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Scale-up* Le scale-up (Mise l'chelle) de l'isolement des produits naturels implique non seulement une augmentation de l'chelle de la purification

n du compos cible mais aussi l'amlioration du niveau ou l'ampleur de sa production. Comme l'chelle augmente, l'efficacit de fonctionnement devient plus importante, ncessitant le dveloppement de procds. La nature du dfi mise l'chelle change invitablement tout au long du cycle de dveloppement d'un compos particulier. Ceci, combin avec les ressources disponibles, en fin de compte une influence sur la stratgie adopte. Les facteurs importants dans le succs de mise l'chelle sont discuts avec une rfrence particulire aux produits microbiens et illustr dans les tudes de cas sur les isolements scale-up de xenovulene A
depuis Acremonium strictum, et (6S)-4,6-dimethyldodeca-2E,4Edienoyl phomalactone depuis Phomopsis sp.

Introduction :

Scale-up est une ncessit pour n'importe quel produit naturel avec la promesse dans n'importe quel domaine, mais une dfinition prcise du terme peut tre un peu difficile atteindre. Un coup d'il travers les textes et littratures classiques assortis indiquerait quun Scale-up efficace peut tre atteint par l'application logique des principes biologiques, chimiques, et d'ingnierie bien caractriss. Dans une certaine mesure cela est vrai, mais la ralit est que l'intensification continue de faire partie de science-partie dart, o les principes scientifiques de fournir un outil utile, mais o l'exprience et, parfois, l'intuition d'un scientifique ont encore un rle important jouer.
L'tendue du champ de mise l'chelle signifie que mme les textes les plus dfinitives peuvent faire plus que de donner un aperu rapide de la rgion. Le chapitre correspondant dans la premire dition de ce livre (1) fourni au lecteur un aperu gnral solide des principes de scale-up, et il

n'est pas dans notre intention donc de rpter cet exercice, mais plutt montrer comment la nature changeante de l'chelle tout au long du cycle de dveloppement d'un compos, ainsi que les ressources disponibles, en fin de compte influer sur la direction prendre. Notre domaine est la dcouverte et le dveloppement de mtabolites microbiens produits par fermentation dans l'industrie pharmaceutique, et nous avons surtout s'appuyer sur cette exprience dans la rdaction de ce chapitre. La plupart des principes discuts sont galement applicables la mise l'chelle et l'isolement des produits naturels provenant d'autres sources. Certaines questions particulires relatives grande chelle des composs de plantes et les organismes marins sont abordes dans des sections distinctes.
La grande diversit des produits naturels qui les rend si prcieuse dans de nombreux domaines peut tre considre la fois comme bndiction et la maldiction de ceux qui sont impliqus dans leurs initiales et ultrieures scale-up isolements. Cette diversit se reflte dans un large panel des proprits physico-chimiques qui font qu'il est difficile de concevoir des procdures gnriques d'extraction et de purification. Lorsque la structure du compos cible est connue, les mthodes dclares pour les composs apparents peuvent tre consults comme points de dpart pour le dveloppement de scale-up des procds. Pour les composs totalement nouvels, une approche empirique doit tre adopte. Nous nous concentrons sur la description des stratgies de scale-up qui ont t efficaces dans notre exprience et les illustrer en rfrence deux tudes de cas, les problmes de scale-up qui leur sont associes, et leur rsolution ventuelle.

Aux fins du prsent chapitre, nous avons donc interprter mise l'chelle=scale-up : la gnration des quantits accrues d'un compos particulier pour une valuation approfondie la suite d'une manifestation initiale de valeur potentielle. Notre point de dpart est donc un produit naturel qui a dj t produite et purifie en quantit suffisante et la puret de sa structure ont t lucids dans la plupart des cas (bien que dans certains cas particulirement difficiles, mise l'chelle peut-tre besoin d'tre initi pour permettre l'achvement de structure de l'lucidation). Avec les techniques modernes de spectroscopie, la caractrisation initiale peut tre ralis avec 5 mg ou moins de la plupart des mtabolites secondaires. Scale-up ncessite non seulement une purification efficace, souvent dsign comme le traitement en aval (DSP), mais aussi augmentation de la production du compos cible livrer les quantits et la puret appropries pour l'utilisation prvue ou le stade de l'valuation.

Les programmes de scale-up pour les produits microbiens dans l'industrie pharmaceutique sont sous la responsabilit des quipes interdisciplinaires composes de scientifiques de fermentation et de purification des chimistes. Les problmes lis la mise l'chelle et la purification de produits naturels changent souvent tout au long du cycle de dveloppement des diffrents composs: de la dcouverte et la caractrisation initiale, grce des programmes de relations structure-activit et de soutien pour les premires tudes prcliniques, le dveloppement ventuel et la dfinition de commerce processus de production viables, capables de transfrer rapidement dans l'environnement de fabrication. Les scientifiques de
scale-up et de purification doivent travailler en parallle chaque tape pour comprendre et grer ces changements de priorits en tant que le compos se dplace d'une phase une autre. Dans les

premiers stades de ces programmes, il ya gnralement une tension entre les besoins de fournir du matriel rapidement pour acclrer l'valuation et la volont de dvelopper les processus de fermentation et de purification pour amliorer l'efficacit de l'isolement. Le succs de la premire activit peut justifier celle-ci mais elle favorise galement la demande pour les besoins matriels accrus. Bien que les priorits changent frquemment au cours de projets de dveloppement, il ya toujours un besoin d'adopter des approches pragmatiques que les ressources quilibre et un calendrier (donc il sera parfois ncessaire de prioriser une fermentation particulire en utilisant un non ou un processus sous-optimale). La premire tape de mise l'chelle est gnralement englober la production de 100 mg plusieurs grammes quantit du compos cible pour des utilisations diverses allant de l'valuation biologique tt pour initier un programme officiel de drivation semi-synthtique tablir des relations structure-activit et de produire des analogues avec des produits thrapeutiques amlioration proprits. Ce travail peut tre dmarr dans l'chelle du laboratoire fermenteurs (1-20L volumes), mais peut tre complt de manire plus efficace en utilisant l'chelle pilote fermenteurs (50-500L volumes). Parce mtabolites microbiens sont souvent produites en tant que familles de mtabolites de structure apparente, cette tape de mise l'chelle fournit souvent l'occasion d'identifier les composants mineurs lis au mtabolite d'origine de l'intrt et, une fois purifi et valus, ceux-ci peuvent aussi avoir des proprits utiles.
D'autres tapes de mise l'chelle impliquent des quantits de matriaux partir de 100 g en kilogrammes multiples et au-del pour le dveloppement prclinique et clinique, qui, en cas de succs, en fin de compte aboutir grande chelle de fabrication. Ces tapes ncessitent procd chelle fermenteurs (> 1m3) et de l'quipement DSP de taille approprie et des installations. La production de cette envergure et les considrations associes aux contrles de la documentation et de la qualit entour par Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) sont largement au-del de la porte

