13/06/2011

COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

Sance I 12/06/2011

ACIDES NUCLEIQUES

INTRODUCTION
Les acides nucliques ont t caractriss chimiquement au dbut du 20me sicle mme si leur rle est rest relativement longtemps inexpliqu. Les acides nucliques ont t isols initialement des noyaux des cellules. On distingue deux grands types: les acides dsoxyribonucliques (ADN) localiss dans le noyau des cellules les acides ribonucliques (ARN)localiss dans le cytoplasme cellulaire. Les acides nucliques (ADN et ARN) sont des macromolcules et comportent des sous-units appeles nuclotides. Ils jouent galement un rle fondamental dans le mtabolisme sous forme di- et tri-phosphoryle ainsi que dans la transmission de 2 linformation dans la cellule (AMPc et GMPc).

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ACIDES NUCLEIQUES
INTRODUCTION

Exprience dOswald Avery (1944)

Travail bas sur une publication de 1928 dont lauteur est Fred Griffith

2 types de pneumocoques

S (smooth)

R (rough)

ACIDES NUCLEIQUES
INTRODUCTION

Exprience dOswald Avery (1944)

Travail bas sur une publication de 1928 dont lauteur est Fred Griffith

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ACIDES NUCLEIQUES
INTRODUCTION

Exprience dOswald Avery (1944)

S +R

ACIDES NUCLEIQUES
INTRODUCTION

Exprience dOswald Avery (1944)

Souche R + protines de S Souche R + capsule de S Souche R + lipides de S Souche R + acides nucliques de S Souche R + ac.nucliq. de S + DNase Souche R + ac.nucliq. de S + RNase

ADN support chimique de lhrdit

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NUCLOTIDE Un nuclotide comporte trois composants: de lacide phosphorique + un ose + une base. Base azote

Groupement phosphate

Sucre : dsoxyribose

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ACIDES NUCLEIQUES

Nuclotides : - base azote - sucre - acide phosphorique

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BASES AZOTES
Il y a 4 sortes de bases azotes:qui appartiennent deux classes de molcules selon le noyau aromatique qui en constitue le squelette.

Il peut y avoir plus de AT que de CG ou l'inverse (a varie selon les espces), mais il y a toujours autant de A que de T et de C que de G. A = T et C = G
Erwinn Chargaff (1947)
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ACIDES NUCLEIQUES 2 sortes de bases azotes htrocycliques bases pyrimidiques (noyau pyrimidine)
4 3

bases puriques (noyau purine)

6 5 7 1

N N
1

N N
3 4

N
8

N
9

Le noyau pyrimidine est le plus simple : cest un noyau aromatique hexagonal six atomes, quatre carbones et deux azotes (n 1 et 3).
13

ACIDES NUCLEIQUES

bases pyrimidiques
fonction imino-amine fonction amide fonction amide

NH2 N O
3 2 4 1

O H HN O
3 2 4 1

O CH3
5 6

5 6

HN O

3 2

4 1

H
5 6

N H
ADN/ARN

N H
thymine (T)
5-mthyl-uracile

N H
uracile (U)

cytosine (C)

ADN

ARN

Les bases pyrimidiques sont au nombre de 3 : la cytosine, la thymine et luracile La cytosine :le carbone 4 est substitu par une fonction amine et le carbone 2 par une fonction ctone. Luracile : les carbones 2 et 4 portent des fonctions ctone. La thymine : les carbones 2 et 4 portent des fonctions ctone, le carbone 5 est substitu par un mthyl. 14

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ACIDES NUCLEIQUES

bases pyrimidiques
fonction imino-amine fonction amide fonction amide

NH2 N O
3 2 4 1

O H HN O
3 2 4 1

O CH3
5 6

5 6

HN O

3 2

4 1

H
5 6

N H
ADN/ARN

N H
thymine (T)
5-mthyl-uracile

N H
uracile (U)
ARN

cytosine (C)

ADN

La dsamination oxydative de la cytosine en uracile: Dans lADN, luracile sera rpar par des enzymes de rparation
Dans lARN, ces changements ne sont pas graves car la dure de vie de lARN et des protines est courte. Labsence de T permet la reconnaissance de lARN pour les enzymes de dgradation et un gain dnergie. 15 La dsamination oxydative de la cytosine Methyle Thymine (pas de rparation) : Dans LADN, elle est source de mutations (Pts chauds de mutations ou hot spot frquente dans les ilots CG)

ACIDES NUCLEIQUES

Tautomrie :
H+
3

quilibre impliquant la migration de protons

NH2 N
3 2 4
2

NH2 H H-N O
3 2 4 1

H
5 6

5 6

N
1

H
Echange dhydrogne entre N1 et N3

Cet quilibre ne concernera pas les bases o N1 est substitu.

