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Annales de Toxicologie Analytique, vol.

XIII, n 2, 2001

IX Congrs Annuel de la Socit Franaise de Toxicologie Analytique La Clusaz, 12-16 Mars 2001

I^sums des
communications orales et affiches
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Article available at http://www.ata-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/ata/2001002

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

Relations entre concentrations des benzodiazepines dans les milieux biologiques et leurs effets pharmacologiques et toxicologiques
B. P I Q U E T . B. LEBRUN-VIGNES, G. AYMARD, D. WAROT Service de Pharmacologie, CHU Piti-Salptrire, APHP, 47-83 bd de l'Hpital, 75013 Paris Deux situations diamtralement opposes existent quant l'valuation pharmacocintique-pharmacodynamique des benzodiazepines (BZD) et apparentes dans l'optique toxicologique : l'usage criminel et l'intoxication accidentelle ou volontaire. Les BZD prsentes comme hypnotiques (triazolam, flunitrazpam, tmazpam,...) ou anxiolytiques (lorazpam) ont t plus rgulirement utilises dans les cas de soumission mdicamenteuse. Si tant est que cela ait t rflchi, le rationnel pharmacocintique et pharmacodynamique l'emploi de ces molcules serait alors de prsenter une cintique de diffusion vers les structures encphaliques rapide et d'tre rapidement limin. Aux doses employes les effets dsinhibiteurs et amnsiants sont obtenus chez la majorit des sujets sans atteindre les effets sdatifs prononcs, ce qui permet d'agir en pleine conscience (1,2) ; de plus, une mise en vidence difficile dans les milieux biologiques semble tre un critre de choix de ces molcules. La conjonction de ces paramtres rend ainsi particulirement dlicat la mesure et l'interprtation des concentrations dans les milieux biologiques. C'est pourtant cette situation qui est la mieux prdite par les tudes de screening et de PK-PD en psychopharmacologie clinique. Diffrents plans exprimentaux et modles ont en effet permis de dterminer des CEso susceptibles de servir de rfrence ou de substitut de fourchette thrapeutique (3,4) et d'interprter les dosages plasmatiques en regard d'un effet "clinique" exprimental. Les donnes chez des patients traits sont nettement plus parcellaires et concernent les indications "anxit" et "attaque de panique" (alprazolam) pertinentes d'un point de vue thrapeutique mais pas dans l'approche toxicologique. Tout autre est la dmarche dans le cas des intoxications (suicide), o la dose est le premier facteur prendre en compte, indpendamment de la molcule, puisque, aprs normalisation sur la puissance intrinsque de chaque substance, toutes sont capables d'induire les mmes effets. Seules diffrent les constantes fractionnelles d'limination ; encore faut-il se situer dans une zone de cintique linaire, ce qui n'est pas vrifi dans la plupart des cas. Les zones "toxiques" ne sont pas clairement dfinies et varient de surcrot individuellement. Il y a donc une relation concentration/effet toxique non gnralisable. Par exemple diverses tudes dmontrent une rponse exacerbe aux BZD chez l'Ag, comparativement des sujets jeunes. Les modi114

fications physiologiques lies l'ge peuvent expliquer la plupart des modifications pharmacocintiques des molcules, qui seraient elles-mmes responsables d'un surdosage relatif Cependant les tudes conduites spcifiquement dans cette population ne permettent pas d'exclure une grande diffrence de sensibilit pharmacodynamique des patients gs, ce qui remet en question la pertinence de l'interprtation d'un dosage isol. Rfrences : 1- Green J.F., McElholm A., King D.J., A comparison of the sedative and amnestic effects of chlorpromazine and lorazpam. Psychopharmacol. 1996 ; 128 : 67-73. 2- Roehrs T., Merlotti L., Zorick F. et al. Sedative, memory, and performance effects of hypnotics. Psychopharmacol. 1994 ; 116 : 130-134. 3- Gupta S.K., Ellingwood E.H., Nikaido A.M. et ai, Simultaneous modeling of the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of benzodiazepines. Pharm. Res. 1990 ; 7 : 570-576. 4- Ellingwood E.H., Heatherly D.G., Nikaido A.M. et al., Comparative pharmacokinetics and pharmacodynamics of lorazpam, alprazolam and diazepam. Psychopharmacol. 1985 ; 86 : 392-399.

Une observation inhabituelle d'intoxication au diazepam avec volution sur un mois des taux de diazepam et de nordiazpam
L. de HARO, M. VALLI. J. H. BOURDON, A. ILIADIS, M HAYEK-LANTHOIS, J. ARDITTI Centre Antipoison, Hpital Salvator, 249, Boulevard de Sainte-Marguerite, F-13274 Marseille Cdex 09 Objectifs : Les auteurs prsentent une observation d'intoxication au diazepam inhabituelle pour plusieurs raisons : il s'agissait d'un produit de laboratoire pur et concentr ; les quantits ingres taient connues et prcises ; le patient n'tait pas trait par diazepam avant l'intoxication ; enfin des prlvements sanguins ont pu tre raliss durant un mois, ce qui a permis d'obtenir des paramtres toxicocintiques rares chez l'homme. Observation : Un homme de 54 ans absorbe 2 grammes de diazepam pur (produit de laboratoire) 20 H. Une heure aprs la prise; il dcide d'avertir les secours. 45 minutes plus tard, il est admis dans l'unit de soins du Centre Antipoison de Marseille. Le patient est trait avec 2 doses espaces de 4 H de 25 grammes de charbon actif, et diurse osmotique neutre. Le patient reste inconscient jusqu' la 13 heure, et prsente une dysarthrie, une diplopie, des vertiges et un ralentissement de l'expression verbale jusqu 'au 9 jour. Le patient quitte d'hpital au dixime jour, mais consulte rgulirement pour permettre le suivi clinique et biologique.
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Rsultats analytiques : Les dosages du diazepam et de son principal metabolite le nordiazpam ont t raliss par CLHP avec dtection barrette de diodes (CLHP/BD). 28 chantillons sanguins ont t analyss, permettant de mesurer 20 taux de diazepam et 28 taux de nordiazpam. L'exploitation mathmatique de ces rsultats a permis d'tablir les donnes toxicocintiques suivantes : volume apparent de distribution : 714 litres, demi-vie de 67 h pour le diazepam et 86 h pour le nordiazpam. D'autres donnes seront prsentes. Conclusion : Les donnes toxicocintiques obtenues dans cette observation montrent que dans un tel cas, la demi-vie du diazepam et de son principal metabolite sont plus longues que les valeurs dcrites dans la littrature pour des doses thrapeutiques (1). L'ide classique considrant que les surdosages en benzodiazepines sont des intoxications modres facilement traites par flumaznil est frquemment exprime (2, 3). Les mdecins doivent savoir que mme si dans la plupart des cas, le pronostic vital n 'est pas mis en jeu, les benzodiazepines ne vont pas disparatre ds que le patient se rveille ! Rfrences : 1- Gilman A.G., Goodman L.S., Nies A.S. et al. Goodman and Gilman 's : The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8"' edition, Pergamon Press, New York, 1990. 2- Lheureux P., Askenasi R. Specific treatment of benzodiazepine overdose. Human Toxicol, 1988 ; 7 : 165-70. 3- Brammer G., Gibly R., Walter FG, Bey T., Torres R., Kohler S., Continuous intravenous flumazenil infusion for benzodiazepine poisoning. Vet Human Toxicol, 2000 ; 45 : 280-1.

Benzodiazepines : vous avez dit concentrations mortelles...


J.P. GOULL >. J. NOUVEAU^, P. BRIQUET, H. DEBRIS >, V. CIRIMELE< , P. KINTZ >
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(1) Groupe Hospitalier du Havre, B.P. 24, 76083 LE HAVRE (France) (2) Institut de Mdecine Lgale, 11 rue Humann, 67085 STRASBOURG (France) Objectif : L'objectif de ce travail est de prsenter deux cas d'ingestion massive de benzodiazepines et de montrer l'extraordinaire tolrance de sujets accoutums la consommation de ces molcules. Matriel et mthodes : Observation 1 : un homme de 44 ans, en invalidit pour dpression, trait par venlafaxine et clorazpate ingre, suite un diffrent familial, 23 botes de Tranxne 50 soit 34,5 g de clorazpate. A l'arrive aux urgences, le malade- est somnolent mais rveillable.

Aprs lavage gastrique, il est admis par scurit en ranimation (score de Glasgow 15). Il est somnolent pendant 3 jours. Il est ensuite transfr en mdecine puis en psychiatrie et quitte l'hpital le 12 jour. Onze prlvements sanguins sont raliss ainsi qu 'un prlvement de cheveux. Observation 2 : une femme de 38 ans, ancienne toxicomane par voie veineuse VIH 1 positive, consulte dans le cadre du traitement de son SIDA. En raison de troubles de la vigilance ainsi que de Velocution, le mdecin demande un bilan toxicologique sanguin et urinaire, orient vers la recherche de stupfiants. Des cheveux sont prlevs. Mthodes : La recherche de stupfiants est ralise dans les urines par immunoanalyse. L'identification et le dosage des benzodiazepines (BZD) par CL/UV/BD et le dosage des BZD dans les cheveux par CG/SM en mode ionisation chimique ngative (1). Rsultats : Observation 1 : les concentrations sanguines varient sur la priode de 12 jours entre 19 et 54 mg/l pour le desmthyldiazpam et de 0,35 6,53 mg/l pour 1'oxazepam. Les dosages dans les cheveux valent respectivement 6,23 et 0,95 ng/mg. Observation 2 : les dosages sanguins et capillaires permettent de mettre en vidence une conduite toxicophile aux BZD : desmthydiazpam 31,7 mg/l et 5,77 ng/mg ; diazepam 8,2 mg/l et 3,02 ng/mg ; oxazepam 3,2 mg/l et 0,67 ng/mg ; lorazpam 0,26 mg/l et 0,26 ng/mg ; lormtazpam 0,18 et 0,39 ng/mg. Conclusion : Ces deux observations mettent en vidence des phnomnes d'accoutumance et de tolrance chez des sujets prsentant des conduites toxicophiles anciennes. Elles contrastent avec les cas dcrits dans la littrature de sujets dcds d'intoxications mettant en cause uniquement une BZD (2), mais galement avec les cas tirs de notre exprience mdico-lgale, pour lesquels les concentrations mesures admises comme tant l'origine du dcs, sont souvent nettement infrieures celles mesures chez ces deux malades. Rfrences : 1- Kintz P., Cirimele V, Vayssette F., Mangin P. Hair analysis for nordiazpam and oxazepam by gas chromatography-negative-ion chemical ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. B, 1996 ; 677 : 241-244.
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2- Richard N., Ghysel M.H., Savart M. Intoxications mortelles par les benzodiazepines : applications mdico-lgales. Toxicorama, 1996 ; VIII : 17-22.

Tolrance de hautes doses de diazepam lors de l'intoxication aigu par la chloroquine


P. HANTSON . P. COUROUBLE , M. de TOURTCHANINOFF , X. WITTEBOLE , F. T H Y S , P. WALLEMACQ
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(1) Dpartement des soins intensifs et des urgences, (2) Laboratoire d'explorations neurophysiologiques, (3) Laboratoire de toxicologie, Cliniques St-Luc, Universit catholique de Louvain, Bruxelles Objectif : L'administration de doses importantes de diazepam fait partie du traitement des formes graves d'intoxication aigu par la chloroquine, sans que le mcanisme d'action ne soit parfaitement lucid(l). Dans des sries importantes de patients ventils, l'administration de diazepam seul, aux doses leves prconises par le protocole de rfrence, n'assure pas toujours une sedation suffisante(2). Nous rapportons une observation documente par des analyses lectroencphalographiques (EEG) et des donnes pharmacocintiques. Observation : Une patiente de 39 ans est admise une heure aprs l'ingestion volontaire de 5 g de chloroquine; elle a galement bu un sirop contenant 360 mg de codine et 72 mg de triprolidine. Elle est parfaitement consciente et prsente les signes cliniques suivants : frquence cardiaque, 146/min; frquence respiratoire, 12/min ; pression artrielle, 161/106 mm H g. U lectrocardiogramme (ECG) d'admission est sans particularit. La conscience se dtriore 20 min plus tard, de mme qu 'apparaissent une hypotension et des modifications de l'ECG (QRS > 120 msec). La patiente est intube et ventile artificiellement. Elle reoit un bolus de 2 mg/kg de diazepam en 30 min, puis une perfusion continue la dose de 60 mg/h pendant 32 h (1 mg/kg/h), combine l'administration d'adrnaline. La situation hmodynamique se stabilise. Une heure aprs le dbut de l'administration de diazepam, la patiente reste parfaitement consciente. Un premier EEG est ralis 12 h aprs le dbut du traitement, et les enregistrements sont rpts toutes les 4 h. L'analyse visuelle dmontre une surcharge en rythmes bta confirme par l'analyse spectrale. Lors du premier enregistrement la puissance relative bta est de l'ordre de 66 % et la "spectral edge frequency 95" (frquence en de de laquelle se situe 95 % du spectre de frquence) de 19 Hz. Ces valeurs restent leves tout au long du monitoring (32 h). La patiente reste veille durant toute la dure de perfusion du diazepam et conserve une ventilation spontane. Elle est extube 32 h aprs l'admission, peu avant l'arrt dfinitif du diazepam. Un pic plasmatique de diazepam de 13,1 pg/ml a t atteint la 44 h. On peut calculer une aire sous la courbe (AUC) de 553,08 pg.h/ml pour une AUC thorique de 597, 22 pg.h/ml selon la dose totale administre de 1075 mg de diazepam. Discussion :
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des proprits pileptognes qui peuvent tre contrles par l'administration de benzodiazepines, ce qui pourrait suggrer une action sur le rcepteur central l'acide gamma-aminobutyrique (GABA). Les donnes obtenues in vitro montrent cependant que ce rcepteur a une faible affinit pour la chloroquine(3). Comme dans le cas prsent, il n'y a aucune vidence dans la littrature d'une modification de la pharmacocintique du diazepam. Rfrences : 1- Riou B, Barriot P, Rimailho A, Baud FJ. Treatment of severe chloroquine poisoning. N Engl J Med 1988 ; 318:1-6. 2- Clemessy JL, Taboulet P, Hoffman JR, Hantson P, Barriot P, Bismuth C, Baud FJ. Treatment of acute chloroquine poisoning: a 5-year experience. Crii Care Med 1996; 24: 1189-1195. 3- Liu L, Katz Y, Wiezman R, Rosenberg B, Pasternak GW, Gavish M. Interactions of chloroquine with benzodiazepine, gamma-aminobutyric acid and opiate receptors. Biochem Pharmacol 1991 ; 41: 1534-1536.

Intoxications par benzodiazepines : analyse de 4078 cas


F. FLESCH"*. A. JAEGER , M.L. HARLAY , B. LATRECH , P. SAUDER
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(1) Centre Antipoison - Hpitaux Universitaires de Strasbourg - 67091 Strasbourg Cedex. (2) Service de Ranimation Mdicale et Urgences Mdicales - Hpitaux Universitaires de Strasbourg 67091 Strasbourg Cedex. Objectif : Analyser sur 13 ans, l'volution des intoxications par benzodiazepines : molcules ingres, traitements effectus, dures d'hospitalisation, volutions. Matriel et mthode : - analyse rtrospective de 4078 cas d'intoxications par benzodiazepines observs dans un service de ranimation et urgences mdicales. - utilisation d'un logiciel SIMA (systme d'information mdico-administratif) qui a permis la gnration de questionnaires personnaliss, la saisie des donnes, l'dition de lettres type et l'interrogation multicritres. Rsultats : De 1987 1999, 9367 patients ont t hospitaliss dans le service pour intoxication mdicamenteuse volontaire. 7067 patients, soit 75 %, avaient pris au moins un mdicament type benzodiazepine. Dans 1626 cas la benzodiazepine tait associe un autre psychotrope (antidpresseur, neuroleptique...) et dans 1157 cas elle tait associe un autre mdicament, non psychotrope. Dans 4078 cas, la benzodiazepine tait la seule molcule ingre et dans 1368 cas on notait une prise

L'hypothse d'une tolrance aigu au diazepam lors d'intoxication aigu la chloroquine n'a pas t jusqu ' prsent lucide par les donnes exprimentales. La chloroquine dose supra-thrapeutique possde

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concomitante d'alcool. Depuis 1987 le bromazpam totalise, par an, le plus grand nombre de cas d'intoxications. Pour l'alprazolam la frquence des intoxications a augment progressivement depuis 13 ans ce qui place, en 1999, cette molcule en 2 position, aprs le bromazpam. Bien que depuis 1994, les traitements (lavage gastrique, charbon activ, flumaznil) soient devenus exceptionnels, il n 'a pas t not d'augmentation de la dure moyenne de sjour. 4 patients sont dcds dont 3, gs de plus de 50 ans, de complications pulmonaires. Conclusion : Les intoxications par benzodiazepines seules reprsentent 44 % des intoxications mdicamenteuses volontaires. Il s'agit d'intoxications gnralement bnignes ne ncessitant aucun traitement particulier, hormis, ventuellement, une surveillance de courte dure. Les sujets gs restent nanmoins une population risques, et des complications rarissimes, mais pouvant mettre en jeu le pronostic vital, sont l'inhalation bronchique et l'embolie pulmonaire. Rfrences : 1- Billy F., Montaz L., Perault M.C., Vandel B., Etude des intoxications mdicamenteuses volontaires reues dans une unit d'accueil des urgences. Thrapie 1998 ; 53 : 553-8.
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Centre antipoison de 1995 1999. Dans 89 cas, les molcules ont t identifies par CLHP/DBD ou CPG/SM. Rsultats : Entre 1995 et 1999, 67353 cas d'intoxications ou de surdosages mdicamenteux ont t rapports au centre antipoison de Lille. Une ou plusieurs benzodiazepines taient suspectes dans 18 819 cas, avec une volution fatale dans 157 de ces 18 819 cas. Le dcs tait survenu l'hpital dans 23 cas, au domicile dans 134 cas. L'analyse des circonstances retrouvait une tentative d'autolyse dans 111 cas, une toxicomanie dans 40 cas, 3 cas de tentative d'empoisonnement et dans 3 cas une erreur thrapeutique (non respect des contre indications). L'ge moyen tait de 40 ans (extrmes 14-88) avec un cart type de 16 ans. Le sexe ratio montrait une prdominance masculine avec 92 hommes pour 65 femmes. La rpartition des produits consomms tait la suivante :
Benzodiazepine seule (dont alprazolam 1, lorazpam 1, oxazepam 1, nordiazpam 1) ou associe une autre benzodiazepine Benzodiazepine associe uniquement une prise d'alcool 8 cas 9 cas

Association de 1 ou plusieurs mdicaments avec les benzodiazepines (dont prsence d'antidpresseurs : 89 cas 32 fois parmi lesquels des tricycliques 16 fois) (avec prsence de carbamates 9 fois, de cardiotropes 6 fois) Association de 1 ou plusieurs stupfiants avec les benzodiazepines (cannabis 5 fois, cocane 4 fois, hrone 14 fois, buprnorphine 9 fois, methadone 13 fois) Association de benzodiazepines avec des mdicaments et des stupfiants (avec prsence de methadone 2 fois et de buprnorphine 4 fois) 38 cas

2- Buckley N.A., Dawson H.A., Whyte I.M., Oconnel D.L., Relative toxicity of benzodiazepines in overdose. B.M.J. 1995 ; 310 : 219-21. 3- Gaudreault P., Guay J., Thivierge R., Verdy I., Benzodiazepine Poisoning. Clinical and Pharmocological considerations and treatment. Drug Safety 1991 ; 6 : 247-65.

13 cas

Intoxications par des benzodiazepines : revue des 157 dcs survenus dans le nord de la France au cours des 5 dernires annes
P. N I S S E . M . DEVEAUX >, J.C. L I N K E , M . H . G H Y S E L , D . P E U C E L L E , M.MATHIEUNOLF
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(1) Centre antipoison de Lille (2) Institut de Mdecine Lgale - CHRU de Lille (3) Laboratoire de police scientifique de Lille Objectifs : Analyse descriptive des dcs incriminant la prise de benzodiazepines notifis au Centre antipoison de Lille pendant cinq ans. Patients et mthodes : Nous avons tudi rtrospectivement les cas d'intoxication par ingestion de benzodiazepines et molcules apparentes, avec une volution fatale, signals au

Le dosage a t effectu 80 fois. Un dpassement des taux plasmatiques toxiques habituels tait constat 46 fois, notamment pour les molcules suivantes (avec le taux maximal mesur): alprazolam (1,5 pg/ml), bromazpam (4 pg/ml), clonazepam (0,256 pg/ml), clorazpate (2962 pg/ml), diazepam (7,5 pg/ml), flunitrazpam (0,231 pg/ml), lorazpam (14,1 pg/ml), nordiazpam (6,5 pg/ml), oxazepam (1790 fig/ml), tmazpam (1,6 pg/ml), zopiclone (11,7 pg/ml), Zolpidem (1,5 pg/ml). L'alcoolmie a t dose 44 fois. Conclusions : Mme si les intoxications aigus par les benzodiazepines sont frquentes, la survenue d'un dcs au dcours de l'intoxication reste rare (0,8 % des cas dans notre exprience). Cependant si la prise concomitante d'alcool, de mdicaments psychotropes ou de stupfiants opiodes lors d'une intoxication volontaire par des benzodiazepines est un critre de gravit ne pas mconnatre dans l'valuation initiale, le risque mortel li la prise isole de benzodiazepines ne doit pas tre minimis (8 dcs sur 157 cas dans cette tude).

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Benzodiazepines : choix et stratgies analytiques


N. J O U R D I L Laboratoire de Pharmacologie CHU Grenoble - BP 217 G R E N O B L E Cedex France Objectif : Quels choix de techniques s'offrent au biologiste face une demande de "recherche de benzodiazepines" ? Quelle stratgie analytique adopter selon que la recherche est globale ou cible ? Autant d'orientations dictes par la nature chimique des 35 molcules qui composent la famille et les limites des diffrentes techniques utilises. L'accent est mis sur les acquis analytiques des 15 dernires annes. Matriel et mthode : La recherche et la mesure des benzodiazepines ont fait l'objet d'un nombre impressionnant de travaux qui attestent de l'intrt port cette famille depuis 40 ans (1re benzodiazepine commercialise en 1960) (1,2,3). La dmarche analytique de recherche et dosage des benzodiazepines se droule en trois tapes : Tout d'abord le dpistage par des mthodes immunochimiques suivi de l'identification puis de la quantification par technique chromatographique. Les performances des principaux tests immunochimiques sont compares. Pour les techniques chromatographiques potentiellement ralisables, le bilan est dress sur les diffrents choix pranalytiques prendre en considration selon le milieu biologique et la nature chimique du compos (hydrolyse, extraction, drivation) (2,3) ainsi que sur les principaux choix technologiques offerts en fonction de la sparation et de la nature du dtecteur. Rsultats : 1. Les tests immunochimiques de dpistage des benzodiazepines (au temps de rponse immdiat) (1) possdent une bonne spcificit vis vis de la famille chimique, mais un degr de reconnaissance diffrent selon la molcule et la nature de l'anticorps. 2. Les techniques chromatographiques (au temps de rponse diffr) n'ont cess d'voluer. Leur mise en oeuvre reste lourde comparativement aux tests immunochimiques. Les limites de dtection varient de 0,2 2 ng/ml pour les techniques CPG-ECD, CPG-SM-1CN, CLHP-SM, CLHP-SM-SM 10 - 20 ng/ml pour les techniques CPG-NPD, CLHP-UV, CLHP-DAD, voire plus pour la EC-SM. L'ouverture de la CLHP l'ensemble des benzodiazepines et leurs drivs polaires, sans distinction de structure chimique, sans tape prliminaire de drivation, avec des limites de dtection en CLHP-ES-SM suffisantes pour accder aux taux circulants des benzodiazepines les plus faiblement doses, prche en faveur de la CLHP-SM pour quantifier les benzodiazepines. De plus, la cration progressive de bibliothques en CLHP-SM devrait largir les possibilits de screening dans ce domaine.

Conclusion : Actuellement, si la recherche de benzodiazepines peut s'appuyer directement sur des tests immunochimiques, l'identification et la mesure des concentrations fait appel d'autres technologies. Il est aujourd'hui ncessaire d'associer plusieurs mthodes analytiques pour raliser une dtection exhaustive. Ce bilan devrait permettre d'acclrer la dmarche du biologiste face un choix technologique et lui rappeler les limites des mthodes qu 'il a slectionnes. Rfrences : J- Drummer O.H., Methods for the measurement of benzodiazepines in biological samples. J. Chromatogr. B. 1998 ; 713 : 201-225. 2- Maurer H.H., Liquid chromatography-mass spectrometry in forensic and clinical toxicology. J. Chromatogr. B. 1998 ; 713 : 3-25. 3- Segura J., Ventura R., Jurado C, Derivatization procedures for gas chromatographic-mass spectromtrie determination of xenobiotics in biological samples, with special attention to drugs of abuse and doping agents. J. Chromatogr. B. 1998 ; 713 : 61-90.

Mthode sensible de dpistage des benzodiazepines actyles par CPG/SM (*)


D. BORREY . E. MEYER , W. L A M B E R T , S. VAN CALENBERGH , C. VAN PETEGHEM , A. P E LEENHEER
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(1) Laboratoire de Toxicologie, Universiteit Gent, Harelbekestraat 72, B-9000 Gent, Belgium (2) Laboratoire de Physiologie, Biochimie et Biomtrie, Universiteit Gent, Salisburylaan 133, B9820 Merelbeke, Belgium (3) Laboratoire de Chimie Mdicinale, Universiteit Gent, Harelbekestraat 72, B-9000 Gent, Belgium Objectif : Les benzodiazepines prsentent une activit hypnotique, sdative et anxiolytique et sont frquemment retrouves dans les cas de toxicologie clinique et mdico-lgale. L'objectif de cette tude a t d'tablir une nouvelle mthode, CPG / SM, de dpistage des benzodiazepines les plus frquemment prescrites, particulirement celles qui sont administres des doses faibles. Nous dcrivons une mthode permettant le dpistage simultan des composs principaux et leurs plus importants metabolites entre autres : alprazolam, a0H-alprazolam, flunitrazpam, 7-NH -flunitrazpam, flurazpam, N-dsalkylflurazpam, ktazolam, oxazepam, lorazpam, triazolam et a-OH-triazolam. Matriel et mthode : L'appareillage utilis est constitu d'une CPG HP 6890 munie d'un injecteur automatique et couple un dtecteur de masse filtre quadrupolaire HP 5973. L'injection est effectue en mode on-column pour am2

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liorer la sensibilit avec le programme de temprature suivant : T = 65 C pendant 1 min, rampe de 20 C/min, Tj=250 C durant 8 min, rampe de 10 C/min, T =300 C durant 2 min. La colonne capillaire est de type SGE-BP1(30 m, D.I. 0.25 mm, 0.25 pm d'paisseur de film) couple une prcolonne de type Restek hydroguard (5 m, D.I. 0.32 mm). Les extractions sont ralises en utilisant des cartouches d'extraction type PH, 100 mg/lml, Varan. Rsultats : Les benzodiazepines polaires ncessitent une drivation avant l'analyse par CPG, Trimthylsilylation et alkylation sont les techniques principalement dcrites. Seule V actylation par ajout de pyridine et d'anhydride actique (1/1 V/V, 20 min 18 C) permet le dpistage de toutes les benzodiazepines slectionnes avec une sensibilit satisfaisante. Les composs thermolabiles oxazepam et lorazpam sont bis-actyls et les drivs ne subissent pas de dcomposition au cours du processus chromatographique. La courbe est linaire de 0.1 5.0 ng/pl en mode SIM et de 2.5 30 ng/pl en mode SCAN avec un coefficient de corrlation toujours suprieur 0.995. Les coefficients de variation des tudes de rptabilit et de reproductibilit varient de 1.1 4.9 %. La mthode peut tre applique aussi 15 autres benzodiazepines administres des doses plus leves que celles initialement slectionnes. Conclusion : Une mthode sensible qui permet la recherche des benzodiazepines, qui varient considrablement de polarit, a t dveloppe. Les drivs obtenus sont stables pendant 4 journes au moins permettant l'application de la mthode en routine. Rfrences : 1- Valentine J.L., Middleton R., Sparks C. Identification of urinary benzodiazepines and their metabolites : comparison of automated HPLC and GC-MS after immunoassay screening of clinical specimens. J. Anal. Toxicol., 1996 ; 20 : 416-424.
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2- Meatherall R. GC-MS confirmation of urinary benzodiazepine metabolites. J. Anal. Toxicol., 1994 ; 18 : 369-381. 3- W. Sadee and E. Van Der Kleijn, Thermolysis of 1,4benzodiazepines during gas chromatography and mass spectroscopy. J. Pharm. Sci., 1971 ; 60 : 135-137. * Prsentation faite en anglais

Extraction automatise du flunitrazpam, 7-amino-flunitrazpam, desmthyl-flunitrazpam et 3-hydroxy-flunitrazpam. Dosages urinaires par CLHP-ES-SM
N. JOURDIL. J. BESSARD, F. VINCENT, H. EYSSERIC, G. B E S S A R D Laboratoire de Pharmacologie CHU Grenoble-BP 217 G R E N O B L E Cedex France

Objectif : Il est trs difficile d'affirmer la consommation de flunitrazpam de par les faibles doses ingres (0.5-2 mg), les taux circulants particulirement bas et la faible reconnaissance de cette benzodiazepine par les tests immunochimiques classiques. De plus, bien que peu toxique, il est utile de rappeler la place part qu'occupe le flunitrazpam dans les toxicomanies et conduites dlictueuses de soumission chimique. Les auteurs proposent une technique automatise d'extraction de la molcule et de ses principaux metabolites dans les urines suivie de leur identification et quantification. Matriel et mthode : L'extraction est ralise l'aide d'un automate Aspee XL de Gilson sur cartouches SPE phase mixte Isolute Confirm-HCX 3ml. La sparation chromatographique est ralise sur colonne Nova-Pak Cl8 4 pm, 2 x 150 mm. La phase mobile se compose d'un mlange 55/45 de phase A (eau-actonitrile 90/10) et phase B (methanol) dlivr en mode isocratique (dbit 150 pl/mn). Les micro-pompes et l'injecteur automatique sont de marque Perkin-Elmer, srie 200. La dtection est ralise par spectromtrie de masse l'aide d'un appareil API 150 EX de Sciex. La source d'ionisation est de type Electrospray, utilise en mode positif et puis. La quantification est ralise en mode fragmentomtrique. Les ions permettant la quantification et la qualification sont : flunitrazpam 314,2 (268,2), flunitrazpam d7 321.2 (275,2), 7-amino-flunitrazpam 284,1 (227,1), 7amino-flunitrazpam d7 291,3 (244,1), desmthyl-flunitrazpam 300,2 (253,9), desmthyl-flunitrazpam d4 304.3 (257,9) et 3-hydroxy-flunitrazpam 330,2 (284,0). Rsultats : La mthode dcrite rvle de bonnes caractristiques analytiques : - Rendements d'extraction compris entre 81 et 100 %, - Linarits jusqu' 100 ng/ml pour l'ensemble des composs, - Rptabilits et reproductibilits comprises entre 0,83 et 7,84 % pour le flunitrazpam, le 7amino- flunitrazpam et le desmthyl-flunitrazpam, entre 5,05 et 13,81 % pour le 3-hydroxy-flunitrazpam, - Limites de quantification : 0,05 ng/ml pour le flunitrazpam et le 7-amino-flunitrazpam, 0,1 ng/ml pour le desmthyl-flunitrazpam, 0,4 ng/ml pour le 3hydroxy-flunitrazpam, - Limites de sensibilit : 0,025 ng/ml pour le flunitrazpam et le 7-amino-flunitrazpam, 0,04 ng/ml pour le desmthyl-flunitrazpam, 0,2 ng/ml pour le 3-hydroxyflunitrazpam. La technique a t transpose avec succs dans le plasma et applique essentiellement sur des prlvements de patients toxicomanes. Conclusion : L'extraction SPE automatise conduit d'excellents rendements (1). La CLHP-ES-SM s'avre tre une technique trs sensible et slective pour la dtermina-

is

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

tion du flunitrazpam et de ses metabolites dans les milieux biologiques (2). Elle a pu notamment rvler un cas de soumission chimique. Des investigations complmentaires sont en cours pour tendre son application d'autres benzodiazepines. Rfrences : 1- Deinl L, Mahr G., Von Meyer L., Determination of flunitrazpam and its main metabolites in serum and urine by HPLC after mixed-mode solid-phase extraction. J. Anal. Tox. 1998 ; 22 :197-202. 2- Bogusz M. J., Maier R.D., Krger K.D., Fruchnicht W., Determination of flunitrazpam and its metabolites in blood by high-performance liquid chromtographyatmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. B . 1998 ; 713 : 361-369.

