Florent Cours Microbiologie Du Pétrole L1 LMD 2022

UNIVERSITE PEDAGOGIQUE NATIONALE
FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
COURS DE MICROBIOLOGIE DU PETROLE

CT MUKEBA BIDUAYA Florent
M. SC en Biologie Moléculaire
Doctorant en Microbiologie
ANNEE ACADEMIQUE : 2021 - 2022

21/12/2022
Cours de Microbiologie par le CT Florent MUKEBA BIDUAYA
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PLAN DU COURS
I. INTRODUCTION A LA MICROBIOLOGIE
II. PHYSIOLOGIE ET ÉCOLOGIE MICROBIENNES
Cours de Microbiologie par le CT Florent MUKEBA BIDUAYA 21/12/2022

I. INTRODUCTION À LA MICROBIOLOGIE
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I.I. Définition
 Un micro-organisme ou microorganisme (du grec μικρός, mikrós, «
petit » et de ὀργανισμός, organismós, « organisme ») ou microbe
(du grec μικρός, mikrós, « petit » et βίος, bíos, « vie ») est un
organisme vivant, invisible à l'œil nu, qui ne peut être observé qu'à
l'aide d'un microscope.
 La microbiologie est une sous-discipline de la biologie consacrée à
l'étude des micro-organismes.
 Les micro-organismes constituent un groupe extrêmement
diversifié d'organismes microscopiques répartis dans les trois
domaines du vivant (eubactérie, archée et eucaryote).
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Illustration d'un mélange contenant des microorganismes (bactéries et virus de types différents).
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I. INTRODUCTION À LA MICROBIOLOGIE (2)
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I.I. Définition
 Ils se distinguent les uns des autres par leur forme, leur taille et
leur mode de vie.
 Les virus, incapables de se reproduire sans détourner la
machinerie cellulaire d'un autre organisme, ne sont pas
considérés par tous les spécialistes comme vivants.
 La microbiologie étudie parfois leurs actions sur les micro-
organismes mais n'a pas pour but de les étudier en tant
qu'entités. Cette étude est réalisée dans une autre discipline de
la biologie : la virologie.
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COVID-19
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Variole du singe Cours de Microbiologie par le CT Florent MUKEBA BIDUAYA Virus de Marburg
I.2. Organismes étudiés
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I.2.1. Procaryotes
Les procaryotes (Prokaryota ou Prokarya), du grec pro (avant) et

caryon (noyau), sont des organismes dont la cellule ne possède pas
de noyau cellulaire ni d'autres organites, ils appartiennent à au moins
deux taxons distincts :
 Les archéobactéries ou archées sont un groupe particulier, car il
ne comprend essentiellement que des espèces anaérobies
(n'ayant pas besoin d'oxygène, voire souvent ne tolérant pas
l'oxygène), vivant dans des environnements extrêmes : on parle
d'organisme extremophile.
 Les eubactéries dans notre quotidien (sol, nourriture...). Ce sont les
bactéries les plus connues. certaines sont aussi extremophiles
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10 I.2.2. Eucaryotes
Les eucaryotes ont un système membranaire interne enfermant des
organites (noyau, plaste, ...) ; ils présentent un cytosquelette interne
(actine, tubuline) absent chez les procaryotes, qui leur confère une
taille souvent plus importante que les procaryotes.
 chaque groupe d'eucaryotes a eu un ancêtre parmi les
procaryotes (archéobactéries ou eubactéries), et que les
mitochondries (et peut-être aussi d'autres organites comme les
chloroplastes) ont aussi eu au moins un ancêtre procaryote distinct
qui aurait colonisé cette ancienne bactérie pour vivre en symbiose
(endosymbiose) avec elle et former tous les eucaryotes qui ne
peuvent plus vivre sans elles.
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I.2.3. Champignon
Les champignons sont présents dans le sol, plantes, débris végétaux,
lichen, parasites de l'homme, des animaux et des plantes.
Remarque : une levure, eucaryote unicellulaire, est un champignon. Il
existe de nombreuses espèces de levures comme Saccharomyces
cerevisiae(levure de boulangerie), la famille des Candida
(responsables des candidoses), Rhodotorula (parfois retrouvée dans la
choucroute qu'elle colore en rouge), Schizosaccharomyces, etc.
Les champignons sont "absorbotrophes" : ils se nourrissent par
absorption. Ils sécrètent des enzymes qui digèrent des polymères dans
le milieu extérieur, ce mécanisme chimique transforme par exemple
les glucides en monomères (petites molécules) qui sont ainsi absorbés.
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16 I.2.4. Algues
Contrairement aux champignons et aux protozoaires, les algues

ont des pigments chlorophylliens leur permettant de réaliser la
photosynthèse.
Elles sont donc des organismes vivants immobiles et autotrophes.
Les algues sont présentes dans le sol, les plantes, l'eau douce et
l'eau de mer.

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Algues spirogyra sp Algues de Volvox

I. INTRODUCTION (3)
18 I.3. Taille des micro-organismes
I.3.1.Procaryotes (bactéries)
De l'ordre de 0,5 à 3 µm (pour la largeur), pas de limite en longueur

; le pouvoir séparateur de l'œil humain est de 100 µm (10-4 m soit
0.1 mm), ces micro-organismes sont donc tous invisibles à l'œil nu.

