Institut de Chimie des

LES BIOFILMS …
Surfaces et Interfaces
UPR CNRS 9069

15 rue J.Starcky BP2488

Interactions 68057 Mulhouse cedex

Système bactérien - Surface des (bio)matériaux

formation des biofilms

Facteurs d’influence :
- caractéristiques de la surface
- conditions de culture
- molécules bioactives
(inhibitrices) Lydie PLOUX
1
– Le Mans – 20/03/2007 -
PLAN
¾ Les biofilms bactériens : définitions et enjeux

¾ Devenir d’un (bio)matériau

• Le film de conditionnement : exemple de l’adsorption de
protéines
• Approche physico-chimique de l’adsorption de virus et des
adhésions cellulaires primaires
• Interactions bactérie – surface et biofilm - surface
• Interactions ostéoblastes – surface
• Influence du film de conditionnement …

¾ Conclusions

2
– Le Mans – 20/03/2007 -
LE BIOFILM Biofilm mixte (cocci et
batônnets)
BACTERIEN sur la surface d’une
plante

dans la nature …

© Gordon McFeters, author

Biofilm d’un
écosystème aquatique
alpin
Canalisation d’eaux usées

Photo by John Lennox

Biofilm dans une flaque d’eau

3
– Le Mans – 20/03/2007 -
 Bactéries

Matrice de
polymère
extracellulaire
+ Substances et débris divers Matériau

PHASE LIQUIDE

- Structure hétérogène
- Nombreux paramètres COLONIES CELLULAIRES «BANDEROLES»

environnementaux VIDE

- Système dynamique (temps,

espace)
CANAUX

Zones plutôt denses Parties en cours de

détachement
4
– Le Mans – 12/09/2006 - Des pores et des canaux
Avantages pour les bactéries …
• protection contre les
antibiotiques et les
nettoyants chimiques

• protection contre des

conditions de vie
défavorables (hautes
températures, lumières,
séchage, …)

• protection contre les actions de nettoyage mécaniques

• réservoir de bactéries viables (possibilité de re-contamination

bactérienne)

5
– Le Mans – 20/03/2007 -
Les problèmes posés

Milieu / Environnement
- Contamination bactérienne
- Contamination chimique (toxine par exemple)

Support
- Corrosion (métaux)
- Colmatage (filtres)
- Dégradations diverses (coating)

6
– Le Mans – 20/03/2007 -
 Biofilm sur la

dans le domaine biomédical …

peau

+
Biofilm sur un
cathéter
Plaque
dentaire
-
- Biofilm sur une
prothèse

-
+ Biofilm dans
l‘intestin 7
– Le Mans – 20/03/2007 -
Un exemple … Homme, 56 ans, endocardite associée à un pacemaker

Fièvre (39,2°), vomissements

Douleurs cardiaques
S. aureus dans prélèv. sanguins

Cloxacilline : 12 g / jour, intraveineux, 4 semaines

Perte des symptômes

7 jours
Fièvre, vomissements
Transpiration abondante
S. aureus dans prélèv. sanguins
Cloxacilline : 12 g / jour, intraveineux, 6 semaines
Rifampicine : 600 mg / jour, oral, 6 semaines
Perte des symptômes
9 jours

Fièvre, vomissements
Transpiration
S. aureus dans prélèv. sanguins
Retrait du pacemaker, recouvert de S. aureus
Cloxacilline : 12 g / jour, intraveineux, 4 semaines
8
Guérison P.Lejeune – Le Mans – 20/03/2007 -
Devenir d’un (bio)matériau …

virus cellules
bactéries
eucaryotes
macromolécules

Propriétés du matériau
Chimie, Topographie, Récepteurs spécifiques, …

9
– Le Mans – 20/03/2007 -
A différentes échelles …

Virus (50 à 100 nm)

Protéine ~ 3 nm
Bactérie (2 µm)

G.Bourbonnais « http://ici.cegep-ste-
foy.qc.ca/profs/gbourbonnais »

