INSTITUT PASTEUR DALGERIE

MICROBIOLOGIE DES LAITS ET PRODUITS LAITIERS

F.MOUFFOK

I . PREPARATION DES ECHANTILLONS .

I.1. Prise dessai . Les laits tant des produits liquides constitueront demble donc une solution mre. Les produits laitiers ( laits secs en poudre, yaourt, fromages, desserts lacts et autres tant des produits solides, feront lobjet de dilutions dcimales, mais au pralable il est ncessaire de procder leur !omognisation laide de tec!niques et dappareils appropris ("royeurs !omognisateurs, #tomatc!er ..$ . Les prises dessai sont effectues sur lc!antillon !omognis en tenant compte de deu% facteurs essentiels sa&oir ' le nombre de pices soumises lanalyse dune part, les oprations analytiques conduire ... (ais, en gnral, on prl&e trois fois )* ml ou )* gr ' les premiers ser&iront lanalyse bactriologique courante, les seconds ser&iront la rec!erc!e de #almonella + #!igella, les troisimes ser&iront la rec!erc!e des Listeria. I.). ,as des produits liquides. -ans le cas des produits liquides, le mlange de trois cinq sac!ets de lait par e%emple constituera la solution mre (#( . 1$. Dilutions d !i"#l$s % Introduire ensuite asptiquement laide dune pipette en &erre gradue et strile, 1 ml de la #(, dans un tube &is strile contenant au pralable / ml du m0me diluant ' cette dilution est alors au 1112 ou 1231. Introduire par la suite 1ml de la dilution 12 31 dans un tube &is strile contenant au pralable / ml du m0me diluant ' cette dilution est alors au 11122 ou 123) . Introduire ensuite aseptiquement laide dune pipette en &erre gradue et strile, 1 ml de la dilution 123) dans un tube &is strile contenant au pralable / ml du m0me diluant 4 cette dilution est alors au 111222 ou 1235 . 6oir sc!ma n71. I.5.,as des produits solides. -ans le cas des produits solides, introduire aseptiquement )* grammes de produit analyser dans un bocal strile pralablement tar ou dans un sac!et strile de type 8 #tomatc!er 9 contenant au pralable ))* ml de diluant soit le :#; ( :ryptone #el ;au $ . <omogniser. ,ette suspension constitue alors la dilution mre (-($ qui correspond donc la dilution 1112 ou 1231. Dilutions d !i"#l$s % Introduire ensuite aseptiquement laide dune pipette en &erre gradue et strile 1ml de la -(, dans un tube &is strile contenant au pralable / ml du m0me diluant ' cette dilution sera alors au 11122 ou 123). Introduire par la suite 1ml de la dilution dans un tube &is strile contenant au pralable / ml du m0me diluant ' cette dilution est sera alors au 11122 ou 1235.

Introduire ensuite aseptiquement laide dune pipette en &erre gradue et strile, 1 ml de la dilution 1235 dans un tube &is strile contenant au pralable / ml du m0me diluant ' cette dilution est alors au 111222 ou 123= . 6oir sc!ma n7).

,es dilutions ser&iront la rec!erc!e des germes sui&ants ' >ermes arobies msop!iles totau% ,oliformes totau% et fcau% #tap!ylococcus aureus Le&ures et (oisissures. ?emarques ' 1. @u moment de la ralisation des dilutions dcimales, il est impratif de c!anger de pipettes entre c!aque dilution.
2.

,ontrairement cela, lors de lensemencement il est recommander de commencer par la plus forte dilution sa&oir 1235 dans le but justement de ne pas c!anger de pipettes. An tra&aillera alors laide dune pipette gradue en &erre strile de * ml.

1 ml

1 ml

/ ml / ml L@I: :#; #(' 1 1231 123) :#;

#c!ma n71 ' ,as des Produits Liquides.

