1 could impact on
Cora function as our data show that Rac1 is required for formation of functional SJ.
To validate this hypothesis, we compared the distribution of Cora in control, rac
mutant and Rac1N17-expressing embryos in dorsal trunk cells. While Cora is
concentrated at SJ in control animals, its distribution was more diffuse in embryos
with impaired Rac1 signaling (Fig. 2.5B-D). This misdistribution of Cora is not
secondary to altered SJ architecture, as the SJ-associated protein Fas3 maintained a
normal localization in embryos mutant for rac or expressing the dominant negative
form of Rac1 (Fig. 2.5E-G). In addition, Rac1N17-expressing embryos displayed septa
that were similar to those formed by control specimens (Fig. 2.5H,I). Thus, Rac1N17
interferes with the localization of Cora, and controls the permeability of SJ without
totally disrupting their ultrastructure. This supports the notion that intracellular
signaling events can regulate SJ permeability while septa with a normal appearance
are present (Laprise et al., 2009). Together, these data show that Rac1 and Cora are
linked in a positive feedback loop in which Cora increases the activation level of
Rac1, which signals back to Cora to control its appropriate subcellular distribution.

56
Figure 18 : Rac1 and Cora act in a positive feedback loop. (A) Control embryos
(CyO, act-GFP/CyO, act-GFP and CyO, act-GFP/cora) and cora mutant embryos
(cora/cora) were homogenized in Rac1 assay buffer. A fraction of each homogenate
was kept to examine Rac1 expression levels (Input), and GST-PAKCRIB (GST-CRIB)
was used to pull-down active Rac1. Native GST was employed as negative control.
Western blotting was used to detect Rac1, Actin, Cora, GFP and GST. Data show
representative images of three independent experiments. (B-D) Immunostaining of
Cora and labeling of the apical matrix using the Chitin-Binding Probe (CBP) in
control (B: btl-GAL4), rac (C: rac1j11, rac2Δ, mtlΔ) and Rac1N17-expressing (D: btl-
GAL4; UAS-Rac1N17) embryos. Panels show a portion of a dorsal trunk. (E-G)
Immunostaining of Fas3 in the dorsal trunk of control (E: btl-GAL4), rac (F: rac1j11,
rac2Δ, mtlΔ) and Rac1N17-expressing (G: btl-GAL4; UAS-Rac1N17) embryos. (B-G)
Nine embryos from three independent experiments were analyzed for each genotype.
Scale bar in B represents 20 µm and also applies to C-G. (H, I) Electron microscope
micrograph of tracheal cells in control (H: btl-GAL4) and Rac1N17-expressing (I: btl-
GAL4; UAS-Rac1N17) embryos. n = 16 for each genotype (taken from a least three
independent embryos. Arrows point to septa. Scale bar in H represents 125 nm and
also applies to I.

57
 Overall, our analysis suggests that Rac1 acts as a downstream effector of the
SJ-associated protein Cora to and promote luminal accumulation of Verm and Serp
(Fig. 2.6). Further exploration of this model will likely shed light on the long-lasting
issue of the molecular events linking Cora to apical secretion. Our results also support
the intriguing concept that SJ initiates intracellular signaling, as reported for adherens
and tight junctions (Zihni et al., 2014, McEwen et al., 2012). In addition, our study
positions Rac1 in the molecular network controlling apical secretion, which is
essential for tube-size specification and for the physiology of many organs (Zuo et al.,
2013). The functional interplay between Cora and Rac1 is bidirectional, as Rac1
promotes the localization of Cora within SJ. Our data also highlight that Rac1 is
essential for the SJ-mediated paracellular barrier, likely through its action on Cora. In
addition, Rac1 favors Rab5-mediated endocytosis of Crb (Fig. 2.6), thereby
specifying epithelial tube length by preventing over-growth of the apical membrane.
This discovery has broad implications. First, it proposes a molecular basis to explain
how Cora restricts Crb activity to sustain apical-basal polarity, which is crucial for
the morphogenesis and specialized functions of most epithelia (Tepass et al., 2001).
Secondly, it provides novel insights into the regulation of Crb levels at the apical
membrane, which impact on epithelial tube length (Laprise et al., 2010). The need to
further understand tube-size specification is emphasized by the fact that numerous
pathologies are associated with tube-size defects (Zuo et al., 2013). Furthermore, the
Rac1-dependent regulation of Crb levels may be relevant to cancer, as removal of Crb
from the membrane is a critical trigger of epithelial-to-mesenchymal transition
(Laprise, 2011, Campbell et al., 2011), which plays a critical role in tumor
progression (Thiery et al., 2009). In conclusion, our study demonstrates that Rac1 is a
central regulator of epithelial tube morphogenesis.

58
Figure 19 : Model of Rac1 activation and function in the control of tracheal tube
length. Cora activates Rac1-dependent signaling, which supports the luminal
accumulation of Verm and Serp. These enzymes are known to modulate the
functional properties of the luminal matrix, thereby restricting tube elongation. In
return, Rac1 controls Cora localization and SJ permeability. Rac1 also promotes
Rab5-dependent endocytosis and subsequent degradation of Crb. This protein favors
apical membrane growth and tube lengthening during epithelial tube morphogenesis.
Overall, our study establishes that Rac1 acts as a central regulator of tube-size
specification.

59
 2.6 Materials and methods

Drosophila genetics. The alleles used in this work were: rac1j11, rac2Δ, mtlΔ (Ng et
al., 2002), crb11A22 (Tepass et al., 1990) and cora5 (Fehon et al., 1994). Recombinant
chromosome generated was: UAS-Rac1V12, UAS-Rab5S43N. Rac1N17 (Luo et al., 1994),
Rac1V12 (Luo et al., 1994) and Rab5S43N (Entchev et al., 2000) were expressed in fly
embryos by crossing the corresponding UAS lines to the ubiquitous driver da-GAL4
(Wodarz et al., 1995) or the tracheal specific btl-GAL4 driver (Shiga et al., 1996) at
25oC.

Antibody production. Polyclonal antibodies against Crb amino acids 867-1048 in

fusion with GST were produced in rats.

Staining of embryos. Drosophila embryos were formaldehyde-fixed and processed

as described previously (Tepass et al., 1990). For Arm staining, embryos were heat-
fixed (Gamblin et al., 2014). Primary antibodies used: mouse anti-2A12 (1/10
dilution) (Developmental Studies Hybridoma Bank, DSHB), mouse anti-Cora (1/500)
(clones C566.9 and C615.16, DHSB), mouse and anti-Tango (1/10) (DHSB), mouse
anti-Arm (1/250) (N2-7A1, DHSB), mouse anti-Fas3 (1/10) (7G10, DHSB), rabbit
anti-Verm (1/500) (Luschnig et al., 2006), rabbit anti-Serp (1/500) (Luschnig et al.,
2006), rabbit anti-aPKC (1/250) (C-20, Santa Cruz Biotechnology) and rat anti-Crb
(1/500) (this study). Secondary antibodies were conjugated to Cy3 (Jackson
Immunoresearch Laboratories) or Alexafluor 488 (Molecular Probes). Rhodamine-
conjugated Chitin-Binding Probe (New England BioLabs) was used at a
concentration of 4 µg/ml, and co-incubated with secondary antibodies.

Pharmacological treatment of embryos. Dechorionated embryos were incubated in

the dark at 25oC in a solution of 0.9% NaCl (under an octane phase) supplemented
with DMSO (control), 0.8 mM Dynasore (30 min; Cedarlane) or 0.1 mg/ml leupeptin
(3 h; Bioshop).

Measurements, quantification of nuclei and statistical analysis. Dorsal trunk

(stage 16 embryos) length was measured between tracheal segments 2 to 8 using

60
ImageJ. Average values were normalized to the mean length of dorsal trunks in
control embryos (error bars represent standard deviation). The number of dorsal trunk
cells was quantified by counting the number of Tango-positive cells within tracheal
segments 7 and 8. A two-tailed t-test (n = 15 embryos) was used to evaluate the
statistical significance.

Septate junction permeability assay. The permeability of dorsal trunks (stage 17

embryos) was assessed as described (Lamb et al., 1998) using a solution of 0.5%
Texas Red-conjugated dextran (10 kDa) (Molecular Probes). Specimens were
observed by confocal microscopy.

Analysis of Rac1 activation levels. cora mutant embryos were balanced over CyO,
act-GFP. Stage 14-16 homozygous mutant embryos (GFP negative) were selected using
a COPAS Select sorter (Union Biometrica), thus providing an embryo population
enriched in cora mutants. GFP-positive embryos from the same collection were used as
control. Embryos were then homogenized, and active Rac1 was pulled-down and
measured as described (Picard et al., 2009, Chartier et al., 2012). 50 µg of embryo lysates
were kept to monitor the total amount of Rac1 in each sample by western blotting
(Laprise et al., 2002). The following primary antibodies were used: mouse anti-Rac1
(clone 102; BD transduction Laboratories), 1/1000; mouse anti-Cora (clones C566.9 and
C615.16, DSHB), 1/500; mouse anti-Actin (Mab1501, EMD Millipore), 1/5000 and
rabbit anti-GST (provided by J.-Y. Masson, Laval University), 1/10000. HRP-conjugated
secondary antibodies were used at a 1/1000 dilution (GE Amersham).

Electron microscopy. Stage 16 embryos were fixed and processed for electron
microscopy as described previously (Laprise et al., 2010). Specimens were observed
on a JEM-1230 (JEOL) transmission electron microscope.

Image acquisition and processing. Embryos were imaged in Vectashield (Vector

Laboratories) with an Olympus FV1000 confocal system and Fluoview 3.0, using a 40X
Apo lens with a numerical aperture of 0.90 or a 20X S Plan Apo lens with a numerical
aperture of 0.75. All image acquisition was performed at room temperature, and the
brightness/contrast tool in Photoshop was uniformly used to process images.

61
 Chapitre 3 :

Contrôle de la tubulogenèse par les partenaires fonctionnels

de Crb et interaction homotypique de la protéine CRB3A

62
 3.1 Avant-propos

Ce chapitre regroupe toutes les expériences non publiées que j’ai pu réaliser
lors de mon doctorat. Le travail présenté dans ce chapitre se décompose en deux sous-
sections.

La section 3.2 traite des mécanismes en aval de Crb qui pourraient contrôler
l’allongement de la trachée embryonnaire de la drosophile et permet de présenter des
données connexes au chapitre 2. J’ai pu réaliser l’intégralité des expériences
présentées et produire l’ensemble des figures.

La section 3.3 regroupe les expériences du projet de mise en évidence de

l’interaction homotypique de la protéine CRB3A chez les mammifères. Ici, j’ai pu
également conduire l’intégralité des expériences et collaborer avec Emily Hardy pour
les expériences de co-immunoprécipitation présentées en figure 3.5. Patrick Laprise a
supervisé l’ensemble des travaux.

3.2 Contrôle de la tubulogenèse par les partenaires

fonctionnels de Crb

La surexpression de la protéine Crb pleine longueur suffit à induire une élongation de

la trachée par rapport aux embryons sauvages (Laprise et al., 2010). Nous nous
sommes alors demandé quels domaines intracellulaires de Crb étaient requis pour
exercer ses fonctions. De manière intéressante, nous montrons que l’expression d’une
version de Crb tronquée de son domaine PBM (btlG4-mycCrbΔPBM) suffit à induire
une élongation de la trachée, par rapport aux embryons sauvages (Figure 3.2). Ceci
suggère que le domaine PBM n’est pas requis dans l’allongement de la trachée et que
le FBM de Crb suffit à paramétrer la longueur de la trachée, en permettant le
recrutement d’un de ses partenaires protéiques à la membrane apicale.

