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MedC sera caractrise par des fragments de masse spcifique (Figure 21 D). A partir du
chromatogramme de courant ionique total, il est possible dobtenir un chromatogramme
correspondant uniquement au courant ionique dune masse spcifique. Ces chromatogrammes
sont appels chromatogrammes dextraction dions . La quantification des molcules est
dtermine partir des chromatogrammes TIC et des chromatogrammes dextraction dions
des masses des fragments spcifiques de la dC et de la 5mdC. La spcificit et la sensibilit
de la quantification sont majores en utilisant les chromatogrammes dextraction dions. Les
temps de rtention de la dC et de la 5-MedC sont dtermins grce linjection de standards.
Ils sont respectivement de 6 et 10 minutes dans nos conditions analytiques. Chacun de ces
fragments, reprsentatif dun compos, est utilis pour quantifier ce compos partir de laire
sous la courbe dfinie par le pic sur le chromatogramme correspondant au temps de rtention
du compos. Pour chaque dtecteur et chaque molcule, nous avons tabli des gammes talon
permettant de convertir laire sous la courbe en concentration, exprime en nano molaire (nM)
et ainsi faire le rapport des concentrations de ces deux composs prsents dans le mme
chantillon. Le taux de 5-MedC dans les gnomes analyss est dfini comme suit : % 5-MedC
= [5-MedC (nM) / dC (nM) + 5-MedC (nM)] * 100. Les gammes ralises en HPLC/DAD
donnent des courbes de rgression dont le coefficient de linarit est trs satisfaisant (0,999).
En revanche, le seuil de dtection des molcules ne permet pas de dceler de faibles
concentrations en 5-MedC (<0,21 M). Si les courbes des gammes obtenues partir des
chromatogrammes dextraction dions ont des coefficients de linarit moins bons, cette
mthode a toutefois un seuil de dtection plus bas. Parmi les ions-fragments reprsentatifs de
la dC et de la 5-MedC, ceux qui permettent ltablissement de gammes talon les plus
linaires (dont le coefficient de linarit est suprieur 0,99) sont respectivement les ions-
fragments m/z 455 et m/z 483, correspondant tous deux aux formes [2M+H]
+
des composs.
Les gammes tablies pour la dC et la 5-MedC partir de ces extractions dions, ainsi qu
partir des chromatogrammes DAD, sont prsentes sur la Figure 22. Nous avons test la
validit de notre mthode de quantification en mesurant les taux de mthylation de deux
oligonuclotides de mme squence (). Le premier, loligonuclotide mthyl (OM),
comporte cinq cytosines mthyles sur neuf. Le second est loligonuclotide non mthyl
(ONM). Cette mthode de quantification a t valide par lobtention des taux de 5-MedC
attendus pour loligonuclotide mthyl (% 5-MedC = 44%) ainsi que pour loligonuclotide
non mthyl (pour lequel nous navons pas dtect de 5-MedC).
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Figure 22. Gammes talon utilises pour la quantification des dC et 5-MedC
Ces gammes ont t tablies en mesurant laire sous la courbe (axe des ordonnes) du pic
correspondant aux fragments m/z 455 et m/z 483 (avec les fragmenteurs 60 et 120), 280nm
pour des concentrations croissantes en nM de dC et 5-MedC. Les coefficients directeurs de
chacune des courbes ainsi que le coefficient de linarit R
2
sont renseigns.
y = 643817x
R = 0,97964
0,E+00
5,E+06
1,E+07
2,E+07
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
m/z 455 frag 120
y = 60,072x
R = 0,99829
0
500
1000
1500
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
Chromato UV
y = 461015x
R = 0,99045
0,00E+00
2,00E+06
4,00E+06
6,00E+06
8,00E+06
1,00E+07
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
m/z 455 frag 60
y = 585415x
R = 0,99314
0,00E+00
5,00E+06
1,00E+07
1,50E+07
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
m/z 483 frag 60
y = 916438x
R = 0,9912
0,00E+00
5,00E+06
1,00E+07
1,50E+07
2,00E+07
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
m/z 483 frag 120
y = 50,779x
R = 0,99933
0,00E+00
2,00E+02
4,00E+02
6,00E+02
8,00E+02
1,00E+03
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
Chromato UV
M M
M M
M M
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Figure 23. Chromatogrammes des extractions dions correspondant aux fragments spcifiques
de la dC (m/z 455) et de la 5-MedC (m/z 483)
A, Echantillon oligonuclotide mthyl (les cytosines marques en rouge sont mthyles).
B, Echantillon oligonuclotide non mthyl . Aucun pic correspondant la 5-MedC (m/z
483) nest dtect dans lchantillon non mthyl au temps de rtention de ce compos
(encadr en pointills rouges).
Afin dvaluer la reproductibilit de notre mthode de quantification, nous avons
ensuite ralis six injections diffrentes, des jours diffrents, dun mlange quimolaire de dC
et 5-MedC, des concentrations de 1000ng/mL (4,4M) dont le taux de 5-MedC est de 50 %.
GCCGAATGCTGACATTCCGGCCGAATGCT
GCCGAATGCTGACATTCCGGCCGAATGCT
A. Oligonuclotide mthyl
B. Oligonuclotide non mthyl
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m/z 455 frag 60
m/z 455 frag 120
m/z 483 frag 60
m/z 483 frag 120
m/z 455 frag 60
m/z 455 frag 120
m/z 483 frag 60
m/z 483 frag 120
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Les quantifications absolues des dC et 5-MedC sont mesures pour chaque chantillon en
DAD 280 nm (Figure 24A) et en MS avec les ions-fragments 455, et 483 avec les
fragmenteurs 60 et 120 (Figure 24B). La quantification absolue en DAD 280 nm de ces
chantillons est reproductible alors quelle prsente une variabilit importante en MS.
Nanmoins, ces deux outils de mesure sont robustes et hautement reproductibles pour ltude
de la quantification relative du taux de 5-MedC par rapport aux dC totales, (vrifi par
ANOVA1, Fobs=2,38 ; Fseuil=3,68 ; p=0,127) (Figure 24C). Nous avons galement
quantifi les taux 5-MedC dans le thymus de veau et les cellules humaines Hela, frquemment
utiliss comme contrle de quantification et pour lesquels les valeurs publies sont
respectivement 2,3 % et 6,4 % (Brown et al. 2007; Stach et al. 2003). Une autre tude a
montr que le taux de mthylation de lADN de thymus de veau peut tre compris entre 4,75
% et 8 ,1 % (Kok et al. 2007). Un groupe de scientifique anglo-saxon a publi dans Journal
of Chromatography B la mthode de quantification des taux de 5-MedC par HPLC et
spectromtrie de masse que nous tions en train de mettre au point (Sandhu et al. 2009). Les
taux de 5-MedC mesurs pour les cellules Hela et le thymus de veau sont respectivement de
3,02 % et 6,26 %. Une nouvelle mesure des 5-MedC sera ralise prochainement afin de
vrifier ces rsultats.
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Figure 24. Tests de quantification de nuclosides standards en lecture UV et en spectromtrie
de masse
Afin de vrifier la robustesse de la quantification et la reproductibilit des rsultats, nous
avons ralis une srie de 6 injections sur diffrents jours de la mme solution quimolaire de
dC et 5-MedC. Les quantifications absolues de la dC et de la 5-MedC ont t dtermines en
lecture UV (A) et en spectromtrie de masse (B) en utilisant les ions fragments m/z 455 pour
la dC et m/z 483 pour la 5-MedC (fragmenteurs 60 et 120). La quantification relative du taux
de 5-MedC de la solution a t effectue (C) avec les mesures dtermines en lecture UV et
en spectromtrie de masse avec les coefficients directeurs correspondants.
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40,00
30,00
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uv frag 60 frag 120
0,00E+00
1,00E+02
2,00E+02
3,00E+02
1 2 3 4 5 6
UV C
0,00E+00
5,00E+01
1,00E+02
1,50E+02
2,00E+02
2,50E+02
3,00E+02
1 2 3 4 5 6
UV 5mdC
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2,00L+06
4,00L+06
6,00L+06
8,00L+06
1,00L+07
1,20L+07
1,40L+07
m/z 433 frag 60 m/z 433 frag 120
dC (m/z 455)
0,00L+00
3,00L+06
1,00L+07
1,30L+07
2,00L+07
m/z 483 frag 60 m/z 483 frag 120
5mdC (m/z 483)
M M
M M
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Frag 60 Frag 60 Frag 120 Frag 120
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1.3. Rsultats
Les ADN des gnomes des 12 espces de drosophiles, fournis par le Drosophila
STOCK CENTER de San Diego (Californie), sont extraits partir dembryons de moins de
16 heures. Nous avons ajout cette tude des ADN extraits partir dembryons de moins de
deux heures des populations naturelles de Makindu (D. simulans) et du Sngal (D.
melanogaster). Les rsultats des taux de mthylation, reprsents sur laFigure 25, sont
prliminaires et la ralisation dun rplicat biologique permettra la validation statistique des
rsultats.
Figure 25. Dtermination du taux de 5-MedC dans les gnomes de drosophiles
La dviation standard, reprsente pour chaque chantillon (barre verticale), a t tablie
partir des valeurs obtenues par les fragmenteurs 60 et 120.
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Nos rsultats montrent que les taux de mthylation dans les gnomes de drosophiles
sont globalement faibles et infrieurs 1 %. Les espces D. sechellia, D. yakuba, D.
mojavensis et D. grimshawi possdent des taux de mthylation de lADN infrieurs 0,50 %
tandis quil est de 0,71 % pour D. simulans. Nos rsultats ne sont pas en accord avec les taux
de mthylation dADN dembryons de moins de deux heures prcdemment publis (Marhold
et al. 2004) pour les espces D. melanogaster (0,37 %) et D. pseudoobscura (0,21 %) pour
lesquelles nous observons respectivement 0,58 % et 0,50 % de 5-MedC. Aucun niveau de 5-
MedC na pu tre dtect pour lespce D. willistoni, pour laquelle la quantit en dC est
quivalente celle mesure chez D. ananasae dont le taux de 5-MedC est pourtant de 0,67 %.
La prsence de mthylation sexe-spcifique au niveau des squences rptes dADN
ribosomaux chez des adultes de D. willistoni a cependant t montre par enzymes de
restriction et Southern-blot (Garcia et al. 2007). Ainsi, les taux de mthylation de lADN des
embryons de cette espce sont probablement faibles et infrieurs au seuil de dtection de
notre technique.
Les taux de mthylation des embryons de moins de deux heures, obtenus pour les
populations naturelles du Sngal (D. melanogaster) et de Makindu (D. simulans), sont eux
aussi trs faibles. En effet, le taux de 5-MedC est de 0,04% pour la population naturelle de
Makindu et non dtectable pour celle du Sngal. Les taux de 5-MedC mesurs sont
largement infrieurs ceux obtenus avec les gnomes des souches squences des espces
correspondantes, dont les ADN ont t extraits partir dembryons gs de moins de seize
heures. Bien que ces derniers chantillons sont composs dembryons dges diffrents, les
taux quasi nuls de 5-MedC obtenus sur les populations naturelles ne sont pas en accord avec
les donnes bibliographiques, selon lesquelles les taux de mthylation sont plus levs dans
les embryons de moins de deux heures que dans ceux de moins de seize heures (Lyko et al.
