ABSTRAIT

La biodégradation des hydrocarbures pétroliers dans les environnements froids, y compris les sols
alpins, est le résultat de micro-organismes indigènes adaptés au froid capables de dégrader ces
contaminants. Dans la présente étude, la prévalence de sept génotypes impliqués dans la dégradation
des n -alcanes ( Pseudomonas putida GPo1 alkB ; Acinetobacter spp. AlkM ; Rhodococcus spp. AlkB1 et
Rhodococcus spp. AlkB2 ), des hydrocarbures aromatiques ( P. putida xylE ), et les hydrocarbures
aromatiques polycycliques ( P. putida ndoB et Mycobacterium sp. souche PYR-1 nidA) a été déterminée
dans 12 sols contaminés par l'huile (428 à 30 644 mg d'hydrocarbures pétroliers totaux [TPH] / kg de sol)
et 8 sols alpins vierges du Tyrol (Autriche) par analyses d'hybridation par PCR de l'ADN total de la
communauté du sol, à l'aide d'amorces oligonucléotidiques et d'ADN sondes spécifiques à chaque
génotype. Les sols étudiés ont également été analysés pour divers paramètres physiques, chimiques et
microbiologiques, et des corrélations statistiques entre tous les paramètres ont été déterminées.
Génotypes contenant des gènes de bactéries à Gram négatif ( P. putida alkB , xylE et ndoB et
Acinetobacter alkM) ont été détectés à un pourcentage significativement plus élevé dans les sols
contaminés (50 à 75%) que dans les sols vierges (0 à 12,5%), indiquant que ces organismes s'étaient
enrichis dans les sols suite à la contamination. Il y avait une corrélation positive très significative ( P
<0,001) entre le niveau de contamination et le nombre de génotypes contenant des gènes de P. putida
et Acinetobacter sp. mais pas de corrélation significative entre la teneur en TPH et le nombre de
génotypes contenant des gènes de bactéries gram-positives ( Rhodococcus alkB1 et alkB2 et
Mycobacterium nidA). Ces génotypes ont été détectés à une fréquence élevée dans les sols contaminés
(41,7 à 75%) et vierges (37,5 à 50%), indiquant qu'ils sont déjà présents en nombre substantiel avant un
événement de contamination. Aucune corrélation n'a été trouvée entre la prévalence des génotypes
dégradant les hydrocarbures et les activités biologiques (respiration, hydrolyse du diacétate de
fluorescéine, activité lipase) ou le nombre de microorganismes cultivables du sol dégradant les
hydrocarbures; il n'y avait pas non plus de corrélation entre le nombre de dégradateurs d'hydrocarbures
et le niveau de contamination. Les activités biologiques mesurées ont montré une corrélation positive
significative entre elles, avec la teneur en matière organique, et partiellement avec la teneur en TPH et
une corrélation négative significative avec la teneur en masse sèche du sol ( P <0,05 à 0,001).

Les hydrocarbures pétroliers sont les contaminants les plus répandus dans l'environnement.
Biodégradation de nombreux composants des hydrocarbures pétroliers à basse température dans les
sols arctiques ( 11 , 47 , 48 ), alpins ( 24 , 26 ) et antarctiques ( 2 , 8) a été signalée et résulte de la
capacité de dégradation des micro-organismes indigènes adaptés au froid. Les microorganismes
psychrophiles et psychrotrophes adaptés au froid sont capables de se développer à des températures
autour de 0 ° C et ont adapté leur métabolisme pour fonctionner de manière optimale à basse
température. Les psychrophiles ont une température de croissance optimale ≤15 ° C et ne dépassent pas
20 ° C, tandis que les psychrotrophes (ou organismes psychrotolérants) ont des températures de
croissance optimales et maximales supérieures à 15 et 20 ° C, respectivement ( 33). Les micro-
organismes adaptés au froid jouent un rôle important dans la biodégradation in situ des hydrocarbures
dans les environnements froids, où les températures estivales ambiantes coïncident souvent avec leur
plage de températures de croissance. Un grand nombre de bactéries dégradantes provenant de sols
froids contaminés ont été identifiés, y compris des représentants des genres Gram négatif et Gram
positif ( 1 , 8 , 9 , 17 , 49 , 50 ).

Diverses méthodes sont utilisées pour caractériser les populations dégradant les hydrocarbures dans le
sol. Les études biologiques du sol, telles que les mesures de la respiration du sol, les activités
enzymatiques et les numérations microbiennes, peuvent donner des informations sur la présence de
micro-organismes viables et sur l'impact des effets des stress environnementaux, tels que la
contamination par les hydrocarbures, sur l'activité métabolique du sol ( 7 , 19 , 28 , 31 , 39). Les
techniques moléculaires directes, non basées sur la culture, pour détecter les gènes dégradant les
polluants microbiens dans les échantillons environnementaux sont également des outils puissants pour
étudier la structure et les fonctions de communautés microbiennes complexes. Les sondes de gènes
cataboliques conçues à partir de gènes spécifiques impliqués dans les étapes enzymatiques clés des
voies de dégradation microbienne des polluants environnementaux peuvent être utilisées pour
examiner à la fois les environnements vierges et contaminés afin de déterminer la présence
d'organismes ayant des capacités fonctionnelles spécifiques ( 6 , 16 ).