I.3. Taille des micro-organismes
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I.3.2. Eucaryotes
Très variable de 2 à 200 µm (pour la largeur), pas de limite en

longueur ; certains eucaryotes sont visibles à l'œil nu (notamment
les algues), d'autres ne sont visibles que sous forme d'agrégats (cas
des champignons, dont les parois plasmiques émettent des
filaments sur une grande longueur relativement à leur taille). Tous
les eucaryotes ne s'agrègent pas ainsi (notamment les
protozoaires, invisibles à l'œil nu)

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 Le rapport surface sur volume est directement influencé par la taille : si
l'on considère une forme simple telle que la sphère, la surface est
proportionnelle au carré de la taille (4πr² si r est le rayon de la sphère),
alors que le volume est proportionnel au cube de la taille (4/3πr³), le
rapport surface/volume est donc inversement proportionnel à r (3/r).
 Ceci conditionne la vitesse à laquelle le micro-organisme se nourrit : la
nourriture passe à travers la membrane plasmique, donc la vitesse
d'absorption est proportionnelle à la surface, mais la quantité à nourrir
est proportionnelle au volume. La vitesse à laquelle entrent et sortent les
nutriments et les déchets est donc inversement proportionnelle à la
taille. Donc plus la bactérie est petite, plus elle va pouvoir se nourrir à
grande vitesse. Elle compense sa petite taille par une multiplication à
très grande vitesse (taux de croissance très rapide).

I.4. Culture des micro-organismes
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I.4.1. Milieu de culture
Un milieu de culture est un support (préparation) qui permet la culture de

cellules, de bactéries, de levures, de moisissures afin de permettre leur
étude.
Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du micro-organisme étudié ce
qui implique :
• couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance, apporter
la source de carbone et d’énergie ;
• présenter un pH voisin du pH optimal ;
• présenter une force ionique optimale (le milieu peut être isotonique mais
ce n’est pas obligatoire).
Principaux ingrédients des milieux de cultures
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I.4.2. Richesse du milieu
Les micro-organismes ont besoin :

 D'une source d'énergie.
 Pour les chimiotrophes, elle provient de la dégradation de composés
chimiques (par exemple du glucose)
 Pour les phototrophes, de la lumière.
 D'une source de carbone
 Pour les autotrophes, il suffit de CO2 atmosphérique (carbone minéral).
 Pour les hétérotrophes, elle provient de molécules organiques (CH4, oses...)
 De macroéléments (Ainsi appelés en raison de leur concentration dans le milieu
de culture). C, H, O, N, S, Na, Mg, P, K (Les éléments carbone, azote, phosphore
doivent être présents aux proportions 100/10/1 pour un milieu correct).
25  De microéléments (Cu, Co, Zn, Cl, Fe...)
 D'une source d'azote (d'origine minérale (sel d'ammonium))
 De facteurs de croissance (Vitamines, acides aminés)
 De dioxygène ou oxygène moléculaire
Pour les aérobies strictes ou d'absence de dioxygène (ou oxygène
moléculaire) anaérobies stricts; pour ces micro-organismes,
le peroxyde d'oxygène (H2O2) formé par la réaction entre l'O2 et
l'H2O les empoisonnent, car ils ne possèdent pas une catalase
dégradant H2O2 à l'inverse des individus aérobies.
Il existe également des micro-organismes aérobies facultatifs capables
de se multiplier en présence ou en l'absence d'oxygène grâce à leur
capacité à utiliser la fermentation et des bactéries microaérophiles qui
ne se développent qu'à une certaine pression en dioxygène.
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I.4.3. Facteurs physico-chimiques
 Température, on distingue trois catégories de micro-organismes selon leur
optimum de croissance. Les psychrophiles ont leur optimum à 15 °C, les
mésophiles à 37 °C, les thermophiles à 65 °C.
Il faut descendre au-delà de -18 °C pour arrêter toute croissance
microbienne. À 3° C il y a peu de risques lié aux bactéries pathogènes
(mésophiles, donc virulentes à la température du corps) ou toxinogènes,
seules quelques bactéries vivant à ces températures peuvent être
dangereuses (Listeria).
 pH, on considère que les bactéries préfèrent la neutralité excepté pour les
bactéries lactiques. Pour les levures et moisissures, le pH optimum est plus
acide (pH=5).

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I.4.4. Diversité du milieu de culture

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Selon la composition chimique: Deux sortes de milieux de culture

 Empiriques : Les milieux complexes ou empiriques : De composition
complexe, mal définie, ils peuvent être :
• d'origine animale : lait, sérum, bouillon et gélose nutritive, gélatine,
etc….
• d’origine végétale : peptone de soja, pomme de terre, exemple de
milieux ; Gassner, Tryptycase, soja, gélose au chocolat, gélose au sang,
etc…..
Exemple : Bouillon nutritif pour bactéries
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Exemple : Bouillon nutritif pour bactéries
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 Les milieux synthétiques ou définis : dans lesquels tous les composants

sont connus qualitativement et quantitativement. Ces milieux sont surtout
utilisés pour l’étude des bactéries autotrophes (non exigeantes) ou pour
étudier les besoins nutritifs d’un germe. Ils sont rarement utilisés en routine
à l’exception de quelques-uns : Citrate de Simmons, Citrate de
Christensen, Urée-Tryptophane.
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33 Exemple : Milieu citrate de Simmons