Nous nous sommes alors intéressés au rôle de la Moésine dans le contrôle de

l’allongement de la trachée de drosophile. En effet, nous avons remarqué en
microscopie électronique que les cellules de la trachée embryonnaire exprimant le

63
dominant négatif Rac1N17 montraient un défaut d’organisation des arêtes de la
taenidia (Figure 3.1). La mise en place de cette architecture apicale est complexe et
repose sur de nombreux facteurs permettant de contrôler les tensions corticales au
sein de la cellule trachéale, notamment la Moésine (Hannezo et al., 2015), qui joue
également un rôle fondamental dans le maintien de la structure tridimensionnelle des
structures photosensibles dans les rétines de drosophile (Karagiosis and Ready,
2004). De plus, il a été montré que la partie intracellulaire de Crb était capable
d’interagir physiquement avec la Moésine (Wei et al., 2015). Pour mettre en évidence
le rôle de la Moésine dans le contrôle de la tubulogenèse, nous avons manipulé
l’activité de la Moésine de la cellule trachéale en exprimant une forme constitutive
active ou inactive de cette protéine. Nous montrons que l’expression d’un dominant
actif de la Moésine dans la trachée (btlG4-mycMoeT559D) induit son élongation,
contrairement à l’expression d’un dominant inactif de la Moésine (btlG4-
mycMoeT559A), qui montre un allongement similaire à une trachée embryonnaire
sauvage (WT) (Figure 3.2).

64
Figure 20 : L’activité Rac1 est nécessaire à l’intégrité physique de la taenidia.
Clichés en microscopie électronique de la taenidia (flèches jaunes) de la trachée de
stade 16 d’un embryon sauvage (WT) et d’un embryon exprimant un dominant
négatif de Rac1 (Rac1N17). Barre noire = 0,5 µm.

65
Figure 21 : L’activation de la Moésine promeut l’allongement de la trachée.
Immunofluorescence Myc et CBP de trachées d’embryons (stade 16) de drosophile
sauvage (WT), exprimant une version de Crb tronquée de son domaine PDM (btlG4-
mycCrbΔPBM), exprimant un dominant négatif de la Moésine (btlG4-mycMoe
T559A) ou un dominant actif de la Moésine (btlG4-mycMoeT559D). Barre jaune =
100 µm.

66
3.3 Étude de l’interaction homotypique CRB3A/CRB3A dans
les cellules de mammifères

Au laboratoire, nous avions remarqué que la surexpression de la protéine

CRB3A suffit à compacter les colonies et à diminuer les protrusions membranaires
des cellules HEK293T, une lignée transformée de cellules embryonnaires rénales
humaines. De manière intéressante, la surexpression de protéines transmembranaires
impliquées dans une interaction homotypique suffit à promouvoir la compaction
cellulaire (Adams et al., 1998). Ainsi, ces observations nous ont suggéré que les
HEK293T pourraient être un bon modèle pour mettre en évidence une interaction
homotypique des domaines extracellulaires de CRB3A.

3.3.1 Étude structure-fonction des domaines intracytoplasmique et

extracellulaire de la protéine CRB3A dans la compaction cellulaire

Dans cette optique, nous avons d’abord réalisé et transfecté plusieurs

constructions plasmidiques encodant différentes troncations étiquetées Myc de la
protéine CRB3A (Figure 3.3A) et vérifié leurs expressions par western-blot (Figure 3.3B)
et leurs localisations membranaires par immunofluorescence dans les cellules HEK293T
(Figure 3.3C). Alors que les cellules contrôles montrent de nombreuses extensions
cytoplasmiques (Figure 3.3Ca), nous avons d’abord noté que les cellules surexprimant
CRB3A (Myc-CRB3A) et une version non N-glycosylable de CRB3A (Myc-
CRB3AN36A) montraient un phénotype de compaction cellulaire similaire (Figure
3.3Cb-c). Ces données suggèrent que la N-glycosylation de CRB3A n’est pas impliquée
dans le processus de compaction des colonies. À l’inverse, les cellules exprimant les
troncations des domaines intracellulaires PBM (Myc-CRB3ΔPBM, Myc-CRB3ΔPBM+)
et FBM (Myc-CRB3ΔFBMPBM) montrent un phénotype semblable aux cellules
contrôles (Figure 3.3Ca et 3.3Ce-g). Ensemble, ces résultats indiquent que la transition
morphologique opérée par les HEK293T est transduite par le domaine intracellulaire de
CRB3A. En revanche, nous n’avons pas pu déterminer l’importance du domaine
extracellulaire dans ce phénomène puisque l’expression de la version de CRB3A
tronquée de son domaine extracellulaire (Myc-CRB3ΔEC) n’est pas détectable en
western-blot et en immunofluorescence (Figure 3.3B et 3.3Cd).

67
Figure 22. Expression et localisation des constructions de CRB3A utilisées. (A)
Schéma des différentes constructions de CRB3A utilisées. (B) Western-blot des
cellules HEK293T transfectées par les différentes troncations de CRB3A. (C) (Haut)
Images en contraste de phase (CP) des différentes constructions de CRB3A
transfectées dans des HEK293T. (Bas) Immunofluorescence en microscopie
confocale de Myc (vert) et DAPI (bleu) des HEK293T transfectées par les différentes
constructions. Barre jaune = 40 µm.

68
3.3.2 Étude du domaine extracellulaire de CRB3A dans la promotion des
forces adhésives intercellulaires

Pour étudier le rôle du domaine extracellulaire de CRB3A, nous avons alors

fait l’hypothèse qu’une interaction homotypique du domaine extracellulaire de
CRB3A était à l’origine des forces adhésives dans le phénotype de compaction des
HEK293T. Pour mesurer la cohésion intercellulaire, nous avons réalisé la technique
de la goutte suspendue. Ce procédé permet de mesurer les capacités d’agglutination
des cellules en absence de contact à un support (Mack et al., 2012). Ainsi, nous avons
transfecté les constructions de CRB3A dans différents types cellulaires et examiné
l’aire des agrégats cellulaires (Figure 3.4). Nous avons utilisé une lignée épithéliale
(MDCK) comme contrôle positif d’agrégation cellulaire et une lignée fibroblastique
(DR95) comme contrôle négatif. Nous avons obtenu une agglutination très variable
des HEK293T nous empêchant d’obtenir des résultats reproductibles. Pour pallier
cette limite expérimentale, nous avons alors transfecté nos constructions plasmidiques
dans des L-cells, une lignée cellulaire murine fibroblastique non adhérente, et n’avons
pas noté d’agglutination des cellules exprimant CRB3A. Alors que l’expression de
plusieurs formes de cadhérines suffit à induire l’agglutination de ces cellules (Duguay
et al., 2003), nos observations montrent que la surexpression de CRB3A n’est pas
suffisante à induire la cohésion des cellules in vitro dans ce type cellulaire.

Figure 23. La surexpression de CRB3A ne modifie pas l’agrégation cellulaire.

Images en contraste de phase des agrégats des cellules HEK293T, HEK293T
transfectées par la construction Myc-CRB3A, MDCK, DR-95, L-cells et L-cells
transfectées par la construction Myc-CRB3A, suspendues dans une goutte pendant 0
et 3h. Barre jaune = 50 µm.

69
3.3.3 Étude de l’interaction homotypique entre les protéines CRB3A par
une approche biochimique

Pour mettre en évidence une interaction homotypique de CRB3A, nous avons

alors opté pour une approche biochimique. Dans ce cadre, nous avons réalisé des
constructions supplémentaires de CRB3A, étiquetées HA et FLAG aux extrémités N-
et C-terminales, que nous avons ensuite transfectées dans les cellules HEK293T.
Nous avons alors remarqué par western-blot que l’ajout d’une étiquette 3XFLAG
dans la partie C-terminale (CRB3A-3XFLAG(Ct)) entraîne une grande hétérogénéité
des formes de CRB3A exprimées (Figure 3.5A). De plus, nous ne détectons pas la
version CRB3A étiquetée HA à l’extrémité N-terminale (HA(Nt)-CRB3A). Nous
nous sommes alors focalisés sur les constructions CRB3A étiquetées FLAG en N-
term (3XFLAG(Nt)-CRB3A) et CRB3A étiquetées HA en C-term (CRB3A-HA(Ct))
pour la suite de cette étude. Nous montrons que ces deux formes co-
immunoprécipitent dans des lysats de cellules HEK293T (Figure 3.5B). Cependant,
nous avons ensuite remarqué par immunofluorescence que le signal de la forme
3XFLAG(Nt)-CRB3A est essentiellement cytoplasmique, suggérant que l’interaction
détectée en co-immunoprécipitation ne se réalise pas à la membrane (Figure 3.5C).
Pour valider la co-immunoprécipitation de ces deux formes, nous avons alors utilisé
les constructions membranaires Myc-CRB3A et CRB3A-HA(Ct) mais nous n’avons
pas détecté de co-immunoprécipitation entre Myc-CRB3A et CRB3A-HA(Ct) (Figure
3.5D), suggérant que ces formes membranaires n’interagissent pas ensemble.

70
Figure 24. Co-immunoprécipitation ectopique de CRB3A. (A) Western-blot
FLAG et HA de cellules HEK293T co-surexprimant CRB3A-3XFLAG(Ct) et
CRB3A-HA(Ct), 3XFLAG(Nt)-CRB3A et HA(Nt)-CRB3A, 3XFLAG(Nt)-CRB3A
et CRB3A-HA(Ct). (B) Co-immunoprécipitation de la forme CRB3A-HA(Ct) par la
formée précipitée 3XFLAG(Nt)-CRB3A (IP FLAG). (C) Immunofluorescence en
microsocopie confocale de la forme 3XFLAG(Nt)-CRB3A (vert) et CRB3A-HA(Ct)
(vert) des cellules HEK293T surexprimant 3XFLAG(Nt)-CRB3A (HEK293T
pcDNA 3XFLAG(Nt)-CRB3A) ou CRB3A-HA(Ct) (HEK293T pMSCV CRB3A-
HA(Ct)). (D) Essai de co-immunoprécipitation dans les cellules co-surexprimant
Myc-CRB3A et CRB3A-HA(Ct) (Gauche) Absence de co-immunoprécipitation de la
forme CRB3A-HA(Ct) par la forme Myc-CRB3A. (Droite) Absence de co-
immunoprécipitation de la forme Myc-CRB3A par la forme CRB3A-HA(Ct). Barre
jaune = 20 µm.

