Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Fiches Techniques

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biotechnologie
Master M1 Biotechnologie et Microbiologie Appliquée Semestre1
 T.P. N°01
 Matière: Biotechnologie et Micrbiologie Appliquée

 Intitulé : Les symbioses rhizobiennes

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte) :

- Echantillonnage des sols

- Germination des graines de légumineuses
- Piégeage des BNL
- Estimation de la croissance des plantes
- Estimation de la nodulation

T.P. N°02
 Matière: Biotechnologie et Micrbiologie Appliquée

 Intitulé : Microorganismes et environnements

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte) :

- Isolement des microorganismes des différents environnements

- Etude macroscopique et microscopique des bactéries, levures et champignons
- Estimation de la croissance des différents groupes microbiens obtenus
- Etude biochimique.

Produits chimiques Petit Matériel/Consommable Appareillage

 Bruleurs à gaz  Spectrophotomètre
 Anse de platine  Centrifugeuse
 Ensemenceur multipoint  Bain–marie-agitateur
 Spatules  Microscopes photoniques
 Boites de Pétri  Balance à précision
 Tubes à vis  pH mètre
 Portoirs
 Cloches
 Cônes jaunes et bleus
 Micropipette Pipettes graduées
 Pipettes Pasteur
  Agar
 Extrait de levure
 Peptone
 Sucres
 NaCl
 Disques d’antibiotiques
 H2O2
 Pinces métalliques
 Pipettes graduées (1ml, 2ml, 5ml,
10ml)
 Papier filtre
 Lames
 Lamelles
 Alcool
 Papier Josef
 Colorants
 Glycérol
 Cellules de comptage
 Tubes Eppendorf
 Sachets isothermes
 Indicateurs pH
 Papier pH
 Parafilm
 Poires
 Propipettes
 Pinces en bois
 Entonnoirs

Master M1 Biotechnologie et Microbiologie Appliquée Semestre1

T.P. N°01
 Matière: Les endophytes : diversité et rôle

 Intitulé : Isolement des bactéries endophytes

 Partie 1 : Préparation des plantes et la stérilisation en surface

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte) :

 Les plantes sont rincées à l’eau courante, puis les racines sont séparées des parties
aériennes.
  Les racines sont désinfectées avec un mélange de 1.05% d’hypochlorite de sodium
et 0.1% de Tween 20 pendant 60 sec (ou 2% d’hypochlorite de sodium+Tween 20
pendant 10 min).
 Les racines sont rincées dans du tampon phosphaté stérile (12.5 mM potassium
phosphate buffer, pH 7.1).
 Les racines sont rincées ensuite dans du sodium thiosulfate (Na2S2O3).
 La racine est imprégnée sur du milieu TSA pour vérifier son éventuelle
contamination en surface.
 Si la croissance se fait dans les 48 h les échantillons sont éliminés pour cause de
désinfection insuffisante.

 Partie 2 : Conditions de la croissance bactérienne

 Protocole :

 Après la vérification de la stérilité, les racines sont triturées dans un mortier avec un
pilon (stérile) dans 5 fois le poids de l’échantillon de tampon phosphaté.
 La suspension des tissus végétaux est diluée ou pas dans de l’eau distillée stérile à
10-1, 10-2 et 10-4 puis étalée sur différents milieux (Gélose Nutritive, King A,
PDA ; La gélose glucosée à l'extrait de pomme de terre)
 Les boites sont incubées à 27C° pendant 48h.
 Les milieux liquides sont mélangés à 250 rpm pendant 16h dans un incubateur
agitateur.
 Pour un premier isolement et une caractérisation phénotypique, les bactéries sont
ensemencées sur milieu: NBY (Yeastextract medium) bouillon ou milieu gélosé
additionné de 40 µg de cycloheximide/ml.

 Partie 3 : Caractérisation phénotypique des isolats

 Protocole :

 L’observation au microscope à un agrandissement x1000: Motilité, Morphologie,

Taille, Mode de division, La coloration de Gram, L’activité de chitinase, L’analyse
des acides gras, L’utilisation de la source de carbone (Biolog).
NB: Les souches de références sont utilisées pour la comparaison.
 Travail personnel donné aux étudiants : Interpréter les résultats de chaque TP.