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Selon l’utilisation : Deux sortes de milieux de culture
 Milieux de base : appelés aussi milieux usuels non sélectifs, on

regroupe sous ce vocable tous les milieux ne contenant aucune
molécule inhibitrice.
Ils sont en général de préparation assez simple et généralement peu
coûteuse, ces milieux contiennent une base nutritive constituée de
molécules azotées (acides aminés, molécules organiques diverses…)
provenant de l’hydrolyse de produit d’origine vivante (animale,
végétale, mycélienne) comme les peptones, les extraits de viande ou
de levure. Exemple : gélose et Bouillon nutritif, gélose et Bouillon Muller-
Hinton. 21/12/2022
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 Milieux d'isolement
Ce sont des milieux servant à séparer les bactéries contenues dans un
échantillon polymicrobien pour pouvoir à la suite les étudier séparément.
Ces milieux peuvent être :
a) Milieux d’enrichissement
C’est des milieux enrichis d’une substance biologique (sang frais, sérum,
jaune d’œuf… etc) ou de suppléments polyvitaminiques, favorisant la
croissance de certains germes que l’on désire isoler.
Exemple : la gélose au sang (milieu enrichi du sang pour les bactéries à
Gram positif tels Streptocoque)
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I.4.Culture des micro-organismes
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b) Milieux sélectifs
Des milieux contenant des agents sélectifs appelés inhibiteurs (sel,
colorant, antibiotique) ou de conditions de culture défavorables qui
empêche la culture des germes sauf celui qu’on étude.
Exemple : Gélose Chapman pour Gram+,
Gélose Mac Conkey (pour les Gram-)
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39 I.4. Culture des micro-organismes
c) Milieux différentiels
Des milieux facilitant la distinction entre un groupe particulier de microbes
recherchés et les autres présents sur le même milieu.
Exemple :
• Gélose au sang différencie entre les bactéries hémolytiques et non
hémolytiques
• Gélose MacConkey différencie entre les bactéries fermentant le
lactose et celles qui ne le fermentent pas.
• Gélose Chapman différencie entre les bactéries fermentant le mannitol
et celles qui ne le fermentent pas.
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La gélose Chapman ou MSA (de l'anglais

Mannitol Salt Agar) est un milieu de
culture sélectif et différentiel employé en
microbiologie pour la culture des
bactéries halophiles et halotolérantes

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La présence de Crystal violet et

de sels biliaires incorporés dans
l’agar MacConkey aide à inhiber
la croissance des bactéries Gram-
positives, ce qui en fait un milieu
sélectif, et des bactéries Gram-
négatives exigeantes, telles que
Neisseria et Pasteurel

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d) Milieux électifs
Un milieu électif est un milieu sur lequel on observe une culture abondante
et rapide de certaines bactéries alors que la plupart des autres espèces
s’y développent peu et lentement.
Exemple :
• Milieu de Loeffler au sérum coagulé (Croissance rapide des bacilles
diphtériques, les autres bactéries sont à croissance lente).
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44 I.4. Culture des micro-organismes
 Milieux d’identification
Ils permettent de mettre en évidence une ou plusieurs propriétés d’une
bactérie pour l’identifier : fermentation d’un sucre, production de gaz,
présence des enzymes.
Exemple : Gélose viande foie permet l’identification du type respiratoire
des bactéries.
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 Milieux de conservation
Ce sont des milieux pauvres qui maintiennent les microorganismes dans un
état de vie ralentie. Les milieux adoptés est la gélose inclinée, ou gélose
nutritive en culot.
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I.4.5.Stérilisation
La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes

d'un objet et ce, de manière durable. En microbiologie, le but de la
stérilisation est d'une part maîtriser les micro-organismes introduits dans le
milieu d'étude, et d'autre part éviter la contamination du milieu extérieur
et des personnes (voir aussi l'article sur l'hygiène).
Il existe trois façons pour stériliser un milieu de culture. Une destruction par
la chaleur, par une méthode de filtration ou par l'emploi de radiation et
d'agent chimique (gaz)
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a) Chaleur
On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».

Chaleur sèche :
Bec Bunsen : tout l'air qui se trouve dans un globe virtuel de 15 cm
de rayon de la flamme d'un bec Bunsen, est passé une fois dans la
flamme. Ceci crée une enceinte fictive stérile. Les microbiologistes
travaillent avec une flamme oxydante qui crépite.
Four Pasteur ou four Poupinel : C'est un four classique utilisé à 180 °C
pendant 90 minutes au minimum.
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Four Poupinel
Zone de stérilité d'un bec Bunsen

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a) Chaleur
Chaleur humide :
Autoclave : cette technique consiste à faire bouillir de l'eau dans
une enceinte close pour augmenter la pression et donc dépasser
les 100 °C d'ébullition (principe de l'autocuiseur). Ceci est réalisé à
134 °C pendant 18 minutes.
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b) Cas particuliers : la pasteurisation et tyndallisation
Pasteurisation :
C’est un procédé pour la conservation des aliments par lequel un aliment
est chauffé à une température définie pendant une période de temps
définie avant d'être refroidi rapidement.
Les températures de pasteurisation varient entre 70 °C et 85 °C. Cette
technique ne détruit qu'une partie de la flore bactérienne.
Ce n'est, en aucun cas, une technique de stérilisation
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Différence entre les techniques de pasteurisation HTST et UHT

