GENETIQUE

BACTERIENNE
Introduction
A. Les mutations
I- Définition :
II- Les différents types de mutation :
B. Les transferts génétiques
I- Transformation :
Découverte de la compétence naturelle chez les bactéries,
Transformation naturelle
Transformation artificielle
II-Conjugaison :
F+ conjugaison ; Hfr conjugaison ; conjugaison interrompue ; sexduction ;
résistance plasmide conjugaison
III- Transduction : transduction généralisée et transduction spécialisée
IV-Recombinaison:
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 Introduction
La génétique:
Science de la variation et de l'hérédité: étude chez
les organismes doués de reproduction sexuée, du croisement
ou hybridation entre races ou variétés de la même espèce.

Les bactéries:
Sont des êtres unicellulaires qui possèdent les éléments
essentiels à la vie cellulaire.
Leur taille varie de 1 à 10 microns (μm). Elles ne sont donc
visibles qu'au microscope optique (×103 ) ou au microscope
électronique (×106).

Est-ce que les bactéries sont concernées par l’analyse génétique ?

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 Au départ, les bactéries étaient considérées comme peu favorables
à l'analyse génétique pour 2 raisons principales:

 L’absence visible de différences morphologiques : liée à la taille

des bactéries (de l’ordre de quelques μm);
 L’absence de spécialisation de la cellule : une cellule bactérienne
donne naissance à deux bactéries puis à 1010 ,toutes les bactéries
sont identiques entre elles et identiques à la cellule mère. On ne
distingue pas de forme germinale ou somatique comme c’est le cas
chez les cellules supérieures.

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Cependant, les bactéries peuvent subir des variations qui seront
transmissibles au cours des générations.

Exemple de variations bactériennes

-Aspect de la colonie
-Dépigmentation de la culture
-Perte de la virulence (capsule) chez le pneumocoque
-Caractère de fermentation (lactose)
-Croissance sur milieu minimum (mutant reverse His+)
-Acquisition de la résistance à un antibiotique

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Ces variations touchent le matériel génétique de la bactérie
(ADN):

 La bactérie possède généralement un seul chromosome

circulaire de taille très variable;
 Le chromosome bactérien est de 1 mm de long (1000 fois la
longueur de la bactérie) et 3 à 5 nanomètres de large: il est
surenroulée dans le cytoplasme grâce à l'action des
topoisomérases (au nombre de 4 chez les bactéries).
 Plusieurs espèces bactériennes ont leur génome séquencé:
E coli: 4700 kb
Pseudomonas aeruginosa: 5900kb
 Cet ADN peut être l'objet de variations qui se traduisent par
l'apparition de différences héréditaires dans les structures et/ou
les fonctions permanentes des bactéries

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Les variations génétiques ou génotypiques résultent d'une:

Mutation,
Transformation,
Conjugaison,
L'acquisition d'un plasmide,
Transduction

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A- Mutations
I. Définition:
 La mutation se définit comme une modification héréditaire du matériel
génétique (génotype). Elle peut être spontanée ou induite par des mutagènes.
 La majorité des mutations se produisent de manière spontanée, ce qui veut dire
que ce sont des évènements statistiquement aléatoires et imprévisibles. Les
mutations spontanées ont lieu à une faible fréquence: une cellule parmi 10 5-108.
 Donc, si un nombre élevé de mutants est nécessaire pour des analyses
génétiques, les mutations doivent être induites.
 L’induction de mutations est accomplie en traitant les cellules avec des
mutagènes.
 La production de mutations à travers l’exposition à des mutagènes est appelée
mutagénèse et l’organisme est dit mutagénisé. 8
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II- Les différents types de mutation

Toutes les mutations proviennent de modifications dans la séquence nucléotidique de

l’ADN ou de délétions d’insertions ou de réarrangements des séquences d’ADN.

II-1- Substitution de base:

Le type le plus simple de mutations est la substitution de base, où une paire de
nucléotides dans une molécule d’ADN double-brin est remplacée par une paire
différente.
Mutation de transition: une substitution de base qui remplace une base
pyrimidine par une autre ou qui remplace une base purine par une autre.

Mutation de transversion: une substitution de base qui remplace une

pyrimidine par une purine ou une purine par une pyrimidine.

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II-2- Insertion et délétions
II-3- Effets des mutations dans les régions codant des
protéines
Effet des substitutions de bases:
Substitutions synonymes ou silencieuses: pas de changement phynotypique

Mutations faux-sens: remplacement d’un acide aminé par un autre. Ceci peut
altérer les propriétés biologiques de la protéine.
Mutation non sens: une substitution de base qui crée un nouveau codon stop
UAA, UAG ou UGA. Obtention d’une protéine tronqué.

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Exemple:

E6V β-globine (substitution

de paire de bases A-T en T-
A): β-globine défectueuse.
formation de longs cristaux
d’hémoglobine polymérisant
en filaments de hauts PM /
globules rouges déformés

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 Effet des délétions / insertions:

Généralement, l’insertion et la délétion conduisent à des décalages du cadre de

lecture par le ribosome, et donc altèrent tous les acides aminés en aval du site de
mutation.
Les mutations qui décalent le cadre de lecture des codons dans l’ARNm sont
appelées mutations de décalage de cadre de lecture.

Un type fréquent de mutation de décalage de cadre de lecture est l’addition ou la

délétion d’une seule base.
Exemple:

Leu Leu Leu Leu

CUG CUG CUG CUG

CUG CAU GCU GCU G

Leu His Ala Ala

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 B- Les transferts génétiques
I- Transformation

La transformation: est un processus par lequel l’ADN étranger

est incorporé par une cellule bactérienne réceptrice.