de ce chapitre la condition que les mthodes adoptes dans les premiers stades de dveloppement devraient idalement tre robuste et adaptable la fabrication chelles. Notre chapitre se concentre principalement sur l'chelle pilote de fermentation et le processus de dveloppement en aval .. Dans sa forme la plus simple, la mise l'chelle peut tre atteinte seulement par laugmentation de l'chelle de production compos et purification ultrieure. Il ya des moments o cette approche est la voie la plus pratique pour obtenir un compos rapidement. Il existe un risque invitable, cependant, que toute augmentation de l'chelle, sans processus de dveloppement suffisant, ne sera pas russie. Une approche alternative et est gnralement prfrable d'augmenter la concentration de la cible par rapport compos de composs indsirables (impurets) dans le matriau traiter. Cela amliore non seulement l'efficacit de la production mais aussi de rduire la complexit de la purification flux de produit entrant. Cela peut amliorer de manire significative la facilit de purification en aval et aboutir des rendements amliors. Ce dernier cours est gnralement effectu avec des produits microbiens sous la forme d'un programme intgr de dveloppement de procds pour amliorer la fois la fermentation et des processus de DSP. Les cots et l'efficacit des processus devenu plus important que l'chelle augmente, et il y aura toujours une certaine marge pour amliorer le procd de purification elle-mme. L'isolement compos initial, dans la plupart des cas, ont t bioessai guide, avec une vitesse d'identification de l'objectif majeur, et est donc trs peu probable d'avoir t efficace en termes de niveaux de production, soit composs ou des rendements tape de purification. Que l'chelle de fonctionnement augmente, pour les produits de fermentation au moins, de sorte que la proportion de l'ensemble intensification processus reprise par les activits DSP. L'importance de la relation entre la production et la DSP du compos cible, et la possibilit de faciliter cette dernire activit en amliorant l'ancien, ne peut pas tre trop fortement soulign . 2-Methodes 2.1- Tests et quantification des produits L'importance de la fiabilit des analyses quantitatives, comme des outils pour diriger le dveloppement du processus de scale-up, en mesurant les concentrations de composs cibles dans les fermentations et dans des extraits concentrs ou luats lors des diffrentes tapes de purification, ne doit pas tre sous-estime. Ils permettent la dtermination prcise des rendements tape, fournissant ainsi un moyen de mesurer et amliorer l'efficacit. Dosages appropris sont gnralement chromatographique et devrait tre capable de dbits levs (typiquement 10-100 d'chantillons par jour). Phase inverse liquide haute performance (HPLC chromatogaphy) mthodes avec dtection par spectromtrie UV / visible ou occasionnellement de masse sont utiliss le plus souvent. Dtecteurs de diffusion de la lumire par vaporation (ELSDs) permettent la dtection de tous les composs dans un chantillon, y compris ceux qui n'ont pas d'absorbance UV, et d'ajouter une dimension supplmentaire au moment d'valuer la puret. Ces mthodes chromatographiques sont prfrables aux tests bass sur l'activit biologique, travers laquelle de nombreux produits naturels sont d'abord dtects et a dcouvert, que ces tests mesurent une rponse globale l'ensemble des composs actifs prsents dans un chantillon. tant donn que la majorit des mtabolites secondaires sont produits sous forme de mlanges de composs troitement apparents avec des degrs variables d'activit, des tests d'activit biologique fournira une rponse composite qui pourrait induire en erreur en ce qui concerne un compos particulier. Il est galement possible d'effets synergiques ou antagonistes entre les composants d'un mlange de ces dosages biologiques. Les Dosages chimiques des composs spcifiques sont donc utiles pour quantifier les diffrents composs sparment dans une srie. Il ya un risque, cependant, de trop compter sur un test qui est trs spcifique du produit. Pour le dveloppement de la fermentation, au moins, il ya du mrite dans la gestion en parallle d'un produit spcifique HPLC avec un gradient d'lution mthode qui permet des changements bruts dans le profil global mtabolite surveiller. Il est relativement frquent dans le dveloppement de procds mettre en uvre une amlioration souhaitable des caractristiques

du processus (par exemple, un titre plus lev, meilleure composition moyenne, pour n'en nommer que quelques-uns) qui produit galement un impact indsirable sur le processus (par exemple, un changement dans le profil des composantes mineures, modifications morphologiques dans l'organisme producteur, et ainsi de suite). Il est donc essentiel que les techniques analytiques appliques tre suffisamment large pour ramasser les changements souhaitables et non souhaitables pendant la phase de dveloppement. 2.2- Dveloppement de fermentation.