Soumission chimique : hypothses neurobiologiques


M. M A L L A R E T CEIP, Laboratoire de Pharmacologie, CHU, 38043 Grenoble cedex 09 La soumission chimique incluant toutes les substances psychoactives (mdicamenteuses et toxiques) est un concept rcent, mme si l'usage criminel de substances psychoactives (alcool thylique, par exemple) est connu depuis fort longtemps. Auparavant sous-estime par le monde mdical, la soumission chimique fait l'objet de nombreuses informations auprs du grand public ; elle induit des inquitudes souvent justifies, et donne lieu de grandes campagnes de prvention, en particulier aux Etats-Unis. La grande diversit des substances concernes, l'absence de certitudes sur les mcanismes physiopathologiques, la crainte d'une dclaration abusive de soumission chimique et la multiplicit des intervenants devant collaborer ont ralenti le processus de notification et d'exploration de ce syndrome. Objectifs : Emettre des hypothses sur les mcanismes neurobiologiques mis en jeu dans le syndrome de la soumission chimique (en excluant les aspects "purement" psychologiques, psychanalytiques et sociologiques) devrait permettre de prciser le mode d'action des substances psychoactives dans la gense de ces troubles. Matriel et mthode : Cette valuation est base sur les donnes de la littrature. Rsultats : La soumission chimique fait intervenir l'agresseur, la victime et la substance psychoactive. L'agresseur peut ventuellement "crer" un environnement psychologique favorable son acte. Sous l'effet chimique, les diffrentes capacits cognitives de la victime (sa mmoire, ses capacits d'veil, d'attention et de rponse une agression) vont tre perturbes. L'implication de neuromdiateurs comme le GABA, le glutamate et Vacetyl choline, semble prdominante dans le fonctionnement cognitifde l'individu et dans les phnomnes de 120

soumission chimique. Les tudes fonctionnelles (IRM fonctionnelles,...) du comportement humain devraient, dans l'avenir, prciser l'effet des substances psychoactives. Les donnes sur les mcanismes d'action de substances aussi diffrentes que l'alcool thylique, les benzodiazepines (flunitrazpam,...), les antagonistes du NMD A (ktamine, gammahydroxybutyrate de sodium, phencyclidine), les anticholinergiques (atropine, datura) permettent d'expliquer la similitude de certains effets pouvant favoriser une soumission chimique, mais aussi les diffrences smiologiques (les diffrences pharmacocintiques seront abordes par un autre orateur). Les altrations mnsiques induites par les diffrentes substances chimiques sont les mieux explores. L'alcool thylique, en dehors de sa toxicit chronique, a des effets amnsiants (troubles du rappel), en raison de son action sur le rcepteur au GABA et aux benzodiazepines. Parmi les cinq formes de mmoire faisant l'objet d'un consensus scientifique (mmoire de travail, mmoire pisodique, mmoire smantique, mmoire procdurale, et phnomnes d'amorage perceptif), les benzodiazepines altrent essentiellement la mmoire pisodique et l'amorage perceptif. Des diffrences d'effets peuvent exister parmi des mdicaments de mme classe : si le diazepam et le lorazpam altrent tous les deux la mmoire pisodique, le lorazpam perturbe seul l'amorage perceptif. Les effets amnsiants de la ktamine ont t prciss. Les troubles de l'attention expliquent d'autres aspects de la soumission chimique. Les consquences intracellulaires (gniques et protiques) sont, en revanche, encore hypothtiques. Conclusion : La soumission chimique est un syndrome complexe, interaction entre un agresseur, une victime de cet acte criminel, et des substances psychoactives trs diverses ayant en commun des proprits amnsiantes et sdatives. Outre l'indispensable rpression de cet acte, il faut prvenir ce syndrome en informant les nombreux intervenants concerns, les victimes potentielles mais aussi en augmentant le contrle des substances risque et le dveloppement de substances (au potentiel thrapeutique conserv) dnues de ce risque devenu inacceptable.

La soumission chimique. Aspects analytiques et expertises mdico-lgales


R KINTZ Institut de Mdecine Lgale, 11, rue Humann, 67085 Strasbourg Objectif : La soumission chimique peut tre dfinie comme l'administration de substances psycho-actives une personne des fins dlictueuses ou criminelles. A l'occasion de cette confrence, l'auteur fera, partir de son exprience d'expert judiciaire une synthse sur les circonstances des agressions, les produits utiliss, les pr-

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XJJI, n 2, 2001

lvements effectuer sur les victimes et les aspects analytiques les plus performants. Matriel et mthode : Les dossiers d'expertises judiciaires effectues depuis 1990 l'Institut de Mdecine lgale de Strasbourg ont t revus pour en extraire les informations les plus significatives en terme de moyen d'introduction du produit dans l'organisme, d'identit chimique du produit, d'intrt du recueil de diffrents prlvements biologiques et de difficults analytiques. Rsultats : Les femmes, les enfants et les personnes ges apparaissent comme les victimes les plus usuelles. L'empoisonnement par un membre de la famille est frquent chez les enfants (pour obtenir une sedation, soit vise pdophile, soit simplement pour "avoir la paix") et les personnes ges (pour dtourner leur vigilance). Ces cas reprsentent moins de 10 % de nos observations. La majorit des observations concernent des filles jeunes, qui leur agresseur administre une substance afin de diminuer leur rsistance l'acte sexuel. Les produits sont majoritairement incorpors dans des boissons, essentiellement le caf ou les prparations alcoolises. Les aliments, comme les ptisseries sont peu utiliss. Le Zolpidem est le compos le plus frquemment rencontr, suivi par les benzodiazepines (lorazpam, bromazpam, flunitrazpam ...), les neuroleptiques (halopridol, promethazine ...) et les produits stupfiants (cannabis, MDMA, LSD, ktamine ...). Le GHB n'a pas encore t observ. Trs (trop) souvent, il n'y a pas eu de prlvement biologique effectu lors de la prise en charge et l'expert doit alors travailler sur dossier, ce qui peut tre trs difficile. Idalement, l'analyse toxicologique devrait s'appuyer sur du sang, des urines et des cheveux, en proscrivant l'immuno-chimie et en faisant des couplages la spectromtrie de masse, la rgle absolue. Conclusion : Chaque cas de soumission chimique (relevant des assises) doit tre document au mieux, mais le diagnostic toxicologique est difficile. Souvent, les produits utiliss ont des demi-vies courtes, les concentrations circulantes sont faibles, les prlvements sont tardifs et les laboratoires d'analyse sont sous-quips. Il conviendrait, pour ce domaine spcifique, de n'accrditer que quelques laboratoires sur le territoire national.

Soumission mdicamenteuse : analyse d'une srie de rsultats toxicologiques urinaires


F. QUESTED '. O. DIAMANT-BHRGER , G. LAGJJER , (1) Urgences mdico-judiciaires, Htel-Dieu - Paris. France (2) Centre Rgional de pharmacovigilance. Hpital Fernand Widal - PARIS - France
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Objectifs : Analyse des rsultats toxicologiques urinaires provenant des observations de "soumissions mdicamenteuses" notifies ou centre rgional de pharmacovigilance de l'Hpital Fernand-Widal durant l'anne 1999. Matriel et mthodes : 54 chantillons urinaires de victimes "drogues" leur insu, examines pour 70 % d'entre elles aux Urgences Mdico-Judiciaires de l'Htel Dieu de Paris, ont t analyss simultanment en immunochimie et en chromatographie gazeuse couple la spectromtrie de masse (CG/SM). La sensibilit et la spcificit des deux techniques sont compares. Leur intrt respectif d'un point de vue mdico-judiciaire est discut. Rsultats : Les analyses toxicologiques urinaires ont t pratiques en moyenne 23 heures aprs l'ingestion (2h - 4J). Les benzodiazepines sont trs majoritairement retrouves (48 dossiers/54 soit 87 % des dossiers). La chromatographie gazeuse couple la spectromtrie de masse (CG/SM) a permis leur identification prcise dans 1/3 des cas (13 dossiers/48) et la dtection de metabolites communs (35 dossiers/48). Pratiquement toutes les benzodiazepines sont reprsentes (bromazpam, clorazpate, diazepam, lorazpam, clobazam, flunitrazpam, oxazepam). D'autres psychotropes sont plus rarement incrimins (anti-histaminiques (5 dossiers), phnothiazines (1 dossier), gamma-hydroxybutyrate ( 1 dossier)). Dans 7 dossiers, des molcules passes inaperues en immunochimie ont pu tre dtectes dans les urines grce aux techniques chromatographiques (hydroxizine (3 dossiers), Doxy lamine (2 dossiers), clobazam (1 dossier), acpromazine (1 dossier). L'association l'alcool est retrouve dans 1 dossier sur 4. Conclusion : l'administration de psychotropes l'insu d'une victime des fins dlictueuses (vol) ou criminelles (agression sexuelle) est un mode d'agression mconnu du corps mdical. Les produits sont incorpors majoritairement dans des boissons, plus rarement dans des aliments (bonbons, ptisseries). L'ampleur du phnomne est probablement sous-estime. La mise en place d'un systme efficace de recensement des cas est ncessaire. Les produits utiliss retrouvs dans notre srie sont majoritairement des benzodiazepines, mais d'autres produits psychotropes peuvent tre en cause. Leur identification prcise est un lment de preuve indispensable l'enqute judiciaire. La prise en charge efficace des victimes suppose la reconnaissance du tableau clinique, des prlvements biologiques prcoces et le recours des techniques analytiques chromatographiques plus sensibles et plus spcifiques que les techniques immunochimiques. Celles-ci restent nanmoins des examens de dpistage indispensables. L'identification de laboratoires quips parat souhaitable (1). Rfrences : 1- LagierG, Questel F., Elkharrat D., Diamant-Berger 121

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

O., Prise en charge des victimes drogues leur insu. Mdecine Lgale Hospitalire 1999 ; 2 (6) : 113-114.

A propos de deux cas d'utilisation originale de la soumission chimique


G. PEPIN. Y. G A I L L A R D Laboratoire d'Expertises TOXLAB, 18 rue Andr Del Sarte, 75018 Paris Objectifs : La soumission chimique a des aspects inattendus ; dans certains cas, les agresseurs peuvent en vivre pendant des annes, dans d'autres cas la police peut y avoir recours en vue de sauver de nombreuses vies. Le laboratoire d'expertises judiciaires en toxicologie doit pouvoir utiliser des mthodes ddies sophistiques afin de rpondre aux exigences de la sensibilit et de la spcificit requises dans le cadre d'affaires judiciaires. Seules ces mthodes, parfois, permettent d'clairer la ralit des faits. Matriel et mthode : Dans les deux affaires prsentes, nous avons utilis la CPG couple la spectromtrie de masse tandem en ionisation chimique ngative ainsi que la CLHP couple la spectromtrie de masse. C'est cette condition seule que nous avons t mme de rsoudre les deux cas suivants. Rsultats : Premier cas : Un homme d'une cinquantaine d'annes est retrouv mort d'hypothermie, en hiver, sous une porte cochre, sans veste, par une nuit trs froide. Il a absorb la veille au soir, une bire dans un bar voisin en compagnie d'un autre homme. L'enqute montre que la carte bancaire de la victime a t utilise aprs le dcs. L'analyse toxicologique rvle la prsence dans les urines de la victime de midazolam 15 ng/ml, administr par le SAMU. Il a aussi t relev une concentration de 13 pg/ml de 7-aminoflunitrazpam. L'auteur interpell avouera ultrieurement avoir ajout un comprim de Rohypnol dans la bire de sa victime. C'tait sa quarantime victime depuis environ 10 ans. Celui-ci en vivait mais, a-t-il dit, c'tait le premier cas de dcs parmi ses "clients ". Deuxime cas : le 15 mai 1993, dans une affaire clbre, le preneur d'otage de l'cole maternelle de Neuilly a t tu par les forces de l'ordre. Une tentative de neutralisation au moyen d'une tasse de caf prpare ( la demande des autorits de police) par un mdecin et contenant du Gamma-OH et de l'Hypnovel avait t entreprise. L'infirmire qui a propos ce caf au preneur d'otages avouera que ce dernier a commenc le boire puis l'a recrach, pressentant manifestement une action de ce genre. Afin de prouver l'opinion publique, que le preneur d'otage n 'avait pas t tu alors qu 'il tait dj hors de combat, une analyse toxicologique a t mene afin de vrifier l'absence d'incapacitant dans le sang du criminel.

Les analyses effectues montrrent un taux physiologique de GHB infrieurs 2 pg/ml par CPG-SM et l'absence de midazolam par CLHP-SM (< 0,1 ng/ml). Conclusions : La varit des produits utiliss, leur demi-vie parfois courte et pour certains, leur rapidit de dgradation aprs prlvement, mais aussi le dlai parfois long entre l'administration et l'chantillonnage, obligent l'analyste d'avoir recours des mthodes ddies, trs sensibles telles que la CPG-SM-SM ou la CLHP-SM.

La soumission chimique : de la difficult d'apprhender l'tendue du phnomne.


M.H. GHYSEL. O. SALVADORE, F. DESCAMPS, S. BOUDJADA, A. COUVREUR Laboratoire de police scientifique - 7 Boulevard Vauban 59800 - Lille France Objectif : Quoi de plus sduisant pour un criminel que de commettre son forfait l'insu de tous, sur une victime aractive, soumise, conciliante voire cooprante. Des produits psychotropes ont t utiliss pour mettre les individus dans ces tats ; nous avons essay d'valuer l'tendue du phnomne en France. Matriel et mthode : Nous nous sommes rapprochs des services de police afin de connatre le nombre de cas de soumission chimique enregistrs. Puis nous avons recens les affaires que nous avions eues traiter au sein du LPS de Lille. Rsultats : Les services de police, interrogs sur le nombre de cas de soumission chimique constats, ne pouvaient pas citer de chiffre prcis. Pour notre part, les analyses aux fins de recherche de soumission chimique ont reprsent 5 cas pour les 10 premiers mois de l'anne 2000. Ces cas ainsi que 2 cas plus anciens, particulirement marquants vont tre prsents. 1- En 1984, un jeune enfant recevait journellement de sa mre des doses de phnothiazines et de mprobamatepour tre "tranquille". L'enfant est dcd. Un mois plus tard, le corps a t exhum. De la lvompromazine, de la primtazine, du mprobamate ont t retrouvs dans les prlvements de foie, poumons et intestin raliss l'autopsie. 2- En 1993, dans un caf, une jeune femme veut voler l'argent d'un transporteur routier. Pour l'endormir, elle introduit des comprims de Tranxne dans sa bire. Le camionneur, qui avait gar son vhicule prs du canal, est retrouv noy. Du nordiazpam a t retrouv dans les cannettes de bire et de Voxazepam dans les urines de la victime. 3- Aprs avoir consomm des cocktails dans un bar, deux jeunes femmes se retrouvent sans force ni nergie, et finalement se rveillent le lendemain dans leur appartement, sans aucun souvenir de ce qui s'est pass. Il n'a pas t retrouv de traces de mdicaments ni de GHB dans les

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Annales de Toxicologie Analytique, vol. XHI, n2, 2001

prlvements de sang et d'urines effectus 48 heures plus tard. 4- Dans le verre d'une femme qui consommait du ros avec des "amis ", a t introduit du Tranxne. La victime s'est endormie et a t viole. Conduite rapidement l'hpital, un prlvement de sang a t effectu. L'alcoolmie tait de 2,87 g/l, le taux sanguin de nordiazpam de 368 ng/ml. 5- Une femme a t enleve Bruxelles et retrouve deux jours plus tard Amiens. Elle ne se souvient de rien. A part du paracetamol, il n'a pas t retrouv de produits mdicamenteux ou toxiques dans ses urines. 6- Le lendemain d'une soire qu 'elle organisait son domicile, une femme, consommatrice de cannabis, se retrouve dans son lit, pensant avoir t viole. Elle porte plainte. Des prlvements de sang et d'urines sont raliss deux jours aprs les faits. Du THC-COOH et du paracetamol ont t retrouvs dans ses urines. Il n'a pas t retrouv d'autres produits toxiques ou mdicamenteux. 7- L'analyse du contenu d'une bouteille d'eau minrale utilise par un cambrioleur a montr la prsence de Zolpidem dans le liquide. Les techniques analytiques utilises seront prsentes. Conclusion : Ces quelques cas cits montrent la varit des formes que peut prendre la soumission chimique. La preuve scientifique de la soumission n 'est pas toujours faite et c'est plus les dclarations des victimes qu'il faut considrer. Avec le dveloppement des saisies informatiques des procdures, ces informations devraient prochainement tre mieux connues. Cependant, la preuve scientifique de la soumission n 'est pas souvent facile raliser par les toxicologues devant travailler sur des prlvements effectus parfois trop longtemps aprs les faits et pas toujours bien conservs.

ngatifs a permis de dgager les concentrations physiologiques dans cette matrice. Une patiente ayant reu une dose de 60 mg/kg de GHB a t tudie ainsi qu 'un consommateur rgulier de cette molcule. Rsultats : Chez les personnes vivantes, les concentrations physiologiques pouvant aller jusqu' 2 pg/ml dans le sang et 10 pg/ml dans les urines ont t releves (3). Les urines permettent d'authentifier la prise chez le cadavre, des concentrations dans le sang allant jusqu ' 15 pg/ml ont t enregistres sans qu 'il y ait eu consommation. Dans les cheveux de tmoins ngatifs, le taux moyen mesur tait de 0,84 ng/mg (extrmes de 0,41 1,79 ng/mg) avec la rpartition suivante selon la coloration : 0,60 ng/mg (valeur moyenne) pour les cheveux blonds (n = 12) ; 0,90 ng/mg pour les cheveux chtains (n = 30) et 0,90 ng/mg pour les cheveux bruns (n = 19). Le taux toute teinte de cheveux confondue, pour lequel on peut tablir un seuil de positivit correspond 1,6 ng/mg que nous proposerons 2 ng/mg. Chez une personne consommant rgulirement du GHB dans un but addictif, des concentrations allant jusqu' 14 ng/mg ont t mesures. Chez une personne ayant reu une fois du GHB dans le cadre d'une anesthsie, les concentrations dans ses cheveux avant et aprs l'opration taient de 0,57 et 0,88 ng/mg respectivement. Conclusions :
Matrice Sang Urine Cheveux Physiologique <2 \ig/ml (3) 2 ng/mg Tlirapeutique ou addictif 2221^g/ml (J) 2 14 ng/mg Post-mortem (naf) <20^g/mt(3) <l^g/ml(3)
-

Overdose 27 309 vg/inl 50 620 ng/ml


-

<10vg/ml(3) I0 2200\iglml(l)

Le GHB dans le sang, les urines et les cheveux : Interprtations des rsultats
Y. G A I L L A R D . J.P. GOULLE
0} (2)

Rfrences : 1- Couper FJ., Logan BK.. Determination of GHB in biological specimens by gas chromatography-mass spectrometry. J Anal. Toxicol, 2000 ; 24 : 1-7. 2- Frison G., Tedeschi L., Brusini Ferrara S.D.. GC/MS analysis of ric acid (GHB) in human hair. Meeting on Clinical and Forensic Analysis. Genova, June 6-8, 1994. G., Castagna F., gamma-hydroxybuty2nd International Aspects of Hair

et G. PEPIN

(I)

(1) laboratoire d'Expertises TOXLAB, 18 rue A. Del Sarte, 75018 Paris (2) laboratoire de Pharmacocintique et Toxicologie Cliniques, Groupe Hospitalier du Havre, Hpital J. Monot, 29 av P. Mends-France, 76290 Montvilliers Objectifs : Cette tude est base sur une revue de la littrature et sur une partie exprimentale. Les auteurs ont cherch dfinir les seuils de positivit du GHB dans le sang, les urines et les cheveux dans les cas d'overdoses et de soumission chimique afin de distinguer la prise exogne des taux physiologiques. Matriel et mthode : Le dosage est ralis par CPG-SM aprs silylation. L'extraction est conduite par voie liquide par l'actate d'thyle en milieu sulfurique (1). Les cheveux sont traits par la soude 0,01 N pendant 16 h 56 C (2). L'analyse de 61 chantillons de cheveux de tmoins

3- Samyn N.. Analytical aspects of overdose with GHB and related compounds. The Toxicological Society of Belgium and Luxembourg. Brussels, November 9, 2000.

Actualits des traitements en toxicologie


V. P A N E L . J. HANNA Unit de Toxicologie Clinique, Centre Hospitalier Universitaire, 38043 Grenoble Cedex 9, France Objectif : Les auteurs font une prsentation gnrale des connaissances et des conduites thrapeutiques actuelles en toxicologie d'urgence : traitement symptomatique, mthodes d'puration digestive, rnale et 123

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extra-rnale, antidotes, en insistant sur les nouveauts et l'volution rcente des ides tout en condamnant les pratiques obsoltes. Matriel et mthode : A partir de donnes pidmiologiques trs gnrales communes aux pays dvelopps, du portrait type d'un intoxiqu, et de l'volution habituelle d'une intoxication aigu, on peut proposer une stratgie thrapeutique en toxicologie d'urgence. Les confrences de consensus, les prises de position des diffrentes socits savantes, les donnes rcentes de la littrature, constituent les principales rfrences de l'expos. Rsultats : Les principales mthodes d'puration digestive sont "discutables" et discutes : vomissements provoqus par le sirop d'ipca, lavage gastrique, charbon activ en dose unique ou administr doses rptes. L'absence de preuves relles de leur efficacit est souligne. Les principaux mcanismes d'action des antidotes sont rappels : action toxicocintique, action toxicodynamique, ou action spcifique en aval de la cible. Les antidotes les plus rcents et/ou les plus actuels sont brivement prsents : naloxone, flumaznil, fragments Fab anti-digitaliques, hydroxocobalamine, fompizole, immun srum anti-viprin. Leurs indications, le plus souvent complmentaires du traitement symptomatique, sont mises en vidence. Enfin, les mthodes d'puration rnale et extra-rnale, hmodialyse en particulier, sont aussi discutes, en insistant sur les pr-requis physico-chimiques et toxicocintiques qui seuls justifient leurs indications ventuelles. Conclusion : La primaut du traitement symptomatique prcoce est souligne. Les mthodes d'puration digestive n'ont pas fait la preuve de leur efficacit dans l'intoxication aigu, leur utilisation systmatique n'est pas justifie. Les indications de l'puration rnale ou extra-rnale sont rares maintenant. Enfin, une meilleure connaissance de la physiopathologie des intoxications et la mise sur le march d'antidotes efficaces a donn un regain d'intrt au traitement spcifique en toxicologie. Rfrences : 1- Krenzelok E.R, McGuigan M., Lheureux R. Position statement : Ipecac syrup. J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1997 ; 35 : 699-709. 2- Vale J.A.. Position statement : Gastric lavage. J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1997 ; 35 : 711-719. 3- Chyka P.A., Seger D.. Position statement : Singledose activated charcoal. J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1997 ; 35 : 721-741. 4- Saviuc P., Danel V. Les antidotes. In : Intoxications aigus en ranimation. Danel V, Barriot P., eds. Paris, Arnette, 1999 : 89-96.

Contribution des experts judiciaires en pharmacotoxicologie au systme de recueil des dcs en relation avec l'usage de substances ayant fait l'objet d'abus ou de dpendance
J. ARDITTI >. M. VALLI , G. PEPIN< , M. DEVEAUX , P. KINTZ , G. LACHATRE , J.P. GOULLE , P. MURA , V. D U M E S T R E , N . RICHARD , C.GATIGNOL
(3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (9) (1 (1) 2)

(1) C.E.I.P. Marseille - Hpital Salvator - 13009 Marseille (2) Toxlab- 75018 Paris (3) I.M.L. Lille - 59000 Lille (4) I.M.L. Strasbourg - 67085 Strasbourg (5) Hpital Dupuytren - 87042 Limoges (6) Groupe Hospitalier du Havre - 76083 Le Havre (7) Centre Hospitalier Universitaire - 86000 Poitiers (8) Bioifice - 33370 Artigues prs Bordeaux (9) Unit Stupfiants et Psychotropes - Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Produits de Sant 93285 St-Denis Objectifs : Dans le cadre de ses missions, le C.E.I.P de Marseille a t mandat par l'Unit Stupfiants et Psychotropes (U.S.P.) de l'Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Produits de Sant (A.ES.S.A.PS.) afin de coordonner la mise en place d'un systme de recueil national des dcs en relation avec l'usage de substances ayant fait l'objet d'abus ou de dpendance (programme Dcs en Relation avec l'Abus de Mdicaments et Substances.D.RA.M.E.S). Une tude de faisabilit incluant les experts en toxicologie a t mise en place. Matriel et mthode : Un groupe de travail a t constitu sous la responsabilit de l'U.S.P. et comprenait 7 experts volontaires, 2 coordinateurs et 1 responsable de l'tude. Cette tude a t ralise partir des donnes anonymises des expertises toxiclogiques de l'anne 1998 et retranscrites sur une fiche labore par le groupe de travail. Rsultats : 123 cas de dcs ont t inclus dans l'tude. Diffrents paramtres ont t analyss et plus particulirement le sexe, l'ge, les antcdents de la victime ainsi que les rsultats des analyses effectues sur les milieux biologiques prlevs lors de l'autopsie. Les victimes principalement de sexe masculin (81,7 %) avaient une moyenne d'ge de 33 11 ans. Le dcs tait li la consommation isole de substances classes stupfiants (78 %) seules, en association entre elles, en association avec des psychotropes ou de spcialits de traitements substitutifs de dpendance aux

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Annales de Toxicologie Analytique, vol. XTJI, n2, 2001

opiacs en association avec des substances classes ou des psychotropes (22 %). Conclusion : Cette tude ralise sur les donnes de l'anne 1998 montre l'intrt de la contribution des experts en toxicologie au systme de surveillance D.R.A.M.E.S. Cette exprience pourrait tre prennise et tendue l'ensemble des experts judiciaires de toxicologie.