… et avec différents atouts … 10

– Le Mans – 20/03/2007 -
 Compétition entre les différents objets

macromolécule
bactérie
cellule
virus Matériau

Film de
conditionnement Matériau

11
– Le Mans – 20/03/2007 -
Film de conditionnement

Molécules présentes dans le milieu

métaux Fe, Mg, …

minéraux

12
– Le Mans – 20/03/2007 -
Film de conditionnement

Molécules présentes dans le milieu

métaux
Albumine
minéraux
Fibronectine
protéines
Fibrinogène
Sérum complet
… autres protéines du sang ou des tissus

13
– Le Mans – 20/03/2007 -
Film de conditionnement

Molécules présentes dans le milieu

métaux
minéraux
Biosurfactants
protéines
(glycolipides ou lipopeptides)
rhamnolipid (Pseudomonas)
lipides surfactin (Bacillus)
serrawettin ( Serratia)

Produits métaboliques bactériens

14
– Le Mans – 20/03/2007 -
Film de conditionnement

Molécules présentes dans le milieu

métaux
minéraux

protéines

lipides
Exopolysaccharides
sucres bactériens

Produits métaboliques bactériens

15
– Le Mans – 20/03/2007 -
Film de conditionnement : les facteurs d’influence

- nature de la molécule (masse, composition élémentaire,

fonctions chimiques, conformation) et du matériau (charge,
hydrophobicité)

Interactions électrostatiques,
Interactions van der Waals,
Interactions hydrophobes

¾ quantité adsorbée
¾ réversibilité
¾ conformation
(dénaturation)

- présence de plusieurs molécules

¾ compétition pour l’adsorption
¾ déplacement de molécules adsorbées
16
– Le Mans – 20/03/2007 -
Film de conditionnement : exemple
Self-assembled monolayers (SAMs)

1) homogènes :
¾ Fibronectine (Fn) et Albumine (Alb) : conformation différente
selon la nature de la surface.
Hydrophobic CH3 Hydrophilic NH2

Conditions expérimentales:
- Fn = 2µg/mL
- Alb = 20µg/mL Fn
- Durée de l’adsorption = 2h
- Séchage = flux de N2

Observation par AFM:

¾ Structure arborescente
sur surfaces hydrophobes Alb
¾ Structure globulaire
sur surfaces hydrophiles

17
S.Fleith, thèse (2005) Contraste de phase(5x5)µm – Le Mans – 20/03/2007 -
 2) Hétérogènes :

CH3 1’ NH2 CH3 1’ NH2 gas + Fn

+ Fibrinogène (Fn)

AFM topographic image (5x5)µm

¾ Conformation arborescente sur CH3

¾ Mélange de conformations globulaire
et arborescente sur NH2

18
S.Fleith, thèse (2005) – Le Mans – 20/03/2007 -
Adsorption et première phase de l’adhésion

Matériau

19
– Le Mans – 20/03/2007 -
Adsorption et première phase de l’adhésion

Matériau

20
– Le Mans – 20/03/2007 -
Adsorption et première phase de l’adhésion

Matériau

Théories DLVO
(Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek)

DLVO : interactions électrostatiques +

interactions Van der Waals
DLVO étendue : + interactions
hydrophobes
DLVO étendue + effets stériques
21
– Le Mans – 20/03/2007 -
Application de DLVO à l’adhésion bactérienne
DLVO étendue + effets stériques
Ong Langmuir (1999) Lipopolysaccharide
(LPS)

22
Membrane d’une bactérie Gram négative – Le Mans – 20/03/2007 -
 Étude par AFM
des
interactions
bactéries-
surface

Accord
qualitatif
Accord
quantitatif
Ong, Langmuir (1999)