1ml

1ml

)* gr dans ))* ml :#;

/ ml :#;

&'L# t$!(ni)u$ $n "ili$u li)uid$ fait appel deu% tests conscutifs sa&oir ' le test de prsomption ' rser& la rec!erc!e des ,oliformes totau%. le test de confirmation ' appel encore test de (ac BenCie et rser& la rec!erc!e des ,oliformes fcau% partir des tubes positifs du test de prsomption. Test de prsomption. Prparer dans un portoir une srie de tubes contenant le milieu slectif (6"L$ raison de trois tubes par dilution. @ partir des dilutions dcimales 1235 1231, porter aseptiquement 1 ml dans c!acun des trois tubes correspondant une dilution donne comme lindique le sc!ma n7=. ,!asseC le gaC prsent &entuellement dans les cloc!es de -ur!am et bien mlanger le milieu et linoculum. Incubation ' Lincubation se fait 5D7, pendant )= =E !eures. Lecture ' #ont considrs comme positifs les tubes prsentant la fois ' un dgagement gaCeu% (suprieur au 1112 de la !auteur de la cloc!e $, un trouble microbien accompagn dun &irage du milieu au jaune (ce qui constitue le tmoin de la fermentation du lactose prsent dans le milieu$. ,es deu% caractres tant tmoins de la fermentation du lactose dans les conditions opratoires dcrites. La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table de (ac >rady qui se trou&e en anne%e. Illustration ' Inoculum 6 " L. :est de Prsomption Fbre ,aractristique 31 12 G G G * 123) G G 3 + 35 12 3 3 G & Le nombre caractristique est donc 8 *+& 9 4 ce qui correspond sur la table de (ac >rady au nombre 1*. An considre alors quil y a 1* ,oliformes par gramme de produit la dilution 1231. Pour obtenir le nombre rel de ,oliformes totau%, il suffit de multiplier ce nombre par lin&erse de la premire dilution pour re&enir 1 soit ' 1* H 12 . &,- ,oliformes totau% par gr de produit analyser.

 Test de confirmation ou test de Mac Kenzie. Les tubes de 6"L trou&s positifs lors du dnombrement des ,oliformes totau% feront lobjet dun repiquage laide dune Ise boucle dans la fois ' 3 un tube de 6"L muni dune cloc!e et sur, 3 un tube deau peptone e%empte dindole, comme lindique le sc!ma n7*. ,!asser le gaC prsent &entuellement dans les ,loc!es de -ur!am et bien mlanger le milieu et linoculum. Incubation ' Lincubation se fait cette fois3ci au bain marie Lecture ' #ont considrs comme positifs, les tubes prsentant la fois ' un dgagement gaCeu% dans les tubes de 6"L, un anneau rouge en surface, tmoin de la production dindole par ;sc!eric!ia ,oli aprs adjonction de ) 5 gouttes du ractif de BoJacs dans le tube deau peptone e%empte dindole. La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table de (ac >rady en tenant compte du fait que ;sc!eric!ia ,oli est la fois producteur de gaC et dindole ==7,. Illustration ;n reprenant le%emple prcdent relatif au dnombrement des ,oliformes totau% , cela suppose que nous a&ons K tubes repiquer sa&oir ' 5 tubes de la dilution 1231 ) tubes de la dilution 123) 1 tube de la dilution 1235. Inoculu m 12
31

==7, pendant )= !eures.

:est de Prsomption 6"L.5D 7 , . G G G G 3 3 3 G

Fbre :est de ,onfirmation ,aractristique 6"L.==7, ;.P.;.I G G G 3 G G G 3 G G

Fbre ,aractristique

* + &

+ & -

123) 1235

:ableau ?capitulatif Le nombre caractristique relatif au dnombrement des ,oliformes fcau% est donc 8 +&- 9, ce qui correspond sur la table de (ac >rady &/, la dilution 1231.
5

(ais pour re&enir 1, il faut multiplier ce nombre par lin&erse de la premire dilution sa&oir ' 1,* H 12 . 1* ,oliformes fcau% par gr de produit analyser. Le rsultat final sera donc de ' 1*2 ,oliformes totau% 1 gr de produit 1* ,oliformes fcau% 1 gr de produit ?emarque ' ;tant donn que les ,oliformes fcau% font partie des ,oliformes totau%, il est pratiquement impossible de trou&er plus de ,oliformes fcau% que de ,oliformes totau%. +' R$!($0!($ $t d no"10$"$nt d$s Coli2o0"$s $n "ili$u solid$ @ partir des dilutions dcimales allant de 1235 1231 &oire 1, porter aseptiquement ) fois 1 ml dans deu% boites de Ptri &ides prpares cet usage et numrotes comme lindique le sc!ma n7K. ,omplter ensuite c!aque boite a&ec en&iron )2 ml de glose au -so%yc!olate 1 L ou dfaut par de la glose 6?"L ou 6?">, fondue puis refroidie =*M17,. Naire ensuite des mou&ements circulaires et de &a3et3&ient en forme de 8 E 9 pour permettre linoculum de bien se mlanger la glose utilise. Incubation ' One srie de boites sera incube 5D7,, pendant )= =E ! et ser&ira la rec!erc!e de ,oliformes totau%, lautre srie sera incube ==7, pendant )= =E ! et ser&ira la rec!erc!e de ,oliformes fcau%..