Les principes gnraux de dveloppement de processus ont t dcrits dans la premire dition de ce volume (1). Par consquent, nous n'avons pas ritrer ces principes ici. Au lieu de cela, nous mettons jour et d'largir ces observations initiales et illustrer par des rfrences rcentes le cas chant. Par exemple, nous citons une tude de cas qui illustre les approches les plus classiques pour le processus de dveloppement, et en plus, illustre l'importance d'avoir une collection de cultures taxonomique wellcharacterized, qui peut tre explor non seulement pour les nouveaux mtabolites secondaires, mais aussi pour d'autres proprits biologiques intressantes telles que les organismes qui peuvent produire des composs apparents ou possdent des activits enzymatiques utiles qui peuvent tre utiliss pour modifier certaines molcules. Nous fournissons galement une brve introduction de base la demande croissante des techniques de recombinaison pour le processus de dveloppement. 2.2.1- Reproductibilit et l'inoculum
La premire tape dans l'optimisation des processus implique gnralement une enqute sur la composition du milieu. Les rendements de type sauvage organismes sont souvent autour de 1 mg / L ou moins, et l'optimisation milieu peut tre un moyen efficace pour amliorer rapidement les rendements plus de 100 mg / L. Ces premires tudes d'optimisation de scne sont gnralement effectues dans des flacons agits et ont tendance tre bas sur des mthodes statistiques exprimentales telles que la Patte Burman, surface de rponse, multivarie et analyse en composantes principales. Reproductibilit du processus est un pralable ncessaire avant que le dveloppement et l'optimisation des processus peut commencer, ou plus correctement, il pourrait tre considr comme la premire tape, car il fournit une base de rfrence fiable contre lequel les jauges d'amliorations futures. Ceci est particulirement important lors de l'utilisation de mthodes statistiques de conception exprimentale, o la variabilit des processus peuvent tre interprts tort comme une amlioration statistiquement significative.

Il n'est pas rare que des organismes producteurs de produits naturels pour afficher un certain degr d'instabilit physiologique et mtabolique qui, en pratique, peut se manifester par un manque de reproductibilit, par exemple, de l'activit dans un essai biologique en aval. Prcieuses ressources et beaucoup de temps peut tre lie la fois dans l'isolement de fermentation et chimiques en essayant de traquer ces'''' perdus ou variable'''' activits de type sauvage isolats. Il est donc souhaitable dans un premier temps que l'activit initiale se reproduit de la mme faon que la fermentation initial. Une activit confirme d'une telle refermentation fournira le scientifique mise l'chelle avec la confiance ncessaire pour prendre le coup plus loin.
La premire mise l'chelle de fermentation doit de prfrence tre ralise dans un systme aussi proche que possible de la fermentation systme dans lequel le tube a t dtect pour la premire utilisation de plusieurs units-Si ncessaire, pour viter les complications inutiles avec d'intensification questions. Par exemple, si le coup initial a t dtecte dans un extrait obtenu partir d'une fermentation de 50 ml flacon boug, puis flacons agits multiples pourraient tre utilises pour produire des volumes jusqu' 5-10 L. Si le referment est couronne de succs, il ajoute la confiance croissante dans l'activit et augmente la probabilit que l'activit permettra de

renforcer en fermenteurs agits. Si le referment choue, alors ce risque indique quelques problmes avec une mauvaise reproductibilit plutt qu'une question de mise l'chelle. Par ailleurs, si le matriel est disponible, fermenteurs de paillasse peut tre utilise, si cette stratgie est adopte, il est souhaitable qu'un referment'''' tre de confirmation longent le fermenteur. Le referment confirmation comprendra normalement un (ou plusieurs) flacon de 250 ml boug dconcert (s), spcialement conu pour imiter de plus prs la situation physique dans un fermenteur (2). Ceux-ci contiennent 50 ml de culture prises directement partir de la cuve de fermentation aprs l'inoculation et serait parallle incuber dans le fermenteur et chantillonn et rcolte similaire. S'il n'y a pas d'activit dans le fermenteur, mais l'activit dans le ballon, c'est une indication claire qu'il peut y avoir une vritable mise l'chelle problme. Si l'activit est perdu la fois dans le fermenteur et ballon, il pointe vers un problme de reproductibilit ou un problme technique. Cette stratgie n'est pas seulement applicable lors du passage de ballon fermenteur, mais il est galement recommand d'inclure une confirmation referment ct de chaque augmentation d'chelle de fermentation pour fournir un contrle de qualit interne sur la qualit de l'inoculum et prparation du milieu. Lors du dplacement de 5L 50L fermenteurs, par exemple, le referment confirmation serait un fermenteur de 5 litres, et ainsi de suite chaque augmentation d'chelon dans l'chelle. Mauvaise reproductibilit peut souvent tre li des questions de reproductibilit dans la production d'inoculum (3-5). Par exemple, l'inoculum peut ne pas tre entirement dvelopp ou suffisamment dvelopps morphologiquement (par exemple, la sporulation, conidiation, myclium diffus ou granuls, la diffrenciation des hyphes, etc), le matriau de dpart (cryotubes, glose incline, et ainsi de suite) utilise pour inoculer la phase d'amorage pourrait ne pas tre conforme, ou la composition du milieu de semences pourrait ne pas convenir. Comprendre les problmes avec l'inoculum peut souvent tre guid par l'examen microscopique simple de l'organisme en pleine croissance dans la phase d'amorage. Par exemple, de nombreux actinomyctes et les champignons prsentent une morphologie bien enrobes lorsque la composition du milieu ne convient pas. Dans d'autres cas, comprendre la nature prcise de la variabilit peut tre difficile, mais il est important d'tre clair quant savoir si la variabilit dans un processus dcoule des spcificits de l'tape de la production elle-mme ou partir de l'tape de production de semences. Dans l'tude de cas du XR543 (voir sous-rubrique 3.2.), la fois les problmes de reproductibilit et un temps de latence prolonge ont t simplement limins en permettant plus de temps pour la phase d'amorage de dvelopper (3-6 j), ce qui entrane une bien dvelopp et l'inoculum uniforme pour le transfert dans la cuve de production. 2.2.2- approches recombinantes

