Techniques Sciences Méthodes
astee-tsm.fr
Caractérisation de biofilms par spectrométrie
d’absorption infrarouge
 F. HUI1, G. P. HUSSON2, B. HOCHET1, G. REBOUTÉ1, J. LÉDION1
Mots-clés : spectrométrie infrarouge, aluminosilicates, biofilms, composés inorganiques
Keywords: infrared spectrometry, aluminosilicates, biofilms, inorganic compounds
Introduction
Les exigences de la réglementation concernant la
distribution des eaux destinées à la consommation
humaine ont conduit les distributeurs d’eau, ainsi que
les exploitants de circuits d’eaux à usage domestique
ou industriel, à s’intéresser de plus en plus à la
matière organique fixée sur les parois des matériaux
placés au contact de l’eau. Cette matière organique
est désignée dans le langage courant sous le vocable
« biofilm ».
Pour la plupart des auteurs, le biofilm est considéré
sous son aspect « organique ». Par exemple,
COSTERTON et coll. [1] définissent le biofilm
comme une « organisation structurée de micro-
organismes dans une matrice polysaccharidique et
protéique, protectrice et nutritive, adhérant à une
surface ».
Dans le cas le plus simple, ce biofilm serait composé de
cellules bactériennes et de leurs métabolites. Un tel bio-
film aurait généralement une structure très
poreuse (plus de 80 % d’eau) et comporterait également
une part importante de particules inorganiques piégées
dans des exopolymères. De plus, au sein d’un biofilm,
des organismes plus évolués comme des algues, des
protozoaires, cohabiteraient avec les bactéries…
Les matières inorganiques ne sont citées qu’en
passant, sans doute dans le souci d’être complet et de
ne rien oublier dans l’énumération, et cela pour bien
souligner la complexité du système. Cependant,
d’autres auteurs se sont tout de même intéressés aux
1 Arts et Métiers ParisTech – LIM-UMR CNRS 8006 – 151, boulevard de
l’Hôpital – 75013 Paris.
2 Université Paris Descartes – 4, avenue de l’Observatoire – 75006 Paris.
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relations minéraux/bactéries [2, 3]. Ces contributions
restent, malgré tout, peu nombreuses.
C’est pourquoi nous nous proposons de montrer
comment l’utilisation de la spectrométrie d’absorp-
tion infrarouge permet d’accéder, de manière relati-
vement simple, aux différents composés inorganiques
présents dans les biofilms.
La spectrométrie d’absorption infrarouge est une
méthode aujourd’hui très classique et largement
utilisée en routine par de nombreux laboratoires. Bien
qu’elle soit ancienne, elle a connu un regain d’intérêt
avec l’apparition d’appareils utilisant la transformée
de Fourier. Cependant, les applications se cantonnent
souvent à la chimie organique, alors qu’elle est
nettement sous-utilisée pour l’analyse des produits
inorganiques, même si certains pionniers, comme
LECOMTE [4], en avaient décrit, au milieu du siècle
dernier et dans le détail, l’intérêt pour les substances
aussi bien organiques qu’inorganiques.
De nos jours, l’obtention de spectres complets est
beaucoup plus rapide, fournissant des informations
sur l’hydratation des produits, les différentes matières
organiques et les divers types de composés inorga-
niques présents. Bien sûr, la méthode a aussi des
limites, mais elles ne sont généralement pas contrai-
gnantes pour l’étude de la fraction minérale des
biofilms.
1. Matériels et méthodes
1.1. Principaux avantages de la méthode
d’analyse
La spectrométrie infrarouge ne fait, elle, aucune dif-
férence entre composés organiques et inorganiques.
Elle voit seulement les mouvements (vibrations, par
 Caractérisation de biofilms par spectrométrie d’absorption infrarouge
exemple) des atomes, les uns par rapport aux autres.
Sur la figure 1, on voit l’aspect d’un spectre qui
montre à la fois de la matière organique et des pro-
duits minéraux. L’important est que les informations
concernant les divers types de composés se trouvent
être séparées, la fréquence dépendant de la masse des
atomes aussi bien que de la longueur des liaisons. Ces
informations peuvent être traitées indépendamment.
De manière générale, la masse des groupements
d’atomes, à l’origine d’une bande, augmente de
l’infrarouge proche à l’infrarouge lointain, c’est-à-dire
de λ = 2,5 μm à 50 μm en longueur d’onde, ou
encore, en prenant 1/λ, de 4 000 à 200 cm–1 en
nombre d’ondes (ν*).
Schématiquement, les groupements O-H sont les
premiers à apparaître entre 4 000 et 3 000 cm–1,
suivis des liaisons organiques (surtout entre 3 000 et
1 000 cm–1), puis les groupements CO3, SO4, SiO4,
de 1 550 à 600 cm–1, et enfin les oxydes et oxy-
hydroxydes métalliques entre 600 et 200 cm–1.
Par ailleurs, cette technique prend en compte la
symétrie des groupements d’atomes et de la maille
cristalline, ce qui permet de distinguer les variétés
allotropiques d’un même composé chimique. Par
exemple, le carbonate de calcium CaCO3 donne des
bandes d’absorption différentes selon qu’il est sous
une forme amorphe et très hydratée ou, plus classi-
quement, sous forme de calcite, d’aragonite ou de
vatérite.
Au-delà d’une approche qualitative, des mesures
quantitatives sont possibles. C’est pourquoi il est
intéressant de pouvoir mesurer les quantités de
matières prélevées. L’information se trouve inscrite
sur les documents sortant du spectromètre, mais il
faut savoir l’en extraire avec certitude. Le principe est
simple : après broyage de l’échantillon dans du
bromure de césium (transparent à l’infrarouge)
servant de dispersant, on comprime l’ensemble sous
forme d’une pastille dont l’aire présentée au spectro-
mètre est constante. Dans ces conditions, les absor-
bances sont additives et, pour un groupement donné,
l’absorbance A est proportionnelle à la masse m du
groupement présent dans la pastille. La pratique est
un peu plus complexe. Elle dépend notamment de la
qualité des spectres obtenus [5, 6].