Besoin en matériels :
Pastilles d’hypochlorite de sodium, Tween 20, K2HPO4, KH2PO4, Sodium
thiosulfate (Na2S2O3), milieu TSA, Eau distillée stérile, Mortier, Flacon de
100ml, Incubateur agitateur, Milieu NBY, cycloheximide, Microscope
Optique, Colorants pour la coloration de Gram (Violet de Gentiane, Lugol,
Fuschine, Alcool), Galerie API 20NE avec ces réactifs, disques oxydase.
 T.P. N°02
 Matière: Les endophytes : diversité et rôle

 Intitulé : Solubilisation du phosphore par les bactérie endophytes

 Protocole :

La capacité des bactéries endophytes à solubiliser le phosphate est testée selon la

méthode décrite par Pikosvskaya en 1948.
 Un volume de 10 µl de chaque culture bactérienne (108 UFC / ml) est déposé sur la
surface du milieu de gélose Picovskaya additionné de 0,1% de bleu de
bromophénol(Gupta et al.,1994), c’est un milieu de base préconisé pour l’isolement
des microorganismes solubilisant les phosphates insolubles et contient du
Ca3(P04)2 comme seule source de phosphate.
 Après 7 jours d’incubation à 30 °C, un halo clair apparait autour des colonies ayant
la capacité de solubiliser les phosphates.
 Les résultats sont examinés et évalués en mesurant le diamètre des halos autour des
colonies. L’index de solubilisation est calculé selon la méthode décrite par Afzal et
Bano, 2008.

Index de solubilisation (IS) = (le diamètre de la colonie + le diamètre du halo) / le

diamètre de la colonie

Travail personnel donné aux étudiants : Interpréter les résultats obtenus,

puis calculer l’index de solubilisation.
POUR INFO : Solubilisation du phosphate :
La solubilisation des phosphates est aussi importante que la fixation biologique
de l’azote. Le phosphore (P) est un macronutriment essentiel pour la croissance
et le développement des plantes mais aussi un important élément nutritif
limitant cette croissance (Ezawaet al.,2002). Contrairement à l'azote, il n'existe
pas de source biologiquement disponible (Ezawaet al.,2002). Même dans les sols
riches la plupart du phosphore n'est pas disponible pour les plantes, une grande
quantité se trouve sous forme insoluble. Les bactéries solubilisant le phosphate,
PSB (Phosphate SolubilizingBacteria) sont fréquentes dans la rhizosphère et
peuvent être utilisées pour résoudre ce problème (Vessey, 2003). Les
microorganismes permettent la disponibilité du P pour les plantes par
minéralisation du P organique du sol et par solubilisation des phosphates
précipités (Kuceyet al.,1989; Pradhan et Sukla, 2005).
Le principal mécanisme de solubilisation des phosphates est la production
d’acides organiques. L’acide gluconique et l’acide 2-cétogluconique sont les plus
fréquemment rencontrés. Les acides glycolique, oxalique, malonique et
succinique, ont également été identifiés. Certaines souches sont capables de
produire en plus des mélanges d’acide lactique, isovalérique, isobutyrique et
d’acide acétique. La libération de ces acides mobilisant le phosphore par
l'intermédiaire d’interactions ioniques avec les cations du sel de phosphate
conduisent à l'acidification des cellules microbiennes et de leur environnement
et par conséquent la libération du phosphate sous forme ionique. La libération
des groupements phosphates liés à la matière organique est assurée par l’action
 des phosphatases (Kumar et Narula 1999; Whitelaw, 2000; Gyaneshwaret al.,
2002).

Besoin en matériels :
Gélose Picovskaya, bleu de bromophénol, boites Petri, étuve

Composition (g /l) du Milieu Pikovskaya

D –Glucose : 10g
(NH4)2 SO4: 0.5g
NaCl: 0.2g
MgSO4 7H2O: 0.1g
KCl : 0.2g
Extrait de levure : 0,5g
MnSO4 5H2O: 0.002g
FeSO47H2O : 0.002g
Ca3(PO4)2 : 5g
Eau distillée : 1000ml

T.P. N°03
 Matière: Les endophytes : diversité et rôle

 Intitulé : La production des phytohormones : Acide Indole Acétique (AIA) par les
bactéries endophytes.

 Protocole :

 La production d’AIA est testée sur un milieu Winogradsky liquide (Holt et

al., 1994) additionné de tryptophane (5 g / l).
 Le milieu est inoculé avec 100 µl de cultures bactériennes à une
concentration de 108 UFC/ml. Les tubes sont incubés à 30 °C pendant 96 h.
 Le dosage colorimétrique est réalisé selon la méthode de Loper et Scroth
(1986). Les cultures ont été centrifugées à 5000 rpm pendant 20 min. Un ml
de surnageant et mélangé avec 2 ml de réactif Salkowski (50 ml d'acide
perchlorique à 35% et 1 ml de FeCl3 à 0,5 M) et 200µl d'acide
orthophosphorique. L’absorbance a été mesurée à 530 nm après 30 min
d'incubation. Les concentrations d'AIA sont déterminées à l'aide d'une
courbe d'étalonnage obtenue dans un intervalle de 0 à 10-3 M AIA (Fluka).
 Travail personnel donné aux étudiants : Interpréter les résultats obtenus,
puis doser la concentration de AIA.