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b) Cas particuliers : la pasteurisation et tyndallisation
Tyndallisation :
C’est une série de chauffages brefs à des températures de 70 °C à
intervalles réguliers (3 chauffages d'une heure, 24 h entre 2 chauffages),
ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les
tuer au chauffage suivant. Par exemple, la destruction des germes
pathogènes du lait se fait par un cycle de 63 °C pendant 30 minutes suivie
de 73 °C pendant 15 minutes.
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c) Filtration
C’est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre
dont les pores ont un diamètre de 0,2 µm ; les micro-organismes sont trop
gros pour passer et sont donc retenus par le filtre. Pour forcer ce liquide à
traverser le filtre on utilise deux solutions :
• mise en pression du liquide par l'intermédiaire d'un piston.
• aspiration du liquide en créant par exemple une enceinte dépressurisée
de l'autre côté du filtre.
Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles
(c'est-à-dire qui ne résistent pas à la chaleur) comme certains acides
aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance
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Filtration sur membrane

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Systèmes de filtration de terrain. A et B : filtration sous vide (ou par gravité si l'air n'est pas évacué du
dispositif) ; C : filtration sous vide à l'aide d'une seringue et d'un filtre à seringue (aspiration) ; D :
filtration sous pression à l'aide d'une seringue et d'un filtre à seringue (remplissage de la seringue à
l'aide d'un robinet à trois voies) ; E : système de filtration tangentielle
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c) Radiation et agent chimique

Elles sont très pénétrantes, car les radiations et certains gaz traversent le
plastique et tuent les micro-organismes.
Les rayons ultraviolets ne sont cependant pas une bonne technique de
stérilisation, car ils sont non pénétrants, donc ils ne passent pas au travers de
matériaux comme le plastique et le verre. De plus certains micro-
organismes sont capables de réparer les dommages infligés par les
ultraviolets si le produit est éclairé après application de rayons ultraviolets ;
c'est le phénomène dit "de photo-réparation".
On peut dans certains cas utiliser le rayonnement gamma, beaucoup plus
pénétrant et puissant que les ultraviolets.
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Stérilisation par ultraviolets

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I.4.6. Notion de culture pure
a) Technique des stries
Elle est basée sur la notion d'UFC (Unité Formant une Colonie). Chaque unité
cellulaire (une cellule, un groupe de cellules ou un morceau d'hyphe) va
donner une colonie.
Sur un milieu de culture, il y a formation d'un monticule de bactéries ou de
levures avec une forme particulière (la colonie). La forme de ce monticule
est déterminée par l'organisation de la colonie, qui elle-même est
déterminée génétiquement. Les champignons vont, eux, développer un
thalle c'est-à-dire ce que l'on peut par exemple observer sur les confitures
ayant "moisi". L'UFC est utilisée aussi pour le dénombrement bactérien en
utilisant des cultures sur boîte à partir de tubes préparés par dilutions en
cascades de la suspension bactérienne mère.
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I.4.6. Notion de culture pure
b) Technique de suspension dilution
Cette technique sert à évaluer le nombre de microorganismes qui se

trouvent dans un milieu liquide (eau de puits, boissons, eau de piscine...) ou
dans un milieu solide (sol, aliments...).
Elle peut aussi servir à isoler une souche pure à partir d'un mélange.
Il s'agit simplement d'une suite de dilutions suivie d'un prélèvement d'un
aliquot qui sera étalé sur un milieu de culture qui pourra être sélectif ou non.
Il suffira ensuite de compter le nombre de colonies, et connaissant le volume
de l'aliquote (en général 1 ml sur une boîte), on en déduira la quantité
approximative de bactéries dans le milieu (on considère qu'1 UFC
correspond à 1 bactérie)
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I.5. Identification des bactéries
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L'identification des bactéries se fait suivant une clé dichotomique qui va des
caractères les plus vastes aux plus pointus pour aboutir à une espèce
bactérienne donnée.
a) Critères morphologiques
L’étude de la morphologie bactérienne est le premier acte effectué par un

laboratoire de diagnostic pour identifier une bactérie. L'observation de la
morphologie bactérienne permet une orientation préliminaire du diagnostic.
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I.5.Identification des bactéries
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 Macroscopique
À l'œil nu, on peut distinguer les caractéristiques d'une colonie :

• La forme du relief (bombée, semi-bombée, plate)
• La taille
• La couleur
• L'aspect (collant, filamenteux...)
• L'odeur
• La transparence (opaque, translucide)
• L'allure des contours (régulier, dentelés)
• La consistance
• La pigmentation
• Aspect de la surface (lisse ou rugueuse)
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I.5.Identification des bactéries
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 Macroscopique
Il existe trois grands types de colonies :