(1) Laboratoire BlOffice - Avenue GAY LUSSAC 33370 - Artigues prs Bordeaux (2) Institut de Mdecine Lgale - 1 1 , rue H U H M A N 67085 - Strasbourg (3) Unit de Mdecine Lgale - C H U PELLEGRIN 33076 - Bordeaux Objectif : Dcrire une association fatale entre le sildnaf (Viagra) et un mdicament vise cardiaque. Description du cas : Un homme de 43 ans dcde dans une chambre d'htel, en compagnie galante, aprs un rapport sexuel. Il tait trait pour des troubles cardiaques et des troubles de l'rection par du Viagra. Dans un pilulier retrouv sur les lieux, des comprims de verapamil (Isoptine), de trimtazidine (Vastarel), de yohimbine et de bromazpam (Lexomil) sont identifis. La notion de traitement par trinitrine est aussi voque. Le mdecin lgiste envisage un dcs par dfaillance cardiaque, sans cause anatomique identifie. Le Procureur requiert alors une expertise toxicologique afin de mettre en vidence les mdicaments absorbs . Matriel et mthodes : Sur les diffrents prlvements effectus par le mdecin lgiste, des analyses par CLHP/SM sont effectues pour identifier et quantifier le sildenafil et la yohimbine (1,2). Les drivs nitrs sont recherchs par ET/CG/SM. Le verapamil et la trimtazidine sont identifis et quantifis en CLHP/DBD. Rsultats : Le sildenafil a t identifi dans le sang, les urines, la bile et le contenu gastrique des concentrations de 105, 246, 1206 et 754 ng/ml et dans les cheveux la concentration de 177 pg/mg. Le metabolite dmthyl a t quantifi dans les urines la concentration de 143 ng/ml. Les concentrations sanguines de verapamil et de trimtazidine ont t mesures respectivement de 659 et 2133 ng/ml, soit des concentrations suprieures celles dcrites en thrapeutique (3). La recherche de trinitrine et de yohimbine s'est avre ngative. Conclusion : Les analyses dans les fluides biologiques confirment l'administration de sildenafil, de verapamil et de trimtazidine. La prsence dans les cheveux de sildenafil indique que le sujet utilisait le Viagra de manire rpte. Bien que non encore rapporte ce jour dans la littrature, l'association sildenafil-verapamil a pu provoquer le dcs de l'intress par des troubles majeurs du rythme cardiaque. Rfrences : 1- Tracqui A., Kintz P., CirimeleV, Ludes. Dosage HPLC/MS du Sildenafil (Viagra) dans les fluides biologiques. Vile Congrs de la SFTA - Marseille, 2-3 juin 1999. 2- Cirimele V, Kintz P., Tracqui A., Malicier D., Ludes B. Dosage de la yohimbine dans les fluides biologiques 125

Intoxications graves par psychotropes dans la population adulte de Pologne du Sud (1997-1999)
W. PIEKOSZEWSKI , J. PACH , E. FLOREKP (1) Institut Mdico-Lgal, Krakow, Pologne (2) Dpartement de Toxicologie, Universit Jagielonski, Krakow, Pologne (3) Chaire de Toxicologie, Acadmie de Mdecine, Poznan, Pologne Objectif : La prsente tude a pour but d'valuer l'incidence d'intoxications aigus par substances psychotropes chez les sujets adultes dpendants de Pologne du Sud, en fonction du principe actif, pour les annes 1997, 1998, 1999. Nous avons en outre valu le nombre de personnes dpendantes prsentant des signes de sevrage au moment de l'ingestion du psychotrope. Matriel et mthode : Le pourcentage d'intoxications par psychotropes chez des toxicomanes avec ou sans syndrome de sevrage de toutes les intoxications traites dans notre clinique est de : 27,2 % (945) en 1997 ; 36,9 % (1193) en 1998 ; 47,9 % (1546 des 3233 cas traits) en 1999. Rsultats : L'thylisme est la plus frquente des dpendances analyses pour les 3 annes. En 1998, les stupfiants taient au deuxime rang des dpendances alors qu 'en 1997 et 1999 les mdicaments pris avec de l'alcool venaient en seconde position devant les stupfiants. L'incidence des dpendances aux colles synthtiques, solvants organiques et mdicaments a connu une nouvelle augmentation en 1999. Nous avons cependant observ une diminution du nombre d'intoxications aux opiacs pour les annes analyses. Les sujets chez lesquels le syndrome de sevrage dominait dans le tableau clinique, taient en majorit dpendants aux opiacs. Pour les annes analyses, les sujets dpendants taient des hommes dans 80 % des cas. Le plus fort taux d'intoxication par l'thanol a t observ pour la tranche de 30 49 ans. Le plus fort taux d'intoxication aux opiacs a t observ pour la tranche de 20 29 ans.
(1) (2)

Ultime performance sous VIAGRA


V.DUMESTRE-TOULET . V. CIRTMELE , P. KINTZ , B. LUDES ,T. BELOOUSSOF , S. GROMB<
(2) 3) 3) 0 (2) (2)

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n2, 2001

par HPLC/lonspray-MS. Application un cas mortel aprs usage thrapeutique. Toxicorama, 1999, vol XI ; 4 : 261-264. 3- Deveaux M., Willaume B., Collier F., Hdouin V, Tournel G., Gosset D. Identification et dosage du Sildenafil et de ses metabolites dans le srum et l'urine par chromatographic liquide haute performance. Vile Congrs de la SFTA - Marseille, 2-3 juin 1999.

Liquide de putrfaction Alcool thylique (GC) MDMA (ecstasy) (GC-MS) MDA (metabolite) (GC-MS) Tetrahydrocannabinol (GC-MS) Pholcodine (GC-MS) U4 g.l' 2602 ng.ml' 311 ng.mf 1,7 ng.ml'
1

bile 1,73 g.l'

cheveux
-

6755 ng.ml' 15,34 ng.mg'' 303 ng.ml'


-

0,92 ng.mg'

0,29 ng.mg'' 0,73 ng.mg'

Poly-intoxication mortelle suivie d'homicide terminal ; propos d'un cas


P. CATHALA . A. D O R A N D E U , B. VICENTE , B. L U D E S , E. BACCINO , P. KINTZ
(2) (l) (2) (1) (l) (I)

(1 )Service de mdecine lgale, CHU Lapeyronie, 34295 Montpellier (2) Institut de mdecine lgale, 11 rue Human, 67085 Strasbourg Objectifs : La prsentation de ce cas clinique a pour but de montrer qu'une dpression respiratoire conscutive une overdose peut s'accompagner d'un autre mcanisme responsable du dcs tel qu'une asphyxie mcanique. Nous rapportons ici le cas d'un cadavre masculin retrouv putrfi dans une malle moiti immerge dans l'eau. Les investigations mdico lgales ont permis de dater le dcs et d'identifier la personne, l'autopsie n'a pas mis en vidence de causes traumatiques l'origine du dcs. L'hypothse d'un surdosage toxique a t retenue en premier lieu puis confirme par l'expertise toxicologique. Cependant, les donnes de l'enqute ultrieures ont mis en vidence des manuvres de suffocation manuelle sur cette personne inconsciente. L'expertise anatomo-pathologique ralise au niveau pulmonaire et pharyng est compatible avec une atteinte pulmonaire plutt d'origine toxique avec possible mcanisme d'asphyxie mcanique pendant la phase d'agonie terminale. Matriel et mthodes : Toxicologie : La recherche et le dosage des toxiques et mdicaments usuels ont t raliss sur des prlvements de liquide de putrfaction, de bile et sur des cheveux par chromatogarphie en phase gazeuze couple la spectromtrie de masse. Anatomo-pathologie : L'tude histologique a port sur 7 fragments prlevs au niveau des poumons et sur le larynx aprs dcalcification. Les colorations histologiques ont t les suivantes: hmatine-osine et rticuline (Gordon-Sweet). Une recherche des diatomes a galement t effectue dans les poumons pour carter le diagnostic de noyade. Rsultats : Toxicologie : Sont seuls retrouvs dans les prlvements analyss les produits suivants : 126

Les taux retrouvs dans les cheveux voquent une utilisation chronique de cannabis et d'ecstasy ainsi qu'une imprgnation taux thrapeutique par la pholcodine. Les concentrations en MDMA retrouves dans le liquide de putrfaction sont potentiellement ltales (1). Le dcs peut donc s'expliquer par une poly-intoxication associant ecstasy, cannabis et alcool. Anatomo-pathologie : L'architecture pulmonaire malgr la putrfaction a t visible grce la coloration de rticuline. Il existait un dme, une congestion ainsi qu'une importante alvolite macrophagique mais sans signe patent de rupture alvolaire. Le larynx ne montrait pas de signe microscopique de fracture. La recherche viscrale de diatomes s'est avre ngative cartant de ce fait le diagnostic de noyade. Conclusion : La description de ce cas mdico-lgal atypique rappelle qu'un tableau d'overdose ne doit pas faire liminer formellement des manuvres criminelles physiques sur un sujet inconscient. Ainsi, des manuvres locales de suffocation peuvent tre possibles, sans qu'aucun lment lsionnel ne soit retrouv lors de l'autopsie. Rfrence : 1- Ghysel M.H., Amphtamines et drivs dans Toxicologie et Pharmacologie mdico-lgales, Elsevier, Paris, 1998 : 465-542.

Usage dtourn de fentanyl transdermique (Durogsic) : une intoxication exemplaire


J.-M. GAULIER >. J. ALBA , M. CANAL , P. MARQ U E R , E. LACASSIE , B . M A G R E T , G. LACHATRE
(I) (2) 0 3) (1 (I) (,)

(l)Service de Pharmacologie et Toxicologie, C H U Dupuytren, (2) Mdecin lgiste, expert prs la Cour d'Appel, (3) Laboratoire de Toxicologie, Facult de Pharmacie, Limoges. Objectif : L'objectif de ce travail est de rapporter le cas d'une intoxication mortelle au fentanyl par usage dtourn de Durogsic. Cas clinique : Une jeune femme de 36 ans, "polyintoxique", abusant rgulirement de Durogsic, Tercian, Subutex, Seresta, Nocodion..., est dcouverte sans vie son domicile. Prs d'elle sont retrouvs : une seringue

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XHI, n 2, 2001

inutilise contenant un liquide translucide, une seringue utilise (contenant un peu de sang) et une cuillre contenant un rsidu solide et un bout de coton. A l'examen du corps, 2 patchs de Durogsic 100 sont dcouverts. Un arrt respiratoire serait vraisemblablement l'origine du dcs. Du sang ainsi que les seringues et la cuillre ont t mis sous scells pour l'expertise. Matriel et mthodes : Diffrents "screenings" ont t raliss : CPG/SM, CLHP/UV-BD et CLHP/ES-SM. Le nordiazpam, Voxazepam ont t quantifis par CLHP/UV-BD, la norbuprnorphine par CLHP/ES-SM et la cyammazine a t dose par CPG/SM. Lefentanyl a t dos par CPG/SM aprs extraction liquide/liquide et drivation par le pentafluoropropionyl anhydride. Rsultats :
Substance Sang Seringue inutilise + ND ND ND + + ND Seringue utilise + ND ND ND ND ND ND Rinage de la cuillre

Suivi toxicocintique de l'arsenic : propos d'un cas


A.L. PELISSIER-ALICOT. G. SALERIO , P. MARQUE!, G. PANTEIX , E. BACCINO .
(4) (2) i2)

(1) Service de Mdecine Lgale, Facult de Mdecine, 13385 Marseille Cedex 5 (2) Service de Mdecine Lgale, Hpital Lapeyronie, 34295 Montpellier Cedex 5 (3) Service de Pharmacologie et Toxicologie, CHU Dupuytren, 87042 Limoges (4) Laboratoire Marcel Mrieux, 69357 Lyon Cedex 7 Observation : Un homme de 38 ans, travaillant dans une exploitation agricole, fait une tentative de suicide par injection intraveineuse de 50 mg d'une solution d'arsenite de sodium une concentration de 250 g/L (Pyralion). Le patient est admis l'hpital dans un tat de conscience satisfaisant, mais prsente rapidement un collapsus cardio-vasculaire et des signes digestifs type de vomissements et diarrhes intenses. La prise en charge thrapeutique comprend, outre les mesures de ranimation non spcifiques, un traitement par dimercaprol (B.A.L.) et N-actyl-cystine (Fluimucil). L'volution, favorable, sera marque par l'apparition d'un pisode dlirant rgressif sous neuroleptiques. Matriel et mthodes : Des dosages sanguins et urinaires ont t raliss sur 11 prlvements successifs durant 202 heures (cf. tableau 1 ) . Un prlvement de cheveux a galement t ralis au second jour de l'hospitalisation. Tous les dosages ont t effectus par spectromtrie d'absorption atomique. Une modlisation pharmacocintique a t effectue sur les rsultats des prlvements sanguins partir du logiciel P-Pharm. Le modle utilis est un modle bi-compartimental avec administration par voie intra-veineuse en bolus et limination partir du compartiment central. Rsultats : Les rsultats des prlvements sanguins et urinaires sont prsents dans le tableau 1. Le dosage effectu dans les cheveux montre une concentration 1051 pg/g. Le volume apparent de distribution de l'arsenic calcul partir de ces rsultats est de 9,86 l/kg, la clairance totale de 0,089 l/kg/h, et la demi-vie d'limination de 53 h. Tableau 1 : concentrations sanguines et urinaires au cours des diffrents temps de prlvement.
Temps de prlvement (H) H2 H4 H6 H10 H 34 H 58 Arsenic sanguin (fig/l) >300 >300 >300 62,8 53,4 50,7 Arsenic unitaire 12879 3818 1952 2818 1486 1544 (fig/l)

(m'i)
Fentanyl Cyaminazine, Oxazepam Nordazpam Diazepam Buprnorphine Norbuprnorphine ND : Non Detect 33 100 974 69 ND ND 0,8

+
ND ND ND ND ND ND

Discussion : La concentration sanguine de fentanyl est compatible avec la survenue d'effets toxiques ltaux dans un tel contexte (1, 2). La prsence concomitante de buprnorphine, de benzodiazepines, voire de cyammazine, n'a pu qu'accrotre l'effet dpresseur respiratoire du fentanyl. La prsence de fentanyl dans les seringues ainsi que dans la cuillre laisse suggrer un dconditionnement de patch fins d'injection ; cette utilisation dtourne par voie parentrale vient se surajouter au surdosage d l'apposition simultane de 2 patchs de fort dosage sur le corps. Une quarantaine de cas de dcs ont t rapports dans la littrature (2,3). Conclusion : Cette intoxication mortelle par fentanyl (qui semble tre le troisime cas rapport d'usage dtourn pouvant tre rattach un dconditionnement suivi d'une administration parentrale de Durogsic) vient souligner la toxicomanie lie cette spcialit (3). Rfrences : 1- Jeal W., Benfield P., Transdermal fentanyl. A review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy in pain control. Drugs 1997 ; 53 : 109-138. 2- Anderson D.T., Muto J.J., Duragesic transdermal patch: postmortem tissue distribution of fentanyl in 25 cases. J. Anal. Tox. 2000 ; 24 : 627-634. 3- Roberge R.J., Krenzelok E.P., Mrvos R, Transdermal drug delivery system exposure outcomes. J. Emerg. Med. 2000 ; 18 : 147-151.

127

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

H 82 H130 H154 H178 H 202

32,3 24,7 < 20 <20 < 20

3470 1055 2142 1530 1063

Conclusion : L'intrt de ce travail est de rapporter pour la premire fois un cas d'intoxication aigu par l'arsenic par voie intraveineuse. Les rsultats de la modlisation pharmacocintique doivent tre discuts en prenant en compte l'administration d'un traitement chlateur, susceptible de modifier l'limination urinaire de l'arsenic (1). Rfrences : 1- Mathieu D., Mathieu-Nolf M., Germain-Alonso M., Neviere R., Furon D., Wattel F. Massive arsenic poisoning - effects of hemodialysis and dimercaprol on arsenic kinetics. Intensive Care Med. 1992 ; 18 : 47-50.

Curarisation aprs morsure par serpent de mer : propos d'un cas survenu en Nouvelle- Caldonie
A. M A N D E A U . M. MIKULSKI , Y. BARGUIL , H. L E C O Q SAINT GILLES
(2) (1) (2) (1)

sur les neurotoxines des serpents du genre Laticauda, Aipysurus et Emydocephalus : Sea Snake Antivenom (CSL Limited, Parkville, Vic, Australia). Rsultats : * Bilan biologique : Creatines phosphokinases leves mais absence de myoglobinurie, coagulation normale. On note des signes de stress (glycmie augmente, importante leucocytose). * Clinique : BNM complet ne cdant pas au test de la prostigmine (figure 1 ) . Le srum, arriv par avion d'Australie, n'a pu tre inject que 3 jours aprs, sous prparation antiallergique par solumdrol du fait d'un terrain atopique. Les 4 doses ont t administres espaces rguliers au cours de la journe, et le lendemain, la rcupration du bloc neuromusculaire tait quasi-complte. La sedation a t arrte et l'enfant extub. Il recouvre alors toutes ses facults musculaires, sans squelle. Conclusion : Dans tous les cas d'envenimation et de curarisation par animaux marins, le plus important est de ventiler la personne et de compresser tout le membre atteint afin de limiter la diffusion du venin. Ce cas clinique a montr que le srum restait efficace, mme trs tardivement aprs l'envenimation, levant de faon spectaculaire le BNM.

(1) Laboratoire de Biochimie, (2) D.A.R.; Centre Hospitalier de Nouvelle-Caldonie, Av. Paul Doumer - B P J5 - 98849 Nouma Nouvelle Caldonie. Objectifs : Le lagon de la Nouvelle-Caldonie contient un nombre important d'organismes marins venimeux, dont les serpents marins sont les plus dangereux. Nous rapportons un cas de morsure suivi d'un bloc neuro-musculaire (BNM) complet chez un jeune enfant, rcupr par l'administration, plus de 72 heures aprs, d'un srum antivenimeux spcifique. Cas clinique : Un enfant de 9 ans a t mordu en mer par un animal non dtermin en nageant au bord de la plage. Des troubles visuels (diplopie), un ptosis, une perte d'quilibre se sont rapidement installs. Une dtresse respiratoire est survenue aprs 15 minutes ncessitant une ventilation artificielle. Devant un BNM complet, l'enfant a t transfr en ranimation et sdat. Matriel et mthode : * Bilan biologique : recherche de signes de rhabdomyolyse et de coagulation intravasculaire dissmine. * Clinique : la curarisation tait suivie en temps rel par stimulation lectrique du nerf cubital au poignet et recueil des mouvements de l'adducteur du pouce par acclromyo graphie (TOF Watch, Organon Technika ) . * Traitement spcifique : administration de 4 doses (1000 Ul chacune) de srum quin antivenimeux spcifique du serpent marin Enhydrina schistosa, actif aussi 128

Erythermalgie et ingestion de champignons (Clitocybe amoenolens)


P. SAVIUO. M. DE MATTEIS , J. BESSARD , P. MEZIN , P-A. MOREAU , Y. CHANE-YENE , M. MALLARET , D. GUEZ , V. DANEL
(4) (5) (13) 6) (7) (I) (2) (3)

(1) Unit toxicologie clinique, CHU, BP217, F-38043 Grenoble cedex 9 (2) Dpartement de neurophysiologie, CHU, BP217, F38043 Grenoble cedex 9 (3) Laboratoire de pharmacologie toxicologie, CHU, BP217, F-38043 Grenoble cedex 9 (4) Laboratoire de pathologie cellulaire, CHU, BP217, F-38043 Grenoble cedex 9 (5) Laboratoire de dynamique des cosystmes d'altitude, UJF, F-73376 Le Bourget-du-Lac (6) Centre rgional pharmacovigilance, CHU, BP217, F-38043 Grenoble cedex 9 (7) 2-32-6 Jonan - JP 569-0056 Takatsuki, Japan En 1996, 5 personnes ont prsent une erythermalgie 24 heures aprs l'ingestion de champignons pris pour Lepista inversa (Scop.) Pat. Objectif : Etablir la relation de cause effet entre l'ingestion d'une espce initialement inconnue et l'apparition d'une erythermalgie. Matriel et mthode : Les intoxiqus ont t investigues, la recherche d'une

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XILT, n 2, 2001

tiologie mdicale ou toxique autre. Une comparaison botanique de plusieurs espces de champignons, une revue bibliographique et une microscopie lectronique des spores ont t ralises. L'espce "inconnue" a t administre per os des rats. Rsultats : Un collectif de 7 cas a t runis. Les symptmes (douleurs, brlures) voluaient par paroxysmes, taient calms uniquement par des bains d'eau glace, rsistaient au traitement, et ont persist plusieurs semaines. Ils taient accompagns d'un rythme au moment des crises, et parfois d'un dme. L'exploration immunologique, toxicologique et de l'tat inflammatoire tait ngative. L'lectromyogramme a montr 3 reprises de discrtes lsions axonales. Aucune autre explication n 'a t trouve. Clitocybe acromelalga Ichimura est une espce japonaise responsable d'un syndrome analogue (1) et dans laquelle des toxines ont t isoles : les acides acromliques (2) sont des amino acides excitateurs des rcepteurs non-NMD A (N-mthyl-d-aspartate) du glutamate, d'action proche des kanates. La comparaison de l'espce "inconnue" avec Clitocybe amoenolens Malenon (d'odeur proche) et Clitocybe acromelalga Ichimura a permis de confirmer Clitocybe amoenolens. L'administration per os de Clitocybe amoenolens 4 rats a montr une perte de poids, et chez les 2 rats les plus doss une prostration, des troubles locomoteurs du train postrieur et un ry thme des pattes. L'examen en microscopie lectronique des nerfs sciatiques a objectiv des lsions axonales et myliniques (J ). Conclusion : Une nouvelle tiologie toxique d'rythermalgie a t mise en vidence. La toxicit de Clitocybe amoenolens a t confirme. Il est recommand de ne plus consommer Lepista inversa, Lepista gilva et Clitocybe gibba avec lesquels il peut tre confondu. Il restait en identifier les toxines, en particulier les acides acromliques. Rfrences : 1- Nakamura K., Shoyama F, Toyama J., Tateishi K., "Empoisonnement par le Dokou-sassa-ko". Japanese J. Toxicol. 1987 ; 0 : 35-9.
4

(2) Unit toxicologie clinique, C H U , BP217, F-38043 Grenoble cedex 9 Objectif : Clitocybe acromelalga, champignon croissant au Japon est connu pour provoquer des rythermalgies. L'objectif de ce travail a t de rechercher d'ventuelles toxines communes cette espce et Clitocybe amoenolens, champignon cueilli dans les Alpes et rcemment dcrit comme susceptible d'induire lui aussi des rythermalgies. Matriel et mthode : Des exsiccata de Clitocybe amoenolens rcolt dans les Alpes, et de Clitocybe acromelalga provenant du Japon ont t broys et tuvs jusqu ' poids constant. Aprs agitation dans un mlange methanol/eau (50/50) durant 5 heures, les extraits rsultants ont t purifis par extraction en phase solide sur des phases change uses d'anions (2), puis analyss en spectromtrie de masse ( CG/IE/SM et CLVES/SM mode ngatif). Rsultats : L'acide acromlique A est une toxine, prsente en quantit notable dans le champignon japonais. Il a t identifi partir du produit pur par le spectre de masse de son driv silyl. Cet acide a ensuite t retrouv dans l'extrait du champignon japonais et enfin identifi dans le champignon franais. La comparaison des profils chromatographiques et des spectres de masse laisse souponner la prsence d'autres toxines communes, notamment un autre isomre de l'acide acromlique. La quantification de l'acide acromlique A a t entreprise en CL/ES/SM mode ngatif. Les premiers rsultats indiquent une teneur voisine de 31 pg/g de produit sec dans Clitocybe amoenolens. Conclusion : 1- Cette tude met en vidence pour la premire fois la prsence d'acide acromlique A dans Clitocybe amoenolens. 2- En terme de classification, elle conforte l'appartenance des deux espces la mme section. 3- Elle pose le problme de la responsabilit de l'acide acromlique dans l'rythermalgie du fait de sa prsence dans deux espces produisant ce syndrome. Rfrences : 1- Erythromelalgia and mushroom poisoning Saviuc P.F., Danel V.C., Moreau P-A.M., Guez D.R., Claustre A.M., Carpentier PH., Mallaret M.P., Ducluzeau R. accept dans J. Toxicol. Clin. Toxicol. 2- Comparison of UV absorption and electrospray mass spectrometry for the high-performance liquid chromatographic determination of domoic acid in shellfish and biological samples Lawrence J.F., Lau B.P-Y. Cleroux C, Lewis D. J. Chromatogr. A 1994 ; 659:119-126.

2- Konno K., Hashimoto K., Ohfune Y., Shirahama H., Matsumot T., Acromelic acids A and B. Potent neuroexcitatory amino acids isolated from Clitocybe acromelalga. J. Am. Chem. Soc. 1988 ; 110 : 4807-15.

Clitocybe acromelalga ...japonais, Clitocybe amoenolens : un cousin franais ?


J. BESSARD. P. SAVIUC , Y. CHANE-YENE , G. BESSARD (1) Laboratoire de pharmacologie et toxicologie, CHU, BP217, F-38043 Grenoble cedex 9
(2) (2)

129

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

A la recherche de sensations fortes : toujours plus...


J.P. G O U L L . P. BRIQUET, I. BERKELMANS, G. BRUNET, R. FRANCONY, P A . MOREAU Groupe Hospitalier du Havre, B.P. 24, 76083 LE HAVRE (France) Objectif : L'objectif de ce travail est de rapporter trois cas d'ingestion volontaire de champignons hallucinognes associe du cannabis. Matriel et mthodes : Observations : Trois jeunes femmes de 21, 18 et 21 ans, consomment une omelette aux champignons hallucinognes cueillis Etretat, prs du Havre. Deux d'entrs elles ont souhait faire une exprience, la troisime est consommatrice occasionnelle d'ecstasy et de cannabis. A l'admission, toutes trois prsentent un syndrome psychodysleptique : hallucinations visuelles type de dformation d'objets au dcours. Des signes sympathomimtiques sont constats : mydriase bilatrale constante, tachycardie dans deux cas. Deux d'entre elles sont nauseuses et l'une est atteinte de vomissements et de cphales. Elles avouent la prise de champignons hallucinognes l'exclusion de toute autre substance, et ont amen l'omelette. Elles sont traites par charbon activ. Deux d'entre elles prsentent un taux de prothrombine diminu (47 % associ un dficit en facteur VII pour l'une, et 65 % pour la seconde). Aucune explication n'est trouve quant l'origine de ces troubles de la coagulation, les explorations complmentaires s'avrant ngatives. Les volutions sont favorables. Mthodes : La recherche de stupfiants est ralise dans les urines par immunoanalyse. Celle-ci est complte par des dpistages urinaires par CG/SM et sanguins par CL/UV/BD. La confirmation du cannabis urinaire est effectue par CG/SM aprs drivation et le dosage des cannabinodes sanguins par CG/SM, selon la procdure recommande par la SFTA (1). La psilocine est identifie dans l'omelette et dans les urines par CG/SM aprs extraction puis drivation par le BSTFA + 1% de TMCS (2). Rsultats : Les recherches de cannabis urinaire par immunoanalyse sont toutes positives, celles-ci sont confirmes par CG/SM. La psilocine est formellement identifie dans les champignons prlevs dans l'omelette ainsi que dans les urines par CG/SM. Si l'thanol est absent, toutes trois avaient galement consomm du cannabis comme l'attestent les dosages sanguins : tetrahydrocannabinol (THC) = 3,0 - 3,4 et 2,0 pg/l ; tetrahydrocannabinol driv hydroxy l (11-OH-THC) -4,6-5,8 et 5,1 pg/l ; tetrahydrocannabinol driv carboxylique (THC-COOH) = 35-56 et 34 pg/l. Conclusion : Ces trois observations illustrent les nouveaux comportements en matire d'usage de substances psychoac130

tives, les sujets n 'hsitant plus consommer en mme temps que le cannabis, dont l'emploi est dsormais bien banalis, d'autres molcules psychoactives ou psychodysleptiques : autres stupfiants, mdicaments dtourns de leur usage, produits hallucinognes. Rfrences : 1- Kintz P., Cirimle V, Ppin G. et coll. Identification et dosage des cannabinodes dans le sang total. Toxicorama, 1996 ; 8 : 29-33. 2- Allouche C, Perry D., Brunei P. et coll. Un drle de champignon : le "magic mushroom " VII congrs de la Socit Franaise de Toxicologie Analytique, Marseille. Toxicorama, 1999 ; XI : 196.

L'volution des teneurs en THC dans les produits base de cannabis en France : mythe ou ralit ?
P. MURA . M. PERRIN , M. CHABRILLAT , H. CHAUDRON ,
(4) (1) (2) 3)

V. DUMESTRE-TOULET^, G. PEPIN

(6)

(1) Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers ; (2) Institut de Recherche Criminelle de la Gendarmerie Nationale , Rosny-Sous-Bois ; (3) Laboratoire Interrgional des Douanes, Paris ; (4) Laboratoire de Police Scientifique, Lyon ; (5) Laboratoire BlOffice, Artigue Prs Bordeaux ; (6) Laboratoire Toxlab, Paris Objectif: Il semble tre tabli que les Californiens produisent des varits de Cannabis Sativa Indica contenant 15 % de A9-ttrahydrocannabinol (THC), tandis que des cultures sous serre aux Pays-Bas conduisent laborer de la rsine titrant jusqu' 30 %. De ce fait, l'augmentation des teneurs en THC dans les produits base de cannabis vendus en France est, depuis quelques annes, frquemment voque dans la littrature. Cependant, notre connaissance, cette affirmation ne repose sur aucune base bibliographique. L'objet de la prsente tude est de vrifier la valeur de cette information. Mthode : Nous avons rassembl 5152 rsultats d'analyses obtenus depuis 1993 sur des produits de saisies effectues par les services des douanes, de la police nationale et de la gendarmerie nationale. Les renseignements fournis indiquaient l'anne de la saisie, le type de produit (herbe, rsine, pollen, etc.) et la teneur observe en THC. Les analyses taient ralises par chromatographic en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse. Rsultats : Quelque soit l'anne tudie, une trs grande variabilit des concentrations est observe pour l'herbe (mlange de feuilles, tiges et sommits florales), mais aussi pour la rsine ("haschich"). Des concentrations

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

en THC infrieures 2 % sont relativement frquentes (18 % des chantillons). Jusqu'en 1995, la moyenne pour l'herbe tait de 5,5 %, et la teneur la plus leve observe dans une saisie a t de 8,7 %. Pendant la mme priode, les chantillons de rsine contenaient en moyenne 7 % de THC, avec un maximum de 10,6 %. Depuis 1996, bien que d'une faon gnrale les teneurs observes dans la majorit des chantillons n 'aient pas beaucoup volu (environ 8 % pour l'herbe et 10 % pour la rsine), sont apparus des chantillons base de cannabis trs fortement concentrs en THC. En effet, nous observons ces dernires annes l'apparition d'chantillons contenant jusqu' 31 % pour la rsine et 22 % pour l'herbe. Au cours de l'anne 2000, 3 % des chantillons d'herbe et 18 % des chantillons de rsine analyss contenaient plus de 15 % de THC. La palme revient aux nouveaux produits apparus sur le march franais depuis 1998 : le "skunk" (varit de fleurs de cannabis originaire des U.S.A.) et le "pollen" (tamines des plants mles), pouvant contenir respectivement jusqu ' 24 et 43 % de THC. Conclusion : Les rsultats de cette tude montrent que l'augmentation des teneurs en THC dans les produits de saisie base de cannabis est apparue en France en 1995. Si la majorit des chantillons d'herbe et de rsine analyss ces dernires annes contiennent rarement plus de 10 % de principe actif, des produits trs fortement concentrs en THC sont apparus, tout particulirement avec les produits nouveaux.

