Cette étude rapporte l'isolement et l'identification

d'espèces bactériennes à partir de sols de fermes de

fleurs capables de se biodégrader
pesticides xénobiotiques couramment utilisés dans les
fermes de fleurs. Des échantillons de sol ont été
prélevés au hasard parmi cinq
principales fermes de fleurs autour du bassin du lac
Naivasha. Quatre points d'échantillonnage pour chaque
serre au sein des fermes ont été
sélectionné au hasard, c'est-à-dire deux points dans
les serres et deux points de drainage de l'eau autour
des serres.
Caractérisation morphologique, culturelle et
biochimique des espèces bactériennes isolées du sol de
l'exploitation florale
échantillons identifiés principalement Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Rhodococcus erythropolis
et Bacillus
espèces subtilis. Analyse qualitative et quantitative
d'échantillons de sol par chromatographie liquide
haute pression
identifié l'aldrine, la dieldrine, l'endosulfan, le
diméthoate, le malathion et le méthylparathion comme
les principaux résidus de pesticides
cadeau. Les isolats bactériens ont été cultivés dans
des milieux nutritifs et incubés avec différentes
concentrations de pesticide
résidus en fonction de la concentration moyenne des
résidus de pesticides analysés à partir d'échantillons
de sol. Analyse pour
la biodégradation des consortiums de pesticides a été
effectuée tous les 2 jours, 10 jours, 15 jours et 21
jours à 15 ° C in vitro. Tous les
les espèces bactériennes étaient capables de dégrader
les résidus de pesticides à différents niveaux. La
bioremédiation peut donc
être une meilleure alternative pour résoudre les
problèmes de pollution autour du bassin du lac
Naivasha. Les produits de bioremédiation étaient
identifié par chromatographie liquide haute
performance.

introduction
L'intérêt pour la biodégradation microbienne des
polluants s'est intensifié
ces dernières années, alors que l'humanité s'efforce
de trouver des moyens durables de nettoyer
environnements contaminés [1]. Ces bioremédiation et
les méthodes de biotransformation s'efforcent
d'exploiter l'étonnant,
capacité naturelle des micro-organismes à se dégrader,
à transformer ou
accumuler une vaste gamme de composés, y compris des
hydrocarbures (par exemple,
huile), biphényles polychlorés (PCB), hydrocarbures
polyaromatiques
(HAP), des composés hétérocycliques (tels que la
pyridine ou la quinoléine),
substances pharmaceutiques, radionucléides et métaux
[2]. Majeur
les avancées méthodologiques de ces dernières années
ont permis de
analyses génomiques, métagénomiques, protéomiques,
bioinformatiques et autres analyses à haut débit de
micro-organismes pertinents pour l'environnement
fournir des informations sans précédent sur les
principales voies de biodégradation
et la capacité des organismes à s'adapter aux
changements environnementaux
conditions [3]. Dans le domaine de la microbiologie
environnementale, les études globales basées sur le
génome ouvrent une nouvelle ère offrant une in silico
sans précédent
points de vue des réseaux métaboliques et de
régulation, ainsi que des indices
évolution des voies de dégradation et à l'adaptation
moléculaire
stratégies pour changer les conditions
environnementales [4]. Fonctionnel
les approches génomiques et métagénomiques augmentent
notre
compréhension de l'importance relative des différentes
voies et
réseaux de régulation aux flux de carbone dans des
environnements particuliers et pour
composés particuliers et ils accéléreront certainement
la
développement de technologies de bioremédiation et de
biotransformation
procédés utilisant plusieurs microbes [5,6].
Matériels et méthodes
Site d'échantillonnage
Le lac Naivasha est un lac d'eau douce au Kenya, à
l'extérieur de la ville de
Naivasha dans la vallée du Grand Rift. Coordonnées
géographiques du lac
sont 0 ° 46’6,70 ”S 36 ° 21’2,32” E. L'activité la
plus importante du lac
Naivasha, bien que pour les grands agriculteurs, est
l'irrigation extensive
industrie de la floriculture et de l'horticulture en
serre. Élevage de bétail
et des sanctuaires de gibier privés et des zones de
conservation existent également dans le
bassin versant [7].
Collecte d'échantillons
Des échantillons de sol ont été prélevés sur cinq
les serres de chacune des cinq fermes fleuries, à
savoir la ferme florale Crescent,
Ferme de fleurs d'Elsamere, ferme de fleurs de
Karuturi, ferme de fleurs de Malewa et
Ferme de fleurs d'égouts autour du bassin du lac
Naivasha. Aléatoire systémique
la méthode d'échantillonnage a été utilisée pour
recueillir les échantillons. Échantillonnage de quatre
les points pour chaque serre dans les fermes ont été
choisis au hasard
c'est-à-dire deux points dans les serres et deux
points de drainage de l'eau
autour des serres. Un noyau de sol a été creusé à
l'aide de la houe et ramassé
à l'aide d'une pelle jusqu'à une profondeur de 5 à 10
cm (pour l'évaluation de
profondeur d'adsorption) des quatre emplacements
différents de chacun
serre et environ 200 g du noyau écopé prélevés. le
les noyaux de chaque serre ont été soigneusement
mélangés pour donner un
échantillon composite de 100 g.