Pue se soit 5D ou ==7,, les premires lectures se feront au bout de )= ! et consistent reprer les petites colonies rouges ayant pouss en masse mais fluorescentes, ce qui signifie que la lecture doit se faire dans une c!ambre noire et sous une lampe O6. Les autres colonies non fluorescentes ne sont ni des coliformes totau% ni des coliformes fcau%. -nombrement ' Il sagit de compter toutes les colonies ayant pouss sur les boites en tenant compte des facteurs de dilutions, de plus ' 3 ne dnombrer que les boites contenant entre 1* et 522 colonies, 3 multiplier toujours le nombre trou& par lin&erse de sa dilution, 3 faire ensuite la moyenne arit!mtique des colonies entre les diffrentes dilutions. 3 il est impossible de trou&er plus de ,oliformes fcau% que de ,oliformes totau%.

S!( "# % R$!($0!($ $t d no"10$"$nt d$s Coli2o0"$s $n "ili$u solid$ @ partir des dilutions dcimales '

1231

123)

1235

1ml 1ml 1ml

1 ml 1 ml

1 ml

5D7,, )=

=E !

==7,, )= =E! Ajouter auparavant environ 20 ml de glose au Dsoxycholate ! " #aisser solidi$ier sur paillasse Dnom%rer les colonies $luorescentes ayant pouss en masse

*'R$!($0!($ $t d no"10$"$nt d$s St0$3to!o)u$s 2 !#u4 -ans les laits et produits laitiers, les #treptocoques du groupe - ou #treptocoques fcau% sont rec!erc!s et dnombrs en milieu liquide par la tec!nique du FPP (nombre le plus probable$. La tec!nique en milieu liquide fait appel deu% tests conscutifs sa&oir '

&

 le test de prsomption ' rser& la rec!erc!e des #treptocoques sur milieu de ?ot!e, le test de confirmation ' rser& la confirmation proprement dite sur milieu ;6@, des tubes trou&s positifs au ni&eau des tests de prsomption. Test de prsomption. Prparer dans un portoir une srie de tubes contenant le milieu slectif de ?ot!e raison de trois tubes par dilution. @ partir des dilutions dcimales 1235 1231, porter aseptiquement 1 ml dans c!acun des trois tubes correspondant une dilution donne comme lindique le sc!ma n7D. "ien mlanger le milieu et linoculum. Incubation ' Lincubation se fait 5D7, pendant )= =E !eures. Lecture ' #ont considrs comme positifs les tubes prsentant un trouble microbien. (ais attention il ny a aucun dnombrement faire se ni&eau. Test de confirmation ou test de Mac Kenzie. ,!aque tube de ?ot!e trou& positif lors du test de prsomption fera lobjet dun repiquage laide dune Ise boucle dans un tube de milieu ;6@ LytsQi. "ien mlanger le milieu et linoculum. Incubation ' Lincubation se fait 5D7,, pendant )= !eures. Lecture ' #ont considrs comme positifs, les tubes prsentant la fois ' un trouble microbien, une pastille blanc!Rtre ou &iolette au fond du tube. La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table de (ac >rady en tenant compte uniquement des tubes d;6@ positifs ou ngatifs. Illustration #i, sur milieu de ?ot!e ' S la dilution 1231 ' ) tubes sur 5 sont positifs, donc repiquer, S la dilution 123) ' ) tubes sur 5 sont positifs, donc repiquer, 35 S la dilution 12 ' 1 tube sur 5 est positif, donc repiquer. ,ela signifie, quon a * tubes repiquer sur milieu ;6@.

@prs repiquage et incubation, si ' S la dilution 1231 ' 1 tube sur ) est positif, S la dilution 123) ' les ) tubes sont ngatifs, S la dilution 1235 ' le tube repiqu est positif, Le nombre caractristique sera de 8 121 9, ce qui correspond 2,D sur la table de (ac >rady. An considre donc quil y a 2,D #treptocoques fcau% la dilution 1231. (ais tenant compte du facteur de dilution et pour re&enir 1, il faut multiplier ce nombre par

'

lin&erse de la premire dilution soit ' 2,D H 12 . D . Le rsultat final sera donc de D #treptocoques fcau% par gr ou ml de produit analyser. -ilutions 1231 123) 1235 Fombre ,aractristique :est de prsomption G G 3 G G 3 G 3 3 1 :est de confirmation G 3 3 3 G 121

S!( "# % R$!($0!($ $t d no"10$"$nt d$s St0$3to!o)u$s 2 !#u4 @ partir des dilutions dcimales '

1231 5 H 1 ml

123) 5 H 1 ml

1235 5 H 1 ml

T$st d$ 30 so"3tion/ *56C/ +7 8 79 (.