2000). De fait, nous pouvons alors envisager que les populations naturelles prsentent des
caractristiques pigntiques diffrentes de celles des souches de laboratoires quant la
mthylation de lADN. Une deuxime rptition de ces mesures, en cours, et permettra de
vrifier ces rsultats.
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2. Exploration de la prsence de cytosines mthyles au
niveau des ET dans des populations naturelles de D.
melanogaster et D. simulans
2.1. Utilisation de couples disoschizomres pour dterminer la prsence de cytosines
mthyles
Dans certains gnomes comme celui dA. thaliana, les ET sont une cible privilgie
des DNMT, et plus globalement des systmes de rgulation pigntique impliqus dans leur
rgulation et le maintien de leur stabilit. Il a t observ chez la drosophile que des
squences dET sont retrouves dans des fractions enrichies en 5-MedC par
immunoprcipitation de lADN mthyl (Salzberg et al. 2004). Le taux de mthylation chez
D. simulans par HPLC et spectromtrie de masse tant de 0,70 %, nous avons voulu savoir si
les ET y taient mthyls dans la ligne germinale des populations naturelles de cette espce.
Pour cela, jai utilis une approche par enzymes de restriction, dans le but de mettre en
vidence la prsence de sites de restriction mthyls dans des squences dET par la
technique de MSRE combine de la PCR. Les endonuclases sont des enzymes possdant
un site de restriction propre, lactivit de clivage du site de restriction par lenzyme pouvant,
dans certains cas, tre inhibe. Ceci est notamment le cas lorsquune ou plusieurs cytosines de
ce site sont mthyles. Lutilisation denzymes clivant le mme site de restriction (ou
isoschyzomres) est particulirement intressante puisque certaines dentre elles sont
sensibles, ou non, la prsence de 5-MedC au site de restriction. Ainsi, il est possible
didentifier un site de restriction localis dans la rgion rgulatrice dun ET, associ deux
isoschyzomres dont lun sera sensible la prsence de 5-MedC et lautre pas. Des amorces
de PCR positionnes de part et dautre du site de restriction permettent de vrifier
lamplification dans les cas de digestion avec une enzyme sensible et une enzyme non
sensible. Jai tudi les rtrotransposons LTR de rfrences Roo, tirant, et 412 ainsi que
llment LINE F. Les populations tudies proviennent du Sngal et de Chicharo (Portugal)
pour lespce D. melanogaster et de Chicharo, Makindu (Kenya), Zimbabw, Grand Ferrade,
Papetee, Canberra, Runion, Can River, Amieu et Anjiro pour lespce D. simulans. Pour
toutes ces populations, les nombres de copies euchromatiques des quatre ET analyss ont t
estims par hybridation in situ, et sont reprsents dans le Tableau 4 (p.75).
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Tableau 4. Nombre moyen de copies des lments F, Roo, 412 et tirant dtermin par
hybridation in situ dans les populations naturelles de D. melanogaster et D. simulans.
D.
melanogaster
D. simulans
Sn Chi Chi Mak Zim Gra Pap Can Ru CaR Ami Anj
F 16 32,5 1 0 0 37 13/0 10,5 0 3 1 ND
Roo 44,5 65 40 40,5 45 41,5 33,5 47,5 43,5 40 28 ND
412 24,5 33,5 16,5 2,5 9 11 20 58 5,5 5 7 ND
Tirant 9 15 0 4 2,5 0 2 0,5 2 0 0 ND
Sn: Sngal, Chi: Chicharo, Mak: Makindu, Zim: Zimbabw, Gra: Grand Ferade, Pap:
Papetee, Can: Canberra, CaR: Can River, Ami: Amieu, Anj: Anjiro.
A partir des squences de rfrence des quatre ET tablies chez D. melanogaster et D.
simulans, jai dtermin dans leur rgion 5, des sites de restrictions pouvant tre clivs par
des enzymes sensibles ou non la mthylation via le logiciel NEB CUTTER
(http://tools.neb.com/NEBcutter2/; (Vincze et al. 2003). La structure canonique de chacun de
ces ET est reprsente sur la Figure 26 sur laquelle sont galement positionns les sites de
restriction des enzymes ainsi que les amorces utilises pour la PCR. Puisque la mthylation de
lADN au niveau des rgions codantes des gnes a t mise en vidence chez D. melanogaster
(Salzberg et al. 2004), jai intgr mon tude des sites de restriction localiss dans les
parties codantes de llment F. Pour les lments tirant et 412, ainsi que pour les sites F
ORF1 et F ORF2 localiss dans les parties codantes de F, les couples MspI/HpaII, dont HpaII
est lenzyme sensible, ont t utiliss. Pour les lments Roo et la rgion 5 de F, les couples
AvaII/BsoBI et BsmAI/BsmBI ont t respectivement utiliss, AvaI et BsmBI tant les
enzymes sensibles. Les sites de restriction de ces enzymes contiennent tous un CpG sur lequel
la prsence dune mthylation empchera lenzyme sensible de cliver le site. Un schma
illustrant cette technique avec les enzymes MspI et HpaII est reprsent sur la Figure 27 et les
sites de restriction de chaque enzyme sont dtaills dans la partie Matriels et Mthodes.
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Figure 26. Recherche de sites mthyls dans la rgion 5 de quatre ET.
Les structures canoniques de tirant, 412, Roo et F sont reprsentes (gag : gne de la
nuclocapside ; pol : gnes de la transcriptase inverse et intgrase ; env : gne de lenveloppe ;
LTR : Long Terminal Repeat). Les sites de restriction des enzymes utilises pour les
digestions sont positionns ainsi que les couples damorces utiliss pour la PCR (flches
noires).
9000
gag
ORF2 ORF1
1000
pb
tirant
412
Roo
F
Site de restriction
MspI/HpaII
MspI/HpaII
AvaII/BsoBI
BsmAI/BsmBI
MspI/HpaII MspI/HpaII
F 5 F ORF1 F ORF2
5LTR
5LTR
3LTR
3LTR
pol
Gag/pol/env
3LTR 5LTR gag pol env
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Figure 27. Illustration de la technique de MSRE.
A: un fragment dADN non mthyl. B: un fragment dADN mthyl, au niveau du
dinuclotide CpG du site de restriction du couple MspI/ HpaII dont la squence nuclotidique
est CCGG. Lenzyme sensible (S) est HpaII et lenzyme non sensible (NS) est MspI. Aprs
digestion, une amplification PCR avec les amorces situes de part et dautre du site de
restriction permet de visualiser sur gel dagarose si le fragment est cliv (pas damplification
= rectangle vide) ou non (amplification = rectangle plein). Le contrle non digr (ND)
permet de visualiser la bande attendue si le fragment nest pas cliv, et le contrle ngatif
(contrle -) permet de vrifier que la digestion est totale.
S
NS
ND
Contrle -
Marqueur de
taille
A: site non mthyl
S NS
ND
Contrle -
Marqueur de
taille
B: site mthyl
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2.2. Rsultats
Lamplification par PCR des fragments correspondant aux ET analyss diagnostique
la prsence ou non de cytosines mthyles au niveau du site de restriction des enzymes
utilises. Les produits de PCR sont dposs sur gel dagarose, comme reprsent sur la Figure
28 pour la population du Sngal (D. melanogaster). Les rsultats montrent que lenzyme
sensible na pas cliv les sites de restriction correspondant aux rgions 5 des lments F et
tirant, dans les ovaires et les testicules, ce qui signifie que ces sites de restriction sont
mthyls dans ces tissus. Llment Roo nest pas mthyl dans les ovaires et testicules de
cette population.
Figure 28. Dtection de cytosines mthyles par enzymes de restriction dans la population de
Sngal (D. melanogaster).
LADN extrait partir dovaires et de testicules a t digr avec les enzymes de restriction
MspI, BsoBI et BsmAI, non sensibles (NS) et HpaII, AvaI et BsmBI sensibles (S). Les
produits de digestion ont ensuite servi dADN matrice pour une amplification PCR avec des
amorces situes de part et dautre des sites de restriction spcifiques des lments F, Roo, 412
et tirant. Un tmoin de PCR partir dADN non digr (C+) a t ralis. La prsence dun
produit damplification partir dADN trait avec lenzyme sensible signifie une absence de
coupure par cette enzyme due la prsence dune cytosine mthyles au niveau du site de
restriction.
Le polymorphisme nuclotidique qui peut exister au sein de la squence des ET
conduit des digestions partielles si les sites polymorphes sont localiss au niveau des sites
de restriction des enzymes utilis. Afin de contrler la digestion de ces sites dans toutes les
populations, jai vrifi la digestion par les enzymes non sensibles la mthylation de lADN
des produits de PCR de chaque couple damorces utilises. Dans tous les cas, les produits de
PCR sont digrs, signifiant quaucun polymorphisme nexiste dans les chantillons au
niveau des sites tudis.
C+
F
Roo
412
tirant
S
ovaires testicules
NS C+ S NS
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Dans la suite de mon manuscrit, lensemble des rsultats sera simplifi et chaque site
sera reprsent par un cercle rempli en noir sil est mthyl, et vide sil ne lest pas. Ces
rsultats sont reprsents sur la Figure 29. De nombreux sites mthyls ont pu tre mis en
vidence par cette mthode dans les populations de D. melanogaster et D. simulans pour
lensemble des ET tudis lexception de Roo. En effet, pour cet ET, seul un site mthyl a
pu tre mis en vidence dans lADN des ovaires de la population de Chicharo (D. simulans).
Pour F et 412, les sites de restriction analyss sont mthyls dans les ovaires dans un
grand nombre de populations. En revanche, dans les testicules, ces mmes sites ne sont pas
mthyls dans la plupart des populations (sauf Sngal (D. melanogaster) et Amieu (D.
simulans)).
Figure 29. Mise en vidence de sites mthyls dans les rgions 5 de quatre ET de rfrence
Makindu
Sngal
Chicharo
Chicharo
F
Makindu
Zimbabw
Grand Ferrade
Papeete
Canberra
Runion
Can river
Amieu
Anjiro
Roo tirant 412
Sngal
Chicharo
Chicharo
Zimbabw
Grand Ferrade
Papeete
Canberra
Runion
Can river
Amieu
Anjiro
Ovaires
Testicules
dDNMT2-/-
D. melanogaster
D. simulans
D. melanogaster
F Roo tirant 412
dDNMT2-/-
D. simulans
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Pour tirant, le site de restriction est mthyl au niveau des ovaires dans toutes les
populations sauf Grand Ferrade (D. simulans) et au niveau des testicules dans les populations
de Sngal et Chicharo de D. melanogaster, et Chicharo, Makindu, Can River et Amieu de D.
simulans.
Les sites de restriction localiss dans les LTR 5 des lments Roo, 412 et tirant, ainsi
que dans la rgion non codante 5 de F sont donc mthyls dans la plupart des populations au
niveau de la ligne germinale femelle. Ces mmes sites ont aussi t identifis comme
mthyls dans la ligne mutante dDNMT2-/-, utilise comme contrle.
Les donnes de BGS obtenues lors de lanalyse de tirant sont en contradiction avec
nos donnes obtenues par enzyme de restriction. En effet, le site de restriction qui apparat
mthyl nest pas retrouv dans les rsultats prsents dans le premier chapitre de ma thse,
concernant les profils de mthylation de la LTR5 de tirant dans les ovaires et les testicules de
la population de Makindu.
