UC Exploration molculaire des ressources vgtales :

Rle de la cyclophiline ROC4 dans la germination de la

graine : Etude de la rgulation transcriptionnelle de 4 gnes

Corneloup Thibault
Simon Lonard

Encadrant : Nardjis Amiour

Sylvain Chaillou

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Introduction :
Les conditions de lenvironnement lors du dveloppement et de la maturation des semences
impactent considrablement leur vigueur germinative. La vigueur germinative est dfinie par la
capacit de lembryon contenu dans la graine reprendre son activit mtabolique de manire
coordonne et squentielle. Les tudes protomiques et transcriptomiques ont confort que le
principal facteur du succs de la germination est la qualit de lARN messager stock durant la
maturation de la plante mre. Mais, la vigueur germinative dpend aussi de multiples variables
biochimiques et molculaires. Son amlioration permettrait damliorer les rendements si on les
inclut dans des programmes biotechnologiques. En effet, la germination est la phase la plus critique
dans le cycle de la vie de la plante, on la dfinit du moment o la graine sche mature prend leau
et termine l o la radicule merge de lenveloppe de la graine (Figure 1) ce qui met contribution
les ARN messagers et protines stocks au cours de la formation de la graine (Rajjou et al, 2012).

Figure 1. Phnomnologie de la germination en trois phases. Rentre deau, germination au sens strict,
mergence de la radicule. On voit ici les diffrentes implications hormonales avec lacide gibbrellique (GA)
et lacide abscissique (ABA). Durant cette phase, des protines stockes et les ARN messagers stocks vont
tre dgrads. Des ARN messagers et protines vont tre synthtises de novo. Puis le mtabolisme va
reprendre. Adapt de Rajjou et al, 2012.

Ce stage dun mois a t effectu au sein de lquipe Physiologie de la germination qui tudie
les mcanismes essentiels de la rgulation de la dormance, la longvit et la rponse de la graine
l'environnement, dans le but d'amliorer la qualit germinative des semences. Au niveau
molculaire, cest la conformation protique au cours de la transition entre la maturation et la
germination qui est un lment prpondrant pour lentre et le maintien ltat quiescent de la
semence et pour le redmarrage brutal de l'activit mtabolique limbibition. Par exemple, parmi
les remaniements post-traductionnels du protome, lisomrisation (cis-trans) des rsidus prolines
dans les chaines polypeptidiques merge comme un mcanisme molculaire cl contrlant la
fonction dun grand nombre de protines (Kumari et al, 2012). Ltude du protome de la graine
mature sche de la plante modle dArabidopsis Thaliana rvle la prsence de plusieurs peptidylprolyl cis-trans isomrases (PPIases) telles que les cyclophilines ROC1 et ROC4. Une PPIase est
une isomrase qui convertit la forme trans en fome cis du peptidyl-propyl (Figure 2).

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Figure 2. Illustration schmatique des isomres trans et cis du groupement peptidyl-propyl.

Linterconversion entre les deux formes est catalyse par les cyclophilines et les autres peptidyl-prolyl
isomrases (PPIases). Adapt de Kumari et al, 2013.

Les PPIase sont impliques dans plusieurs processus tels que le trafic cellulaire, la stabilisation des
complexes, lapoptose, la signalisation, la diffrenciation, la dtoxification et la rparation (figure 3).
Une partie des cyclophilines, un sous-groupe de la famille des immunophilines ont ce domaine
PPIase. Elles auraient aussi un rle dans le repliement des protines ce qui les rend affili la classe
des chaperones (Kumari et al, 2013).

Figure 3. Modle thorique du rle des PPiases dans les diffrents stress de la cellule. De Kumari et al,
2013.

Le projet tudie la cyclophiline ROC4 qui est une PPIase des plus abondantes dans la graine sche
dArabidopsis. Il y aurait 29 squences conserves chez cette espce. Un phnotype li la
germination a t observ chez le mutant knock-out roc4. Des expriences pralables ont
montr que ce mutant germe plus vite que le gnotype sauvage columbia (Col0). Cette observation
a soulev la question suivante : lactivit de la PPIase est-elle corrle avec la vigueur germinative
de la graine ?
Dans un premier temps une premire approche a t conduite, la protomique. La comparaison
entre le gnotype sauvage et le mutant roc4 a rvl une quarantaine de protines diffrentiellement
exprimes (figure 3). Quelques spots ont pu tre identifis grce la carte Arabidopsis Seed
Proteome (tableau 1)

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Figure 4 : Gel dlectrophorse bidimensionnelle montrant les 40 spots protiques diffrentiellement

exprimes chez le mutant roc4.
Tableau 1. Prsentation des protines identifies partir de la carte Arabidopsis Seed Proteome .