'

'

'

'

T$st d$ !on2i0"#tion/ *56C/ +7 (.

'

'

'

!0

,'R$!($0!($ d$ S#l"on$ll#.
la rec!erc!e des #almonella ncessite une prise dessai part.

Tour 1 ' Pr3enric!issement. Prle&er )* ml ou )* gr de produit analyser dans 1 sac!et strile de type #tomatc!er contenant ))* ml deau peptone tamponne. "royer cette suspension dans un broyeur de type #tomatc!er, la transposer dans un flacon strile quon incube 5D7, pendant 1E !eures. Tour ) ' ;nric!issement. Lenric!issement doit seffectuer sur deu% milieu% slectifs diffrents sa&oir ' 3 le milieu de ?appaport 6assiliadis rparti raison de 12 ml par tube, 3 le milieu de #lnite 3 ,ysteUn rparti raison de 122 ml par flacon. Lenric!issement proprement dit, se fait donc partir du milieu de pr3enric!issement de la faVon sui&ante ' 3 2,1 ml en double pour les tubes de ?appaport 6assiliadis, 3 12 ml en double pour les flacons de #lnite ,ystWn, comme lindique le sc!ma n7E. Incubation. Le premier tube de ?appaport sera Le deu%ime tube de ?appaport sera Le premier flacon de #lnite sera Le deu%ime flacon de #lnite sera incub incub incub incub 5D7,, )= !. =)7,, )= !. 5D7,, )= !. =)7,, )= !.

Tour 5 ' Isolement. ,!aque tube et c!aque flacon fera lobjet dun isolement sur deu% milieu% gloss diffrents sa&oir ' 3 le milieu glos <eQtoen 3 le milieu glos "ili lactos au &ert brillant et au rouge de p!nol. :outes les boites ainsi ensemences seront incubes 5D7, pendant )= !. Tour = ' Lecture des boites et Identification. Les #almonella se prsentent de la faVon sui&ante ' 3 colonies roses entoures dune Cone rouge sur glose "L6"?P. 3 colonies le plus sou&ent gris bleu centre noir sur glose <eQtoen. sIdentification morp!ologique et bioc!imique. ,inq colonies caractristiques et distinctes feront lobjet dune identification morp!ologique et bioc!imique qui se droulent comme suit ' ;tat frais (bacilles, mobilit$, ,oloration de >ram (bacilles >ram ngatifs$, ;nsemencement dun tube de Bligler (:#I$ qui sera incub 5D7,, )= ! (Lactose, #acc!arose, >lucose, >aC et <)#$, ;nsemencement dun tube de glose nutriti&e incline qui sera incub 5D7,, )= ! qui ser&ira lagglutination sur lame,

!!

;nsemencement ' S soit dune galerie bioc!imique classique (AFP>, A%ydase, L-,, A-,, @-<, :moin, Ore, Indole, :-@, ,itrate de #immons, 6P, ?($, S ou dune galerie bioc!imique @PI )2;.

Identification @ntignique. ,ette dernire repose sur lagglutination sur lame de &erre , partir des m0mes colonies isoles la &eille sur >F incline en tubes , laide des srums de groupes dabord A(@ , A(" puis les autres aprs.

:'R$!($0!($ d$ List$0i# "ono!;to<$n$s %

la rec!erc!e des Listeria ncessite une prise dessai part.