Nouvelles mthodes d'extraction pour les matrices liquides


J.-L. V E U T H E Y Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique, Universit de Genve, 1211 Genve 4 La prparation d'un chantillon avant son analyse au moyen d'une technique approprie fait partie intgrante du procd analytique. Les techniques d'analyse ont connu ces dernires annes un trs grand dveloppement permettant d'amliorer notablement leur slectivit et sensibilit et de rduire drastiquement le temps d'analyse. Toutefois, la prparation d'chantillon n'a pas connu un tel dveloppement et de fait, cette tape du procd analytique devient limitante en termes de temps d'analyse et de prcision obtenue. Ainsi, il est ncessaire aujourd'hui de dvelopper des procdures de prparation rapides, efficaces et pouvant tre automatises. Pour les matrices solides, les extractions en phase superritique, acclres par solvant et par micro-ondes sont maintenant reconnues en tant que procdures alternatives aux techniques conventionnelles permettant de rduire fortement le temps de prparation de l'chantillon. Pour les matrices liquides complexes tels que les liquides biologiques, les extractions liquide-liquide classiques sont souvent rempla-

ces par des extractions sur support solide (solid phase extraction, SPE et solid phase micro extraction, SPME), permettant de rduire le temps de prparation de l'chantillon et pouvant tre facilement automatises avec les chromatographies. La commercialisation de nouveaux supports slectifs (empreinte molculaire, anticorps monoclonaux, etc..) ou compatibles avec la percolation directe et rapide de fluides biologiques (support accs restreint) a largement contribu au succs de l'extraction sur phase solide. De plus, ces supports peuvent tre utiliss sous formes de cartouches, de disques, de fibres ou de colonnes coupls directement ou indirectement aux colonnes chromatographiques. Enfin, le dveloppement de la spectromtrie de masse comme dtecteur de choix en analyse toxicologique et pharmaceutique a galement contribu au dveloppement de nouveaux concepts plus rapides de prparation de l'chantillon. Diffrentes techniques d'extraction de matrices liquides et leur couplage avec les chromatographies et la spectromtrie de masse seront dcrites. Plus particulirement, des applications d'analyse de substances mdicamenteuses telles que la methadone et son principal metabolite prsents dans des fluides biologiques seront prsentes. Les exemples comprendront l'utilisation de supports accs restreint ou polymriques compatibles avec l'injection directe de fluides biologiques et l'emploi d'un systme commutations de colonnes (prcolonne/colonne analytique). Ces systmes seront coupls un spectromtre de masse quip de Vlectrospray comme technique d'ionisation pression atmosphrique et d'un analyseur simple ou triple quadripoles. Cette configuration permet d'augmenter la sensibilit, la rapidit et la slectivit de l'analyse par rapport aux modes de dtection conventionnels utiliss en chromatographie liquide.

tude ponctuelle de rendements d'extraction au cours des procdures de recherche large de mdicaments ("screening")
A.TURCANT , M. ARTUR , J.H BOURDOISP, B. CAPOLAGHP>, C. CHARLIER , A. GRUSON , N. HOUDRET . M.F. KERGUERIS , C. LACROIX , D. LAMIABLE , M. M O U L S M A , P. MURA , F. VINCENT >
(2) (2) t2) (2) (2) (2) (2) (2) (2 (12) (2)

(1) Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, CHU ANGERS 49033, (2) Commission Toxicologie Hospitalire, SFTA Objectif : La commission de toxicologie hospitalire de la SFTA a cherch valuer diffrentes procdures d'extraction, tant liquide-liquide (LL) que liquide-solide (LS), lors de la recherche large de toxiques dans le sang. Matriel et Mthodes : Deux mlanges de 5 substances chacun ont t prepa-

id

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

rs sous forme de solutions mthanoliques 50 mg/L de Zolpidem, de nordiazpam, de cyammazine et 12,5 mg/L d'alprazolam et d'hydroxyzine pour le mlange 1 et 100 mg/L d'amisulpride, 50 mg/L de propranolol, 25 mg/L de fluoxetine et de clomipramine et 12,5 mg/L de miansrine pour le mlange 2. Ces 2 mlanges ont t dilus au l/50e dans du plasma de veau ftal et chaque centre a reu un chantillon des solutions mthanoliques et 6 ml de l'chantillon plasmatique. Les 13 centres ont effectu les analyses par CLHP couple un dtecteur UV barrette de diodes (n = 9) ou par CPG couple la spectromtrie de masse (n = 4). Rsultats : 9 centres ont test l'extraction LL (4 solvants divers, 4 Toxitubes A et 1 Extrelut) et 7 l'extraction LS (4 Bondelut Certify, 2 Oasis et 1 SDS DAU). L'extraction LL par solvants divers a t faite pH entre 9 et 11 par, soit un solvant unique (dichloromthane, ther), soit un mlange binaire (dichloromthane/hexane 3/4), soit un mlange ternaire (chloroforme/heptane/isopropanol 60/26/14). Les rendements sont suprieurs 60 % sauf pour le mlange binaire (20 50 %). L'extraction par Toxitube A donne des rsultats fluctuants selon les centres malgr un protocole a priori unique avec notamment des valeurs faibles (< 50 %) pour cyammazine, clomipramine et miansrine. L'Extrelut B a donn des rsultats faibles pour les 3 mmes molcules. L'extraction LS sur Bondelut Certify donne des rsultats satisfaisants (> 60 %) sauf pour nouveau les 3 molcules ci-dessus et les valeurs de la fluoxetine sont fluctuantes selon les centres. Des rsultats comparables sont observs avec les autres extractions LS l'exception des cartouches Oasis MCX qui donnent des valeurs suprieures 50 % pour les 9 molcules dtectes. Discussion : Cette tude ponctuelle mene sur quelques molcules et sur un nombre d'essais par centre trs faible (1 3) montre une grande diversit de rsultats selon la prparation de l'chantillon. Cette disparit est peut-tre galement lie la diffrence d'approche analytique et laisse penser que les procdures de screening sont ingales selon les centres. Les extractions LL semblent mieux adaptes une recherche large que les extractions LS l'exception, peut-tre, des Oasis MCX . Estil possible d'envisager une standardisation unique pour l'extraction soit LL soit LS ?

(4) Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, CH Le Havre 76083 (5) Laboratoire de Biochimie, Hpital Edouard Herriot Lyon 69437 Objectif: La rduction de la dure de prparation des chantillons, associe une amlioration de l'efficacit de l'extraction est une proccupation constante de la Toxicologie d'urgence. Dans cette optique, la commission de Toxicologie Hospitalire a men une tude sur la sonification applique l'extraction liquide-liquide. Matriel et mthodes : Un sonificateur syntonisation automatique Fisher Bioblock de 130 Watt et une microsonde de 3mm de diamtre ont t utiliss sur des volumes infrieurs 10ml dans des tubes borosilicats 16 x 100 mm. Les chantillons retenus sont des plasmas sanguins surchargs en fluoxetine et norfluoxtine, deux mlanges de 5 substances chacun (sol. A : Zolpidem, nordiazpam, cyammazine, alprazolam, hydroxyzine ; sol. B : amisulpride, propanolol, fluoxetine, clomipramine, miansrine) et des prlvements sanguins envoys pour une recherche toxicologique. La technique de comparaison est une extraction liquide-liquide mcanique (70 AR/min) utilisant les mmes solvants que ceux utiliss lors de la sonification. L'tude a t conduite en deux tapes : recherche des meilleures conditions d'utilisation puis comparaison des rsultats obtenus avec une extraction classique par agitation. Cinq centres ont test ce type d'extraction sur les diffrents types d'chantillons et plusieurs solvants (dichloromthane, hexane, chloroforme, chlorobutane). Rsultats : La hauteur d'immersion de la sonde s'est rvle un paramtre important dans l'efficacit de l'extraction et doit tre dtermine pour chaque type d'extraction. Il en est de mme pour l'amplitude de vibration et la dure d'agitation. La comparaison des rendements d'une extraction par sonification en moins de 10 secondes avec ceux de l'extraction mcanique en 15 minutes montre des rsultats similaires. Lors des essais de rptabilit, la dispersion des valeurs par sonification a t sensiblement le double de celles obtenues en extraction mcanique. Discussion : Les rendements obtenus sont diffrents selon le type de molcule. Une tude est en cours pour prciser le rle de la nature des molcules, des solvants et du tampon de pH utiliss. Ces premiers rsultats montrent l'intrt d'une mthode nouvelle sans consommable qui peut apporter une amlioration dans la prparation des chantillons et qui mrite une attention plus approfondie de la part de la communaut toxicologique.

Extraction liquide-liquide par sonification


P. LEVILLADSP. B. CAPOLAGHI . M. F. KER(l2)

GUERIS , C. LACROrX , M . MOULSMA


(2) Laboratoire de Biochimie-Toxicologie, Bel-Air C H R Metz-Thionville 57100

(13)

(14)

(15)

(1) Commission Toxicologie Hospitalire, SFTA Hpital

(3) Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, Hotel Dieu Nantes 44035 132

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XUJ, n 2, 2001

Recommandations pour la technique d'extraction des 1RS en toxicologie hospitalire


D. L A M I A B L E . B. CAPOLAGHI , M.F. KERGUERIS , M. LAVIT ', J. ARPITI , C. LACROLX , M. MOULSMA , N. HOUPRET, C. CHARLIER , A. TURCANT
(2) 2 (2) (2) (2) (2) 0 2) (2)

(1) Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, CHU de Reims , (2) Commission de Toxicologie Hospitalire de la S.RT.A. Objectif : L'augmentation de la prescription des antidpresseurs inhibiteurs de la srotonine et la mise disposition des cliniciens d'un nombre croissant de spcialits vont de pair avec l'apparition de plus en plus frquente d'intoxications impliquant ces mdicaments. Ce fait n 'est pas sans crer quelques difficults en toxicologie hospitalire car il n'existe ni de technique rapide d'identification de ces molcules par mthode immunologique, comme c'est le cas pour les antidpresseurs tricycliques, ni de technique standardise. Trois tudes ponctuelles de qualit sur la fluoxetine, la paroxetine, le milnacipran, et ralises entre 10 laboratoires utilisant leurs procdures habituelles, ont montr une dispersion importante des rsultats (CV=40 %), et la ncessit d'une harmonisation de la technique d'extraction face l'imprcision des rsultats. Matriel et mthode : Une valuation interlaboratoires (n=10) de la mthode d'extraction retenue a t ralise et a permis de proposer le schma suivant avec comme talon interne le paramthylmilnacipran :
Srum
P E : 1ml A j o u t talon interne et N a O H 4 M Liquide/liquide

nique CLHP est de l'ordre de 15 % aux deux niveaux de concentrations et pour les 7 molcules. Une plus grande variabilit est observe pour l'ensemble des dosages raliss en phase gazeuse, un des centres ayant tendance surdoser et l'autre sousdoser. Conclusion : Cette tude illustre l'importance d'une standardisation des procdures pour les dosages de mdicaments par chromatographie et le rle indispensable d'un contrle de qualit pour la mise en place et le suivi de ces techniques.

Intoxication mortelle par le sulfure d'hydrogne : propos de deux cas


V.CIRIMELE . P.KINTZ >, C. P O C H E , M.VILL A I N , F. BILLAULI, G. PEPIN< , B.LUPES>
0) 3) 0) (1 (2)

(1) Institut de Mdecine Lgale, 11, rue Humann, 67085 Strasbourg (2) Service de Biochimie, CH de Chambry, BP 1125, 73011 Chambry (3) Toxlab, 18, rue Andr P e l Sarte, 75018 Paris Objectifs : Le dosage des ions sulfures est gnralement ralis par ionomtrie mais la sensibilit de cette technique peut tre parfois insuffisante. Les mthodes de dosage par titration sont peu spcifiques et donc peu recommandables en toxicologie mdico-lgale. Le dosage par chromatographie en phase gazeuse couple un dtecteur capture d'lectrons ou de masse ncessite gnralement une prparation longue et fastidieuse (extraction, drivation complexe). Ce travail a pour objectif de dvelopper un procd rapide, sensible et spcifique pour le dosage directe du sulfure d'hydrogne dans le sang par le couplage espace de tte-chromatographie en phase gazeuse-spectromtrie de masse. Cette technique a t applique deux cas d'intoxication mortelle par sulfure d'hydrogne. Matriel et mthode : L'chantillon de sang (1 ml) est introduit dans un flacon en verre et hermtiquement scell. Aprs addition d'acide orthophosphorique concentr ( 1 ml), le flacon est incub 15 min 80 C dans un systme HS 40 (Perkin Elmer). Sous une pression d'hlium de 15 psi, un aliquot de la phase vapeur est transfr au systme chromatographique (Hewlett Packard 5890). La sparation est ralise sur colonne Supel-Q plot (30 m x 0,32 mm), aprs division dans un injecteur chauff 250 C (pression en tte de colonne 6 psi) et programmation en temprature du four (35 C, 25 C/min jusqu' 250 C). L'acquisition est ralise en mode "ions slectionns" (H S : temps de rtention 1,59 min, m/z 32, 33, 34) sur un dtecteur de masse Hewlett Packard 5971. La quantification est ralise aprs talonnage externe de l'appareil pour des concentrations variant de 0,1 25 pl H S/ml de sang.
2 2

Extraction

Hexane alcool n-amylique 98/2

Phase aqueuse
Eliminer

Phase organique
H C I 0,01 M

Rextraction Phase aqueuse CLHP

CPG

1 Phase organique
Eliminer

L'tude de qualit de cette recommandation a t effectue partir de srum surcharg deux niveaux de concentration avec 7 1RS : citalopram, fluoxetine, fluvoxamine, milnacipran, paroxetine, sertraline et venlafaxine. Sur les dix centres participant, 8 ont ralis la sparation par chromatographie en phase liquide, la lecture se faisant en U.V. ou sur une barrette de diodes et deux par chromatographie en phase gazeuse couple un spectromtre de masse. Rsultats : La moyenne de la prcision intersite obtenue en tech-

133

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

Rsultats et conclusion : Le technique de dosage du sulfure d'hydrogne dans le sang est linaire (r = 0,98) pour des concentrations variant de 0,1 (0,2 mg/L) 25 pl/ml (38,5 mg/L) de sang, rptable (coefficient de variation de 5,8 % 1 pl/ml ou 1,5392 mg/L) et sensible (S/N = 100 0,1 pl/ml ou 0,2 mg/L). Par ce procd, il est donc possible dfaire la diffrence entre une concentration physiologique (< 0,05 mg/L) et une concentration potentiellement ltale. Le dosage du sulfure d'hydrogne dans le sang de deux victimes (gouttiers) a permis de doser ce toxique des concentrations de 0,7 pl/ml (1,1 mg/L) et 5,5 pl/ml (8,5 mg/L). Ces concentrations sont compatibles avec les concentrations mortelles (0,92 14,2 mg/L) dj publies (1,2). La mthode dveloppe est simple (sans extraction, ni drivation), rapide (20 min), sensible (taux physiologiques dtectables) et spcifique pour le dosage du sulfure d'hydrogne dans le sang. Rfrences : 1- Winelc et al. Death from hydrogen-sulphide fumes, Lancet 1968 ; 1 : 1096. 2- Tracqui et al. Intoxication mortelle par l'hydrogne sulfur. J. Md. Strasbourg 1991 ; 22 : 172-175.

Dpistage et quantification de toxiques ou mdicaments dans le sang total par lectrophorse capillaire (*)
J.C. H U D S O N R.C.M. Police, Forensic Laboratory, P.O. Box 6500, 6106 Dewdney Ave. W., Regina, Saskatchewan, S4P 3J7, Canada Objectif : U lectrophorse capillaire (CZE) est maintenant utilise pour I 'analyse qualitative et quantitative de mdicaments ou de toxiques dans le sang total. Cette prsentation traite de l'utilit de cette technique dans un laboratoire de toxicologie. L'identification de toxique peut tre dtermine avec prcision en utilisant les mobilits lectrophortiques couples au spectre UVde chaque molcule. Des exemples provenant de plus de 500 molcules analyses dans ce laboratoire judiciaire vont dmontrer Vavantage de mettre en pratique Vlectrophorse capillaire dans un laboratoire de toxicologie. Matriel et mthode : La procdure de dpistage des toxiques inclut l'analyse par lectrophorse capillaire de zone des toxiques basiques aprs extraction en phase liquide et des toxiques acides aprs extraction en phase solide (1). Ces analyses ont t effectues sur des systmes P/ACE 5500 et P/ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, USA) avec dtecteur barrettes de diode. Les conditions d'analyse sont les suivantes : - pour les composs basiques : capillaire de silice vierge (50 cm x 75 pm D.I.), tampon de sparation : 100 134

mM phosphate pH = 2,38, tension : 18kV, T : 25 C, injection lectrocintique : 10 kV x 8 sec, dtection UV : 200 nm (spectre de 190 350 nm), - pour les toxiques acides : capillaire de silice vierge (50 cm x 75 pm D.I.), tampon de sparation : 100 mM borate pH = 8,5, tension : 16,5 kV, T : 25C, injection pression 34,5 mBar pour 16 secondes, dtection UV : 200 nm (spectre de 190 350 nm). Rsultats : Les travaux ont t raliss pour 550 composs basiques ainsi que pour plus de 100 molcules acides. La combinaison des mobilits lectrophortiques et des spectres UV permet une identification prcise de ces diffrents toxiques. En effet, des tudes de reproductibilit ralises pendant 4 mois ont montr des coefficients de variation sur les mobilits lectrophortiques infrieurs 0,3 % (2). Des tudes de cas (analyse de sang putrfi par exemple) ont galement t effectues, mettant en vidence la robustesse de Vlectrophorse capillaire (2). Conclusion : L'lectrophorse capillaire est utilise en routine dans ce laboratoire depuis 1994. Cette technique a t intgre aux procdures de dpistage telles que la technique EMIT et les techniques de chromatographie. Les rsultats obtenus par lectrophorse capillaire sont devenus les premiers pris en compte dans la dtermination des cas positifs ou ngatifs. La CZE pourrait rentrer en comptition directe avec les techniques conventionnelles de chromatographic en tant que technique de dpistage de choix en mdecine lgale. Rfrences : 1- Hudson J.C, Golin M. and Malcom M. Capillary Zone Electropheris in a Comprehensive Screen for Basic Drugs in Whole Blood. Can. Forens. Sci. J. 1995 ; 28 : 137-152. 2- Hudson J.C, Capillary Zone Screen for Drugs Can. Forens. Sci. * Prsentation Golin M, Malcom M.J., Whiting C, Electropheris in a Comprehensive of Forensic Interest in Whole Blood. J. 1998 ; 31 : 1-29.

faite en anglais

Importance des proprits acidobasiques de la mirtazapine dans les techniques sparatives


L. LABAT. P. DALLET, M.H. LANGLOIS, E. KUMMER, J.P. DUBOST Laboratoire de Chimie Analytique, UFR des Sciences Pharmaceutiques, 3 place de la Victoire, F-33076 Bordeaux cedex. Objectif : La mirtazapine (M) est un antidpresseur de nouvelle gnration d'action centrale, antagoniste des rcepteurs G2 prsynaptiques, l'origine d'une augmentation de la neurotransmission noradrnergique et sro-

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

toninergique. L'identification et le dosage de la M et de son metabolite actif, la dmthylmirtazapine (DMM), dans les milieux biologiques peuvent tre raliss par chromatographie liquide haute performance (CLHP) (1, 2) ou en lectrophorse capillaire (EC) (3). Ces deux molcules possdent deux fonctions amine de basicit trs diffrente. Nous en tudions l'incidence sur leur comportement analytique en CLHP et EC. Matriel et mthodes : Nous avons dtermin les deux pKa de la M en potentiomtrie et en spectrophotomtrie UV. La sparation d'un mlange de 12 antidpresseurs, dont la M et la DMM, a t effectue en CLHP sur une colonne Satisfaction RP 18AB (250 mm x 4,6 mm, 5 pm) (CIL Cluzeau Info Labo) 45 C avec une phase mobile actonitrile/tampon pH 4,8 (35/65, v/v) (1). En EC, la sparation a t optimise 25 C sur un capillaire en silice fondue conditionn par un tampon borate 42 mM (pH 9,5) 20 % de methanol et une tension applique de 15 kV(3). Pour les deux techniques, nous avons tudi l'influence de diffrents paramtres (composition des phases mobiles en CLHP et des tampons de migration en EC, temprature d'analyse) sur les temps de rtention (tR) en CLHP et sur les temps de migration (tM) en EC. Rsultats : Le pKa du groupement amino-2-pyridine de la M est de 3,6 et celui de la fonction amine tertiaire, de 7,5. En CLHP, nous avons mis en vidence l'influence particulirement importante du pH de la phase mobile (pH 3 5) et de la temprature (25 C 50 C) sur les tR des deux molcules. En EC, les augmentations du pH du tampon de migration (pH 9,2 9,9) et du pourcentage en methanol (0 30 %) sont l'origine d'un allongement des tM de l'ensemble des molcules. L'augmentation est cependant beaucoup plus importante au del de 20 % de methanol pour la M et la DMM. Une augmentation de la tension applique ou de la temprature montre une diminution des tM de toutes les molcules. Conclusion : Les comportements analytiques de la M et de la DMM sont trs dpendants des variations de pH dans des zones proches des deux pKa. Ainsi, le changement de l'tat d'ionisation de la M et de la DMM entre pH 3 et 5 esta l'origine d'une modification importante de leurs temps de rtention en CLHP. Les deux molcules sont beaucoup moins sensibles aux variations de pH dans les zones plus basiques utilises en EC Rfrences : 1- Dallet P. et al. Sparation des antidpresseurs de nouvelle gnration par CLHP sur colonnes Satisfaction RP18 AB et Stability C 8. 38 Congrs Socit de Toxicologie Clinique, 7-8 Dcembre 2000, Bruxelles.
me

sant mirtazapine and its demethyl metabolite in human plasma. J. Chromatogr B 1999 ; 721 : 309-16. 3- Labat L. et al. Intoxications par les nouveaux antidpresseurs : screening en ECZ. 38 Congrs Socit de Toxicologie Clinique, 7-8 Dcembre 2000, Bruxelles.
me

Dosage des CLHP/SM

cyanures

sanguins

par

A. TRACQUI. J.S. RAUL, A. GRAUT, P. KINTZ, B. LUDES Institut de Mdecine Lgale, 11 rue Humann, 67085 Strasbourg (France) Objectif: Dvelopper une mthode de dosage des cyanures sanguins par CLHP/SM. Matriel et mthodes : I ) Extraction. Dans un tube headspace utilis comme cellule de microdiffusion, ajouter a) 2 ml de sang total, 50 pl de K' C N (1,43 mM, standard interne [Aldrich, Rf. 49,053-9]) et 2 ml de H S0 concentr, b) un godet de recueil (tube Eppendorff) avec 200 pl de methanol/ammoniaque (90 :10, v/v). Sertir, agiter doucement (30 min). Ouvrir, ajouter dans le godet 30 pl de 2,3naphtalne-dialdhyde (NDA, 10 mM) et 30 pl de taurine (50 mM). Laisser ragir 20 min, pipetter le contenu du godet, vaporer 45 C. Reprendre l'extrait sec avec 30 pl de methanol, injecter 2 pl. 2) Chromatographie. Colonne CLHP : NovaPak Cl8, 4 pm (Waters), 150 x 2,0 mm, i.d. + pr-colonne OptiGuard Cl8 (Interchim), 15 x 1,0 mm, i.d. ; phase mobile : actonitrile/tampon 2 mM NHjCOOH, pH 3,0 ; gradient 35-80 % en 9 min, dbit 200 pl/min, split postcolonne 1 : 3. 3) Dtection. Spectromtre de masse Perkin-Elmer Sciex API-100, interface ionspray ; tension d'ionisation (capillaire) - 4500 V ; tension d'orifice - 50 V ; lectromultiplicateur + 2200 V ; acquisition en TIC ou en SIM sur les masses m/z 299,0 et 191,0 (complexe form avec CN), 301,0 et 193,0 (complexe form avec C' N).
3 I5 2 4 I3 5

2- Maris F.A. et al. HPLC assay with fluorescence detection for the routine monitoring of the antidepres-

Rsultats : Cette mthode apparat fiable, sensible et hautement spcifique. Les limites de dtection et de quantification pour CN sont de 10 et 30 ng/ml dans le sang (0,38 et 1,15 pM). La calibration est linaire de 30 ng/ml 6 pg/ml. La variabilit intra- et inter-analyses (teste 500 ng/ml) est toujours < 10 %. Conclusion : II s'agit de la premire mthode CLHP/SM dcrite dans la littrature pour le dosage des cyanures sanguins. Inspire de travaux antrieurs faisant appel la complexation de CN par NDA + taurine pour former un driv fluorescent (1,2), elle s'en distingue par l'tape pralable de microdiffusion et par la dtection SM ; ces modifications permettent de l'appliquer des matrices 135

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

fortement dgrades et surtout lui confrent la spcificit absolue souhaitable dans les applications mdicolgales. Une autre amlioration dcisive rside dans l'utilisation d'un analogue isotopique du cyanure comme standard interne ; galement dcrite pour la premire fois dans la littrature, cette innovation fournit une solution lgante et efficace aux problmes poss par la quantification prcise des cyanures dans le sang. Rfrences : 1- Sano A. et ai- High-performance liquid chromatographie determination of cyanide in human red blood cells by pre-column fluorescence derivatization. J. Chromatogr., 1992 ; 582 : 131-135. 2- Lacroix C. et ai- Dosage des cyanures par HPLC. Application des prlvements mdico-lgaux. Comm. prsente au VIIme Congrs de la SFTA, Marseille, 23 juin 1999.

Intrt de la CPG-SM-SM compare la CLHP-SM pour la dtection du LSD dans les phanres
M. C H E Z E . F. VAYSSETTE, G. PEPIN Laboratoire d'expertise TOXLAB, 18 rue Andr Del Sarte, 75 018 Paris Objectifs : Le LSD est un puissant hallucinogne qui agit des doses trs faibles. Il est habituellement vendu sous forme de buvards imprgns 50 pg en moyenne. Les concentrations conscutives dans les phanres sont de l'ordre du picogramme rendant sa dtection particulirement difficile. Les deux mthodes de dosage disponibles ce jour sont soit peu sensibles, soit pas assez spcifiques pour la toxicologie mdico-lgale. Nous avons utilis avec succs des colonnes d'immunoextraction pour le LSD associes des techniques suffisamment sensibles et spcifiques telles que la chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse (CLHP-SM) et la chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse tandem (CPG-SMSM) dont nous avons pu comparer les limites de dtection. Ces techniques ont t appliques l'analyse des poils pubiens d'un jeune homme, consommateur avr de LSD interpell en possession de 1500 buvards. Matriel et mthode : A 100 mg de phanres dcontamins puis broys extemporanment sont ajouts 5 ng de LSD-d3 (Radian) comme talon interne deutr. L'extraction de la matrice est conduite par sonication mthanolique (4 heures 50 C). L'extrait est filtr avant d'tre vapor puis repris par 5 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH6) et 300 pl d'albumine bovine (Ortho Clinical Diagnostic) pour extraction par immunoaffinit sur colonnes LSD ImmunElute (Microgenics, France). L'extrait est vapor puis repris par 15 pl de methanol

pour injection directe en CLHP-SM ou driv par 15pl de BSTFA (Rgis) 70 C pour injection de 2ul en CPG-SM-SM. Le systme de CLHP-SM est un API Sciex 165 muni de micro pompes relies une colonne Cl 8 Kromasil 150 x 1 mm, 5pm d ;p ; (Higgins Analytical) munie d'une pr-colonne. La sparation s'effectue en mode isocratique (75 % tampon formiate 5mM pH3, 25 % d'actonitrile enrichi au methanol). La dtection se fait en mode positif pour une tension d'orifice de + 40V et une tension de spray de + 5,8 kV en mode SIM m/z 327.3 (LSD-d3), 324.3 (LSD) pour la quantification et m/z 223.2 (LSD) pour la confirmation. Pour une meilleure sensibilit on utilise la CPGSM-SM constitue d'un systme HP 5890II sur colonne CP-SU-8CB (30m x 0.25 mm- Chrompack) utilisant un gradient de temprature standard. Le spectromtre de masse est un TSQ 7000 (Thermoquest) utilis en mode impact lectronique et pour une nergie de collision de -17 eV. L'acquisition se fait en mode SRM m/z 253 et 297, ions fils du m/z 398 (LSD-d3) et m/z 253 et 294, ions fils du m/z 395 (LSD). Rsultats : Nos analyses ont permis de mettre en vidence la prsence de LSD dans les poils pubiens d'un jeune homme dont la consommation dclare tait de 15 buvards par semaine un taux de 26 pg/mg par CLHP-SM confirm 29 pg/mg en CPG-SM-SM. Les limites de dtections obtenues sont trs satisfaisantes, de 4 pg/mg en CLHP-SM et de 0,5 pg/mg en CPG-SM-SM. Conclusion : La limite de dtection obtenue en CPG-SM-SM laisse prvoir la mise en vidence dans les phanres de consommations bien moindres, environ 40 50 fois infrieures celle prsente ici et aussi l'largissement de la fentre de dtection, limite quelques jours dans l'urine, quelques semaines voire plusieurs mois. Rfrences : 1- Nakahara et al. Detection of LSD and metabolite in rat hair and human hair. J. Anal. Toxicol., 1996 ; 20 : 323-329. 2- Rrich et al. Analysis of LSD in human body fluids and hair samples applying ImmunElute columns. For. Sci. Int., 2000 ; 107 : 181-190.

