Sci. Nat. Vol.

6 N2 : 117 - 123 (2009)

Techniques dextraction des phnols de racinaires de palmier huile
117
Sci ences & Nature Vol .6 N2 : 117 - 123 (2009)
Performance de deux techniques dextraction des phnols racinaires
pour lvaluation du marquage de la tolrance la fusariose des clones
de palmier a huile (Elaeis guineensis Jacq.)
Sekou DIABATE
1 *
, Kouakou E. KONAN
2
, Dsir ALLOU
1
, Ouolo A. COULIBALY
3
&Hubert DE FRANQUEVILLE
4
1
Centre National de recherche Agronomique (CNRA), Laboratoire Central de Biotechnologie 01 B.P.1740 Abidjan 01
2
Centre National de recherche Agronomique (CNRA), Station de Recherche de La M 13 B.P.989 Abidjan 13; COTE DIVOIRE
3
Centre National de recherche Agronomique (CNRA), Station dexprimentation et de Production B.P. 8 Dabou; COTE DIVOIRE
4
CIRAD, TA 80/02, Avenue Agropolis F34398 Monpellier ; CEDEX 5 - FRANCE
*Auteur pour les correspondances (E-mail: sekou_diabate2002@yahoo.fr)
Reu le 21-02-2008, accept le 10-03-2009.
Rsum
Les premires tudes sur les mcanismes de dfense du palmier huile ont mis en vidence le rle des composs
phnoliques dans la tolrance la fusariose des clones et croisements partir des racines inocules par lagent
pathogne. Notre travail a consist dune part amliorer les premires techniques dextraction en remplaant
lEthanol par un mlange Ethanol-eau et dautre part amliorer les techniques de microanalyses des marqueurs de
tolrance la fusariose. Les rsultats ont montr que les modifications apportes ont permis daccder une quantit
plus importante de phnols que la mthode classique. En outre, les analyses des phnols totaux et la fongitoxicit
ont permis de discriminer les clones tolrants des clones sensibles. Ces nouvelles mthodes nous ont permis
dvaluer plus rapidement la tolrance la fusariose des clones aprs inoculation de lagent pathogne.
Mots cl s: Palmier huile Fusarium Phnols Clones extraction.
Abstract
Performance of two techniques of extration of roots phenols for the testing of the tolerance marking
in the wilt disease of oil palm clones (Elaeis Guineensis Jacq)
The early studies on the defence mechanisms of the oil palm tree put in evidence the role of phenolic compounds
in the tolerance of wilt disease of the clones and crossings from the roots inoculated by the pathogenic agent.
Our work consists on one hand in improving the first techniques of extraction by replacing the Ethanol by a mixing
Ethanol-water and on the other hand by improving the techniques of microanalyses of the tolerance markers to wilt
disease. The results showed that these modifications permitted to reach a quantity more important of phenol than
the classic method. Besides, the analyses of the total phenol and the fongitoxicity permitted to discriminate the
tolerant clones from the sensitive clones. These new methods allow us to evaluate faster the tolerance to wilt disease
of the clones after inoculation of the pathogenic agent.
Key-Words: Oil palm tree Fusarium Phenols Clone extraction.
Arti cle original
118
Sci. Nat. Vol.6 N2 : 117 - 123 (2009)
Sekou DIABATE et al. 118
1. Introduction
Parmi les nombreuses maladies qui affectent
la culture du palmier huile, la fusariose est
celle qui revt le plus dimportance en Afrique
tropicale. La Cte dIvoire, le Ghana, le Bnin, le
Nigeria, le Cameroun, le Congo et le Congo
dmocratique sont les pays les plus touchs
(Franqueville & Diabat, 2004). Lagent
pathogne de cette trachomycose
est un champignon tellurique spcifique du palmier
huile: Fusarium oxysporum f. sp. elaeidis (F.O.E.).