23
– Le Mans – 20/03/2007 -
… dégager des tendances
VIRUS
Adhésion-agrégation

Floyd 1977 Images MEB

Sharp 1975 24
– Le Mans – 20/03/2007 -
 L’adhésion-agrégation virale dépend

Du sérotype viral Gerba 1984, Lytle 1995, Dowd 1998

- la charge de surface (point isoélectrique)
- la présence d’un coating de surface (polypeptides)

De la surface Gerba 1984, Voorhuizen 2001, Gassiloud 2005

- la charge de surface
- l’hydrophobicité

25
– Le Mans – 20/03/2007 - Gerba 1984
Du milieu Gerba 1984, Lukasik 2000, Zhuang 2003
- pH
- la force ionique
- la nature des ions présents

Gerba 1984 26
– Le Mans – 20/03/2007 -
L’adhésion-agrégation virale est

¾ Réversible Lytle 1995, Loveland 1996

¾ Médiée par les protéines adsorbées Lipson 1984
¾ Favorable à la survie virale Floyd 1977, Gerba 1984,
Gassiloud 2005
¾ Facteur d’inactivation virale Gassiloud 2005

L’adhésion-agrégation virale est

¾ surtout étudiée pour les applications dans le domaine de la

contamination des eaux rétention/inactivation
¾ utilisée pour caractériser les propriétés « barrière » des
matériaux
27
– Le Mans – 20/03/2007 -
 BACTERIES

G.Bourbonnais « http://ici.cegep-
P.Lejeune ste-foy.qc.ca/profs/gbourbonnais
28 »
– Le Mans – 20/03/2007 -
Les étapes de la formation du biofilm

Maturation et
détachement

SURFACE 1 2
Colonisation Colonisation
primaire secondaire

29
– Le Mans – 20/03/2007 -
Variations inter-bactéries dues à …

¾ la composition de la membrane bactérienne (présence de LPS)

¾ la présence de flagelle(s)

• permettent les mouvements « contrôlés » des bactéries

(transport vers la surface)
• permettent de « dépasser » les forces répulsives
(adhésion primaire)
• jouent peut-être un rôle d’adhésine
(interactions spécifiques) 30
– Le Mans – 20/03/2007 -
¾ la présence d’organelles d’adhésion - Plus courts, plus fins et
plus nombreux que les
flagelles
- protéine polymérisée
Curli
Flagelles, fimbriae,
pili favorisent la
formation du biofilm,
en particulier dans la
phase initiale
Prigent-
Combaret
(2000)

?
Interactions à faible
distance : liaisons
hydrogènes et liaisons
covalentes

31
P.Lejeune
– Le Mans – 20/03/2007 -
Attachement irréversible,
consolidation

32
– Le Mans – 20/03/2007 -
Les étapes de la formation du biofilm

Maturation et
détachement

SURFACE 1 2
Colonisation Colonisation
primaire secondaire

33
– Le Mans – 20/03/2007 -
 Création de colonies bactériennes …

Curli

¾ Prolifération
¾ Regroupement des bactéries en colonies (twitching)
et migration des colonies (swarming)

Lejeune, Bioadh’05
34

P.Lejeune – Le Mans – 20/03/2007 -

 Synthèse des EPS
(acide colanique pour Escherichia coli)

EPS

35
P.Lejeune – Le Mans – 20/03/2007 -
Bactéries
- Présence d’organelles (flagelles, pili)
- Charge et hydrophobicité de la
membrane externe

Surface du matériau
- Chimie de surface
- Charge, énergie et hydrophobicité de la surface
- Topographie de la surface

Conditions environnementales
- pH, température, tension ionique
- présence de surfactant
- composition chimique 36
– Le Mans – 20/03/2007 -
Charges de surface

- point isoélectrique des bactéries : pH 2

⇒ charge négative à pH 7
mais : très variable selon les bactéries
Dankert 1986
et les conditions environnementales
Li 1999

- - - - - -- - - - - - --
-- - -- -
-- - - - -- - - -
attraction répulsion
+ + + + + + + + + + - - - - - - - - - -

