Chromatographie

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1. Dfinition.
Cest une mthode de sparation, non destructrice en son principe, base sur le fait que le coefficient de partage dun solut entre deux phases dpend de la nature du solut, et donc, si lune des phases est mobile par rapport lautre, les soluts mettront un temps plus o moins long parcourir le chemin imparti cette phase mobile.

2. Buts de la chromatographie.
On peut distinguer deux objectifs principaux:

2.1. Objectif analytique.

Il sagit didentifier des soluts qualitativement et/ou quantitativement, lopration se faisant par le seul processus chromatographique, auquel peuvent tre associes, en passage direct, dautres techniques analytiques chimiques ou physico-chimiques destines faciliter lanalyse qualitative (on qualifie cela de couplage ). Les quantits analyses doivent tre extrmement minimes afin de ne pas scarter des rgles didalit de la thermodynamique (le coefficient de partage nest autre quune constante dquilibre thermodynamique, o les activits intervenant ne sont gales aux concentrations que si elles sont trs faibles. Les systmes de dtection devront donc tre trs sensibles.

2.2. Objectif prparatif.

Les concentrations des soluts sont ici importantes et on travaille hors des rgles didalit thermodynamiques. Les quantits produites demeurent cependant faibles (de lordre du kg / jour) et le procd ne sera utilis que pour prparer des substances rares, sensibles la chaleur (protines, etc...).

3. Variantes chromatographiques.
On peut distinguer les chromatographies en phase liquide et celles en phase gazeuse.

3.1. Chromatographies en phase liquide.

On distingue:

Il sagit soit dun adsorbant (chromatographie liquide - solide : CLS), ou bien dun substrat agissant par partage (chromatographie liquide - liquide : CLL). Dans les deux cas, le vhicule porteur, un liquide, peut tre soit la pression ordinaire, soit soumis une pression pouvant atteindre plusieurs centaines de bars. Dans ce dernier cas, on utilise le procd de chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP).

3.1.1. La chromatographie sur colonne (CPL) : le substrat actif est tass dans un tube.

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3.1.2. Si le substrat est un changeur dion, on opre par chromatographie par change dions. 3.1.3. On peut utiliser la chromatographie sur gel permable. Elle permet dobtenir des
sparations de constituants de degrs de polymrisation diffrents dans un polymre.

3.1.4. La chromatographie sur papier (CP) : le substrat est la charge (eau, sels,...) et les
fibres dun papier convenablement choisi, le vhicule se dplaant dans le papier grce aux forces capillaires.

3.1.5. La chromatographie sur couche mince (CCM) rpond la mme description, mais
le substrat est tal et fix sur une plaque inerte, verre ou autre.

3.2. Chromatographie en phase gazeuse.

Le substrat est toujours contenu dans un tube ou colonne (classiques ou capillaires). L encore, cest un adsorbant (chromatographie gaz - solide : CGS) ou un support inerte imprgn dun liquide lourd stationnaire (chromatographie gaz - liquide : CGL). Quand le mlange analyser est liquide, il est gnralement introduit sous cette forme dans lappareil, conu pour le vaporiser instantanment. Le vhicule est toujours un gaz dont la pression dentre peut tre choisie et ventuellement programme, de mme que la temprature laquelle est porte la colonne peut tre maintenant constante ou au contraire programme.

4. Terminologie gnrale de la chromatographie.

4.1. Solut: toute substance constituant dun mlange, spare par chromatographie. 4.2. Phase mobile: le vecteur, liquide ou gazeux, qui dplace le solut. 4.3. Phase stationnaire: le produit qui, par ses affinits avec les soluts, va permettre leur sparation quand la phase mobile les dplace. 4.4. Support: Un substrat inerte qui porte la phase stationnaire. 4.5. Remplissage: lensemble des produits (adsorbant, support + phase stationnaire, etc...) qui garnissent une colonne chromatographique. 4.6. Colonne chromatographique: tube de diamtre et longueur variable, en verre, mtal, ou autre substance, lintrieur duquel soprent les sparations chromatographiques. 4.7. Dveloppant: une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui dplace les soluts dans la phase stationnaire, de telle manire quils demeurent dans celle-ci : cas de la CP et de la CCM.