Il existe peu d'informations sur la prévalence et la répartition géographique de diverses populations

dégradant les hydrocarbures dans les sols. Les génotypes cataboliques impliqués dans la dégradation de
fractions représentatives d'hydrocarbures pétroliers, y compris les n -alcanes, et les hydrocarbures
aromatiques aromatiques et polycycliques (HAP), semblent être répandus dans les sols arctiques ( 46 ,
47 ) et les sédiments de l'Alaska ( 42 ). Dans une étude récente de la prévalence de divers gènes d'alcane
monooxygénase dans les sols arctiques et antarctiques, Rhodococcus spp. se sont avérés être les
génotypes dégradant les alcanes les plus abondants dans les sols vierges et contaminés alors que
Pseudomonasspp. peuvent s'enrichir à la suite d'événements de contamination et Acinetobacter spp. ne
se sont pas avérés être des membres prédominants des communautés microbiennes dégradant les
alcanes polaires ( 51). Cependant, aucune information n'est disponible sur les génotypes cataboliques en
milieu alpin. Il existe diverses différences entre les sols antarctique, arctique et alpin. Outre les
différentes localisations géographiques, les sols alpins européens sont soumis à des événements
réguliers de gel-dégel, à de fortes fluctuations de température (les températures de l'air peuvent varier
de -5 à + 20 ° C) et à de fortes précipitations (2000 à 3000 mm par an) . Les communautés microbiennes
alpines peuvent différer de celles des habitats arctiques et antarctiques car de forts vents de vallée
provenant de paysages boréaux et méditerranéens transportent continuellement des micro-organismes
vers les Alpes.

Dans la présente étude, la prévalence de sept génotypes impliqués dans la dégradation des n- alcanes,
des hydrocarbures aromatiques et des HAP dans les sols alpins européens vierges et contaminés par
l'huile a été déterminée par des analyses indépendantes de la culture (PCR et analyses d'hybridation).
Les sols ont également été analysés pour divers paramètres physiques, chimiques et microbiologiques, y
compris le dénombrement microbien dépendant de la culture, et des corrélations statistiques ont été
déterminées entre tous les paramètres. Il s'agit de la première analyse moléculaire des populations
microbiennes dégradant les hydrocarbures dans les sols alpins et de la première tentative de corrélation
de ces génotypes avec d'autres paramètres.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Les sols.

Douze sols contaminés par les hydrocarbures et huit sols vierges (non contaminés) ont été prélevés en
septembre 2001 sur divers sites alpins du Tyrol (Autriche) à des altitudes comprises entre 500 et 2900 m
au-dessus du niveau de la mer. Des échantillons ont été prélevés dans plusieurs zones d'un site et
mélangés pour produire des échantillons composites. Les sols contaminés provenaient de zones proches
de réservoirs de stockage de diesel, de stations-service, de pompes à essence ou de garages. Les sols
vierges correspondants ont été collectés au même endroit ou à des endroits comparables sans pollution
par les hydrocarbures (tableau(Tableau 1).1). Les sols ont été collectés depuis la surface jusqu'à une
profondeur d'environ 0 à 5 cm avec des spatules stériles, transportés dans des glacières au laboratoire
et stockés à -20 ° C jusqu'à leur analyse. Les sous-échantillons ont été stockés à -80 ° C pour l'analyse
biologique moléculaire.
Analyse chimique et physique.

Les hydrocarbures pétroliers totaux (TPH) ont été extraits des sols avec du 1,1,2-trichlorotrifluoroéthane et quantifiés
par spectroscopie infrarouge ( 13 ). La masse sèche du sol (dm) a été déterminée à partir de la perte de poids après
traitement thermique (20 h à 105 ° C). La perte au feu en tant que mesure de la teneur en matière organique du sol a
été calculée à partir de la perte de poids des sols séchés au four après 3 h à 500 ° C ( 37 ). Pour déterminer le pH du
sol, 1 partie de sol a été mélangée avec 2,5 parties de CaCl 2 10 mM et le pH a été mesuré avec une électrode en verre
après 2 h ( 39 ). Toutes les analyses ont été effectuées avec deux répétitions et les valeurs moyennes obtenues sont
rapportées.

Analyse microbiologique.

Trois répliques ont été utilisées pour toutes les analyses et les valeurs moyennes obtenues sont rapportées. Les écarts
types obtenus étaient ≤10%.

(i) Respiration et activités enzymatiques.