1.2. Prélèvement et pastillage
Pour obtenir un spectre représentatif du biofilm
étudié, il est nécessaire de faire le prélèvement de
manière rigoureuse. La première opération consiste
à procéder à un lavage du biofilm à l’eau déminéra-
lisée, de manière à éliminer au maximum l’eau du
réseau qui l’imbibe et les « sels » qu’elle contient.
Un séchage modéré, par évaporation à la tempé-
rature ambiante (ou éventuellement à l’étuve
jusqu’à 60 °C maximum), suffit alors à éliminer
l’excès d’humidité sans dénaturer le produit à
analyser. La seconde opération est le prélèvement
proprement dit. Lorsque le biofilm est abondant, on
peut utiliser une technique de micro-abrasion à
l’aide de petits outils en acier inoxydable. S’il est
invisible à l’œil nu, on procède par contact : du
bromure de césium en poudre fine est frotté sur la
surface et se pollue par le biofilm. C’est ce bromure
enrichi en biofilm qui sera analysé.
On procède alors au pesage (en routine, une pesée de
10 à 100 μg) à l’aide d’une balance automatique au
microgramme. Le broyage doit être soigné, d’une
durée standardisée (10 minutes, par exemple). Il se
fait en présence de bromure de césium (23 ± 2 mg
pour une pastille de 5 mm de diamètre). Ce dernier
est indispensable pour obtenir des spectres dans
l’infrarouge lointain (jusqu’à 200 cm–1). L’opération
se fait dans un mini-mortier en alumine monocristal-
line (α-Al2O3), incolore, saphir ou rubis suivant la
couleur de l’échantillon. Après broyage, on procède
immédiatement au pastillage à l’aide d’un moule
approprié (5 ou 3 mm de diamètre) placé sous une
presse hydraulique.
1.3. Spectres infrarouges
Les pastilles sont analysées avec un spectromètre
Perkin-Elmer à transformée de Fourier, avec une
résolution de 4 ou 8 cm–1 en accumulant 120 spectres
(conditions de routine). Tous les spectres sont enre-
gistrés en mode absorbance, donnant ainsi une
échelle linéaire pour les mesures quantitatives.
L’appareil est équipé d’un système de réduction du
trajet optique dans l’air, afin de minimiser les pertur-
bations liées à l’air ambiant (humidité, CO2). La
figure 1 donne un exemple de spectre ainsi obtenu.
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 Étude
C : calcite ; SiO4 : aluminosilicates.
Figure 1. Spectre d’un biofilm (sans précaution particulière de
prélèvement)
Sur ce spectre, formé sur une surface en polyéthylène,
on observe bien l’eau résiduelle d’hydratation du
biofilm (O-H), les bandes (liaisons C-H, vers
2 950 cm–1) des matières organiques et les bandes
amide I et II des protéines, caractéristiques d’une
activité biologique, ainsi que la présence de miné-
raux : carbonate de calcium sous forme de calcite
(repérée C) et aluminosilicates (repérés SiO4).
1.4. Opérations complémentaires
Le dépouillement des spectres obtenus peut se heur-
ter à diverses difficultés lorsqu’il y a interférence entre
les bandes d’absorption de plusieurs produits. C’est
pourquoi on peut, après enregistrement du spectre,
rebroyer la pastille, puis la calciner à une tempéra-
ture appropriée. Cette calcination peut avoir pour
objet la transformation d’une substance, peu visible
en infrarouge (IR), en une autre qui absorbe avec plus
de netteté (par exemple, les sulfures qui peuvent être
transformés en sulfates), ou bien l’élimination des
matières organiques par calcination à 550 °C en
atmosphère oxydante.
Après calcination, on reconstitue une pastille qui est
passée dans les mêmes conditions dans le spectro-
mètre. La perte de substance, lors des transferts, est
limitée à 1 % si l’on prend soin de piéger les résidus
sur les parois (de la coupelle, par exemple), avec très
peu de CsBr (pur, broyé), en les ajoutant à la pastille.
On peut voir, sur la figure 2, le spectre du résidu
minéral du biofilm de la figure 1. On retrouve de l’eau
en faible quantité (eau atmosphérique reprise par
hygroscopie lors du pastillage), de la calcite (notée C),
ainsi que des aluminosilicates (notés SiO4).
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C : calcite ; SiO4 : aluminosilicates.
Figure 2. Spectre du biofilm de la figure 1, après calcination à
550 °C
1.5. Caractérisation des micro-organismes
De manière parallèle, des recherches systématiques
de la nature de la flore bactérienne de ces mêmes
biofilms ont été mises en œuvre. Le biofilm est décro-
ché par grattage, écouvillonnage ou passage dans une
cuve à ultrasons, d’une autre portion de tuyaux
(titane, caoutchouc, PVC, etc.), étudiés conjointe-
ment par spectrométrie IR. Ce prélèvement est ense-
mencé par inclusion en gélose nutritive (gélose PCA),
puis incubé à 36 °C ± 2 °C pendant 44 heures (± 4 h),
et à 22 °C (± 2 °C) pendant 68 heures (± 4 h), de
sorte que les micro-organismes revivifiables forment
des colonies dans et sur le milieu. Cette première
étape permet une estimation quantitative de la flore
et une comparaison des techniques de décrochage.
En même temps, dans le but d’identifier la flore, celle-
ci est récupérée à la surface d’une membrane
(0,45 μm) par filtration, puis cultivée sur une gélose
PCA 48 h à 36 °C. Elle est par la suite repiquée,
isolée, puis identifiée par une combinaison d’obser-
vations microscopiques et de tests biochimiques. Les
différents résultats des divers échantillons de tuyaux
sont comparés entre eux. Les résultats sur des
portions prélevées dans le temps du même tuyau sont
comparés de la même façon.
1.6. Eaux utilisées
Pour former des biofilms caractéristiques de circuits
d’eaux destinées à la consommation humaine, on a
choisi de travailler avec des eaux naturelles, utilisées
pour l’alimentation de Paris (d’origine souterraine,
aqueducs de la Vanne et du Loing, eau A) ou une eau
(B) d’origine superficielle (eau de Seine destinée à
 Caractérisation de biofilms par spectrométrie d’absorption infrarouge