Tour 1 ' Pr3enric!issement. Introduire aseptiquement )* gr de produit analyser dans ))* ml de bouillon Nraser X additionn de supplment comme lindique le sc!ma n7/. "ien mlanger milieu et inoculum, puis incuber 527, pendant )= !. Tour ) ' ;nric!issement et isolement. @ partir du bouillon Nraser X ' Prendre aseptiquement 2,1 ml du bouillon Nraser dans un tube contenant 12ml de bouillon Nraser additionn lui aussi de son supplment. "ien mlanger milieu et inoculum, puis incuber 5D7,, )= !. Procder un isolement sur glose Palcam (P1$, puis incuber 5D7,, )= =E!. Tour 5 ' Isolement sur P). Procder un isolement sur glose Palcam (P)$ partir du bouillon Nraser, puis incuber 5D7, pendant )= =E!. Tour = ' Lecture des isolements et Identification bioc!imique. Abser&er les colonies noires caractristiques ayant pouss sur glose Palcam, puis effectuer les tests sui&ants ' ,atalase, ,oloration de >ram (petits ">P$, (obilit (en ;tat Nrais ou mieu% en glose mobilit ))7,$, ,amp3test ou glose au sang, @PI + Listeria. Sur le plan biochimique, Listeria monocytogenes est : aro3anarobie facultatif, ,atalase G A%ydase + Fitrate rductase + >lucose G, <)# +, >aC + ;sculine G Indole + , Ore + , :-@+ , 6P G et ?( G <molyse de type Y.
!2

?emarques ' 1. Otiliser a&ec c!aque c!antillon ou groupe dc!antillons, une souc!e tmoin de Listeria monocytogenes. #i le tmoin ne marc!e pas, lanalyse est refaire.
2.

,oncernant le supplment pour le milieu Nraser, il faut le reconstituer strilement un flacon par )),* ml dun mlange, &olume 111,eau1t!anol strile. (langer doucement pour dissoudre. @jouter strilement alors ' S ),)* ml du flacon ))* ml de bouillon Nraser X S 2,1 ml du flacon 12 ml de bouillon Nraser "ien mlanger a&ant de rajouter linoculum. ,e supplment est constitu de ' @crifla&ine ZZZZZZ... )E,1 mg @cide nalidi%ique ZZZZ.. )),* mg ,itrate de fer ammoniacal Z..11,)* mg ,oncernant le supplment pour le milieu Palcam, il faut le reconstituer strilement laide de * ml deau distille strile. (langer doucement pour dissoudre. @jouter strilement ),)* ml du flacon ))* ml de glose de base Palcam fondue puis refroidie =*7, en&iron . "ien mlanger et rpartir en boites de Ptrie . ,e supplment est constitu de ' #ulfate de Polymy%ine " ZZ.. *2 222 OI ,eftaCidime ZZZZZZZ.. 12 mg @crifla&ine ZZZZZZZ.. ),* mg

!3

S!( "# d$ R$!($0!($ d$ List$0i# "ono!;to<$n$s Tour 1 )* gr dans ))* ml de Nraser X 527,, 1E Isolement )= ! 2,1 ml

Tour ' ) ;nric!issement

Palcam ou ?apidLmono 5D7,, )= !

F0#s$0 +

527,, )= !

Tour ' 5 Palcam ou ?apidLmono 5D7,, )= ! * ,olonies :#@[; Tour ' = Purification ,atalase >ram (obilit ,amp3test >alerie @PI + Listeria

#uite Idem

!4

,amp3test

Listria monocytogenes de rfrence #tap!ylococcus @urus ?!odococcus ;qui

>lose :#@

#ouc!e #c!ma n712

tester

Le tableau sui&ant indique quelques caractres bioc!imiques du genre Listeria. C#"3't$st #.auru s L.monocyto G L.i&ano&ii 3 L.innocua 3 L.Jels!imri 3 L.seeligeri G ;spces F$0"$nt#tion d$s Su!0$s -3%ylose L3 \ mt!yl r!amnose mannoside 3 G G G 3 3 3 G ou + G G G ou + G G 3 3