71
3.3.4 Étude de l’interaction homotypique entre les protéines CRB3A par
une approche chimique

Pour contourner les difficultés liées aux étiquettes protéiques, nous avons
alors entrepris d’utiliser une approche chimique pour étudier l’interaction entre les
domaines extracellulaires de CRB3A. Nous avons alors fait l’hypothèse qu’un
peptide synthétique mimant la structure extracellulaire de CRB3A devrait interagir et
s’accumuler aux régions jonctionnelles de cellules polarisées en culture. Dans ce
cadre, nous avons fait synthétiser chimiquement le peptide extracellulaire de CRB3A,
qui a été couplé au dérivé fluorescent FITC (isothiocyanate de fluorescéine),
permettant de suivre la localisation du peptide CRB3A en microscopie. Ainsi, nous
avons traité des cellules polarisées (MDCK) avec le peptide synthétique couplé au
FITC (pCRB3A-FITC). Nous avons alors observé un signal fluorescent uniforme
(Figure 3.6B) et semblable aux cellules contrôles traitées uniquement au FITC,
indiquant que notre peptide synthétique n’est pas capable de se fixer aux régions
jonctionnelles de cellules polarisées.

En parallèle, nous avons voulu montrer une interaction homotypique directement

entre deux peptides synthétiques mimant la structure du domaine extracellulaire de
CRB3A. Pour cela, nous avons choisi de synthétiser le peptide extracellulaire de
CRB3A à la surface de billes TentaGel™ (Quarrell et al., 1996) et ChemMatrix®
(Garcia-Ramos et al., 2010), deux types de polymères utilisées dans le criblage
d’interactions à haut débit de banques peptidiques (Franz et al., 2003). Nous avons
alors fait l’hypothèse que notre peptide fluorescent devrait s’accumuler sur les billes
de polymères exhibant la structure du domaine extracellulaire de CRB3A. Ainsi, nous
avons incubé les billes TentaGel™-CRB3A et ChemMatrix®-CRB3A avec notre
peptide synthétique CRB3A couplé au FITC (pCRB3A-FITC), et examiné en
microscopie le signal fluorescent des billes de polymère (Figure 2.4A). Nous avons
d’abord observé que les billes TentaGel™-CRB3A et ChemMatrix®-CRB3A traitées
avec le peptide CRB3A-FITC exhibaient un signal fluorescent important par rapport
aux billes contrôles, suggérant que le peptide CRB3A libre est capable de se lier aux
billes TentaGel™-CRB3A et ChemMatrix®-CRB3A. Cependant, l’ajout du FITC

72
seul (FITC) sur les billes TentaGel™-CRB3A et ChemMatrix®-CRB3A suffit à
induire un signal de fluorescence, indiquant l’existence d’une interaction non
spécifique entre le peptide de surface CRB3A des billes et le FITC. Nous avons alors
essayé de compétitionner cette interaction en incubant notre peptide marqué avec un
excès de peptide non marqué et n’avons pas noté de diminution du signal fluorescent
des billes TentaGel™-CRB3A et ChemMatrix®-CRB3A (pCRB3A-
FITC/10XpCRB3A)(Figure 3.6B), suggérant que l’interaction du peptide libre
CRB3A-FITC avec les billes TentaGel™-CRB3A et ChemMatrix®-CRB3A est
réalisée essentiellement par le FITC.

73
Figure 25. Absence d’interaction homotypique par l’utilisation de peptide
synthétique. (A) Immunofluorescence par microcopie confocale de cellules MDCK
(MDCK), MDCK traitées à la FITC (MDCK+FITC) ou au peptide extracellulaire de
CRB3A couplé au FITC (MDCK + pCRB3A-FITC). (B) Images confocales de billes
contrôles ChemMatrix® et TentaGel™ traitées à la FITC (Contrôle), de billes
ChemMatrix®-CRB3A et TentaGel™-CRB3A traitées au FITC (FITC), de billes
ChemMatrix®-CRB3A et TentaGel™-CRB3A traitées au peptide de CRB3A couplé
au FITC (pCRB3A-FITC) ou à un mélange 1 :10 de peptide extracellulaire de
CRB3A couplé et non couplé au FITC (pCRB3A-FITC/10XpCRB3A). Barre jaune =
20 µm.

74
 3.4 Matériels et méthodes :

3.4.1 Contrôle de la tubulogenèse par les partenaires fonctionnels

de Crb.

Génétique des embryons. Les embryons utilisés pour l’immunofluorescence sont

issus du croisement de femelles btl-GAL4 et des mâles btl-GAL4 (Contrôle), UAS-
mycMoeT559A, UAS-mycMoeT559D (Speck et al., 2003) et UAS-myc-crbiDERLI
(Klebes and Knust, 2000). Les embryons utilisés pour la microscopie électronique
proviennent du croisement de femelles btlGAL4 et des mâles btlGAL4 (Contrôle) ou
UAS-Rac1N17 (Luo et al., 1994).

Immunofluorescence. Les embryons ont été déchorionnés pendant 5 min dans une
solution d’eau de Javel diluée à 50%. Les embryons ont ensuite été rincés à l’eau
distillée puis fixés pendant 8 min sous agitation à température pièce dans un vial à
scintillation contenant 2 mL de formaldéhyde à 37%, 3mL de PEM (100 mM PIPES
pH=7.0, 2mM EGTA et 1 mM MgSO4) et 5mL d’heptane. Les embryons ont ensuite
été dévitellinisés en retirant la phase aqueuse du vial puis en ajoutant une pipette de
transfert de méthanol. Le vial a été agité vigoureusement pendant 30s sur une plaque
agitatrice à 425 rpm. Les embryons ont ensuite été rincés au méthanol et incubés
pendant 20 min à température pièce dans du méthanol. Les embryons ont ensuite été
rincés à l’éthanol puis 3 fois au PBS, Triton X-100 0.3%. Les embryons ont ensuite
été lavés 3 fois pendant 15 min au PBS, Triton X-100 0.3% à température pièce. Les
embryons ont ensuite été saturés pendant 1 h à température pièce avec du PBS, Triton
X-100 0,3% + 2% NGS (Normal Goat Serum) et l’anticorps anti-Myc (Sigma-
Aldrich) a ensuite été incubé sur la nuit à 4ºC à une dilution de 1/1000 dans du PBS,
Triton X-100 0,3% + 2% NGS. Les embryons ont ensuite été rincés et lavés 3 fois
dans du PBS, Triton X-100 0.3% puis l’anticorps secondaire couplé au Cy3 (Jackson
Immunoresearch Laboratories) et 4 µg/mL de Chitin-Binding Probe (New England
BioLabs) ont été incubé 1 h à température pièce. Les embryons ont à nouveau été
rincés et lavés 3 fois au PBS, Triton X-100 0.3% puis montés sur des lamelles
contenant 50 µL de VectaShield (Vector Laboratories).

75
Microscopie électronique. Les embryons de stade 16 ont été déchorionnés puis
préfixés dans un vial à scintillation contenant une solution de 25% de glutharaldéhyde
(diluée dans 100mM de cacodylate de sodium, pH=7.2) sous une phase d’heptane
pendant 30 min. Les embryons ont ensuite été dévitellinisés manuellement avec une
aiguille puis fixés pendant 1 h dans une solution 2% de glutharaldéhyde (diluée dans
100mM de cacodylate de sodium, pH=7.2). Les embryons ont ensuite été lavés dans
le tampon cacodylate puis fixés dans une solution 1% OsO4, 0.8% p/v ferricyanide de
potassium préparée dans 100mM de cacodylate de sodium, pH=7.2 à l’abri de la
lumière à 4ºC pendant 1 h. Les embryons ont ensuite été rincés au tampon cacodylate,
puis à l’eau et incubés pendant 1 nuit à 4ºC dans une solution 2% d’acétate d’uranyl.
Les embryons ont ensuite été déshydratés dans des solutions contenant des
concentrations croissantes d’éthanol (50%, 70%, 80%, 90%, 100%) puis inclus
progressivement dans de la résine Spurr (25%, 50%, 75%, 100%). Les embryons ont
ensuite été disposés dans des moules en silicone et la résine a été laissée durcir à
80ºC. Les coupes d’embryons ont ensuite été préparées par la plate-forme d'Imagerie
Moléculaire & Microscopie de l’Université Laval et observées avec un microscope
électronique à transmission JEM 1230 (JEOL).

3.4.2 Étude de l’interaction homotypique CRB3A/CRB3A dans les

cellules de mammifères

Construction des plasmides. L’ADN complémentaire de Myc-CRB3A a été obtenu

de B. Margolis (Université du Michigan, Ann Harbor, MI). Les troncations des
domaines membranaires ont été générées par PCR et clonées dans le vecteur
psecTagB (B. Margolis), pcDNA3.1Z+ (J-Y. Masson, Université Laval, Canada) ou
MFGIpuro (M. Caruzo, Université Laval, Canada) par le kit InFusion (Clontech
Laboratories, Mountain View, CA).

Culture cellulaire et transfection. Les HEK293T, MDCK, DR95 et L-cells ont été
cultivées à 37°C sous une atmosphère humide contenant 5% CO2, dans du DMEM
supplémenté de 10% de FBS (Wisent, Inc., Saint-Bruno, Canada), 2 mM glutamine,
10 mM HEPES, 50 U/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine (Life
Technologies). Les cellules ont été transfectées avec 1 µg de vecteur par le réactif

76
Fugene HD (Promega, Madison, WI) à un ratio ADN:FuGene de 1:3. Les cellules
transfectées ont été sélectionnées avec 2 μg/mL de puromycine (Bioshop, Burlington,
Canada) pour les constructions plasmidiques MFGIpuro et pMSCVpuro ; 100 μg/mL
de Zeocin™ (Invivogen, San Diego, USA) pour les constructions psecTagB et
pcDNA3.1Z+.

Immunofluorescence. Les cellules ont été lavées dans du PBS (phosphate buffered
saline) et fixées dans une solution à 4% de paraformaldehyde (dilué dans du PBS)
pendant 20 min à température pièce. Les cellules fixées ont ensuite été perméabilisées
avec une solution 0.1% Triton X-100 (dilué dans du PBS (PBT)) pendant 15 min et
saturées avec une solution PBT+2% BSA (bovin serum albumin) pendant 30 min à
température pièce. Les anticorps primaires ont été dilués dans du PBT+0.2%BSA
(BSA-PBT) pendant 1 h à température pièce. Les cellules ont été ensuite rincées puis
lavées 3 fois pendant 5 min dans du PBT, avant d’être incubées avec l’anticorps
secondaire dilué dans du BSA-PBT pendant 30 min dans le noir à température pièce.
Les noyaux des cellules ont été ensuite marqués pendant 5 min avec une solution de
PBT contenant 1 μg/ml de 4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Roche,
Mississauga, Canada). Ensuite, les cellules ont été rincées 3 fois et les lamelles
montées avec du VectaShield (Vector Laboratories). Les images
d’immunofluorescence ont été obtenues par imagerie confocale (FV1000; Olympus).
Les dilutions des anticorps utilisés sont les suivantes : anti-Myc, 1/100 (Sigma-
Aldrich, Oakville, Canada) ; anti-HA, 1/200 (MediMabs, Mont-Royal, Canada) ; anti-
FLAG, 1/200 (M2, Sigma). L’anticorps secondaire a été conjugué au Alexa Fluor 488
(Molecular Probes/Life Technologies) et utilisé à une dilution de 1/400.