La respiration du sol ( évolution du CO 2 ) a été déterminée par la technique Isermeyer, où le CO 2 produit pendant 24
h à 10 ° C a été quantifié par titrage ( 39 ). Pour mesurer l'activité lipase, le p- nitrophénol libéré à partir du butyrate de
p- nitrophényle après 10 min à 30 ° C et pH 7,25 a été quantifié par colorimétrie à 400 nm ( 27 ). L'hydrolyse du
diacétate de fluorescéine (FDA) a été déterminée en utilisant une méthode adaptée ( 28 ) de celle de Schnürer et
Rosswall ( 40 ); la quantité de fluorescéine libérée par la FDA après 2 h à 25 ° C et pH 7,6 a été quantifiée à 490 nm.

(ii) Numérations microbiennes.

Les numérations microbiennes du sol (micro-organismes cultivables) ont été déterminées par la méthode de comptage
sur plaque pour les cellules viables. Des suspensions de sol ont été préparées en secouant du sol correspondant à 5 g
de dm avec 45 ml de pyrophosphate de sodium à 0,28% pendant 30 min à 10 ° C et 150 tr / min. Des dilutions
appropriées, préparées dans du NaCl à 0,9%, ont été étalées en surface sur des plaques d'agar. Des plaques d'agar- R 2
A ( 36 ) ont été utilisées pour dénombrer les micro-organismes hétérotrophes aérobies. Les CFU des hétérotrophes ont
été comptés après 28, 14, 7 et 3 jours à 2, 10, 25 et 37 ° C, respectivement. Les populations dégradant les
hydrocarbures ont été quantifiées sur des plaques d'agar contenant de la gélose purifiée et un milieu de sels minéraux
à pH neutre tamponné au phosphate ( 24 ) supplémenté d'extrait de levure (10 mg litre -1); 20 ul de la source de
carbone (diesel ou hexadécane) ont été déposés sur un petit morceau de papier filtre placé sur le couvercle de la boîte
de Pétri. Les dégradateurs d'hydrocarbures ont été dénombrés après 14 et 6 jours à 10 et 37 ° C, respectivement.

Caractérisation moléculaire.

Pour déterminer la prévalence de divers génotypes dégradant les hydrocarbures dans les sols alpins contaminés aux
hydrocarbures et vierges, l'ADN total de la communauté a été extrait des sols et criblé par PCR en utilisant des
ensembles d'amorces oligonucléotidiques spécifiques pour chaque génotype de dégrader.
(i) Extraction totale d'ADN communautaire du sol et purification d'ADN.

L'ADN communautaire total de chaque échantillon de sol a été extrait à l'aide d'une méthode adaptée ( 15 ) de celle
de Flemming et al. ( 14 ). Avant le traitement de lyse, 1 g de sol a été mélangé avec 950 pi d'eau distillée stérile.
Ensuite, 50 pi de Tris-HCl 250 mM (pH 8,0) contenant 5 mg de lysozyme ont été ajoutés, et les échantillons ont été
incubés pendant 30 min à 30 ° C et ensuite pendant 30 min à 37 ° C avec mélange par inversion toutes les 10 min.
Après l'ajout de 5 pi de protéinase K (20 mg ml -1 ), les échantillons ont été incubés pendant 1 h à 37 ° C. Le traitement
de lyse a été complété par l'ajout de 5 ul de dodécyl sulfate de sodium à 20% et une incubation pendant 30 min à 85 °
C. Les échantillons ont été centrifugés (13 600 × g) pendant 10 min à température ambiante. Les surnageants ont été
traités avec 0,5 volume d'acétate d'ammonium 7,5 M, incubés sur de la glace pendant 15 min pour précipiter les
protéines et les acides humiques, et centrifugés pendant 5 min à 4 ° C. L'ADN a été précipité avec 1 volume
d'isopropanol à -20 ° C pendant une nuit. Les pastilles ont été lavées avec de l'éthanol à 70% froid et séchées sous vide
rapide. Chaque échantillon d'ADN a été remis en suspension dans 200 pi de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) -1 mM EDTA. Pour
obtenir un ADN amplifiable par PCR de haute qualité, tous les échantillons ont été purifiés à l'aide de colonnes de spin
de polyvinylpolypyrrolidone pour éliminer les composés inhibiteurs de la PCR ( 10). Pour confirmer que l'ADN avait été
extrait avec succès des sols, les extraits d'ADN du sol ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (0,7%
d'agarose) pour les bandes d'ADN chromosomique observables. Pour vérifier l'absence de tout composé inhibiteur de
la PCR dans les préparations d'ADN et pour confirmer que l'ADN pourrait être amplifié avec succès par PCR, des
amorces eubactériennes universelles d'ADNr 16S ( 12 ) ont été utilisées comme contrôle d'amplification PCR positif sur
des dilutions appropriées (1:10, 1 : 50 et 1: 100) de chaque extrait d'ADN du sol.

(ii) Détection des gènes cataboliques par PCR et analyse d'hybridation.