Spot n

Effet

Nom

Implication

127

roc4
down

Alcool dshydrognase

Oxydation et stress oxydant, rponse au

stress salin, rponse au cadmium.

146

roc4
down

Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase, cytosolic

156

roc4
down

Phosphoglucomutase,
cytoplasmic 2

157

roc4
down

Actin 7

121

roc4
up

ATP-dependent Clp
protease ATP-binding
subunit / ClpC

Chaperone

121

roc4
up

Ferritine 1

Gne de rgulation pour la rponse au

stress phosphate.

129

roc4
up

Cell division cycle protein

(CDC48)

Rponse au cadmium. Croissance des

cellules.

Rponse au cadmium

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On a choisi 4 protines identifies pour tudier labondance de leurs transcrits :

LAlcohol deshydrogenase (ADH), la phosphoglucomutase (PG), la Ferritine (Fe) et la Cell division
cycle protein (CDC). Celles-ci sont intressantes tudier en premier car elles sont impliques aussi
dans diffrents stress (au cadmium, au phosphate, au stress oxydant) o interviennent les PPiases.
En tudiant labondance des transcrits de ces 4 protines on va chercher savoir comment sont
rguls les gnes codant ces protines au niveau transcriptionnel. On comparera le taux
dexpression des ADNc chez le mutant roc4 par rapport au gnotype sauvage cultivs dans
diffrentes conditions de temprature.

I.

Matriels et Mthodes :

Des plantes de gnotype sauvage (Col-0) et mutants roc4 dArabidopsis Thaliana ont t cultives
dans trois conditions de temprature : Standard (21-23C), chaud (26-28C) et froid (16-18C)
(Tableau 2). Pour chaque gnotype nous avons travaill sur deux rplicats biologiques.

Tableau 2 : Echantillons utiliss et plan dexprience de ltude. Des graines sauvages ou mutantes
dArabidopsis Thaliana cultives dans trois conditions de temprature (S : standard, C : chaud, F : froid).
Deux rplicats biologiques ont t raliss par couple (phnotype, Temprature) pour n=12. Les
correspondances utilises (1T, 2T) pour les expriences sont indiques.

Sauvage col-0
(T)

Mutant roc4
(R)

Temprature Standard (21C-23C)

Col1 S, col2 S
(1T,2T)

Roc 1 S, Roc 2 S
(1R,2R)

Temprature froid (16-18C)

Col3 F, Col4 F
(3T, 4T)

Roc 3 F, Roc 4 F
(3R, 4R)

Temprature chaud (26-28C)

Col5 C, col6 C
(5T, 6T)

Roc5 C, Roc6 C
(5R,6R)

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1. Mthodes :
1.1

Extraction des ARN, Rtrotranscription et Q-PCR

Le protocole gnral est prsent en figure 5, il va de lextraction des ARN dans les graines
lanalyse de labondance des rtrotranscrits (ADNc) par Q-PCR.

Extraction dARN

Broyage azote liquide, tampon dextraction avec betamercaptoethanol 1,5%, Phnol /Chloroforme, chlorure de
lithium (prcipitation des ARN)
Evaluation au nanodrop de la quantit et qualit ARN
Purification ventuelle sur colonne de PVP

Rtro transcription

A partir d1ug dARN, avec traitement DNASE

Fermentas
Vrification de lexpression des rtrotranscrits par
PCR avec les amorces dun contrle (facteur
dlongation, EF)