Découvert par Griffith en 1928, le phénomène de transformation n’a

été compris qu’en 1944 à la suite des expériences d’Avery, MacLeod
et MacCarty.

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1. Découverte de la compétence naturelle (Griffith 1928)

Streptococcus pneumoniae
Souche (S) capsulée:
virulente
Souche (R) non capsulée:
non pathogène

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Facteur à partir de souche (S) tuée à la chaleur:

responsable de la conversion de (R) en (S) 15
 -Injection de pneumocoques (S): septicémie mortelle

- Injection de pneumocoques (S) tués à la chaleur:

ne provoque pas la mort de la souris
- Injection de pneumocoques (R) :
ne provoque pas la mort de la souris
- L’injection d’un mélange:
pneumocoques (S) tués à la chaleur + pneumocoques (R):
provoque la mort de la souris

Substances à partir des pneumocoques (S) tués à la chaleur:

responsable de la transformation des bactéries (R) vivantes non
capsulées en bactéries (S) capsulées et virulentes
(polyholosides capsulaires?)
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 Découverte: ADN facteur transformant
(Avery, McLeod, McCarty 1944)

Avery et collaborateurs:
- Les extraits (ne contenant pas de cellules) issus de souche (S) tuée à
la chaleur: induisent la transformation.
La fraction active purifiée à partir de ces extraits s’est avérée l’ADN

L’ADN codant la synthèse de capsule est libéré par la souche (S)

tuée à la chaleur est capturé par la souche (R) la transformant
ainsi en souche (S)
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18
 2. Transformation bactérienne naturelle

 Certaines bactéries sont naturellement capables de capturer l’ADN

(cellule compétente) à un stade particulier du cycle de croissance
(état de compétence: fin de phase exponentielle) lorsqu’elles
produisent une protéine spécifique appelée: facteur de
compétence.
 Les cellules compétentes fixent +que 1000 fois l’ADN en
comparant avec les cellules non compétentes
 Au sein d’un genre bactérien transformable: seulement certaines
souches ou espèces sont transformables
 La compétence chez la plupart des bactéries transformables est
régulée. Des protéines spécifiques jouent un rôle dans la capture et
le traitement de l’ADN.

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 Les étapes impliquées dans la transformation naturelle sont:
1- Une bactérie donatrice meurt et se dégrade;

2- Un fragment d’ADN issu de la bactérie donatrice se fixe à des

protéines de liaison au niveau de la paroi cellulaire d’une bactérie
réceptrice vivante et compétente;
3- Une nucléase coupe l’ADN fixé en fragments;
4- Parfois un brin d’ADN est dégradé par une nucléase et l’autre
pénètre dans la cellule réceptrice. Dans d’autres cas, l’ADN est capturé
par la cellule réceptrice sous forme double brin. Après capture, l’ADN
est attaché à une protéine spécifique de compétence pour échapper à la
dégradation par les nucléases jusqu’à ce qu’il atteint le chromosome .
5- La protéine RecA favorise la recombinaison homologue entre le
fragment d’ADN et l’ADN chromosomique de la souche réceptrice
(intégration dans le génome de la souche réceptrice) 20
Compétence naturelle chez Bacillus subtilis
(facilement transformable)
Les cellules produisent et excrètent durant leur croissance un peptide
de petite taille. L’ accumulation de ce peptide à des concentrations
élevées induit les cellules pour devenir compétentes.
Chez Bacillus, environ 20% des cellules deviennent compétentes et
restent dans cet état pendant plusieurs heures.
Par contre chez Streptococcus, 100% des cellules deviennent
compétentes, mais seulement pour une période brève durant le cycle
de croissance.

Cellules de B. subtilis en phase stationnaire

(P comK - gfp)
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3. Transformation artificielle
Transfert d’ADN à des bactéries très faiblement transformables naturellement
(Escherichia coli et autres bactéries à Gram-):

Favoriser la compétence chez E. coli:

 Transformation par choc thermique:
 Cellules traitées avec de fortes concentrations en calcium et puis incubées
dans la glace pour plusieurs minutes deviennent compétentes (capables de
capturer l’ADN double brin).
 La transformation de ces cellules compétentes est réalisée en mélangeant
l’ADN plasmidique avec les cellules, incubation du mélange pendant 30 min
dans la glace et par la suite un choc thermique est appliqué pendant 2 min
à 42 °C pour favoriser l’entrée de l’ADN dans les cellules.
 Les cellules transformées sont par la suite incubées en milieu LB pendant 60
à 90 min à 37 °C pour favoriser l’établissement du plasmide et le gène de
résistance aux antibiotique qu’il porte.
 Les cellules sont ensuite étalées sur milieu sélectif pour la propagation des
cellules recombinantes hébergeant le plasmide.

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  Transformation par électroporation:

 Cellules en phase exponentielle (DO 600 nm ~ 0.8) lavées avec de l’eau

stérile glacée , puis glycérol 10% glacé et repris dans un petit volume de
glycérol 10% glacé.
 La transformation de ces cellules est réalisée en mélangeant l’ADN
plasmidique avec les cellules, incubation du mélange pendant 1 min
dans la glace et application d’un pulse: 2.5 kV, 200 Ohms, 25 µF.
 Les cellules transformées sont par la suite incubées en milieu LB
pendant 60 à 90 min à 37 °C pour favoriser l’établissement du plasmide
et le gène de résistance aux antibiotiques qu’il porte.
 Les cellules sont ensuite étalées sur milieu sélectif pour la propagation
des cellules recombinantes hébergeant le plasmide.

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 Notion d’efficacité de transformation:
Nombre de transformants (colonies isolées)/µg d’ADN

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