Les 20 extraits d'ADN purifiés ont ensuite été criblés par PCR pour détecter les sept gènes cataboliques suivants qui
codent pour des enzymes impliquées dans une variété de voies de dégradation des hydrocarbures bactériens connus:
alkB , alcane monooxygénase de Pseudomonas putida GPo1 ATCC 29347, anciennement conçu P. oleovorans , C 5
dégradation d'un alcane en C 12 ( 20 , 44 , 45 ); alkM , alcane monooxygénase d' Acinetobacter sp. souche ADP-1,
dégradation d'un alcane en C 10 à C 20 ( 35 ); alkB1 et alkB2( Dégradation des alcanes en C 12 à C 16 ), les alcanes
monooxygénases de Rhodococcus spp. ( 52 ); xylE , catéchol-2,3-dioxygénase de P. putida ATCC 33015, dégradation du
xylène et du toluène ( 34 ); ndoB , naphtalène dioxygénase de P. putida ATCC 17484, dégradation des HAP
(naphtalène) ( 21 ); et nidA , grande sous-unité pyrène dioxygénase de Mycobacterium sp. souche PYR-1, dégradation
des HAP (pyrène) ( 18 ). Les jeux d'amorces oligonucléotidiques spécifiques de ces génotypes ont été précédemment
décrits: alkB ,alkM , alkB1 et alkB2 dans la référence 51, et xylE et ndoB dans la référence 49. Pour le gène nidA , les
amorces oligonucléotidiques (amorce directe, 5′-ATCTTCGGGCGCGCCTGGGTGTTTCTCGG 3 ′; amorce inverse, 5′-
AATTGTCGGCGCGCTGT) régions présentant une identité de séquence d'ADN élevée à partir de quatre séquences de
gènes de grandes sous-unités de dioxygénase provenant de deux Rhodococcus spp. (Numéros d' accès GenBank
AF121905 , AF082663 ), un Nocardioides sp. ( ABO17794 ) et un Mycobacterium sp. ( AF249301) et a conduit à
l'amplification de fragments PCR de 323 pb. Etant donné que la souche ADP-1 Alkm amorces peuvent avoir été trop
spécifique pour amplifier Acinetobacter Alkm homologues autres que ADP-1 Alkm de la souche de source ( 51 ),
universel Acinetobacter Alkm amorces (amorce sens [Alkm-F universel], 5'-CGIGIIGCIACICCTGAAGATCCAGC -3 ';
amorce inverse [universel Alkm-R], 5'-ITTATTITTCCAICTATGCTCTGG-3') ont été dérivées de régions d'identité de
séquence élevée d'ADN de sept Alkm gènes de six Acinetobacter souches ( Acinetobacter sp souche ADP-1 [. 35 ];
Acinetobacterles souches EB104, 69-V, NRRLB-2769A et NCIB 8250 [ 41 ]; et Acinetobacter sp. souche M1 [ alkMa et
alkM ] [ 43 ]).
Toutes les amplifications PCR ont été réalisées comme décrit précédemment ( 49 ) pendant 30 cycles de 1 min de
dénaturation à 94 ° C, 1 min d'hybridation à 60 ° C, et 1 min d'extension à 72 ° C, avec une extension finale de 3 min à
72 ° C. Les fragments PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (1,2% d'agarose) et visualisés par
coloration au bromure d'éthidium ( 38 ). Pour vérifier l'amplification du fragment PCR correct, les fragments PCR ont
été transférés des gels d'agarose aux membranes en nylon et analysés par hybridation Southern avec des sondes ADN
spécifiques pour alkB , alkM , alkB1 , alkB2 , xylE , ndoB et nidA, en utilisant des conditions de préhybridation,
d'hybridation et de lavage à haute stringence à 65 ° C, essentiellement comme décrit précédemment ( 51 ). Les
fragments alkM produits à la fois à partir de la souche ADP-1 alkM et des ensembles d'amorces universelles
Acinetobacter alkM ont été sondés avec une sonde de 499 pb ( 51 ) dérivée du fragment PCR de la souche ADP-1 alkM
. Les sondes ont été marquées avec le système de marquage et de détection d'acide nucléique non radioactif
digoxigénine DIG, en utilisant le kit de marquage et de détection d'ADN DIG (Roche Molecular Biochemicals, Laval,
Québec, Canada).

Pour déterminer la spécificité et l'utilité des deux ensembles d' amorces alkM , cinq souches d' Acinetobacter (ADP-1,
EB104, 69-V, NRRLB-2769A et NCIB 8250) et deux souches témoins négatives ( P. putida GPo1 et Rhodococcus sp.
souche Q15) ont été testés en utilisant les deux jeux d' amorces alkM par la procédure d'hybridation PCR. Pour l'
ensemble d'amorces ADP-1 alkM , seule la taille de fragment de PCR attendue a été amplifiée et un signal
d'hybridation a été obtenu à partir de la souche témoin positive ADP-1 mais pas des quatre autres souches, indiquant
qu'elle était spécifique de cet organisme. Avec l' Acinetobacter alkM universelamorces, les fragments de PCR de 372
pb attendus d'intensité relativement égale ont été amplifiés à partir des cinq souches d' Acinetobacter testées mais le
signal d'hybridation était plus fort pour l'ADP-1 que pour les quatre autres souches: les fragments de 370 pb amplifiés
par l' amorce alkM universelle l'ensemble étaient internes au fragment de PCR de la souche ADP-1 alkM de 472 pb
d'origine dans toutes les souches d' Acinetobacter testées; l'indentité de la séquence d'ADN dans la région de 370 pb
allait de 67 à 100%. Pour les souches témoins négatifs, des signaux d'amplification et d'hybridation très faibles ont été
observés avec la souche de Rhodococcus mais pas avec P. putida GPo1.