PCR quantitative

Test de dilution et choix des

amorces spcifiques
Q-PCR sur les diffrents
chantillons sauvages et
mutants

Figure 5 : Etapes Protocole exprimental de ltude. Adapt de Thomas et al 1994, Galland, Godin et al
2011. Tout est certifi RNase free(Sigma). (A) Les graines sont broyes dans un mortier avec de lazote

liquide. Un tampon dextraction contenant 1,5% beta-mercaptoethanol et 1% SDS permet de

dnaturer les protines et couper les ponts disulfures, de lEDTA pour chlater les cations divalents
qui interviennent chez les Rnases et Dnases, cela permet dinhiber ces mtalloenzymes. Enfin, le
chlorure de Lithium LiCl permet de prcipiter les ARN (Cathala et al, 1983). Evaluation au
nanodrop de la qunatit et qualit des ARN. Une ventuelle purification est effectue sur colonne
PVP (Poly(Vinylpolypyrrolidone) (Biorad). (B) Avant la rtrotranscription, un traitement DnaseI
(kit fermentas) est effectu, la transcriptase inverse utilise provient de Revert Aid H Minus. Une
PCR pour amplifier les rtrotranscrits suivie dune lectrophorse sur gel dagarose 1% avec TAE
0,5x et du BET a t effectue. (C) Pour chaque gne 3 couples damorces ont dj t tests par
PCR. Ceux prsentant une bonne expression en PCR ont ensuite t tests par Q-PCR diffrentes
dilutions afin de dterminer la dilution approprie de lchantillon et valuer la spcificit de
chaque couple damorce. La dilution au 1/20me a t ensuite choisie pour ltude de lexpression
des transcrits des 4 gnes : aldehyde dehydrogenase, ferritin, cell cycle division protein et
phosphoglucomutase.

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1.2 Squences oligonuclotidiques utilises :

Les squences doligonuclotides slectionnes pour lanalyse de lexpression diffrentielle des

chantillons sont prsentes au tableau 3.
Tableau 3 : Squences (primers) doligonuclotides retenus aprs test de dilutions pour les
amplifications en PCR quantitative Qpcr. Plusieurs couples damorces pour un mme gne ont t testes
auparavant. Pour AD un htrocouple AD1 reverse et AD2 forward a t retenu, ainsi que pour CD : CD1
reverse et CD2 forward. Sigles : AD : alcool dshydrognase, PG : phosphoglucomutase, Fe : ferritine, CD :
cell division protein factor.
Nom
Squence Forward
Squence reverse
Taille (pb)
PG2

AGCTGCACTTGATGTCGTTG

TCGACGTGAACTACAGCAAC

20

Fe2

GGCCATTCCAATCACATCTC

CCGGTAAGGTTAGTGTAGAG

20

AD1*

GGTCTTGGTGCTGTTGTTT

CCAGAACCACGACAACAAA

19

AD2*

CCATTTTTGGTCTTGGTGCT

GGTAAAAACCAGAACCACGA

20

CD1*

TTGCAAGTACGGCATCAGAG

AACGTTCATGCCGTAGTCTC

20

CD2*

CTTGGCAAGTACGCCATCAGA

GAACCGTTCATGCGGTAGTCT

21

*Voir lgende.

1.3 Test de de sensibilit de la germination lacide abscissique (ABA):

Une exprience pralable a montr que le mutant roc4 prsente un phnotype de germination et
germe plus vite que le gnotype sauvage Col-0. Pour vrifier si ce taux de germination est influenc
par lacide abscissique (ABA), un inhibiteur de germination, nous avons effectu un test de
sensibilit lABA sur le gnotype sauvage et le mutant roc4 avec une concentration de 1 M.
Nous avons calcul le taux de germination sur 50 graines au bout de trois jours dimbibition sur 5
ml de glose avec ABA et sans ABA (groupe tmoin) pour les deux gnotypes Col-0 et roc4. Nous
avons ralis chaque exprience en triplicat, soit n=12.

II.

Rsultats et Discussion :
1. Rendement et puret des extractions dARN :

Echantillon

Rendement moyen (%)

[ARN] (ng/l)

(n=2)

Moyenne de
labsorance
A260/280

Col S

0,14 0,01

729 43

1,50 0,00

Col C

0,15 0,04

786 207

1,69 0,01

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Col F

0,47 0,06

2421 326

1,82 0,05

Roc S

0,23 0,20

1204 1073

1,72 0,08

Roc C

0,31 0,35

1596 1787

1,59 0,08

Roc F

0,35 0,01

1821 35

1,57 0,21

Tableau 4 : Moyennes et cart types du rendement, de la teneur en ARN et de la puret des extraits dARN
pour chaque groupe sauvage et mutant par conditions de temprature.