Il peut y avoir aucun doute la valeur des mthodes traditionnelles de titres produits, tels que l'augmentation des cycles successifs de mutagense alatoire et de dpistage ont rvl beaucoup de succs notables pour les divers produits naturels, y compris la pnicilline, l'rythromycine, la tylosine et la daptomycine (6). Ces techniques empiriques sont maintenant compltes par des approches plus rationnelles recombinantes, ainsi que l'utilisation de cette technologie dans le processus de dveloppement de procds de produits naturels a augment de faon spectaculaire au cours des dernires 10 ans (7-9). Des techniques de recombinaison ont t utiliss non seulement pour augmenter la production (10,11), et de rduire les impurets (12), mais aussi de crer de nouveaux composs de nombreux structurellement lis au produit microbienne initiale caractris (8,13).
L'un des inconvnients de cette approche est que, avec les modifications dlibres introduits dans un hte pendant le processus de clonage, un certain nombre de mutations pliotropiques non identifiables sont aussi parfois mis en place. La consquence est que ces souches recombinantes peuvent prsenter des proprits physiologiques qui diffrent sensiblement de la souche mre. Les

titres produits sont gnralement beaucoup plus faible, et les caractristiques de fermentation tels que la morphologie, la consommation d'oxygne et le taux de croissance peuvent galement tre affects (10). En outre, ces techniques se prtent la production d'un grand nombre de souches qui doivent tre valus pour l'amlioration des processus possibles. Cela signifie qu'une approche gnrique efficace l'optimisation des souches recombinantes, tandis que hautement souhaitable, peut tre difficile raliser tant donn que chaque souche peut possder diffrentes caractristiques de la fermentation. Plusieurs approches ont t tentes avec diffrents degrs de succs, mais rcemment, des exemples de russite ont t rapports par des chercheurs utilisant des souches prouves de production industrielle comme htes pour l'expression htrologue (8,10). Cette approche vise compenser la baisse de la productivit et de toute drive dans les proprits de dformation en utilisant un hte trs productive et bien caractris . 2.3- Traitement en aval( DSP) :

Comme dj indiqu, il n'existe pas de processus de purification gnrique qui peut tre applique des produits naturels en raison de leur composition chimique large et la diversit biologique, et donc le processus de purification doivent tre adaptes pour les groupes composs d'intrt particuliers. Procds d'isolement scale-up ont t dvelopps avec succs pour une grande varit de produits naturels. Comme les dtails des mthodes d'extraction et de purification applicables grande chelle isolement des produits naturels sont bien couverts dans un livre publi assez rcemment (14), nous nous concentrons sur les stratgies DSP et les principes que nous avons trouv pour tre utile et d'illustrer leur application des tudes de cas de sous-positions 3.
Lorsque vous commencez dvelopper un procd de purification grande chelle, il est important d'tablir certains paramtres et des objectifs tels que la nature et les proprits du compos, le compos se trouve, combien d'tapes de traitement seront ncessaires depuis l'extraction jusqu' purifi produit final, l'conomie et des considrations futures de scurit pour chaque tape du processus, et la puret et la quantit requise pour le produit final. Les deux derniers lments dpendront de l'utilisation prvue et les exigences deviennent plus strictes que progresse un compos de l'valuation prclinique des essais cliniques pour un ventuel ingrdient pharmaceutique actif (IPA) d'tat. Mise l'chelle de la purification de produits naturels implique souvent plusieurs tapes couvrant une varit de techniques diffrentes. Chaque technique employe doit trouver un quilibre entre la rsolution, la vitesse, la capacit et la rcupration (rendement), et devrait tre slectionn pour correspondre aux objectifs de chaque tape du processus. L'efficacit globale du processus dpendra du nombre d'oprations unitaires ainsi que le rendement chaque tape. Il convient de souligner que le rendement (en grammes ou en kilogrammes de produit) de la premire tape a le plus d'impact sur la quantit de produit obtenu la fin du processus. Perte de produit pendant la rcupration initiale est difficile rattraper dans les tapes ultrieures, et donc l'effort d'amlioration est gnralement meilleur en priorit sur les premires tapes du processus. Elaborer des mthodes de purification peuvent tre dveloppes et mises en uvre pour une utilisation l'chelle du laboratoire, mais une telle approche risque que la suite mise l'chelle sera impossible. Il est gnralement une stratgie judicieuse pour maintenir le processus aussi simple que possible, en minimisant la manipulation des chantillons et le nombre d'tapes de purification. Les Mtabolites secondaires microbiens sont biosynthtises intrieur de la cellule et souvent scrte dans le milieu extracellulaire environnante produits-c'est gnralement le cas avec les actinomyctes. Certains produits, en particulier des champignons, toutefois, soit restent dans la cellule ou sont scrtes mais reste troitement associe la paroi cellulaire. Ces composs

biomasse associes ncessitent une certaine forme d'extraction avant qu'ils puissent tre traits plus loin. Occasionnellement, un produit apparatra dans la biomasse et surnageant, dans ce cas, il est prfrable de traiter un seul flux de produit. L'approche peut tre ici de procder une extraction tout-bouillon ou d'essayer de manipuler le bouillon de sorte que le produit peut tre rcupr dans la fraction de la biomasse ou l'autre ou le surnageant (voir sous-rubrique 3.1.). Diffrentes approches sont adoptes lors de l'laboration d'un procd de purification de produits de la biomasse associes ou extracellulaire, mais en gnral, il ya quatre tapes cls qui peuvent tre appliques aux deux catgories et une description de base est donne ci-dessous. 2.3.1- Clarification :