?.qui 3 G 3 3 3

-3

!5

5'R$!($0!($ d$ St#3(;lo!o!!us #u0$us. #elon la disponibilit des milieu% de culture, trois tec!niques diffrentes sont recommandes pour la rec!erc!e de #tap!ylococcus aureus sa&oir ' mt!ode de "aird ParQer mt!ode denric!issement sur milieu de >iolliti ,antonii mt!ode denric!issement sur milieu de ,!apman. Mthode de Baird Parker. Prparation du milieu. @u moment de lemploi faire fondre un flacon contenant ))* ml de glose "aird ParQer , le refroidir ensuite dans un bain deau =*7, , puis ajouter 1* ml dune solution de jaune d]uf au :llurite de potassium. (langer soigneusement et aseptiquement, puis rpartir le milieu en boites de ptri raison de 1* 1E ml par boite. Laisser solidifier les boites sur paillasse, puis les sc!er en les plaVant retournes cou&ercle en bas (bord de la boite sur le bord du cou&ercle$ dans une tu&e de sc!age rgle entre =* **7,. ;nsemencement. @ partir des dilutions dcimales 123* dans le cas des to%i3infections alimentaires et partir de 1235 dans le cas des contr^les de routine, porter aseptiquement 1 ml de c!aque dilution rparti en surface raison de 5 fractions sensiblement gales dans trois boites contenant le milieu de "aird ParQer puis taler laide dun m0me taleur en commenVant par les boites de plus forte dilution, comme lindique le sc!ma n711. Incubation. Lincubation se fait 5D7, pendant )= =E !eures. Lecture. #eront considres comme positi&es, les boites contenant des colonies caractristiques sa&oir des colonies noires, brillantes, con&e%es entoures dune Cone de transparence qui peut 0tre translucide. @prs )= !eures, peut apparaWtre dans cette Cone transparente, un anneau opalescent immdiatement au contact des colonies. Pour sassurer quil sagit bien de colonies de #tap!ylococcus aureus, effectuer sur ) 5 colonies de c!aque boite des tests bioc!imiques rapides sa&oir ' une preu&e la catalase ( laide de leau o%ygne$ une preu&e la coagulase ( laide de plasma de lapin$. Puelques caractres bioc!imiques de diffrentes espces de stap!ylocoques sont rsums dans le tableau ci 3 aprs. #tap!ylocoque ,atalase ,oagulase (annitol en anarobie ?sistance la Fo&obiocine (* (icro3gr $ aureus G G G # intermedius G G 3 # saprop!yticus G 3 3 ? epidermitis G 3 3 #

!6

?emarques ' 1. Les boites coules a&ec de la glose "aird 3 ParQer non sc!es peu&ent 0tre conser&es entre 2 et G*7, au ma%imum )= !eures . ). -es colonies non caractristiques peu&ent apparaWtre sur les boites ' il sagit de colonies noires , brillantes , con&e%es ou gris noirRtres ayant parfois un aspect mat et une te%ture sc!e, dpour&ues de Cone de transparence, de catalase et de coagulase. Mthode denrichissement au milieu de Giolliti Cantonii. Prparation du milieu denric!issement. @u moment de lemploi, ou&rir aseptiquement le flacon contenant le milieu de >iolliti ,antonii pour y ajouter 1* ml dune solution de :llurite de Potassium. (langer soigneusement. Le milieu est alors pr0t lemploi. ;nsemencement. @ partir des dilutions dcimales retenues, porter aseptiquement 1 ml par dilution dans un tube &is strile. @jouter par la suite en&iron 1* ml du milieu denric!issement comme lindique le sc!ma n7 1). "ien mlanger le milieu et linoculum. Incubation. Lincubation se fait Lecture. #eront prsums positifs, les tubes ayant &irs au noir. Pour sassurer quil sagit bien dun d&eloppement de #tap!ylococcus aureus, ces tubes feront lobjet dune confirmation par isolement sur glose ,!apman pralablement fondue , coule en boites de ptri et bien sc!es. Les boites de ,!apman ainsi ensemences seront incubes leur tour 5D7, pendant )= =E !eures. @prs ce dlai, reprer les colonies suspectes sa&oir les colonies de taille moyenne, lisses, brillantes, pigmentes en jaune et pour&ues dune catalase et dune coagulase. ;%pression des rsultats.
-

5D7, pendant )=

=E !eures.

#i la dilution 1235, le tube a noirci au bout de )= !eures dincubation, mais lisolement sur ,!apman, il ny a pas de colonies caractristiques 4 ce tube est considr comme ngatif. #i par contre la dilution 1231, le tube a noirci au bout de )= !eures dincubation, et lisolement, il y a des colonies caractristiques, il faut tenir compte de la dilution en question, car le nombre rel de #tap!ylococcus aureus correspond lin&erse de la dilution.

!&

-ans ce cas, il y a donc 12 #tap!ylococcus aureus par gramme ou millilitre de produit analyser. R$!($0!($ d$ St#3(;lo!o!!us #u0$us 3#0 l# " t(od$ d$ Giolitti C#ntonii @ partir des dilutions dcimales '

1231

123)

1235

1ml 1*ml >,

5D7,, )=

=E !

?action Positi&e Fgati&e Isolement sur ,!apman

?action

5D7, , )= =E ! 4 :ests bioc!imiques ',atalase ,coagulase. 9'R$!($0!($ d$ s3o0$s dAn# 0o1i$s Sul2ito'R du!t$u0s $t d$ Clost0idiu" 3$020in<$ns

!'