Les mthodes de lutte sont prventives et se
situent essentiellement au niveau du choix du
matriel vgtal aprs un test dinoculation de
lagent pathogne au stade prppinire (Allou et
al., 2003). Tout matriel vgtal test qui a un indice
infrieur 100 est jug tolrant. Les recherches
sur les mcanismes physiologiques de la
rsistance la fusariose ont t entreprises pour
complter et apporter une base plus fondamentale
au test de prppinire (Taquet, 1985; Diabat,
1985). Le rle des composs phnoliques a t
mis en vidence dans les racines des plantules
inocules par le F.O.E. aprs blessures (Diabat
et al., 1992). Cependant, il tait difficile de doser
avec prcision, la totalit de la teneur en phnols
des racines des plantules. Pour apporter une
solution ces problmes qui limitaient ces
premires avances sur les mcanismes de
dfense du palmier huile la fusariose, une
nouvelle technique dextraction des composs
phnoliques impliqus dans la raction de
dfense du palmier face au fusarium est propose
en comparaison avec lextraction classique. Les
rsultats attendus de ces travaux devraient
permettre de savoir avec prcision la manire de
doser les phnols produits lors de la raction de
dfense du palmier huile la fusariose vasculaire.
2. Matri el et mthodes
2.1. Matriel vgtal
Le matriel vgtal tudi est compos de racines
de plantules de 6 gnotypes issues de la
multiplication vgtative in vitro appeles clones
dindice fusariose connu. Les clones sont
regroups en trois couples de deux gnotypes
comportant chacun un gnotype sensible et un
gnotype tolrant (Tableau 1).
Couple Clone Im
I
LMC 022
LMC 074
28
187
II
LMC 119
LMC 165
10
141
III
LMC 062
LMC 204
42
163
Tabl eau 1: Liste des couples de clones tudis.
Im= Indice fusariose; Im<100: clone tolrant; Im>100: clone
sensible
2.2. Mthodes di noculation au F.O.E et
prl vement dchantill ons racinaires
Pour lvaluation de la fongitoxicit des racines,
des inoculations de plantules ont t ralises.
La mthode dinoculation retenue est celle du
trempage des racines dans linoculum liquide du
F.O.E. Cinq essais dinoculation ont t raliss
uniquement avec le couple LM022/LM074. Dans
chaque essai, 5 plantules par clone ont t
dterres pour provoquer des blessures au niveau
des racines. Le systme racinaire a t ensuite
nettoy puis tremp dans linoculum du F.O.E
raison de 10
7
spores par plantule. Les plantules
ont t ensuite repiques dans le terreau. Pour
chaque clone, des nombres gaux de plantules
non inocules ont t prlevs et ont constitu les
tmoins. Cinq dlais de prlvement de racines
analyser ont t retenus (T0, T+1jour, T+3jours,
T+5jours et T+8jours aprs inoculation). Pour
chaque dlai de prlvement, les racines des
plantules ont t dcoupes, peses et
conserves au conglateur 4C pendant 48 heures
avant lextraction des composs phnoliques.
2.3. Mthodes dextraction des composs
phnoliques
Deux mthodes dextraction des phnols ont t
utilises; une mthode dextraction classique et
une mthode dextraction nouvelle. Dans la
mthode dextraction classique, 5 g de racines
fraiches ont t dcoups et broys dans 40 ml
dEthanol pur laide dun Mixer (Taquet, 1985).
La macration des tissus dans lEthanol pur a t
effectue temprature ambiante pendant 24
heures. Le mlange racines broyes Ethanol est
ensuite filtr. Le filtrat est sch par un Evaporateur
rotatif 40C et repris dans 4 ml dEthanol pur.