minéraux. Les tubes sont immergés dans le bac, de

Eau A Eau B
Paramètres telle manière que l’on puisse former des biofilms
Eau souterraine Eau de surface

Tem pérature (°C ) 11,6 10,0 en eau quasi stagnante à l’extérieur des tubes, et des
C onductivité (μS /cm ) 506 448 biofilms en eau circulante à l’intérieur des tubes
pH 7,5 7,8 (figure 3).
Turbidité (NFU) 0,10 0,15 Les tubes utilisés, d’un diamètre d’un demi-pouce,
Dureté (degré F) 27,1 22,6
ont été choisis, lors d’essais préliminaires, en maté-
Titre alcalimétrique complet (degré F) 22,1 16,7
riaux divers : cuivre, acier inoxydable austénitique,
C alcium (m g/l) 106,4 85,0
titane, verre et bicouche polyéthylène/caoutchouc.
M agnésium (m g/l) 2,4 3,3
Par la suite, on a uniquement utilisé des tubes en
Sodium (mg/l) 6,9 10,0
P otassium (m g/l) 1,8 2,9
titane (pour avoir un matériau à la fois inerte en
Total (méq/l ) 5,86 5,03 matière de corrosion, mais aussi non nutritif et non
Hydrogénocarbonate (mg/l) 269,6 203,7 toxique pour les micro-organismes), et des tubes
S ulfate (m g/l) 21,0 29,0 bicouche polyéthylène/caoutchouc (pour disposer de
C hlorure (m g/l) 18,0 24,0 matériaux nutritifs). De cette manière, l’analyse n’est
Nitrate (mg/l) 32,0 24,0 gênée par des interférences avec les produits de cor-
Total (méq/l ) 5,88 5,01 rosion ou par un ralentissement des colonisations,
provoqué par l’effet, plus ou moins bactéricide, de
matériaux comme le cuivre et le verre.
Tableau I. Caractéristiques physico-chimiques moyennes des eaux étudiées

l’alimentation de Paris), dont les compositions types
sont données au tableau I.
Des biofilms ont été également produits, à partir
d’eaux résiduaires, ayant ces deux eaux comme
alimentation.
2. Résultats obtenus sur divers biofilms
Ces résultats sont relatifs à une campagne d’obten-
tion de biofilms, d’une durée de 35 jours. L’eau utili-
sée est l’eau B (eau de Seine). La température de l’es-
sai est la température ambiante, de l’ordre de 20 °C.