Cette tape permet une sparation de la biomasse du milieu de fermentation aqueux avant l'tape de traitement suivante. Les deux techniques les plus courantes qui sont utilises pour cette tape sont la filtration (par exemple, filtration frontale, la microfiltration, filtration tangentielle) et centrifugation. Le rsultat net est soit de fournir un surnageant exempt de particules, ou le filtrat pour la capture des produits, ou de la biomasse pour l'extraction ultrieure. Il est essentiel que le bouillon clarifi est exempt de particules pour empcher l'encrassement des rsines qui peuvent tre utiliss lors de l'tape de capture. La plupart de la biomasse associe des produits naturels sont extractibles l'eau des solvants miscibles tels que le mthanol (MeOH) et de l'actone, mais il est galement important pour la biomasse soit aussi sec que possible pour amliorer l'efficacit de l'extraction et de maintenir le volume de solvant organique ncessaire pour un minimum.
L'un des centrifugeurs plus couramment utilis pour la clarification du bouillon est une centrifugeuse pile de disques tels que celui utilis pour la purification de xenovulene (voir sous-positions 3,1.). Ce type de centrifugeuse a tendance tre moins efficace en granuls qui spare les cultures telles que ceux habituellement observs avec fongiques fermentations-due en partie des espaces troits entre les disques empils et en partie la mthode de dcharge boue. Ils ont tendance fournir un surnageant qui, dans notre exprience, ncessite une filtration supplmentaire avant de passer l'tape de capture, et un rtentat riche en biomasse, qui est vacue sous forme de boue humide et pourrait prsenter des difficults dans la ralisation efficace d'extraction par solvant sans schage supplmentaire. Pour les cultures filamenteux, nous avons trouv des systmes de sparation volutives telles que la PowerfugeTM Carr fournir une solution de sparation plus pratique. Ce type de centrifugeuse semi surmonte la plupart des problmes rencontrs avec la pile de disques non seulement en fournissant des forces centrifuges leves (20.000 g), mais aussi en vitant l'utilisation de disques et par la possession d'un systme lgant de dcharge contenu. Ce systme donne plus souvent un bouillon exempt de particules et un endroit sec, fraction de biomasse souvent poudreuse ou friables qui facilite grandement la suite d'extraction par solvant.

Lors de l'utilisation de filtration comme l'tape de sparation initiale, il ya un certain nombre de stratgies qui peuvent tre utilises pour amliorer l'efficacit du procd de l'tape telle que l'addition d'adjuvants de filtration tels que clite, ou de modification des conditions de fermentation (par exemple, l'ajustement du pH ou de la temprature ) pour provoquer une prcipitation ou de floculation. Des prcautions doivent tre prises, cependant, lorsque des additifs sont utiliss, car ils peuvent interfrer avec la substance d'intrt et sera trs probablement tre enlevs avant les tapes supplmentaires de purification.
2.3.2- capture et concentration du produit : L'objectif de cette tape consiste simplement capturer, se concentrer et stabiliser le compos cible du flux de produit clarifi. Il est important que cela soit effectu le plus rapidement et le plus efficacement possible afin qu'il minimiser les ventuels effets de extracellulaires enzymes de

dgradation et des acides qui peuvent tre prsents dans la fermentation. Pour les produits extracellulaires, l'tape de capture dpend de la nature chimique du compos cible. Pour les composs hydrophobes, un solvant non miscible l'eau tel que l'actate d'thyle (EtOAc) ou le butanol peut tre utilis. Mais la manipulation de grandes quantits de ces solvants peut tre problmatique et peu pratiques grande chelle. Dans notre exprience, il est gnralement prfrable d'utiliser une rsine d'adsorption hydrophobe, dans lequel le compos est conserv et se concentre sur la rsine et polaires flux de contaminants par le biais non lie ralisant ainsi une purification brut. La rsine est ensuite lave l'eau pour liminer les impurets faiblement liaison avant lution du produit partir de la rsine avec un tel solvant miscible l'eau comme l'actone ou de MeOH. Un certain nombre de rsines d'adsorption que nous avons trouv pour tre utile sont numrs dans le tableau 1. Ceux-ci diffrent dans la taille des particules, la porosit et la slectivit. Il est possible d'atteindre un niveau suprieur de purification si une rsine plus slectif est utilis ce stade, ou en utilisant un rgime plus lution solvant spcifique o la force d'lution est que progressivement augment. Mais il est souvent plus pragmatique consistant utiliser une rsine relativement grossires telles que Diaion HP20, qui permet des dbits levs et pour terminer la capture et l'lution rapidement. Pour les produits lis la biomasse, la capture et la concentration sont atteints par extraction par solvant. Dans les deux cas, le rsultat est un extrait de solvant, qui est sch sous pression ( l'aide d'envergure vaporateurs rotatifs, voire un vaporateur couche mince), pour obtenir un extrait stable prt pour la prochaine tape de purification.

Si le compos cible est acide ou basique, puis une colonne de capture l'aide d'un anion ou d'une rsine changeuse de cations peut tre utilise (Tableau 1), avec lution par l'ajustement du pH ou par augmentation de la force ionique de l'luant. Par ailleurs, si le compos devient hydrophobe sur la neutralisation, la suppression ionique par ajustement du pH suivie par l'utilisation de la rsine hydrophobe comme ci-dessus peut tre plus appropri. Pour les composs hydrophobes, il est possible de raliser une extraction directe sur bouillon de fermentation non spare l'aide d'un solvant miscible l'eau tel que EtOAc, ce qui en omettant la ncessit de clarifier spare et tapes de capture de produits et en fournissant potentiellement une meilleure efficacit des processus globaux et les rendements des produits. Les dfis majeurs ce sujet sont la manipulation de ces solvants en toute scurit, et de traiter avec des mulsions qui peuvent se former, grande chelle. Une autre technique capable de capturer des produits directement partir de bouillon entier est dtendu lit d'adsorption (EBA) de chromatographie, qui utilise un seul passage travers une rsine d'adsorption. EBA est actuellement limite aux produits extracellulaires, principalement des protines et des peptides qui se lient l'change d'ions et les rsines d'affinit, mais a t utilis pour la purification de immunomycin (15) et pneumocandines (16).
2.3.3. Chromatographie Le rsultat net de la prise du produit et des tapes de concentration est un extrait assez rudimentaire ncessitant une purification extensive qui ncessite souvent plusieurs tapes de sparation chromatographique comprenant soit un mlange de mesures plus basse rsolution en utilisant diffrents modes de sparation ou un petit nombre de mesures haute rsolution. Les mthodes chromatographiques appliques dpendra des proprits physico-chimiques du compos cible et les impurets partir de laquelle il doit tre spar. Mthodes chromatographiques qui sont largement utiliss dans l'intensification sont la chromatographie d'adsorption en utilisant des rsines avec une haute slectivit, d'anions et chromatographie d'change de cations et HPLC prparative en utilisant phase inverse phases stationnaires. Pour les composs hydrophobes, la chromatographie en phase normale est devenu beaucoup plus facile raliser l'chelle avec le dveloppement de flash chromatographie en utilisant l'quipement comprime radialement cartouche premballs