Intoxication aigu par le 2,4 D (acide 2,4 dichlorophnoxyactique)


M. CANAL, J.-M. GAULIER, E. LACASSIE. L. LIRON, P. M A R Q U E T , G. L A C H T R E
0 (I3)

(1) Service de Pharmacologie et Toxicologie, CHU Dupuytren, Limoges (2) Service de Ranimation, Centre Hospitalier de Villefranche sur Sane (3) Laboratoire de Toxicologie, Facult de Pharmacie, Limoges

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Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

Objectif : Nous rapportons le cas d'une intoxication aigu par ingestion volontaire d'acide 2,4 dichlorophnoxyactique ou 2,4 D Cas clinique : Une femme de 44 ans a t admise en Service de Ranimation la suite d'une tentative d'autolyse par absorption d'un flacon de 250 mL d'herbicide ("Gamme KB JARDIN") contenant du 2,4 D. Elle prsentait de graves troubles lectrolytiques et hmodynamiques qui ont ncessit l'utilisation d'amines pressives ainsi qu'une hmodialyse. Des chantillons de srum et d'urine ont t prlevs pour l'analyse toxicologique. Matriel et mthode : Les dosages urinaires et sanguins du 2,4 D ont t raliss par chromatographic en phase liquide couple la spectromtrie de masse en tandem (CLHP-ES-SMSM) avec une source d'ionisation pression atmosphrique de type turbo-ionspray (API 2000, Applied Biosystems). Aprs une simple dprotinisation (par le methanol) des chantillons biologiques (prise d'essai de 100 pL) et addition de l'talon interne (indomtacine), la sparation est ralise sur une colonne nuclosil C , 5 pm (150 x 1 mm d.i.) l'aide d'un gradient de concentration formiate d'ammonium (2,5 mM, pH 3) / actonitrile et la dtection en mode d'ionisation ngative sur la base des paramtres suivants :
18

Forensic Sci 1984 ; 29 :1237-41. 3- Prescott LF, Park J, Darrien I, Treatment of severe 2,4-D and mecoprop intoxication with alkaline diuresis. Br J Clin Pharmacol 1979 ; 7 : 111-6.

tude cas-tmoins inclusion prospective de l'usage de cannabis chez des conducteurs impliqus dans un accident corporel de la circulation routire. Rsultats prliminaires obtenus chez 420 conducteurs et 381 sujets tmoins
P. MURA . P. KINTZ , J.M. GAULIER >, F. VINCENT ', J.P. GOULLE , M . MOULSMA< , F. MAIROT *, S. MARTIN-DUPONT ', A. CADOUR , J. NOUVEAU, S. TILHET-COARTET , O. POURRAT
4 (5) 6) 2 3 (4) 6) (1) (2) (3

(1) Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers ; (2) Institut de Mdecine Lgale de Strasbourg ; (3) Centre Hospitalier Universitaire de Limoges ; (4) Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble ; (5) Centre Hospitalier du Havre ; (6) Centre Hospitalier Universitaire de Lyon Objectif: La prsence de delta-9 tetrahydrocannabinol, metabolite psychoactif principal du cannabis, est frquemment mentionne dans les rapports d'analyses toxicologiques effectues chez des conducteurs impliqus dans un accident de la circulation routire (1). Cependant, une analyse fine de la littrature internationale montre qu ' ce jour, les rsultats des tudes pidmiologiques ne permettent pas de prciser la part de responsabilit du cannabis dans la survenue des accidents car trop parcellaires et/ou ralises sur l'urine et/ou par des mthodes non spcifiques et surtout sans comparaison avec une population tmoin. L'objet de la prsente tude est de dterminer la frquence de l'usage de cannabis chez les conducteurs impliqus dans un accident corporel, en analysant le sang des conducteurs et des tmoins par CPG-SM et en tenant compte du sexe, de l'ge et de l'association ventuelle d'autres produits psychoactifs. Matriel et mthodes : L'tude a t mene paralllement Grenoble, Le Havre, Limoges, Lyon, Poitiers et Strasbourg. A ce jour, ont t inclus 420 conducteurs impliqus dans un accident corporel, l'exclusion de ceux qui avaient reu une administration de produits psychotropes dans le cadre de la prise en charge thrapeutique. Les 381 tmoins recruts ce jour taient constitus de patients admis aux urgences hospitalires pour un motif autre qu'un accident de la voie publique. Les cannabinodes taient recherchs et doss dans le sang par CPG-SM, selon la procdure recommande par la SFTA (2). Les

Dtection slective par Multiple Reaction Monitoring Temps de rtention Temps de Paire d'ions de Paire d'ions d e (min) rtention relatif quantification confirmation (urna) (urna)
4,0! 5.35 75 1 219.1/161 356/312,2 211.1/162,8 -

2.4 D

Indomtacine

La limite de quantification est de 0,1 m g / L et la linarit a t vrifie j u s q u ' 200 m g / L (dans le srum et l ' u r i n e ) .

RESULTATS : J u des Prlvements or


il J4 ill

Concentration d 2,4 D (mg/L) e Sr m u Urine


156 66 20 0^7 31 7 22 0,7

JI9

Conclusion : Les rares cas d'intoxications mortelles par le 2,4 D dcrits ont permis de dterminer par CLHP/UV-BD des concentrations plasmatiques de 750 mg/L (1), sanguines de 389 mg/L (1) et urinaires de 670 mg/L (2) ; dans un cas d'intoxication svre, la concentration plasmatique mesure tait de 400 mg/L (3). La mthode CLHP-ES-SM-SM prsente s'est avre simple, trs efficace pour le diagnostic toxicologique et surtout pour le suivi de cette intoxication par un produit dont l'limination tait longue et en particulier pour une faible concentration urinaire. Rfrences : 1- Keller T, Skopp G, Wu M, Aderjan R, Fatal overdose of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Forensic Sci Int 1994 ; 65 : 13-8. 2- Fraser AD, Isner AF, Perry RA, Toxicologie studies in a fatal overdose of2,4-D, mecoprop, and dicamba. J

137

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

produits associs taient recherchs et doss par CPG (alcool) et CLHP-BD (autres substances). Rsultats : Une analyse globale des rsultats (tous sexes et ges confondus) montre que la prsence d'au moins un cannabinode (THC et/ou THC-COOH) tait retrouve chez 47 conducteurs ( 11,2 %) et chez 41 tmoins (10,8 %). En ne considrant que les cas dans lesquels du THC tait prsent ( > 1 ng/ml de sang), le nombre de conducteurs positifs tait alors de 29 soit 6,9 % et de 22 pour les tmoins soit 5,8 %. La prise en compte de l'ge des sujets a conduit des rsultats trs significatifs pour certaines tranches d'ge. En effet, dans la tranche 18 20 ans (n = 80), du THC tait retrouv chez 18,6 % des conducteurs et chez 8,1 % des tmoins. Cette forte prvalence chez les conducteurs tait observe pour toutes les tranches d'ge infrieures 27 ans (15,9 23 %) avec une diffrence significative par rapport aux tmoins (5,9 14,8 %). Parmi les conducteurs positifs au THC, celui-ci tait seul prsent chez 49 % d'entre-eux. Les plus fortes prevalences d'usage taient observes Strasbourg, puis par ordre dcroissant Grenoble, Poitiers, Limoges, Le Havre et Lyon. Conclusion : Ces rsultats prliminaires confirment une forte prvalence de l'usage de cannabis en particulier chez les moins de 30 ans, et indiquent que la prsence de son principe actif dans le sang constitue un facteur de risque d'accidents de la circulation, cela tant particulirement significatif chez les jeunes conducteurs. Rfrences : 1- Mura P., Ppin G., Marquet P., et coll. Place des stupfiants dans les accidents mortels et corporels de la voie publique. Rsultats de 169 analyses sanguines ralises en 1998 et 1999 la demande d'une autorit judiciaire. Toxicorama 1999 ; 11 : 225-31. 2- Kintz P., Cirimele V, Ppin G., et coll. Identification et dosage des cannabinodes dans le sang total. Toxicorama 1996 ; 8 : 29-33.

Dpistage des drogues au bord de la route. Les rsultats de l'tude Europenne ROSITA
A.VERSTRAETE Laboratoire de Biologie Clinique Hpital Universitaire, Gent, Belgique Toxicologie,

tre utiliss au bord de la route. Matriel et mthode : Dans le cadre du projet Rosita (1), 2968 sujets ont t tests dans 8 pays, dont 6 pays (Allemagne, Belgique, Espagne, Finlande, Italie et Norvge) o les tests ont t effectus au bord de la route et/ou au poste de police. Des immunoessais rapides ont t utiliss pour la dtection des drogues dans les urines, la salive et/ou la sueur. Les analyses de confirmation dans les urines, le sang, la salive ou la sueur ont t effectues en laboratoire. Rsultats : Les policiers n'ont pas eu d'objections majeures prlever les chantillons. Dans une majorit des pays, la salive est l'chantillon prfr. Les tests rapides de dpistage de drogues ont t trs apprcis par les policiers, qui ont parfois montr une grande crativit pour rsoudre les problmes pratiques rencontrs. Les tests rapides augmentent la confiance du policier, qui sera plus vite enclin commencer une procdure, et pargnent du temps et de l'argent. Un prlvement urinaire ne pose pas de problmes si l'infrastructure ncessaire (camion sanitaire) est prsente, mais est beaucoup plus difficile si ce n 'est pas le cas. Certains tests urinaires (Rapid Drug Screen, SYVA Rapidtest, Dipro Drugscreen 5, Triage) ont donn de bons rsultats (exactitude >95 % en comparaison avec les mthodes de rfrence), mais aucun test n'a donn de bon rsultat pour tous les paramtres. Pour la dtection des amphtamines (y compris le MDMA), la combinaison d'un test amphtamine et mthamphtamine donne souvent d'excellents rsultats. La salive et la sueur sont des chantillons prometteurs, qui donnent parfois de meilleurs rsultats que l'urine quand l'analyse est faite par CG-SM. La prise d'un chantillon de salive ou de sueur est mieux accepte par les automobilistes. Les tests rapides qui sont disponibles maintenant (Drugwipe, Cozart Rapiscan et Avitar Oralscreen) ne sont pas encore assez fiables (exactitude entre 50 et 81 % en comparaison avec le sang). De plus il reste encore beaucoup de progrs faire pour l'chantillonnage, la dure d'excution des tests, le volume de salive ncessaire et la fiabilit. Pour le cannabis et les benzodiazepines, les tests actuels ne sont pas assez sensibles. De nouveaux prototypes de tests rapides pour la dtection de drogues dans la salive sont annoncs, et de nouvelles tudes seront ncessaires pour leur valuation. Conclusion : Les test rapides de dpistage de drogues sont trs utiles. Dans l'avenir, l'usage de la salive semble le plus prometteur, mais les tests actuels ne sont pas encore satisfaisants. En attendant, les tests urinaires peuvent tre une solution acceptable. Rfrence : 1- Verstraete A, Puddu M. Evaluation of different roadside drug tests. Rosita consortium, Gent, Belgium. Peut tre tlcharg de www.rosita.org

Objectif : Selon les experts, une meilleure application de la lgislation drogues et scurit routire peut tre obtenue par une meilleure formation des officiers de police et par l'utilisation de tests permettant de dpister sur place, c'est--dire au bord de la route, la prsence de drogues dans les liquides biologiques des conducteurs. Le projet Rosita avait pour objectif de dterminer s'il existe des tests fiables de dtection de drogues, pouvant 138

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XITI, n 2, 2001

Identification de kavalactones dans le sang, la salive et l'urine par CLHP / BD, approche cintique et application la toxicologie clinique et mdico-lgale
Y. BARGUIL \ A. MANDEAU . J. COLLIGNON , K. BEATA , D. D U H E T
(,) 2) (1 (I) (1)

(1) Laboratoire de Biochimie, Centre Hospitalier de Nouvelle-Caldonie, Av. Paul Doumer - BP J5 - 98849 Nouma Nouvelle - Caldonie (2) IRD, laboratoire des substances naturelles terrestres, Promenade Roger Laroque BP A5 98848 Nouma Cedex Nouvelle - Caldonie Objectifs : Le kava est une boisson traditionnelle du Pacifique prpare partir de la racine du Piper methysticum Forst. Les principes actifs sont des a-pyrones : kavalactones (KL) aux activits psychotropes. Des cas de surdosages sont observs dans le Pacifique (bar kava) et en Europe (spcialits pharmaceutiques), entranant une symptomatologie diverse : troubles neurologiques, hpatiques et cutans. Nous avons mis au point une mthode rapide et spcifique de dtection des KL et de leurs metabolites par CLHP / BD dans diffrentes matrices biologiques : sang total, urine, sueur et salive. Matriel et Mthodes : Aprs extraction sur Toxitube A et B (ANSYS Diagnostics, Inc., CA), les KL et certains metabolites (KL dmthyles ou rduites, en cours d'identification) sont chromatographies sur une colonne Symetry C8 (5 pm, 4.6 x 250 mm Waters, actonitrile / tampon phosphate pH 3.6 en gradient de concentration) coupl un dtecteur barrette de diodes (M996). - Un extrait total thanolique de la boisson a t inject afin de pouvoir reconnatre les spectres et. les temps de rtention des diffrentes KL. - Chez huit volontaires ayant absorb du kava, sang, sueur, salive et urines ont t prlevs diffrents temps. Rsultats : Les longueurs maximales d'absorption (kmax) et les temps de rtention (tr) des KL (ou de leurs metabolites) dans les diffrentes matrices biologiques diffrents temps sont prsents dans le tableau ci-dessous :
Extrait tot. Y* DHK* K* THY* DHM* M* 19.95 19.32 19.07 18.79 18.45 18.30 tr et fentre de dtection Xmax Sang Salive Urine (15 60 min) (30 60 min) (l 36 h) 19.56 20.03 12.41 (m*) 217,261,356 19.31 19.80 11.76 (m*), 19.17 235 19.04 19.55 11.59 (m*), 18.91 202,245 18.75 226,274 18.40 18.96 18.22 234,284 18.26 18.82 206,226,265,305

Sueur : KL non dtectes, leur lipophilic n'tant pas favorable au transfert passif depuis le plasma. Conclusion : Notre mthode d'identification de KL et de ses metabolites par CLHP / BD est suffisamment rapide (traitement d'un chantillon en moins d'une heure) pour tre utilise en toxicologie clinique d'urgence. Elle est non invasive (urine et salive) et permet de distinguer une consommation rcente (salive et sang) d'une consommation plus lointaine (urines).

Comparaison de cinq immunoessais pour la dtection des amphtamines


A .VERS TR AETE . P. PEZZATI , E. VAN VELDE
(,) ( (2)

DE

(1) Laboratoire de Biologie Clinique - Toxicologie, Hpital Universitaire, Gent, Belgique et (2) Ospedale Santa Maria Nuova, Florence, Italie Objectif : La dtection des amphtaminiques de type ecstasy (XTC) par immunoessai est souvent problmatique (1,2). Pourtant, en Europe, l'XTC est une des drogues les plus populaires, et rcemment, l'intrt pour la dtection de ce type de molcules s'est accru aux EtatsUnis. Rcemment, un nouveau coffret CEDIA, qui serait beaucoup plus sensible pour le MDMA, est apparu, et nous l'avons compar quatre autres immunoessais. Matriel et mthode : Les immunoessais utiliss taient la polarisation de fluorescence (FPIA) sur ADx ou AxSYM, l'ancienne et la nouvelle version du "Cloned Enzyme Donor Immunoassay" (CEDIA, (respectivement CEDIA A et CEDIA N), l'EMIT II monoclonal amphtamine /mthamphtamine, et le "Kinetic Interaction of Microparticles in Solution" (KIMS) sur Cobas Integra. Les tests CEDIA et EMIT ont t adapts sur un Hitachi 917. La confirmation a t faite par CG/SM, aprs extraction en phase solide et drivation par HFBA, avec des talons internes deutrs. La comparaison a t effectue sur 217 chantillons urinaires, dont 94 taient positifs (c.--d. qu'ils contenaient plus de 200 ng/mL d'une amphtaminique) : 34 contenant seulement de l'amphtamine, 47 du MDMA, du MDEA et/ou du MDA et 13 contenant de l'amphtamine et une ou plusieurs des molcules suivantes : MDMA, MDEA ou MDA. Rsultats : La sensibilit et la spcificit un seuil de dpistage de 300 ng/mL, l'aire sous la courbe (AUC) ROC (pour la dtection de l'amphtamine ou de l'XTC) et le seuil optimal calcul sur base de la courbe ROC sont donns dans le tableau ci-dessous.

DHK = K = Kavane, m = metabolite, Dhydrokavane, Y = Yangonine, DHM = Dihydromthysticine, THY = Tetrahydroyangonine, M = Mthysticine

139

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

Test CEDIA A CEDA N EMIT FPIA KIMS

Sensibilit 75 % 98% 89% 90% 91 %

Spcificit 80% 67% 85% 98% 65%

AUC ROC Seuil 'optimal' (ng/mL) 0.880 359 0.959 538 0.924 275 0.970 330 0.907 520

Conclusion : La nouvelle formulation CEDIA amliore sensiblement la dtection du MDMA et du MDEA, mais la spcificit n'est pas trs bonne. Les meilleurs rsultats sont obtenus avec FPIA, qui a une excellente spcificit. Un seuil de positivit plus lev amliore la spcificit, sans trop diminuer la sensibilit. Rfrences : 1 - Verstraete A, Van haute I. Spcificit des immunoessais pour la dtection des amphtamines. Toxicorama 1997 ; 9 : 65-71. 2- Ensslin HK, Kovar KA, Maurer HH. Toxicological detection of designer drug 3,4-methylenedioxy-ethylamphetamine and its metabolites in urine by GC-MS and FPIA. J. Chromatogr B Biomed Appl 1996 ; 683 : 189-97.

Evolution des intoxications par benzodiazepines chez les patients toxicomanes de 1987 2000
C. T O U R N O U D , B . LATRECH, E. KRENCKER, N. I H A D A D E N E , F. FLESCH. P. SAUDER, A. JAEGER Centre Antipoison - Hpitaux Universitaires Strasbourg - 67091 Strasbourg Cedex. de

(34 %). Dans 75% des cas, l'intoxication par benzodiazepines est associe la prise de drogues. Parmi celles-ci, c'est l'hrone qui est en l position (45 % des cas) jusqu'en 1996. A partir de 1997 dans 44 % des intoxications (1), cette molcule a t supplante par le Subutex. Dans 35 % des cas, on note une prise concomitante d'alcool. 66 % des patients prsentaient un coma Glasgow >10, 6 % un coma Glasgow < 5. Un myosis tait prsent dans 35 % des cas, une bradypne dans 22 % . Les complications ont t rares : 40 rhabdomyolyses, 10 infections pulmonaires. Aucun dcs n'a t not dans cette srie. 5 % des patients ont t intubs. La naloxone a t utilise dans 12,5 % des cas, leflumaznil dans 8,5 % des cas. Les dosages toxicologiques dans le sang et les urines ont t raliss dans 28 % des cas. Conclusion : Le Rohypnol et le Tranxne restent les molcules les plus utilises par les patients toxicomanes. La mise sur le march du Subutex a totalement modifi les habitudes toxicomaniaques. Les dosages permettent d'tayer le diagnostic mais sont peu souvent raliss. Dans la grande majorit des cas, ces intoxications sont peu graves, mais il convient de rester vigilant devant l'arrive de nouvelles molcules (ecstasy, GHB...) Rfrences 1- Tracqui A., Tournoud C, Kopferschmitt J. et al. Intoxications aigus par traitement substitutif base de buprnorphine haut dosage. Presse Mdicale 1998 ; 27: 557-61.
re

Objectif : Analyser sur 14 ans l'volution des intoxications par benzodiazepines dans une population de patients toxicomanes. Matriel et mthode : Il s'agit d'une analyse rtrospective de 1987 octobre 2000 portant sur 445 cas d'intoxications par benzodiazepines chez des patients toxicomanes hospitaliss dans un service de ranimation et d'urgences mdicales. Diffrents critres ont t tudis : benzodiazepines ingres, associations avec prise de drogues, volution dans le temps du type de molcules utilises. ... Ceci a pu tre ralis grce l'utilisation d'un logiciel SIMA (systme d'information mdico-administratif) permettant la saisie des donnes et l'interrogation multicritres. Rsultats : Parmi 7506 patients hospitaliss de 1987 octobre 2000 pour intoxication mdicamenteuse volontaire par benzodiazepines, 445 sont toxicomanes. La catgorie d'ge la plus reprsente est celle des 20-30 ans (66 %). Sur cet intervalle d'tude et parmi les benzodiazepines ingres, c'est le flunitrazpam qui reste dominant (50 %) suivi par le clorazpate dipotassique 140

Comparaison des effets lectroencphalographiques induits par le midazolam ou par le propofol doses faiblement sdatives chez des volontaires sains
P. HANTSON. N. VAN B R A N D T , R. VERBEECK , M. de TOURTCHANINOFF ', J.M. GUERIT ', P. MAHIEU .
(2) 3 3 (,) (2)

(1) Dpartement des soins intensifs, (2) Laboratoire de pharmacocintique, (3) Laboratoire d'explorations neurophysiologiques, Cliniques St-Luc, Universit catholique de Louvain, Bruxelles Objectif : Le midazolam et le propofol sont frquemment utiliss aux soins intensifs pour leurs proprits anxiolytiques ou sdatives selon les doses utilises. Le but de ce travail est de comparer les effets lectroencphalographiques (EEG) de faibles doses de midazolam ou de propofol chez des volontaires sains et d'tudier la rversibilit ventuelle de ces effets par l'administration d'un antagoniste des benzodiazepines, leflumaznil.

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XUI, n 2, 2001

Materiel et mthodes : Huit volontaires sains ont t recruts (7 hommes, 1 femme, ge moyen 29 ans). Chaque volontaire particip deux sections distinctes ( 1 midazolam, 1 propofol) ralises 1 semaine d'intervalle. Les volontaires sont installs dans une pice l'abri du bruit et de lumire vive. Un enregistrement basai de l'EEG est ralis pendant 15 min. L'EEG est analys par le systme Quick Brain de Micromed qui va raliser une analyse transforme de Fourrier (FFT). Les bandes classiques delta, thta, alpha et bta sont analyses en terme de puissance absolue, puissance relative, Spectral Edge 95 et frquence mdiane. Le midazolam est administr en bolus de 0,05 mg/kg suivi d'une perfusion continue pendant 45 min la vitesse de 0,5 mg/kg/h. Pour le propofol, ces doses sont respectivement de 0,5 mg/kg pour le bolus, et ensuite une perfusion continue de 45 min la vitesse de 1 mg/kg/h. Des prlvements sanguins de midazolam et de propofol permettent de vrifier l'atteinte d'un tat d'quilibre plasmatique pour les 2 substances. Leflumaznil (0,25 mg) est administr au temps 30 min et 45 min. Rsultats : Il n'y a pas de diffrence significative entre les 2 mdicaments quant leur action sur la disparition de la bande alpha de l'EEG. Par contre, le pourcentage de restauration de l'activit alpha initiale aprs injection de flumaznil est plus important dans le groupe midazolam que dans le groupe propofol. Les deux mdicaments provoquent le mme profil EEG d'apparition d'ondes bta rapides correspondant l'effet clinique anxiolytique et sdatif. Le rythme bta rapide n 'est pas influenc par l'administration de flumaznil dans le groupe propofol. Conclusion : Il semble que tant le midazolam que le propofol produisent des modifications EEG compatibles avec une activation du rcepteur l'acide gamma-aminobutyrique (GABA).' Le site d'action du propofol n'est pas influenc par le flumaznil et est distinct du site d'action des benzodiazepines. Rfrence : 1 - Peduto VA, Concas A, Santoro G, Biggio G, Gessa GL. Biochemical and electrophysiologic evidence that propofol enhances GABAergic transmission in the rat brain. Anesthesiology 1991 ; 75 : 1000-1009.

Objectif: Les mdicaments sdatifs ou analgsiques couramment utiliss chez les patients de soins intensifs sont en grande partie lis aux protines plasmatiques. C'est ainsi que le midazolam est li 97-98 % l'albumine srique, alors que le sufentanil est li pour 92-93 % l'alpha-1 glycoprotine acide. Or, d'un point de vue pharmacologique, seule la fraction libre de la substance est active sur le systme nerveux central. Des modifications de la liaison protique peuvent donc avoir des consquences sur les effets observs, principalement pour les mdicaments possdant un coefficient d'extraction hpatique lev, en raison d'une augmentation des concentrations libres des substances. L'objectif de ce travail tait d'valuer les variations de la fraction libre du midazolam (et du sufentanil) dans leurs conditions relles d'utilisation chez des patients critiques prsentant des dysfonctions organiques. Matriel et mthodes : Quarante-deux patients sjournant en soins intensifs ont t inclus dans l'tude et rpartis en diffrents groupes : 9 patients contrles ne prsentant pas de dysfunction organique, 9 patients en insuffisance cardiaque, 9 patients en insuffisance hpatique, 9 patients en insuffisance rnale et 6 patients sous assistance respiratoire extra-corporelle (ECMO). Les dysfonctions d'organes taient dfinies selon les scores de svrit classiquement admis (APACHE II, GORIS). Tous les patients ont t traits par administration continue de midazolam et de sufentanil. En raison de l'importance des pathologies sous-jacentes, toutes les autres administrations mdicamenteuses (antibiotiques...) taient autorises. Des chantillons sanguins ont t prlevs quotidiennement pendant la dure d'administration du midazolam et du sufentanil et le plasma a t congel 30 C jusqu'au moment de la dtermination de la fraction libre du midazolam et de sufentanil par dialyse l'quilibre. Le midazolam a t analys par chromatographic H PLC, l'extraction tant ralise avec du tolune. Les concentrations sont exprimes en ng/ml. La dialyse l'quilibre est ralise en utilisant le systme Dianorm compos de deux cellules de teflon spares par une membrane de dialyse (cut-off : 1200014000). La fraction libre est dfinie comme le rapport de la concentration libre et de la concentration totale du mdicament dans le plasma et est exprime en %. Rsultats : Tous les groupes tudis ont montr une grande variabilit inter-patient pour le midazolam et pour le sufentanil. La valeur mdiane de la fraction libre du midazolam exprime en % dans les diffrents groupes est la suivante : groupe contrle 4 % (2-11%), groupe cardiaque 6,7 % (3-13 %), groupe hpatique 5,3 % (2.521 %), groupe rnal 4,8 % (3.5-11 %), groupe assistance respiratoire 4 % (2-14 %). Il existe une corrlation statistiquement significative entre la fraction libre de midazolam et la concentration d'albumine srique. Des corrlations peuvent tre galement dcrites avec 141

Dtermination de la fraction libre du midazolam chez des patients prsentant des dysfonctions organiques
P. H A N T S O N . N . VAN B R A N D T , R. BEECK , P. MAHLEU
(2) (I) (1) (2)

VER-

(1) Dpartement des soins intensifs, (2) Laboratoire de pharmacocintique, Cliniques StLuc, Universit catholique de Louvain, Bruxelles

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

la creatinine srique, l'ure sanguine et le temps de prothrombine. Conclusion : La fraction libre du midazolam (et aussi du sufentanil) peut subir d'importantes variations dans les conditions d'utilisation relle et de polythrapie chez les patients hospitaliss aux soins intensifs. La question d'une adaptation des doses thrapeutiques ne devrait cependant se poser que pour des mdicaments haut coefficient d'extraction hpatique (sufentanil par exemple). Rfrence : 1- Van Brandt N., Hantson Ph. Pharmacokinetics and Drug-Protein Binding. In : Yearbook of Intensive Care and Emergency Medicine 1996, JL Vincent (Ed), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg : 761-770.

midazolam reste prdictible mme aprs plus de 1000 heures de perfusion. Conclusion : Ces donnes confirment la rduction de la CL du midazolam chez des patients prsentant une dysfonction hpatique. Rfrence : 1- Oldenhof H, de Jong M, Steenhoek A, Janknegt R. Clinical pharmacokinetics of midazolam in intensive care patients, a wide interpatient variability ? Clin Pharmacol Ther 1988 ; 43 : 263-269.

Application de la pharmacocintique de population au midazolam en administration intraveineuse prolonge chez des patients de soins intensifs
P. HANTSON >. N . VAN B R A N D T , R. BEECK< \ P. MAHIEU >
2 (, (l (2)

Dtermination des benzodiazepines dans les fluides biologiques par chromatographic liquide haute performance (CLHP) et par technique de commutation de colonnes
A. El MAHJOUB. Ch. STAUB Institut Universitaire de Mdecine Lgale, Hpitaux Universitaires de Genve, Suisse Objectif : Afin de faciliter le dosage en routine des benzodiazepines dans les fluides biologiques, une mthode CLHP rapide, simple et automatise a t dveloppe et valide. Matriel et mthode : Une mthode automatise couplant la chromatographic liquide haute performance quipe d'un dtecteur barrette de diodes et la technique de commutation de colonnes (colonne switching), a t applique au dosage de cette famille mdicamenteuse dans le plasma (ou le srum) (1) ainsi que dans le sang complet (2). La procdure complte a ensuite t valide et son exactitude a t vrifie par le dosage d'un srum certifi. Le plasma, aprs centrifugation, est directement inject dans le systme chromatographique. Les benzodiazepines sont d'abord extraites au moyen de la colonne preparative (BioTrap 500 MS), puis spares sur la colonne analytique (LiChrospher Select B C ). Le sang, par contre, ncessite une tape supplmentaire afin d'liminer les globules rouges ou d'autres substances endognes pouvant perturber le systme. Cette tape consiste prcipiter les substances endognes gnantes avec 2 ml d'un mlange methanol-actonitrile (1/1). Rsultats : La mthode a t dveloppe selon un mode univari (variation d'un seul paramtre la fois) pour cinq benzodiazepines frquemment prescrites en Suisse : le clonazepam (Rivotril), le diazepam (Valium), le flunitrazpam (Rohypnol), le midazolam (Dormicum) et I'oxazepam (Sresta). La procdure a ensuite t valide dans les conditions optimales obtenues. Les coefficients de rgression pour la linarit sont suprieurs 0,997, tandis que les rendements d'extraction sont autour de 98 % dans le
8

VER-

(1) Dpartement des soins intensifs, (2) Laboratoire de pharmacocintique, Cliniques StLuc, Universit catholique de Louvain, Bruxelles Objectif : L'objectif de ce travail est d'tudier par une approche de population le comportement pharmacocintique du midazolam administr en perfusion continue prolonge chez des patients de soins intensifs prsentant des pathologies diverses( 1 ) . Matriel et mthodes : Trente-sept patients hospitaliss aux soins intensifs sont rpartis selon la pathologie prsente (cardiaque, respiratoire, hpatique, rnale). Les patients traumatiss mais sans dysfonction d'organes servent de groupe contrle. Le midazolam leur est administr en perfusion continue pendant une dure minimale de 48 h. Au total 747 chantillons sanguins de midazolam sont analysables (de 2 36 chantillons par patient). Le modle de distribution 1 compartiment a t retenu. Les paramtres de clairance (CL) et de volume de distribution (Vd) ont t dtermins par rgression non linaire en utilisant le logiciel de pharmacocintique de population dvelopp par PPHARM. Rsultats : La population dans son ensemble prsente une CL moyenne de 25,22 Uh, soit 420 ml/min et un Vd de 273,38 litres. L'analyse statistique AN OVA montre que le groupe des insuffisants hpatiques est significativement diffrent des autres avec une CL totale moyenne de 132 ml/min. Aucune diffrence significative n'est retrouve pour le Vd. Par contre, le temps de demi-vie (tin) est significativement prolong chez les insuffisants hpatiques. Individuellement, la pharmacocintique du 142

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XTII, n 2, 2001

srum (ou le plasma) et autour de 85 % dans le sang complet, pour les cinq substances cites. Les coefficients de variation (CV %) obtenus pour la rptabilit sont infrieurs 5 % pour les deux matrices. Enfin les limites de quantification obtenues permettent de dterminer des teneurs toxiques pour le flunitrazpam (LOQ = 50 ng/ml) et des teneurs thrapeutiques pour les quatre autres benzodiazepines (LOQ = 30-80 ng/ml). Conclusion : La mthode prsente permet la prparation de l'chantillon biologique ainsi que l'analyse chromatographique en moins de 30 minutes. Parmi les nombreux avantages de la technique de commutation de colonnes nous pouvons mentionner : l'analyse d'une grande srie d'chantillons, une consommation rduite de solvant, un gain de temps et enfin un risque diminu de contamination avec des chantillons biologiques infectieux. Rfrences : 1- EL Mahjoub A., Staub Ch., High-performance liquid chromatographie method for the determination of benzodiazepines in plasma or serum using the columnswitching technique. J. Chromatogr.B. 2000 ; 742 : 381-390. 2- EL Mahjoub A., Staub Ch., Semi-automated highperformance liquid chromatographic method for the determination of benzodiazepines in whole blood. J. Anal. Toxicol. 2001 in press.

valuation d'une nouvelle trousse immunologique utilise dans le dpistage des benzodiazepines en toxicologie d'urgence
C. D E B B A S C H , FLOUVAT B. DELHOTAL-LANDES. B.