1.7. Dispositif pour la formation des biofilms 2.1. Biofilms observés sur divers matériaux
Quatre matériaux ont été utilisés : un matériau
Afin de disposer de biofilms formés dans des condi-
nutritif, le caoutchouc, deux matériaux réputés
tions hydrauliques identiques, on utilise, dans un bac
« inertes », le titane et le verre, et un matériau réputé
de 15 litres, un ensemble de quatre tubes de 10 cm
bactériostatique, le cuivre.
de long, montés en série, dans lesquels circule l’eau
en circuit semi-ouvert, avec appoint permanent et
purge pour éviter de concentrer cette eau en sels

C : calcite ; MO : matière organique ; SiO4 : aluminosilicates.

Figure 4. Spectres infrarouge, avant et après calcination, du
biofilm formé sur la paroi intérieure d’un tube de caoutchouc
Figure 3. Dispositif utilisé pour le développement de biofilms (eau en écoulement permanent)

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 Étude

Sur la figure 4, relative au biofilm formé à l’intérieur

du tube souple en caoutchouc, on observe les pics
d’absorption classiques des biofilms : matières orga-
niques révélées par les absorptions liées aux liaisons
C-H, ainsi que les bandes amide I et II (1 650 et
1 550 cm–1). On observe, en outre, de petites quan-
tités de calcite, ainsi que la présence d’aluminosi-
licates. Ces produits sont confirmés sur le spectre
obtenu après calcination. Il faut bien noter que,
malgré les apparences, les aluminosilicates sont en
bien plus grande quantité que le carbonate de
calcium. En effet, les carbonates absorbent beaucoup
plus que les silicates, à quantités molaires égales. Il
faut aussi remarquer que le biofilm, après un séchage
à 60 °C de 30 minutes, comporte encore beaucoup
d’eau.
Les spectres obtenus sur les parois internes des tubes
de verre borosilicaté sont reportés sur la figure 5. Le
biofilm correspondant est moins abondant. Cepen-
dant, les produits minéraux associés, calcite et
aluminosilicates, sont toujours présents. Comparati-
vement, la calcite est légèrement plus abondante, ce
qui peut être mis en rapport avec l’alcalinité superfi-
cielle du verre.
Lorsqu’on procède à l’analyse du biofilm formé sur la
paroi interne d’un tube en titane, donc non nutritif,
mais aussi non actif du point de vue chimique
ou électochimique, il est observé néanmoins que,
là aussi, le biofilm est hydraté et contient tous les
produits déjà présents sur les autres matériaux
(figure 6). De même, la quantité d’aluminosilicates
C : calcite ; MO : matière organique ; SiO4 : aluminosilicates.
Figure 5. Spectres infrarouge, avant et après calcination, du bio-
film formé sur la paroi intérieure d’un tube de verre borosilicaté
(eau en écoulement permanent)
C : calcite ; MO : matière organique ; SiO4 : aluminosilicates.
Figure 6. Spectres infrarouge, avant et après calcination, du bio-
film formé sur la paroi intérieure d’un tube de titane (eau en
écoulement permanent)
déposés est supérieure à la quantité de calcite. Cela
est parfaitement net sur le spectre obtenu après
calcination à 550 °C.
Sur la figure 6, ce sont les spectres relatifs au biofilm
formé sur la paroi interne de tubes en titane qui sont
représentés. L’écoulement étant toujours identique à
celui utilisé pour les autres tubes. Là encore, on peut
observer, pour ce matériau à la fois non nutritif et non
réactif du point de vue chimique ou électrochimique,
que le biofilm contient les mêmes produits que précé-
demment. L’hydratation moins abondante est sans
doute liée au fait que le biofilm se forme plus lente-
ment en l’absence d’un substrat nutritif, d’où l’analo-
gie avec le spectre obtenu sur le verre. La seule diffé-
rence se situe au niveau de la calcite, qui est en très
faible quantité, ce qui est logique puisque le matériau
n’apporte aucune alcalinité.
Enfin, l’analyse des produits formés sur la paroi
interne de tubes de cuivre a donné les spectres de la
figure 7. Le produit dominant est bien sûr un produit
de corrosion du cuivre, la malachite de formule
Cu2CO3(OH)2 (repérée M sur le spectre). Cette mala-
chite est très mal cristallisée, mais son identification
ne fait aucun doute. Les matières organiques sont peu
visibles, car elles sont masquées largement par la
bande énorme des O-H. De même, on ne peut pas se
prononcer sur la présence ou non des bandes amide I
ou amide II, qui sont occultées par les bandes de
malachite.
De plus, le cuivre ayant la réputation d’être bactério-
statique, il ne facilite pas la mise en place de biofilm.