La mthode de dtection par simple PCR des fragments non digrs par lenzyme
sensible peut amplifier des squences minoritaires non retrouves dans les clones squencs
du premier chapitre. Afin de vrifier cela pour les autres ET, jai dtermin par BGS les
profils de mthylation des rgions 5 de F, Roo et 412 comprenant les sites de restriction
tudis, partir dADN dovaires de la population de Makindu (Figure supplmentaire 4,
Figure supplmentaire 5, Figure supplmentaire 6). Les sites de restriction analyss tant
sensibles la mthylation des cytosines des dinuclotides CpG, jai calcul la frquence de
mthylation des cytosines en fonction de leur contexte dinuclotidique partir des profils de
mthylation de F, Roo et 412 (Figure 30). Le dinuclotide CpG du site de restriction des
enzymes MspI et HpaII (CCGG) a t retrouv mthyl dans un clone sur 29 pour llment
412. Aucune mthylation des sites de restriction analyss pour F et de Roo na pu tre
identifie par BGS. Les cytosines mthyles de la rgion 5 de F et 412 concernent tous les
dinuclotides avec une prfrence au niveau des dinuclotides CpA et CpG pour F et CpA,
CpG et CpT pour 412. Les cytosines mthyles de la rgion 5 de Roo sont exclusivement
localises au niveau de dinuclotides CpA et CpT, pour lesquels aucune mthylation
symtrique na t identifie par bisulfite. Ce rsultat est cohrent avec les rsultats obtenus
avec lenzyme AvaI, sensible la prsence de CpG mthyls.
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Figure 30. Frquence de dinuclotides mthyls dans les rgions 5 de Roo, F et 412
ADN extrait partir dovaires de la population de Makindu (D. simulans), puis trait au
bisulfite de sodium.
Figure 31. Mise en vidence de sites mthyls dans les rgions codantes de F
Enfin, les sites F ORF1 et F ORF2 localiss dans les parties codantes de llment F
sont mthyls dans lensemble des populations analyses (Figure 31) sauf dans la ligne
mutante dDNMT2-/-.
u,uu
u,1u
u,2u
u,Su
u,4u
u,Su
u,6u
u,7u
u,8u
u,9u
CpA CpC Cpu CpT
Roo
I
412
Sngal
Chicharo
Chicharo
ORF 1
Makindu
Zimbabw
Grand Ferrade
Papeete
Canberra
Runion
Can river
Amieu
Anjiro
ORF 2
dDNMT2-/-
Ovaires
D. melanogaster
D. simulans
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2.3. Conclusion
La mthylation de lADN chez les 12 gnomes de drosophiles est faible avec un
niveau de 5-MedC infrieur 1%. Nous ne pouvons pas tablir de corrlation entre la
proportion en 5-MedC dun gnome et sa quantit en ET, ce qui suggre que la mthylation
des cytosines chez la drosophile nest pas principalement dirige contre les ET. Chez D.
simulans, nous avons cependant mis en vidence des cytosines mthyles au niveau de
dinuclotides CpG pour les rgions 5 de F, 412 et tirant. Ce travail exploratoire doit tre
approfondi et il est ncessaire de pouvoir vrifier ces rsultats par des techniques diffrentes.
Pour cela, plusieurs mthodes sont envisageables. Il serait trs enrichissant de raliser des
Methyl DNA ImmuniPrcipitation (MeDIP) dans les populations naturelles de D.
simulans et de cloner et squencer lADN enrichi en 5-MedC. Aussi, il serait opportun de
dterminer le profil de mthylation sur tout le long de la squence dun ET, afin de voir si des
profils spcifiques de mthylation peuvent tre mis en vidence au niveau des cytosines dans
les parties codantes de ces ET. Les rsultats obtenus au niveau des parties codantes de
llment F favorisent lhypothse dune mthylation de lADN lintrieur des gnes, et cela
devra tre tudi pour les autres ET. Enfin, lexistence dune diffrence de mthylation entre
les lignes germinales mle et femelle est confirme.
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DISCUSSION - PERSPECTIVES
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1. Problmes dinterprtation des donnes produites par
bisulfite
Dans divers organismes, de nombreuses tudes utilisant le traitement au bisulfite ont
mis en vidence la prsence de Densely Methylated DNA Island (DMI), qui prsentent
des taux de mthylation suprieur 50% (Wang et al. 2001; Tasheva et Roufa, 1995; Tasheva
et Roufa, 1994). Dans le cadre de ltude de la rgulation somatique du rtrotransposon
Invader 4 chez D. melanogaster, des squences fortement mthyles, correspondant la
LTR5 de cet lment, ont t rapportes (Phalke et al. 2009). Ces rsultats, obtenus par
bisulfite sur de lADN extrait partir dembryons de moins de deux heures, montrent des
profils de mthylation des cytosines sans prfrence dinuclotidique, avec des taux de 5-
MedC trs levs (>50%). Les amorces utilises pour lamplification aprs traitement ne sont
pas dgnres et sont donc favorables lamplification prfrentielle des squences non
converties. Les conditions de traitement, caractrises par une courte phase de damination
dune heure avec une solution de bisulfite de sodium de faible molarit (3,1 M), ont t
remises en question quelques mois plus tard (Schaefer et Frank Lyko, 2010). De plus, il a t
montr que la conversion des cytosines non mthyles par des solutions de bisulfite de
sodium de faible molarit (< 5,5 M) ncessite une phase de damination plus longue pour
obtenir une efficacit de conversion de lordre de 95 % (Genereux et al. 2008). Ainsi, jai
considr que de telles squences, obtenues durant ma thse, devaient tre considres
comme des artefacts, les expriences complmentaires ralises par la suite ne montrant pas
un tel type de profil de mthylation. Chez A. thaliana, il est admis que les taux de mthylation
sont levs et aussi bien symtriques quasymtriques. Rcemment, Slotkin et al (2009)
proposent ce titre un modle de la rgulation des ET dans le pollen reposant principalement
sur la prsence de ces squences fortement mthyles. Lexpression des ET dans le pollen est
suprieure celle trouve dans les autres tissus de la plante et est associe une
dmthylation de leurs rgions rgulatrices. Le grain de pollen contient un noyau vgtatif et
un noyau germinal (sperme), et les rsultats de ces auteurs montrent que les squences dET
correspondant au noyau vgtatif prsentent une dmthylation des trinuclotides CHH,
tandis que les squences dET du sperme sont hypermthyles au niveau de ces mmes
positions. Les auteurs proposent via leur modle que les transcrits dET produits dans le
noyau vgtatif sont clivs en petits ARN allant cibler la mthylation des sites correspondant
dans le gnome du sperme et ainsi rguler lexpression des ET. Ce modle repose en partie
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sur des rsultats de bisulfite montrant de longues chaines de cytosines mthyles sans
prfrence dinuclotidique sur les brins sens et antisens de fragments dADN du noyau
germinal. Ces profils de mthylation ressemblent fortement ceux mis en vidence dans mes
rsultats prliminaires sur les populations de Makindu et Zimbabw de D. simulans et doivent
tre interprts avec prcaution. En effet, dans les travaux de cartographie de la mthylation
de lADN chez A. thaliana, il a t considr que les squences contenant plus de trois
cytosines mthyles conscutives dans un contexte CHH sont non converties (Cokus et al.
2008). Dans cette tude, lefficacit du traitement au bisulfite est estime 99,97 %, en
prenant comme rfrence le taux de conversion du gnome non mthyl du chloroplaste.
Malgr toutes ces prcautions, des squences fortement mthyles ont t obtenues, dont le
profil de mthylation prsente une priodicit de 150 pb conserve entre les clones. Cette
priodicit est dfinie comme lalternance de rgions fortement mthyles et de rgions plus
faiblement mthyles. Selon ces auteurs, cette distance de 150 pb correspond la distance
entre deux nuclosomes qui seraient positionns au niveau des rgions faiblement mthyles,
et lADN enroul autour du nuclosome serait moins accessible aux DNMT (Cokus et al.
2008). Pour les populations de Makindu et Zimbabw, les squences non converties ont des
profils fortement corrls les uns avec les autres (Figure supplmentaire 1, p.159), ce qui
suggre que ces profils ne sont pas dus des artefacts alatoires le long de la squence
dADN, mais plutt des composants molculaires ou protiques qui empcheraient la
conversion des cytosines non mthyles certaines positions. Ces profils prsentent
galement une priodicit de lordre de 150 pb comparable celle observe dans les
squences fortement mthyles du gnome dA. thaliana (Cokus et al. 2008). De plus, cest
dans la population de Makindu, dans laquelle tirant est transcrit, que la proportion de
squences non converties est la plus forte. La relation entre lARN et la mthylation de
lADN fait intervenir le mcanisme de RNA directed DNA Methylation (RdDM) chez la
plante, et permet la mise en place de profils de mhylation spcifiques au niveau des
squences dET htrochromatiques (Mathieu et Bender 2004). Cependant, rien nexplique de
manire vidente comment le mcanisme de RdDM permet la mthylation de toutes les
cytosines dune squence. Toujours chez la plante, et aprs avoir test plusieurs mthodes
diffrentes de traitement au bisulfite, dautres auteurs ont ralis deux traitements conscutifs
permettant dobtenir une efficacit de conversion de 99,14 % (taux de conversion du gnome
du chloroplaste) (Lister et al. 2008). Dans cette tude, pour laquelle les petits ARN ont t
totalement squencs, les auteurs ont mis en vidence la correspondance entre les squences
de ces derniers et les squences fortement mthyles avant den conclure que les petits ARN
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sont impliqus dans la mise en place de ces profils de mthylation. Durant ma thse, jai mis
en avant que labsence de squences non converties tait corrle avec labsence
dhtroduplexes ARN/ADN. Le traitement au bisulfite de sodium convertit les cytosines des
molcules dADN dnatures. Par consquent, les homoduplexes ADN/ADN ainsi que les
htroduplexes ARN/ADN peuvent empcher la conversion des cytosines de ces squences.
Le traitement au bisulfite se fait dans un thermocycleur une temprature de 64C et favorise
ainsi des hybridations ADN/ARN sur certaines rgions. Un article sur la prsence
dhtroduplexes ARN/ADN et leur implication dans les artefacts lis au traitement au
bisulfite est actuellement en prparation.
Henderson et al (2010) a publi un article sur les conditions exprimentales
appliquer pour obtenir des rsultats fiables issus de traitements au bisulfite de sodium chez les
plantes, dans lequel il rappelle que de longues chaines de cytosines conscutives mthyles
correspondent lamplification par PCR dADN non converti. Ainsi, tout rsultat obtenu
aprs traitement au bisulfite qui montre de fortes quantits en 5-MedC dans une squence doit
tre prouv par une autre approche permettant de vrifier ces profils, notamment lutilisation
denzymes de restriction. Pour ce faire, jai donc vrifi cela par lutilisation denzymes de
restriction sensibles et non sensibles la mthylation de lADN. Cette approche, qui ma
permis de montrer que tirant nest pas hypermthyl dans les populations naturelles de D.
simulans, a rvl que le gnome de ces populations nest pas dpourvu de 5-MedC. En effet,
de nombreux sites de restriction localiss dans des squences dET sont mthyls dans un
grand nombre de populations. De plus, lidentification de certains sites de restriction mthyls
dans la ligne mutante dDNMT2 suggre que dautres enzymes capables de mthyler les
cytosines de lADN peuvent tre prsentes chez cette espce.