Analyse des données statistiques.

Les calculs statistiques ont été effectués à l'aide du logiciel Statistica 6.0. La distribution normale des données a été
testée par le test de Kolmogorov-Smirnov. En fonction du manque (teneur en TPH, teneur en matière organique et
respiration du sol) ou de la présence (tous les autres paramètres étudiés) de la distribution normale des corrélations
entre les caractéristiques du sol étudiées ont été analysées par corrélation de rang de Spearman ou analyse de
régression (corrélation produit-moment de Pearson).
RÉSULTATS ET DISCUSSION

Analyse chimique et physique, respiration et activités enzymatiques des sols.

La plupart des sols étudiés dans cette étude étaient caractérisés par une faible teneur en matière organique (<2%);
seuls trois sols avaient une teneur élevée en matière organique (> 10%). Les valeurs de pH variaient de 4,8 à 9,2. Les
12 sols contaminés par le pétrole avaient une teneur en TPH allant de 428 à 30644 mg / kg de sol dm (tableau(Tableau
1).1). La contamination par les hydrocarbures peut entraîner une stimulation significative des activités physiologiques
des microorganismes du sol ( 7 , 19 , 28 , 31 ).

Les activités biologiques mesurées dans cette étude (respiration en termes d' évolution de CO 2 , hydrolyse FDA et
activité lipase [Tableau[Tableau 1])1]) ont montré une corrélation positive statistiquement significative entre eux et
avec la teneur en matière organique et une corrélation négative significative (sauf pour la respiration du sol) avec la
teneur en dm du sol (Tableau (Tableau 2).2). Des corrélations positives significatives ont également été trouvées entre
le niveau de contamination et la respiration du sol, ce qui indique l'adaptation des micro-organismes indigènes du sol à
la contamination et à l'utilisation microbienne des hydrocarbures comme source supplémentaire de carbone. La
respiration du sol est une mesure de l'activité biologique totale du sol et résulte de la dégradation de la matière
organique, où la formation de CO 2 est la dernière étape de la minéralisation du carbone. Les mesures
respirométriques fournissent des informations sur le potentiel de biodégradabilité des hydrocarbures dans les sols et
sont souvent utilisées comme paramètre pertinent lors des traitements de bioremédiation. L'augmentation de la
respiration après l'application d'huile indique une minéralisation réussie des hydrocarbures ( 7 , 22 ,24 , 28 ).
L'absence de corrélation entre la teneur en TPH et les activités enzymatiques hydrolytiques mesurées (hydrolyse FDA
et activité lipase) dans cette étude peut être attribuée à des facteurs interférents, tels que la composition des
composants contaminants en raison de l'âge de la contamination et / ou de la présence de composés inhibiteurs, qui
peuvent influencer l'activité enzymatique dans les sols contaminés. Le taux d'hydrolyse de la FDA dans le sol a été
considéré comme un indice approprié de l'activité enzymatique globale, car la FDA est hydrolysée par un certain
nombre d'enzymes différentes telles que les protéases, les lipases et les estérases ( 40 ). Dans une étude de l'impact
des hydrocarbures sur les activités enzymatiques du sol, la présence d'huile diesel a entraîné une augmentation
significative de l'hydrolyse et de l'activité lipase de la FDA par rapport à celles des témoins non contaminés ( 28).
Cependant, d'autres auteurs ont trouvé des taux d'hydrolyse FDA nettement inférieurs dans les sols contaminés par
l'huile que dans les sols vierges ( 32 ). L'activité lipase du sol est un outil précieux pour surveiller la biodégradation de
l'huile dans les sols fraîchement contaminés par le diesel ( 30 ), très probablement en raison d'une teneur élevée en
composés aliphatiques disponibles.

Comptages microbiens du sol.

Bien que le dénombrement des populations microbiennes soit généralement effectué pour obtenir des informations
sur le potentiel de biodégradation des hydrocarbures et / ou pour tester l'efficacité de la bioremédiation, il est associé
à un certain nombre de difficultés tant du point de vue méthodologique que de l'interprétation des résultats. Seule
une petite fraction des microorganismes (<1 à 10%) peut être isolée et cultivée sur des milieux de laboratoire car les
besoins de croissance de nombreuses souches sont inconnus. Pour cette raison, les décomptes de plaques sous-
estiment la véritable densité de population viable ( 3 - 5 ).