colonnes (17,18). tapes chromatographiques utilises dans le premier procd de purification sera destin la purification intermdiaire de sorte que plus l'enlvement de contaminants en vrac partir du compos cible et ses analogues est atteint. Une dernire tape haute rsolution, parfois appel une tape de polissage, est utilis pour enlever les traces de contaminants et d'isoler le compos cible et ses analogues comme des entits uniques. HPLC prparative (voir chap. 8) est la mthode la plus couramment utilise pour cette tape. Le procd de purification peut aboutir l'isolement et la caractrisation des constituants mineurs lis si cela est jug utile, mais le but ultime sera efficace, conomiquement viable purification du compos cible elle-mme. tapes de purification chromatographique ont tendance tre lents et coteux exploiter, afin ils doivent tre rduites au minimum et tre conu pour tre aussi efficace que possible. 2.3.4. Cristallisation et lyophilisation Une fois la puret a t atteint, les composs sont en gnral sous la forme d'un luat d'une colonne de chromatographie dans un mlange solvant organique / eau, ou dans un tampon contenant des sels. Ces solvants et les sels exiger l'enlvement de stabiliser le compos cible sous une forme utilisable. Des sels tampons peuvent tre facilement limins par des colonnes de dessalement ou par diafiltration, tandis que les solvants peuvent tre vapor en laissant le compos dans la phase aqueuse avant le schage sous une forme solide par lyophilisation (conglation-schage). Cristallisation (voir chap. 11) ou la prcipitation peut acclrer la rcupration de produit pur cristallin ou poudre formes solides, mais les mthodes appropries doivent tre dveloppes spcifiquement pour chaque nouveau compos. Un exemple publi rcemment d'un rgime d'isolement avec succs en utilisant la chromatographie d'adsorption et prparative HPLC en phase inverse, et culminant dans une tape de cristallisation, c'est l'isolement grande chelle de l'pothilone D, exprim de manire htrologue dans des fermentations 1000L xanthus Myxococcus (19). 2,4. Produits naturels provenant de sources non microbiennes 2.4.1. Plant Products Les dfis scale-up de travailler avec des produits vgtaux sont bien connus et, partant, ne sont traits que trs brivement ici. La variabilit des matires premires peut tre cause par diffrents gnotypes; saisonnier, variation diurne et gographique et les diffrences phnotypiques entre les diffrentes parties de plantes et plants de diffrents ges (20). Il est donc important de saisir toutes les informations pertinentes relatives la matire vgtale lors de la premire source de dpistage, de sorte que les chances d'tre en mesure d'obtenir du matriel rapprovisionn un stade ultrieur contenant les mmes mtabolites sont maximises. Ces dfis aussi des opportunits actuelles pour les programmes d'enqute matires premires analogues certains aspects du dveloppement de fermentation. Ainsi, si un compos phytochimique plomb est difficile obtenir et ne se prte pas la synthse chimique totale, alternative d'approvisionnement travers la collecte et l'tude des autres membres du mme genre, ou d'autres plantes connues pour produire des composs similaires peuvent tre lances. Le suivi ultrieur par la modification de semi-synthtique de drivs connexes, plus abondantes combines des stratgies culturales alternatives telles que l'tablissement de plantations ou de cultures de tissus vgtaux peuvent galement tre pris en considration (21). L'exemple clbre est celui du Taxol?, O les proccupations relatives l'impact environnemental de l'original approvisionnement de l'corce de l'if du Pacifique, Taxus brevifolia, a conduit l'laboration ventuelle d'un procd de fabrication bas sur la modification de semi-synthtique de la 10dsactylbaccatine III obtenue partir de coupures de plantations de l'if europen, T. baccata (21). Il convient de noter que la dcision d'investir des ressources dans la recherche de voies alternatives de la fabrication du Taxol n'a t prise qu'aprs une excellente activit a t observe dans les essais cliniques.

2.4.2. produits de la mer De toutes les sources tablies de produits naturels biologiquement actifs, les organismes marins constituent les principaux dfis en termes de mise l'chelle pour la dcouverte de mdicaments et le dveloppement (22). Non seulement le milieu marin par nature plus difficile pour la collecte de l'chantillon, mais bon nombre des problmes associs aux plantes s'appliquent galement, en particulier variation de la production de mtabolites entre les chantillons d'un mme organisme recueillies auprs de diffrentes zones gographiques ou mme de diffrentes profondeurs (23). Mtabolites marins sont intressants pour la dcouverte de mdicaments cause des puissances remarquables de leurs activits biologiques et de leurs structures chimiques diffrentes et complexes.