Rcemment, la spectromtrie de masse a permis la dcouverte dune nouvelle
modification pigntique associe aux cytosines. Les 5-hydroxymethylcytosines (5-
OHMedC) rsultent de lajout dun groupe hydroxyle sur les 5-MedC par les enzymes de la
famille Tet, trs conserves chez les mammifres. Les 5-OHMedC sont particulirement
enrichies dans les cellules de Purkinje du cerveau (Kriaucionis et Heintz, 2009), et absentes
des cellules cancreuses. Des mutations dans des protines de la famille Tet ont de plus t
associes des leucmies mylodes (Tahiliani et al. 2009), suggrant aini que les 5-
OHMedC influeraient la rgulation de certains gnes. Ces 5-OHMedC, contrairement aux 5-
MedC, ne permettent pas la fixation de la Methyl Binding Protein MeCP2 (Valinluck et
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al. 2004). Enfin, les 5-OHMedC sont converties de la mme manire que les 5-MedC par le
bisulfite de sodium. Cette technique ne distingue donc pas les 5-MedC des 5-OHMedC dans
une squence (Huang et al. 2010). Bien quun orthologue de la famille TET ait t identifi
chez D. melanogaster (Tahiliani et al. 2009), nous navons pas dtect de 5-OHMedC par
spectromtrie de masse dans toutes les espces pour lesquelles nous avons estim le taux de
mthylation. Nous suggrons donc que cette modification des 5-MedC nexiste pas chez la
drosophile, ou des niveaux trs faibles situs en dessous de la limite de dtection de notre
appareillage.
Les analyses de mthylation de lADN par BGS gnrent des quantits abondantes
dinformations mais cette technique comporte de nombreux biais dont la reproductibilit a t
montre lors de ma thse. Les biais de conversion et les biais damplification peuvent tre
mis en vidence par lutilisation denzymes de restriction et en utilisant diffrents jeux
damorces pour amplifier une mme rgion.
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2. Conservation de la mthylation de lADN chez les
eucaryotes et rgulation des ET
Bien que fortement conserve, la mthylation de lADN na ce jour pas pu tre
dtecte dans les gnomes de Saccharomyces cerevisae et Caenorhabditis elegans. Ces deux
espces deucaryotes possdent dautres systmes de rgulation post-transcriptionnelle des ET
impliquant notamment chez le nmatode la voie des RNAi (Lesage et Todeschini 2005;
Bessereau 2006). Le champignon Neurospora crassa possde une unique DNMT appele
DIM-2, responsable de la mthylation des cytosines en contextes symtriques et asymtriques
(Kouzminova et Selker, 2001). Chez cette espce, un systme de mutagnse dirig contre les
ET appel Repeat Induced Point-mutation (RIP), dtecte les squences rptes de plus de
400 pb et induit des transition C:G en T:A. Ce mcanisme est si efficace que peu dET sont
actifs chez N. crassa. Les squences mthyles chez cette espce, identifies par MedIP,
correspondent des ET riches en AT qui sont sous le contrle de la RIP (Selker et al. 2003).
Chez les insectes, la fonction de la mthylation des cytosines est implique, selon les espces,
dans des fonctions aussi diverses que la rgulation des gnes, les empreintes gnomique, la
rgulation des ET et la stabilit du gnome (Field et al. 2004). De nombreux insectes
possdent des systmes de mthylation comparables ceux des vertbrs avec dans leur
gnome un ou plusieurs orthologues des diffrentes DNMT. Labeille Apis millifera, le ver
soie Bombyx mori, et la gupe Nasoni vitripentis en font partie. Le gnome de labeille, dans
lequel les gnes DNMT1, DNMT2 et DNMT3 sont prsents, possde un systme de
mthylation de lADN dirig contre les dinuclotides CpG intervenant dans la rgulation des
gnes (Wang et al. 2006). De plus, les cytosines mthyles sont principalement localises
dans les rgions codantes des gnes et absentes au niveau des ET (Field et al. 2004). Le
phasme Medauroidea extradentada possde quant lui une forte proportion de CpG
mthyls, ainsi que des CpA et CpT localiss au niveau des squences rptes et lintrieur
des gnes (Krauss et al. 2009). Le gnome du ver soie, B. mori, contient 0,67% de 5-MedC,
principalement localises au niveau des dinuclotides CpG, lintrieur des gnes et absente
au niveau des ET (Xiang et al. 2010). tonnamment, aucun lien na pu tre tabli chez cette
espce entre la mthylation des promoteurs et la rpression de la transcription. Au contraire,
une corrlation a t mise en vidence entre le taux de mthylation des rgions codantes dun
gne et son expression. Cette mme corrlation a t mise en vidence chez A. thaliana, chez
laquelle la mthylation des cytosines dans le corps des gnes est un vnement galement
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frquent. Selon le dogme de la mthylation des cytosines, la prsence de 5-MedC au niveau
de la rgion promotrice dun gne empche son expression, et de nombreuses donnes
rcentes montrent que les parties codantes des gnes exprims sont fortement mthyles. Il a
t propos que la mthylation de lADN dans les parties codantes des gnes qui sexpriment
(donc non mthyls au niveau de leur rgion promotrice) empcherait une initiation de la
transcription ailleurs que sur le promoteur (Suzuki et Bird, 2008).
La vaste conservation au cours de lvolution de la mthylation de lADN suggre un
rle important et nous avons vu que son implication dans la rgulation des gnes nest pas la
mme selon lespce considre. La mthylation des cytosines dans le corps des gnes est un
vnement rpandu au cours de lvolution des gnomes eucaryotes (Zemach et al. 2010). A
linverse, les systmes de rgulation des ET par la mthylation de lADN sont peu conservs.
Une tude chez lHomme a montr que la majorit des sites CpG sont mthyles (Edwards et
al. 2010), et que le taux de mthylation des squences est corrl avec leur densit en
dinuclotides CpG. Les squences trs denses en CpG, comme les rgions promotrices des
gnes, sont linverse non mthyles. Selon les auteurs, ltat des cytosines est, par dfaut,
mthyl et que les promoteurs seraient prservs de cette mthylation par leur forte densit en
dinuclotides CpG. Limplication de la mthylation de lADN dans la structure et le maintien
de la stabilit du gnome est appuye par plusieurs exemples, dans lesquels labsence de
mthylation est associe des anomalies chromosomiques ainsi qu une leve de la
rpression des ET.
The genome is an ecological niche, and it was inevitable that the resources available
there should come to be exploited by specialized replicating entities .
Dans leur article, dont la citation ci-dessus a t extraite, Bestor et al (1997) indiquent
que la mthylation des cytosines est un mcanisme de prservation de lintgrit du gnome
des mammifres et des plantes en rprimant les ET. Ils considrent que le gnome de la
drosophile, qui possde beaucoup dlments actifs et peu de mthylation de lADN, ne
possde pas ce systme de rpression. Chez la drosophile, la seule enzyme capable de
mthyler lADN est DNMT2, qui est aussi la DNA methyl transferase la plus conserve
des gnomes eucaryotes (Ponger et Li, 2005). Bien quelle possde tous les domaines
catalytiques spcifiques des DNMT, lactivit DNMT de cette enzyme est trs faible
(Hermann et al. 2003) et comme nous lavons vu dans le chapitre 2, les taux de 5-MedC dans
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les gnomes de drosopiles sont faibles. Des rsultats rcents ont montr que son activit
principale est de mthyler les ARNtAsp, (Acide Aspartique) chez lHomme, les plantes, la
souris et la drosophile (Goll et al. 2006). Lenzyme DNMT2 est une RNA Methyl
Transferase parmi dautres, dont la conservation extrmement importante des procaryotes
jusquaux eucaryotes pourrait toutefois suggrer que les DNMT des mammifres et des
plantes en drivent (Pavlopoulou et Kossida, 2009). La localisation de DNMT2 nuclaire et
cytoplasmique, ainsi que la faible activit DNMT, peuvent expliquer les faibles taux de 5-
MedC observs chez la drosophile. Bien que le gne dDNMT2 semble tre impliqu chez la
drosophile dans la mise en place de marques dhistones htrochromatiques au niveau des ET
(Gou et al. 2010; Phalke et al. 2009), le lien entre la mthylation de lADN des squences
dET et son rle dans leur rgulation transcriptionnelle nest, ce jour, pas tabli. Ceci
suggre que le gne dDNMT2 pourrai tre impliqu dans un mcanisme de rgulation des
gnes et des ET qui ne ferai pas intervenir la mthylation des cytosines de lADN.
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3. La rgulation des ET chez la drosophile : exemple de
tirant dans les populations naturelles de D. simulans
Le phnotype associ des mutants pour l histone methyl transferase SU(VAR)3-
9, qui mthyle lhistone H3 sur la lysine 9, est caractris par des translocations
chromosomiques, dfauts de structure de la chromatine et perte dhtrozygotie, aussi bien
dans la ligne germinale que dans la ligne somatique (Peng et Karpen, 2009). Une
drpression des ET peut conduire au mme phnotype (Bourc'his et Bestor 2004; Miura et al.
2001), et, comme nous avons vu au cours du chapitre 1, la structure de la chromatine est
implique dans la rgulation de lET tirant. Les ET peuvent tre considrs comme des
lments essentiels de la stabilit des gnomes. Les squences dET seraient donc impliques
dans ltablissement des rgions htrochromatiques et euchromatiques, indispensables pour
la stabilit du gnome. Mes rsultats ont montr que tirant etait capable de modifier la
structure de la chromatine au niveau de son site dinsertion, mais aussi en amont. En effet,
linsertion dune copie complte de tirant dans lintron du gne tkv dans la population de
Makindu est responsable de la prsence de la marque htrochromatique H3K27-me3 au
niveau de son promoteur. Etablie partir du gnome squenc de D. melanogaster, la
distance entre le dbut de la LTR5 de cette copie de tirant et le promoteur du gne tkv est
estim 2 571 pb. Linfluence quun ET peut avoir sur la structure de la chromatine au
niveau de son environnement gnomique a t dcrit avec llment P, dont linsertion peut
conduire au phnomne de Position Effect Variegation (PEV) caractris par une
htrochromatinisation de gnes euchromatiques (Girton et Johansen, 2008; Weiler et
Wakimoto, 1995). Le spreading, sur plusieurs kb, de la marque H3K27me3 a t rapport
chez la Drosophile (Suganuma et Workman, 2010) et chez la A. thaliana, chez laquelle le
silencing pigntique provoqu par linsertion dun ET dans ou proximit dun gne a
de plus t mis en vidence (Schubert et al. 2006; Lippman et al. 2004). Des rsultats
prliminaires obtenus dans lquipe montrent que le gne tkv est plus faiblement exprim
dans la population de Makindu que dans les autres populations analyses, ce qui confirme
linfluence de la prsence de la marque H3K27me3 au niveau de son promoteur. Le
phnotype associ des mutations du gne tkv chez la drosophile est caractris par des ailes
dont les nervures sont fines, na cependant pas t mis en vidence dans la population de
Makindu. Ce cas particulier devra tre tudi afin de comprendre linfluence des ET sur les
gnes et les interactions qui peuvent exister entres ces squences.
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Avec lexemple de tirant, nous avons montr que des rgions euchromatiques sont
associes des marques htrochromatiques lorsquune copie de cet lment y est insre.