Western blotting. Les cellules ont été préalablement rincées au PBS avant d’être
lysées sur glace pendant 20 min dans une solution 40 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1%
Triton X-100, 40 mM β-glycero-phosphate, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5%
glycerol, 50 mM NaF, 0.1 mM orthovanadate de sodium, 0.1 mM
phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 μg/mL aprotinine, 10 μg/mL leupeptine et 0.7
μg/mL pepstatine. Les échantillons ont été centrifugés 10 min à 4°C à 17000g et le
surnageant a été conservé pour l’analyse. Les surnageants ont ensuite été dosés avec

77
une gamme de BSA par colorimétrie avec la méthode BCA (BiCinchoninic acid
Assay). 50 µg de chaque échantillon ont ensuite été dénaturés dans du tampon
Laemmli, chauffés pendant 5 min à 95°C puis séparés par SDS-PAGE. Le gel de
polyacrylamide a ensuite été transféré sur une membrane de nitrocellulose. La
membrane a été saturée dans une solution 5% lait, Tween 0.05% (dilué dans du PBS)
pendant 1 h sous agitation douce à température pièce et la membrane a été incubée
pendant une nuit à 4°C avec les anticorps primaires dilués dans la solution 5% lait,
Tween 0.05%. La membrane a ensuite été rincée 1 fois et lavée 3 fois pendant 10 min
avec du PBS, Tween 0.05% avant d’ajouter les anticorps secondaires dilués dans la
solution 5% lait, Tween 0.05% pendant 1 h à température pièce. Enfin, les
membranes ont été à nouveau rincées et lavées 3 fois avec du PBS, Tween 0.05%,
puis lavée 1 fois au PBS. Enfin, les membranes de nitrocellulose ont été révélées par
chimiluminescence avec une solution de 125 µM luminol, 2.35 µM peroxyde
d’hydrogène et 225 µM d’acide coumarique (dilués dans 100 mM Tris-HCl pH=8.5).
Les dilutions des anticorps utilisés sont les suivantes: anti-Myc 1/1000 (Sigma-
Aldrich), anti-FLAG 1/1000 (Sigma-Aldrich), anti-HA 1/1000 (Medimabs, Mont-
Royal, Canada), anti-actine (1/10,000; Millipore, Etobicoke, Canada). L’anticorps
secondaire conjugué à la peroxydase (GE Healthcare) a été utilisé à une dilution de
1/1000.

Co-immunoprécipitation. Les cellules ont été lysées sur glace pendant 20 min dans
du tampon RIPA (Radioimmunoprecipitation assay buffer) (20 mM Tris-HCl, pH 7.4,
150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 1.5 mM MgCl2, 1.5 mM EGTA, 10% glycerol, 1 mM
phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.1 mM orthovanadate de sodium, 10 μg/ml
aprotinine, 10 μg/ml leupeptine et 0.7 μg/ml pepstatine). Les lysats ont ensuite été
centrifugés à 17000g pendant 10 min à 4°C et le surnageant a été conservé pour
analyse et dosé comme expliqué précédemment. 1 mg de lysat protéique a ensuite été
incubé avec 2 μg d’anticorps pendant 2 h à 4˚C sous agitation douce. 40 μL d’une
suspension de billes Protein A-Sepharose (Sigma-Aldrich) prélavées avec du tampon
RIPA ont été ensuite incorporés à la préparation pendant 45 min à 4˚C. Les billes ont
ensuite été lavées 3 fois avec du tampon RIPA puis ont été éluées avec du Laemmli
bouillant. L’éluat a ensuite été analysé par western-blot.

78
Goutte suspendue. Les cellules ont été lavées, trypsinées puis comptées. Des gouttes
de 30 μL de suspension cellulaire à 106 cellules/mL sont suspendues dans des plaques
24 puits, préalablement remplies à moitié d’eau distillée. Les plaques contenant les
gouttes sont ensuite laissées pendant 0 ou 3 h à 37˚C sous une atmosphère humide
contenant 5% CO2. Les gouttes sont ensuite pipettées et refoulées 10 fois avant d’être
étalées sur lame pour être analysées. Pour chaque expérience, trois gouttes ont été
utilisées et 5 champs représentatifs d’agrégats cellulaires par goutte ont été
photographiés et les aires des agrégats ont été mesurées avec le logiciel ImageJ.

Préparation des billes ChemMatrix® et TentaGel™. Les billes contrôles

ChemMatrix® et TentaGel™, ChemMatrix®-CRB3A et TentaGel™-CRB3A, le
peptide CRB3A et le peptide CRB3A-FITC ont été synthétisés par E. Biron
(Université Laval, Canada). La séquence du peptide extracellulaire utilisée est
AWGQIQTTSANENSTVLPSSTSSSSDGNLRPEAITA . Pour la préparation des
billes, 1 mg de billes ChemMatrix® ou TentaGel™ est incubé pendant 2 h dans du
dimethylformamide (Sigma-Aldrich) à température pièce. Les billes sont ensuite
lavées 3 fois à l’eau distillée, puis 3 fois au TBST (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM
NaCl, 0.1% Tween), puis incubées pour la nuit à 4˚C dans du TBST-3%BSA sous
agitation douce. Les peptides synthétiques ont été ajoutés sur les billes pour une
concentration finale de 0.5 nM puis incubés pendant 6 h à 4˚C sous agitation douce.
L’essai de compétition a été réalisé en co-incubant le peptide marqué avec 5 nM de
peptide CRB3A non couplé à la FITC. Les billes ont ensuite été lavées 3 fois avec du
TBST et les billes ont été montées avec du VectaShield.

Marquage de CRB3A in vitro par le peptide synthétique. Les cellules MDCK ont
été fixées comme décrit précédemment puis incubées avec 2.5 nM de FITC ou de
peptide CRB3A-FITC en lieu d’anticorps primaire, puis lavées et montées comme
décrit précédemment.

79
3.6 Materiel et méthodes :

Génétique des embryons. Les embryons utilisés pour l’immunofluorescence sont

issus du croisement de femelles btl-GAL4 et des mâles btl-GAL4 (Contrôle), UAS-
mycMoeT559A, UAS-mycMoeT559D (Speck et al., 2003) et UAS-myc-crbiDERLI
(Klebes and Knust, 2000). Les embryons utilisés pour la microscopie électronique
proviennent du croisement de femelles btlGAL4 et des mâles btlGAL4 (Contrôle) ou
UAS-Rac1N17 (Luo et al., 1994).

Immunofluorescence. Les embryons ont été déchorionnés pendant 5 min dans une
solution d’eau de Javel diluée à 50%. Les embryons ont ensuite été rincés à l’eau
distillée puis fixés pendant 8 min sous agitation à température pièce dans un vial à
scintillation contenant 2 mL de formaldéhyde à 37%, 3mL de PEM (100 mM PIPES
pH=7.0, 2mM EGTA et 1 mM MgSO4) et 5mL d’heptane. Les embryons ont ensuite
été dévitellinisés en retirant la phase aqueuse du vial puis en ajoutant une pipette de
transfert de méthanol. Le vial a été agité vigoureusement pendant 30s sur une plaque
agitatrice à 425 rpm. Les embryons ont ensuite été rincés au méthanol et incubés
pendant 20 min à température pièce dans du méthanol. Les embryons ont ensuite été
rincés à l’éthanol puis 3 fois au PBS, Triton X-100 0.3%. Les embryons ont ensuite
été lavés 3 fois pendant 15 min au PBS, Triton X-100 0.3% à température pièce. Les
embryons ont ensuite été saturés pendant 1 h à température pièce avec du PBS, Triton
X-100 0,3% + 2% NGS (Normal Goat Serum) et l’anticorps anti-Myc (Sigma-
Aldrich) a ensuite été incubé sur la nuit à 4ºC à une dilution de 1/1000 dans du PBS,
Triton X-100 0,3% + 2% NGS. Les embryons ont ensuite été rincés et lavés 3 fois
dans du PBS, Triton X-100 0.3% puis l’anticorps secondaire couplé au Cy3 (Jackson
Immunoresearch Laboratories) et 4 µg/mL de Chitin-Binding Probe (New England
BioLabs) ont été incubé 1 h à température pièce. Les embryons ont à nouveau été
rincés et lavés 3 fois au PBS, Triton X-100 0.3% puis montés sur des lamelles
contenant 50 µL de VectaShield (Vector Laboratories).

Microscopie électronique. Les embryons de stade 16 ont été déchorionnés puis

préfixés dans un vial à scintillation contenant une solution de 25% de glutharaldéhyde
(diluée dans 100mM de cacodylate de sodium, pH=7.2) sous une phase d’heptane

80
pendant 30 min. Les embryons ont ensuite été dévitellinisés manuellement avec une
aiguille puis fixés pendant 1 h dans une solution 2% de glutharaldéhyde (diluée dans
100mM de cacodylate de sodium, pH=7.2). Les embryons ont ensuite été lavés dans
le tampon cacodylate puis fixés dans une solution 1% OsO4, 0.8% p/v ferricyanide de
potassium préparée dans 100mM de cacodylate de sodium, pH=7.2 à l’abri de la
lumière à 4ºC pendant 1 h. Les embryons ont ensuite été rincés au tampon cacodylate,
puis à l’eau et incubés pendant 1 nuit à 4ºC dans une solution 2% d’acétate d’uranyl.
Les embryons ont ensuite été déshydratés dans des solutions contenant des
concentrations croissantes d’éthanol (50%, 70%, 80%, 90%, 100%) puis inclus
progressivement dans de la résine Spurr (25%, 50%, 75%, 100%). Les embryons ont
ensuite été disposés dans des moules en silicone et la résine a été laissée durcir à
80ºC. Les coupes d’embryons ont ensuite été préparées par la plate-forme d'Imagerie
Moléculaire & Microscopie de l’Université Laval et observées avec un microscope
électronique à transmission JEM 1230 (JEOL).

81
Chapitre 4 : Discussion

82
 Les cancers d’origine épithéliale représentent 80% des cancers chez l’Homme.
La progression tumorale s’associe à une perte de polarité épithéliale, à la perte des
structures jonctionnelles, à une transition morphologique et à une désorganisation de
l’architecture des tissus épithéliaux. De plus, l’expression et la localisation
subcellulaire des modules de polarité épithéliale sont généralement dérégulées dans
les carcinomes. Ainsi, le rétablissement de la polarité épithéliale pourrait être un axe
thérapeutique prometteur dans le traitement du cancer. C’est pourquoi, l’identification
des mécanismes soutenus par la polarité épithéliale est un enjeu majeur pour la santé
humaine. Parmi les modules de polarité épithéliale, le module Crumbs joue un rôle
central dans la morphologie épithéliale puisque la perte de l’expression de CRB3A
chez les mammifères entraîne un défaut de maturation des jonctions cellulaires et
promeut un changement morphologique cellulaire, associé à une agressivité accrue
des tumeurs épithéliales (Fogg et al., 2005, Karp et al., 2008).

Le premier objectif de mon doctorat était donc d’approfondir nos connaissances sur
les fonctions et la régulation cellulaires de la protéine CRB3A chez l’humain. Ainsi,
nos travaux ont d’abord tenté de caractériser les modalités d’une interaction
homotypique de CRB3A. Ensuite, nous avons pu mettre en évidence que CRB3A
permet de localiser à la membrane de cellules cancéreuses humaines un sentier
signalétique p114RhoGEF>RhoA>ROCK (Annexe 1), qui permet de limiter les
propriétés tumorales de ces cellules.