Laboratoire de Toxicologie et de Pharmacocintique, Hpital Ambroise Par 9, avenue Charles de Gaulle 92100 - Boulogne-Billancourt, France Objectifs : Les benzodiazepines sont des mdicaments trs prescrits dont la recherche toxicologique d'urgence peut tre ralise l'aide d'une mthode immunoenzymologique en technique EMIT. L'tude que nous avons conduite sur 93 chantillons plasmatiques de patients admis aux urgences de notre hpital a pour objectif d'adapter la recherche de benzodiazepines dans le plasma un nouveau kit urinaire (EMIT Il Plus benzodiazepines, Dade Behring) dont l'anticorps est un anticorps polyclonal de mouton anti-diazpam, kit dj valid sur les urines aux Etats-Unis. Matriel et mthodes : Les rsultats plasmatiques obtenus chez les patients avec le kit EMIT II Plus benzodiazepines EMIT II Plus benzodiazepines ont t compars ceux obtenus

avec la trousse de rfrence (EMIT DAU benzodiazepines) sur un automate COBAS-MIRA Plus (Roche Diagnostic) et en effectuant une identification des benzodiazepines par technique HPLC en cas de discordance dans les rsultats (1, 2). Ce kit EMIT II Plus benzodiazepines permet une dtection quantitative ou semi-quantitative des benzodiazepines avec un cut-off 200 ou 300 ng/ml. Dans un premier temps, nous avons tudi la stabilit de ce nouveau kit liquide, prt l'emploi, en passant une gamme de calibration allant de 0 1000 ng/ml de lormtazpam. Les 5 points de calibration ont t doss tous les jours pendant 15 jours, puis 1 jour sur 2 les 15 jours suivants. La rptabilit intrasrielle a t value sur 2 plasmas de patients, l'un en dessous du cut-off de 200 ng/ml, l'autre au-dessus. Enfin, un certain nombre de surcharges plasmatiques de benzodiazepines ont t utilises afin d'tudier si les ractions croises donnes pour l'urine taient valables pour du plasma. Rsultats : A l'issu de cette valuation, ce kit EMIT II Plus benzodiazepines, facile l'emploi, prsente en mode qualitatif une grande fiabilit en tant que rptabilit ( CV <6%) et reproductibilit et une stabilit d'au moins 1 mois. Par contre, l'expression des rsultats, en mthode quantitative, prsente une moins bonne fiabilit et stabilit. L'utilisation de ce mode quantitatif ne semble pas approprie. La comparaison des rsultats de recherche qualitative par les 2 kits EMIT II Plus et EMIT DAU montre une bonne corrlation. Des discordances de rsultats n'ont t observes que chez 2 patients. Par technique CLHP, le loprazolam a t identifi dans un des plasmas discordant. De plus une bonne corrlation entre les ractions croises, mesures dans une matrice urinaire et dans une matrice plasmatique ont t observes avec le kit EMIT II Plus, justifiant la possibilit d'utiliser le kit EMIT II Plus benzodiazepines sur une matrice sanguine. Rfrences : 1- Zorza G., Brun-Ney D., DelhotalL-Landes B., Flouvat B. Evaluation d'une nouvelle trousse immunologique utilise dans le dpistage toxicologique des benzodiazepines en mdecine d'urgence hospitalire. Ann. Biol. Clin., 1994 ; 52 : 347-353. 2- ErnoufD., Boussa N., Recherche srique des benzodiazepines par mthode immunoenzymatique en toxicologie d'urgence : aide l'interprtation. Ann. Biol. Clin., 1998 ; 56 : 65-71.

Apport du laboratoire de toxicologie dans le suivi des patients sous hrone mdicale
Ch. STAUB Institut Universitaire de Mdecine Lgale, Hpitaux Universitaires de Genve, Suisse 143

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

Objectif : L'actylcodine (ACOD), une impuret constante de la fabrication d'hrone non pharmaceutique, a t propose comme marqueur biologique de consommation d'hrone illgale. Rcemment, notre groupe a dvelopp et valid une technique de chromatographic gazeuse spectromtrie de masse (CG/SM), permettant la dtection de la 6monoactylmorphine (MAM), de l'ACOD et des autres opiacs dans l'urine (1) et les cheveux (2). Suite ce dveloppement, notre laboratoire s'est vu charg de contrler la consommation parallle (hrone illgale ou autres substances action psychotrope) des 24 patients d'un centre de prescription d'hrone mdicale pendant une priode de six mois. Nous nous proposons de prsenter les rsultats de ce travail et la lumire de ces derniers, de discuter l'applicabilit des deux mthodes (urine et cheveux) de dtection de l'ACOD dans le contexte d'un centre de prescription d'hrone mdicale. Matriel et mthode : Des chantillons d'urines et de cheveux ont t collects respectivement, chaque mois (7 fois 24 = 168 prlvements d'urines) et tous les trois mois (3 fois 24 = 72 chantillons de cheveux). Des tests immunologiques ont t pratiqus sur tous les chantillons d'urines et la recherche d'ACOD et des autres opiacs a t effectue, la fois, sur les chantillons d'urines et de cheveux. Rsultats : Sur la base des analyses d'urines, 50 % des patients sont des consommateurs rguliers (un consommateur est considr rgulier s'il prsente entre 4 et 7 rsultats positifs sur les six mois d'observation) de cannabis, 45,8 % des patients sont des consommateurs rguliers de benzodiazepines et enfin 29,2 % des patients sont des consommateurs rguliers de methadone. La recherche de l'ACOD sur les urines a montr que 3 patients sur 24 avaient consomm de l'hrone provenant de la rue. Par contre, la mme recherche sur les cheveux a montr que six patients (dont les trois patients rvls par l'analyse des urines) taient des consommateurs rguliers d'hrone illgale. Conclusion : Cette tude dmontre, si ncessaire, le rle primordial tenu par le laboratoire de toxicologie dans le contrle et le suivi des patients sous hrone mdicale. En terme de consommation parallle, le cannabis et les benzodiazepines restent les substances les plus consommes. Enfin en ce qui concerne la dtection d'une consommation d'hrone illgale, la mthode sur les cheveux se rvle, sans conteste, plus sensible que la mthode sur les urines. Rfrences : 1- Staub Ch., Marset M., Mino A., Mangin P.. Detection of acetylcodeine in urine as indicator of illicit heroin use ; method validation and results of a pilot study. Clin. Chem., (2001) in press. 2- Girod Ch. Staub Ch., Acetylcodeine as a marker of 144

illicit heroin in human hair : method validation and results of a pilot study. J. Anal. Toxicol, (2001) in press.

Rapports de distribution des concentrations plasma/sang complet ou srum/sang complet pour le THC, le 11OH-THC et le THCCOOH pour des individus vivants ou dcds
C. GIROUD . A. MENETREY , M. AUGSBURGER , T. BUCLIN \ P. SANCHEZ-MAZAS , P. MANGIN >
(1) (2 (3) 0 (1) (I)

(1) Laboratoire de toxicologie analytique, Institut de Mdecine Lgale, Lausanne (2) Division de pharmacologie clinique, CHUV, Lausanne (3) Centre de toxicodpendance Lausanne, Switzerland de St Martin,

Objectif : L'usage rcratif et l'abus de cannabis sont en progression constante en Suisse (1). Les cannabinodes sont dtects seuls ou en combinaison avec d'autres drogues dans les chantillons de sang prlevs chez des conducteurs souponns de conduite sous l'influence de produits psychotropes (2). De plus, le THC et ses metabolites sont frquemment mis en vidence dans le sang d'individus impliqus dans des vnements ayant des suites mdico-lgales comme les agressions et les meurtres. Pour valuer l'influence que la prise de cannabis a pu avoir sur le comportement et les performances, il est en gnral ncessaire d'estimer le laps de temps coul entre l'vnement juridiquement significatif et le moment de la prise de sang. Pour ce faire, le groupe de Huestis (3) a propos 2 modles mathmatiques. Ces modles sont bass sur les concentrations plasmatiques de cannabinodes. Comme des chantillons de plasma sont rarement disponibles notre laboratoire, il serait utile de pouvoir estimer le moment de la dernire prise de cannabis partir des taux sanguins. Ceci devrait tre possible si leur facteur de distribution entre le plasma et le sang est connu. Objectifs : Les valeurs des rapports de distribution plasma/sang et "srum'Vsang pour le THC, le 11-OH-THC et le THCCOOH ont t calcules partir de leurs concentrations respectives mesures dans le plasma ou le "srum" d'autopsie et le sang complet pour des chantillons prlevs chez des individus vivants ou dcds. Matriel et Mthode : Les chantillons biologiques ont t prlevs sur 8 fumeurs invtrs de cannabis, vivants, et sur 6 individus dcds. Seuls les "srums" non hmolyses ont t inclus dans cette tude. Les concentrations de cannabinodes ont t mesures par CG/SM en mode SIM sur les extraits purifis sur phase solide et mthyls.

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XHI, n 2, 2001

Rsultats : Les rapports de distribution plasma/sang complet sont trs semblables pour les 3 cannabinodes et se situent aux environs de 1,6 ; leur coefficient de variation individuel est infrieur 15 %. Les valeurs des rapports de distribution "srum"/sang complet sont en moyenne plus leves pour les chantillons prlevs postmortem, ils se situent vers 2,4. Les rsultats individuels sont galement rpartis sur un domaine plus large avec un coefficient de variation deux fois plus lev au moins. Conclusions : Les donnes obtenues suggrent que la plus grande prudence est ncessaire si l'on dsire estimer la concentration srique des cannabinodes partir des valeurs dtermines dans le sang entier prlev postmortem. Toutefois, il devrait tre possible d'utiliser les modles mathmatiques dvelopps par Huestis pour estimer le moment de la prise de cannabis partir des taux sanguins mesurs chez des individus vivants en prenant en compte un facteur de multiplication de 1,6 pour calculer le taux plasmatique. Rfrences : 1- Rapport sur le Cannabis de la Commission fdrale pour les questions lies aux drogues CFLD, Office fdral de la sant publique, 3013 Berne, septembre 1999. 2- Augsburger M., Rivier L., Drugs and alcohol among suspected impaired drivers in Canton de Vaud (Switzerland). Forensic Sci. Int. 1997 ; 85 : 95-104. 3- Huestis M. A., Henningfield J. E., Cone E. J., Blood cannabinoids. II. Models for the prediction of time of marijuana exposure from plasma concentrations of delta 9-tetrahydrocannabinol (THC) and 11 -nor-9-carboxy-delta 9-tetrahydrocannabinol (THCCOOH) J. Anal. Toxicol. 1992 ; 16 : 283-290.

entier, pour ses activits anxiolytiques ou sdatives. Dans le Pacifique, et particulirement en NouvelleCaldonie, la consommation croissante pose un problme de sant publique, ce qui nous a amen dterminer ses effets biologiques et cliniques. Matriel et Mthode : 19 buveurs chroniques se sont prts un questionnaire et un prlvement de sang et d'urine : biochimie du sang ralise sur appareil Beckman Synchron CX9, hmatologie sur automate Cell DynAbbott et coagulation sur appareil Hemolab bioMrieux; biochimie des urines sur bandelettes urinaires Multistix 10 $G Bayer. Rsultats et Disc ,on : 19 grands const nateurs (14 hommes et 5 femmes principalement d'origine europenne, gs de 25 55 ans) buvant depuis plusieurs annes 5 7 soirs/semaine l'quivalent de 1,5 3,5g de KL chaque soir. La consommation d'alcool est rgulire chez 58 % des buveurs et le cannabis est fum par 37 %. Signes biologiques : on note une augmentation de la yglutamyl-transfrase (enzyme hpatique, valeur 2 fois suprieure la normale) chez les grands consommateurs, qui boivent du kava depuis plus de 5 ans de faon rgulire (10 personnes). Conclusion : Chez les consommateurs chroniques tudis, la biologie est perturbe long terme et les signes cliniques sont relativement importants. Il est ncessaire de poursuivre notre tude en recrutant un plus grand nombre de buveurs, d'autant plus que des phnomnes d'hypersensibilit retarde (urticaire, oedme de la face) et plusieurs cas d'hpatites subfulminantes non tiquetes sont survenus rcemment en Nouvelle-Caldonie chez des consommateurs occasionnels. Il convient alors d'informer les consommateurs sur les risques potentiels lis un usage de kava prolong.
r

Effets d'une consommation chronique de kava : tude ralise chez 19 buveurs en Nouvelle-Caldonie
A. M A N D E A U . Y. BARGUIL, P. CABALION , D. DUHET
2) (I) (2)

Hmorragie bipallidale aprs intoxication simultane par l'thanol et l'thylne glycol


C.RAGOUCY-SENGLER. VRE , P.KINTZ >
(2) (3

D.CAPARROS-LEFEB-

(1) Laboratoire de Biochimie, Centre Hospitalier de Nouvelle-Caldonie, Av. Paul Doumer - BP J5 - 98849 Nouma Nouvelle - Caldonie. (2) IRD, laboratoire des substances naturelles terrestres, Promenade Roger Laroque B P A5 98848 Nouma Cedex, Nouvelle - Caldonie. Objectifs : Le kava est une boisson traditionnelle du Pacifique prpare partir de la racine d'un poivrier, le Piper methysticum Forst. possdant des proprits psychotropes. Les principes actifs, appels kavalactones (KL) sont des a-pyrones liposolubles. Aujourd'hui, le kava est consomm dans le monde

(1) Laboratoire de Pharmaco-toxicologie, C H U 97110 Pointe Pitre (2) Service de Neurologie, CHU 97110 Pointe Pitre (3) Institut de Mdecine Lgale, 11 rue Humann 67085 Strasbourg Objectif : Les lsions bipallidales aigus ou subaigus sont des lsions rares, elles peuvent tre la consquence d'une perturbation mtabolique lie l'inhibition de l'activit mitochondrial induite par un toxique (1). Nous dcrivons chez un alcoolique chronique un cas d'intoxication aigu par l'thylne glycol (EG) ayant pro-

US

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

voqu une hmorragie bipallidale probablement associe une calcification tissulaire (2). Description du cas : Un homme de 50 ans, alcoolique chronique d'origine afro-caribbene, est admis au CHU de POINTE PITRE en fvrier 2000 pour une perte inexplique de la conscience. L'examen neurologique confirme l'atteinte neurologique. Le scanner crbral ralis l'admission met en vidence une hmorragie bipallidale et l'IRM confirme la localisation unique de la lsion. Les examens biologiques sont normaux pour le ionogramme, les dosages de la creatinine et de la glycmie, la calcmie est abaisse (2 mmol/l). Le trou anionique est normal (9 mmol/l) mais le trou osmolaire plus lev que la normale (17 mOsmol/kg). L' analyse toxicologique du sang et des urines met en vidence une alcoolmie de 3,5 g/l, une alcoolurie de 1,67 g/l et la prsence d'EG un taux toxique gal 6,06 mmol/l. La carboxyhmoglobinmie est de 3,1 % soit lgrement suprieure la normale. L'intoxication par EG est exceptionnelle dans les pays tropicaux car I 'EG est un liquide antigel. Cependant il est parfois utilis dans les liquides de refroidissement des moteurs afin d'viter leur evaporation. Le patient, consommateur quotidien d'environ 500 ml de rhum par jour, a sans doute absorb un rhum mlang de l'EG. L'encphalopathie prsente par notre patient est probablement lie l'intoxication simultane par l'alcool et l'EG. L'intoxication par EG provoque galement une insuffisance rnale et un dme pulmonaire, ces symptmes n 'ont pas ts retrouvs chez notre patient. La prsence simultane d'alcool en grande concentration dans le sang de notre patient a inhib le mtabolisme de l'EG (3), modifi le tableau toxique habituellement retrouv et peut expliquer l'origine des images radiologiques retrouves. Conclusion : L'intoxication par I'ethylene glycol est essentiellement aigu avec des signes cliniques neurologiques peu spcifiques. Les perturbations biologiques comme Vacidse mtabolique et le trou osmolaire ne sont pas toujours manifestes. Les images de scanner et d'IRMprsentes par notre patient n'ont jamais t dcrites dans un cas d'intoxication par EG. Leur mise en vidence doit conduire effectuer un bilan toxicologique incluant la recherche et le dosage des alcools et glycols. Rfrences : 1- Albin RL. Basal ganglia neurotoxins. Neurol Clin 2000 ; 18 : 665-680. 2- Bianco F, F loris R. M RI appearences consistent with haemorrhagic infarction as an early manifestation of carbon monoxide poisoning. Neuroradiology 1996 ; 38, suppl 1 : S70. 3- Ammar K A, Heckerling P S. Ethylene glycol poisoning with a normal anion gap caused by conurent ethanol ingestion : importance of the osmolal gap. Am J Kidney Dis 1996 ; 27 : 130-133. 146

Intoxication au paraquat : discordance entre pronostic et volution propos d'un cas


H. BELHADJ-TAHAR , C. MAIGNAN , CARA1VP, P. CHEVALIERS, M. FABRE
(I) (1) (2)

E.

(1) Centre Anti-poisons et de Toxicovigilance, CHU Purpan Toulouse (2) Service de Ranimation, CH Brive Objectifs : Le Paraquat est un herbicide de contact trs utilis en milieu agricole, ce qui explique la survenue de nombreux cas d'intoxication par ce pesticide dans le monde. Le but de ce travail est de passer en revue les mcanismes physiopathologiques ainsi que les diffrents indicateurs de gravit lors de l'intoxication par le Paraquat. Matriel et mthode : L'apprciation des facteurs pronostiques s'est base sur : - les courbes de gravit de Proudfoot et de Shermann prenant en compte les taux de paraquatmie qui a t dose par Chromatographic Liquide de Haute Performance (HPLC) - des critres cliniques, biologiques et oesogastroscopiques. Cas clinique : Un homme de 41 ans est admis aux urgences, 2 heures aprs tentative d'autolyse par Gramoxone, la paraquatmie H 5 est chiffre 2,7mg/L; le reste du bilan biologique est normal. Par contre, la clinique est domine par un tableau d'irritation oesopharynge. Un traitement vacuateur avec neutralisation par charbon activ est effectu H . L'volution est marque par une altration de l'tat gnral accompagne ds le 2 jour d'une dysphagie avec lsion d'oesophagite diffuse de stade III la fibroscopie, d'une insuffisance rnale ncessitant une dialyse et d'une dgradation de la fonction respiratoire par fibrose pulmonaire. La paraquatmie J7 atteint 0,01 mg/L. Le dcs survient J8 dans un tableau de bloc alvolo-capillaire. Rsultats et discussion : L'volution fatale de ce patient semble en contradiction avec le pronostic favorable estim par diffrents indicateurs de gravit ; les taux de paraquatmie H et J tant respectivement situs au dessous des courbes de Proudfoot et de Shermann. Cette discordance rsulterait du dlai trop court entre l'intoxication et le dosage pratiqu H j , d'o ncessit d'extrapolation graphique. Par ailleurs, la traduction clinique de l'effet toxique rnal et oesophagien laissait prsager un pronostic dfavorable. Conclusion : L'application des indicateurs de gravit doit tenir compte des proprits pharmacocintiques du toxique en cause, en vitant l'extrapolation graphique de ces
2

me

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XHI, n 2, 2001

courbes. L'amplitude de la courbe de la paraquatmie varie en fonction du temps du pic plasmatique qui fluctue entre 30 min et 4h(l ) . Rfrences : 1- Maignan C. Intoxication au paraquat : revue de la littrature. Thse en Mdecine, 1999 Limoges.

Intrt de l'extraction en phase solide en Toxicologie : exemple d'extraction de 15 substances toxiques et mdicamenteuses par 7 colonnes d'extraction en phase solide diffrentes par un protocole unique
N. SADEG. M. D U M O N T E T Laboratoire Claude Bernard - Centre Hospitalier Ren Dubos, F - 95300 Pontoise, France Objectif : L'objectif de cette tude est de montrer l'intrt d'adopter les mthodes d'extraction en phase solide (SPE), ct des techniques d'extraction liquide-liquide, en recherche toxicologique. Matriel et mthodes : Nous avons utilis un protocole unique pour l'extraction en une seule tape de mdicaments acides, neutres et basiques. Un protocole d'extraction en gnral est un compromis entre la slectivit et le taux de rendement. Seul le taux de rendement est dtermin dans notre tude. Le protocole d'extraction utilis est le suivant : conditionnement par methanol et tampon phosphate pH 4,4, passage de l'chantillon, lavage par la solution tampon pH 4,4 et l'lution par du methanol. Rsultats : Taux de rendements d'extraction par diffrentes colonnes SPE de diverses substances chimiques mdicamenteuses partir du srum (pour chaque extraction, n = 3). * ND = non dtect.
piracftimoJ Cirbamazipine Dlgitoiine Mthotrulc Phnobarbital PhnytoTne Mprobimte Sslityl Theophylline Vglproate Diazepam Amphtamine Imipramine Morphine Hvdroeodone Certify % 97 109 100 100 105 109 ND* 0 97 55 46 9 0 0 0 MiS Drugs /. 51 114 99 100 110 99 ND 0 89 55 57 0 0 0 0 MN HR-P /. 62 19 S 100 43 41 ND 65 16 39 1 5 1 8 3 22 1 4 Oasil HLB /. 121 113 86 100 110 77 ditcctt 58 1 06 36 44 80 91 77 9] liolule HO'/. 47 100 71 1O 0 102 92 dlecte 0 95 62 54 45 7 1 9 0 Isolute Hx% 65 106 85 2.5 110 III delecte 23 1 02 74 55 68 99 71 6J Speed KlowV. 39 75 56 100 78 69 delecte 0 72 8 58 76 1 7 36 1

niaque par exemple et ceci permettra de crer un recul d'ionisation et donc de dcrocher ces analytes de la phase stationnaire. Ces mdicaments basiques sont donc correctement lues lorsque l'on rajoute de l'ammoniaque au solvant d'lution (methanol). Par contre, les mdicaments acides sont faiblement extraits car peu retenus par la phase stationnaire. Pour amliorer le rendement d'extraction par ces colonnes, il faudra modifier les conditions de l'tape de lavage selon les molcules extraire. En effet, le mcanisme de rtention est fonction du choix des tampons et de leurs pH. La colonne MNHR-P extrait seulement les mdicaments acides. La colonne Isolute HAX est intressante par ses performances, mais donne de faibles taux de rendement pour le methotrexate et les salicyls.

Analyse de bire en toxicologie mdicolgale par lectrophorse capillaire micellaire


O. PLAUT , Ch. STAUB Institut universitaire de mdecine lgale, Hpitaux Universitaires de Genve, Suisse Objectif : Dans le cadre d'analyses toxicologiques en mdecine lgale, le laboratoire peut tre amen devoir analyser des liquides inconnus, afin d'y rechercher la prsence ventuelle de toxiques stupfiants ou mdicamenteux. Dans deux cas distincts de leve de corps au domicile d'une personne dcde, notre laboratoire s'est trouv confront, paralllement aux analyses portant sur des fluides biologiques, l'analyse d'un liquide jaune, pouvant tre de la bire, contamine ou non. L'lectrophorse capillaire offre plusieurs avantages lors de ce type d'investigation : l'injection directe de solutions aqueuses est possible, sans avoir se soucier de la puret de la solution et de la concentration des analytes; le volume d'chantillon ncessaire est trs faible (de l'ordre de 5 pl) et le volume inject est ngligeable (environ 10 ni). Matriel et mthode : Les chantillons ont t analyss sur un appareil d'lectrophorse capillaire Biofocus 3000 (Bio-Rad), quip d'un capillaire de 50 cm de longueur totale x 50 pm de diamtre intrieur et d'un dtecteur UV longueur d'onde variable, faisant l'acquisition en continu de spectres de 195 300 nm. L'electrolyte employ tait un tampon phosphate/borate (pH 8,2) complt par 50 mM de dodcylsulfate de sodium (SDS). Rsultats : L'analyse des liquides et la comparaison des profils obtenus avec des chantillons de bire du commerce a permis, dans les deux cas, de mettre en vidence la prsence de bire ainsi que d'un contaminant (diclofenac et cyanure). L'identification des contaminants n'a t rendue possible que grce l'apport de techniques 147

Conclusion : Grce aux nouvelles colonnes mises sur le march, l'extraction en phase solide commence s'imposer de plus en plus en Toxicologie Analytique. La colonne OASIS HLB extrait correctement les diffrents mdicaments analyss. Aux conditions utilises, les colonnes Certify, MN Drugs Isolute HCX et Speed Flow ABN extraient faiblement les molcules basiques et neutres. En effet, les analytes basiques ne sont pas lues et restent accrochs la matrice ; il faudra, pour augmenter la force luante, alcaliniser l'luat par de l'ammo-

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complmentaires (CPG/SM et test color). Le diclofenac aurait pu tre identifi d'aprs son spectre UV, pour autant que ce spectre soit disponible dans une bibliothque (et que le logiciel de l'appareil permette la comparaison de spectres). Dans le cas du cyanure, la comparaison des profils a permis d'valuer la concentration minimale de contaminant dans la bire. Conclusion : L'lectrophorse capillaire offre, pour l'analyse directe de solutions aqueuses, des avantages qui en font un outil complmentaire apprciable dans un laboratoire de toxicologie mdico-lgale.