Lextrait ainsi obtenu est conserv au rfrigrateur
4C avant les dosages. Dans la mthode
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Techniques dextraction des phnols de racinaires de palmier huile
119
dextraction nouvelle, 5 g de racines sont broys
dans lAzote liquide (-160C) et repris dans 40 ml
dun mlange Ethanol-Eau (70-30; v/v) en prsence
de 1 ml dun antioxydant, le mtabisulfite de Sodium
(MBS) 2 % dans leau. Ce mlange est port
bullition sous vide pendant 30 mn. Aprs
refroidissement, le liquide obtenu est filtr et sch
par un vaporateur rotatif 40C. Le rsidu est
repris dans 4 ml du mlange Ethanol-Eau (70-30)
+0,1 ml de MBS 2 % dans leau. Lextrait obtenu est
conserv au rfrigrateur 4C avant les dosages.
2.4. Quantification des composs phnoliques
La quantit de phnols contenue dans les extraits
racinaires est mesure par la mthode de Folin
ciocalteu (Marigo, 1973). Cette mthode mesure
le potentiel doxydorduction des phnols. Les
teneurs sont calcules en prenant lacide
chlorognique comme rfrence et sont
exprimes en mg dquivalent dacide chloro-
gnique par gramme de poids frais.
2.5. Eval uat i on de l a f ongi toxi ci t des
extraits racinai res.
Les proprits fongitoxiques des extraits ont t
values en milieu liquide, en prsence des
spores de Fusarium oxysporum f sp. elaeidis
(Taquet, 1985). Les tests sont raliss en flacon
dErlen meyer (25 ml) rgulirement agit.
Lincubation ncessaire la germination des
spores a une dure de 15 heures, la temprature
de 27C. Le rsultat des tests est tabli sur un
total moyen de 150 200 spores. Les rsultats
ont t exprims en pourcentage dinhibition
calcul par rapport au taux de croissance du tmoin
sans extrait racinaire.
2.6. Analyses statistiques
Les analyses statistiques de lensemble des
donnes sont effectues avec les logiciels
ANOVA, XLSTA7.1 (ADDINSOFT, 2004). Ces
logiciels ont permis de faire lanalyse de
variance au seuil de 5 % et lorsquune diffrence
significative a t mise en vidence, les groupes
homognes ont t constitus partir du test
de NEWMAN-KEULS.
3. Rsultats
3.1. Comparaison de la performance des
techniques dextraction pour le marquage
de la tol rance des clones
Les rsultats danalyses du dosage des
composs phnoliques racinaires des clones ont
montr que la quantit de phnols extraits tait
significativement plus importante avec la technique
dextraction nouvelle que la technique dextraction
classique. Ces rsultats sont confirms aussi bien
avec les clones non inoculs (Tableau 2) quavec
les clones inoculs (Tableau 3). Les rsultats
danalyses de lvolution des phnols aprs
linoculation de lagent pathogne ont aussi
rvl que lextraction par la nouvelle mthode
a libr significativement plus de phnols aprs
dosage que la mthode classique quelque soit
le temps dincubation du Fusarium oxysporum
f. sp. elaeidis (Fig. 1).
% de germination du tmoin - % de germination du motif
Taux dinibition =
% de germination du Tmoin
C C
B
A
B
B C B
A
B
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
T0J T1J T3J T5J T8J
P
h
e
n
o
l
Temps
Extraction-Classique
Extraction-Nouvelle
Fi gure 1: Evolution des teneurs globales en phnols des racines aprs inoculation du F.O.E. en fonction des
techniques dextraction
120
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Tabl eau 2: Comparaison en fonction de la technique dextraction, des teneurs phnoliques globales des racines
de clones tolrants et de clones sensibles non inoculs: Moyenne mesure sur cinq individus
Tabl eau 3: Comparaison en fonction de la technique dextraction, des teneurs phnoliques globales des racines
de clones tolrants et de clones sensibles inoculs: Moyenne mesure sur cinq individus
Source ddl
Somme des
carrs
Carr
moyen
F de Fisher Pr > F
Clone 1 16000000,000 16000000,000 47,727 <0,0001
Extraction 1 1072562500,000 1072562500,000 3199,417 <0,0001
Temps 4 16546250,000 4136562,500 12,339 <0,0001