#elon la disponibilit des milieu% de culture, deu% tec!niques sont recommandes pour la rec!erc!e de ,lostridium perfringens sa&oir ' mt!ode gnrale sur glose 6iande + Noie 5D7,, mt!ode slecti&e sur glose :#F ou :#, =K7,. Mthode nrale. Prparation du milieu. @u moment de lemploi faire fondre un flacon de glose 6iande foie, le refroidir dans un bain deau =*7, puis ajouter une ampoule d@lun de Ner et une ampoule de sulfite de sodium. (langer soigneusement et aseptiquement. Le milieu est ainsi pr0t lemploi, mais il faut le maintenir dans une tu&e =*7, jusquau moment de lutilisation. ;nsemencement. Les tubes contenant les dilutions 123) et 1231 seront soumis ' dabord un c!auffage E27, pendant E 12 minutes, puis un refroidissement immdiat sous leau de robinet, dans le but dliminer les formes &gtati&es et de garder uniquement les formes sporules. @ partir de ces dilutions, porter aseptiquement 1 ml de c!aque dilution en double dans deu% tubes &is striles de 1K mm de diamtre, puis ajouter en&iron 1* ml de glose 6iande Noie pr0te lemploi, dans c!aque tube comme lindique le sc!ma n715. Laisser solidifier sur paillasse pendant 52 minutes. Incubation. ,es tubes seront ainsi incubs 5D7, pendant 1K, )= ou au plus tard =E !eures. Lecture. La premire lecture doit se faire imprati&ement 1K !eures, car, dune part les colonies de ,lostridium #ulfito3rducteurs sont en&a!issantes auquel cas on se trou&erait en face dun tube compltement noir rendant alors linterprtation difficile &oire impossible et lanalyse est refaire. dautre part, il faut absolument reprer toute colonie noire ayant pouss en masse et dun diamtre suprieur 2,* mm. -ans le cas o_ il ny a pas de colonie caractristique r3incuber les tubes et effectuer une deu%ime lecture au bout de )= !eures &oire =E !eures. Interprtation des rsultats. Il est donc impratif de reprer toute colonie noire, puis procder son identification bioc!imique. ,ertains auteurs prconisent de casser le tube laide dune lime mtallique 1 cm au dessus de la colonie suspecte et de prendre le centre de la dite colonie, car trs sou&ent il y a d&eloppement de colonies de #tap!ylocoques et de "acillus c^t, quon prendrait tord pour des colonies de ,lostridium #ulfito3rducteur.

dentification bioc!imique.

!(

Le centre de la colonie noire suspecte ( qui est en ralit blanc!e mais entoure dune aurole noire $ sera alors dpos soigneusement dans un tube contenant du bouillon : > [ ou : [ pralablement rgnr E27, pendant 1* minutes . Placer ensuite ce tube dans un agitateur (6orte%$ pour bien mlanger la colonie dans le milieu puis lincuber en anarobiose pendant )= =E !eures. @prs la priode dincubation, constater le trouble du milieu, puis raliser les tapes sui&antes ' ;tat frais pour constater sil y a mobilit ou non ... ,oloration de >ram pour constater les types de colonies et leur coloration #il sagit de bacilles >ram positifs, faire un isolement sur deu% boites de glose au sang de mouton frais ' S lune sera incube 5D7, en arobiose, S lautre sera incube 5D7, en anarobiose. @prs )= =E !eures dincubation ' S slectionner les boites ayant pouss strictement en anarobiose, S noter le type d!molyse, S faire une coloration de >ram puis une raction catalase, S sassurer quil sagit bien dune souc!e pure, sinon purifier, S puis ensemencer une >alerie bioc!imique @pi )2 @ incuber toujours 5D7, et toujours en anarobiose. Mthode !lecti"e. La mt!ode slecti&e de rec!erc!e de ,lostridium perfringens est identique mt!ode gnrale, mise part ' le milieu de culture ' il sagit cette fois ci dun milieu slectif TSN ou TSC ( :ryptone #ulfite Fomycine ou :ryptone #ulfite ,yclosrine$, ces deu% antibiotiques in!iberont toute la flore &entuellement prsente !ors mis les spores de ,lostridium perfringens, rendant ainsi le milieu slectif . la temprature dincubation ' =K7,, la slection est encore plus stricte. La suite des oprations reste sans c!angement. la

R$!($0!($ d$ s3o0$s dAn# 0o1i$s Sul2ito'R du!t$u0s

20

$t d$ Clost0idiu" 3$020in<$ns @ partir des dilutions dcimales '

1231

123)

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

@jouter 1* ml de glose 6 N par tube Laisser solidifier sur paillasse, puis incuber 5D7,, =E!.