Isolation and characterization of bacterial species

5 mg des échantillons de sol de la ferme florale ont
été dissous dans 10 ml de
eau déminéralisée distillée et le mélange ensuite
inoculé avec
milieux de croissance nutritifs. Pour l'isolement de
P. aeruginosa, 20 ml de glycérol
et 10 g de Tryptone ont été mélangés avec du milieu
MSM et dissous dans
1000 ml d'eau distillée. Une boucle de la suspension
bactérienne résultante
a été strié sur des plaques d'asparagine contenant
1,5% d'agar. Environ 1 g de
du phosphore a également été ajouté pour favoriser la
production de pyocyanine qui est
unique à Pseudomonas aeruginosa et a été noté comme
bleu-vert
pigment soluble dans l'eau qui confère une couleur
verdâtre au support. E.
coli et B. subtilis ont été isolés en inoculant des
échantillons de sol avec LB
milieux de croissance mélangés avec 10 g de tryptone,
5 g d'extrait de levure et 10 g
NaCl en suspension dans 1 Lt d'eau distillée tandis
que R. erythropolis était
isolé en inoculant des échantillons de sol avec des
milieux nutritifs MSM. Deux
la sous-culture a été effectuée en ajoutant du 1-
chloorobutane comme source de carbone.
Les échantillons ont été incubés pendant 48 heures à
37 ° C sous agitation vigoureuse
à 200 tr / min pour assurer l'aération des bactéries.
Les bactéries étaient alors
transféré dans des assiettes d'asparagines fraîches.
Petite quantité de Dapsome
un fongicide a été ajouté pour inhiber la croissance
des champignons.
Tests d'identification d'espèces bactériennes isolées
Identification des bactéries tolérantes aux pesticides
isolées de la fleur
les échantillons de sol de la ferme étaient basés sur
des
caractérisation biochimique selon le Manuel de Bergey
de
Bactériologie systématique [8] avec quelques
modifications. Après 24 heures de
incubation, les plaques ont été étudiées pour les
colonies de microbes cultivés sur
les média. Les microorganismes cultivés sur gélose
MacConkey sont capables de
métabolisant le lactose qui produit des sous-produits
acides qui abaissent la
pH du milieu qui fait passer l'indicateur rouge neutre
au rouge,
et si suffisamment d'acide est produit, une zone de
précipitation de la bile se développe
autour de la colonie [9]. L'activité de la catalase a
été déterminée par le
présence de bulles dans une solution à 3% H2O2 [9,10].
L'activité oxydase était
analysé par oxydation de 1% d'oxalate de p-
aminodiméthylaniline. La motilité
a été déterminée avec un microscope optique en
utilisant la goutte suspendue
technique. L'hydrolyse de l'amidon a été analysée
comme décrit par Cowan et
Manuel de l’acier pour l’identification des bactéries
médicales
Paramètres physico-chimiques des échantillons de sol
de ferme
Les paramètres physiques et chimiques des échantillons
de sol sont déterminés comme
une indication si les conditions environnementales des
échantillons de sol sont
favorable à la biorestauration des résidus de
pesticides xénobiotiques. le
les paramètres physico-chimiques déterminés étaient la
température (° C) du
échantillons de sol de ferme, demande biologique en
oxygène (DBO), produit chimique
Demande en oxygène (DCO), O2 dissous, ions
inorganiques (PO43-, NO3-, K+, Mg2+) et le carbone
organique.
Réactifs chimiques standard
Dans la préparation de la solution mère, 0,25 g de
l'organochlorure normes de pesticides (aldrine,
dieldrine et endosulfan) et normes de pesticides
organophosphorés (diméthoate, malathion et parathion)