4.1 Étude de l’interaction homotypique CRB3A/CRB3A dans

les cellules de mammifères

La compréhension de la fonction des domaines de CRB3A est cruciale pour

déterminer les mécanismes fonctionnels de la protéine au sein de la cellule
épithéliale. Dans l’annexe 1, nous montrons que l’expression d’une protéine
transmembranaire impliquée dans les mécanismes de polarité épithéliale promeut la
cohésion de cellules non polarisées. Nous avons réalisé une analyse structure-fonction
de la protéine CRB3A pour identifier les domaines responsables du phénotype de
compaction cellulaire (Figure 3.3). Ainsi, nous avons pu déterminer l’importance des

83
domaines intracellulaires dans ce phénotype. Ces résultats sont en accord avec la
littérature chez les mammifères et la drosophile, qui soulignent le rôle crucial de la
signalisation de la portion cytoplasmique de CRB3A dans le maintien de la
morphologie épithéliale (Fogg et al., 2005, Roh et al., 2003, Izaddoost et al., 2002,
Wodarz et al., 1995). En effet, ces domaines sont associés à l’organisation du
cytosquelette apical (Medina et al., 2002). Ainsi, nos résultats suggèrent que le
phénotype de compaction cellulaire pourrait être assuré par un mécanisme dépendant
du remodelage du cytosquelette dans les HEK293T. Cependant, nous n’avons pas pu
étudier l’importance du domaine extracellulaire de CRB3A dans la compaction des
cellules HEK293T, puisque l’expression d’une version tronquée de l’intégralité du
domaine extracellulaire de CRB3A n’est pas détectée. Ceci suggère que le domaine
extracellulaire de CRB3A est nécessaire à la stabilité de la protéine et que la
troncation de l’intégralité de sa partie extracellulaire promeut sa dégradation.

La surexpression de protéines transmembranaires impliquées dans une interaction

homotypique peut promouvoir la compaction et l’agrégation cellulaire (Adams et al.,
1998). L’observation d’un phénotype de compaction des colonies de HEK293T
surexprimant CRB3A suggère que la protéine CRB3A est elle-aussi impliquée dans
une interaction homotypique. Pour établir l’existence de cette interaction, nous avons
d’abord voulu montrer que la surexpression de CRB3A pouvait promouvoir les forces
cohésives intercellulaires. Nous avons alors observé que les L-cells surexprimant
CRB3A ne montrent pas d’agglutination accrue (Figure 3.4). Néanmoins, ce résultat
négatif n’écarte pas notre hypothèse. En effet, deux études ont montré que les
propriétés adhésives des cadhérines desmosomales, des protéines établissant
également des interactions en trans-, nécessitaient la présence de leurs partenaires
fonctionnels intracellulaires pour générer et stabiliser l’interaction de leur domaine
extracellulaire (Marcozzi et al., 1998, Tselepis et al., 1998). Ainsi, les L-cells sont des
cellules fibroblastiques qui pourraient ne pas exprimer les partenaires fonctionnels
intracellulaires de CRB3A, empêchant ainsi la stabilisation de l’interaction du
domaine extracellulaire de CRB3A, expliquant alors l’absence d’agglutination de ces
cellules. Dans ce cadre, il serait intéressant de tester l’agglutination des L-cells co-
surexprimant CRB3A, PALS1 ou PAR6-aPKC, impliquées dans la stabilisation

84
membranaire des fonctions de CRB3A (Fogg et al., 2005, Hurd et al., 2003, Roh et
al., 2003). Néanmoins, nos expériences montrent que l’expression de CRB3A n’est
pas suffisante à promouvoir une agrégation cellulaire, observée dans les HEK293T
(Figure 3.4) et les cellules HeLa (Loie et al., 2015), suggérant que CRB3A requiert
des partenaires additionnels pour générer des forces adhésives soutenant la cohésion
cellulaire.

Nous montrons ensuite une co-immunoprécipitation des formes 3XFLAG(Nt)-

CRB3A et CRB3A-HA(Ct) dans les cellules HEK293T (Figure 3.5). Néanmoins,
nous avons observé en immunofluorescence que la forme 3XFLAG(Nt)-CRB3A,
immunoprécipitée par CRB3A-HA(Ct), est essentiellement cytoplasmique (Figure
3.5C). De plus, nous ne détectons pas d’interactions entre les formes membranaires
Myc-CRB3A et CRB3A-HA(Ct) (Figure 3.5D). Ensemble, ces observations
suggèrent que l’interaction entre les formes 3XFLAG(Nt)-CRB3A et CRB3A-
HA(Ct) ne s’effectue pas à la membrane plasmique. Ces résultats proposeraient alors
l’existence d’un mécanisme limitant ou empêchant l’interaction homotypique de
CRB3A à la membrane. Dans ce cadre, nous avons montré que les domaines
intracellulaires de CRB3A suffisaient à modifier la morphologie des cellules
HEK293T (Figure 3.3). Ainsi, il serait alors intéressant de vérifier que ce signal ne
pourrait pas, en retour, inhiber la fonction du domaine extracellulaire de CRB3A.
Pour étudier cette hypothèse, il faudrait réaliser les co-immunoprécipitations des
formes de CRB3A tronquées de leurs domaines intracellulaires, bien que ceux-ci
puissent également être importants à la stabilisation de cette interaction. Nous
pourrions alors montrer l’existence d’une régulation rétro-négative de la
fonction du domaine extracellulaire de CRB3A par les fonctions de ses domaines
intracellulaires.

Nous avons ensuite étudié directement l’hypothèse d’une interaction homotypique du

domaine extracellulaire de CRB3A par une approche chimique (Figure 3.6).
Cependant, le fluorophore que nous avons utilisé (FITC) se lie de manière non
spécifique aux billes de polymère exhibant la structure du domaine extracellulaire de
CRB3A. Néanmoins, il n’est pas exclu que le peptide CRB3A soit capable de se fixer

85
de manière spécifique au domaine extracellulaire de CRB3A couplé aux billes
traitées. En effet, il faudrait réitérer ces expériences en utilisant un autre fluorophore.
D’autre part, nous montrons qu’un peptide mimant le domaine extracellulaire de
CRB3A n’interagit pas avec les protéines CRB endogènes de cellules polarisées. Ces
résultats nous suggèrent plusieurs pistes. D’abord, notre peptide synthétique du
domaine extracellulaire de CRB3A pourrait ne pas encoder de fonction. En effet,
l’établissement et le maintien d’une conformation spatiale adéquate d’un domaine
protéique peuvent nécessiter la présence et la fonctionnalité d’autres domaines au sein
de la même protéine (Bhaskara and Srinivasan, 2011). Ainsi, l’absence des domaines
intracellulaires de CRB3A pourrait modifier et inactiver la structure tridimensionnelle
responsable de la fonctionnalité de la partie extracellulaire de CRB3A.
Alternativement, CRB3A est N-glycosylée sur son domaine extracellulaire, une
modification post-traductionnelle qui peut modifier l’affinité d’interaction d’un
récepteur avec ses ligands extracellulaires (Moremen et al., 2012). Dans ce cadre,
l’absence de N-glycosylation de notre peptide synthétique pourrait expliquer une
absence d’enrichissement du signal fluorescent au sein des cellules polarisées. Enfin,
l’affinité du peptide synthétique pourrait être aussi trop faible pour les protéines
CRB3A endogènes dans les conditions réalisées pour être visible en microscopie à
fluorescence.

Ensemble, nos résultats ne permettent pas de valider l’existence d’une interaction

homotypique de CRB3A à la membrane plasmique. En revanche, nos données
suggèrent que si cette interaction existe, celle-ci pourrait être régulée
négativement à la membrane plasmique par un mécanisme cellulaire qui reste à
être déterminé. Dans ce cadre, nos résultats indiquent ainsi les pistes futures à
explorer pour caractériser les modalités de l’interaction homotypique de CRB3A.

86
4.2 Fonctions de CRB3A dans le contrôle de la morphologie
cellulaire et de la répression tumorale.

Pour caractériser les mécanismes en aval de la protéine CRB3A dans le

contrôle de la morphologie cellulaire, nous avons utilisé les cellules HeLa, une lignée
cellulaire d’adénocarcinome humaine qui n’exprime plus CRB3A et qui a perdu ses
caractéristiques et sa morphologie épithéliales (Annexe 1).

4.2.1 CRB3A contrôle un module contractile via l’activité RhoA

Nous avons observé que l’expression de CRB3A dans les cellules HeLa suffit
à induire in vitro un phénotype pseudo-épithélial. En effet, ces cellules s’organisent
en colonies compactes et forment une architecture dense et périphérique de fibres
d’actine, qui pourrait ressembler à la ceinture circonférentielle d’actine de cellules
épithéliales en culture (Annexe1, Figure 1L). Nous avons associé ce phénotype à une
coopération fonctionnelle des domaines FBM et PBM de CRB3A, qui permettent le
recrutement de p114RhoGEF et d’Ehm2, un orthologue de Yrt (Laprise et al., 2006).
Ainsi, bien que les protéines Crb et Yrt soutiennent des fonctions antagonistes chez la
drosophile pendant l’établissement de la polarité épithéliale, Yrt nécessite Crb pour
exercer ses fonctions. De plus, chez les mammifères, Ehm2 est capable de lier les
protéines CRB (Laprise et al., 2006). Néanmoins, le rôle in vivo de cette interaction
dans la biologie des épithéliums reste à être déterminé. Nous montrons qu’Ehm2 et
CRB3A collaborent fonctionnellement. Cette découverte pourrait être intéressante
dans la compréhension des mécanismes de contrôle de la morphologie cellulaire. En
effet, Ehm2 est recrutée aux jonctions serrées pour stimuler la contractilité de la
myosine-II, mais le récepteur jonctionnel d’Ehm2 pour cette fonction n’est pas connu.
De plus, la surexpression d’Ehm2 dans des cellules polarisées suffit à induire une
constriction apicale dépendante du sentier p114RhoGEF>RhoA>ROCK et la perte
d’Ehm2 se traduit par un défaut de maturation des jonctions cellulaires (Nakajima
and Tanoue, 2010, Nakajima and Tanoue, 2011). Ensemble, nos données et ces
observations suggèrent que CRB3A pourrait contrôler in vivo la contractilité et
la maturation des jonctions serrées, en assurant le recrutement concomitant de

87
PATJ et d’Ehm2. De manière intéressante, chez le poisson-zèbre, Mosaic Eyes
(l’orthologue d’Ehm2) collabore avec le module Crumbs dans la formation des
jonctions serrées (Jensen and Westerfield, 2004). Il serait alors intéressant de montrer
que l’interaction entre CRB3A et Ehm2 permet de restreindre spatialement
l’activation de la voie p114RhoGEF>RhoA>ROCK aux jonctions serrées pour
soutenir leur maturation et maintenir la morphologie des cellules polarisées.

4.2.2 Crumbs, un chef d’orchestre de la morphologie apicale ?

Nous montrons qu’une surexpression de CRB3A s’associe à une compaction

cellulaire qui mime une morphologie de type épithéliale. De manière intéressante,
chez la drosophile, la surexpression de Crb peut également provoquer une contraction
du domaine apical (Harden et al., 2002). Cependant, la surexpression de Crb, dans les
cellules polarisées de drosophile et de mammifère, est généralement associée à une
croissance de la membrane apicale (Lemmers et al., 2004, Wodarz et al., 1995).
Ensemble, ces informations suggèrent que les protéines Crb sont en amont de
plusieurs mécanismes contrôlant la morphologie cellulaire.