Le dénombrement des micro-organismes dans les sols vierges et contaminés a démontré que des populations
microbiennes significatives étaient présentes dans tous les sols, comme le montrent les dénombrements viables
d'hétérotrophes et de dégradateurs de pétrole (tableau (Tableau 3).3). Les nombres d'hétérotrophes cultivables ont
été déterminés à 2, 10, 25 et 37 ° C pour obtenir des informations sur la plage de températures de croissance des
micro-organismes indigènes du sol. Le plus grand nombre de micro-organismes viables a été observé à 25 ° C dans 15
des 20 sols étudiés et à 10 ° C dans 5 des sols (P4, P6, C6, C8 et C10). Dans aucun des sols, la température de
croissance optimale n'était de 2 ou 37 ° C. Cependant, dans la majorité des sols, les populations poussant à 2 et 10 ° C
étaient plus importantes (de 1 à 3 ordres de grandeur à 2 ° C et de 2 à 4 ordres de grandeur à 10 ° C) que celles
poussant à 37 ° C. C, indiquant la prédominance des micro-organismes adaptés au froid.47 , 48 ).
Le nombre de dégradants de gasoil cultivable a été déterminé à 10 ° C (adapté au froid; psychrophiles et
psychrotrophes) et 37 ° C (mésophiles). Dans les sols alpins, les températures supérieures à 10 ° C ne sont atteintes
que pendant la période de forte irradiation solaire et les chaudes journées d'été. Les micro-organismes adaptés au
froid (psychrotrophes) se développent rarement à ≥ 37 ° C, tandis que les mésophiles se développent rarement à ≤ 10
° C. Le nombre de dégradateurs d'huile adaptés au froid était en général supérieur au nombre de dégradants
mésophiles. Dans la plupart des sols, le nombre de micro-organismes utilisant des hydrocarbures adaptés au froid était
supérieur de 2 à 3 ordres de grandeur (10 sols [P3, P5, P6, P8, C1 à C3, C7, C8 et C12]) ou même> 3 à 4 ordres de
grandeur (5 sols [P2, P4, C5, C6 et C9]) que ceux des populations mésophiles correspondantes (Tableau(Tableau 3).3).
Cela souligne le rôle important des communautés microbiennes adaptées au froid dans la biorestauration des sols
contaminés dans les habitats alpins.
Le calcul des ratios des dégradateurs d'hydrocarbures et des hétérotrophes dans les sols étudiés a montré qu'une
partie importante des hétérotrophes était capable d'utiliser l'hexadécane et le diesel. Dans 17 sols, 13 à 92% des
hétérotrophes adaptés au froid (10 ° C) étaient de l'hexadécane et des dégradateurs de pétrole; dans les 3 sols
résiduels, 4 à 9% de la population hétérotrophe utilise encore des hydrocarbures. Parmi les populations mésophiles
(37 ° C), la proportion de dégradants de pétrole parmi les hétérotrophes avait tendance à être plus faible, avec 11, 7 et
2 sols contenant respectivement 10 à 97%, 1 à 8% et 0,3 à 0,4% de dégradants de pétrole ( Table(Tableau 3).3). Les
résultats ci-dessus étaient indépendants du niveau de contamination des sols. Cela peut s'expliquer par l'ubiquité des
micro-organismes dégradant les hydrocarbures. Des microorganismes adaptés au froid dégradant le pétrole ont été
trouvés dans des environnements alpins ( 25 , 29 ) et arctiques ( 48 , 53 ) vierges et contaminés . Cependant, une
augmentation de la population dégradant les hydrocarbures après contamination a également été documentée dans
divers sols froids ( 2 , 11 , 24 , 47 ).

L'ubiquité des dégradateurs d'hydrocarbures a également été confirmée par une analyse de corrélation (Tableau
(Tableau 4).4). Il n'y avait pas de corrélation entre la teneur en TPH et le nombre de dégradants d'hydrocarbures
cultivables. Le nombre d'hétérotrophes adaptés au froid (cultivés à 10 ° C) a montré une corrélation positive
significative avec le nombre de dégradateurs de gazole et d'hexadécane adaptés au froid, et le même résultat a été
obtenu pour les populations mésophiles (cultivées à 37 ° C). Comme déjà observé pour les activités biologiques, le
nombre d'hétérotrophes et de dégradateurs d'hydrocarbures a généralement montré une corrélation positive
significative avec la teneur en matière organique du sol, et il y avait une tendance négative, bien que non significative,
à corréler avec le dm du sol. Cependant, les numérations microbiennes n'étaient pas significativement corrélées avec
les activités biologiques (à quelques exceptions près pour l'hydrolyse par la FDA). Des résultats similaires ont été
décrits précédemment ( 32). Les activités biologiques étaient plus élevées dans les sols vierges que dans les sols
contaminés par le pétrole, tandis que les nombres microbiens étaient similaires dans les sols vierges et contaminés (
32 ). Des corrélations positives entre les dénombrements microbiens et les activités biologiques du sol ont été
rapportées principalement pour les études de biorestauration après la biostimulation des microorganismes du sol ( 11
, 31 , 47 ).
Caractérisation moléculaire.