Le fentanyl tait dans les cheveux de l'anesthsiste


M. VILLAIN, V. CIRIMELE. P. KINTZ, B. LUDES Institut de Mdecine Lgale, 11, rue Humann - 67000 Strasbourg - F R A N C E Objectif : Un mdecin anesthsiste d'une cinquantaine d'annes, pratiquant dans une clinique tait suspect de consommer du fentanyl. Toutes ses analyses urinaires se sont rvles ngatives. De manire augmenter la fentre de dtection, il a t ncessaire de raliser des analyses de cheveux. Cette observation a confirm qu 'il est possible de caractriser dans les cheveux des molcules ingres jusqu' plusieurs mois avant le moment du prlvement. Matriel et mthode : Une mche de cheveux de trois centimtres a t prleve au niveau du vertex postrieur et envoye, pour analyse, l'Institut de Mdecine Lgale de Strasbourg. Aprs dcontamination par le dichloromthane (2 fois 5 ml, 2 min), l'chantillon a t pulvris dans un broyeur boulet jusqu' l'obtention d'une poudre fine. 80 mg ont t incubs une nuit dans 2 ml de tampon Soerensen pH 7,6, en prsence de 2,5 ng de fentanyl-d (standard interne). La phase aqueuse a t extraite en phase solide. L'chantillon a t dpos sur une colonne Isolute Cl 8 (active par 3 ml de methanol et conditionne par 3 ml d'eau bidistille), puis rinc par 2 fois 1 ml d'eau bidistille. Aprs schage de la colonne, 1 heure, sous vide, le fentanyl a t lue avec 3 fois 0.5 ml d'actone/dichloromthane (3/1, v/v). La phase organique a t vapore sous vide et le rsidu repris dans 30 pl de methanol. Un aliquot de 2 pl a t inject dans une colonne HPSMS d'un systme CPG/SM/SM Finnigan TSQ 700, en mode impact lectronique. L'acquisition a t ralise en mode SRM (selected reaction monitoring). L'ion parent (m/z 245) et les ions fils (m/z 245, 189, 146) ont t dtects dans le troisime quadripole, aprs la collision avec l'argon. Le fentanyl a t identifi partir de son temps de rtention et de l'abondance des trois ions fils de confirmation (R = 11,91).
5 t

La quantification a t faite par rapport au fentanyl-d$ (R = 11,89 ; m/z 250). Rsultats : Dans les conditions chromatographiques utilises, le pic de fentanyl est parfaitement isol. Aprs validation de la mthode (linaire entre 20 et 1000 pg/mg, limite de dtection de 20 pg/mg et rendement d'extraction de 82 % 100pg/mg), l'analyse de l'chantillon de cheveux a permis de quantifier le fentanyl une concentration de 644 pg /mg. Conclusion : Cette concentration est trs importante en regard de celles retrouves dans la littrature (1,2) et signifie que le mdecin a consomm de faon rgulire ce stupfiant. L'analyse des cheveux permet donc de mettre en vidence une exposition rpte un xnobiotique malgr des rsultats urinaires ngatifs probablement suite une abstinence momentane durant les quelques jours prcdant le prlvement. Rrences : 1- Selavka CM., Mason A.P., Riker D.,Crookham S. Determination of fentanyl in hair : the case of the crooked criminalistic. Journal of Forensic Sciences. 1995 ; 40: 681-685 2- Sachs S.,Uhl M., Hege-Scheuing G., Schneider E. Analysis of fentanyl and sufentanil in hair by GC/MS/MS. Int. J. Leg. Med. 1996 ; 109 : 213-215.
t

Dtection et quantification du LSD dans le sang total par chromatographic en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse (CG/SM/SM) en trappe ionique
D. LIBONG , S. B O U C H O N N E T . 1 . RICORDEL
(1) 0 (2)

(1) Laboratoire des Mcanismes Ractionnels - Ecole Polytechnique - route de Saclay - 91128 PALAISEAU Cedex (2) Laboratoire de Toxicologie de la Prfecture de Police - 2, Place Mazas - 75012 PARIS Objectif : Parce qu'ils permettent la mise en uvre de protocoles d'analyse en spectromtrie de masse tandem (SM/SM), les analyseurs de type trappe ionique constituent des outils de choix pour la dtection et la quantification des traces dans les milieux complexes et particulirement dans les milieux biologiques. L'objectif de notre tude est la mise au point d'un protocole slectif et sensible de dtection et de quantification du LSD vrifiant la praticabilit de ce type d'analyseur. Matriel et mthode : Notre tude a t ralise sur un appareillage de couplage CG-SM SATURN 2000 VARAN. La mthode optimise comporte un protocole d'injection chromatographique froid sur colonne Cp-Sil-8 MS de 30 m. Ce

148

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type de protocole permet d'injecter un volume d'chantillon de 8 pl, alors qu 'une injection plus "classique " (" chaud") limite gnralement ce volume 1 pl (1). L'chantillon est ionis par ionisation chimique (IC) positive l'actonitrile ; il a t en effet montr que VlC positive est plus slective et plus sensible vis vis du LSD que l'ionisation lectronique (2). L'analyse des ions est ralise par SM/SM. La prparation de l'chantillon comporte une tape d'extraction liquideliquide suivie d'une tape de purification par SPE sur cartouche de type Bondelut certify (1210-2051). Elle ne ncessite pas de drivation du LSD. La mthode de quantification utilise le LAMPA (lysergic acid mthylpropylamide) pour talon interne. Rsultats : Les chromatogrammes et spectres de masse obtenus montrent l'excellente slectivit de la mthode dont le seuil de dtection est de 0,02 ng de LSD par ml de sang (la prise d'essai est de 2 ml). Ce faible seuil de dtection s'explique par l'injection de grands volumes d'chantillon et par l'excellente slectivit de la technique : allier la slectivit de l'IC celle de la SM/SM permet d'liminer tous les polluants du chromatogramme (polluants issus de la matrice et de la phase stationnaire) et de stocker ainsi plus d'ions d'intrt dans la trappe ionique. La mthode montre une bonne linarit depuis le seuil de dtection jusqu' 10 ng/ml : Avec 8 points de calibration, le coefficient de corrlation est de 0,995 partir d'extraits sanguins, 0,999 partir d'chantillons "purs". Les rptabilit et reproductibilit sont satisfaisantes (infrieures 15 %) ; des tudes sont en cours pour tenter de les amliorer. Conclusion : La chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse en tandem en trappe ionique permet une dtection fiable et particulirement sensible du LSD dans le sang, sans ncessit de drivation. Rfrences : 1- Sklerov J.H., Kalasinsky K.S., Ehorn C.A. Detection of Lysergic Acid Diethylamide (LSD) in Urine by Gas Chromatography-Ion trap Tandem Mass Spectrometry. J. Anal. Toxicol. 1999 ; 23 : 474-478. 2- C.C. Nelson and Foltz RL. Determination of Lysergic Acid Diethylamide (LSD), Iso-LSD and NDemethyl-LSD in Body Fluids by Gas Chromatography/Tandem Mass Spectrometry. Anal. Chem. 1992 ; 64 : 1578-1585.

(2) CH Sainte Marie, 63000 Clermont-Ferrand Objectif: L'olanzapine (Zyprexa) reprsente, dans la famille thrapeutique des neuroleptiques atypiques, un progrs important en terme d'efficacit et de tolrance, ce qui en fait un mdicament de plus en plus prescrit dans les schizophrnies. La recherche d'une zone de concentrations plasmatiques associe une efficacit nous a conduit dvelopper une mthode de dosage plasmatique spcifique. Matriel et mthode : Aprs une double extraction en milieu basique (1 ml plasma) par un mlange hexane/isopropanol (99,5/0,5 v/v) en prsence d'un talon interne, le metabolite Ndmthyl de la trimipramine, l'olanzapine est spare sur une colonne de silice Si 5pm (Phnomenex, 250 x 4,6 mm) et dtecte en UV 240 nm. Rsultats : Le temps de rtention de l'olanzapine est de 3,9 min. Les tudes de reproductibilit inter- et intra-journalires donnent des coefficients de variation compris entre 8,8 et 11,8 % aux concentrations de 5 et 40 ng/ml. Les courbes de calibration (1,25 - 80 ng/ml) sont linaires (pente = 0,012 0,004 ; ordonne l'origine = 0,069 0,269 ; r = 0,9962 0,0037). La limite de dtection est de 1 ng/ml. Cette technique a t applique jusqu'ici au suivi thrapeutique d'une premire srie de patients (n = 30) traits des posologies allant de 7,5 30 mg/j. Les concentrations plasmatiques d'olanzapine varient de 3,6 89,4 ng/ml. Les signes cliniques associs la plus forte concentration plasmatique d'olanzapine ont t l'apparition de signes extrapyramidaux discrets. Conclusion : Cette mthode analytique est simple, sensible et facilement combinable des mthodes prcdemment dveloppes dans notre laboratoire pour d'autres psychotropes (1). Elle doit permettre d'tudier les corrlations entre dose, efficacit clinique, effets indsirables et concentrations plasmatiques d'olanzapine (2) ainsi que l'interfrence ventuelle du tabagisme (3). Rfrences : 1- Coudore F, Nicolay A, Hoareau M, Eschalier A. Another use of silica gel and aqueous eluent for HPLC analysis of clozapine and desmethylclozapine. J. Anal. Toxicol. 1999 ; 23 : 195-199. 2- Rabinowitz J, Lichtenberg P, Kaplan Z. Comparison of cost, dosage and clinical preference for risperidone and olanzapine. Schizophr. Res. 2000 ; 46 : 91-96. 3- George TP, Ziedonis DM, Feingold A, Pepper WT, Satterburg CA, Winkel J, Rounsaville BJ, Kosten TR Nicotine transdermal patch and atypical antipsychotic medications for smoking cessation in schizophrenia. Am. J. Psychiatry 2000 ; 157 : 1835-1842.

Dosage plasmatique de l'olanzapine par CLHP/UV


F. COUDORE . D. BALAYSSAC , A. B U Y E N S , M. HOAREAU , C. CORPELET, P.M. LLORCA , A. ESCHALIER
(l) (2) (1) (1) (,) (,)

(1) Lab. Pharmacologie Clinique et Toxicologie, C H U G. Montpied, 63001 Clermont-Ferrand

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Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

Dtermination de valeurs physiologiques de la testosterone dans les cheveux par une mthode radio-immunologique directe. Intrt dans la lutte contre le dopage
E. MORNAY , M . DEVEAUX . B. SOUDAN , D. GOSSET (1) Institut de Mdecine Lgale, place Tho Varlet, 59000 Lille (2) Laboratoire de Biochimie, Clinique Linquette, CHRU, 59037 Lille cedex Objectif : L'objectif de ce travail est d'tablir des valeurs physiologiques de la testosterone dans les cheveux par une mthode radio-immunologique (RIA ) simple et rapide. Patients et mthode : La population tudie est compose de 12 hommes, 9 femmes et 4 enfants, ne pratiquant pas de sport habituellement. Environ 100 mg de cheveux sont dcontamins par 5 ml de dichloromthane (2x2 min). Les cheveux schs puis pulvriss sont incubs 95 C durant 10 min dans de la soude. Aprs dissolution complte, la solution est neutralise par de l'acide chlorhydrique. L'extraction de la testosterone est ralise sous agitation horizontale durant 20 min par 5 ml d'actate d'thyle. Aprs centrifugation, la phase organique est rcupre puis vapore sous azote. Le dosage RIA est effectu par une mthode radioimmunologique directe (Coat-A-Count Testosterone totale, Dade-Behring) utilise pour doser habituellement la testosterone dans le plasma. L'extrait sec est repris par 250 pl de srum humain dpourvu de testosterone ; la solution est alors traite comme un chantillon plasmatique. L'analyse de solutions de tampon et de testosterone de titres connus a permis de dterminer un rendement d'extraction voisin de 80 %. Rsultats : Les valeurs trouves sont rassembles dans le tableau L Tableau I : Concentrations de testosterone mesures dans les cheveux (en pg/mg).
patients Hommes ( 18-50 ans) Femmes (23-54 ans) Enfants (5-14 ans) n 12 9 4 moyenne 10,70 3,56 1,70 (limites) (3,56-23,31) (1,75 - 6,43) (0,63 - 2,69) cart-type 6,18 1,68 0,90
(1) (1) (2)

mthode de dosage CPG/SM CLHP/RIA CLHP/EIA RIA nos valeurs

limites 1,2-24,3 3,7-22,4


-

hommes m n 3,4 9,9 3,8 5,9 10,7 37 22 13 25 12

limites 0,88-3,4 0,3-3,1


-

femmes m n 1,6 1,2


'-

limites
-

enfants m n
-

11 19

0,3-3,1
-

1,5 1,5
-

6 5
-

3,6-23,3

1,8-6,4

3,6

0,6-2,7

1,7

Conclusion : Le protocole mis au point permet de doser la testosterone contenue dans les cheveux l'aide d'une trousse de RIA du commerce. Nos valeurs semblent un peu plus leves que celles dj publies, surtout pour les femmes. Cependant, elles restent trs infrieures celles retrouves chez les sportifs dops. Cette technique pourrait donc tre utilise en premire intention afin de raliser un screening sur des prlvements de cheveux. Toute valeur suprieure 30 pg/mg devrait alors tre confirme par la mthode de rfrence actuelle (CPG/SM). Enfin, certains points demandent tre claircis : effet de matrice de la mlanine, valeurs de base chez le sportif non dop, interfrence de l'pitestostrone.

valuation du Triage 8 pour le dpistage des stupfiants et mdicaments psy= choactifs dans les urines de 163 conducteurs impliqus dans un accident corporel et de 33 patients toxicomanes
R M U R A . N. BARITAULT, E. JEHL , P. KINTZ
(I) (2) (2)

(1) Laboratoire de Biochimie et Toxicologie, Centre Hospitalier Universitaire, BP 577, 86021 POITIERS Cedex France (2) Institut de Mdecine Lgale, 11 rue Humann, 67085 STRASBOURG Cedex Objectif : Une loi a t adopte en juin 1999, instituant un dpistage systmatique des stupfiants chez les conducteurs impliqus dans un accident mortel de la circulation routire. Les modalits d'application prcisent que ce dpistage sera ralis dans les urines et qu'en cas de positivit, une prise de sang sera effectue pour confirmation mais aussi pour y rechercher la prsence de mdicaments psychoactifs. Raliser rapidement et avec un matriel unique le dpistage dans les urines des principaux produits psychoactifs licites et illicites pourrait tre trs utile non seulement dans le cadre de cette loi, mais aussi lorsqu'une vritable politique de prvention sera mise en place. C'est pourquoi nous avons entrepris de tester les performances du Triage8, prsent comme un test rapide destin dpister en une seule tape les opiacs(OPIA), les amphtamines (AMP), la cocane (COC), le cannabis (CAN), la methadone (MTD), les benzodiazepines (BZD), les barbituriques (BAR) et les antidpresseurs

Nous avons ensuite compar nos valeurs toutes celles publies dans la littrature, rassembles dans le tableau II. Tableau II : Valeurs des concentrations de testosterone dans les cheveux (en pg/mg), compares aux valeurs rapportes dans la littrature (m : moyenne, n : nombre d'individus). 150

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tricycliques (ADT). Matriel et mthodes : Ont t inclus dans cette tude 163 chantillons urinaires provenant de conducteurs impliqus dans un accident corporel et hospitaliss ainsi que 33 chantillons provenant de patients toxicomanes bnficiant d'un traitement de substitution par la methadone. Le Triage 8 (BMD S.A., Marne La Valle, France) utilise une technique d'immuno-comptition. Aprs 10 min d'incubation de l'chantillon urinaire dans une cupule ractionne lie (tape de comptition), le mlange est transfr dans la chambre de dtection. Aprs lavage et le temps ncessaire la diffusion totale du liquide (moins de 5 min), le rsultat est interprt par lecture directe (la prsence d'une bande colore indique la prsence de la substance correspondante). Les seuils de positivit sont annoncs 50 ng/ml pour le CAN, 300 ng/ml pour MTD, BZD, COC, OPIA et BAR et 1000 ng/ml pour AMP et ADT. Les rsultats taient compars ceux d'une analyse par chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse (CPG-SM) pour les stupfiants et la methadone ou par chromatographie liquide haute performance avec dtection barrettes de diodes pour les autres substances. Rsultats : Une excellente corrlation (absence de faux positif ou faux ngatif) a t observe pour la COC, la MTD, les BAR et les ADT. Des rsultats faussement ngatifs taient retrouvs pour les OPIA (5 cas), le CAN (3 cas), les AMP (4 cas) et les BZD (1 cas). Aucun rsultat faussement positif n 'a t observ. L'utilisation du Triage 8 a montr que ce test tait caractris par une bonne rsolution (bandes colores trs nettes), conduisant une grande facilit d'interprtation des rsultats. Le temps total de l'analyse est d'environ 15 minutes. Conclusion : Bien que le temps ncessaire sa mise en uvre soit suprieur celui de la plupart des autres tests disponibles dans le commerce (1), le Triage 8 prsente l'avantage de pouvoir dpister simultanment dans l'urine les principales substances psychoactives licites et illicites. Les bonnes performances observes dans cette tude en font un systme de dpistage pouvant tre trs utile, en premire intention, dans le cadre de la lutte contre l'inscurit routire, mais aussi dans bien d'autres applications (suivi de patients sous methadone, toxicologie hospitalire, etc.). Rfrences : 1- P. Mura, P. Kintz, Y. Papet, G. Ruesch, A. Piriou. Evaluation de six tests rapides pour le dpistage du cannabis dans la sueur, la salive et les urines. Acra Clin Belg 1999 ; 1 : 35-38.

Intgration de l'analyseur multiparamtrique Dimension RxL au sein d'un laboratoire de pharmacotoxicologie


F. PARANT. M. MOULSMA, G. L A R D E T Laboratoire de Biochimie - Pharmacotoxicologie et Traces. Hpital Edouard Herriot. Lyon Objectifs : Le secteur automatis d'un laboratoire de pharmacotoxicologie doit rechercher optimiser d'une part la qualit des prestations fournies (1,2) et d'autre part sa productivit (meilleure organisation, rationalisation du parc analyseurs...) (3). Les gains de productivit obtenus permettent notamment un redploiement des tches en faveur du dveloppement des techniques analytiques sparatives. Le remplacement d'un automate nous a permis de redfinir nos exigences dans le choix du nouvel analyseur. Associes aux exigences communes tout secteur automatis (performances analytiques, cadence, cot, convivialit...), des exigences spcifiques la pharmacotoxicologie doivent tre prises en compte. L'analyseur doit prsenter une orientation "mdicaments" (antipileptiques, cardiotoniques, antibiotiques, immunosuppresseurs...) et une orientation "toxicologie" (alcool, drogues urinaires, pseudocholinestrases sriques...). Paralllement, l'automate doit nous offrir la possibilit d'adapter des techniques en canal ouvert (adaptation des recherches benzodiazepines et antidpresseurs tricycliques EMIT Syva, dosage colorimtrique des drivs nicotiniques urinaires (4 ractifs)...). Enfin, l'activit du laboratoire, qui s'intgre au sein d'une Fdration de Biochimie, ncessite la mise en commun des moyens matriels. Diffrentes analyses (HCG, TSH, CRP, proteinurics, lactates...) doivent pouvoir tre ralises sur cet analyseur. Rsultats : Notre choix s'est port sur l'analyseur multiparamtrique accs alatoire Dimension RxL quip du module HM (permettant l'immunoanalyse en phase htrogne). Les ractifs sont conditionns en flex. Dix canaux ouverts sont disponibles. Le Dimension RxL, d'une cadence thorique de 170 tests/h (en phase htrogne) 500 tests/h (en phase homogne) rpond amplement notre activit (96 000 tests avec 21 paramtres) et l'activit prvisionnelle pour 2001 (106 000 tests avec 29 paramtres) (ciclosporine sur sang total et drogues urinaires en EMIT II Plus prvues pour 2001). A noter que la souplesse de la gestion des ractifs, la stabilit des calibrations et la rduction des dlais de rendus des rsultats sont, sur cet analyseur, trs apprciables. Conclusion : Entre 1999 et 2001, l'acquisition du Dimension RxL quip du module HM nous a permis de rformer quatre automates : un OPUS, un COBAS MIRA, un TDx et un IMX et de raliser un transfert d'activit 151

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d'un COBAS MIRA sur cet analyseur {Proteinurics). Paralllement, l'activit automatise de la garde s'est recentre sur le seul Dimension RxL (contre trois analyseurs prcdemment). Rfrences : 1- Pechard A. et al. Analyse critique des diffrentes mthodes utilises pour le dpistage toxicologique dans un laboratoire d'urgence. Ann. Biol. Clin. 1999 ; 57: 525-537. 2- Feuillu A. Dosages toxicologiques Biol. Clin. 2000 ; 58 : 753-754. en urgence. Ann. labo-

3- Travers E. M. Cost analysis in the toxicology ratory. Clin. Lab. Med. 1990 ; 10 : 591-623.

Intoxication au bromure de mthyle par fuite d'extincteur


G. HOIZEY . P.F. SOUCHON , A. NICOLAS, D. LAMIABLE >,P. SABOURAUD , N. BEDNAREK , C. F R A N C E S , T. T R E N Q U E , J. MOTTE , H. MILL A R T
(1 (2) (2) (,) (,) (2) 0 (1) (2)

turiques, de salicyls et de stupfiants ngative. L'activit cholinestrasique est normale. La possibilit d'une intoxication par la strychnine ou par divers raticides est galement carte. Enfin, le "screening" par CPG/SM s'est rvl ngatif. C'est finalement la dcouverte, dans une grange jouxtant la maison familiale, d'extincteurs datant de 1950, qui a orient la recherche vers l'ventualit d'une intoxication par le bromure de mthyle. En effet, certains de ces extincteurs prsentaient une fuite pouvant tre responsable d'manations toxiques, la jeune fille ayant reconnu jouer rgulirement dans ce lieu. C'est dans ce contexte que nous sommes amens rechercher une intoxication par ce puissant toxique dont la symptomatologie est compatible avec l'tat prsent par la jeune fille. Le dosage d'ion bromure est alors ralis sur l'ensemble des prlvements sanguins raliss depuis son admission en milieu hospitalier. Mthode : Le dosage sanguin de l'ion brome a t ralis par technique lectromtrique l'aide d'une lectrode slective (Orion), aprs prcipitation des protines par l'acide trichloractique. Rsultats : Le dosage ralis sur le srum prlev le jour de l'admission de la jeune fille l'hpital montre une concentration importante de bromure sanguin gale 183 mg/L (normale < 5mg/L). Une semaine plus tard, le taux de bromure sanguin reste encore lev avec une valeur de 103 mg/L. Au plan clinique, l'tat de la patiente s'amliore avec quasi-disparition du syndrome extra-pyramidal et persistance de lgres myoclonies au repos. La ralisation d'une IRM crbrale montre l'absence de lsions crbrales. Cette volution favorable a permis sa sortie de l'hpital 4 jours plus tard. A J21 et deux mois aprs l'intoxication, les concentrations sanguines de bromure ont t retrouves respectivement 34 mg/L et 5,2 mg/L. Aucune squelle neurologique n'est constater une anne aprs l'intoxication. Conclusion : Bien que cette intoxication par fuite d'anciens extincteurs se soit avre sans consquence tragique, elle nous montre, cependant, qu 'un risque persiste encore aujourd'hui et ce, alors qu 'une mesure rglementaire datant de 1966 rend obligatoire la destruction de ces appareils.

(1) Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, CHU de REIMS (2) American Memorial Hospital, Hpital d'Enfants, C H U de REIMS (3) Socits d'Etudes des Risques Toxiques, NANTES Le bromure de mthyle est un gaz incolore, peu odorant, utilis autrefois comme extincteur d'incendie (interdit depuis 1960, JO du 12.10.1960) ou agent rfrigrant. Ses proprits pesticides lui confrent encore aujourd'hui une indication, dans certaines conditions, dans le cadre du traitement des vgtaux, des locaux et des sols agricoles par fumigation. Observation : Une jeune fille (12 ans) est admise au CHU de Reims pour myoclonies gnralises, aprs avoir transit par un hpital priphrique 24 heures auparavant pour cause de vomissements, de difficults la marche avec apparition de mouvements anormaux. A l'entre dans le Service des Grands Enfants du CHU de Reims, la patiente, consciente, prsente des mouvements dsordonns, brusques et asymtriques. On note galement une dysarthrie majeure probablement lie ces mouvements anormaux de nature chorique. Les jours suivants, il persiste un net syndrome extra-pyramidal avec dystonie des membres. Les enregistrements d'EEG n'objectivent, priori, aucune dcharge corticale pouvant voquer un syndrome pileptique, et les examens biologiques raliss l'arrive (acide lactique, ammonimie, ionogramme, bilans hpatique, inflammatoire et de coagulation) sont normaux. Le bilan toxicologique initial est ralis sur les prlvements sanguins et urinaires collects lors de l'admission au CHU. Il montre une alcoolmie ngative, une recherche de benzodiazepines, d'antidpresseurs tricycliques, de barbi-

Devenir de l'actaldhyde chez l'homme aprs absorption d'une quantit unique et modre de vin rouge et de vin de champagne
G. HOIZEY. M. KALTENBACH , C. FRANCES , D. LAMIABLE , H. MILLART , NAZEYROLLAS , V. DURLACH >, J. CARON >
(I) (1) (3) (4 (4 (2) (I)

(1) Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, CHU de Reims, Reims

152

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

(2) Laboratoire de Pharmacologie Pharmacocintique, UFR de Pharmacie, Reims (3) Service de Cardiologie ;

et

(4) Service d'Endocrinologie, CHU de Reims, Reims Objectif : L'actaldhyde, premier metabolite de l'thanol, est potentiellement impliqu dans certains effets toxiques faisant suite la consommation de boissons alcoolises. Bien qu'aujourd'hui, ses effets sur l'organisme soient relativement bien connus, son devenir chez l'Homme reste peu tudi, notamment aprs absorption de vin de champagne. Dans ce contexte, il semblait intressant de comparer, dans le cadre d'une tude pharmacocintique contrle, le devenir de l'actaldhyde chez l'homme, aprs ingestion de vin de champagne et de vin rouge. Matriel et mthode : Cette tude a port sur un chantillon de 12 sujets sains, jeun, de sexe masculin, et d'ge compris entre 20 et 30 ans. Deux traitements ont t tudis selon un protocole d'essai crois : champagne brut (375 ml, titre alcoolique 12,4 %v:v) et vin rouge (375 ml, titre alcoolique 12,3 % v :v) absorbs en 10 min. Une priode de 5 semaines tait respecte entre chaque exprience. Les prlvements sanguins taient raliss 10 minutes avant, puis pendant 4 heures aprs absorption de la boisson alcoolise. En raison du caractre fortement volatil de l'actaldhyde (Pt Eb : 21 C), l'ensemble des chantillons sanguins ont t prlevs dans des tubes (fluorure de sodium et oxalate de potassium) pralablement placs dans de la glace. L'actaldhyde tait analys rapidement au moyen d'une technique couplant "espace de tte "/CPG-FID, adapte de celle dcrite par McCarver-May (1). Les thanolmies ont t dtermines en parallle par CPG-FID. Les quantits d'thanol et d'actaldhyde ayant atteint la circulation gnrale ont t estimes par l'aire sous la courbe (AUC) calcule sur 4 heures. L'influence du type de boisson sur le devenir de l'actaldhyde a t value partir du ratio AUC JAUC . L'analyse statistique a t ralise au moyen du test non-paramtrique de Wilcoxon pour chantillons apparis. Rsultats : L'volution des concentrations sanguines en thanol en fonction du temps aprs absorption de vin rouge ou de champagne est similaire. Aucune diffrence significative n'a t retrouve dans les AUC quelle que soit la boisson ingre. A l'inverse, les profils caractrisant l'volution des concentrations sanguines en actaldhyde sont diffrents pour les deux boissons tudies et ce, en dpit d'une variabilit inter-individuelle marque. L'AUC aprs absorption de vin rouge est significativement suprieure celle dtermine aprs ingestion de champagne, avec une lvation de l'AUC de l'ordre de 35 % pour le vin rouge comparativement au champagne (p < 0,01). Logiquement, la comparaison des ratio UC jAUC i des deux boissons a
Actaldhyd EtMnol Acta[dhsd Ethano

rvl une diffrence statistiquement significative (p < 0,01). Conclusion : Ces rsultats montrent que l'ingestion d'une quantit unique modre de vin de champagne, comparativement au vin rouge, se traduit par une exposition de l'organisme l'actaldhyde significativement plus faible. Cette observation pourrait s'expliquer par un mtabolisme diffrent sur un plan quantitatif et/ou l'existence de substances dans l'une ou l'autre des boissons susceptibles d'interfrer avec le mtabolisme de l'thanol et/ou de l'actaldhyde. Rfrences : 1- McCarver DG, Durisin L. An accurate automated, simultaneous gas chromatographic headspace measurement of whole blood ethanol and acetaldehyde for human in vivo studies. J. Anal. Toxicol. 1997 ; 21: 134141.