-nombrer les colonies noires ayant pouss en profondeur

5'R$!($0!($ $t d no"10$"$nt d$ L$=u0$s $t Moisissu0$s

2!

@ partir des dilutions dcimales, 1235 1231, porter aseptiquement = gouttes dans une boite de ptri contenant de la glose A>@ ou #abouraud au ,!loramp!nicol, comme lindique le sc!ma n71=. ;taler les gouttes laide dun rRteau strile, puis incuber ))7, pendant * jours. -ans le souci de ne pas se trou&er en face de boites en&a!ies soit par les Le&ures soit par les (oisissures, on doit effectuer des lectures et des dnombrements tous les jours, Le&ures part et les (oisissures part. ?emarques importantes ' 1. Aprer de la m0me faVon et dans les m0mes conditions, a&ec le diluant (:#;$, c`est3 3dire quil faut prendre quatre gouttes du diluant, les taler a&ec un rRteau part et les incuber dans le m0me endroit que les boites tests, cette boite constitue le tmoin diluant. ). Incuber telle quelle, une boite du milieu utilis sa&oir A>@ ou #abouraud, cette dernire sera incube galement telle quelle dans le m0me endroit et dans les m0mes conditions de temprature, elle constitue le tmoin du milieu. 5. @u moment de la lecture, commencer obligatoirement par les deu% boites tmoin milieu et diluant, si lune dentre elles est contamine, lanalyse est ininterprtable donc refaire. Interprtation des rsultats ' ;tant donn dune part, quon a pris = gouttes des dilutions dcimales, ;tant donn dautre part, quon considre que dans 1 ml, il y a )2 gouttes, Pour re&enir 1 ml, il faut multiplier le nombre trou& par *. Par ailleurs, tant donn quon a tra&aill a&ec des dilutions dcimales, on doit multiplier le nombre trou& par lin&erse de la dilution correspondante, faire ensuite la moyenne arit!mtique, puis e%prim le rsultat final en ml ou en gr de produit analyser.

S!( "# d$ R$!($0!($ $t d no"10$"$nt d$ L$=u0$s $t Moisissu0$s

22

@ partir des dilutions dcimales '

1231

123)

1235

:#;

A>@

=gttes

=gttes

=gttes

=gttes

A>@

A>@

A>@

))7,, *jours, a&ec lecture tous les jours.

#c!ma n7 1=

23

NORMES > INTERPRETATION

;n attendant lapparition du proc!ain arr0t interministriel fi%ant les critres microbiologiques de certaines denres alimentaires, linterprtation des rsultats des analyses bactriologiques se fait actuellement conformment larr0t interministriel du )D (ai 1//E paru sur le journal officiel de la ?@-P n7 5*1/E. ,es rsultats sont e%prims selon trois critres ' satisfaisants non satisfaisants acceptables ' cest dire conformes au% normes imposes par la lgislation. ' cest dire pour lesquels le seuil dacceptabilit est dpass. ' pour lesquels le rapport c1n est infrieur )1*.

c ' tant le nombre dunits dc!antillons donnant des &aleurs comprises entre m et ( . n ' tant le nombre dunits par c!antillon . m ' nombre minimal de micro3organismes trou&s (limite infrieure$ ( ' nombre ma%imal de micro3organismes trou&s (limite suprieure$ TABLE DE MAC ' GRAD? Fombre ,aractristique 222 221 212 211 2)2 122 121 12) 112 111 1)2 1)1 152 )22 )21 )2) )12 )11 )1) ))2 ))1 Fombre de (icro3organismes 2,2 2,5 2,5 2,K 2,K 2,= 2,D 1,1 2,D 1,1 1,1 1,* 1,K 2,/ 1,= ),2 1,* ),2 5,2 ),2 5,2
24

))) ))5 )52 )51 )5) 522 521 52) 512 511 51) 515 5)2 5)1 5)) 5)5 552 551 55) 555

5,* =,2 5,2 5,* =,2 ),* =,2 K,* =,* D,* 11,* 1K,2 /,* 1*,2 )2,2 52,2 )*,2 =*,2 112,2 1=2,2

25