Hogt 1986
Adhésion initiale Harkes 1991
Van der Mei 1992
Kiremitci-Gumustederelioglu 1996
Gottenbos 2001
37
Li 2004
– Le Mans – 20/03/2007 -
Gottenbos J Antimicr Chemoth 2001

1 heure 7 heures

Chargée + Chargée + Chargée +

Chargée - Chargée - Chargée -

P.aeruginosa E.coli

Temps d’incubation Roberts 2004

Modèle bactérien
Milieu de culture

++ ++
++
Li Int J Food Microb 1999 Li 2004 - - - - - --
-- -
+ +
-- - - -
++ + +
+++
Tension ionique Adhésion initiale
+ -+ +- +- + -+ +- 38+- + -+
– Le Mans – 20/03/2007 -
Hydrophobicité et énergie de surface

• Surfaces hydrophobes : favorables à l’adhésion bactérienne

Tegoulia 2002
Katsikogianni 2004

règle Bactéries hydrophiles sur surfaces hydrophiles

Bactéries hydrophobes sur surfaces hydrophobes

An 1998
Bakker 2004

• Energie de surface faible surface antibactérienne

Tsibouklis 1999
Li 2004

39
– Le Mans – 20/03/2007 -
Topographie de la surface (rugosité)

- paramètre critique : Taylor 1998

0,5-1,0 µm
taille des bactéries Boyd 2002
1-3 µm
Sites protégés

E.coli sur silice :

lisse

E.coli sur silice :

poreux (1 à 2µm)

¾ Structures inférieures à la taille d’une bactérie ? 40

– Le Mans – 20/03/2007 -
 [1] Gjaltema 1997 [4] Bakker 2004

[2] Bos 1999 [5] Roberts 2004

[3] Li 1999 [6] Terada 2005

[1] [2] [3] [4] [5] [6]

Bactérie +
Charge de surface + - + +
Energie de surface
Hydrophobicité 0 + -
Rugosité + - - -

Milieu de Composition Autres

facteurs
+ effet majeur
culture chimique
(protéines) déterminants
si charge <0
- effet mineur
Composition
0 pas d’effet chimique Rugosité
41
– Le Mans – 20/03/2007 -
 Etude cinétique d’un biofilm formé sur des SAMs
hydrophobes et hydrophiles

Mouillabilité à l’eau (θe après stérilisation)

CH3 NH2

98,5° ± 3,5 54,0° ± 2,5

?
MATERIAU 1 2

Film de Colonisation Colonisation

conditionnement primaire secondaire

Adhésion bactérienne Maturation et détachement

Ploux (2007)
42
– Le Mans – 20/03/2007 -
 1,2E+08
NH2
1,0E+08
CH3 évolution cyclique

cells/cm2
8,0E+07
6,0E+07 =
4,0E+07
2,0E+07 maturation puis
0,0E+00 détachement
0 100 200 300 400
Culture duration (hours)

CH3 NH2

Biofilm

en milieu
confiné
CH3 NH2
PDMS
in milieu
aqueux

1 mm

Ploux (2007)
43
Haidara (2000) – Le Mans – 20/03/2007 -
 Modèle du processus de détachement :
deux voies, physique et biologique …

Détachement

Signal
Modification de la biologique Modification de la
morphologie du morphologie du
(bio)film (bio)film

= Signal Signal =
physique physique Modification de la
Modification des
conditions de vie cohésion du
physiologique
Caractéristiques de la surface (bio)film
MATERIAU

Ploux (2007)
44
– Le Mans – 20/03/2007 -
 CELLULES
EUCARYOTES

K.Anselme Image MEB

G.Bourbonnais « http://ici.cegep-ste-
foy.qc.ca/profs/gbourbonnais » 45
– Le Mans – 20/03/2007 -
 Cinétique de l’adhésion cellulaire
Phases

Forces de Van der Waals

Secondes Forces ioniques

Minutes Liaisons Intégrine-ligand

Augmentation de la zone de
contact, regroupement des
Heures récepteurs en cluster et
interactions avec le
cytosquelette