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4.8. luant: une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui dplace les soluts dans la phase stationnaire, jusqu ce quils sortent de celle-ci 4.9. Chromatographie dlution: celle dans laquelle la phase mobile parcourt en permanence la phase stationnaire afin que les soluts introduits une extrmit de celle-ci sortent lextrmit oppose. Dans cette mthode, la phase mobile est inerte vis--vis de la phase stationnaire. 4.10. Chromatographie de dplacement: procd dans lequel la phase mobile a plus daffinit que le solut pour la phase stationnaire, donc le pousse devant elle. 4.11. Rapport frontal: rapport entre la distance parcourue par un solut dans une phase stationnaire et la distance parcourue dans le mme temps par le dveloppant. 4.12. Coefficient de partage: rapport des concentrations respectives du solut dans la phase stationnaire et la phase mobile, au cours de lanalyse. 4.13. Valeurs de rtention: toutes donnes qui permettent de chiffrer laction spcifique dune phase stationnaire donne sur un solut donn, au cours dune analyse chromatographie. 4.14. Chromatogramme: trace sur un papier enregistreur des rponses successives du dtecteur, au cours de llution des soluts hors des colonnes.

1. Analyse qualitative
Elle sert essentiellement lidentification des composants dun mlange.

1.1. Utilisation des grandeurs de rtention.

Pour une phase stationnaire donne, le volume de rtention spcifique est caractristique du solut concern. mais sa mesure prcise nest pas possible avec un chromatographe ordinaire Aussi recourt-on aux valeurs de rtention relatives, cest-dire en rapportant la grandeur (essentiellement un temps de passage dans la colonne) relative un solut inconnu, celle dun produit connu, inject sur la mme colonne,

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dans les mmes conditions. on obtient ainsi une valeur de rtention indicies "2" correspondent ltalon.

o les valeurs

Les temps de rtention sont mesurs au sommet des pics chromatographiques.

1.2. Tables.
Des tables ont t constitues, avec comme entres la nature de la phase stationnaire et la temprature. Nanmoins, un certain nombre de contraintes existent au niveau du choix des talons et lon prfre souvent se rfrer une chelle universelle, par exemple celle des indices de rtention, propose par KOVATS (1963). Ces derniers sont fonds sur la relation linaire constate entre le logarithme du volume de rtention spcifique et le nombre n datomes de carbone du solut, dans une famille de produits homologues, par exemple celle des hydrocarbures saturs aliphatiques: , relation valable uniquement pour les termes comportant plus de cinq atomes de carbone.

2. Performances des colonnes chromatographiques. 2.1. Facteur de capacit.

Soit t0 le temps mis pour la phase mobile traverser la colonne, et ti le temps de rtention de chaque solut. Le facteur de capacit de la colonne k sexprime de la manire suivante:

2.2. Slectivit dune colonne.

Pour caractriser la distance sparant les sommets de deux pics conscutifs 1 et 2, on utilise le facteur de slectivit (ou rtention relative) dfini par la relation: o K1 et K2 sont les coefficients de partage des soluts 1 et 2 entre les phases stationnaire et mobile. Ce facteur de slectivit a mesure la diffrence de distribution thermodynamique des deux soluts. Il est facile de dmontrer que: ,o apparaissent les enthalpies libres de distribution des soluts entre les deux phases.

2.3. Efficacit dune colonne.

Les pics tant supposs Gaussiens, on peut caractriser llargissement des pics, dautant plus important que lefficacit de la sparation est faible, par un nombre de

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Pour une gaussienne vraie, n sexprime des trois manires suivantes:

plateaux thoriques n, semblable celui rencontr pour la distillation fractionne.

o est lcart-type de la gaussienne exprim en unit de temps,

o est la largeur du pic la base exprime en unit de temps, dtermine par lintersection des tangentes au points dinflexion la courbe gaussienne et de la ligne de base, et o est la largeur du pic mi - hauteur, exprime en unit de temps. En pratique, on mesure directement tr , et sur le chromatogramme. Pour pouvoir comparer entre elles des colonnes de diffrentes longueurs, on dfinit la hauteur quivalente un plateau thorique (HEPT), de la manire suivante: H = L/N o L est la longueur de la colonne. Une colonne efficace prsente souvent une HEPT de quelques microns (colonnes capillaires en CPG).

2.4. Rsolution des colonnes.

La rsolution R entre deux pics est dfinie par la relation: Il dcoule de cette dfinition que la sparation est dautant meilleure que R est plus grand. Ainsi pour deux pics daires voisines, lorsque R est suprieur 1, la sparation est pratiquement complte, puisquil ny a alors que 2% de recouvrement. Pour R infrieur 0,8 la sparation est gnralement insuffisante. En supposant les largeurs des pics la base du mme ordre, on dmontre que la rsolution R peut tre exprime par la relation:

o est la slectivit de la colonne, le facteur de capacit du second pic et N le nombre de plateaux thoriques relatif au second solut.

2.5. Paramtres influenant lefficacit.

Globalement, interviennent les facteurs suivants:

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- le diamtre des particules de remplissage de la colonne qui doit tre petit. Cette dernire doit tre charge de faon trs homogne. - le gaz porteur ne doit pas tre trop lger (en CPG) - lpaisseur du film de phase stationnaire doit tre trs petite. - le dbit de phase mobile influe de manire complexe, selon la courbe suivante:

On montre quil existe galement un optimum de temprature, et gnralement, en CPG, plus la temprature de la colonne est basse, meilleure est la sparation, avec cependant un temps danalyse parfois rdhibitoire.