Besoin en matériels :
Milieu Winogradsky, tryptophane, Acide perchlorique, FeCl3, Acide
orthophosphorique, Spectrophotomètre.

Composition (g /l) du Milieu de Winogradsky exempte d’azote

Solution stock (g /l)
 KH2PO4 : 50,0 g
MgSO4 7H2O: 25,0g
NaCl : 25,0 g
FeSO4 7H2O: 1,0g
Na2MoO42H2O : 1,0g
MnSO4 4H2O: 1,0 g
Eau distillée : 1000ml
pH: 7,2 ajusté avec du NaOH
Préparation du Milieu Winogradsky exempte d’azote
Solution stock : 5ml
D Glucose : 0,5g
CaCO3 : 0,1g
Eau distillée qsp : 1000ml
pH : 6,2 ajusté avec du H2SO4
Master M1 Biotechnologie et Microbiologie Appliquée Semestre1

 Travaux Pratiques du module : Les symbioses actinorhiziennes

Sortie sur terrain

 Protocole :

 Principe:

Objectifs de la sortie :

- Reconnaitre et décrire les espèces non légumineuses/plantes actinorhiziennes ainsi

que leur intérêt.
- Faire une enquête nodulaire.
- Réaliser une récolte de graines.
- Prélever du sol rhizosphérique pour le piégeage des Frankia.

 Méthodologie (succincte) :
- Décrire la plante actinorhizienne rencontrée, récolter les graines,
- Réaliser un échantillonnage de sol rhizosphérique que vous mettez dans des sachets
dans un endroit sec,
- Déterrer les racines pour vérifier la présence des nodules.
- Étiqueter les sachets : Nom de la plante, date de prélèvement, région de prélèvement
et les données GPS.
- Les graines, les nodules et les échantillons de sol serviront pour les TPs qui suivent.
 Matériels utilisés :
- Pioche
- Sachets de conservation+ Marqueur
- G.P.S
T.P. N°01
 Matière: Les symbioses actinorhiziennes
 Intitulé : Rafraichissement des cultures de Frankia.

 Protocole :

 Principe:

Objectif du TP : Obtenir un inoculum frais de Frankia(Souche CcI3)

Séance1 : Observation des Frankiaet Préparation de Milieu de culture pour Frankia

Matériels utilisés :
Pour observation :
o Solution à 0,02% de bleu trypan dans du lactophénol
o Microscope optique
Pour préparation de milieu :
o Ingrédients pour préparer le milieu de culture BAP (Voir Tableau 01)
o Peser : Balance et balance de précision, Spatule, Verre de montre, Becher
o Dissoudre : Eau distillée, Eprouvette, Agitateur et barreaux magnétiques
o Ajuster le pH : pH-mètre, NaOH et HCl, pipettes pasteur et tétines
o Répartir : Flacons
o Stériliser : Autoclave

 Séance2 : Enrichissement de la culture de Frankia

Matériels :
o Culture de Frankia(Souche CcI3)
o Milieu de culture pour Frankia (préparé durant la séance1)
o Micropipette (1000μl) avec cônes bleus stériles
o Centrifugeuse et tubes coniques à centrifugation
o Seringues stériles
o Agitateur placé à l’intérieure de l’étuve réglée à 28°C

 Méthodologie (succincte) :

o Laisser la culture de Frankia décantée puis vérifier la limpidité du surnageant,

o Prélever ensuite juste le culot pour le déposer dans des tubes de 50 ml,
o Centrifuger à 4000 rpm à 20 °C pendant 9 min,
o Après centrifugation, jeter immédiatement le surnageant et ajouter 5 ml de
milieu
o Casser ensuite les hyphes en effectuant des aspirations refoulements à l'aide
dune seringue stérile,
o Transférer le tout dans des erlenmeyers contenant le milieu de culture et incuber
à 28°C sous agitation douce et à l’obscurité pendant une semaine.