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ACIDES NUCLEIQUES
quilibre amino-imino (cytosine)

NH2 N O
3 2 4 1

NH H HN O
3 2 4 1

H
5 6

5 6

N H

N H

99,99%

0,01%

En solution ces 2 espces molculaires sont en quilibre (quilibre fortement dplac vers la forme amino).
17

ACIDES NUCLEIQUES
quilibre nol-ctone (thymine-uracile)

O
1

H+
2

H O H N O
3 2 4 1

O H
5 6

H-N O

3 2

4 1

N O H

5 6

3 2

4 1

H
5 6

N H

N H

N H

En solution

forme ctone prdominante

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Bases Pyrimidiques Modifies

Il existe des bases pyrimidiques modifies (chez les phages par exemple).

NH2 N O
3 2 4 1

NH2 CH3 N O
3 2 4 1

CH2OH
5 6

5 6

N H

N H

5-mthylcytosine

5-hydroxymthylcytosine

19

Bases Pyrimidiques Modifies

Des analogues de luracile (5-halogno-uracile) sont utiliss en thrapeutique anti-tumorale (Anticancreux). .

O HN O
3 2 4 1

X
5 6

N H

X = F, Cl, Br, I

20

10

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ACIDES NUCLEIQUES 2 sortes de bases azotes htrocycliques bases pyrimidiques (noyau pyrimidine)
4 3

bases puriques (noyau purine)

6 5 7 1

N N
1

N N
3 4

N
8

N
9

Les purines ont un double noyau aromatique comportant gauche un cycle hexagonal de 4 carbones et 2 azotes et droite un cycle pentagonal de 3 carbones (dont 2 communs avec le prcdent) et 2 azotes.
21

BASES PURIQUES
NH2 N1
2 3 6 5 4 9

O N
7 8

HN H2N

6 1 2 3 5 4

N
7 8 9

N
ADN/ARN

NH

N
ADN/ARN

NH

adnine (A)

guanine (G)

Les bases puriques sont au nombre de 2 : ladnine et la guanine. Ladnine : le carbone 6 est substitu par une fonction amine. Elle est la seule des bases nucliques dont la formule ne contient pas datome doxygne. La guanine :le carbone 2 est substitu par une fonction amine et le carbone 6 par une fonction ctone.
22

11

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ACIDES NUCLEIQUES
Dautres purines existent : xanthine, hypoxanthine, acide urique, cafine

O HN O N NH N H xanthine N

O N

NH N H hypoxanthine

Intermdiaire du mtabolisme de ladnine et de la guanine

23

ACIDES NUCLEIQUES
Dautres purines existent : xanthine, hypoxanthine, acide urique, cafine

O CH3 N O N CH3 cafine N N CH3 CH3 N O

O NH N

N CH3

thophylline

24

12

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ACIDES NUCLEIQUES
Dautres purines existent : xanthine, hypoxanthine, acide urique, cafine

O HN O N CH3 thobromine

CH3 N N HN O

O NH O NH O HN O N O NH NH acide urique (goutte) NH

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ACIDES NUCLEIQUES

Nuclotides : - base azote - sucre - acide phosphorique

26

13

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ACIDES NUCLEIQUES 2 sortes de sucres D-ribose

5

D-dsoxyribose
(2-dsoxyribose)
5

HOH2C
4 3

O
1 2

OH HOH2C
4 3

O
1 2

OH

OH

OH

OH

ARN

ADN

pentoses sous forme furanique (5 atomes dans le cycle)

Le dsoxyribose, est driv du ribose par une rduction de la fonction alcool secondaire du carbone n2 qui confre cet AN une plus grde stabilit propre sa fonction de conservation de linformation 27 gntique.

ACIDES NUCLEIQUES

Liaison base-sucre
N
3 2 1 4 5 6

nucloside
N
1 2 6 3 5 4

N
7 8 9

HOH2C

N H O
4 3 1 2

H2O OH HOH2C
5

N O
4 3 1 2

N H OH

H2O

OH OH / H

OH OH / H

Les sucres (ribose ou dsoxyribose) se lient aux bases azotes par des liaisons impliquant un des azotes de la base (azote n1 des pyrimidines ou azote n9 des purines) et le carbone n1 de lose (carbone rducteur ou fonction semi-actalique). Ce sont des liaisons N-osidiques. 28

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ACIDES NUCLEIQUES

Nuclotides : - base azote - sucre - acide phosphorique

30

15

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ACIDES NUCLEIQUES acide phosphorique : H3PO4 O P

pKa = 7

pKa = 2 pKa = 10

H-O

O-H

O-H

Les diffrentes fonctions acides ont des pKa variables.