Synthèse de la matrice
Jours extracellulaire
46
K.Anselme – Le Mans – 20/03/2007 -
 cellule
adhérente

cellule
en cours
d’adhésion
cellules
en K.Anselme
division
47
– Le Mans – 20/03/2007 -
 L’adhésion cellulaire
Jonctions
Inter-
Cytosquelette Cellulaires
Noyau Actine
Expression
des gènes

Ca2+
Signalisation Na+
K+

Point focal
Intégrines

Matrice extracellulaire

MATERIAU
48
K.Anselme – Le Mans – 20/03/2007 -
Protéines membranaires
¾ Interactions cellule-matériau ou cellule-matrice
¾ Sites d’attachement des filaments d’actine

Figure 16-75
Molecular biology of the cell,
3rd Edition, B. Alberts et al.
49
– Le Mans – 20/03/2007 -
Les points focaux
Double marquage fluorescent : en
orange, les points focaux

Figure 19-10 Figure 17-42 de Molecular biology of the cell, 3rd

Edition, B. Alberts et al.
50
– Le Mans – 20/03/2007 -
Influence des caractéristiques physico-
chimiques de surface

¾ Topographie de la surface
- amplitude de la rugosité (nano- and micro-
topographie)
- organisation de la rugosité (isotrope/anisotrope)
- porosité (micro- and macro-porosité)

¾ Chimie de surface
- composition de la surface
- énergie de surface, hydrophilicité/hydrophobicité
51
– Le Mans – 20/03/2007 -
Amélioration de l‘adhérence
(modification de la porosité, de la texture, …)
Cellules osseuses sur des matériaux poreux ou à topologie structurée
Images MEB

K.Anselme
52
K.Anselme – Le Mans – 20/03/2007 -
 Influence de la chimie de surface
CH3 NH2 3’ CH3 1’ NH2
H (°) 15 +/- 4 17 +/- 2 22 +/- 4 22 +/- 10

53
S.Fleith, thèse (2005) – Le Mans – 20/03/2007 -
Influence du film de conditionnement : quelle surface ?

Réduction de l’energie
de surface

Hiérarchie des couches adsorbées: Eirich, Bolger et Michaels (1968)

54
– Le Mans – 20/03/2007 -
Influence du film de conditionnement
protéines Albumine Effet inhibiteur pour l’adhésion bactérienne
Fibrinogène Effet promoteur pour l’adhésion bactérienne

Fibronectine et Pluronic F68 (copolymère amphiphile) Dewez (1998)

Adsorption préférentielle des cellules sur les zones avec protéines

Polystyrène (PS)

PS-OX

Image ToF SIMS 55

Hépatocytes de rat
– Le Mans – 20/03/2007 -
Influence du film de conditionnement

biosurfactant Favorise la formation des colonies bactériennes

Souche mutante de Serratia liquefaciens défectueuse en biosurfactant

serrawettin

Plaques contenant de la
serrawettin
Gouttes d’eau contenant
de la serrawettin
0 0,5 0,8 1,0 2,0 40

Daniels (2004)

56
– Le Mans – 20/03/2007 -
 Conclusions

Aspects physico- Aspects

chimiques biologiques

Modèles biologiques
Surfaces (réelles ou modèles)
(macromolécules, cellules)
Conditions environnementales
(milieu de culture, film de
conditionnement) 57
– Le Mans – 20/03/2007 -
Conclusions
¾ identifier les caractéristiques des cellules (bactéries et cellules
eucaryotes) et de l’environnement
¾ tenir compte du facteur TEMPS (adhésion primaire, adhésion
long-terme)
¾ gérer la compétition entre « objets biologiques » (protéines,
cellules eucaryotes, bactéries)

… optimiser les biomatériaux

Remerciements
Fabienne Poncin-Epaillard
Karine Anselme
Arnaud Ponche 58
– Le Mans – 20/03/2007 -