Modalits Moyenne Regroupements
Test de LMC 022 7035,000 A
Newman-Keuls LMC 074 6235,000 B
(SNK) Modalits Moyenne Regroupements
Nouvelle 9910,000 A
Classique 3360,000 B
Source de variation ddl
Somme
des carrs
Carr
moyen
F de
Fisher
Pr > F
Clone 1 4360818,517 4360818,517 517,958 <0,0001
Extraction 1 84647039,905 84647039,905 10053,992 <0,0001
Modalits Moyenne Regroupements
Nouvelle 9177,500 A
Test de Newman-Keuls (SNK) Classique 5053,700 B
Modalits Moyenne Regroupements
LMC 22 7407,000 A
Couple A
LMC 077 6877,182 B
Source de variation ddl
Somme
des carrs
Carr
moyen
F de
Fisher Pr >F
Clone 1 3380,000 3380,000 1352,000 <0,0001
Extraction 1 146232320,000 146232320,000 58492928,000 <0,0001
Modalits Moyenne Regroupements
Nouvelle 9317,000 A
Test de Newman-Keuls (SNK) Classique 3909,000 B
Modalits Moyenne Regroupements
LMC 119 6626,000 A
Couple B
LMC 165 6600,000 B
Source de variation ddl
Somme
des carrs
Carr
moyen
F de
Fisher Pr >F
Clone 1 416161,250 416161,250 166464,500 <0,0001
Extraction 1 184923211,250 184923211,250 73969284,500 <0,0001
Modalits Moyenne Regroupements
Nouvelle 9881,500 A
Test de Newman-Keuls (SNK) Classique 3800,000 B
Modalits Moyenne Regroupements
LMC 062 6985,000 A
Couple C
LMC 204 6696,500 B
3.2. Comparaison de la fongitoxicit des
phnols pour le marquage de la tolrance
des clones
Lanalyse de la fongitoxicit des phnols des
plantules inocules extraites par les deux
mthodes a montr dune part lexistence de
diffrences significatives entre les niveaux de
fongitoxicit des composs phnoliques en
fonction des techniques dextraction. La technique
nouvelle a permis de rvler des niveaux de
fongitoxicit bien plus levs que les niveaux de
fongitoxicit qui ont t rvls par la technique
classique. Dautre part, les niveaux de fongitoxicit
des composs phnoliques du clone tolrant LMC
022 inocul ont t significativement plus levs
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Techniques dextraction des phnols de racinaires de palmier huile
121
que les niveaux de fongitoxicit du clone sensible
LMC 074 inocul (Tableau 4). Des variations
significatives de niveaux de fongitoxicit des
composs phnoliques ont t observes au
cours du temps toujours avec des valeurs plus
leves avec la mthode dextraction nouvelle
contrairement la mthode dextraction classique
(Figure 2).
Tabl eau 4: Comparaison en fonction de la technique dextraction, des fongitoxicit globales des racines de clones
tolrants et de clones sensibles inoculs: Moyenne mesure sur cinq individus
Source ddl Somme des carrs Carr moyen F de Fisher Pr > F
Clone 1 3025,000 3025,000 383,799 <0,0001
Extraction 1 400,000 400,000 50,750 <0,0001
Temps 4 184,000 46,000 5,836 0,000
Modalits Moyenne Regroupements Pr >F
Test de Nouvelle 34,600 A
Newman-Keuls Classique 30,600 B
(SNK) Modalits Moyenne Regroupements
LMC 022 38,100 A
LMC 074 27,100 B
A
A
B
A
A
BC
A
C
BC
AB
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
T0J T1J T3J T5J T8J
F
o
n
g
i
t
o
x
i
c
i
t

Temps
Extraction-
Classique
Extraction-
Nouvelle
Fi gure 2: Evolution des teneurs globales en phnols des racines aprs inoculation du F.O.E. en fonction des
techniques dextraction
4. Discussion
Plus le taux de phnol tudi sera grand plus la
probabilit de mettre en vidence de bons
marqueurs phnoliques de la rsistance la
fusariose sera forte. Dans ce but, le premier facteur
considr a t lamlioration de lextraction. Celle-
ci dpend du solvant utilis. Les rsultats ont
montr que la technique dextraction la plus efficace
consistait en une macration de 30 mn bullition
sous reflux, dans un mlange Ethanol 70 % - Eau
30 %, en prsence dun antioxydant, le mtabisulfite
de sodium (MBS) qui a t ajout au solvant de
macration afin dviter les phnomnes
doxydation des phnols au cours de leur
extraction. Cette mthode a permis en effet
dextraire en moyenne plus dune fois de phnols
que la macration classique dans lthanol pur.