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 Caractérisation de biofilms par spectrométrie d’absorption infrarouge

comme le verre ou les métaux, qui peuvent se corro-

C : calcite ; M : malachite ; MO : matière organique ; SiO4 : aluminosilicates.
Figure 7. Spectres infrarouge, avant et après calcination, du
« biofilm » formé sur la paroi intérieure d’un tube de cuivre (eau
en écoulement permanent)
Cela a été mis en évidence par d’autres méthodes
comme le dosage d’ATP. Par ailleurs, le rôle « anti-
tartre » du cuivre est bien vérifié : on ne note pas
la présence de calcite dans le « biofilm-produit de
corrosion ».
Mais, comme pour les autres matériaux, on retrouve
des aluminosilicates piégés dans le dépôt. Cela est
nettement visible sur le spectre obtenu après calcina-
tion, même si les silicates sont occultés dans l’infra-
rouge lointain par le CuO résultant de la transforma-
tion de la malachite.
2.2. Évolution des biofilms dans le temps
Les quatre exemples qui sont donnés, ci-dessus, mon-
trent que si l’on veut observer commodément des bio-
films, il faut éviter l’emploi de matériaux réactifs,
der, même modérément comme le cuivre. D’où le
choix qui a été fait d’utiliser des métaux à l’état passif,
tels que les aciers inoxydables ou le titane (tota-
lement inerte), couplés à du tuyau bicouche poly-
éthylène/caoutchouc, quasi inerte, mais nutritif pour
les micro-organismes. Une campagne d’essai, dont les
résultats ont donné plus d’une centaine de spectres à
exploiter, a permis de regarder les corrélations qui
peuvent exister entre les quantités des différents pro-
duits présents dans les biofilms.
Pour cela, on compare l’absorbance des substances à
évaluer, avec l’absorbance de l’eau résiduelle présente
dans le biofilm après séchage standard de 30 minutes
à 60 °C. Du fait que l’eau est considérée comme le
principal constituant des biofilms par la plupart des
auteurs [1-3], c’est cette eau résiduelle, faisant forcé-
ment partie de la constitution du biofilm, qui sert de
référence. Les résultats obtenus sont donnés dans les
tableaux II et III. On constate, en ce qui concerne les
divers matériaux utilisés, que c’est bien le caoutchouc
qui donne les biofilms les plus abondants, en ce sens
que c’est sur ces matériaux que l’on observe le plus
de matières organiques. Cela est confirmé par la pré-
sence la plus marquée de la bande amide I pour ce
matériau. L’observation visuelle va également dans
le même sens. La durée de constitution du biofilm,
35 ou 90 jours, ne semble pas influer sur le classe-
ment de ce matériau nutritif.
Après ces résultats préliminaires, une analyse plus
fine, mettant en jeu un plus grand nombre de me-

Rapport
Rapport Rapport Rapport d’absorbance
d’absorbance
d’absorbance d’absorbance Matières organiques/
Matières
Amide I/eau Aluminosilicates/eau aluminosilicates
organiques/eau

C aoutchouc 0,75 0,70 0,36 2,08

Matériau Titane 0,40 0,37 0,46 0,87
(35 jours) C uivre 0,16 0,21 0,20 0,80
V erre 0,43 0,43 0,21 2,05
C aoutchouc 0,45 0,63 0,27 1,67
Matériau Titane 0,33 0,30 0,12 2,75
(90 jours) C uivre 0,06 0,47 0,35 0,17
V erre 0,36 0,36 0,13 2,77
Tableau II. Recherche de corrélations entre les quantités de produits présents sur les tubes en titane, en verre, en cuivre, et sur les
tuyaux bicouche polyéthylène/caoutchouc, en écoulement et en eau stagnante

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 Étude

Rapport
Rapport
Rapport Rapport d’absorbance
d’absorbance
d’absorbance d’absorbance Matières
Matières
Amide I/eau Aluminosilicates/eau organiques/
organiques/eau
aluminosilicates

Titane (extérieur) 0,65 0,45 0,55 1,18

Matériau Titane (intérieur) 0,24 1,06 0,38 0,63
(35 jours) PE (extérieur) 0,76 0,54 0,34 2,23
Caoutchouc (intérieur) 0,76 0,61 0,38 2,00
Titane (extérieur) 0,32 0,25 0,11 2,91
Matériau Titane (intérieur) 0,35 0,36 0,13 2,70
(90 jours) PE (extérieur) 0,65 0,53 0,30 2,17
Caoutchouc (intérieur) 0,55 0,53 0,24 2,29
Tableau III. Recherche de corrélations entre les quantités de produits présents sur les tubes en titane, ainsi que sur les tuyaux bicouche
polyéthylène (PE)/caoutchouc, en écoulement ou en eau stagnante