• Colonies de TYPE S (Smooth=lisse) : contours lisse et réguliers, semi-bombée, surface
brillantes, crémeuses.
• Colonies de TYPE M (Muqueux) : contours lisse et réguliers, très bombées, surface
très brillantes, filantes.
• Colonies de TYPE R (Rough=rugueux) : contours irréguliers, plates rugueuses et
mates, sèches.
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78 a) Critères morphologiques
 Microscopique
Etat frais
L'état frais se fera avec une suspension de colonie qui ne sera pas fixée
sur la lame comme la coloration de gram mais se fera avec une goutte
de suspension entre lame et lamelle. Cette observation microscopique
se fera à l'objectif x40 avec peu de lumière pour ne pas tuer les
bactéries car le but de cette observation est de voir leurs mobilités (on
peut voir aussi la morphologie mais cela se voit mieux en coloration de
gram).
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 Microscopique
Coloration de Gram
Les bactéries étant en général quasiment transparentes, on
commence par préparer un étalement (faire un frottis) sur lame de
microscope auquel on applique une coloration de Gram. L'observation
microscopique se fera à l'objectif x100 avec de l'huile à immersion. Les
bactéries à Gram positif apparaîtront mauves alors que celles à Gram
négatif apparaîtront roses. Il existe d'autres colorations, comme par
exemple celle au vert de malachite permettant de mettre en
évidence les formes sporulées. La coloration de Gram permet de
déterminer le type de paroi cellulaire.
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À la fin , les bactéries à GRAM négatif tacheront le rose / rouge et les bactéries à Gram positif
tacheront le bleu / viole
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 Microscopique
Forme
La forme est extrêmement diverse au sein du monde bactérien. Si on
excepte les bactéries dépourvues de paroi (Mycoplasmes), qui
peuvent être très polymorphes, la diversité est relativement restreinte
pour les bactéries d’intérêt médical et vétérinaire. Parmi celles-ci, on
distingue principalement des formes sphériques (Cocci), cylindriques
(bacille), spiralées (spirille), enroulées (spirochète) à appendice
bourgeonnant ou filamenteux.
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 Microscopique
Mode de groupement
Elles peuvent se regrouper en chaînes (Streptococcus, Enterococcus,
Lactococcus...), en amas asymétriques ou grappes (Staphylococcus),
en amas cubiques réguliers (sarcines), en palissades ou en paquets
d’épingles (Corynebacterium)... Le mode de groupement, à condition
de l’apprécier sur une culture jeune effectuée en milieu liquide et de
tenir compte de l’aspect prédominant, est également un élément
important pour orienter l'identification.
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 Microscopique
Taille
Les plus petites bactéries ont une taille de 0,1 à 0,2 micromètre (Chlamydia)
alors que certaines ont un diamètre supérieur à 10 micromètres. La plus
grande bactérie connue (Thiomargarita namibiensis) peut atteindre un
diamètre de 750 micromètres.
Présence de spores
Toutes les bactéries n'ont pas la possibilité de sporuler. La totalité des bacilles
à Gram+ sporulent en situation de stress. Pour mettre en évidence les spores
au microscope optique, il suffit de les colorer au vert de malachite ou à
l'encre de Chine. Mais on peut les deviner à la coloration de Gram
(absence de coloration). Les spores sont présentes chez les Bacillus.
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Une urédospore, ou urédiniospore,

est une spore à paroi mince
produites par l'urédium, une étape
dans le cycle de vie de certaines
espèces de champignons comme
les rouilles. L'urédospore est une
structure dicaryotique ayant un
état n+n. Par conséquent, elle se
compose de deux noyaux
génétiquement distincts.
Les urédospores se développent

dans l'urédie, généralement sur la
surface sous une feuille.

 Microscopique
Mobilité
Les bactéries peuvent être équipées d'un ou plusieurs flagelle(s) leur
permettant de se déplacer. Les 2 mobilités les plus courantes sont la mobilité
par ciliature péritriche si la bactérie se déplace dans tous les sens, soit par
ciliature polaire si la bactérie part dans un seul sens. Pour définir le mode de
déplacement des bactéries, on parle de chimiotactisme. La bactérie
évoluant dans un milieu se déplace selon des gradients de concentration
pour se rapprocher de sa "nourriture"
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 Microscopique
Capsule
La capsule est formée de polymères (polysaccharides ou protides) disposés
en couches à la périphérie de la bactérie. Celle-ci permet à la bactérie
d'adhérer aux surfaces (coloniser les surfaces) et d'échapper au système
immunitaire car les antigènes de surface sont recouverts par la capsule qui
les rend indétectables (pouvoir pathogène).
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b) Critères biochimiques
On identifie aussi une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat.
On la met donc en contact dans un milieu de culture avec un glucide, ou
un peptide, ou d'autres substrats plus complexes. On peut révéler l'utilisation
de ce substrat par virage (changement de couleur) d'un indicateur de pH
car un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un produit
basique, etc.
Chaque famille de bactéries a des caractères propres, on peut donc les
rassembler facilement avec des caractéristiques de base comme l'utilisation
du glucose avec ou sans oxygène, la réduction des nitrates, etc. Ensuite, on
dispose de galeries d'identifications biochimiques qui sont parfois vendues
par des sociétés spécialisées. Ces tests sont assez longs, de un à deux jours.
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c) Critères génétiques
On peut citer des techniques de génie génétique comme :