Elle a permis daccder aux phnols solubles en
solution dans le milieu cellulaire tudi jusqu
prsent (Taquet, 1985; Diabat, 1985; 1990) et
aussi aux phnols lies la paroi cellulaire dont
le rle dans le processus de rsistance aux
maladies a t reconnu (Ampomah & Fried, 1988).
Lanalyse des rsultats a montr que la raction
de dfense du palmier huile contre la fusariose
vasculaire se manifestait par la synthse de
122
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Sekou DIABATE et al. 122
composs phnoliques. En outre, lvolution des
teneurs phnoliques a indiqu des quantits plus
importantes de phnols chez les clones tolrants
que chez les clones sensibles. Lanalyse des
rsultats a aussi indiqu une activit antifongique
plus marque chez les clones tolrants que chez
les clones sensibles. Ces rsultats corroborent
ceux de Renard et al., (1986) qui ont constat
dans les racines de palmiers inoculs, un
accroissement significatif de drivs de lacide
benzoque. Ces substances ont inhib in vitro la
croissance du F.O.E.
En ce qui concerne lanabolisme phnolique, une
accumulation importante de phnols en rponse
une infection de la plante rsistante a t
gnralement constate. Ce phnomne peut
concerner aussi bien les phnols simples que
les polymres phnoliques (Ledeme, 1991, Zhu
& Yao, 2004). Chez les plantes sensibles par
contre, lanabolisme phnolique suivant linfection
ne saccompagne daucun accroissement de
laccumulation phnolique dans les tissus
racinaires de lhte. Qualitativement, les extraits
alcooliques raliss partir de ces tissus savrent
sans effet sur la croissance in vitro du champignon
(Bell et al., 1984; Basham, 1986; Trojaak & Berbec,
2005). Les rsultats que nous avons obtenus chez le
palmier huile confirment ces hypothses et augure
une possibilit de mise en place dun test prcoce
la fusariose du palmier huile.
5. Concl usion
La r-investigation des mthodes dextraction
et de dosages des composs phnoliques a
permis de dgager les acquis suivants:
- dabord une mthode de broyage lazote
liquide (-160C) qui a permis dobtenir une
poudre fine et homogne partir de 5 g de
racines. De plus la temprature de lazote
liquide a permis de maintenir les tissus
racinaires congels durant tout le temps
du broyage, ce qui a limit les risques de
dgradation des produits phnoliques.
- ensuite laddition du Mtabisulfite de
Sodium 2 % dans le solvant de
macration a empch loxydation des
phnols au cours de leurs extractions.
- en outre, lextraction des racines broyes
dans un mlange Ethanol-Eau (70 %-30
%, v/v) a donn aprs dosage un extrait
moins riche en huile, et plus riche en
phnols. Ce qui a entran une activit
antifongique plus grande contrairement
la mthode dextraction classique avec
lEthanol pur. Ainsi la discrimination entre
clones tolrants et clones sensibles a t
facilite.
- le dosage des phnols a aussi montr
quil existait une rponse phnolique des
plantules linoculation du Fusarium
oxysporum f sp elaeidis les jours qui
suivaient cette inoculation. Cette rponse
tait plus importante avec la nouvelle
mthode dextraction que la mthode
classique.
Enfin, ces rsultats sont particulirement
importants dans loptique de la mise au point
dun test prcoce dtection de la tolrance la
fusariose partir du dosage des phnols
racinaires.
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