T.P. N°02
 Matière: Les symbioses actinorhiziennes

 Intitulé : Germination des graines de Casuarina equistifolia

 Protocole :

Objectif du TP : Faire germer in vitro les graines de Casuarina equistifolia

Matériels :
o Hypochlorite de calcium (Ca Cl2O)
o Papier filtre
o Pince à thé
o Graines de Casuarina equisetifolia
o Acide sulfurique à 96%
o Eau distillée stérile
o Triton
o Alcool (75°C)
o Becher
o Boites avec milieu MSC (milieu pour plantes)
o Chambre de culture pour plantes

 Méthodologie (succincte) :

o Préparer d’abord la solution d'hypochlorite de calcium (Ca Cl2O à 5%), laisser

agiter pendant 40 min puis filtrer sous la hotte chimique,
o Remplir ensuite une pince à thé de graines de Casuarina equisetifolia, ces
dernières sont scarifiées dans de l’acide sulfurique à 96% pendant 2 min,
o Arrêter l’effet de l’acide sulfurique par trempage dans de l’eau déminéralisée et
rinçage à jet fort sous le robinet,
o Passer ensuite à la désinfection des graines dans du Triton (quelques gouttes de
Triton dans de l’eau stérile) pendant 5 min puis à l’alcool (75°) ensuite rincer à
l’eau déminéralisée.
o Désinfecter les graines à l'hypochlorite de calcium précédemment préparé, en les
émergeant dans un Becher contenant l'hypochlorite versé à ras bord à fin
d’éviter les contaminations,
o Laisser tremper pendant 40 min et rincer avec de l’eau stérile (3fois),
o Laisser sécher les graines ainsi désinfectées et scarifiées toute la nuit sous la
hotte,
o Placer ensuite les graines dans des boites avec milieu MSC préalablement
préparé,
o Entreposer les boites ainsi semées dans une chambre de culture.
 T.P. N°03
 Matière: Les symbioses actinorhiziennes

 Intitulé : Inoculation des plantules de Casuarina equistifolia

 Protocole :

Objectif du TP : Réaliser une inoculation in vitro des plantules de Casuarina

equistifolia

Matériels :
o Boites de Petri en matière plastique (9 cm) avec couvercles peints en noir
o Agrafeuse
o Solution nutritive de Crone sans azote

 Méthodologie (succincte) :

o Placer des plantules stériles de Casuarina equisetifolia âgées de 6 à 8

semaines dans des boîtes de Petri avec les racines posées sur le fond et la tige
maintenue verticalement par une agrafe fixée sur le bord interne de la boîte.
o Les couvercles des boîtes de Petri, peints en noir, comportaient une fente pour
laisser passer les tiges. Les racines baignaient dans 30 ml de solution nutritive
de Crone sans azote diluée au 1/10 ou le Fe3(P04)2, 8H20 est remplacé par Fe
EDTA (4 mg/l) additionné de 1 ml d’inoculum.
o Renouveler cette solution toutes les semaines.

Tableau 01 : Milieu BAP utilisé comme milieu de culture de Frankia

(d'après Murry et al., 1984)

Concentration en g/l Dose en ml/l

d’eau distillée
Mg S04, 7H2O 0,05

CaCI2, 2H2O 0,01

NH4CI 0,267

Propionate de Na 0,48

FeNa EDTA 0,01

1
Oligoéléments (Tableau
1.1)
1
Vitamines BAP (Tableau
10
1.2)
 Tampon BAP (Tableau
1.3)

Tableau 1.1. Solution d’oligoéléments utilisée dans le milieu BAP

Concentration en g/l d'eau distillée

H3BO3 2,86

MnC12, 4H2O 1,81

ZnSO4, 7H2O 0,22

CuSO4, 5H2O 0,08

Na2O4 Mo, 2H2O 0,025

CoSO4, 7H2O 0,001

Tableau 1.2. Solution de vitamines utilisée dans le milieu BAP

Concentration en g/100 ml
d'eau distillée
Solution de vitamines M6B :
Thiamine 1
Acidenicotinique 5
Pyridoxine 5
Ajouter à 100 ml de la solution de vitamines M6B
- 1ml de biotine en solution à 4,5mg/2ml d'eau
- 1ml d'acide folique en solution à 5mg/1ml d'eau
-1ml de pantothénate de Ca à 5mg/5 ml d'eau

Tableau 1.3. Tampon BAP utilisé dans le milieu BAP

Concentration en g/l
d'eau distillée
KH2PO4 136,09 (1)
K2HPO4 174,18 (2)
Ensuite mélanger 560ml de (1) et 320ml de (2), puis ajuster le pH à 6,7 à l'aide des deux
solutions.
 T.P. N°01
 Matière: Méthode de l’évaluation de l’efficacité