• La PCR (Polymerase Chain Reaction) pour cibler un gène présent
uniquement chez une famille ou un genre bactérien par réhybridation
spécifique de courtes séquences d'ADN (oligonucléotides amorces)
synthétiques précises.
• Les puces à ADN qui utilisent le même principe mais ayant une précision
allant jusqu'à la souche même.
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103 I.6. Antibiotiques
Les antibiotiques sont des substances chimiques qui ont une action
spécifique avec le pouvoir de limiter la prolifération de bactéries
spécifiques. Elles sont dépourvues de toxicité pour les autres cellules
(champignons et autres eucaryotes). Ces molécules peuvent avoir une
action drastique, c'est-à-dire bactéricide ; leur efficacité peut être
également limitée à empêcher le développement des bactéries (on parle
alors d'action bactériostatique).
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CHAPITRE II. PHYSIOLOGIE ET ÉCOLOGIE MICROBIENNES
105
Introduction
 Les micro-organismes sont restés très longtemps les ignorés de la
biosphère. Lorsque leur existence a été reconnue, elle a été
perçue surtout comme une menace liée à l'existence de
pathogènes.
 L'immensité du monde microbien apparaît aussi dans son ubiquité
et sa diversité. Cette immensité a une implication à sa mesure, à
savoir son rôle crucial dans le fonctionnement de la biosphère,
même si la reconnaissance de ce rôle est sans doute encore
incomplète. Malgré leur diversité, les micro-organismes partagent
des principes communs de fonctionnement. Entre eux, mais aussi
avec les autres organismes vivants.
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CHAPITRE II. PHYSIOLOGIE ET ÉCOLOGIE MICROBIENNES
106
Introduction
 Par ailleurs, les micro-organismes exercent entre eux et avec les
autres constituants de la biosphère des interactions nombreuses à
de multiples niveaux. La microbiologie des hydrocarbures
constitue un élément important de cet ensemble, du fait de sa
dimension environnementale et de ses applications industrielles.
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I.1. Physiologie de la cellule microbienne
107 1.1.1.Mécanismes fondamentaux
1.1.1.1. Base thermodynamique de l'autonomie cellulaire
 Une cellule vivante doit disposer, sous des formes qui peuvent être
diverses, des éléments constitutifs de sa biomasse (C, H, N et O
notamment, des minéraux, ainsi qu'un minimum d'eau).
 Chacun de ces éléments sera incorporé dans la biomasse en une
proportion qui lui est propre et C5H7NO2 comme formule simplifiée
de la composition de la biomasse microbienne.
 Au plan thermodynamique, elle doit disposer d'une source
d'énergie indispensable pour les biosynthèses multiples et les autres
processus nécessaires à son fonctionnement : c'est le principe
fondamental de la vie cellulaire
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 Deux types de sources sont exploités : l'énergie lumineuse par les
phototrophes et l'énergie chimique par les chimiotrophes.
 Cette dernière dérive essentiellement de la source primaire,
l'énergie lumineuse.
 L'ensemble des réactions qui concourent à la production
d'énergie et à leur utilisation par les processus vitaux constitue le
métabolisme
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 Les organismes vivants, qu'il s'agisse de bactéries ou des cellules
eucaryotes plus complexes des organismes supérieurs, capturent leur
énergie au moyen du transfert d'électrons thermodynamiquement
favorable d'un donneur (D) à un accepteur (A).
 Ce transfert est couplé à l'accumulation d'énergie sous la forme d'une
espèce chimique utilisable par la cellule qui est habituellement
l’adénosine triphosphate (ATP), la principale « monnaie énergétique »
cellulaire
 Ce transfert d'électrons est utilisé par ces bactéries pour produire de
l'énergie
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1.1.1.Mécanismes fondamentaux
110
1.1.1.1. Base thermodynamique
La plupart des couples rencontrés pouvant

fonctionner comme donneurs et accepteurs
d'électrons.
L'échelle des potentiels indique les couples où

le transfert d'électrons D — » A est favorable
N.B. Pratiquement tous les couples D/A accessibles

dans l'environnement sont utilisés.
21/12/2022
111
Sources d’énergies utilisées par les micro-organismes

Carbone comme source pour la croissance, les micro-organismes lithotrophes sont
généralement autotrophes (utilisent le CO2) comme source de carbone, au
contraire des micro-organismes organotrophes qui utilisent une source de carbone
organique (la même souvent que la source d 'énergie) et sont dits hétérotrophes.
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 Lorsque l'oxydation concerne un donneur minéral les bactéries sont

dites chimiolithotrophes. Elles sont habituellement aérobies
(l'accepteur est l'oxygène). Le cas de l'oxydation de l'ammoniaque
par les bactéries nitrifiantes telles que Nitrosomonas (D/A : NH3/O2).
 La réaction productrice d'énergie peut être aussi, et c'est le cas très
répandu des chimiorganotrophes, l'oxydation d'un composé
organique avec des accepteurs d'électrons variés.
21/12/2022
 Par exemple, un substrat comme le glucose (CH2O)6 pourra être
complètement oxydé en CO2 et les électrons transférés à l'oxygène,
cas énergétiquement le plus favorable.
 En l'absence d'oxygène (Tableau ci-dessous), l'accepteur d'électrons
peut-être notamment le nitrate (NO3-) qui est réduit en azote, ou le
sulfate (SO4+) qui est réduit en H2S, ou le CO2 qui est réduit en
méthane.
 L'énergie récupérable lors de l'oxydation d'un composé organique-
type (CH2O représente un sixième de glucose) par différents couples
d'accepteurs. 21/12/2022
114
Le métabolisme anaérobie : quelques exemples 21/12/2022

