Ce TP propose d'illustrer en Premire S l'action sur la morphognse de deux hormones vgtales : l'ANA

(auxine) =Acide Naphtalne Actique et le BAP (cytokinine) = Benzylaminopurine.

Matriel ncessaire.
Premire tape : la production de cals.
Deuxime tape : culture sur des milieux diffrents.
Rsultats obtenus.
Proposition d'organisation .

Matriel ncessaire pour la ralisation des diffrentes tapes de la

manipulation.
verrerie et petits matriels (voir organisation paillasse) - pince passe l'alcool et rince l'eau strile avant
chaque utilisation, gants en polythylne dsinfects l'alcool 70 avant usage...
Macrolments : milieu de Murashige et Skoog dilu 2 fois - SIGMA propose ce milieu concentr 10 fois (rf
:M0654), trs pratique.
Oligolments : milieu de Murashige et Skoog dilu 2 fois - SIGMA propose ce milieu concentr 10 fois (rf
:M0529), trs pratique.
Vitamines : hydrosol polyvitamin Roche (en pharmacie) 0,5ml/l, il existe d'autres solutions polyvitamines (ex:
Alvityl) qui servent de complments alimentaires pour jeunes enfants.
Elments organiques : saccharose 20 g/l
Glifiant : agar-agar 8 g/l
Rgulateurs de croissance :

o auxine : choisir de prfrence ANA (disponible chez JEULIN) qui reste trs stable la lumire et au chauffage -
raliser une solution 1 mg par ml dans de l'alcool 70 ( 100mg d' ANA pour 100 ml d'alcool 70.) -
o cytokinine (BAP) (disponible chez JEULIN) : raliser une solution 1 mg par ml dans de la soude 0,1N (100 mg
de BAP pour 100ml de solution de soude)

NB : les milieux qui seront fabriqus ne sont certainement pas parfaits, mais ils ont l'avantage d'tre simples (et
a marche !) - toutes les manipulations se font en milieu strile.(une hotte strile est souhaitable mais on peut trs
bien travailler prs d'une flamme ou d'un " bec lectrique " qui semble aussi assurer une zone strile
suffisante).Informations sur cot :En considrant l'achat des produits (macrolments + microlments +
vitamines + rgulateurs de croissance) et le conditionnement impos par le distributeur, le total s'lve environ
110 euros.Ces produits se conservent plusieurs annes au rfrigrateur ou au conglateur. Les autres produits,
non spcifiques de cette manipulation, sont gnralement dans les laboratoires.Avec les produits achets, on
peut facilement ralise la manipulation dans 20 classes entires soit un cot moyen par classe de 5,5 euros.

Premire tape : la production de cals.

Cette tape est ralise au laboratoire. Manipulation en milieu strile. Il faut compter 3 4 semaines pour
avoir assez de cals.

Prparation du milieu de culture :

Dissoudre le sucre dans la solution minrale, la verser dans un bcher en pyrex ou en inoxydable, ajouter l'agar-
agar en pluie, attendre 3 4 minutes que l'agar-agar gonfle.
Porter bulition feu doux, en agitant constamment jusqu' ce que le mlange soit homogne et limpide.
Attendre 7 8 minutes que la temprature baisse, puis ajouter :
-2 ml de la solution d'ANA(=2 mg par litre)
-2 ml de la solution de BAP(=2 mg par litre)
-0,5ml de la solution polyvitamine
Homogniser, couler le milieu de culture dans les tubes et striliser. Les tubes peuvent se conserver plusieurs
jours au rfrigrateur.
 Prparation de la paillasse et mise en culture :

Strilisation du matriel vgtal : ( le jour suivant la fabrication du milieu)

liminer la premire couronne de feuilles de l'endive, prlever les feuilles sur les deux ou trois couronnes
suivantes.
les feuilles sont dsinfectes 10 minutes dans un bain de Domestos dilu 5 fois.
les feuilles sont ensuite rinces dans 3 bains successifs d'eau strile.
elles sont enfin dposes dans un autre bain d'eau strile avant de prlever les explants.

Mise en culture :
les explants sont prlevs dans la partie mdiane des feuilles(15mm x 30mm).
la polarit des tissus doit tre respecte : repiquer la base de la feuille.
utiliser un scalpel trs bien affut de faon ne pas craser les vaisseaux du bois.
 Stockage des cultures et obtention des cals :
une temprature stable de 20 22 semble convenir, viter les carts trop importants
il faut trois quatre semaines pour avoir assez de cal.
Deuxime tape : cultures sur des milieux diffrents.
La division des cals :
Au bout de trois quatre semaines, les cals sont sortis des tubes et fragments en units qui seront repiques
par les lves.Cette manipulation est trs dlicate : le cal se casse assez facilement.
 Composition des milieux de culture :

les macrolments : identique l'tape 1

les oligolments : identique l'tape 1
lments organiques : identique l'tape 1
vitamines : identique l'tape 1
glifiant : identique l'tape 1
rgulateurs de croissance : concentration variable suivant les milieux :

ANA (auxine) en BAP (cytokinine)

mg/l en mg/l
Culture 1 0 0
Culture 2 0 2
Culture 3 1 2
Culture 4 2 0
Culture 5 2 2
 Mise en culture des cals :

PAS de strilisation du matriel vgtal : les cals sont dj striles, ils sont sortis et diviss sous la hotte strile
(ou dans un environnement strile), ils sont dposs dans des boites de ptri striles pour attendre la mise en
culture.
Cette tape peut tre ralise par les lves si on dispose de suffisamment de cals.
La mise en culture est trs dlicate :
les cals sont fragiles, ils ne doivent pas tre trop srrs avec la pince.
les cals ne doivent pas tre enfoncs profondment mais seuleument mis en contact avec le milieu.

Stockage des cultures :

une temprature stable de 20 22 convient trs bien, il faut absolument viter les carts trop importants
une photopriode de 8h 10h de lumire par jour semble satisfaisante.
il faut un minimum de deux trois semaines pour avoir des rsultats significatifs.

Rsultats obtenus :
 Culture 1

Culture 2
Culture 3

Culture 4
 Culture 5

Proposition d'organisation :
Organisation matrielle pour une classe :

Nombre de tubes (24 X 150) avec

Etapes
milieu prvoir
Etape1 : Production 40 tubes permettent d'esprer
du cal environ 80 fragments de cal
Etape 2 : culture du
cal sur diffrents 10 pour chaque milieux = 50 tubes
milieux

Plannification :

J : Lancement
J+57
de la J + 3 4 semaines
semaines
manipulation
1-prparation du 1-prparation des
milieu de diffrents milieux de
culture pour cals culture 1, 2, 3, 4, 5.
Ralisation
au
2-mise en 2-fragmentation des
laboratoire
culture des cals
explants
3-stockage des
 3-stockage des cultures une fois
cultures celles-ci ralises
1-mise en culture des
cals sur les diffrents 1-observation
milieux des cultures
Ralisation
par les
2-ralisation d'autres 2-interprtation
lves
manipulations (voir des rsultats
les autres ateliers obtenus
proposs ci-dessous)

Travail en ateliers :
1/4 de la classe ralise cette manipulation.
1/4 travaille sur l'origine et le rle de l'auxine
1/4 de la classe travaille sur les tissus cible de l'hormone
1/4 de la classe travaille sur le rle de la lumire dans la croissance oriente de la plante