 Intitulé : Test de nodulation

 Protocole :

Objectif du TP : Evaluation de l’efficacité des symbioses microbiennes

 Méthodologie (succincte) :
1. Isolement des bactéries à partir des nodules
o Echantillonnage des nodules
o Désinfection des nodules (Hypochlorite de sodium à 3% 2 min)
o Rinçage avec de l’eau distillée stérile
o Écrasement d’un nodule dans une boite de Pétri contenant le milieu YEM.
o Incubation à 28°C pendant 72h

Matériels :
o Nodules
o L’hypochlorite de sodium (3%)
o Eau distillée stérile
o Pince métallique
o Boite pétri
o Milieu YEM
o Etuve
o Bec bunsen
o Anse de platine
Composition de milieu de culture YEM ou YMA

Milieu de culture YMA (Yeast Mannitol Agar) (Vincent, 1970)

Utilisé pour la culture courante des souches de BNL, sa composition en gramme par litre est la
suivante :
Extrait de levure ………………………………...........01g
Agar-Agar ………………………………………...........15g
Mannitol …………………………………………..........10g
KCl 1g
FeCl3 0.02g
Solution minérale de Bergersen 10 M…………..100ml : CaCl2, 2H2O 0.53g
Bergersen (1961) Na2HPO4, 12H2O 4.5g
MgSO4, 7H2O 1g
H2O distillée 1000ml
H2O distillée……………………………………….qsp 1000ml

pH (6.9 –7)
2. Examen macroscopique et microscopique
Objectifs du TP :
 Apprendre à manipuler le microscope optique et à faire la mise au point.
 Purification des isolats
Matériels utilisés :
o Microscopes optiques
o Lames préparées
o L’huile de paraffine pour une observation à Gr. x100
o Coloration de Gram (Culture de BNL sur boite, Lames, pissette d’eau
distillée, anse, flamme du Bec Bunsen, pince en bois, colorants (Violet de
Gentiane, Fuschine, Lugol), Alcool éthylique, Bac de coloration,
microscopes optiques, l’huile d’immersion, papier Joseph).

3. Test d’infectivité des souches vis-à-vis de leur plante hôte

Les souches extraites des nodosités de légumineuses ne peuvent être identifiés
comme rhizobia qu’après avoir effectué le test de nodulation, montrant leur
capacité à former des nodosités sur leur plante hôte,
Stérilisation, germination et mise en culture des plantes
Inoculation des plantes in vitro 

Matériels utilisés :
 Graines de la légumineuse récoltée
 L’hypochlorite de sodium (12°) Eau gélosée (0.8%)
 Acide sulfurique ou scalpel
 Eau distillée stérile Agar-agar…………....0.8 g
 Eau gélosée en boite à 0.8% Eau distillée………....100 ml
Autoclavé pendant 20 min à
 Papier aluminium
120°C
 Pince métallique
 Boite Pétri
 Solution nutritive (Fahreus,1957)
 4. Paramètres de croissance analysés 
 Nombre de nodosités (L'évaluation du taux de nodulation consiste à
déterminer le nombre des nodules formés)
 La hauteur des parties aériennes,
 La mésure du poids sec de la partie aérienne (PSA) et celui de la
partie racinaire (PSR) des plantes sont mesurés ; le poids sec est
obtenu par un séchage des racines et des parties aériennes (tiges et
feuilles) à 70°C pendant 48h. (Plusieurs études ont montré que le
poids sec des parties aériennes est un bon indicateur de l'efficacité
relative de la souche, il y a une bonne corrélation entre la production
de matière sèche et la capacité des légumineuses à fixer l’azote
atmosphérique) , Cette méthode permet de comparer l’efficience des
souches inoculées sur des plantes poussant sur un milieu sans azote
(Domenach et Wery, 1989).
 Rendement en graines et en gousses 

T.P. N°02
 Matière: Méthode de l’évaluation de l’efficacité

 Intitulé : Dosage des protéines par la méthode de BRAFORD (Dosage Calorimétrique)

 Protocole :
 Objectif du TP :
Ce TP met en œuvre la mesure colorimétrique d’une solution de protéines
en utilisant un spectrophotomètre pour la lecture de la densité optique. Il faudra
pour cela construire une gamme d’étalonnage, diluer la solution étalon et utiliser
des pipettes automatiques pour la mesure de petits volumes.