Comment expliquer que tirant soit exprim uniquement dans la population de Makindu ? Les
copies M3 et Z2 sont associes des marques euchromatiques, mais seule la copie M3 est
complte, ce qui peut expliquer que des transcrits de tirant naient pu tre mis en vidence
que dans la population de Makindu. Afin didentifier la copie de tirant qui est exprim, il
faudra tudier par CHIP lassociation de la copie M3 avec dautres marqueurs caractristiques
de lhtrochromatine et de leuchromatine, ainsi quavec des marqueurs dexpression comme
par exemple, la polymrase II, qui peu tre utilise en ChIP pour identifier les squences
transcrites (Sun et al. 2010). Le squenage des transcrits de la population de Makindu pourra
galement nous permettre didentifier la copie transcrite partir des polymorphismes de
squences observs.
Des rsultats rcents dhybridation in situ de tirant sur ovaires des populations de
Sngal, Makindu, Chicharo et Zimbabw, ralises par Abdou Akkouche (Thse de
doctorat), ont permis de localiser les transcrits de type C de tirant de la population de
Makindu au niveau des cellules nourricires appartenant la ligne germinale. De nombreux
transferts dARN ont lieu des cellules nourricires vers lovocyte lors de la maturation de
lovocyte, cependant, aucun transcrit de tirant na t localis dans lovocyte. Cela suggre
dune part quun mcanisme de rgulation de tirant empche son expression dans lovocyte,
et dautre part, que les ARN de tirant localiss dans les cellules nourricires sont squestrs
dans des structures particulires empchant leurs transferts vers lovocyte. Dans la voie de
rgulation de la ligne germinale des ET par les piRNA, il a t montr rcemment chez la
drosophile que les transcrits dET rguls sont squestrs dans les Yb-Bodies, structures
localises dans le nuage nuclaire (Olivieri et al. 2010). Lensemble de ces donnes suggre
que les copies exprimes de tirant sont rgules par la voie piRNA dans la ligne germinale
de la population de Makindu. Cette voie de rgulation, galement implique dans le
phnotype de dysgnsie des hybrides (Brennecke et al. 2008), fait intervenir des populations
de petits ARN dont la composition peut tre diffrente entre plusieurs souches, comme cela a
t montr au sein de lespce D. virilis (Rozhkov et al. 2010). Ce travail ouvre diffrentes
perspectives dont une approche spcifique danalyse de la rgulation de tirant par la
chromatine et par les piRNA, et une approche globale didentification des piRNA dans les
populations naturelles tudies ici.
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Nous avons vu que le modle de tirant est idal pour tudier linfluence dun ET sur la
structure de la chromatine et les consquences au niveau de lexpression des gnes situs
proximit. Le rle fonctionnel des protines impliques dans la voie de rgulation piRNA
devra tre confirm par la mise en vidence de la colocalisation et de linteraction des
protines PIWI avec les ARN de tirant. Dans notre hypothse, les transcrits de tirant
squestrs dans les Yb-bodies proviendraient de la copie M3.
Enfin, nous avons vu dans le chapitre 2 que les taux de mthylation chez les
drosophiles, dtermins par HPLC, sont faibles, mais que lanalyse par enzymes de restriction
montre que les ET prsentent des sites mthyls. Chez de nombreuses espces dinsectes, de
mammifres ou de plantes, les ET sont la cible privilgie de la mthylation des cytosines.
Les rsultats prliminaires obtenus partir dADN extrait dembryons de moins de 2 heures
des populations de Makindu (D. simulans) et Sngal (D. melanogaster) montrent des taux de
5-MedC trs faibles. Ces rsultats devront tre confirms et lanalyse devra tre tendue
dautres populations naturelles de D. simulans, diffrents stades de dveloppement.
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Article publi en 2010:
Rebollo R, Horard B, Hubert B, Vieira C, Jumping genes and epigenetics: Towards
new species, Gene, 454. 1-7
Article en rvision :
Ken Kraaijeveld
1,2
*, Brechtje Zwanenburg
1
, Padu Franco
1
, Benjamin Hubert
3
,
Cristina Vieira
3
, Sylvia de Pater
1
, Richard Stouthamer
4
, Peter de Knijff
2
& Jacques J. M. van
Alphen
5
, Rampant proliferation of a transposable element in an asexual wasp. En rvision
dans la revue Science. Jai ralis dans le cadre de ce travail les analyses de mthylation
dun ET par BGS.
Articles en prparation:
Hubert B, Akkouche A, Fablet M, Vieira C, Tirant transposable element induced
change in chromatin structure in natural populations of D. simulans (journal pour
soumission: FASEB)
Hubert B, Bellvert F, Comte G, Vieira C, Variation of 5methylcytosine proportion
among drosophilids phylogeny and natural populations
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Rampant proliferation of a transposable element in an asexual wasp
Ken Kraaijeveld
1,2
*, Brechtje Zwanenburg
1
, Padu Franco
1
, Benjamin Hubert
3
, Cristina Vieira
3
, Sylvia
de Pater
1
, Richard Stouthamer
4
, Peter de Knijff
2
& Jacques J. M. van Alphen
5
1
Institute of Biology, Leiden University, PO Box 9505, 2300 RA Leiden, The Netherlands
2
Department of Human Genetics, Leiden University Medical Center S4-P, P.O. Box 9600, 2300 RC
Leiden, The Netherlands
3
Universit de Lyon, F-69000, Lyon; Universit Lyon 1; CNRS, UMR5558, Laboratoire de Biomtrie et
Biologie Evolutive, F-69622,Villeurbanne, France
4
Entomology, University of California, Riverside, CA 92521, USA
5
UMR 6553 ECOBIO, Universit de Rennes I, Campus de Beaulieu, Avenue du Gnral Leclerc, 35
042 Rennes cedex, France
*To whom correspondence should be addressed. E-mail: (Rozhkov et al. 2010)
One-sentence summary: Asexual lineages of a parasitoid wasp have accumulated large numbers of
copies of a retrotransposon as predicted by theory.
ABSTRACT
Asexual taxa are predicted to face early extinction because they lack an effective means of containing
the proliferation of transposable elements (TEs). We report that asexual strains of a parasitoid wasp
harbour over four times as many copies of a gypsy-like retrotransposon as sexual strains from the
same species. The asexual strains represent at least eight distinct clonal lineages that have been
accumulating TEs independently. The difference in copy number was not the result of the infection
with parthenogenesis-inducing Wolbachia. The accumulation of TE copies may eventually create a
significant genetic load and drive the extinction of asexual populations.
The widespread occurrence of sex is one of the most elusive problems in evolutionary biology.
The inefficiency of purifying selection in asexual lineages can potentially lead to unchecked
proliferation of vertically transmitted transposable elements (TEs), causing their demise (1,2). To test
this prediction, we established 25 asexual and 10 sexual isofemale lines of the parasitoid wasp
Leptopilina clavipes. Asexual populations are infected with a parthenogenesis-inducing Wolbachia,
while sexual populations are not infected. Sexual and asexual field populations were variable at both
microsatellite (16 loci) and mtDNA loci (1516 bp; Fig. 1A & B). In the asexuals, the number of mtDNA
nucleotide differences between strains correlated to the pair-wise genetic relatedness estimated from
the microsatellite data (Mantel test r = -0.57, P = 0.002). This shows that multiple female lineages
have become infected with Wolbachia. Since the sequences for 6 Wolbachia genes were identical for
all strains, the most likely explanation for is horizontal transmission of Wolbachia during its spread.
We identified a partial sequence (1110 bp) of a reverse transcriptase in the genome of L.
clavipes, showing significant similarity to the gag-pol polyprotein domain of retrotransposons from the
gypsy-Ty3 superfamily. The sequences for two sexual and two asexual strains were identical.
Quantitative real-time PCR (qPCR) revealed that the asexual strains had greater than four-fold higher
copy numbers than the sexual strains (Fig. 1C). Southern blot analysis produced a single band at
approximately 700 bp, which was substantially more intense in the asexual strains compared to the
sexual stains (F
1,18
= 103.82, P < 0.00000001; fig. S1). Genetically related strains resembled each
other in copy number of the gypsy-like element (qPCR results vs. microsatellite data; Mantel test:
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asexual
= -0.38, P
asexual
= 0.05, r
sexual
= -0.39, P
sexual
= 0.02), indicating that asexual lineages have
accumulated copies of this element independently.
To investigate whether the accumulation of TE copies was due to a direct effect of Wolbachia
infection, we repeated the qPCR analysis using asexual females from which Wolbachia had been
removed using antibiotics. The difference in copy number between sexual and asexuals was very
similar to that in untreated females (Fig. 1C) and the Cp ratios were highly correlated to those of the
untreated samples of the same strain (r = 0.84, P < 0.0001). Wolbachia may affect the methylation
state of the host genome (3), thereby re-activating methylated TEs. We tested for such an effect by
applying bisulfite sequencing to eight samples. There was no evidence that the gypsy-like element in
L. clavipes is methylated in either sexual or asexual strains (fig. S2).
The time taken to accumulate TE copies can be estimated using the formula y = (1+t)
g
, where
y is the proportional increase in copy number, t is the transposition rate and g is the number of
generations (4). Assuming a TE transposition rate of 10
-4
per element per generation, the observed
four-fold increase would have taken 14,000 generations in the absence of purifying selection. The
asexual strains differed from the sexual strains by an average of 3.35 nucleotides on a total of 275
synonymous mtDNA sites, resulting in an estimated divergence time of 60,000 generations (mutation
rate assumed to be 2.1x10
-7
per base per generation; 5). Latent assortative mate preferences show
that the ancestor of the asexual populations remained sexual for a considerable part of this divergence
time (6). The time left would have been enough to accumulate a four-fold difference in TE copy
number, but only if purifying selection on the asexuals was inefficient. No signs of fitness reduction in
asexual strains of L. clavipes have so far been detected, but if the asexual strains continue to gain TE
copies at this rate, negative fitness effects would be expected in the future.
References and Notes
1. E. S. Dolgin, B. Charlesworth, Genetics 174, 817-827 (2006).
2. I. Arkhipova, M. Meselson, Bioessays 27, 76-85 (2005).
3. I. Negri, et al., Proc. R. Soc. B 276, 2485-2491 (2009).
4. A. Burt, R. Trivers, Genes in conflict: the biology of selfish genetic elements. (Belknap Press,
Cambridge, 2006).
5. R. Raychoudhury et al., Heredity 104, 318-326 (2010).
6. K. Kraaijeveld, P. Franco, B. M. Reumer, J. J. M. van Alphen, Evolution 63, 3085-3069 (2009).
7. We thank F. Kraaijeveld-Smit, A. Goudswaard, R. Vossen, N. Pul, B. Zwaan, R. Glas, T. de Jong,
M. van der Zee and J. Bast for help and discussions. This study was supported by a NWO-Veni-grant
to KK.
Supporting Online Material
Materials and Methods
Figs. S1 to S4
Tables S1 to S2
References
Author contributions
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Fig. 1. (A) mtDNA haplotype network of L. clavipes strains. Branch lengths are proportional to genetic
distance and dot size to the number of strains. (B) Microsatellite genotype network, with colors
representing mtDNA haplotypes (as in A). (C) Relative difference in copy number of the gypsy-like
retrotransposon as measured by qPCR for 10 asexual and 9 sexual strains. Error bars are SEM.
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Supporting online material
Materials and Methods
Wasp strains and Wolbachia removal. Sexual and asexual strains of L. clavipes were collected and
cultured as described in (6). The removal of Wolbachia using antibiotics is described in (6).