Activit de certaines enzymes antioxydatives et concentrations des vitamines chez les rats aprs exposition la fume du tabac
E. FLOREK . J. WRZOSEK , W. PJJEKOSZEWSKF>, P. CZEKAJ
(3) (1) (,)

(1) Chaire de Toxicologie, Acadmie de Mdecine, Poznan, Pologne (2) Institut d'Expertise Lgal, Krakow, Pologne (3) I P Chaire d'Histologie et d'Embryologie, Acadmie de Mdecine, Katowice, Pologne Objectif : La fume du tabac est compose de plus de 4000 agents chimiques. Le tabagisme est, parmi de nombreux facteurs, y compris physiologiques, la cause d'exposition de l'organisme l'action des radicaux libres. La premire ligne de dfense constitue par les mcanismes qui neutralisent les radicaux libres, formes de l'oxygne particulirement actives, est assure par les enzymes suivantes : la catalase (CAT), la superoxide dismutase (SOD), la glutathion peroxydase (GSH-Px) et certaines vitamines : C, E et fi-carotne. La premire tape a consist essayer d'valuer l'influence de la concentration de la fume du tabac et du temps d'exposition sur l'activit de SOD et GSH-Px dans le plasma d'animaux. Ensuite nous avons dtermin l'activit de SOD et GSH-Px dans les hmaties ainsi que les concentrations de vitamines C, E, et fi-carotne dans le plasma des rats exposs la fume. Matriel et mthode : Des rats Wistar d'un poids de 250 10 g ont t exposs l'inhalation dans la chambre toxicologique selon le schma suivant : 1) en fonction de la dose de fume : une exposition de 1 semaine la fume d'une concentration de 500, 153
mc

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

1000, 1500 mg de CO/m d'air ; 2) en fonction du temps d'exposition : expositions de 1, 2 et 3 semaines la fume d'une concentration de 1000 mg de CO/m d'air ; 3) inhalation de 3 semaines de la fume d'une concentration de 1500 mg de CO/m d'air. L'exposition a dur 6 heures par jour, 5 jours par semaine. L'efficacit de l'exposition la fume du tabac a t dtermine en valuant l'limination urinaire de la cotinine metabolite principal de la nicotine. L'activit des enzymes ainsi que les concentrations des vitamines ont t doses par mthode spectrophotomtrique. Le dosage de la cotinine a t ralis l'aide de chromatographic liquide haute pression (CLHP).Tous les rsultats ont t analyss statistiquement. Rsultats : Nous avons constat que la fume du tabac influence de manire dose- et temps-dpendante l'activit de SOD dans le plasma des rats et que la concentration leve de la fume augmente l'activit de GSH-Px. Le temps d'exposition des animaux n'a pas d'influence importante sur l'activit de la glutathion peroxydase. L'exposition de 3 semaines la fume du tabac de 1500 mg de CO/ m d'air a produit une chute d'activit de SOD dans les hmaties des rats de 44 %, alors que l'activit de GSH-Px a augment de 61 %. Dans le mme groupe d'animaux nous avons dtermin galement les concentrations de vitamines C, E et J3carotne du plasma. L'inhalation de la fume du tabac a produit une diminution de 28 % de la teneur en vitamine C, de 30 % en vitamine E et la concentration de fi-carotne a diminu de 75 %.
3 3 3

Etude histochimique et morphologique de l'action de la fume du tabac au niveau de la zone 1 et 3 de 1'acinus hpatique
P. C Z E K A J , G. NOWACZYK-DURA , E. FLORERA, M . KAMINSKI , A. PALASZ
(1) (,) (l) (l)

(1) I P Chaire d'Histologie et d'Embryologie, Acadmie de Mdecine, Katowice, Pologne (2) Chaire de Toxicologie, Acadmie de Mdecine, Poznan, Pologne Objectif : Les composants de la fume du tabac sont toxiques, mutagnes voire mme cancrignes. Certains d'entre eux dstabilisent la fonction cellulaire en induisant I 'hypoxic La nicotine a pour effet de diminuer le dbit sanguin, l'oxyde de carbone (CO) fait tomber le taux de l'oxygne dans le sang et, par consquent, sa diffusion vers les tissus. Une exposition prolonge de la mre la fume du tabac peut entraner de l'hypoxie chronique chez le ftus. Matriel et mthode : Dans la prsente tude des femelles de rat Wistar (12 154

me

individus) ont subi une exposition de 21 jours la fume du tabac en concentration de l'ordre de 1500 mg CO/m . Pour les femelles gestantes, la priode d'exposition correspondait celle de la gestation. Deux types d'valuation ont t raliss au niveau du foie chez la mre, le ftus J21 de gestation et le nouveau-n Jl postnatal : 1/ morphologique - sur des coupes de paraffine colores l'hmatoxyline-osine et analyses au moyen de mthodes morphomtriques, et 2/ histoenzymomtrique avec estimation d'activit des enzymesmarqueurs de mtabolisme oxy datif - succinate de shydrognase (SDH) - et non oxy datif - lactate des hydrognase (LDH) selon les ractions histoenzymatiques values l'aide de mthodes densitomtriques. Tous les rsultats ont t analyss statistiquement. Rsultats : Les diffrences d'activit de SDH et LDH entre les zones du foie des ftus au 21 jour de gestation et chez les nouveau-ns taient discrtes mais significativement plus leves dans la zone 1 des acinus que dans la zone 3. L'activit de SDH et LDH dcroissait dans le foie des ftus alors qu'une augmentation a t observe dans le foie des nouveau-ns des mres exposes la fume du tabac au cours de la gestation. En effet, la diminution et l'augmentation de l'activit enzymatique tant de mme valeur, nous avons observ son galisation entre les deux zones. L'activit de SDH tait accrue dans le foie des femelles adultes au niveau de la zone 3 par rapport la zone 1, alors que l'activit de LDH tait comparable dans les deux zones. La fume du tabac augmentait l'activit de SDH dans les deux zones des acinus hpatiques chez les femelles gestantes et non gestantes ainsi que l'activit de LDH dans les deux zones chez les femelles non gestantes. L'effet inducteur de la fume disparaissait chez les femelles gestantes (zone 1 et 3). Finalement, la majorit des rats exposs la fume du tabac prsentaient une activit de SDH et LDH accrue dans la zone 3 par rapport la zone 1 des acinus hpatiques. Conclusion : 1/ L'activit de SDH et LDH dans le foie des rats dpend de l'ge de l'animal et de la zone de I 'acinus hpatique. 2/ La gestation et la fume du tabac, tous les deux, sont les facteurs qui modifient significativement mais diffremment l'activit de SDH et LDH dans le foie des rats. 3/Les valeurs de changements de l'activit de SDH et LDH dans la zone 1 et 3 de Vacinus hpatique provoques par la gestation et par la fume du tabac sont comparables. 4/ L'activit de SDH et LDH chez les ftus et les nouveau-ns exposs la fume du tabac est comparable dans la zone 1 et 3 des acinus hpatiques, alors que chez les femelles gestantes et rats adultes exposs la fume du tabac elle est plus leve dans la zone 3.
3 me

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XTII, n 2, 2001

I Congrs des Jeunes Scientifiques du TIAFT


Gent, Belgique, 6-7 Avril 2001
Young Scientists in Gent : it was great ! On April 6-7, about 50 young scientists of TIAFT met in Gent, Belgium. This was the first meeting of the YS committee, that was created in 1996 during the Interlaken conference. In attendence were scientists from all over the world; most came from Western Europe, but some were from the United States, Poland or Chile. Thanks to Nele Samyn, Karine Clauwert and Alain Verstraete, who were the hosts, the meeting was a real success, giving us the opportunity to meet, discuss and exchange information and ideas, leading to a stimulating experience. The meeting started on Friday afternoon in the medieval remains of an old monastery with 5 general lectures, as following : - Nele Samyn (Belgium) : Influence of collection methods on saliva drug concentrations : practical experience and literature review - Rebecca Jufer (USA) : Controlled experimental studies - part 1 - Simona Pichini (Italy) : Controlled experimental studies - part 2 - Alain Verstraete (Belgium) : Overview of screening equipment and application of cut-off values - Karine Clauwert (Belgium) : Developments in confirmatory techniques In order to enhance the attractiveness of the meeting, the organisers planned an enjoyable social program, offering cultural and culinary features of Gent. Three different dinner places and a night walk through the city created a nice environment for informal interaction. Saturday was devoted to free papers, of which the abstracts are listed below. Finally, Alain Verstraete presented the experience of the european ROSITA project and the meeting was concluded by Sam Niedbala (USA) with the presentation of the future of oral fluid in workplace drug testing. The closing ceremony was on a boat, with a final taste of local alcohol, just to enhance the good contacts and promote friendship. Two unforgetable days, that demonstrate the need for some informal discussions between the new generation, the people that will make the forensic toxicology of tomorrow. Pascal Kintz, Chairman of the Y S C

er

155

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

Pitfalls associated with the use of a simple sample preparation in the analysis of saliva with LC-ESI-MS/MS.
K.A. M O R T I E R , K.M. CLAUWAERT , W.E. LAMBERT, J.F. VAN BOCXLAER , E.G. VAN DEN EECKHOUT, C.H. VAN PETEGHEM , A.P. DE L E E N H E E R ,
(2) (,) (,) (1) (2)

(1) Laboratory of Toxicology, Ghent University, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent, Belgium (2) Laboratory of Medical Biochemistry and Clinical Analysis, Ghent University, Harelbekestraat 72, B9000 Ghent, Belgium (3) Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Ghent University, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent, Belgium The fast analysis of biological fluids with LC-ESI-MS is often hampered by the presence of endogenous compounds. These matrix components restrict the use of a simple sample preparation and short chromatographic run times. Saliva is presented as a relatively clean matrix compared to other biological fluids such as plasma or serum. Indeed, typical matrix components like proteins and lipids are more than twenty times less concentrated. Hence, a simple protein precipitation sample preparation method for LC-ESI-MS/MS analysis of saliva was developed, which would allow the simultaneous identification and quantification of amphetamines (amphetamine, methamphetamine, MDA, MDMA and MDEA), opiates (codeine, morphine and 6-monoacetylmorphine) and cocaine with its metabolite benzoylecgonine in one single experiment. To 200 pL of saliva, 100 pL of methanol (containing standards and internal standards) and formic acid were added, followed by vortex mixing and centrifugation at high speed. The supernatant was neutralised with ammonia and 50 pL was injected on a phenyl type column ( 100 x2.1 mm) which was eluted with a mixture of water, methanol and ammonium formate in a gradient system. A validation of the method was performed, consisting of linearity evaluation, within-day and total-repoducibility, stability of the compounds during analysis, precision and absence of matrix suppression. As judged by todays bioanalytical validation criteria, the method seemed successful, except for the presence of matrix suppression, which caused erroneous results when analysing the saliva of different individuals spiked with exactly the same quantity of the drugs. To ascertain this conclusion, matrix suppression was further investigated by the continuous postcolumn introduction of MDMA, during the analysis of a blank saliva sample. This allows a visualisation of the ionization 156

suppression by the matrix components, during the entire chromatographic run. It was seen that the ionization was disturbed for almost the entire run. In order to avoid this, a more aggressive protein precipitation was developed. A high amount of actonitrile (five times the sample volume) and methanolic hydrochloric acid were added to the saliva sample. After centrifugation an amount of supernatant was evaporated and reconstituted. In another experiment an extra ultrafiltration step was incorporated. However, both procedures still suffered from an extensive matrix suppressive effect. Therefore, it was concluded that the LC-ESI-MS/MS analysis of saliva, preceded by an aselective sample preparation, can seriously suffer from ionization suppression by endogenous compounds. Our data clearly demonstrate the need to include evaluation of a suppressive effect by matrix constituents in a validation procedure. This work was supported grant GOA99-120501.99 and by Eur. Comm. grant SMT4-CT98-2257.

Oral Fluid Testing in Road Traffic - The German Experience within the ROSITA Project
S. STEINMEYER, H. OHR, M. R. MOELLER, Institute of Legal Medicine, Saarland 66421 Homburg/Saar, Germany University,

The German objective of workpackage 4 of the EU project ROSITA was to examine the performance of different drug test systems directly at the roadside, as equipment of the Saarland, traffic police and done at traffic controls. In addition to seven different urine test systems, devices for the testing of saliva and/or sweat were also used by the police officers: Drugwipe (Securetec GmbH), single tests COC (58 tests performed: 54 visual + 4 electronically read out, no failures), OP I (62 tests performed: 61 visual + 2 electronically read out, no failures), AMP ( 147 test performed: 137 visual + 10 electronically, no failures) Oral Screen (Avitar Inc.), 3-panel test CAN-COCOPI (10 tests performed: thereof 6 failures), ToxiQUICK (Biomar), 5-panel test CAN-COC-OPImAMP-BZO-MTD + single test AMP (1 test performed: thereof 1 failure). In practice, it quickly appeared that both OralScreen and ToxiQUICK are presently not acceptable for the police work. In contrary, the Drugwipe test system was accepted and can be seen as useful help for the officers, especially in connection with an electronic reader which minimised the permanent problem of unclear results. The police officers have assessed all the test devices via

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n 2, 2001

standardised questionnaires, which in total give a clear overview about advantages and disadvantages, test usability and handling in police routine. The officer's favourite specimen for testing is sweat, followed by saliva, and both matrices are assessed as more practicable for testing than urine. However, due to the short time of experience and to manual and analytical problems (collection methods, dependency of consistence of specimen, reading, not all substances covered), at this point of time the saliva/sweat tests were ranked behind the urine tests by the police officers, although they would prefer to work with these specimens. The analytical evaluation of the roadside tests was done on basis of the obtained results of serum analysis according to the legal requirements. The statistical parameters for the read-out Drugwipe tests are: Sensitivity: COC 62,50 %, OPI 88,89 %, AMP 100 %. Specificity: COC 74,29 %, OPI83,78 %, AMP 51,06 %. Accuracy: COC 72,09 %, OPI 85,54 %, AMP 80,00 %. PPV: COC35,71 %, OPI 72,73 %, AMP 75,00 %. NPV: COC 89,86 %, OPI 93,94 %, 100,00 %. Unfortunately, there are only a few results for the electronically readout Drugwipe tests (due to the late involvement of the reader into the German field study) and for the Oral Screen and ToxiQUICK; therefore, in terms of sensitivity, specificity etc., the data do not allow to make any statements.

The use of oral fluid and sweat wipes for the detection of drugs of abuse in impaired drivers
NELE SAMYN, BART VIAENE, LAEREMANS, GERT D E BOECK, BART

National Institute of Criminalistics and Criminology, Vilvoordsesteenweg 100, 1120 Brussels, Belgium In march 1999, the Belgian parliament adopted a law on driving under the influence of certain psychoactive drugs. A driver is sanctioned if THC, cocaine, benzoylecgonine, morphine, amphetamine, MDMA, MDEA or MBDB are detected in blood in concentrations exceeding the analytical cut-off values mentioned in the law. An initial suspicion of impairment is established using a limited drug recognition test battery, followed by a urine test on-site. During the course of this study, newly trained police officers evaluated over two hundred drivers. For over a hundred subjects, oral fluid (obtained by spitting) and sweat samples (obtained with a sweat wipe moistened with 70% of isopropanol) were quantitatively analysed and compared to the corresponding blood and urine results. The reliability of Drugwipe (Securetec, Germany) in an on-site situation is assessed by means

of the blood, saliva and sweat confirmatory results obtained with GC-MS. The prevalence of positive samples was high due to the selection of subjects before sampling. The probability that a positive oral fluid result for a certain drug class will match a positive blood result is expressed as the positive predictive value (PPV). PPV s were excellent (>90 %)for amphetamines, cocaine and cannabis. Due to the low prevalence of opiates in our study, the PPV of 78 % for opiates needs to be taken with caution. These values are calculated when the limit of detection for both bodyfluids was taken as the cut-off value. When the legal limits for blood were applied, in addition to the proposed SAMHSA cut-off values for oral fluid, the PPV remained high for amphetamines, cocaine and cannabis but decreased for opiates. The probability that a positive sweat wipe result matched a positive blood result was lower than for oral fluid in the cannabis and opiates class, but remained high for cocaine and amphetamines. The sensitivity of the Drugwipe test on the tongue varies between 45 % for opiates and 77 % for amphetamines, when saliva is taken as the confirmatory matrix. The sensitivity of the Drugwipe sweat test in the detection of opiates, cocaine and amphetamines is respectively 62 %, 67 % and 92 %. The agreement between Drugwipe results and blood analysis is acceptable for amphetamine and/or MDMA, especially when using sweat as the screening matrix. Undoubtedly, oral fluid and sweat offer a better noninvasive way of screening at the roadside because of the possibility of direct supervision. Saliva analysis is the only alternative to blood sampling to assess impairment related to drug abuse. For roadside testing purposes, a screening test should only require a small amount of sample to facilitate the collection. The Drugwipe test uses a simple procedure. Sweat testing is very easy in a DUID situation but external contamination of the skin needs to be taken into consideration. Any correlation with the presence of a pharmacological effect at the time of sampling is ruled out. However, as an indication of potential drug abuse and in addition to the drug recognition test battery, sweat testing might be preferable to urine testing.

Detection of Fluoxetine Norfluoxtine in Saliva


FIONA M. WYLIE, JOHN S. OLIVER,

and

Department of Forensic Medicine & Science, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ, Scotland U.K. Fluoxetine and norfluoxtine were identified in the sali-

157

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIII, n2, 2001

va of patients receiving treatment for depression. A method was developed and validated to detect fluoxetine and its metabolite in this biological specimen. Saliva samples were collected with Omni-Sal devices and the analytes were extracted using solid phase extraction. Internal standard, tumoxetine was added to the samples which were then diluted with phosphate buffer and applied to preconditioned cyanopropyl columns. Various wash steps were carried out followed by elution with dichloromethane/isopropanol (8:2) containing 2 % concentrated ammonia. Samples were derivatized with heptafluorobutyric anhydride and detected by gas chromatography/mas s spectrometry using selective ion monitoring. Recoveries greater than 86 % were achieved for both analytes over a linear range of 0-100 ng/ml saliva. The limit of detection was 1 ng/ml. Eight saliva case samples were analyzed and concentrations in the range of 22.1-223.2 ng/ml (mean 72.0 ng/ml) were obtained for fluoxetine and 33.2-143.3 ng/ml (mean 74.8 ng/ml) for norfluoxtine. Six of these eight samples gave higher concentrations for the metabolite than the parent drug. Corresponding blood and saliva samples for three patients were analyzed and saliva/plasma ratios within the limits of theoretical values were achieved. The methods easily detected both fluoxetine and norfluoxtine in all of the saliva samples tested. .

unavoidable. Here we present the development of an alternative method. Amphetamines were isolated from plasma using a simple methanol extraction procedure and subsequently analysed using reversed phase HPLCMS/MS. A Quattro Ultima (Micromass) tandem mass spectrometer fitted with a z-spray ion source was used for the analyses. The instrument was operated in electro spray positive ionisation mode and was coupled to a Waters 2690 Alliance HPLC system. The mobile phase (A: WmM ammonium acetate /B: 95 % acetonitrile, 5 % lOmM ammonium acetate) (85/15) was delivered at a flow rate of 0.3 ml/min. A Hypersil BDS CI 8 column (100 mm x 2.1 mm, 3.5 pm) was used. Quantification of the drugs and their deuterated analogues was performed using multiple reaction monitoring (MRM). The developed method, which has a chromatographic run time of less than 10 minutes, enables the simultaneous quantitation of MDMA, MDA, MDEA, amphetamine, methamphetamine and ephedrine in a single analysis. Limits of detection of 1 ng/ml plasma or better were achieved. In addition, to assess the feasibility of using saliva as a convenient, non-invasive marker of drug abuse, the method has been used for the quantitation of the commonly abused amphetamines in saliva samples collected from current users. These levels will be compared to corresponding levels in plasma and urine as determined by GC-MS.

Measurement of Amphetamines Biological Samples by LC-MS/MS


(l) (2)

in
(1)

MICHELLE WOOD , MICHAEL MORRIS , D O N A L D P COOPERA, GERT DE BOECK , NELE SAMYN< , JAN CLAEREBOUDT ,
2) (3)

Immunochromatographic teststrips for saliva analysis


JRG ZIMMERMANN , NELE SAMYN , MARIA DA COSTA >, T H O M A S W U S K E \ RAINER POLZIUS , HANS-JRGEN DUCHSTEESP,
(3 (3 (3) (I) (2)

(1) Micromass U K Ltd., Floats Rd, Manchester, M23 9LZ, UK. (2) National Institute for Criminalistics Criminology (NICC), Brussels, Belgium. (3) Micromass Belgium, Vilvoorde, Belgium. The identification and quantification of drugs of abuse in biological specimens is of great importance. Traditionally, this has been a two-step procedure i.e. initial screening for classes of substances e.g. amphetamines (using immunoassay) followed by confirmation of the particular drug (s) using a more specific method. The sensitivity and specificity of gas chromatography/mass spectrometry (GC-MS) has made this the technique of choice for confirmation in most laboratories. However, the procedure is very labour-intensive and time-consuming particularly as sample preparation i.e. solid phase extraction and derivatisation are and

(1) Universitt Hamburg, Institut fr Bundesstr. 45, D-20146 Hamburg (2) Nationaal Instituut voor Criminologie, Brussels, Belgium

Pharmazie, en

Criminalistiek

(3) Dragerwerke AG, D-23542 Lbeck Testing saliva for drugs of abuse is a challenging task. Although many aspects still need further research and development the analysis of drugs in saliva seems to be promising. A topic of interest is driving under the influence of drugs of abuse which is a major problem for traffic safety. Saliva could give information about the drug concentration in blood in a very rapid and easy way [1, 2]. Therefore we investigated the detection of these substances in oral fluid using a lateral flow immuno-chromatographic tests trip with competitive detection system e.g. decreasing signal for positive

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samples. Two different types of strips were designed. The first one is sensitive for opioids and cocaine and a second one for the detection of amphetamines. During this development the sensitivity was measured using aqueous solutions of the analytes. Having suitable test systems we studied the sensitivity with frozen saliva samples from persons being suspected of driving under the influence of drugs. 10 pl of saliva which represent the volume being collected on the tongue were pipetted on the test pin. The saliva was eluted onto the strip with 100 pl of buffer solution and the result could be determined after 2 min. Every sample was tested twice. After drying the strips the intensity of the two lines was measured using a scanner. The relation between the detection and control line signal was calculated and these values were compared with the results of a GC/MS analysis. The corresponding graphs will be presented together with images of typical teststrip results. Literature: 1. N. Samyn, A. Verstraete, C. van Haeren, P. Kintz, Analysis of Drugs of abuse in saliva. FORENSIC SCI REV, (1999) 11(1): 1-19 2. G.Skopp, L.Ptsch, Perspiration versus saliva- basic aspects concerning their use in roadside drug testing INT J LEGAL MED (1999) 112: 213-221.

Determination of MDMA ("Ecstasy") in saliva : a controlled study in recreational users


MONICA NAVARRO, MAG F A R R , SIMONA P I C H I N I , J O R D I ORTUO, PERE NOLASC ROSET, ESTER MENOYO, JORDI S E G U R A ' , RAFAEL DE LA T O R R E *
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Saliva and plasma samples were collected from eight healthy volunteers, recreational users of 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA). Subjects were administered with an oral 100 mg dose in a double blind, cross-over with random treatment assignment, balanced with placebo clinical trial. Parent drug and main metabolites were determined by gas-chromatography/mass spectrometry in both fluids and apparent pharmacokinetic parameters of MDMA in saliva were estimated. Saliva to plasma ratios were also calculated at each time interval and correlated to saliva pH. MDMA, 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA) and 4-hydroxy-3-methoxy methamphetamine (HMMA) could be detected in saliva. Peak MDMA concentration in saliva, was achieved at 1.5 hours after administration, (range 1728.9-6510.6 ng/ml). Then, salivary concentrations declined, reaching a mean concentration of 126.2 ng/ml by 24 hours after intake. Saliva to plasma ratio (S/R) of MDMA concentrations varied between 32.3 and 1.2 and presented a mean maximum value of 18.1 at 1.5 hours. Salivary pH appeared to be affected by MDMA administration. Salivary pH was 0.6 units (from 7.4 at predose to 6.8 at 4h) lower in the MDMA condition, that has to be compared with a 0.2 units reduction in the placebo condition. Lowest salivary pH values corresponded to the highest MDMA salivary concentrations and hence S/R showed to be strongly dependent on salivary pH. Several clinical variables (cardiovascular effects, psychomotor performance...) were correlated with plasma and saliva concentrations. The measurement of MDMA in saliva is a suitable alternative to plasma in clinical and toxicological situations. It may help to establish if subjects are under the influence of the drug, in a much less invasive way than with plasma and without specific requirements for sample collection, facilitating its on-site performance. Acknowledgements : This investigation was supported by: FIS 97/1198 and 98/0081, CIRIT 99-SGR-242 and PNSD (Spain).

(1) Department of Pharmacology, Institut Municipal d'Investigaci Mdica (IMEM), (2) Universitat Autnoma de Barcelona, (3) Clinical Biochemistry Department, Istituto Superiore di Sanit, Roma, Italy, (4) Universitat Pompeu Fabra, Dr. Aiguader 80, Barcelona 08003, Spain, Tlf : 34 93 221 10 09 - Fax : 34 93 221 32 37 - E-mail : rtorre@imim.es Saliva is an alternative biological matrix for drugs of abuse testing with several advantages over conventional matrices such as blood and urine. Collection is rapid and non-invasive. Several reports have detailed the appearance of drugs of abuse in saliva, but few have presented the excretion profile of amphetamines and related compounds after a controlled administration.

Determination of MDMA ("Ecstasy") in saliva with Drugwipe analytical device: a controlled study in recreational users
MONICA NAVARRO, MAG FARR , SIMONA P I C H I N F , PIERGIORGIO ZUCCARO >, ROBERTA PACIFICI, JORDI ORTUO, P E R E N O L A S C ROSET, ESTER MENOYO, JORDI S E G U R A , RAFAEL DE LA T O R R E *
3) (3 (14) 0 2) (12)

(1) Department of Pharmacology, Institut Municipal d'Investigaci Mdica (IMIM),

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(2) Universitat Autnoma de Barcelona, (3) Clinical Biochemistry Department, Istituto Superiore di Sanit, Roma, Italy, and Universitat Pompeu Fabra, Dr. Aiguader 80, Barcelona 08003, Spain, Tlf : 34 93 221 10 09 - Fax : 34 93 221 32 37 - E-mail : rtorre@imim.es Recently, saliva has been used to realise on-site tests with special devices that permit to perform drug assays immediately at the site of specimen collection. These assays on saliva proved to be sufficiently sensitive for the detection of recent cocaine and amphetamine abuse in suspected users. However, the application of on-site testing of saliva after controlled administration of amphetamine or related compounds was never performed. Eight healthy volunteers, recreational users of 3,4methylenedioxymethamphetamine (MDMA), were administered with an oral 100 mg dose in a double blind, cross-over with random treatment assignment, balanced with placebo clinical trial.. Drugwipe Amphetamines analytical device was wiped on the tongue of the subjects at different time-intervals ranging from 0 to 24 hours after administration. Furthermore, at each time, a saliva sample (1-2 ml) was obtained by spitting into a plastic tube. The test was reapplied in the laboratory by pipetting 2 ml of saliva on the device pad. The colour reaction in the test-area of the Drugwipe was measured with the Drugread hand photometer. Quantitative analyses of salivary samples were also performed by GC/MS. Drugwipe performed better if applied to a saliva sample in the laboratory than directly on the tongue. At 1.5 and 4 hours after drug administration, 100% subjects gave a positive result, while at 6 hours after treatment 1 out of 8 subjects gave a negative result. At 24 hours, no positive results were observed. Saliva samples from placebo treatment never showed a false positive result. Negative results were observed when MDMA salivary concentrations were under 650 ng/ml. Although the number of subjects participating in this study is limited, the results support saliva testing with Drugwipe and Drugread for monitoring MDMA in the early hours after its use. It may help to screen potentially intoxicated drivers in roadside on site- testing and in the workplace drug testing, when appropriate confirmation with a chromatographic method in saliva can be performed. This investigation was supported by: FIS 97/1198 and 98/0081, CIRIT 99-SGR-242 and PNSD (Spain), Dipartimento Afifari Sociali (Italia), Securetec.

Elimination kinetics of oral nandrolone in urine and saliva


V. CIRIMELE, P. KINTZ, B. LUDES, Institut de Mdecine Lgale, Laboratoire de Toxicologie, 11 rue Humann, 67085 Strasbourg Cedex (France) Athletes use exogenous anabolic steroids such as nandrolone because it has been claimed that they increase lean body mass, strength, aggressiveness and lead to a shorter recovery time between workouts. To document nandrolone exposure, the target analytes are the glucoronoconjugated metabolites norandrosterone (NA) and noretiocholanolone (NE) in urine. In the recent years, remarkable advances in sensitive analytical techniques have enabled the analysis of drugs in unconventional biological specimens such as saliva. Saliva has been increasingly used as an analytical tool in pharmacokinetic studies, therapeutic drug monitoring and for the detection of illicit drugs. To the best of our knowledge, no data seems available for the detection of any anabolic in human saliva. In order to study the elimination kinetics of nandrolone in human, nandrolone sulfate (22 mg) was administered orally to a 28-year-old male. Urine and saliva specimens were collected during 48 hours and extracted according to our previously published procedure (1). Briefly, urine (2.5 ml) and saliva ( 1 ml) samples, spiked with 25 ng of the deuterated analog of NE, were extracted using 1solute CI 8 columns. After elution with methanol (3 x 0.5 ml), the extract was dried, hydrolysed with fi-glucuronidase at pH 7.0 (lh at 50C) and purified with pentane. The drivtized (MSTFA/NH I/2mercaptoethanol) steroids were detected by GC/MS in the SIM mode of acquisition.
4

In urine, nandrolone was detected 1 hour after administration and for 10 hours. NA and NE were detectable for 48 hours. In saliva, nandrolone was detected only 1 hour after administration (13 ng/ml). NA was never detected and NE tested positive for 9 hours with concentrations ranging from 0.7 to 2.6 ng/ml. The concentrations observed in saliva are largely lower than those detected in urine, with a different kinetic profile for the metabolites elimination (NA>NE in urine, NA never detected in saliva) and a smaller detection window (more than 48 hours in urine against 10 hours in saliva). The advantages of this sample, over traditional media like urine or blood, is almost a non invasive and easy collection procedure with low risks of adulteration or substitution. Nevertheless, the low elimination rate of nandrolone from saliva lets presume that this medium is not suitable to detect nandrolone.

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In conclusion, saliva does not constitute a suitable specimen for doping control of anabolics. References 1- P. Kintz, V. Cirimele, H. Sachs, T. Jeanneau and B. Ludes, Forensic Sci. Int., 101 (1999) 209.

Determination of Cocaine and Metabolites in Saliva by GC/MS-EI


P. C M P O R A O., A.M. B E R M E J O TABERNERO, P. FERNNDEZ, B.,

its
M.J.

Institute of Legal Medicine. University of Santiago of Compostela. Faculty of Medicine. San Francisco s/n. Santiago of Compostela. Spain. A simple analytical method for the simultaneous determination of Cocaine and its main metabolites, ecgonine methyl ester (EME) and benzoylecgonine (BEG) in saliva was developed. A procedure of extraction liquidliquid with Toxilab (distributed by Dipesa, Spain), derivatization with N, O-bis-trimethylsilyl-trifluoroacetamide (BSTFA) and trimethylchlorosilane (TMCS, 1 Wo), and subsequent analysis by gas chromatography/ mass spectrometry (GC/MS) in SIM mode have been carried out. The answer of the detector was linear in a concentration range of 25-1000 ng/ mLfor each analyte, with a reproducibility of 4.33 % for EME, 9.55 % for Cocaine and 5.49 % for BEG, and a recovery of extraction of 99.15 Wo, 98.78 % and 106.97 Wo, for EME, Cocaine and BEG, respectively, at a concentration of300 ng/mL The limits of detection (LOD) were 1.7 ng/mL for EME, 0.2 ng/mL for Cocaine and 4.2 ng/mL for BEG and the limits of quantification (LOQ) were 5.7 ng/mL for EME, 0.8 ng/mL for Cocaine and 14.1 ng/mL for BEG. Finally, the method was applied to 40 real samples of saliva, collected with Salivette (Sarstedt), 24 of them positive for cocaine, 18 for BEG and 12 for EME. In view of the obtained results, we concluded that the saliva is an alternative biological sample for the determination of cocaine and their metabolites.

were obtained from drivers suspected to be driving under the influence of drugs. Both police and physicians made an impairment evaluation of the suspected drivers. The police were trained to do the on-site tests. The on-site results were compared with laboratory results, Gas Chromatography-Mass Spectrometry methods covering up to 200 commonly abused substances. The samples were tested for amphetamines (AMP), cannabinoids (THC), opiates (OPI) and cocaine metabolites (COC) by the on-site devices. Some of the devices also included a metamphetamine (MET) and a benzodiazepine (BZO) test. Both positive and negative samples were tested. A total of 800 persons and eight on-site devices for urine and two for oral fluid testing were included in this study. Good results were obtained for the urine on-site devices, with accuracies of93-99 %for amphetamines, 97-99 Wo for cannabinoids, 94-98 Wo for opiates and 90-98 Wo for benzodiazepines. However, differences in the ease of performance and interpretation of test result were observed. Particularly one of the oral fluid devices was difficult to interpret and the other was difficult to use. It was possible to detect amphetamines and opiates in oral fluid by the used on-site devices, but the benzodiazepine and cannabinoid tests didn't fulfil the needs of sensitivity.

The Finnish experience from the ROSITA project


MAREELLE G R N H O L M , PIRJO LILLSUNDE, National Public Health Institute, Laboratory of Substance Abuse, Mannerhemintie 166, 00300 Helsinki, Finland In the Finnish part of the Road Side Testing Assessment (ROSITA) evaluation both urine and saliva devices were included. The saliva devices were performed roadside by police and urine in a laboratory. Samples 161