sures, s’est portée sur les différences qui peuvent être
observées entre biofilms « intérieurs », formés dans
une eau en écoulement, et biofilms « extérieurs »,
formés dans la même eau quasi stagnante. Les résul-
tats sont reportés sur le tableau III.
Les valeurs mesurées des différentes absorbances
montrent une situation complexe. Cependant, quelle
que soit la durée des essais, les matériaux nutritifs,
polyéthylène et caoutchouc, restent bien ceux qui
favorisent le plus les biofilms. Les résultats ne sem-
blent pas influencés par la stagnation ou l’écoule-
ment. Pour le matériau inerte et non nutritif, en l’oc-
currence le titane, la durée et l’écoulement semblent
jouer un rôle, ce qui est logique puisqu’il faut que les
éléments nutritifs puissent, par diffusion, alimenter
les micro-organismes du biofilm, surtout en début de
formation. Néanmoins, ces matériaux permettent la
formation, sans difficulté, de biofilms qui peuvent
être relativement abondants.
À travers les exemples cités, on peut voir que la tech-
nique d’analyse par spectrométrie d’absorption infra-
rouge, sur des prélèvements de faible quantité, de
l’ordre de 100 μg, en utilisant des micro-pastilles de 3
ou 5 mm de diamètre, donne des spectres IR d’excel-
lente qualité qui permettent bien de caractériser toute
la complexité organique et inorganique des biofilms.
Par ailleurs, les analyses effectuées, après calcination,
ont prouvé sans conteste que les biofilms étudiés
contiennent toujours des produits minéraux qui sont
caractérisables (formule, cristallinité) et mesurables,
soit directement par une absorbance caractéristique,
soit en comparant les absorbances avant et après
calcination. Il est important de constater que, sur
environ 150 biofilms formés à partir d’eaux destinées
à la consommation humaine et analysées par nos
soins, on trouve toujours des quantités importantes
d’aluminosilicates. Or, ces eaux sont des eaux de
faible turbidité (inférieure en général à 0,2 NTU). On
peut donc penser qu’il existe une synergie entre
micro-organismes et particules colloïdales d’argiles
dans le développement des biofilms. Il faut alors
considérer que les substances minérales sont autre
chose que des « impuretés » piégées par le biofilm
lors de sa constitution. Au contraire, elles sont réel-
lement constitutives de ce biofilm. Dans le cas pré-
sent, nous avons déjà vu que les quantités des deux
composés majoritaires (organique et minéral) sont
souvent d’un ordre de grandeur comparable, comme
on avait déjà pu l’observer dans le cas de la filtration
des produits laitiers.
En effet, dans une étude plus ancienne, en associant
la spectrométrie infrarouge avec d’autres techniques
telles que la spectrométrie de photoélectrons X,
les auteurs avaient pu conclure à une interaction
protéines-phosphates-calcium [7], ce matériau mixte
(très variable suivant la nature de ces protéines) étant
susceptible de se fixer sur la zircone [8] ou d’autres
supports comme les aciers inoxydables [9]. Fonda-
mentalement, en effet, les protéines possèdent loca-