Genetic diversity structure of sexual and asexual populations of L. clavipes. We assessed genetic
diversity at three levels: nuclear, mitochondrial and Wolbachia. We commissioned a genomic library
enriched for three types of tandem repeats (CA, GA and ATG; Genetic Identification Services). One
hundred colonies were sequenced, from which we selected 16 loci. Loci were amplified using loci-
specific primers (table S2; all T
a
= 55C) and run on a MegaBase 1000 (Amersham). Genotype
profiles were scored manually. Asexual genotypes were homozygous due to gamete duplication by
Wolbachia. All but two sexual genotypes were homozygous due to prolonged inbreeding in the lab.
The diploid genotypes were therefore treated as haploid in Fig. 1. We sequenced 1057 bp of the
mitochondrial gene cytochrome oxidase subunit 1 (CO1) using the primers described in (S1), except
the reverse primer for the second part, which was re-designed for this study:
TCATCTAAAAATTTTAATCCCAGT. We also sequenced 459 bp ND1 using the primers described in
(S2). The sequences for the two mitochondrial genes were concatenated using BioEdit and analysed
using DNAsp. Haplotype networks were drawn using Network. Last, we sequenced six Wolbachia
genes (coxA, hcpA, ftsZ, fbpA, gatb, wsp
(S3)).
Identification of the gypsy-like element. A short fragment of sequence was obtained using the nested
set of degenerate PCR primers described in (S4). DNA of the sexual strain DC was used as template
for this reaction. The sequence showed significant similarity to gypsy-like elements in Nasonia
vitripennis (accession XM_001601092.1) and Bombyx mori (accession AB032718.1). Based on the
similarity between these two sequences, new degenerate primers were designed:
AARYTNTAYGCNGCNAAY and RTARAARTTNACCATNCC. These were used in PCR reactions (25
l total volume) with the following conditions: 94C for 4 min, then 45 cycles of 94C for 40 s, 50C for
40 s and 72C for 30 s and then 72C for 3 min. The PCR product was cleaned (Promega wizard kit)
and cloned with the TOPO-TA cloning kit (Invitrogen). Positive colonies were picked and amplified
using standard M13 primers. Clones containing inserts of the expected size (~1000 bp) were
sequenced. These contained the target sequence within a total of 1110 bp. To compare the sequence
between strains, we designed specific primers (TTTACGCTGCAAATGGTTCA and
TTGAATCGCTTCGACCTTTT) and used these to sequence the fragment in two sexual and two
asexual strains.
Identification of the forkhead gene. The transcription factor forkhead was chosen as a control gene to
standardize the qPCR signal, as this gene is highly conserved and single-copy in Nasiona vitripennis.
Sequences for Nasiona vitripennis (accession XM_001601750.1), Trichogramma kaykai (accession
EU650782.1) and Cirrospilus coachellae (accession EF137269.1) were aligned using ClustalW. The
following degenerate primers were picked using the software Genefisher: RTSACCCTCAACGGCA
and AGCCGTTKTCRAACA, cloning and sequencing were performed as described above. Species-
specific primers were developed (GGATGCAGAGTCCAGAAGGA and
TTGGCAAAATTCCATTAGGC) for use in qPCR.
Quantitative PCR. For qPCR, we designed a set of primers spanning a 109 bp region in the reverse
transcriptase (CGTTCGGTCTGTTCGAATTT and GCGAAACAGAAGTCCAATCC). Genomic DNA
was extracted from one recently emerged female per strain (Qiagen blood and tissue kit). Relative
copy numbers of the gypsy-like TE and forkhead sequences were quantified using the Lightcycler LC-
480 qPCR system (Roche). The qPCR reactions contained 5 ul qPCR MasterMix for SYBR Green
(BioRad), the equivalent of 60 ng DNA and 300nM of each primer, and were run in duplicates, using
the following two-step cycling program: 95C for 15 s, 60C for 1 min for 40 cycles. Efficiency of the
PCR reactions was estimated from the samples separately for the two genes using the software
LinRegPCR. Data from qPCR were analysed using the second derivative maximum method. Here, the
Cp-value represents the cycle at which the increase of fluorescence is highest and where the
logarithmic phase of a PCR begins. The mean Cp of the duplicates for the TE was calibrated on one
of the sexual samples (PCR efficiency^dCp) and then normalized on the control gene.
Southern blot analysis. Genomic DNA was extracted from ten recently emerged females per strain
using phenol/chloroform. Ten g DNA per strain was digested with EcoRI and electrophorized on a
0.7% agarose gel. The DNA was transferred to hybond+ membrane (Amersham Biosciences), which
was then probed with the DIG-labelled 1110 bp gypsy-like sequence described above. Hybridization
and detection were performed using the DIG labelling protocol (Roche Applied Sciences). The
intensity of each band was quantified using ImageJ and normalized on the intensity of the marker
band. The relative intensities were ln-transformed and compared using ANOVA.
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Bisulfite sequencing. Bisulfite treated samples were PCR amplified with primers
GGTAAATGAAGAAATGYYAAGTAT and CAATCACCRAAAATATTRTTTTTCC to yield a PCR
product of 373 bp. The PCR product was cleaned and sequenced following standard procedures.
Bisulfite sequencing data were analysed using Kismeth
(S5).
Supplementary Figures
Figure S1: (A) Southern blot of genomic DNA digested with EcoRI and probed with the gypsy-like
sequence. The first lane contains the size marker (HindIII-digested lambda). Each sample lane
contains DNA extracted from ten female wasps from a single strain. (B) Ethidium bromide-stained
agarose gel used for the southern blot, showing the relative amounts of DNA loaded in each lane.
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Figure S2: Cytosine methylation patterns of the gypsy-like transposable element of L. clavipes as
determined by bisulfite sequencing. Each line represents a single clone and each circle a cytosine
(red: CG, blue: CHG, green: CHH). The circle is filled when the cytosine is methylated. Two to fifteen
clones were sequenced per wasp strain. Two asexual strains (AR3 and BB1) and two sexual strains
(CBY and DC) were used. Females that had been cured of their Wolbachia infection using antibiotics
are denoted Rif.
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Supplementary Tables
Table S1: Genbank accession numbers.
Locus Accession numbers
Gypsy-like retrotransposon HM999657
Microsatellite loci HM999630 - HM999648
COI (mtDNA) HM999658 - HM999666
ND1 (mtDNA) HM999649 - HM999650
Wolbachia coxA HM999651
Wolbachia hcp HM999652
Wolbachia ftsZ HM999653
Wolbachia fbp HM999654
Wolbachia gatB HM999655
Wolbachia wsp HM999656
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Table S2: Primers used for microsatellite genotyping.
Locus name Forward Reverse
E101 GAGAGTCGTCCTTTGAGTCAC CGTCGTCGTAGTGGAGATACT
E108 CGTTAAACCAATCTGTGACG AATGTGGATGCAAATCAGAG
E3a CTCTCACTCCAAACTTGTCTG GAACGAATTAACCCATTGTG
F101 AAACGAAGCTCAGAATACAAGC GTTGCGTAAAATTGTCAACTTG
F102 TTACCCCTTATTTTCCTCTGTC TGGGCTCTCTATTCTATTCTCC
F103 ATTCCGTGAACCCAACAC CGTAATGAAGGAGAGTCTGC
F107 GCGAGAAACGTCTACTAGCTC TCACCACCTCATTCATTCAC
F112 GGATTGATTTACGACAGACG CCCAACTCCTGACATTGAG
F118 GGAACAGCCTTTACTGCAC AATCGTAAGAAAACGCCTAAC
F119 GCATTCTCATTCAGCATAAAC CGGTGTATTTCCCAAAGAC
F124 CGGTTTATCGCAGTGATACA GGACGTTACATTTGTCTCTTCA
F129 CGCCAACAAAGAGATGTC CGTGTGCGAATAAAATACG
F130 CTGGTTCCAATCTCGTGTG GCCATCATCATCATCAAGG
F2 GGAATGGGATGGGATGAG GCTCGGAGAGAGATTACGC
F5 GCACGCGATAACACCAATAG GCCGATGTTCTTGATGTTTG
G10 ACAGGTCCGACGAACATAAC AGGGGATTTCTGAACTGGAT
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Supplemental References
S1. S. J. Scheffer, E. E. Grissell, Mol. Ecol. 12, 415-421 (2003).
S2. P. T. Smith, S. Kambhampati, W. Vlkl, M. Mackauer, Mol. Phylogenet. Evol. 11, 236-245 (1999).
S3. L. Baldo et al., Appl. Environ. Microb. 72, 7098-7110 (2006).
S4. I. Arkhipova, M. Meselson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 14473-14477 (2000).
S5. E. Gruntman et al., BMC Bioinformatics 9, 371 (2008).
Author Contributions
K.K. conceived the project, participated in all aspects and wrote the manuscript. B.Z. identified the
gypsy transposable element. P.F. sequenced the mtDNA. B.H. and C.V. performed the bisulfite
sequencing. S.P. performed the Southern blot analysis. R.S. conceived the phylogenetic part. P.K.
analyzed the population genetic data. J.A. pervised the project. All authors discussed and commented
on the manuscript.
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MATRIELS ET MTHODES
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1. Origine et levage des souches de drosophiles
Les populations naturelles de D.melanogaster et D.simulans tudies durant ma thse
ont t captures dans la nature et sont leves au laboratoire. Ces souches sont des lignes
isofemelle tablies partir de femelles uniques fcondes dans leur milieu naturel o elles ont
t rcoltes diffrentes dates et par diffrents exprimentateurs. Les lignes isofemelles
sont fortement consanguines. Les lignes mutantes pour le gne dDNMT2 sont drives de D.
melanogaster et ont t amicalement fournies par Gunter Reuter (dDNMT2-/-), Kent Golic
(R2), et C.K. James Shen (GS12412).
Les souches sont maintenues au laboratoire dans des tuves 25C. Le milieu de
culture se prpare de la faon suivante :
Quantit pour 1,2 kg, soit une soixantaine de tubes :
15 g agar-agar + 400 mL deau du robinet ont t ports bullition en remuant constamment.
110 g de farine de mas, 115 g de levure de bire sche, et 500 mL deau du robinet ont t
mixs jusqu obtention dun mlange homogne, puis verss dans lagar cuit.
A ce mlange ont t ajouts 6 g de nipagine dissous dans 47,5 mL dthanol 95 %,
lensemble a t ajust 1,2 kg avec de leau chaude, et bien mlang. Striliss lautoclave
pendant 30 minutes 130C, le milieu est ensuite homognis et coul dans les tubes
dlevage.
2. Rcolte des embryons
Des mouches adultes ont t mises pondre dans des boites contenant de la glose,
compose de jus de raisin + 3 % dagar, et partiellement recouverte de levure de boulanger.
Deux heures aprs, les embryons sont rcolts, grce un tamis, par rinage de la glose au
PBS 1X. Les embryons ainsi rcolts sont collects dans des tubes Eppendorf de 1,5mL
contenant du PBS 1X, dchorions par des lavages leau de javel 1%, puis lADN est extrait
en suivant le protocole dextraction dADN par phnol chloroforme dcrit ci-dessous.