Comme confirm dans les diffrentes publications dextraction de lARN, les rendements sont trs
pauvres (Cathala et al, 1983), mais lextraction est assez pure dans lensemble. Deux chantillons
ont t purifis pour amliorer leur puret, mais ce ntait pas trs efficace avec une perte de 60%
de lchantillon pour une puret faiblement inchange. Une colonne Cleanup pourrait tre utilise.

2. Rtrotranscription et PCR :
A1
1

Figure 6. Vrification de la rtrotranscription des diffrents chantillons avec le gne de rfrence EF.
(A) Migration sur gel TAE 0.5x, 1% agarose et BET 100 mV aprs la PCR. (B) Rptition sur les
chantillons mal amplifis. 1a est le tmoin positif (10l), B est le tmoin ngatif (eau), les produits
contiennent 1g dADN. A1 : tmoin positif (rtrotranscrit partir de col-0 dj valid dans une premire
exprience). M : Marqueur de poids molculaire Gene Ruler 1kb Plus DNA Ladder (PM). Les rfrences
des chantillons sont nonces au tableau 2.
8

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La vrification de la rtrotranscription par PCR est prsente (Figure 6), le taux de russite est de
50%. Des extractions dARN ont t effectues nouveau par la suite afin davoir des rplicats
supplmentaires pour les rptitions.
3. Rsultat des Q-PCR
Pour chaque chantillon des tests de dilution des ADNc (1/10,1/20, ,1/100) ont t raliss pour
dterminer la quantit adquate pour raliser la qPCR. La dilution au 1/20 a t retenue. La
spcificit de plusieurs couples damorces a t teste. Les courbes de fusion prsentant un pic
unique caractristique dune bonne spcificit ont t retenues. Figure (7)
A

Figure 7 : Spcificit et efficacit des combinaisons damorces choisies. (A) Exemple dune courbe de fusion pour le
couple damorces CD2/CD1. Un seul pic montre la spcificit. (B) Courbe standard de rgression linaire pour le
couple AD2/AD1, la qualit de la rgression montre lefficacit des amorces.

4. Expression diffrentielle des 4 gnes :

La figure suivante indique les rsultats de labondance des 4 transcrits chez le mutant roc4 par
rapport au gnotype sauvage Col-0 dans deux conditions de culture : standard et chaud.

Standard
Chaud

Figure 8. Profil dexpression des 4 gnes ADH, CDC, PG et Fe dans deux conditions de culture (standard et
chaud). La lecture en logarithme de base 2 permet dinterprter plus facilement les rsultats.
9

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On reprsente lexpression diffrentielle des quatre transcrits chez le mutant roc4 par rapport au
sauvage Col-0 (fold change) sur la figure 8. Les rsultats qpcr de la culture dans la condition
froid ne sont pas prsents car les qpcr ralises avec le contrle interne EF ne sont pas
exploitables. Au niveau des deux autres conditions de temprature standard et chaud , on
remarque que lexpression des 4 gnes est inverse, ils sont sous-exprims dans la condition
standard et surexprims dans la condition chaud . On sait que les variations climatiques
peuvent agir sur les conditions de maturation de la graine et probablement sur lexpression et la
qualit des ARN stocks ltat sec.

A
B

Name
ADH
PG
Fe
CDC

Effect
(Protome)
Down
Up

Figure 9. Sous-expression des 4 gnes chez le mutant roc4 en conditions standard (A) et comparaison
avec le protome (B).

Si on compare lexpression, en condition standard, des 4 gnes au niveau transcriptionnel (figure 9)

et au niveau traductionnel (protome), on remarque quil y a une corrlation positive uniquement
pour deux gnes : laldhyde dehydrognase (ADH) et la phosphoglucomutase (PG). Ce rsultat
nest pas surprenant et est concordant avec ce quon connait dj sur les deux rgulations. En effet,
plusieurs tudes ont montr quen gnral la corrlation entre le transcriptome et le protome est
autour de 50%.
Les deux autres gnes codant pour la Ferritine (Fe) et la cell cycle division protein (CDC) sont
sous-exprims alors quau niveau protique on observe une accumulation. Lors de la reprise
germinative, les pools dARN stocks et des protines vont tre mobilises avant dtre dgrads.
Cette accumulation des transcrits est un niveau de rgulation de la vigueur germinative via leur
qualit (Rajjou et al, 2012). On sait aussi que les PPiases interviendraient dans la rgulation de la
qualit de ces ARN stocks (Figure 3, Kumari et al, 2013) ou de la conformation protique des
protines. Ainsi, on peut supposer que la cyclophiline ROC4 rgule bien les protines Fe et CDC
un niveau de rgulation post-traductionnel ou post-transcriptionnel.