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 Caractérisation de biofilms par spectrométrie d’absorption infrarouge
lement dans leur structure des charges résiduelles à
plusieurs niveaux. Par exemple, des charges positives
sur les atomes de calcium disséminés sur un certain
nombre de sites, mais également des charges néga-
tives au niveau des groupements carboxylates. Elles
peuvent donc amorcer une fixation sur des supports
très divers, surtout si l’on s’éloigne de leur point
isoélectrique. Les ions calcium extérieurs viennent
de toute façon se complexer avec les protéines, les
carboxylates constituant des sites privilégiés (analo-
gie avec les carbonates, qui ont leur bande principale
dans la même région voisine de 1 400 cm–1). Les pre-
mières structures de ces matériaux mixtes sont
amorphes dans le cas des phosphates, et plus aisé-
ment visibles que les carbonates de calcium. Les
hydroxyapatites sont les composés thermodynami-
quement stables dans ces conditions, mais avec une
énergie d’activation plus élevée que pour CaCO3 ;
elles se forment au cours du temps ou sont activées
par élévation de la température. Il y a bel et bien, dans
ce cas, une synergie entre la formation de « dépôts »
et celle de biofilm. La rigidification de ces structures,
par un excès de composé inorganique cristallisé,
n’intervient pas dans les premières étapes et dépend,
notamment, des propriétés du composé inorganique
engagé.
Dans les biofilms formés en milieu aqueux, ce sont
sans doute les silicates, ou les aluminosilicates d’ori-
gine argileuse, qui jouent ce rôle de rigidification. Les
résultats obtenus sur plus d’une centaine de biofilms,
formés sur divers matériaux (verre, cuivre, aciers
inoxydables, PVC, caoutchouc) ont montré qu’avec
une alimentation à base d’eaux industrielles, de
rivière ou souterraine, on obtenait toujours des
aluminosilicates, quelle que soit la turbidité de l’eau
utilisée. Il semble bien que les développements bacté-
riens, révélés en infrarouge par les bandes amides I
et II, sont facilités par la présence de ces composés
d’origine argileuse. En retour, les développements
bactériens doivent contribuer au piégeage de ces
aluminosilicates. Cette hypothèse est confortée par
ce que l’on peut observer dans le domaine de l’assai-
nissement. Il est bien connu [10] que l’adjonction de
smectites colloïdales est utilisée pour améliorer le
fonctionnement des fosses septiques en assainisse-
ment individuel. Par ailleurs, on a pu montrer récem-
ment [11] que, dans les biofilms qui se forment au
départ des évacuations de lavabos, les aluminosili-
cates provenant des dentifrices sont l’élément structu-
rant essentiel.
Conclusion
L’analyse par spectrométrie infrarouge des biofilms
est une méthode simple, rapide à mettre en œuvre
(une demi-heure par spectre), à forte sensibilité,
donnant des informations qualitatives et quantitatives
concernant les composés, aussi bien organiques
qu’inorganiques, que ces derniers soient amorphes,
bien ou mal cristallisés (dans ce cas, on peut évaluer
un taux de cristallinité).
Dans des circuits alimentés en eaux destinées à la
consommation humaine, les caractérisations effec-
tuées ont bien confirmé, sur des tubes en écoulement
sans apport de contamination par des eaux de rivière,
que des biofilms pouvaient être formés dans des
temps raisonnables de quelques dizaines de jours.
Ces biofilms se forment sur toutes les surfaces
étudiées, mais, bien sûr, d’abord sur les matériaux
nutritifs comme le caoutchouc et le polyéthylène. Les
matériaux métalliques inertes peuvent, eux aussi, se
recouvrir facilement de biofilms.
En conséquence, on a jugé opportun d’associer ces
deux types de matériaux (inertes et nutritifs) pour
obtenir une caractérisation correcte des dépôts
obtenus. De cette manière, les produits de corrosion
n’interfèrent pas avec les produits qui proviennent
de l’activité biologique du biofilm. Cette activité bio-
logique n’induit pas seulement des produits orga-
niques, mais aussi des produits minéraux parmi les-
quels on retrouve toujours des aluminosilicates
amorphes, mais aussi, quelquefois, du carbonate de
calcium sous forme de calcite ou d’aragonite. Ainsi,
dans le cas de biofilms mélangés à des produits de
corrosion, les aluminosilicates pourraient servir de
marqueurs révélant la présence d’activité biologique
dans le processus de corrosion et d’encrassement.
Bien entendu, ces études doivent être couplées avec
les méthodes classiques de caractérisation des micro-
organismes présents.
TSM numéro 7/8 - 2010 - 105e année | 53
 Étude
Bibliographie
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Résumé
F. HUI, G. P. HUSSON, B. HOCHET, G. REBOUTÉ, J. LÉDION
Caractérisation de biofilms par spectrométrie d’absorption infrarouge
Les exigences de la réglementation européenne
concernant la distribution des eaux destinées à la
consommation humaine ont conduit les distribu-
teurs d’eau, comme les exploitants de circuits
d’eaux à usage domestique ou industriel, à s’inté-
resser de plus en plus à la matière organique fixée
sur les parois des matériaux placés au contact de
l’eau. Cette matière organique est placée dans le
langage courant sous le vocable « biofilm ».
Le biofilm est, la plupart du temps, considéré sous
son aspect « organique ». Il est défini comme une
« organisation structurée de micro-organismes,
dans une matrice polysaccharidique et protéique,
protectrice et nutritive, adhérant à une surface ».
Dans cette optique, le biofilm serait composé de
cellules bactériennes et de leurs métabolites. Il
aurait, en général, une structure très poreuse
(plus de 80 % d’eau) et comporterait également
une part plus ou moins importante de particules
inorganiques piégées dans des exopolymères. De
plus, au sein d’un biofilm, des organismes plus
évolués comme des algues, des protozoaires,
cohabiteraient avec les bactéries…
Les matières inorganiques ne sont citées que pour
mémoire. Cependant, quelques rares auteurs se
sont tout de même intéressés aux relations miné-
raux/bactéries. Ces contributions restent, malgré
tout, peu nombreuses. C’est pourquoi nous propo-
sons de montrer comment l’utilisation de la spec-
54 | TSM numéro 7/8 - 2010 - 105e année
Zahid Amjad (ed.), Calcium phosphates in biological and
industrial systems. Kluwer Academic Publishers, chapt.
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spectrométrie d’absorption infrarouge ». J.I.E., Poitiers