Néanmoins, comment Crb peut contrôler à la fois la constriction et la croissance du

domaine apical dans les cellules polarisées ? Ces observations et nos données
proposent un modèle bimodal du maintien de la morphologie cellulaire par
Crb/CRB3A, régulée de manière spatialement distincte par la Moésine/protéines
ERM et Yrt/Ehm2 (Figure 4.1). En effet, chez la drosophile, le contrôle de la
morphologie épithéliale nécessite le recrutement de la Moésine au domaine apical par
le domaine FBM de Crb (Letizia et al., 2011). Cette coopération entre Crb et les
protéines ERM contribuerait au maintien de l’intégrité physique du domaine apical
(Medina et al., 2002, Thomas and Williams, 1999, Saotome et al., 2004, Coscoy et
al., 2002). Il est important de noter que la Moésine régule, en retour, spatialement les
fonctions de Crb, en promouvant les fonctions de Crb au domaine apical et en les
limitant aux domaines jonctionnels (Hashimoto et al., 2015). Enfin, la Moésine est
impliquée au domaine apical dans un antagonisme fonctionnel réciproque avec
l’activité RhoA (Speck et al., 2003). Ensemble, nos données et ces observations
suggèrent ainsi qu’au moins deux fonctions antagonistes de Crb pourraient

88
coexister le long de la membrane d’une cellule polarisée et coopérer dans le
maintien de la morphologie cellulaire. Ainsi, nous proposons qu’un premier
complexe jonctionnel CRB3A>Ehm2 pourrait d’abord assurer la contractilité
jonctionnelle par RhoA du domaine apical (Figure 4.1A). La fonction de ce premier
complexe serait en antagonisme avec un second complexe apical, CRB3A>ERM, qui
garantirait l’organisation structurale du domaine apical en inhibant la contractilité
jonctionnelle réalisée par RhoA (Figure 4.1B). De plus, nous montrons une perte du
phénotype contractile des cellules HeLa surexprimant CRB3A en inhibant la
myosine-II et en diminuant la quantité des protéines ERM. Ainsi, nos données
montreraient l’importance de ces deux fonctions de CRB3A dans le maintien de
la morphologie cellulaire (Figure 4.1C).

Notre modèle pourrait expliquer l’importance du dosage des protéines Crb et le

changement apparent de leur localisation pendant la morphogenèse de plusieurs tissus
épithéliaux. En effet, dans les cellules des placodes de la trachée et des glandes
salivaires chez l’embryon, Crb s’accumule de manière stéréotypique le long du
domaine apical des cellules procédant à une constriction apicale. Ainsi, cette
accumulation apicale de Crb permet le recrutement de la Moésine nécessaire à la
formation des fosses trachéales (Letizia et al., 2011). D’autre part, la morphogenèse
des glandes salivaires nécessite une accumulation apicale de Crb, qui promeut leur
invagination en inactivant les ROCK (Roper, 2012). Ainsi, en accord avec notre
modèle, Crb pourrait favoriser dans les deux cas les fonctions apicales de la Moésine,
qui inhiberait en retour le sentier RhoA>ROCK pour assurer l’invagination des
placodes de ces deux tissus. Dans ce cadre, notre modèle pourrait alors préciser le
rôle fonctionnel du domaine extracellulaire de Crb pendant la morphogenèse des
tissus épithéliaux (Figure 4.1C). En effet, lors de la morphogenèse des placodes
trachéales, une action concertée de la Moésine et de Crb, maintenue à la membrane
apicale par son domaine extracellulaire (Letizia et al., 2011), permet de stabiliser en
retour la morphologie cellulaire des placodes (Letizia et al., 2013). Ainsi, notre
modèle suggère qu’une interaction homotypique réalisée par le domaine
extracellulaire de Crb promeut le recrutement et favorise les fonctions de la Moésine
au domaine apical pour stabiliser la morphologie de ces cellules. Chez les

89
mammifères, la surexpression de CRB3A promeut in vitro le sentier RhoA>ROCK
(Loie et al., 2015). Chez la drosophile, les fonctions de RhoA et de la Moésine
s’antagonisent mutuellement pour contrôler la morphologie épithéliale (Speck et al.,
2003). Ces observations pourraient suggérer que la surexpression de CRB3A
pourrait alors inhiber l’activité du module CRB3A>ERM nécessaire à la
stabilisation de l’interaction du domaine extracellulaire de CRB3A. Il serait
intéressant de vérifier l’existence d’une interaction homotypique de CRB3A dans des
cellules favorisant l’activité du module CRB3A>ERM, en co-surexprimant les
protéines ERM nécessaires à la stabilisation apicale de CRB3A ou en inhibant au
préalable le sentier RhoA>ROCK de ces cellules.

90
Figure 26. Modèle des fonctions bimodales de Crb dans le maintien de la
morphologie cellulaire. Voir texte 4.2.2 pour les explications.

4.2.3 CRB3A réprime l’agressivité des cellules tumorales en modifiant

la morphologie cellulaire ?

Nous montrons que la surexpression de CRB3A s’accompagne d’une

modification morphologique associée à une diminution des propriétés migratoires in
vitro ainsi qu’à une diminution de la croissance des xénogreffes des HeLa. Comment

91
la mise en place d’une architecture corticale dense d’actine peut-elle limiter les
propriétés agressives de ces cellules tumorales ? Nous montrons que la surexpression
de CRB3A promeut la phosphorylation de la chaîne régulatrice de la myosine-II, une
modification post-traductionnelle associée à l’activation de ses propriétés contractiles
(Vasquez et al., 2014). De plus, nous observons une forme compacte des colonies
cellulaires surexprimant CRB3A, suggérant l’existence d’un cytosquelette
périphérique d’actine contractile. Il serait alors crucial d’étudier la voie Hippo dans
les cellules HeLa surexprimant CRB3A pour établir son implication dans l’inhibition
de la croissance des xénogreffes. En effet, l’activation de la contractilité corticale par
la voie RhoA>ROCK a préalablement été associée à une prolifération accrue des
cellules, liée à la répression de la voie Hippo, qui peut s’exercer par une voie
mécanosensitive indépendante des contacts cellulaires (Aragona et al., 2013,
Rauskolb et al., 2014, Dupont et al., 2011). Ainsi, au contraire, nous montrons que
l’activation de la voie RhoA>ROCK s’associe à une inhibition de la migration
cellulaire, qui pourrait être défavorable à la croissance des xénogreffes. De manière
intéressante, CRB3A permet de coupler l’activation de la voie Hippo et l’arrêt de la
prolifération en réponse à l’augmentation de la densité cellulaire (Varelas et al., 2010,
Ling et al., 2010, Robinson et al., 2010, Aragona et al., 2013). Ainsi, nos résultats
suggèrent que la transition morphologique des cellules HeLa surexprimant
CRB3A pourrait limiter la croissance des xénogreffes en favorisant l’activation
de la voie Hippo.

Alternativement, une étude récente montre que l’activation des propriétés contractiles
de la myosine-II participerait au maintien de la morphologie cellulaire en séquestrant
l’actine nécessaire aux protrusions membranaires aux régions contractiles (Lomakin
et al., 2015). Cette observation pourrait également expliquer à la fois l’accumulation
d’actine corticale et la diminution des propriétés migratoires des HeLa surexprimant
CRB3A, indépendamment de la voie Hippo. Nos données suggèreraient alors que
CRB3A pourrait in vivo inhiber la migration cellulaire en favorisant la
contractilité jonctionnelle.

92
 4.3 Régulation de Crumbs dans le contrôle de la
tubulogenèse.

Un des axes de mon doctorat s’est attaché à définir la fonction des

mécanismes en aval des protéines Crb dans le contrôle de la morphologie cellulaire.
Dans un second axe, je me suis intéressé au contrôle en amont des fonctions de Crb,
en prenant comme modèle la trachée embryonnaire de drosophile, pour mettre en
lumière ses fonctions dans la morphogenèse des tubes épithéliaux in vivo. En effet, un
des aspects fondamentaux de la morphogenèse des tissus épithéliaux est de
comprendre comment des mécanismes signalétiques intrinsèques à chaque cellule se
coordonnent entre-eux pour générer un tissu à la géométrie adaptée à sa fonction.
Dans cet axe, nous avons pu mettre en évidence le rôle critique de l’activité Rac1 sur
le contrôle des fonctions de Crb pendant le développement de la trachée
embryonnaire (Chapitre 2). Comme le contrôle de sa longueur engage au moins deux
signalisations distinctes, nous avons alors entrepris d’étudier l’implication de Rac1
dans ces deux voies.

4.3.1 Rac1, un régulateur négatif des fonctions apicales de

Crb

En accord avec des travaux précédents (Chihara et al., 2003), nous confirmons
d’abord que l’activité Rac1 est essentielle à la morphogenèse de la trachée
embryonnaire de drosophile. Nos résultats mettent en évidence que l’activité Rac1
limite la taille des troncs dorsaux en inhibant les fonctions de Crb. Ces résultats
appuient le fait que les mécanismes cellulaires de polarité épithéliale et de
morphogenèse tissulaire sont intimement liés (Laprise et al., 2010). Nos données
suggèrent ainsi que l’ensemble des fonctions cellulaires de Rac1 liées au contrôle
de la polarité épithéliale pourrait également être impliqué dans le contrôle de la
tubulogenèse, notamment le module basolatéral Akt/PI3K (Gassama-Diagne et al.,
2006, Chartier et al., 2011). Dans ce cadre, il serait d’abord intéressant d’étudier le
métabolisme des phosphoinositides pour élargir nos connaissances des acteurs

93
impliqués dans le contrôle des paramètres morphométriques des tubes épithéliaux
chez la drosophile.

Ces premières données soulèvent la question intrigante du contrôle spatial de Crb par
Rac1. En effet, comment l’activité d’une protéine apicale peut-elle être contrôlée par
l’activité d’une GTPase ? De manière intéressante, l’activité Rac1 orchestre
localement l’endocytose Rab5-dépendante de protéines transmembranaires dans les
épithéliums tubulaires de drosophile (Chihara et al., 2003, Pirraglia et al., 2010).
D’autre part, Rab5 est déjà caractérisée pour promouvoir l’endocytose de Crb (Lu and
Bilder, 2005), bien que les mécanismes en amont contrôlant ce processus étaient
inconnus. Nous montrons que Rac1 est en amont de Rab5 dans l’endocytose de Crb
dans l’ectoderme de drosophile. Ainsi, nos données suggèrent que Rac1 pourrait
défavoriser l’accumulation apicale de Crb en activant une machinerie
endocytique basée sur Rab5. Il faudrait alors poursuivre la caractérisation de la
coopération de Rac1 sur Rab5 pour raffiner nos connaissances de la mise en place de
l’identité du domaine basolatéral. Ainsi, nous pourrions montrer que l’activité Rac1
promeut l’activation de Rab5, en dosant l’état d’activation de Rab5 dans des
embryons exprimant le dominant négatif Rac1N17 et le dominant actif Rac1V12.