ont été achetés auprès d'Ultra Scientific (Analytical
Normes). Ils ont été pesés dans des fioles jaugées de
250 ml et
dissous à la marque avec du méthanol pour faire une
solution mère standard
de 1000 ppm. Des dilutions en série ont ensuite été
effectuées pour obtenir 10 ppm, 20
ppm, 40 ppm, 60 ppm, 80 ppm et 100 ppm. Les trente six
(36)
Les solutions étalons préparées ont ensuite été
conservées au réfrigérateur à 4 ° C.
Extraction de résidus de pesticides à partir
d'échantillons de sol de ferme
Les échantillons de sol ont été extraits en triple à
l'aide d'un bulbe tassé dans le sol
colonne. 5 g de chaque échantillon ont été pesés dans
un bocal en verre et fortifiés à
cette étape, avant d'ajouter 10 g de sulfate de sodium
anhydraté granulaire
(Na2SO4) pour absorber l'humidité. Les mélanges
d'échantillons ont été manuellement
agité pendant 30 secondes, placé sur un rouleau
pendant 30 secondes, puis
laisser reposer pendant 20 minutes pour laisser le
temps au sulfate de sodium
pour absorber toute humidité résiduelle du sol. Les
mélanges d'échantillons
ont ensuite été transférés dans une colonne à bulbe de
250 ml et le pot d'échantillon a été
rincé trois fois avec de petites quantités de 5 ml
d'hexane et transféré dans
la colonne à bulbe. La teneur en sol a été extraite
avec de l'acétone: hexane
(1: 1 v / v, 250 ml) et l'éluat recueilli et concentré
à 100 ml
utilisant un évaporateur rotatif. L'éluat de sol
concentré a été lavé par
séparation liquide-liquide avec du sulfate de sodium
saturé (25 ml) et
eau distillée (300 ml) dans un entonnoir séparateur
(500 ml). Après avoir secoué,
la couche aqueuse a été drainée dans un bêcher et le
produit non aqueux
l'hexane a été transféré dans un entonnoir séparateur
(250 ml). L'aqueux
la couche a été renvoyée dans l'entonnoir de
séparation de 500 ml et ré-extraite
avec 15% de dichlorométhane dans l'hexane (40 ml). La
couche organique était
combinés dans l'entonnoir de séparation de 250 ml et
lavés doucement avec
eau distillée (100 ml) pendant environ 30 secondes.
Après avoir jeté le
couche aqueuse, la couche organique a été filtrée sur
sulfate de sodium,
évaporé à presque siccité sur un évaporateur rotatif,
puis sur les côtés du
ballon rincé avec de l'hexane (20 ml) et évaporé à
environ 1 ml. le
la procédure d'extraction a été effectuée en triple
pour chacune des serres
échantillons de sol. L'extrait
d'échantillon a été transféré
quantitativement dans un
tube à centrifuger, concentré sur un
évaporateur d'azote à 0,5 ml et
préparé pour l'étape de nettoyage de
la silice
Nettoyage des extraits de sol
Le processus de nettoyage du gel de
silice pour les extraits de sol a
été réalisé
par les méthodes décrites par
Frimpong et al. [11]. 1 g de gel de
silice qui
a été préalablement activé à 110 ° C
pendant 8 heures a été soigneusement
emballé dans
Colonne de 10 ml de cartouche en
polypropylène et 5 ml de solution
d'acétonitrile
a été utilisé pour conditionner la
cartouche. Les extraits concentrés
étaient
puis chargé sur la colonne et un
ballon en forme de poire de 50 ml a
été placé
sous la colonne pour recueillir
l'éluat. 10 ml d'acétonitrile ont
ensuite été
utilisé pour éluer la colonne et le
filtrat total collecté, concentré
à sec à l'aide d'un évaporateur
rotatif réglé à 37 ° C. Les résidus
ont été redissous dans 1 ml de
methanol et dilués à 2,0 ml de
volume final dans hexane avant
l'analyse par chromatographie
liquide haute performance (HPLC)