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3. Extraction dADN gnomique
1. Broyer le tissu dans 170 L de tampon de broyage (Tris-HCl pH8 50mM + EDTA
50mM + SDS 1%)
2. Ajouter 10 L Pk 10 g /L puis agiter
3. Incuber pendant 3h 55C (puis ajouter 5 L RNAse A 10 g/%L, incuber 5 minutes
37C)
4. Incuber 4C, 15 minutes
5. Ajouter 36 L de KO actate 5M, vortexer
6. Incuber a 4C pendant 15 minutes
7. Centrifuger (12 000 rpm, 15 minutes, 4C)
8. Rcuprer le surnageant (SN)
9. Ajouter 36 L de KO actate 5M, agiter (STEP1)
10. Incuber 4C, 15 minutes
11. Centrifuger (12 000 rpm, 15 minutes, 4C)
12. Ajouter 1 volume de Phnol/Chloroforme/IAA, vortexer 15
13. Centrifuger (12 000 rpm, 5 minutes, 4C)
14. Rcuprer le SN et mettre dans un nouveau tube et recommencer une deuxime fois
15. Prcipitation de lADN :
- 1L of glycogne
- 1/10 vol dactate de sodium 3M (pH=5.2)
- 2.5Vol dEtOH 95% froid
16. Homogniser
17. Incuber toute la nuit -20C
18. Centrifuger (14 000 rpm, 30 minutes, 4C)
19. Jeter le surnageant et laver le culot avec 1 mL dEtOH 70 % froid
20. Centrifuger (14 000 rpm, 15 minutes, 4C)
21. Jeter le surnageant et laisser scher le culot dADN temprature ambiante pendant 2
heures
22. Reprendre le culot dans 45 L H2O
23. Incuber 1h, 37C
24. Dposer sur gel dagarose 1 % pour vrifier la qualit de lADN
25. Quantifier lADN.
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4. Traitement au Bisulfite
Le traitement de lADN au bisulfite de sodium est utilis pour dterminer le profil de
mthylation de squences dADN. Les cytosines non mthyles vont tre converties en
uracile tandis que les cytosines mthyles ne sont pas converties. Une fois lADN trait, les
squences dintrt sont amplifies par PCR en utilisant des amorces dgnres pour toutes
les positions de cytosines. Durant cette tape, les uraciles seront remplaces par des thymines.
Les produits de PCR sont clons et squencs. Pour toutes les expriences de traitement au
bisulfite de sodium, des rplicats techniques ont t raliss, et des rplicats biologiques et
techniques ont t raliss pour les rsultats obtenus avec les amorces tir01.
Prparation des chantillons :
- Dissquer partir dindividus adultes de 4 jours, dans du PBS 1X :
o 20 paires dovaires pour les femelles
o 35 paires de testicules pour les males
- Broyer et aliquoter les ovaires et testicules des volumes respectifs de 3 L et 9 L
- Traiter la protinase K, en suivant pour les ovaires et pour les testicules,
respectivement, la procdure A et la procdure B (de EZ DNA Methylation-Direct
TM
KIT)
- Traiter au bisulfite de sodium et extraire lADN en suivant les conditions standard
recommandes par le fabriquant (EZ DNA Methylation-Direct
TM
KIT, ZYMO
RESEARCH).
5. PCR de lADN trait au bisulfite de sodium
Les amplifications PCR de la rgion rgulatrice de tirant partir de lADN trait ont t
ralises avec les amorces rpertories dans le Tableau 5. Pour chaque PCR, 4 L dADN
trait ont t amplifis dans un volume final de raction de 50 L. Le cycle de PCR utilis est
le suivant :
1. Dnaturation (94 C, 10 minutes)
2. Dnaturation (94 C, 30 secondes)
3. Hybridation (Tm selon amorce, 30 secondes)
4. Elongation (72 C, 30 secondes), puis retour tape 2, 30 cycles
5. Finition (72 C, 10 minutes)
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Tableau 5. Amorces PCR utilises pour lamplification de squences dADN traites au
bisulfite de sodium.
Bisulfite Genomic Sequencing
ET/gne amorce Squence (5-3) Tm (en C)
Taille du produit de PCR
(pb)
Tir01 f gga-aga-ygg-yaa-ytg-g
Tir01 r car-tct-aca-tct-trc
43 451
Tir52 f gaa-aay-gga-gga-yty-gag-tag
Tir52 r cat-ttr-rta-ctt-cac-aac-ttc-aat-t
51,5 293
TirC1 f agg-tag-gta-att-att-aat-agg-tag-g
tirant (type C)
TirC1 r cac-ccc-cta-aac-ccc-cac-rcc-tct-a
52,4 400
191 f ayg-gag-tga-aay-tgy-tga-att-g
Copie M1
191 r cca-ata-aar-aat-acr-act-rac-ttt-c
52,4 328
271 f gaa-aaa-aaa-aag-gga-gag-aga-aaa-a
Copie M2
271 r tcc-tcc-rtt-ttc-atc-tta-tac-ata-a
52,4 408
151f gga-gya-tgg-agy-aya-agg
151r caa-trt-trc-art-rcr-ac
59 585
152f tta-agt-agg-aaa-gtt-ttt-gta-aag-g
Copie M3
152r cca-ata-aar-aat-acr-act-rac-ttt-c
52,4 342
TypeSb f tga-agt-ggy-atg-gaa-att-atg-ttt-a
tirant (Type S) TypeSb r aca-ctt-rca-ttr-tcr-aat-aaa-aat-t
48,5 463
Roobisu f gag-agy-gat-aaa-tta-tat-tta-gga-t
Roo Roobisu r tat-tta-tac-tct-rtt-cct-tac-ctt-t
45,3 563
Fbisu f ggt-tgt-ttt-gag-tga-agt-gaa
F Fbisu r acc-car-ctt-ttt-trt-tta-crt-ttt-c
43,5 527
412bisu f aag-gya-aaa-agt-ata-agt-gya-tgg-t
412 412bisu r cca-tac-tca-ata-raa-ctc-tac-tca-c
48,5 487
Act5Cf ggy-ygg-att-tgy-ygg-aga-yg
Actine 5C Act5Cr cca-rat-ctt-ctc-cat-atc-rtc
58 161
6. Clonage/Squenage/Analyse des profils de
mthylation
Aprs traitement au bisulfite de sodium, les produits de PCR ont t clons avec le Kit
TOPO-TA cloning pour squenage (Invitrogen) suivant les recommandations du fabriquant.
Les bactries transformes sont tales en boite de Ptri contenant du milieu de culture L.B.
plus ampicilline, incubes 37 C pendant 16 heures. La confirmation des colonies positives
est ralise par PCR en utilisant les amorces universelles M13 forward et reverse, qui
permettent damplifier les fragments dADN insrs dans le vecteur. Les produits de PCR
correspondant la taille attendue ont t squencs par Genoscreen. Les squences ont t
alignes avec CLUSTALW2 (Larkin et al. 2007). Les profils de mthylation ont t analyss
avec le logiciel KISMETH (http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl) (Gruntman et al.
2008). Les frquences de mthylation des dinuclotides ont t calcules grce des outils
dvelopps (codes pythons) par Hussein Mortada. Le premier script python, appell Cpos.py
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prend comme entre le fichier texte dalignement des squences traites. Dans ces squences,
le nombre de C va tre compt pour chaque position permettant ainsi de calculer le
pourcentage de cytosines non converties qui est donc gal, pour chaque position, au rapport
du nombre de cytosines divis par le nombre total de squences alignes. Le deuxime,
appell Racio.py, prend comme entre le fichier texte de la squence de rfrence (fichier1) et
le fichier texte dalignement des squences traites (fichier2). A partir de ces deux fichiers, le
pourcentage de C pour chaque squence du fichier2 est calcul (rapport du nombre de C dans
chaque squence du fichier1 par le nombre de C de la squence de rfrence) ainsi que celui
des dinuclotides CpA, CpT, CpG et CpC.
Solution : Milieu de culure L.B. (Luria-Bertani) plus ampicilline :
peptone 1 g
Extraits de levure 0,5 g
NaCl 1 g
Agar 1,5 g
Ampicilline 0,1 mg/mL
H2O qsp 100 mL
7. Digestions enzymatiques
Les ADN gnomiques ont t digrs pendant 16 heures 37C ou 55C selon
lenzyme considre, en accord avec les instructions du fabriquant (BioLabs). Les paramtres
de digestion utiliss pour chaque enzyme sont indiqus dans le tableau 3. Les couples
denzymes sensibles/non sensibles correspondant chaque ET tudi sont indiqus dans le
Tableau 6 et les paramtres de digestion dans le Tableau 7. Les amorces PCR utilises pour
diagnostiquer ltat de mthylation de chacun des sites sont rfrences dans le Tableau 8.
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Tableau 6. Enzymes de restriction utilises.
Elment transposable Enzyme sensible Enzyme non sensible
F site 5 BsmBI BsmAI
F ORF1 HpaII MspI
F ORF2 HpaII MspI
Roo AvaI BsoBI
412 HpaII MspI
tirant HpaII MspI
Tableau 7. Paramtres utiliss pour les digestions enzymatiques en fonction des enzymes
utilises.
Enzyme Site de restriction TC Nombre d units
BsmAI 5-CGTCTCN-3 55 50
BsmBI 5-CGTCTCN-3 55 10
MspI 5-CCGG-3 37 500
HpaII 5-CCGG-3 37 150
AvaI 5-CYCGRG-3 37 200
BsoBI 5-CYCGRG-3 37 40
Les cytosines qui bloquent lactivit de clivage de lenzyme si elles sont mthyles
(colores rouge) sont toutes localises au niveau de dinuclotides CpG. La temprature (TC)
ainsi que le nombre dunits enzymatiques utilises pour la digestion sont renseignes.
Tableau 8. Amorces PCR utilises pour diagnostiquer ltat de mthylation des sites de
restriction.
Enzymes de restriction
ET Amorce Squence (5-3) Tm (en C) Taille du produit de PCR (pb)
FR1 atg-tct-gcg-ttt-ggg-att-gt
F site 5
FF1 tga-gtg-aag-tga-acg-cca-aa
58 239
FR1site1 tct-cgc-atg-cat-ttt-ctt-tg
F ORF1
FF1site1 caa-act-ccagct-cct-ttt-gc
57 194
FR1site2 cgt-aac-tgc-gaa-gtc-gat-ca
F ORF2
FF1site2 gca-gta-ggg-cca-cac-ttc-at
62 207
Roo r1 ata-gtc-ccc-gcc-tta-tcg-ag
Roo
Roo f1 ttg-ggctcc-gtt-cat-atc-tt
58 250
412 r1 tag-gct-aat-ccg-cgt-agc-tg
412
412 f1 aac-atg-atc-acc-cac-tcg-aag
58 219
Tir r1 ttg-ctt-cgt-ttc-tta-caa-tgg
Tir f1 ggg-gaa-acc-taa-aac-cct-tc
62,5
Tir r1bis gct-gaa-act-taa-aaa-cct-tca-tac-a
tirant (type C)
Tir f1bis agt-ttg-ttt-cgt-ttc-tta-cat-gtt-t
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8. Immunoprcipitation de la Chromatine (ChIP)
La ChIP est une technique qui permet dextraire la chromatine des cellules puis de
limmunoprcipiter avec des anticorps spcifiques dirigs contre des protines constitutives
de la chromatine, comme par exemple les histones. Il est ainsi possible de rcuprer des
fractions dADN enrichies en H3 totale (H3T), H3K9me2, H3K27me3 et H3K4me2. Les
anticorps anti-dimethyl histone H3 (Lys4), anti-dimethyl histone 3 (Lys9) et anti-trimethyl
histone 3 (Lys27) ont t fournis par Millipore et lanti-histone H3 (ChIP Grade) a t fournie
par AbCam. Une rgion faiblement enrichie en H3T aura des valeurs denrichissement faible
pour les marques tudies, il sera donc important de normaliser les rsultats obtenus en
fonction de lenrichissement en nuclosome, rapport par lenrichissement en H3T.