115
 On définit un type respiratoire en fonction de l’accepteur final
d'électron.
 Le type respiratoire est dit respiration quand un accepteur externe est
utilisé, aérobie lorsque l'accepteur final est l'oxygène, et anaérobie
lorsque l'accepteur d'électrons est une autre molécule minérale
externe.
 L'accepteur d'électrons peut aussi être interne. Par exemple, dans la
production de lactate à partir de glucose selon l'équation :
21/12/2022
116
 Le pyruvate, produit d'oxydation du glucose, sert d'accepteur aux
électrons libérés pour former le lactate.
 Ce cas correspond à un type respiratoire appelé fermentation, qui
signifie qu'un accepteur interne tel qu'une molécule organique
dérivée du donneur d'électrons est utilisé.
 Dans la fermentation du glucose en butyrate et acétate par
Clostridium butyricum par exemple, un autre accepteur interne, l'ion
H+ est utilisé ; il y a production d’hydrogène.
 En termes de variations d'énergie libre (ΔG0’), si l'on compare par
exemple des voies de conversion du glucose utilisant des accepteurs
d'électrons différents, les valeurs de ΔG0’ correspondantes sont très
différentes 21/12/2022
117 1.1.1.1. Base thermodynamique de l'autonomie cellulaire
 Les considérations qui précèdent illustrent l'impressionnante aptitude

des organismes vivants, tout particulièrement les bactéries, à capter
les diverses sources d'énergie possibles.
 Ces modes de capture de l'énergie ne fonctionnent pas de façon
indépendante à l'échelle de la biosphère. Selon les conditions
géochimiques de l'habitat, le sens du transfert d'électrons (oxydation
du sulfure d'hydrogène par les bactéries sulfoxydantes ou réduction
du sulfate par les bactéries sulfato-réductrices) peut être inversé.
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1.1.1.2. Mécanisme de l'autonomie cellulaire
118
Chromosome permet d'accomplir trois

fonctions essentielles détaillées ci-dessous,
à savoir de fournir les moyens du
métabolisme, les enzymes et les structures
membranaires de la cellule, de permettre
la multiplication cellulaire et de permettre
aussi l'évolution de l'organisme.
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A. Moyens du métabolisme : enzymes et membranes
 L'ADN contient l'information nécessaire à la production des outils (les

enzymes notamment), et des structures (les membranes en
particulier), permettant le fonctionnement du métabolisme.
 Cette information est repartie en gènes, chacun constitué d'une
séquence typiquement de l'ordre de 1,1 kpb (milliers de paires de
bases).
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a. Enzymes
120
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b. Membranes
121
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c. Multiplication cellulaire
 Les deux brins de la double hélice d'ADN peuvent se séparer et diriger
la synthèse de deux autres brins complémentaires et chacun d'eux
utilisé comme moule (ou modèle en négatif), conduisant ainsi à
l'obtention de deux ADN double brin identiques par l'intermédiaire
d'enzymes, les ADN polymérases.
 Ce processus, dit de réplication, permet à l'ADN de diriger la
duplication de l'ensemble des constituants de la cellule et sa division.
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123
d. Evolution de l'organisme
 Le processus de réplication laisse place à des possibilités de
modifications occasionnelles du matériel génétique. Ces
modifications permanentes, les mutations, souvent défavorables,
seront contre-sélectionnées. D'autres seront neutres et seront
relativement conservées. Certaines enfin seront sélectionnées si elles
confèrent à l'organisme un avantage dans l'environnement où il est
placé.
 Cet aspect est une propriété majeure du vivant et en particulier du
monde bactérien, caractérisé en premier lieu par sa surprenante
adaptabilité à des environnements très variés.
21/12/2022
124
1.1.2. Métabolisme des substrats carbonés
 L'utilisation des substrats carbonés organiques où s'inscrit une grande

partie de la microbiologie pétrolière.
 Chez ces microorganismes Chimiohétérotrophes (bactéries,
champignons et levures), diverses molécules organiques peuvent être
dégradées : polysaccharides, protéines, lipides, hydrocarbures...
 La molécule dégradée sert habituellement à la fois de source de
carbone et d'énergie.
21/12/2022
125
1.1.2.1. Catabolisme
 La dégradation du substrat organique (catabolisme) permettra
d'abord la production d'énergie. Et également fournir les composés
carbonés (les intermédiaires) qui seront les molécules de départ pour
la synthèse des constituants cellulaires.
 Différentes étapes entrent en jeu dans cette dégradation.
 Après transport dans le milieu extérieur (par des mouvements
cellulaires, turbulence ou diffusion), les substrats solubles pénètrent
dans la cellule (nutrition par absorption), par diffusion simple (passive)
ou par des systèmes de transport utilisant des protéines membranaires
spécifiques (transport actif). Dans ce dernier cas, le transport se fait
contre un gradient de concentration et est couplé à une utilisation
d'énergie. 21/12/2022
126
1.1.2.1. Catabolisme
 Les substrats insolubles sont au préalable solubilisés (hydrolyse enzymatique
en leurs unités constituantes par des exoenzymes excrétées par la bactérie
ou par des enzymes de surface).
 Dans d'autres cas comme celui des hydrocarbures, les substrats peuvent
être pseudo-solubilisés par production de surfactants formant des micelles
hydrophiles.
 Les voies de dégradation du substrat intracellulaire aboutissent à un nombre
restreint de composés simples comme l’acétyl-CoA ou le pyruvate.
 La glycolyse est une voie importante du métabolisme des sucres mais
d'autre voies existent. Une voie catabolique essentielle pour les
hydrocarbures et les composés lipidiques est la β-oxydation (oxydation en
position β du carbone terminal) qui aboutit à la production d'acétyl-CoA 21/12/2022
127 1.1.2.2. Voies amphiboliques
 Les produits intermédiaires du catabolisme constituent d'une part les