Les puissances sont, cependant, gnralement traduit par de faibles concentrations de ces mtabolites tant prsents dans les organismes producteurs. Par consquent, des collections de grands volumes d'organismes producteurs peuvent tre ncessaires pour complter lucidation de la structure mme de mtabolites d'intrt avant de penser l'chelle pour une valuation plus pousse, ce qui conduit d'importantes proccupations sur l'impact environnemental et l'exploitation durable. Il est logique que les scientifiques intresss par la dcouverte et le dveloppement devrait se concentrer sur les organismes qui peuvent tre rchantillonnes facilement en grandes quantits (22). La complexit structurale de mtabolites marins rend gnralement difficile synthse totale n'importe quelle chelle, en particulier celui qui a besoin d'tre commercialement viable. Produit de la mer l'chelle et de ravitaillement ont t traites avec succs par l'aquaculture de la neritina bryozoaire Bugula pour bryostatine 1, et l'ascidie Ecteinascidia tubinata pour ectinascidine 743, les deux composs ayant un potentiel anticancreux important (23). Les dtails d'un isolement grande chelle de bryostatine 1 suivantes bonnes pratiques de fabrication ont t dcrits (24). De nouvelles possibilits sont prsentes par l'hypothse que certains mtabolites trouvs chez les invertbrs marins sont effectivement produites par les micro-organismes associs. Si ces symbiotes peuvent tre cultives de faon indpendante produire des mtabolites d'intrt, puis mise l'chelle peut tre plus simple, mme si la culture ici dfis restent levs (22). Alternativement, les groupes de gnes pour la biosynthse de ces produits dans les micro-organismes, ou, ventuellement, chez les invertbrs marins ont pu tre identifis et transfrs par des approches gntiques molculaires dans des organismes plus facilement cultives en laboratoire (25). 3. tudes de cas Jusqu' prsent, nous avons discut des approches et stratgies gnrales plutt que des difficults spcifiques et les mthodes utilises pour les surmonter. Mise l'chelle est difficile de dcrire ainsi que de pratiquer. Nous pensons qu'il est mieux pour illustrer les dfis et des solutions adoptes, travers deux tudes de cas.
3,1. Un Xenovulene La production de XR368 (Fig. 1), un agoniste des rcepteurs GABA-roman benzodiazepene (26), dans le champignon Acremonium strictum, a t amlior, passant de 1 mg / L 100 mg / L par l'application de mthodes statistiques Burman Patte de conception exprimentale essayer d'identifier les sources de carbone et d'azote dans le milieu amliorerait le produit titre. Maltose a t identifie comme une composante cl de support pour amliorer la productivit, et cela a t encore amlior en doublant l'ensemble ratio C: N du milieu (27). Sur la dcouverte initiale, xenovulene A est une composante mineure dans un mlange produit complexe qui est ncessaire purification laborieuse principalement par de multiples tapes HPLC en phase inverse. L'amlioration titre a t accompagne d'une amlioration trs significative de la simplicit du profil mtabolique observe. Un Xenovulene est devenu le produit de fermentation majeure permettant

DSP beaucoup plus simple. Ce processus de fermentation a t ensuite largies directement 3000 L avec une performance constante celle observe dans le modle de l'chelle du laboratoire.

La phase initiale de tout purification par fermentation est la capture du produit. Lors de la cessation de la fermentation, xenovulene A a t trouv galement rpartis entre le surnageant de fermentation et la biomasse, partir de laquelle il a t libr facilement par addition de solvants organiques. Il aurait t possible de traiter le surnageant et la biomasse comme deux flux de produits distincts, mais cela aurait t laborieux, gnralement, il est toujours prfrable de travailler sur un flux de produit unique. Nous avons opt dans ce cas pour essayer de librer le produit de la biomasse associe dans le surnageant avant le bouillon de fermentation a t rcolt dans le rservoir. Ceci a t ralis en ajoutant Tween 1% la fermentation 1 h avant la rcolte, qui a la concentration du produit dans le surnageant > 90% (voir note 1).
L'quipement, l'chelle de l'exploitation, les limites du procd et la qualit de bouillon sont quelques-uns des facteurs qui rgissent la technique de sparation utiliser. Pour la fermentation strictum A., malgr la culture tant granuls, centrifugation donn lieu une telle biomasse suffisamment bien spars et le surnageant que cette technique tait adapt l'chelle directe l'chelle 500L avec un Westfalia centrifugeuse chemine d'vacuation intermittente disque. Le xenovulene a ensuite t captur partir du surnageant sur un Diaion HP20 rsine 40L (Mitsubishi) colonne (30 cm? 60 cm et un dbit linaire de 100 cm / h) par chromatographie d'adsorption. Aprs lavage l'eau, le produit a t lue de la colonne avec de l'actone, et l'luat sch sous pression rduite pour un concentr aqueux en utilisant un vaporateur film mince cyclone. Cette tape de capture sur HP20 tait donc une tape de chromatographie basse rsolution, sa fonction principale tait non seulement de piger le compos cible et des analogues troitement lis dans le surnageant, mais aussi pour faciliter une rduction du volume du flux de produit avant la oprations unitaires suivantes. Une purification supplmentaire de xenovulene a t obtenue par extraction de revenir le concentr aqueux (15 L) avec de l'EtOAc (2? 15 L). Xenovulene, un compos non polaire, a t partag dans la phase organique en laissant d'autres impurets polaires dans la phase aqueuse. Partitionnement solvant (voir chap. 10) comme cela est souvent utilis comme une tape de nettoyage dans l'isolement produit naturel. Modification du pH et de la force ionique ou de la phase aqueuse peut influer sur les coefficients de partage et des composs d'entranement dans et hors des phases diffrentes, aboutissent une purification partielle. Expriences de criblage initiaux avec chromatographie en couche mince (TLC) Plaques et une gamme de diffrents mlanges de solvants indiqu qu'un semipurification assez rudimentaire et rapide pourrait tre obtenue par une sparation chromatographique en phase normale sur silice, souvent appele chromatographie flash (15,16) . Ceci a t ralis en utilisant une colonne de silice SORBSILTM 15L et une phase mobile isocratique constitu de l'hexane: EtOAc (2:1) et 0,1% d'acide actique; xenovulene riches en fractions ont t runies aprs une analyse HPLC. La ralisation de cette tape de sparation cette chelle a t facilite par des avances significatives en flash chromatographie (quipement Biotage FlashTM technologie de compression radiale), qui venait d'tre disponibles au moment de ce travail. Ces laboratoire l'chelle de production des systmes de chromatographie clair en utilisant des colonnes de silice pr-emballs sont disponibles pour la purification de gram--kilogramme quantits de compos. Xenovulene ce stade de la purification est d'environ 70-80% pure par CLHP. Haute puret xenovulene (> 95%) a t obtenu en utilisant une tape de polissage final haute rsolution impliquant HPLC prparative en utilisant une Kiloprep