Identification et quantification des

extraits de pesticides
L'analyse qualitative a été réalisée
dans le cadre d'un processus en deux
étapes de
analyse et dépistage général
inconnu. Dans un premier temps,
ciblé
une analyse des normes de pesticides
a été effectuée pour trois
les pesticides organochlorés, c'est-
à-dire l'aldrine, la dieldrine et
l'endosulfan; et
trois pesticides organophosphorés,
c'est-à-dire le diméthoate, le
malathion et
parathion. Dans un deuxième temps,
des extraits de pesticides du sol de
la ferme ont été injectés
dans la HPLC et les pics de
chromatogramme des échantillons
comparés
aux pics du chromatogramme standard
des pesticides. Temps de rétention,
isotopique
la correspondance de modèle, la
recherche de fragment et la
recherche de bibliothèque ont été
utilisées comme
critères de confirmation pour la
recherche ciblée. En analyse
quantitative,
la concentration connue de chaque
norme de pesticide a été préparée
par série
dilution pour obtenir la
concentration finale de 1 ppm. Par
la suite 20 μL de
chaque norme de pesticide a été
injectée dans HPLC et l'absorbance
mesuré. Les mesures ont ensuite été
utilisées pour calibrer la HPLC
instrument de sorte que la
concentration des échantillons de
sol puisse être lue directement à
partir de l'instrument HPLC. Cela a
donné la concentration de la
résidus de pesticides dans chaque
échantillon de sol analysé. 20 μL de
chaque pesticide
les extraits ont ensuite été
injectés en HPLC et l'absorbance
mesurée.
Les mesures ont été effectuées en
triple pour chaque sol de serre
échantillons. La concentration
moyenne de chaque résidu de
pesticide dans chaque
serre a ensuite été tabulée et par
la suite la concentration moyenne
de chaque résidu de pesticide dans
chaque ferme de fleurs calculé.
Détermination de la biorestauration
des résidus de pesticides par
espèces bactériennes
La culture mère de chaque isolat
bactérien a été cultivée dans un
nutriment
moyen pendant 48 heures à mi-phase
logarithmique de croissance. Chaque
pesticide était
ajouté à un Erlenmeyer pré-stérilisé
de 100 ml à la concentration de
50 μg / ml dans l'acétone. Après
évaporation de l'acétone, 50 ml de
MSM ont été
placés dans des flacons Erlenmeyer
de 100 ml et les flacons ont été
agités pendant deux
les heures. Le milieu a été inoculé
avec une suspension des cellules de
P.
aeruginosa, E. coli, R. erythropolis
et B. subtilis cultivés sur
médias pendant 48 heures. La
biorestauration des résidus de
pesticides dans le sol a été
menée en sol non stérilisé afin
d'étudier l'interaction de ces
espèces bactériennes avec des
amendements organiques, avec
l'endogène
communauté microbienne sur la
biodégradation des sols appliqués
avec
pesticides xénobiotiques comme cela
se produit sur le terrain. Six
ensembles de cinq sols
chacun des sous-échantillons a été
inoculé avec des espèces
bactériennes isolées. le
le cinquième sous-échantillon n'a
pas été inoculé pour servir de
témoin. Chaque échantillon
a été enrichi avec une norme de
pesticide différente. Le sixième
échantillon était
enrichi avec toutes les normes de
pesticides pour servir d'échantillon
de mélange. Tout
les échantillons de sol ont été
incubés à 28 ± 2 ° C et sous
secouer pour fournir une condition
aérobie. Résidus de pesticides
provenant de
des échantillons de sol incubés et
non incubés ont été extraits 2
jours, 10 jours,
15 jours et 21 jours après les
périodes d'incubation. Les
échantillons de sol ont été
extraites et nettoyées selon la
méthode de Krause et al. [12].
Ils ont ensuite été agités
mécaniquement avec 50 ml d'acétone-
eau (3: 1)
pendant une heure dans un flacon en
verre de 500 ml. L'extrait a été
filtré
à travers un tampon de coton propre,
puis 50 ml de filtrat ont été
concentrés
en utilisant un évaporateur rotatif
sur bain-marie à 40 ° C pour
éliminer l'acétone
puis extrait deux fois avec 50 ml de
chloroforme. Le combiné
l'extrait de chloroforme a été séché
en utilisant du sulfate de sodium
anhydre puis
évaporé à sec à 40 ° C à l'aide d'un
évaporateur rotatif avant HPLC
détermination de l'analyse
qualitative et quantitative de
produits de bioremédiation.
analyses statistiques
La biodégradation des résidus de
pesticides par les espèces
bactériennes a été
évalué en comparant les différences
de concentration de résidus de
pesticides
entre les traitements, chacun
composé de 3 répétitions. Toutes les
données étaient
analysé par des analyses de variance
(ANOVA), en utilisant SPSS 16.0
statistique
logiciel (SPSS Inc., États-Unis) et
système d'analyse statistique (SAS)
la version 9.4. Des comparaisons par
paires de moyennes ont été utilisées
pour calculer
Valeurs de différence les moins
significatives de Fisher (LSD, P =
0,05)