composés précurseurs des biosynthèses et d'autre part, en s'oxydant
en CO2, fournissent l'énergie qui sera utilisée notamment dans ces
biosynthèses.
 Ces voies métaboliques de transformation qui ont un rôle à la fois
dégradatif et biosynthétique sont appelées voies amphiboliques.
 Une voie très générale, de première importance, est le cycle citrique
(ou cycle tricarboxylique ou cycle de Krebs).
 Deux modes de fonctionnement du cycle sont à noter, avec chacun
un rôle différent.
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 Dans le premier: mode oxydatif, dont le rôle est énergétique, le
groupement acétyle de l'acétyl-CoA est entièrement oxydé en CO2.
 C'est par l'intermédiaire de ce mode de fonctionnement du cycle
citrique qu'est produite la majeure partie de l'ATP du métabolisme des
micro-organismes hétérotrophes aérobie.
 Cette conversion de l'énergie s'effectue dans les structures
membranaires déjà évoquées (membrane cytoplasmique chez les
bactéries et mitochondries chez les eucaryotes) par phosphorylation
oxydative lors du transfert d'électrons des donneurs (NADH et FADH2)
à l'accepteur (O2) dans la chaîne respiratoire.
21/12/2022
 Dan le deuxième: rôle biosynthétique. Il implique que l'oxaloacétate
soit régénéré lorsque des intermédiaires du cycle sont prélevés pour
des biosynthèses.
 Cela peut se faire notamment, par carboxylation du
phosphoénolpyruvate lorsque la dégradation du substrat suit la voie
de la glycolyse.
 Dans le cas des hydrocarbures, qui font intervenir la β-oxydation, le
cycle glyoxylique est essentiel. Ce dernier constitue une dérivation qui
contourne trois enzymes du cycle citrique oxydatif mais fait intervenir
deux enzymes supplémentaires, l'isocitratase qui convertit l'isocitratase
en glyoxylate et succinate, et la malate synthétase qui condense le
glyoxylate sur l'acétyl-CoA pour donner une molécule de malate.
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130
1.1.2.2. Voies amphiboliques
 Un autre ensemble amphibolique essentiel est constitué par les voies
de glycogenèse qui permettent de remonter du cycle citrique ou du
pyruvate vers les sucres et d'autres intermédiaires qui sont nécessaires
aux synthèses des constituants cellulaires, acides aminés, acides
nucléiques, lipides, polysaccharides.
 Ces voies sont amphiboliques parce qu'elles s'interpénètrent avec des
voies utilisées pour la dégradation des sucres lors de leur utilisation
comme source de carbone et d'énergie, à savoir la glycolyse et la
voie des pentoses phosphates.
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131 1.1.2.3. Anabolisme
 Certains intermédiaires serviront de point de départ des biosynthèses
qui mèneront à toutes les molécules constituant la cellule : a. a puis
protéines (Fonctions diverses: enzymes…), nucléotides (sous-unités des
a. nucléiques ARN et ADN), acide gras (constituants essentiels des
membranes), polysaccharides (constituants des parois bactériennes).
 Les intermédiaires sont d'abord transformés en monomères qui
s'associent et forment les macromolécules. Cette activité de
biosynthèse est consommatrice d'énergie.
 La cellule utilise l'énergie emmagasinée (ATP) pour effectuer des
réactions dont le bilan n'est rendu thermodynamiquement favorable
que par son intervention : l'hydrolyse de l'ATP (en ADP + Pi le plus
souvent) est en effet couplée à ces réactions de synthèse et intégrée
dans le bilan réactionnel.
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132
1.1.2.3. Anabolisme
 Si l'on considère par exemple la condensation des aminoacides en
protéines, on peut estimer que 4 ATP sont utilisés pour la formation
d'une liaison peptidique.
 Le carbone minéral (CO2) peut être utilisé comme source de
carbone. C'est le cas des micro-organismes autotrophes
phototrophes ou lithotrophes.
 Il est alors assimilé par des voies anaboliques spécialisées,
fréquemment le cycle de Calvin. Dans cette voie, le CO2 est
directement incorporé dans une séquence cyclique d'interconversion
des sucres (C5 + C1 2 C3) et aboutit au métabolisme central.
D'autres voies spécialisées de fixation du CO2 seront détaillées plus
loin à propos des méthanogènes et des méthylotrophes. 21/12/2022

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COURS DE MICROBIOLOGIE DU PETROLE

ANNEE ACADEMIQUE : 2021 - 2022

II. PHYSIOLOGIE ET ÉCOLOGIE MICROBIENNES

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