Lacide phosphorique (H3PO4) possde trois fonctions acide. Deux de ces fonctions sont estrifies dans les ADN et les ARN. La troisime fonction acide est libre. LH3PO4 permet la solubilisation de lADN dans leau grce leurs charges (-) Il est responsable de la fonction des acides nucliques. Les H3PO4 permettent la polymrisation des acides nucliques (nuclotides).

ACIDES NUCLEIQUES

Liaison acide phosphorique-sucre= Estrification

OH O P OH HO-H2C
5

O
OH O P O O

O
4 3 1 2

OH

H2O CH2
4 3 5

OH OH / H O
1 2

OH

OH OH / H

32

16

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ACIDES NUCLEIQUES
nuclotides pyrimidiques
NH2
4

O H3C OH O
5 5 4

H
6 3 1 2

OH
5

5 6

N 3
2

N O

O P O O

CH2
4

O
3 2

N
1

O P O O

CH2
4

O
3 2

N
1

HO H HO H dsoxycytosine-5-monophosphate dsoxythymidine-5-monophosphate (dCMP) (dTMP) La liaison dun nucloside avec un phosphate se fait par une estrification de la fonction alcool primaire (carbone n5) du sucre et une des trois fonctions acides du phosphate. Lester obtenu est un nuclotide = Un nuclotide est donc form dune base azote, lie par une liaison osidique avec un sucre, lui-mme li par une liaison ester avec un phosphate. 33

ACIDES NUCLEIQUES
nuclotides puriques
NH2 N
7 6 5 4 3

O N
7 6 5 4 3

OH
5

O P O O

CH2
4

O N
1 2 3

1 2

N OH
5

N
1 2

O P O O

CH2

O N
4 3 1 2

NH2

HO H dsoxyadnosine-5-monophosphate (dAMP)

HO H dsoxyguanosine-5-monophosphate (dGMP)

La liaison dun nucloside avec un phosphate se fait par une estrification de la fonction alcool primaire (carbone n5) du sucre et une des trois fonctions acides du phosphate. Lester obtenu est un nuclotide = Un nuclotide est donc form dune base azote, lie par une liaison osidique avec un sucre, lui-mme li par une liaison ester avec un 34 phosphate.

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ACIDES NUCLEIQUES
Dans les cellules les nuclotides sont retrouvs sous forme nulosides mono, di- et triphosphates adnine liaisons anhydride dacide NH2 liaison phosphoester N 6 N 7 5 1 8 O O O 4 2 3 9 5 N pKa = 7 CH2 O N HO P O P O P O 4 1 O O O
3 2

HO

OH adnosine

AMP ou adnylate ADP ATP

35

ACIDES NUCLEIQUES
A partir dATP, et grce une enzyme appele adnylate cyclase, il y a synthse dAMP cyclique. NH2 N 6 N 7 5 1 8 O O O 4 2 3 9 5 N CH2 O N HO P O P O P O 4 1 O O O
3 2

ATP

adnylate cyclase
5

OH OH N
7 8 5 4

NH2
6 3 1 2

O + O

CH2
4

O N
1 2 3

HO P O P OH O O

O= P O - O

OH

PPi

AMPc
36

18

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On dsigne par nuclotides les nuclosides monophosphates : AMP ou acide adnylique, dTMP ou acide dsoxythymidylique, etc... Les nuclosides polyphosphates sont des diphosphates : ADP ou GDP... ou encore des triphosphates, les plus riches en nergie : ATP ou GTP ; etc... Les acides nucliques sont forms par une polycondensation de nuclotides AMP, CMP, GMP et UMP pour les acides ribonucliques, dAMP, dCMP, dGMP et dTMP pour les acides dsoxyribonucliques 37

ACIDES NUCLEIQUES : NOMENCLATURES

O
P
5

5
OH
5

CH3
5 6

N 3
2

P
5

3 3 3 3

Thymine (T)
O O N
7 6 5 4 3 1

P
5

O P O O

CH2
4

O
3 2

N
1

P
5

HO

T G A C

N H
2

5pTpGpApC 3 TGAC TgAC tgac

O C-O-P-O-C O Liaison phosphodiester

H
5

8 9

Guanine (G)
H
7 5 4 3

O P O

CH2
4

N H H N
6 1

O
1 2 3

H N
2

N H
8 9

Adnine(A)