(23-25 sept. 2008, tome 2, pp 70 - 1 à10).
trométrie d’absorption infrarouge permet d’accé-
der, de manière relativement simple, aux diffé-
rents composés organiques ou inorganiques pré-
sents dans les biofilms.
Technique aujourd’hui très classique et largement
utilisée en routine par de nombreux laboratoires,
elle a connu un regain d’intérêt avec l’apparition
d’appareils utilisant la transformée de Fourier.
Cependant, les applications se cantonnent souvent
à la chimie organique, alors qu’elle est nettement
sous-utilisée pour l’analyse des produits inorga-
niques.
L’obtention de spectres complets est beaucoup
plus rapide, fournissant des informations sur l’hy-
dratation des produits, les différentes matières
organiques et les divers types de composés inor-
ganiques présents. Bien sûr, la méthode a aussi
des limites, mais elles ne sont généralement
pas contraignantes pour l’étude de la fraction
minérale des biofilms.
Cependant, le dépouillement des spectres obtenus
peut se heurter à des difficultés lorsqu’il y a inter-
férence entre les bandes d’absorption de plu-
sieurs produits. C’est pourquoi on peut, après
enregistrement du spectre, rebroyer la pastille,
puis la calciner à une température appropriée.
Cette calcination peut avoir pour objet la transfor-
mation d’une substance, peu visible en infrarouge
(IR), en une autre qui absorbe avec plus de netteté
 Caractérisation de biofilms par spectrométrie d’absorption infrarouge
(par exemple les sulfures, qui peuvent être trans-
formés en sulfates), ou bien l’élimination des
matières organiques par calcination à 550 °C en
atmosphère oxydante. Après calcination, on
reconstitue une pastille qui est analysée dans les
mêmes conditions.
Les analyses effectuées avant et après calcination
sur une centaine de biofilms ont prouvé, sans
conteste, que tous les biofilms étudiés contenaient
bien des produits minéraux en quantités quelque-
fois très importantes. Ces produits minéraux sont
F. HUI, G. P. HUSSON, B. HOCHET, G. REBOUTÉ, J. LÉDION
Biofilms characterisation by infrared spectrometry
The requirements of the European regulations
concerning drinking water supply have led the
water treatment companies and the network opera-
tors to be more and more interested in the organic
matters fixed on the wall of materials in contact
with water. These organic matters are commonly
called “biofilms”.
For most researchers, biofilm is just considered
under its “organic” aspect. They define biofilm as
a “structured organism of micro-organisms in a
matrix of polysaccharides and proteins which are
protective and nutritive, adherent to a surface”.
In the simplest case, biofilm would be composed
of bacteria cells and their metabolites. Such a bio-
film would have generally a very porous structure
(more than 80% of water) and would also contain a
more or less important part of inorganic particles
trapped in the exopolymers. Moreover, within the
biofilm, more evolved organisms, such as algae
and protozoans would cohabit with the bacteria.
Inorganic matters are just mentioned by the way,
perhaps with the intention of giving an exhaustive
enumeration and in order to underline well the
complexity of the biofilm. Nevertheless, a few
researchers are interested in the relations bet-
ween minerals and bacteria in the biofilm. In spite
of all, their contribution remains scarce. That is
why we propose to show how the use of infrared
absorption spectrometry allows to characterise, in
a relatively simple way, the different inorganic
compounds found in biofilms.
The infrared absorption spectrometry is now a very
classical method, which is largely used by nume-
rous laboratories. Although it is an old method, it
has sparked renewed interest as the Fourier
Transformed mode was used. Nevertheless, it is
usually only implemented in the field of organic
compounds, and not in the analysis of inorganic
matters, even though some pioneers such
caractérisables (formule, cristallinité) et mesu-
rables, soit directement par une absorbance
caractéristique, soit en comparant les absor-
bances avant et après calcination. Il en résulte une
présence quasi générale d’aluminosilicates,
même dans les eaux de faible turbidité destinées à
la consommation humaine. Par ailleurs, lors d’une
étude sur la cinétique de formation de biofilm, on
peut coupler ces analyses avec la caractérisation
– par culture et/ou polymerase chain reaction (PCR) –,
au cours du temps, des micro-organismes se déve-
loppant dans le biofilm.
A b st ra c t
J. Lecomte, had described in details, in the middle
of the last century, the interest of the infrared
absorption spectrometry for both organic and inor-
ganic compounds.
Nowadays, it takes less time to obtain complete
spectrums and, in the process, one gets informa-
tion about the compounds hydration and the diffe-
rent types of organic and inorganic matters. Of
course, the method also shows its limits, but these
are not restrictive as far as the study of the mine-
ral fraction of the films is concerned.
However, the interpretation of the obtained spec-
tra can be difficult when there is interference
among absorption picks of several compounds.
This is why we usually regrind the pastille, after
saving the spectrum, then calcine the pastille at a
suitable temperature. This calcination can be
aimed at transforming a substance, which shows
poor absorbance in IR, into another one which
gives a strong absorbance (e.g. sulphide can be
transformed into sulphate). The recalcination can
be also used to eliminate organic matters at
550 °C. After the recalcination, a new pastille is
made and it is analysed in the same conditions.
The obtained results after the calcinations have
showed indisputably that the studied biofilms
contained indeed mineral matters which are by
far to be of a minority: on one of them, a propor-
tion of 43% of mineral matters has been obtained
after calcinations during 17 hours at 550 °C (the
biofilm having been dried previously during 1 h at
60 °C). In addition, these mineral matters can be
characterised and measured either directly by a
characteristic absorbance or by comparison of
absorbance before and after calcination. More-
over, during a study on the kinetics of biofilms
formation, we can combine these analyses with
the characterisation (by culture and/or PCR) of
micro-organisms developed in the biofilms.
TSM numéro 7/8 - 2010 - 105e année | 55
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