2. Analyse quantitative.
Une fois identifis le ou les soluts intressants, celui-ci permet lanalyse quantitative grce la relation: mi = Ki Ai , qui relie la masse m du solut i inject laire du pic Ai reprsentant ce solut. Il est donc ncessaire de mesurer les aires des pics et de dterminer, pour chaque solut, le coefficient de proportionnalit Ki .

2.1. mesure de laire des pics.

On utilise essentiellement la triangulation manuelle et lintgration automatique.

2.1.1. Triangulation
On assimile le pic un triangle soit en traant les tangentes aux points dinflexion de la courbe et

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en calculant laire:

Ai = H , soit en mesurant la largeur mi -hauteur et en calculant laire par: Ai = H ,

ou encore en mesurant les largeurs au quart ( ) et aux trois quarts ( ) de la hauteur, . grce :

2.1.2. Intgration
Elle peut se faire par planimtrie, mais surtout par intgration mcanique, ou mieux lectronique et informatise. Quand les pics sont trs pointus et trs troits, on peut se contenter des mesures des hauteurs H , alors proportionnelles aux aires.

2.2. Dtermination du coefficient de proportionnalit.

il est impossible avec les chromatographes courants de calculer le coefficient de proportionnalit par mesure directe de laire du pic enregistr quand on introduit une masse exacte, connue, dun solut dun injecteur. Les seringues dinjection ne permettent pas de reprer le volume dchantillon avec une prcision suffisante. On aura donc recours des mthodes dtalonnage, qui, comme en analyse qualitative, feront de la chromatographie quantitative un procd relatif vis--vis de substances connues. Voici les principales mthodes utilises.

2.2.1. Normalisation interne.

On considre ici, en premire approximation, que tous les Ki sont gaux (principalement dans les sries homologues telles que alcanes, alcools, etc..). On obtient alors les pourcentages en masse de chaque solut de la manire suivante:

2.2.2. Mthode des ajouts doss.

Le principe est le suivant: on prend dabord le chromatogramme du mlange de soluts tudier. Admettons que lon cherche dterminer le pourcentage en masse du compos n 2. On va obtenir laire du pic correspondant A2 , et lon dtermine galement celle dun pic voisin, par exemple A3 . On pse ensuite exactement une masse M de ce mlange voisine de 1g par exemple. Puis un y rajoute une masse m0 du compos n2, connue exactement, voisine de 300 mg environ. Le chromatogramme du nouveau mlange donne deux aires A2 et A3. Dmontrons maintenant le rsultat suivant:

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Soit M0 la masse initiale de mlange, et m0i les masses des divers constituants de ce mlange. On en pse exactement une fraction M qui contient les masses mi des constituants. Grce la seringue chromatographique, on injecte dans la colonne une masse contenant les masses i des constituants. Nous allons nous intresser aux constituants n2 et n3. Comme les rapports des masses des constituants dun mlange se conservent dans toute fraction de ce mlange, il vient: (1) la masse M prpese, on rajoute alors une masse m0 pese prcisment de compos n2. En appelant la masse injecte et i les masses des constituants de , il vient: (2)

En admettant que tout ce qui a t inject sort de la colonne, on a :

Do nous liminons les constantes de proportionnalit:

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Le rapport de ces galits donne:

(3)
(1) et (2) nous donnent dautre part:

En combinant (3) et (4), nous obtenons une relation o seul m2 est inconnu:

Le pourcentage en masse de 2 dans le mlange est donc:

La mthode demande une bonne linarit de la rponse du dtecteur chromatographique, ce qui nest pas toujours le cas. Nous supposerons cependant que le dtecteur utilis en TP, le catharomtre, prsente cette qualit.

2.2.3. talonnage interne

Dans cette mthode, on compare individuellement chacun des pics valuer au pic dune substance talon E , convenablement choisie, introduite en proportion connue dans le mlange analyser. il convient videmment que le pic talon ne soit confondu avec aucun des pics du chromatogramme. On peut crire:

On dfinit alors On calculera donc la rponse de chaque solut concern par rapport ltalon. La mthode est gnrale. Elle est prcise et reproductible.

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Elle suppose nanmoins le choix dun talon qui, outre la ncessit de ne pas chevaucher avec les autres soluts, doit donner un pic de valeur de rtention proche de celle du pic mesurer, daire approximativement gale celle du pic du solut, et dont la rponse doit se situer dans la zone de linarit du dtecteur utilis.