H Les liaisons reliant les nuclotides: 5 N N H H les nuclotides sont assembls O P O CH2 O N 4 1 entre eux par des liaisons ester O 4 3 2 H N entre un OH de H3PO4 et lH de la fonction OH 5 3 Cytosine (C) 6 2 situe en 3 de lose. 1 O H H O 5 N Quand lH3PO4 prsente ses deux fonctions O P O CH2 O acides bloques dans la formation dester, on 4 1 O parle de liaison phosphodiester : a la liaison 3 2 ester entre H3PO4 et lOH en 3 de lose, b la HO H liaison ester en 5 de lose

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Sens de lecture dun acide nuclique:

Par convention, on lit toujours un acide nuclique dans le sens de lextrmit 5 comportant en rgle un groupement phosphate) vers lextrmit 3 qui possde un OH libre. La squence des bases dun ADN par convention sera crite soit dans le sens vertical ou dans le sens horizontal en prcisant les extrmits 5 et 3 et on indique seulement les bases correspondantes (A, T, G ou C).

3 T A C A G 5 A T G T C

LES ADN
Les ADN prsentent des plusieurs caractristiques propres et qui les opposent aux ARN: Lose: le 2-dsoxyribose (remplac par le ribose dans les ARN). Les bases: A, C, G et T, soit deux bases puriques A et G et deux bases pyrimidiques :C et G. Dans les ARN, T est remplac par U (uracile). Les polymres de nuclotides: La molcule dADN est constitue en rgle de deux chanes (ou brins) de nuclotides contrairement aux molcules dARN qui sont le plus souvent sous forme dun seul brin.

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Structure des acides nucliques 1. ADN

LADN est form de deux chanes de polynuclotides antiparallles (vont dans des directions opposes); Les bases sont presque perpendiculaires laxe (inclinaison de 6o); Les bases sont enfouies lintrieur de la structure, avec le squelette sucre-phosphate lextrieur; Les deux chanes sont maintenues ensemble via la formation de ponts H entre bases azotes:

bases

A forme 2 ponts H avec T (paire de base AT) G forme 3 ponts H avec C (paire de base GC)

Squelette sucre-phosphate

Cette relation A:T et G:C dicte la complmentarit des deux chanes:

La nature de la base sur un brin donne immdiatement la nature de la base sur le brin oppos;

41

42

21

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Structure des acides nucliques 1. ADN

Les deux chanes polynuclotidiques forment une hlice droite:
Environ 10 paires de bases par tour dhlice; 3.4 entre 2 bases 34 par tour 20 de diamtre

Prsence de deux crevasses sillons la surface de lhlice:

Petit sillon faible distance entre les deux chanes; Grand sillon: plus grand espace entre les deux chanes;

Certains antibiotiques peuvent sinsrer dans un des sillons de lADN (Ntropsine) dautres sintercalent entre les bases CHMI 2227 - E.R. Gauthier, 44 (Daunomycine). Ph.D.

1 (ngstrom) = 0.1 nm = 1 x 10-10 m

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Les formes de lADN.

La forme B de lADN est la forme biologique la plus importante. dcrite en 1953 par Crick et Watson. Les caractristiques de lhlice rgulire sur les suivantes:
10 paires de bases par tour de spire le pas de lhlice est de 3,4 nm et le diamtre de lhlice est de 2 -2,4 nm.

Dans les cellules, la forme de lhlice est un peu plus compacte et comporte environ 10,5 paires de bases par tour de spire. Une caractristique importante de la forme B de lADN est la prsence de deux types de sillons appels sillon majeur (1,2 nm de large) et sillon mineur (0,6 nm de large).

James Watson (1928- )

Francis Crick (1916-2004)

Nobel 1964
2003 : 50 ans aprs la dcouverte de la structure de lADN

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Helice A= Duplex ARN/ARN et ADN/ARN

Plus large: 26 Plus courte: 11 bp/turn Distance par paire de base: 2,6 Les bases sont plus inclines (20o) Rle : structure secondaire du RNA; complexes RNA/RNA ; hybrides RNA/DNA (rplication et transcription). Comme pour lADN : les molcules hybrides ADN/ARN et les duplexes dARN/ARN suivent les mmes rgles de complmentarit et dantiparalllisme. Cependant, le 2OH de lARN affecte la structure de lhlice.
CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 47

La forme Z de lADN
Initialement : ration de laboratoire (Rich, 1979) avec loligonuclotide artificiel d(CGCGCG). Actuellement, on peut obtenir du Z-DNA dans des conditions plus physiologiques. Le Z-ADN forme une double hlice rotation gauche avec 12 paires de bases par tour dhlice. le pas dhlice est plus important (4,5nm) le diamtre de lhlice est plus petit 1,8 contient seulement un sillon. Localiation des Helices de type Z:
squence alterne de Pu et Pyr:squences riches en (GC)n dans le gnome : lots GC. Peut tre reconnu par des Ac anti-Z DNA. De telles squences peuvent se retrouver dans des oprateurs comme "lac operator" ce qui augmente l'affinit pour le lac repressor d'env. 1000X.