Lenrichissement en IgG permet de mesurer laspcificit de limmunoprcipitation. Le plan
exprimental utilis pour cette technique est reprsent sur la Figure 32.
Figure 32. Schma du plan exprimental de la ChIP.
Pour chaque population, chacun des rplicats biologiques a t ralis partir de 150 paires
dovaires de chaque population. Aprs extraction de la chromatine, les immunoprcipitations
(IP) ont t ralises pour les marques H3T, IgG, H3K9me2, H3K27me3 et H3K4me2 avec
leurs anticorps respectifs. Une fraction de la chromatine, non immunoprcipite appele
INPUT, partir de laquelle lADN sera extrait, sera utilise pour calculer lenrichissement de
chaque marque tudie.
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Protocole de ChIP :
1- 150 paires dovaires collectes partir de femelles ges de 3 jours pour chaque
population ont t dissques, et laves au PBT.
2- Ajouter 10 mL de Crosslink solution . Agiter pendant 10 minutes temprature
ambiante.
3- Enlever la phase aqueuse, ajouter 10 mL de STOP solution puis agiter 5 minutes
temprature ambiante.
4- Enlever le surnageant et resuspendre les ovaires dans 7,5 mL de PBT froid + 300 L
dinhibiteurs de protases).
5- Isolation des cellules : Homogniser les tissus avec un pilon Potter homognisateur,
puis centrifuger (1 minute, 400 g, 4C).
6- Rcuprer le surnageant puis centrifuger (10 minutes, 1100 g, 4C).
7- Resuspendre le culot avec 7,5 mL de Cell Lysis Buffer froid + 300 L
dinhibiteurs de protases.
8- Isolement des noyaux : Homogniser les tissus avec un pilon Potter homognisateur,
puis centrifuger (4 minutes, 2000 g, 4C).
9- Resuspendre le culot avec 1 mL de Nuclear Lysis Buffer froid + 60L
dinhibiteurs de protases. Incuber temprature ambiante pendant 20 minutes.
10- Ajouter 1mL de Nuclear Lysis Buffer froid + 60L dinhibiteurs de protases.
11- Sonication de la chromatine (7 cycles, 30 secondes ON, 30 secondes OFF) puis
vrifier sur gel dagarose la taille des fragments (500 pb).
12- Centrifuger (10 minutes, 20 000 g, 4C).
13- Rcuprer le surnageant, puis ajouter le tampon 1 (qsp 6 mL).
14- Ajouter 150 L de solution de billes de sphadex puis incuber 4C pendant 1 heure.
15- Centrifuger (1 minute, 1000 g, 4C).
16- Aliquoter la chromatine (1 mL pour lIP, 500 L pour lINPUT).
17- Ajouter 5 L danticorps (1 mg/mL) puis incuber pendant la nuit 4C sur un plateau
rotatif.
18- Ajouter 80 L de solution de billes puis incuber 3 heures 4C sur un plateau rotatif.
19- Centrifuger (2 minutes, 400 g, 4C).
20- Faire les lavages suivants : 2 x 4 minutes avec la solution dIP lavage 1, puis 2 fois x
4 minutes avec la solution IP lavage 2, puis 2 x 2 minutes avec du TE.
21- Ajouter 100 L de TE + 1 L de RNAse A (10 mg/mL) pendant 1 heure 37C.
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22- Ajouter de la protinase K (0,5 mg/mL) + 10 L de SDS 10% et incuber 3 heures
55C.
23- Ajouter 1 volume de Phnol/Chloroforme/IAA, vortexer 15 secondes
24- Centrifuger (12 000 rpm, 5 minutes, 4C)
25- Rcuprer le SN et mettre dans un nouveau tube
26- Ajouter 25L de NaAc 3M ph5,3 + 1L de glycogne + 550L dthanol 100.
27- Incuber 1 heure -20C.
28- Centrifuger (18 000 g, 15 minutes, 4C), laver le culot lthanol 70, puis centrifuger
encore une fois.
29- Reprendre le culot dans 40 L de TRIS 10mM pH8 pour les IP, et dans 100 L pour
lINPUT.
30- Quantifier les chantillons au nanodrop et ramener leur concentration 6 ng/L.
Solutions prparer avant de commencer:
PBT: PBS 1X, 0,1% Triton X100
Stop solution: 125 mM Glycine, PBT
Crosslink Solution: 50 mM Hepes pH8, 1 mM EDTA.Na2, 0,5 mM EGTA, 100
mM NaCl.
Prparation des billes:
Peser 160 mg de protine A Spharose et ajouter 8 mL de PBS 1X puis incuber 1
heure 4C sur un plateau rotatif. Centrifuger (3 minutes, 400g, 4C) puis enlever
le surnageant. Ajouter 2mL de PBS 1X, BSA 0,1% puis incuber toute la nuit
4C sur un plateau rotatif. Centrifuger (3 minutes, 400g, 4C) puis enlever le
surnageant. Ajouter 720 L de PBS 1X, BSA 0,1%.
Solution IP lavage 1: Triton X100 1%, SDS 0,1%, 500 mM NaCl, TE1X
Solution IP lavage 2: Triton X100 1%, Deoxycholate 0,1%, SDS 0,1%, 140 mM
NaCl, 1 mM PMSF, TE1X.
Cell Lysis Buffer : (PIPES 5mM pH8, KCL 85mM, NP40/IGEPAL 0,5%)
Nuclear Lysis Buffer : 10 mM EDTA, 0,5% N-lauroylsarcosine, 50 mM
HEPES, pH8
Tampon 1: 0,1% Triton X100, 0.1% sodium deoxycholate, 0,1% SDS, 140 mM
NaCl, TE1X.
Inhibiteurs de protases : Complete Protease Inhibitor Cocktail tablets in glass
vials (Roche).
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9. qPCR
Les ADN ont t dilus et ramens la concentration de 6 ng/L, puis quantifis par qPCR
dans un lightcycler (Roche diagnostics) en utilisant les amorces du Tableau 9. Le taux
denrichissement a t calcul par diffrence de Ct par rapport lINPUT de chacune des
populations et les rsultats ont t normaliss par H3T. Les mesures ont t ralises partir
de deux expriences indpendantes.
Tableau 9. Amorces utilises en qPCR pour lanalyse des rsultats de ChIP.
qPCR TM=62C
site amorce Squence (5-3)
Rdprochip f ttt-aaa-cgc-cag-caa-gtg-tg
promoteur tkv RD
Rdprochip r acg-act-cgc-gaa-gaa-cgt-at
ilot f1 cac-cga-gtg-aaa-ctg-ctg-aa
M1, C1, Z1
ilot r1 atg-ttg-cag-tgc-gac-ttt-tg
CflanqR ctg-agc-act-tga-ttt-ggg-ctt-aga-cag-gc
M2
C2tir r gtg-ttc-cag-ttg-ccg-tct-tc
15qf2 tgt-gcg-gat-ttc-tac-tgt-ttt-c
M3
15qr2 agc-ata-atg-aac-atg-ccg-act
3122 f cgc-cag-aaa-aca-cca-aca-ga
C2
3122 r ggt-tta-gag-ggt-ggg-gtg-gt
451 f tgt-gga-cat-tag-gga-ctg-ga
C3
452 r tag-agg-cgt-ggg-ggt-tta-g
idl2_2 f cca-gag-caa-gca-aac-att-ga
Z2
idl2_2 r tag-agg-cgt-ggg-ggt-tta-g
idl3_1 f cgt-atc-gtt-cgt-gcc-att-ta
Z3
idl3_1 r ggt-tga-gtg-tcc-gac-gat-tt
15notir f gca-tcc-aat-gcg-aac-aag-aa
15notir
15notir r agg-tcc-gca-gtt-cca-cag-tt
27notir f gcc-ttt-ttg-tgt-gcc-caa-ct
27notir
27notir r gcg-ttg-ctc-taa-ggg-ga
rp49 f ct-ggt-ttc-cgg-caa-ggt-atg-t
RP49
rp49 r ca-gtt-caa-ctc-aaa-acc-gcc-aaa
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10. Hydrolyse de lADN et prparation des chantillons
pour la HPLC
Les chantillons dADN gnomique des 12 espces de drosophiles dont les gnomes
ont t squencs ont t extrait partir dembryons gs de moins de 16 heures et fournis par
le Drosophila Species Stock Center (University of California, San Diego,
http://stockcenter.ucsd.edu). LADN de thymus de veau a t command chez Invitrogen, les
oligonuclotides mthyls (5-GCC-GAA-TGC-TGA-CAT-TCC-GGC-CGA-ATG-CT-3) et
non mthyls (5- GC-5MedC-GAA-TG-5MedC-TGA-CAT-TCC-GGC-5MedC-GA-ATG-
5MedC-T-3) ont t produits par EUROGENTEC. Les nuclotides standards 2-
deoxyuridine 5monophosphate (dU), 2-deoxyguanosine 5monophosphate (dG), 2-
deoxycytidine 5monophosphate (dC), 2-deoxyadnosine 5monophosphate (dA), 5-methyl
2-cytidine 5monophosphate (5-MedC), et 2-deoxythimidine 5monophosphate (dT) ont t
fournis par SIGMA-ALDRICH.
Tous les chantillons ont t traits la RNase A (concentration finale de 20 g/L)
pendant 1 heure 37C. LADN a ensuite t prcipit avec 1 volume disopropanol froid,
puis centrifug 11 000 g pendant 10 minutes. Le culot dADN a ensuite t lav lthanol
70%, centrifug 5 minutes 11 000 g, repris dans de leau et stock + 4C.
Pour chaque hydrolyse, jai utilis 6,5 g dADN dans un volume de 10 L. Les
chantillons ont t dnaturs 2 minutes 100C puis mis rapidement dans la glace pendant 5
minutes. La raction dhydrolyse a t initie par lajout de 10 L de nuclase P1 et 2 L de
sulfate de zinc, et les chantillons ont t incubs 16 heures 37C. Une foi la raction
dhydrolyse termine, les chantillons ont t incubs 2 heures 37C avec 0,75 L de
phosphatase alkaline + 1,25 L de Tris-HCL (pH8,3) afin denlever les groupements
phosphates des nuclotides. Les chantillons ont t centrifugs et le surnageant a t
rcupr et conserv + 4C.
Les taux de mthylation chez la drosophile sont faibles, et afin davoir des quantits en
5-MedC dtectables pour chacun des chantillons, les produits de quatre hydrolyses ont t
rassembls, dont 70 % ont t injects pour la HPLC.
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Pour cette tude, les analyses sont ralises sur une HPLC HP 1100 series (Agilent
technologies) couple un dtecteur barrette de diode (DAD) (G1315 ; Agilent
technologies) et un spectromtre de masse simple quadriple avec une source dionisation par
electrospray HP MSD 1100 series (G1946 ; Agilent technologies). Lensemble de
lappareillage est pilot par le logiciel chemstation (Agilent technologies). Ce systme est
quip dune colonne en phase inverse Eclipse XDB