 Méthodologie (succincte) :

1) Faire une courbe standard en double

2) Dans un eppendrof, mélanger 799 μl d’H2O + 1 μl d’échantillon + 200 μl de réactif
de Bradford.
3) Incuber 5 min environ à Roon temperature, ne pas attendre plus de 30min avant de
faire la lecture sinon la lecture sera erronée.
4) Transvaser dans une cuve à spectrophotomètre et lire la DO à 595 nm
5) Rentrer les DO obtenues dans les zones grises du ficherexcel « Bradford.xls » afin de
calculer la concentration protéique des échantillons.
Matériel et Solution:
 Cuve a spectrophotomètre
 Bio-Rad Proteinassay (réactif de Bradford) stocker à 4˚C
 SAB : Sérum Albumine Bovine 1mg/ml
 Pipettes automatiques
 Tubes à hémolyse de 5 ml
 Fiole jaugée de 100 ml
 Spectrophotomètre
 vortex

T.P. N°03
 Matière: Méthode de l’évaluation de l’efficacité

 Intitulé : Dosage d’Azote et du Phosphore

Introduction
Le phosphore total est l’ensemble du phosphore présent dans un échantillon sous
forme de phosphates ou de composé organophosphorés. La présence du
phosphore dans les effluents industriels provient surtout des détergents, des
engrais et de la décomposition de la matière organique. Par la méthode Kjeldahl,
l’azote ammoniacal et l’azote organique sont dosés simultanément. Ces deux
formes d’azote sont présentes dans les détritus organiques soumis aux processus
biologiques naturels. La présence d’azote organique dans les effluents industriels
provient des abattoirs, de certaines usines chimiques utilisant de l’azote organique.
Cette méthode est basée sur les méthodes Total KjeldahlNitrogen in Acid Digests et
Total phosphorus in Acid Digests de SealAnalytical. dérivé des protéines animales
et de la décomposition de la matière organique.

Principe et théorie
 La détermination du phosphore total et de l’azote total Kjeldahl s’effectue en deux
étapes.
La première étape est une digestion en milieu acide qui transforme tout le
phosphore présent en orthophosphate et tous les composés organiques azotés
en azote ammoniacal.
Dans la seconde étape, les ions orthophosphates et les ions ammonium sont dosés
par un système automatisé. L’ion orthophosphate réagit avec l’ion molybdate et
l’ion antimoine pour former un complexe phosphomolybdate. Ce dernier est
réduit avec l’acide ascorbique en milieu acide pour provoquer l’apparition du
bleu de molybdène, dont l’absorbance à 660 nm est proportionnelle à la
concentration de l’ion orthophosphate. Les ions ammonium réagissent avec du
salicylate, du nitroferricyanure et de l’hypochlorite de sodium pour former en
milieu alcalin un complexe salicylate ammoniacal, dont l’absorbance à 660 nm
est proportionnelle à la concentration d’azote ammoniacal.

 Protocole :

1- Préparation de l’échantillon :

Les tubes de digestion doivent être chauffés à environ 400 °C pendant un

minimum de 2,5 heures pour les décontaminer.
− La solution témoin et les solutions étalons doivent être préparées de la même
façon que les échantillons. − Ajouter quelques pierres à ébullition (cf. 6.19) dans
les tubes de digestion. − Ajouter 2 gouttes d’émulsion antifoam A® (cf. 6.18).
− Pour les liquides, homogénéiser l’échantillon en l’agitant et introduire 25 ml
d’échantillon. − Pour les solides, homogénéiser l’échantillon non séché avec une
spatule pour avoir un échantillon représentatif et utiliser un poids équivalent à
0,20 g d’échantillon solide exprimé sur base sèche et ajouter 25 ml d’eau à pH < 2
avec H2SO4 9 N. Pour les boues d'usines d'épuration, peser une quantité moindre
d'échantillon. MA. 300 – NTPT 2.0 11 de 16
Note – Pour les échantillons de fumiers, les résultats sont exprimés sur base
humide. Cependant, pour tous les autres échantillons solides, les résultats sont
exprimés sur base sèche et le pourcentage d’humidité est déterminé sur une autre
portion de l’échantillon.
Note – Préparer une série de tubes en utilisant 25 ml d’eau avec les réactifs. Ces
solutions serviront d’eau de dilution pour les échantillons trop concentrés.
− Ajouter 10 ml de la solution de digestion (cf. 6.22).
− Mélanger à l’aide d’un agitateur Vortex.
− Digérer les échantillons en les chauffant à 150 °C pendant 30 minutes de façon à
faire évaporer l'eau. Dans un deuxième temps, ils sont chauffés à une température
minimale de 380 °C pendant 30 minutes pour digérer la matière organique.
− Après la digestion, enlever les tubes et les laisser refroidir dans la hotte (environ
10 minutes). Ajouter environ 30 ml d’eau et agiter immédiatement à l’agitateur
Vortex pour dissoudre les sels résiduels. Si nécessaire, remettre les tubes dans le
bloc de digestion pour aider la dissolution des sels. Compléter à 75 ml avec de
l’eau. Boucher le tube et mélanger plusieurs fois par inversion. − Laisser reposer
quelques heures.