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50

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LES ARN

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Proprits physico-chimiques de lADN

DENSIT des AN

Proprits physico-chimiques de lADN

Dnaturation de lADN :
Les acides nucliques double brins (db) (ds) peuvent tre convertis en acides nucliques simple brins (sb) (i.e. dnaturs) de plusieurs faons: Augmentation de la temprature Diminution de la concentration de sel Produits chimiques: NaOH/formamide/formaldhyde (brisent les ponts H) Inversement, lADN sb ou SS peut tre renatur de la faon suivante: : Diminution de la temprature Augmentation de la concentration en sel Ce phnomne peut tre suivi par spectrophotomtrie: Les acides nucliques sb absorbent davantage 260 nm que les acides nucliques db: hyperchromicit;

CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

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27

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Dnaturation de lADN
La temprature laquelle 50% de lacide nuclique db sest dnatur est appele la temprature de fusion (Tm) Le Tm est affect par plusieurs facteurs: Concentration en sels. Longueur des molcules: Tm augmente avec la longueur (pour ADN < 150 pb) Contenu en G+C: Plus le contenu en GC est lev, plus le Tm sera aussi lev.

DNA#1

Hyperchromicit

DNA#2

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ACIDES NUCLEIQUES

Dnaturation de lADN
Densit optique 260 nm

La dnaturation de lADN : augmentation de labsorption dans lultra-violet diminution de la viscosit et augmentation de la densit.

ADN monocatnaire

ADN bicatnaire Tm Temprature (C)

260nm
ADN double brin

<

260 nm
ADN simple brin

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ADN: Absorbance
Les acides nucliques absorbent ~260 nm ( cause des bases puriques/pyrimidiques); Gnralement: les prparations dacides nucliques pures donnent un rapport A260/A280 denviron1.8; Des valeurs de A260/A280 infrieures 1.8 sont gnralement indicatives de la contamination des acides nucliques par des protines. une absorbance de 1 260 nm donne:
50 g / ml dADN 40 g / ml dARN

59

Hybridation des acides nucliques et des sondes nucliques

Lhybridation est une proprit fondamentale des acides nucliques qui repose sur les rgles de complmentarit. Il est possible dapparier des brins dADN (ou dARN) avec des oligonuclotides ou polynuclotides qui reconnaissent spcifiquement des squences sur les brins dADN de manire anti-parallle et complmentaire. Ces oligo ou polynuclotides sont appels sondes nucliques Remarque : Oligonuclotide (oligomre) < 50 nuclotides

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Hybridation
Les acides nucliques sb ayant des squences complmentaires vont se renaturer lorsquelles seront mlanges ensemble (hybridation);
ADN-ADN ADN-ARN ARN-ARN

La renaturation se produira mme si les deux brins ne sont pas parfaitement complmentaires Cependant, le Tm diminue avec le nombre de diffrences dans la complmentarit (mismach) Ce phnomne est trs utilis lors de ltude des acides nucliques:
Squenage PCR Analyse Southern Analyse Northern Analyse FISH Puces ADN

CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

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Effets des acides et alcalis sur les A.N

Acide fort = augmentation de la T= hydrolyse complte de AN. Acide faible = hydrolyse mnage = coupure de la liaison N-osidique : AN apuriniques ou apyrimidiniques Hydrolyse alcaline: changement tautomrique:
PH neutre : forme ceto (oxo)( forme physiologique. PH alcalin : forme enol

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HYDROLYSE ENZYMATIQUE des AN

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Les enzymes de restriction sont des hydrolases agissant sur des liaisons esters = des estrases

Il existe 3 types denzymes classs en fonction des sites quelles reconnaissent : 1. enzymes de type I : lenzyme reconnat un site particulier et coupe environ 1000 jusqu 5000 nuclotides plus loin. 2. enzymes de type II : ce sont les plus nombreuses et les plus utilises aux laboratoires de BM. Leurs sites de restrictions de 4 8 paires de bases sont des squences palindromiques. 3. enzymes de type III : Lenzyme reconnat une squence mais coupe une vingtaine de paires de bases plus loin.

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Liste non exhaustive des enzymes de restriction

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