Alternativement, nos données pourraient suggérer que l’activité Rac1 pourrait inhiber
les machineries responsables de la stabilisation de Crb au domaine apical. En effet,
l’expression d’un dominant actif de Pak, un effecteur de Rac1 (Lu and Mayer, 1999),
suffit à déstabiliser le cytosquelette apical des cellules de l’épithélium folliculaire
(Conder et al., 2007). De plus, dans les glandes salivaires, l’expression d’un dominant
actif de Rac1 suffit également à induire une endocytose accrue de Crb et une
diminution d’aPKC à la membrane apicale (Lee and Thomas, 2011). Enfin, la perte
de Cdc42 entraîne l’endocytose de Crb de la membrane apicale (Harris and Tepass,
2008). Ensemble, ces observations et nos données suggèrent que l’activité Rac1
pourrait déstabiliser la localisation apicale de Crb en inhibant le module Par-
6/aPKC/Cdc42. Pour affiner nos connaissances des fonctions de Rac1 dans la
polarité épithéliale, il serait alors nécessaire d’étudier la relation fonctionnelle entre
Rac1 et Cdc42. Ainsi, nous pourrions doser l’état d’activation de la GTPase Cdc42

94
dans des embryons exprimant le dominant négatif Rac1N17 ou le dominant actif
Rac1V12. L’endocytose de Crb induite par la perte de Cdc42 peut être en partie
corrigée par l’expression d’une version constitutivement active d’aPKC (aPKCCAAX
(Sotillos et al., 2004)) (Harris and Tepass, 2008). Nous pourrions alors montrer un
antagonisme fonctionnel entre aPKC (au domaine apical) et l’activité Rac1 (au
domaine latéral) en étudiant la localisation des marqueurs de polarité épithéliale dans
des embryons co-exprimant les dominants actifs Rac1V12 et aPKCCAAX.

4.3.2 Rac1, un chef d’orchestre du trafic vésiculaire dans

la signalisation liée aux jonctions septées ?

Le contrôle de la longueur de la trachée embryonnaire fait ensuite intervenir

une signalisation régulée par les jonctions septées. C’est pourquoi, nous nous sommes
attachés à caractériser le rôle de Rac1 sur ces structures. Ainsi, nous montrons que
l’activité Rac1 est requise à leurs fonctionnalités (Figure 2.4). De plus, nous
montrons que Rac1 n’est pas nécessaire à leurs formations (Figure 2.5 H-I).
Comment peut-on expliquer cette fonction de Rac1 sur ces structures jonctionnelles ?
L’activité Rac1 promeut la fonction de Pak, qui est essentielle au recrutement du
module Scribble dans la formation des jonctions septées des cellules impliquées dans
la fermeture dorsale de l’embryon (Bahri et al., 2010). Toutefois, nous avons pu
observer en microscopie électronique la présence de jonctions septées et n’avons pas
noté de différence d’immunomarquage de FasIII, un marqueur de ces structures
(Woods et al., 1997), suggérant que la fonction de Pak n’est pas cruciale dans les
étapes de formation des jonctions septées de la trachée embryonnaire. Rac1 pourrait
alors soutenir la réorganisation du cytosquelette qui charpente ces jonctions. En effet,
de manière intéressante, bien qu’elles ne partagent pas d’homologie structurale avec
les jonctions septées, les jonctions serrées nécessite également une activation
contrôlée de Rac1 pour assurer leurs fonctionnalités (Jou et al., 1998, Chen and
Macara, 2005, Mack et al., 2012). Les jonctions septées sont des structures
membranaires associées à un cytosquelette d’actine (Lane and Flores, 1988), bien que
son rôle dans l’établissement et le maintien de ces structures n’a pas été étudié. Ainsi,
de manière analogue aux jonctions serrées des mammifères, Rac1 pourrait s’associer

95
localement à des machineries cytosquelettiques (Yamazaki et al., 2007) permettant de
réorganiser le cytosquelette et de permettre la stabilisation des jonctions septées. Il
serait alors intéressant d’étudier les partenaires fonctionnels de Rac1 contrôlant le
remodelage du cytosquelette d’actine en aval, comme le complexe nucléateur d’actine
Arp2/3 (Huang et al., 2013) conservé chez la drosophile (Hudson and Cooley, 2002),
impliqué dans la maturation des jonctions serrées (Zhou et al., 2013), pour étendre
notre vision des fonctions de Rac1 dans la maturation des jonctions septées et dans le
processus de la tubulogenèse.

Pour étudier le rôle de Rac1 sur les jonctions septées, nous nous sommes alors
focalisés sur la protéine Coracle. En effet, le phénotype de la trachée embryonnaire
des embryons déficients pour l’activité Rac1 est similaire aux embryons mutants pour
cora, caractérisés notamment par une perte de la sécrétion des enzymes Verm et Serp
(Lamb et al., 1998, Laprise et al., 2010). De plus, cora est essentiel à l’inhibition des
fonctions de Crb pendant l’embryogenèse (Laprise et al., 2009). Ces observations
nous ont alors suggéré une coopération fonctionnelle entre Cora et Rac1 que nous
avons alors entrepris de caractériser. Ainsi, nous avons trouvé que la diminution de
Rac1 perturbe la localisation latérale de Cora, soulevant l’éventualité d’un contrôle
spatial de Cora par Rac1. Comment un défaut de l’activité Rac1 peut influencer la
localisation d’une protéine cytoplasmique ? Coracle est recrutée à la membrane
latérale par la Nrx-IV, une protéine transmembranaire assurant l’intégrité structurale
des jonctions septées. Il est important de noter que les localisations de Cora et de la
Nrx-IV sont interdépendantes (Ward et al., 1998). De plus, nous avons observé en
microscopie électronique que la perte de l’activité Rac1 entraîne une perte de
l’architecture de la taenidia (Figure 2.11), phénocopiant la perte de plusieurs
régulateurs du trafic vésiculaire impliqués dans la formation des jonctions septées
(Nilton et al., 2010). Ainsi, nos observations pourraient suggérer que l’activité
Rac1 pourrait être requise au trafic ou à la stabilité membranaire de la Nrx-IV.
Il serait alors intéressant d’étudier les relations fonctionnelles entre la Nrx-IV et
l’activité Rac1 en suivant la localisation de la Nrx-IV dans des embryons exprimant
le dominant négatif Rac1N17. Enfin, nous montrons que la perte de Rac1 est associée à
la perte de la sécrétion des enzymes Verm et Serp. Comment expliquer ce défaut de

96
sécrétion ? D’abord, nous avons montré que la perte de Rac1 perturbe l’intégrité des
jonctions septées. Cette explication pourrait suffire à expliquer en aval la perte de la
sécrétion de ces deux enzymes (Wang et al., 2006b, Luschnig et al., 2006).
Cependant, une étude montre le rôle décisif de Rac1 dans le trafic des vésicules de
sécrétion des macrophages (Stanley et al., 2014). Ainsi, Rac1 pourrait également
contrôler directement le trafic des vésicules contenant les facteurs Verm et Serp.

Ensemble, ces observations et nos données suggèrent un rôle orchestral de Rac1

dans le trafic vésiculaire de la cellule épithéliale, permettant de réguler la
formation et la fonction des jonctions septées.

4.3.3 Rac1 et Cora coopèrent dans l’inhibition des

fonctions de Crb

Nous avons ensuite étudié le rôle de Cora sur l’activité Rac1. En effet, les
embryons mutants pour rac ou cora présentent des anomalies développementales
similaires, notamment un défaut de fermeture dorsale (Chartier et al., 2011, Lamb et
al., 1998), qui pourrait également suggérer que Cora, en retour, promeut les fonctions
de Rac1. Dans ce cadre, nous montrons que la perte de Cora se traduit par une
diminution de l’activité Rac1, indiquant ainsi l’existence d’une boucle de rétroaction
positive entre ces deux acteurs (Figure 2.5). Cette découverte d’une coopération
fonctionnelle entre Cora et Rac1 est fondamentale. En effet, Coracle inhibe les
fonctions de Crb par un mécanisme inconnu (Laprise et al., 2009). Nos données
suggèrent ainsi que Cora participe à l’activation de la GTPase Rac1 au niveau
basolatéral, impliquée dans un antagonisme fonctionnel avec Crb (Chartier et al.,
2011). Ainsi, nos résultats viennent enrichir le modèle de régulation cellulaire de
mise en place de la polarité épithéliale (Fletcher et al., 2012) (Figure 2.6).
Néanmoins, le mécanisme d’activation de Rac1 par Cora reste à être déterminé. De
manière intéressante, certaines protéines à domaine FERM sont capables de moduler
localement l’activité de GTPases en recrutant spécifiquement des GEF ou des GAP
(Fehon et al., 2010). Ainsi, ces données pourraient alors montrer que Cora pourrait
promouvoir l’activation de Rac1 en recrutant spécifiquement une GEF de Rac1 aux
jonctions septées. Nous avons alors criblé chez la drosophile les GEF de Rac1

97
capables de restreindre l’allongement de la trachée. Nos résultats préliminaires (non
montrés) semblent indiquer que la GEF de Rac1 Still life, l’orthologue drosophile de
la GEF de Rac1 Tiam-1 (Sone et al., 1997), pourrait jouer un rôle important dans la
restriction de l’allongement de la trachée embryonnaire. En effet, Tiam-1 est
impliquée dans la maturation et la fonctionnalité des jonctions serrées chez les
mammifères (Mertens et al., 2005). Alternativement, Cora pourrait promouvoir
indirectement le recrutement d’une GEF de Rac1 en assurant l’intégrité structurale
des jonctions septées. Dans ce cadre, il serait alors nécessaire de doser l’activation de
Rac1 pour d’autres mutants de composants structuraux des jonctions septées. Ces
données suggéraient alors que les jonctions septées inhibent les fonctions
apicales de Crb en favorisant l’activation de Rac1 au domaine latéral et
participeraient ainsi activement au maintien de l’identité basolatérale de la cellule.

Enfin, il est important de noter que les drosophiles homozygotes mutantes pour des
pertes de fonction de rac1 sont viables et fertiles (Ng et al., 2002) puisque rac1, rac2
et mtl ont des fonctions partiellement redondantes (Hakeda-Suzuki et al., 2002). Pour
étendre nos connaissances de la modulation des fonctions des protéines de polarité
épithéliale par les GTPases, il serait alors intéressant de réitérer nos expériences du
suivi de l’endocytose de Crb dans un embryon surexprimant Rac2 (Avet-Rochex et
al., 2007). Cette expérience pourrait ainsi établir l’implication de l’ensemble de la
famille des gènes rac de la drosophile dans la compensation de la perte de rac1 dans
l’élaboration et le maintien de la polarité épithéliale.

4.4 Fonctions de Crb dans le contrôle de la

tubulogenèse.

L’ensemble de mes travaux de doctorat soulève une question fondamentale.

En effet, comment Crb, une protéine transmembranaire, peut contrôler la
morphologie d’un tube épithélial ? De manière intrigante, une étude biophysique
montre que la modulation des contraintes mécaniques conduisant à la rigidification
d’un tube biologique suffit à promouvoir une morphologie sinueuse (Hannezo et al.,
2012), qui peut être obtenue in vivo par la surexpression de Crb (Laprise et al., 2010).