2- Dosage :
 Le dosage des phosphates est fait en utilisant un analyseur colorimétrique
automatisé. La couleur produite lors de la réduction du complexe formé en
présence d'orthophosphates, d’ions molybdates et d’ions antimoniates est
mesurée à 660 nm. La figure 1 représente le schéma de l’analyseur.
Le dosage de l’azote total est fait en utilisant un analyseur colorimétrique
automatisé. La couleur produite lors de la réaction entre l’azote ammoniacal, le
salicylate, le nitroferricyanure et l’hypochlorite est mesurée à 660 nm. La figure 2
représente le schéma de l’analyseur. L'étalonnage de l'instrument est fait
quotidiennement.

 Méthodologie (succincte) :
Appareillage
1. Balance dont la sensibilité est de 0,1 mg
2. Bloc de digestion pour les échantillons.
3. Agitateur Vortex
4. Système automatisé pour le dosage de l’azote ammoniacal et des phosphates

Réactifs et étalons
1. Acide sulfurique, H2SO4 (CAS no 7664-93-9)
2. Hydroxyde de sodium, NaOH (CAS no 1310-73-2)
3. Oxyde mercurique, HgO (CAS no 21908-5-2)
4. Sulfate de potassium, K2SO4 (CAS no 7778-80-5)
5. Hypochlorite de sodium, NaOCl, 4-6 %
6. Sulfate d’ammonium, (NH4)2SO4 (CAS no 7783-20-2)
7. Molybdated’ammonium, (NH4)6Mo7O24•4H2O (CAS no 12054-85-2)
8. Chlorure de sodium, NaCl (CAS no 7647-14-5)
9. Tartro-antimoniate de potassium, K(SbO)C4H4O6•½H2O (CAS no 28300-74-5)
10. Phosphate de potassium monobasique, KH2PO4 (CAS no 7778-77-0)
11. Tartrate de potassium et de sodium tétrahydraté (CAS no 6381-59-5)
12. Phosphate dibasique de sodium, Na2HPO4•7 H2O (CAS no 7782-85-6) ou
phosphate dibasique de sodium anhydre, Na2HPO4 (CAS no 7758-79-4)
13. Salicylate de sodium (CAS no 54-21-7)
14. Nitroferricyanure de sodium (CAS no 13755-38-9)
15. Acide ascorbique (L+) (CAS no 50-81-7)
16. Laurylsulfate de sodium, C12H25NaO4S (CAS no 151-21-3)
17. Brij-35® (marque déposée par Atlas Chemical Industries Inc.)
18. Émulsion antifoam A
19. Pierres à ébullition
20. Solution de sulfate mercurique
Note – Préparer cette solution sous la hotte. Peser précisément environ 8,0 g de HgO
(cf. 6.3) et dissoudre dans 40 ml d’eau. Ajouter 10 ml d’acide sulfurique (cf. 6.1),
laisser refroidir et compléter à 100 ml avec de l’eau.
21. Solution de lavage acide
Diluer 7,8 ml de H2SO4 (cf. 6.1) dans environ 900 ml d’eau, laisser refroidir et
compléter à 1 000 ml avec de l’eau.
22. Solution de digestion Note –
Préparer cette solution sous la hotte. Peser précisément environ 133 g de K2SO4 (cf.
6.4) et dissoudre dans une solution contenant 500 ml d’eau et 200 ml de H2SO4 (cf.
6.1). Agiter jusqu’à dissolution complète. Ajouter 25 ml de la solution de sulfate
mercurique (cf. 6.20) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau.
23. Solution d’acide sulfurique 9 N
Diluer 250 ml de H2SO4 (cf. 6.1) dans environ 600 ml d’eau tout en agitant, laisser
refroidir et compléter à 1 000 ml avec de l’eau.
24. Solution mère acide/sel
Peser précisément environ 5,0 g de NaCl (cf. 6.8) et dissoudre dans environ 700 ml
d’eau. Ajouter 12 ml de H2SO4 (cf. 6.1), laisser refroidir et compléter à 1 000 ml
avec de l’eau. Peser précisément environ 2,0 g de laurylsulfate de sodium (cf. 6.16)
et ajouter au contenu de la solution. Filtrer sur un papier Whatman si nécessaire.
