Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 6

Numération des leucocytes

Dénombrement direct au microscope

1 - Principe

Le sang recueilli sur anticoagulant sec, est dilué de façon précise dans un liquide qui lyse
leshématies (trop nombreuses, elles gêneraient la numération).
Les leucocytes sont comptés au microscope dans un volume connu de sang dilué, sur
unhématimètre.

Remarque : Lors de cette numération, on dénombre toutes les cellules nucléées du sang.
Aussi, si le frottis sanguin révèle la présence d’érythroblastes (précurseurs des érythrocytes
possédant un noyau), il faut corriger le résultat pour obtenir le nombre réel de leucocytes.
(Voir fiche 10 : exercices - formules leucocytaires).

2 - Réactifs et matériel

2.1 - Sang à analyser

Le sang est prélevé chez un sujet à jeun et au repos.
On peut utiliser :
• Du sang veineux recueilli sur EDTA. Cet anticoagulant sec ne dilue pas le sang et respecte
l’aspect des cellules.
• Du sang capillaire prélevé au bout du doigt chez l’adulte ou au talon chez le nouveau-né.

2.2 - Matériel
• Pipette automatique P 200 et pipette à déplacement positif et à piston de 20 µL

• Hématimètre et lamelle planée.

L’hématimètre de Malassez est utilisé habituellement.
L’hématimètre de Thoma ayant un volume trop faible (0,1 mm3) ne doit pas être utilisé.

• Microscope avec objectif à sec (x 10 et x 40)

2.3 - Diluant : liquide de Hayem

• Acide acétique .................. 1 mL
• Bleu de méthylène (1%) ... 5 mL
• Eau distillée QSP .............200 mL
2.4 - Manipulation

2.4.1 - Préparation de l’hématimètre (cf. fiche 2)

- Faire adhérer la lamelle aux plateaux.
Cytologie sanguine

2.4.2 - Dilution du sang au 1/20

Le sang doit être soigneusement homogénéisé (20 min sur l’agitateur rotatif ou nombreux
retournements lents du tube)
Préparer le matériel nécessaire à la manipulation avant d’enfiler les gants.
- Réaliser la dilution : prélever 20 µL de sang et les diluer dans 380 µL de diluant.
- Homogénéiser le mélange sang-diluant.
- Laisser en attente 10 min pour permettre la lyse des hématies.
- Homogénéiser à nouveau avant utilisation.
2.4.3 - Remplissage de l’hématimètre
- Laisser l’hématimètre 5 min sur un plan horizontal pour que les cellules sédimentent.
2.4.4 - Comptage au microscope
Manipuler le microscope sans gant.

* Utiliser l’objectif à sec x 10 pour la * Régler l’éclairage sur une faible intensité :
mise au point, puis x 40 pour le - Lentille du condenseur basculée
comptage - Diaphragme plus ou moins fermé.

- Vérifier à l’objectif x 10 l’absence de bulles d’air et l’homogénéité de la répartition des

leucocytes, dans la chambre de comptage, sinon recommencer le remplissage.

- Utiliser l’objectif x 40 pour compter les cellules

Dénombrer les cellules dans la totalité de la chambre de l’hématimètre de Malassez (10
bandes), en procédant par bande (1 bande = 10 rectangles).
2.4.5 - Calcul
Soit : Établir les équations aux grandeurs
* (fd) le facteur de dilution de sang :N = f (fd, v, n)
* (v) le volume de comptage en L
* (n) le nombre total de leucocytes N=
comptés
(N) le nombre de leucocytes par litre Établir les équations aux unités :
de sang

Calcul du volume utilisé : Hématimètre de Malassez v =

Numération après dilution, déterminer les équations aux grandeurs

simplifiéesfd = 20 N
= f(n) N =
Écart type de répétabilité Sr = 0,15 G/L Rappel : G ou Giga = 109
Incertitude composée Uc = 0,30 G/L
Incertitude élargie U = k. Uc (facteur d'élargissement k=2 pour un niveau de confiance de 95%)
Exprimer le résultat correctement arrondi et accompagné de l'incertitude élargie
Cytologie sanguine

✎ Attention : si le nombre de leucocytes est très important, il est alors nécessaire de diluer le
Cytologie sanguine

Sang au 1/100.
Dans le cas ou fd =100, établir les équations aux grandeurs simplifiée N = f(n).
N=
2.4.6 - Causes d’erreurs
- Mauvaise homogénéisation du sang
- Mauvaise dilution ou mauvaise homogénéisation du sang dilué.
- Mauvaise répartition dans l’hématimètre
- Mauvais dénombrement.

2.5 - Interprétation des résultats

2.5.1 - Intervalles de référence (sujets à jeun et au repos)

Nombre de leucocytes (G/L)

Adulte 4,0 à 10,0
Nouveau-né 15,0 à 30,0
Enfant 1 an 6,0 à 15,0

Il existe des variations liées à :

L’état physiologique du sujet : état de veille ou de sommeil, activité physique, digestion, grossesse
l’âge du sujet (voir tableau ci-dessus) ; il n’y a pas de différence liée au sexe.
C’est entre 5 et 12 ans que les valeurs deviennent celles de l’adulte.

Remarque :
La numération des leucocytes ne concerne que les leucocytes circulants. 50 % des leucocytes totaux
du sang sont marginés, c’est à dire accolés à la paroi des vaisseaux sanguins.
En cas de stress (décharge d’adrénaline), ils passent dans la circulation, ce qui augmente le nombre
de leucocytes circulants.

2.5.2 - Résultats pathologiques

* Il y a leucopénie si le nombre de leucocytes est inférieur aux intervalles de référence.

* Il y a hyperleucocytose si le nombre de leucocytes est supérieur aux intervalles de
référence.

Il est important dans la discussion de préciser l’intensité de l’anomalie (faible, modérée, forte…).
fig. 10 : Numération des cellules au microscopeoptique