98
De plus, il est intéressant de noter que les phénotypes de trachée allongée, induits par
la modulation de fonction d’acteurs intracellulaires et extracellulaires très différent
structuralement et fonctionnellement (Chihara et al., 2003, Laprise et al., 2010,
Nelson et al., 2010, Wu et al., 2004), exhibent tous une très grande ressemblance
morphologique. Ainsi, ces observations suggèrent que les fonctions de ces acteurs
clés convergent en aval vers une signalisation mécanique commune. En outre, une
étude a montré l’existence d’un couplage mécanique entre le pôle apical des cellules
trachéales et la matrice apicale extracellulaire qui régule la morphogenèse de la
trachée, et qu’un défaut de ce couplage mène à un allongement du tube (Dong et al.,
2014). Il est utile de rappeler que l’activité Crb permet d’allonger la trachée
indépendamment de la matrice apicale extracellulaire (Laprise et al., 2010).
Ensemble, ces observations suggèrent que Crb permettrait de définir les
paramètres mécaniques du domaine apical, afin de contrôler les paramètres
morphométriques de la trachée indépendamment de la matrice apicale
extracellulaire.

Cette hypothèse est attrayante puisqu’elle permet de lier la signalisation

intracellulaire au contrôle de la tubulogenèse. Ainsi, le contrôle des fonctions de Crb
au domaine apical, notamment dans l’organisation du cytosquelette cortical, pourrait
jouer un rôle majeur dans le paramétrage des contraintes mécaniques qui gouvernent
l’allongement du tube. Comment Crb peut promouvoir des contraintes mécaniques et
rigidifier le domaine apical des cellules épithéliales ? Nous montrons que l’expression
d’une forme tronquée du PBM de Crb dans la trachée embryonnaire (btl-
MycCrbΔPBM) suffit à provoquer son allongement (Figure 3.2). Ces données
indiquent que la fonction d’allongement de la trachée réalisée par Crb peut être
indépendante de son domaine PBM, et donc, de ses fonctions cellulaires dans
l’élaboration de l’identité du domaine apical de la cellule. De plus, ces données
préliminaires indiquent en outre que, contrairement à l’expression du dominant
négatif (btl-MycMoeT559A), l’expression d’un dominant actif de la Moésine (btl-
MycMoeT559D) induit aussi un allongement de la trachée. Enfin, la surexpression de
la Moésine dans les cellules photoreceptrices de drosophile restreint la réorganisation
du domaine apical, empêchant ainsi la maturation des structures photosensibles

99
(Karagiosis and Ready, 2004). Ainsi, en accord avec notre modèle fonctionnel
bimodal de Crb (Figure 4.1), nos données suggèrent que Crb pourrait permettre
le recrutement de la Moésine pour rigidifier le domaine apical et favoriser la
morphologie sinueuse de la trachée. De plus, la perte des GEF de RhoA dans la
trachée de drosophile phénocopie une surexpression de Crb (Massarwa et al., 2009),
suggérant que l’inactivation des fonctions de RhoA favoriserait la rigidification du
domaine apical, qui participerait ainsi en retour à l’élongation des tissus tubulaires.
Ensemble, ces données pourraient suggérer que l’antagonisme apical des
fonctions de Crb (Figure 4.1) pourrait également contrôler la taille de tubes
biologiques (Figure 4.2).

Enfin, les paramètres morphométriques de la trachée sont indépendants du nombre de

cellule qui la constitue. En effet, des embryons manipulés dans leur cycle cellulaire,
présentant soit la moitié, soit le double du nombre normal de cellules trachéales,
arrivent à bâtir une trachée aux dimensions similaires aux embryons sauvages (Beitel
and Krasnow, 2000). Ces observations suggèrent l’existence d’autres mécanismes
mécaniques qui pourraient s’ajouter dans la régulation de l’allongement de la trachée
de drosophile. Dans ce cadre, la diminution de l’activité Rac1 permet d’inhiber le
réarrangement des contacts cellulaires au stabilisant la E-cadhérine jonctionnelle
(Chihara et al., 2003). Rac1 pourrait alors moduler directement les informations
mécaniques transduites par les jonctions adhérentes, qui permettent de coordonner
des processus cellulaires à l’échelle du tissu (Lecuit and Yap, 2015). Alors, la
modulation de l’activité de Rac1 par Crb pourrait jouer un rôle essentiel dans la
morphogenèse des tissus épithéliaux.

100
Figure 27 : Modèle du contrôle de la tubulogenèse par Crb. Crb pourrait
promouvoir la rigidité et une stabilisation mécanique du domaine apical par le
recrutement de la Moésine, qui assure en retour l’allongement du tube épithélial. Crb
pourrait également promouvoir la contractilité des jonctions adhérentes, nécessaire à
la réorganisation des jonctions cellulaires. Enfin, l’activité Rac1 est enrichie au
domaine latéral par un mécanisme dépendant des jonctions septées. L’activité Rac1
permet ainsi de limiter les fonctions de Crb en déstabilisant le domaine apical et les
jonctions adhérentes.

La stabilisation mécanique du domaine apical par Crb par la Moésine pourrait

également jouer un rôle déterminant dans d’autres processus dans la trachée
embryonnaire de drosophile. En effet, les cellules distales de la trachée promeuvent la
formation et la croissance de tubes intracellulaires qui permettent les échanges gazeux
avec l’extérieur. De plus, la surexpression de Crb ou l’expression d’un mutant
constitutif actif de la Moésine empêchent la mise en place d’un réseau élaboré de
tubes intracellulaires au sein des cellules distales (Schottenfeld-Roames et al., 2014).
Ainsi, l’activation excessive du sentier Crb>Moésine au sein des cellules distales
pourrait accroître la rigidité de la membrane apicale des tubes intracellulaires,
qui inhiberait en retour leurs ramifications ultérieures.

La stabilisation mécanique du domaine apical par Crb pourrait aussi être utilisée dans
d’autres processus morphogénétiques chez la drosophile. En effet, pendant la
morphogénèse des glandes salivaires de drosophile, l’élongation de la placode
salivaire est favorisée par Ribbon (Rib), un facteur de transcription qui, de manière

101
concomitante, inhibe la transcription de la Moésine et promeut la transcription de Crb
pour assurer le remodelage des jonctions cellulaires (Kerman et al., 2008). De
manière intéressante, les embryons mutants pour rib ou surexprimant un dominant
actif de la Moésine montrent des défauts de transition morphologique du domaine
apical, associés à un défaut de migration collective des cellules de la placode salivaire
(Xu et al., 2011). En accord avec notre modèle, ces informations suggèrent que la
perte de rib favorise le sentier Crb>Moésine, qui participe alors à rigidifier le
domaine apical et à inhiber le remodelage des jonctions cellulaires, limitant ainsi la
morphogenèse des glandes salivaires.

La rigidification du domaine apical par le module Crb>Moésine pourrait également

jouer également un rôle déterminant dans les épithéliums non tubulaires. En effet,
d’abord, la perte de crb s’associe à une désintégration des tissus qui remodèlent leurs
jonctions cellulaires et leurs surfaces apicales pendant l’embryogenèse (Campbell et
al., 2009). Ensuite, une étude récente montre le rôle déterminant des fonctions
réalisées par le domaine FBM de Crb dans le maintien de l’intégrité physique de
l’amnioserosa de l’embryon de drosophile, en contrôlant un module contractile basé
sur les ROCK et activant les fonctions de la Moésine (Flores-Benitez and Knust,
2015). Ces observations pourraient suggérer que le maintien d’une rigidité
apicale contrôlée par le module Crb>Moésine est centrale pendant la
morphogenèse des tissus épithéliaux.

Enfin, la perte des protéines CRB entraîne un collapse de la structure

tridimensionnelle de la rétine, de la drosophile à l’humain (Bulgakova and Knust,
2009). Chez les mammifères, la perte de CRB3 entraîne la perte des microvillosités
dans l’intestin, la formation de blebs à la membrane apicale des cellules trachéales et
une irrégularité de la membrane apicale des cellules rénales, associés à des défauts
mineurs de polarité apico-basale (Whiteman et al., 2014, Charrier et al., 2015). Ces
observations suggèrent ainsi que la protéine CRB3 pourrait être spécifiquement
impliquée dans le paramétrage de la rigidité de la membrane du domaine apical
in vivo. Enfin, la perte de CRB3 s’associe notamment à des fusions de villosités de
l’intestin de souris (Whiteman et al., 2014), phénocopiant ainsi la perte de l’Ezrine

102
(Saotome et al., 2004). Ces observations suggèrent ainsi que les fonctions mécaniques
en aval des protéines CRB dans la morphogenèse des organes épithéliaux en trois
dimensions pourraient être conservées chez les mammifères et notamment chez
l’humain.

103
4.5 Conclusions

Lors de ma thèse, j’ai pu participer à mettre en évidence un volet de régulation de la

morphologie cellulaire épithéliale par CRB3A qui joue un rôle prépondérant dans
l’activation de la myosine-II par la voie RhoA>ROCK. De plus, j’ai pu montrer que
l’antagonisme fonctionnel entre Rac1 et Crb est conservé dans un contexte
développemental en participant à contrôler les paramètres morphologiques d’un tissu
épithélial tridimensionnel. Ces travaux s’inscrivent ainsi dans le raffinement de nos
connaissances du contrôle réciproque entre la morphologie cellulaire et l’architecture
tissulaire. En effet, à partir de l’ensemble de nos résultats, nous proposons chez la
drosophile un modèle fonctionnel de Crb et de sa régulation dans le contrôle de la
morphogenèse des tissus épithéliaux. L’identification et la caractérisation des
mécanismes orchestrant la mise en place d’une asymétrie membranaire sont d’abord
des enjeux cruciaux pour la compréhension de la biologie des épithéliums. En effet, la
mise en place et la modulation de complexes de polarité, du remodelage du
cytosquelette et du trafic vésiculaire coopèrent fonctionnellement dans le maintien de
l’homéostasie des épithéliums. Cependant, les modalités de leurs interconnexions
restent encore largement méconnues dans le développement. Ainsi, mes travaux
participent au décryptage du dialogue entre ces mécanismes intracellulaires.

D’autre part, les cancers d’origine épithéliale représentent 80% des cancers humains.
L’expression et la localisation subcellulaire des modules de polarité épithéliale sont
généralement dérégulées dans les carcinomes. De plus, la progression tumorale
s’associe à une perte de polarité épithéliale, à la perte des structures jonctionnelles, à
une transition morphologique et à une désorganisation de l’architecture des tissus
épithéliaux. Ainsi, l’identification des mécanismes cellulaires qui la soutienne est
également un enjeu majeur pour la santé humaine. Dans ce cadre, mes travaux
participent à caractériser les voies signalétiques à rétablir dans le traitement du
cancer.

104
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125
Annexes

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Annexe 1 : CRB3A Controls the Morphology and Cohesion of
Cancer Cells through Ehm2/p114RhoGEF-Dependent
Signaling.

Avant Propos :

Cette annexe traite d’un mécanisme moléculaire en aval de la protéine CRB3A chez
les mammifères, mis en évidence au laboratoire. Dans ce cadre, j’ai pu collaborer
étroitement avec Elise Loie sur ce projet lors de la caractérisation de la fonction du
domaine extracellulaire de CRB3A (Section 3.3) et j’ai notamment pu réaliser la
construction CRB3AN36A utilisé dans ce chapitre.

127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
Annexe 2 : Rac1 controls epithelial tube length through the
apical secretion and polarity pathways.

141
142
143
144
145
146
147