Biotage KP250? HPLC et un systme 100mm 600mm colonne BONDAPAKTM C18 avec une phase mobile isocratique de l'eau: MeOH (25:75) et le dbit de 400 ml / min .. Les fractions riches en composs ont t rassembles et sches sous pression rduite avec la poule finale qui donne 21,5 g de xenovulene avec un rendement global du procd de 43% pour un processus en 5 tapes, correspondant approximativement un rendement moyen de 85% pour chaque tape du processus (figure . 2). 3,2. XR543 [(6S) -4,6-Dimethyldodeca-2E, 4E-Dienoyl Phomalactone] La valeur d'une collection de cultures taxonomique caractrise peut tre illustre par l'histoire chelle pour la production du nouveau driv phomalactone XR543 (28). Ce fut le membre le plus puissant d'une srie d'inhibiteurs de l'activation des macrophages (roman 6-substitu 5,6-dihydro-apyrone esters) qui se trouvent dans les fermentations de la souche fongique Phomopsis sp. 22502 (fig. 3). La premire de la srie est d'identifier XR379, un nouvel ester d'un analogue de l'acide connu mtabolite fongique phomalactone. Cet expos seulement une activit modre biologique, mais il a t jug utile d'tudier le mlange complexe de mtabolites produits dans les fermentations de ce champignon pour la prsence de plus de membres actifs de la srie. Premire mise l'chelle dans des fermenteurs de travail ont port principalement sur l'augmentation du volume des tubes essai de flacons agits puis 2 L et 10L fermenteurs. Comme le processus emmnag dans des fermenteurs, il a t not que l'organisme producteur possde une morphologie particulirement difficile. Les fermentations ont tendance avoir une phase de latence prolonge (jusqu' 7 jours), qui a t suivie par une priode de croissance rapide conduisant de trs fortes hmatocrite (> 70%) et une trs visqueux oxygne limite bouillon. Alors que les titres d'XR379 sont parfois bons environ 300 mg / L, une mauvaise reproductibilit signifie qu'une forte proportion de lots produits produit peu ou pas.

Ces questions ont t abordes initialement en essayant de contrler les niveaux de biomasse en rduisant la concentration moyenne. Bien que ce rsultat fait en moins de biomasse, elle a galement permis une meilleure matrise de la fermentation par l'vitement de la limitation d'oxygne et donc la productivit globale volumtrique a t rellement amlior. La phase de latence prolonge a t limin en augmentant la priode d'incubation de l'inoculum de 3 6 d d veiller ce qu'une graine toujours bien dvelopp a t transfr dans chaque phase de production. La rsolution de ces problmes de reproductibilit a t suivie par des tudes rapides d'optimisation moyen et l'utilisation du contrle du pH qui, cumulativement, a entran la productivit des processus pour atteindre plus de 800 mg / L. Comme le titre du XR379 augment, tout comme le ceux des autres membres de la srie qui avait d'abord t difficile d'isoler et de caractriser.
L'effort a pay avec l'isolement et la caractrisation des XR543, (6S) -4,6-dimethyldodeca-2E, 4Edienoyl phomalactone. XR543 tait de 25 fois plus actif que le XR379 dans le test d'activation des macrophages et obtenu de bons rsultats dans les essais secondaires. Comme XR543 titres taient beaucoup plus faibles que ceux des XR379, un producteur de phomalactone a t demand de fournir un modle la fois pour la synthse des XR543 lui-mme, et pour permettre la synthse d'analogues de sonder l'activit de cette srie autre compos. Ceci a t facilit par la dcouverte d'une autre souche fongique (Paecilomyces sp. 3527), qui a produit phomalactone lui-mme comme un mtabolite majeur sur la fermentation. Transfert du Paecilomyces sp. dans le processus de fermentation dj optimis pour le Phomopsis sp. cd des titres est suprieure 600 mg / L de produit la premire tentative.

La stratgie de purification utilis ici est similaire xenovulene sauf que XR543 est un compos associ aux cellules qui est extractible avec du MeOH et le fonctionnement de l'appareil utilis pour la premire tait une combinaison de filtration et l'extraction par solvant. En cas de rsiliation de la fermentation, 5 L d'un 20% (v / v) de Hyflo Supercel clite dans l'eau a t ajoute au bouillon (pour agir comme un adjuvant de filtration) et on mlange avant de passer le mlange travers un filtrepresse. La biomasse retenus et le mlange clite ont ensuite t extraites in situ par pompage et de recirculation 25 L de mthanol travers le filtre-presse pendant 24 h. L'extrait de solvant est rcupr partir de la presse et sch sous pression rduite pour un concentr aqueux (10 L) l'aide d'un vaporateur couche mince. La fraction aqueuse a ensuite t partag par extraction rpte de retour avec un volume gal d'actate d'thyle: hexane (1:1). XR543, tant de nature lipophile, extrait dans la phase organique en laissant les impurets polaires dans la phase aqueuse. L'extrait au solvant a t sch sous vide un faible volume (50 ml) et ensuite fractionn par chromatographie clair en utilisant un systme Biotage Flash Chromatographie 75 avec un 100 300mm Hyperprep KPsilTM 32-62 mm colonne de silice et une phase mobile isocratique (EtOAc: hexane 1:1) avec un dbit de 250 ml / min. XR543 fractions riches en ont t regroupes, et une purification finale par HPLC prparative (HPLC Waters Delta PrepTM systme avec 25 mm de colonne NovapakTM 200mm 5 C18 et une phase mobile isocratique d'actonitrile 85%: 15% d'eau et 0,1% v / v acide actique l'acide et le dbit de 50 mL / min) ont abouti un compos pur avec un rendement global du procd de 20%. Phomalactone a t purifie partir du bouillon de fermentation clarifi l'aide d'un processus en trois tapes. Initialement, la capture et la concentration du bouillon clarifi est obtenu par extraction dans de l'EtOAc et vaporation sous pression rduite. Elle a t suivie par un fractionnement brut sur gel de silice en utilisant un systme Biotage Flash Chromatographie 75 et une phase mobile isocratique (100% EtOAc). Phomalactone riches en fractions ont t rassembles puis ensuite purifi par HPLC prparative en utilisant une Shandon Hyper prparation BOSTM HS C18 (100 A 12 mm) colonne (ID 10 30 cm de longueur?) Et une phase mobile isocratique (85% d'eau: actonitrile 15% , le dbit de 170 mL / min) pour donner pur phomalactone. 4. noter 1. L'ajout de surfactants et d'autres produits chimiques pour librer des composs dans le bouillon est bien connu, mais des prcautions doivent tre prises pour que leur addition ne pas interfrer avec les tapes de purification ultrieures.

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