(i) Prévalence des génotypes.

L'amplification par PCR du fragment d'ADNr 16S correct a été obtenue pour tous les extraits de sol (données non
présentées), indiquant que l'ADN du sol avait été extrait avec succès et qu'une inhibition de l'amplification par PCR ne
s'était pas produite. Des analyses de PCR et d'hybridation ultérieures des populations microbiennes indigènes ont
indiqué que les sept génotypes ( alkB , alkM , alkB1 , alkB2 , xylE , ndoB et nidA ) étaient présents dans les sols alpins
vierges et / ou contaminés (tableau(Tableau 5).5). Dans la plupart des cas, des fragments d'ADN amplifiés à partir de la
PCR d'extraits d'ADN de sols alpins vierges et contaminés se sont hybridés à la sonde de gène correspondante,
indiquant que les fragments de PCR amplifiés possédaient un niveau élevé d'identité de séquence d'ADN (≥68%) avec
les régions correspondantes du gènes cataboliques cibles étudiés. Un gel représentatif est illustré à la Fig.Fig. 1.1. Le
fragment PCR de la taille attendue ne s'est pas hybridé aux sondes de gène respectives dans trois cas; Les fragments
PCR des sols vierges P4 et P2 ne se sont pas hybridés à alkB et xylE , respectivement, et le fragment PCR alkM universel
dans le sol contaminé C5 ne s'est pas hybridé à la sonde du gène ADP-1 alkM , indiquant que des génotypes
apparentés à distance ou une PCR fausse fragments avaient été amplifiés. Dans certains cas, des fragments de PCR qui
n'étaient pas ou n'étaient que faiblement détectés visuellement après coloration au bromure d'éthidium ont été
détectés par une analyse d'hybridation ultérieure en raison de la plus grande sensibilité de la technique d'hybridation (
51). Dans une étude précédente utilisant une technique d'extraction d'ADN de sol très similaire avec des sols polaires (
51 ), les limites de détection pour alkB1 , alkB et ADP-1 alkM ont été rapportées à ≈10 4 cellules / g de sol pour la
détection visuelle des produits d'amplification par PCR et ≈10 2 à 10 3 cellules / g de sol par hybridation des produits
d'amplification PCR.
Pour les génotypes dégradant les alcanes, les génotypes alkB1 et alkB2 ont été détectés dans de nombreux sols alpins
vierges et contaminés. alkB1 a pu être trouvé dans 37,5% (pourcentage de sols qui ont donné un signal d'hybridation
positif à partir des produits d'amplification PCR) des sols vierges et 41,7% des sols contaminés, tandis que alkB2 a été
détecté dans une plus grande mesure à la fois en vierges (50%) et sols contaminés (75%). D'autre part, l' alkB a été
détecté dans de nombreux sols contaminés (75%) mais seulement dans l'un des huit sols vierges (12,5%). Utilisation
des apprêts universels alkM , alkMdes génotypes ont été détectés dans 50% des sols contaminés, mais n'ont été
trouvés dans aucun des huit sols vierges, semblable au résultat d' alkB (tableau(Tableau 5).5). Cependant, il est
intéressant de noter que les fragments de PCR ADP-1 alkM n'ont été détectés dans aucun des sols alpins lors de
l'utilisation du jeu d' amorces ADP-1 alkM original par PCR et analyse d'hybridation (données non présentées); L'ADP-1
alkM a également été rarement détecté dans les sols contaminés polaires vierges ( 51 ). Les fragments alkM de 370 pb
amplifiés par l' ensemble d'amorces alkM universel obtenu à partir des sols s'hybridaient relativement faiblement à la
sonde du gène ADP-1 alkM (472 pb) (par rapport au contrôle positif, ADP-1 alkM amplifié par l' alkM
universelamorces) (données non présentées), bien que l'intensité des fragments de PCR obtenus à partir des sols et du
témoin soit à peu près égale. Des résultats similaires ont été observés avec des analyses de validation d'hybridation
par PCR des souches témoins d' Acinetobacter (c'est-à-dire, une forte amplification par PCR alkM des cinq souches d'
Acinetobacter testées et seulement une hybridation relativement forte avec le fragment d'amplification PCR de la
souche témoin ADP-1 alkM ). Ces résultats indiquent que le génotype ADP-1 alkM et les organismes qui le contiennent
ne sont pas présents en quantités significatives dans les sols polaires ou alpins, mais d'autres génotypes alkM sont
présents dans les sols alpins en quantités suffisantes pour être détectés par hybridation PCR.