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5. Test de sensibilit lABA :

Figure 10. Test de sensibilit des sauvages et mutants roc4 lABA 1 Um. Vrification de la germination
(sortie de la radicule) de 50 graines aprs 3 jours dimbibition sur glose 5 ml dans des boites de ptri. Les
barres derreurs reprsentent les carts types (n=3). Col : sauvage, Roc : mutant.

Prcdemment, les expriences dIsabelle Fabrissin ont montr un taux de germination plus
important chez le mutant roc4. Lacide abscissique inhibe la germination de la graine. Or le test de
sensibilit lABA effectu dans cette tude ne montre pas empiriquement des rsultats significatifs
(grands carts types). On ne peut donc pas conclure, la concentration utilise dABA tait peut-tre
trop faible pour diffrencier nos deux groupes.

Conclusion :
Lanalyse protomique ralise sur des graines sches du mutant roc4 cultiv dans des conditions
standard a rvl une diffrence daccumulation dune quarantaine de protines par rapport au
gnotype sauvage Col-0. Une premire identification de ces protines a t ralise partir de la
carte seed proteome dArabidopsis. Parmi les gnes codant ces protines, nous avons choisi 4
pour tudier leur niveau de transcription : une alcohol dhydrognase, une phosphoglucomutase,
une ferritine et une protine du cycle de division cellulaire (CDC8). Ce choix a t ralis en
fonction de leur implication dans diffrents stress tels que le stress au cadmium, la carence en
phosphate ou au stress oxydant. En plus des conditions de culture standard, nous avons aussi tudi
lexpression de ces gnes dans deux autres conditions de culture : chaud et froid. Nous avons
ensuite compar cette expression celle des protines rgules par les mmes gnes.
Condition Standard (21-23C) :
- Sousexpression des transcrits et diminution du taux des protines pour lalcohol
dehydrogenase et la Phosphoglucomutase.
- Sousexpression des transcrits et accumulation des protines pour la cell division
cycle protein (CDC48) et la ferritin 1 precursor ce qui traduit une diffrence
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entre la rgulation transcriptionnelle et traductionnelle pour ces deux gnes. En effet,

la rgulation se fait tous les niveaux et notamment au niveau de la qualit des ARN
stocks au cours de la maturation.
Condition chaud (26-28C) : Surexpression des transcrits.
Condition Froid (16-18C) : Nous navons pas pu exploiter les rsultats.
Test de sensibilit du mutant roc4 lABA : Le mutant roc4 nest pas sensible lABA une
concentration de 1 M et prsente un taux de germination comparable au gnotype sauvage.
Pour les perspectives, lensemble les manipulations a bien fonctionn sauf pour les chantillons
cultivs en condition de culture au froid. Ceci est d quelques erreurs de manipulations qui nont
pas permis dobtenir des rsultats. Pour le test de germination, une dure plus courte ou une
concentration plus leve dABA serait ncessaire car le seuil de sensibilit nest peut-tre pas
suffisant. Il serait intressant de raliser des analyses protomiques sur les deux autres conditions de
temprature (chaud et froid) pour comparer labondance en protines et en transcrits dans ces deux
conditions et complter nos rsultats. Il serait intressant aussi de tester la sensibilit de la
germination au cadmium car ces gnes tudis prsentent dans la littrature un stress au cadmium.

Bibliographie :
Loic Rajjou et al, Seed Germination and Vigor . The Annual Review of Plant Biology, 2012. Doi : 10.1146/annurevarplant-042811-105550
KUMARI ET AL, Cyclophilins, proteins in search of function .Plant Signaling & Behavior 8:1, e22734; January 2013;

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