Le génotype dégradant aromatique P. putida xylE (dégradation BTEX) a été trouvé dans un seul des huit sols vierges
(12,5%) mais dans 58,3% des sols contaminés (Tableau(Tableau 5).5). Pour les génotypes dégradant les HAP, le ndoB
était présent dans un seul des sols vierges (12,5%) mais s'est enrichi dans les sols contaminés (66,7%). Le génotype
mycobactérien nidA était présent dans les sols vierges (50%) et contaminés (58,3%) à des degrés similaires (tableau
(Tableau 55).

(ii) Effet de la teneur en TPH sur la prévalence des génotypes.

Il y avait une corrélation statistiquement significative entre le niveau de contamination et la prévalence des génotypes
dans les sols alpins lorsque les sept génotypes étudiés ont été considérés (coefficient = 0,508, p = 0,022 *, n = 20). Les
génotypes contenant des gènes de bactéries à Gram négatif ( alkB , xylE et ndoB de P. putida , et alkM d' Acinetobacter
sp.) Ont été détectés à un degré significativement plus grand chez les contaminés (50 à 75%) que chez les primitifs (0 à
12,5%) sols (tableau(Tableau 5).5). Ceci a été confirmé par une corrélation positive très significative ( P <0,001) entre la
teneur en TPH des sols et le nombre de génotypes contenant des gènes de P. putida et Acinetobacter sp. (coefficient =
0,692, P = 0,0007 ∗∗∗, n = 20). En revanche, il n'y avait pas de corrélation significative entre le niveau de contamination
et le nombre de génotypes contenant des gènes de bactéries gram-positives ( alkB1 et alkB2 de Rhodococcus sp., NidA
de Mycobacteriumsp.). Ces génotypes ont été détectés avec une fréquence élevée dans les sols contaminés (41,7 à
75%) et vierges (37,5 à 50%) (tableau(Tableau 55).

Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que les micro-organismes contenant des génotypes dégradant les
hydrocarbures dérivés de pseudomonades et d' Acinetobacter sont enrichis suite à une contamination par les
hydrocarbures, mais des populations importantes sont rarement trouvées dans les sols alpins non contaminés. En
revanche, un nombre substantiel de bactéries contenant des génotypes dérivés de Rhodococcus ( alkB1 et alkB2 )
Mycobacterium ( nidA ), et probablement d'autres actinomycètes contenant de l'acide mycolique à haute G + C
étroitement apparentés sont déjà présents dans les sols avant que des événements de contamination ne se
produisent. Des tendances similaires ont été observées avec les sols arctiques et antarctiques ( 51 ) et avec les
populations adaptées au froid du CFS-Alert (47 ) et d'Eureka ( 48 ) dans l'Extrême-Arctique canadien. MacNaughton et
coll. ( 23 ) ont également observé une augmentation de la population à Gram négatif avec le temps dans les parcelles
mazoutées par rapport aux parcelles non huilées.

La prévalence observée de certains génotypes dans les sols vierges ou contaminés peut être expliquée par le schéma
rK , qui suppose que l'évolution favorise soit l'adaptation à des taux élevés de reproduction ( r stratèges) soit
l'utilisation optimale des ressources environnementales ( stratèges K ) ( 5 ). Les bactéries telles que les pseudomonas
(dans cette étude P. putida ) et les membres du genre Acinetobacter , qui colonisent rapidement et se développent sur
les matières riches en nutriments (dans cette étude, les éléments nutritifs étaient représentés par la contamination
par les hydrocarbures), sont r stratégistes. D'autres, comme les streptomycètes, les corynebactéries et les bactéries du
sol similaires (dans cette étude, Rhodococcuset Mycobacterium spp.) ont tendance à mieux réussir dans les situations
de ressources limitées et sont des stratèges K. Les populations de stratèges K sont généralement des membres plus
stables et permanents de la communauté ( 5 ).

Aucune corrélation n'a été trouvée entre la prévalence des génotypes dégradant les hydrocarbures et les activités
biologiques étudiées (respiration, hydrolyse FDA et activité lipase) ou le nombre de microorganismes cultivables du sol
dégradant les hydrocarbures. Cela peut s'expliquer par plusieurs faits. La quantification des cellules viables ne donne
aucune information sur l'activité des populations. Il existe des différences méthodologiques entre les méthodes
microbiologiques classiques dépendant de la culture et les méthodes de biologie moléculaire indépendantes de la
culture, et les corrélations manquantes entre la prévalence des génotypes cataboliques et le nombre de dégradants
d'hydrocarbures suggèrent que de nombreuses bactéries non cultivables, encore inconnues contenant des génotypes
homologues, existent dans ces derniers. Sols alpins. Il peut y avoir eu une augmentation du nombre de dégradateurs
d'hydrocarbures dans les sols contaminés, mais ils peuvent ne pas avoir été cultivables par les méthodes utilisées. De
plus, il n'y a pas de milieu sélectif pour faire la distinction entre Gram négatif (K stratèges) et des microorganismes
gram-positifs ( r stratèges). Des études supplémentaires sont nécessaires pour vérifier si des corrélations peuvent être
obtenues entre les activités mesurées et les activités potentielles déterminées par des approches indépendantes de la
culture.