Cette solution se conserve à température ambiante aussi longtemps que la solution
reste claire.
25. Réactif molybdate
Peser précisément environ 3,1 g de molybdate d’ammonium (cf. 6.7) et 0,085 g de
tartro-antimoniate de potassium (cf. 6.9) et dissoudre dans environ 400 ml.
Compléter à 500 ml avec de l’eau. Filtrer si nécessaire.
Conserver dans une bouteille ambrée.
26. Solution d’acide ascorbique
Peser précisément environ 1,50 g d’acide ascorbique (L+) (cf. 6.15) et dissoudre dans
environ 80 ml d’eau. Agiter et compléter à 100 ml avec de l’eau. Filtrer si nécessaire.
Cette solution se conserve 7 jours à environ 4 °C dans une bouteille ambrée.
27. Solution tampon de travail
Peser précisément environ 26,8 g de phosphate dibasique de sodium hydraté ou 14,2
g de phosphate dibasique de sodium anhydre (cf. 6.12), 32,0 g d'hydroxyde de
sodium (cf. 6.2) et 50,0 g de tartrate de potassium et de sodium (cf. 6.11) dans
environ 600 ml d'eau et compléter à 1 000 m avec de l'eau. Ajouter 2,0 ml de Brij-
35® (cf. 6.17).
Cette solution se conserve une semaine à température ambiante.
28. Solution de salicylate de sodium et de nitroferricyanure de sodium
Peser précisément environ 40,0 g de salicylate de sodium (cf. 6.13) et 1,00 g de
nitroferricyanure de sodium (cf. 6.14) broyé et dissoudre dans environ 800 ml d’eau.
Compléter à 1 000 ml avec de l’eau et filtrer. Filtrer si nécessaire.
Cette solution se conserve pendant un mois dans une bouteille ambrée.
29. Solution d’hypochlorite de sodium 4 % (V/V)
Diluer 4 ml de NaOCl (cf. 6.5) dans environ 80 ml d’eau et compléter à 100 ml avec
de l’eau.
Cette solution se conserve pendant 8 heures.
30. Solution mère d’azote de 1 000 mg/l N
Peser précisément environ 4,717 g de (NH4)2SO4 (cf. 6.6) préalablement séché à
105 °C et dissoudre dans environ 800 ml d’eau. Ajouter 5 ml de H2SO4 9N (cf. 6.23)
et compléter à 1 000 ml avec de l’eau.
Cette solution se conserve deux ans à environ 4 °C.
31. Solution mère de phosphore de 1 000 mg/l P Peser précisément environ 4,394 g
de KH2PO4 (cf. 6.10) préalablement séché à 105 °C et dissoudre dans environ 800
ml d’eau. Ajouter 5 ml de la solution de H2SO4 9 N (cf. 6.23) et compléter à 1 000
ml avec de l’eau. Cette solution se conserve deux ans à environ 4 °C. 6.32. Solution
intermédiaire combinée d’azote et de phosphore de 100 mg/l Dans une fiole jaugée
de 100 ml, introduire à l’aide d’une pipette 10 ml de la solution étalon d’azote de 1
000 mg/l N (cf. 6.30) et 10 ml de la solution étalon de phosphore de 1 000 mg/l P (cf.
6.31) dans environ 70 ml d’eau. Ajouter 0,5 ml d’acide sulfurique 9 N (cf. 6.23) et
compléter au trait de jauge avec de l’eau.
Cette solution se conserve six mois à environ 4 °C.
33. Solutions étalons combinées d’azote et de phosphore de 0, 0,5, 2,0, 4,0, 7,0 et 10
mg/l
 Dans une série de fioles jaugées de 100 ml, introduire à l’aide de pipettes 0, 0,5, 2, 4,
7 et 10 ml de la solution étalon combinée de phosphore de 100 mg/l P et d’azote de
100 mg/l N (cf. 6.32) dans environ 40 ml d’eau. Ajouter 0,50 ml de la solution de
H2SO4 9 N (cf. 6.23) et compléter au trait de jauge avec de l’eau.
Ces solutions se conservent six mois à environ 4 °C.

Master M1 Biotechnologie et Microbiologie Appliquée Semestre1

T.P. N°01
 Matière: Les associations mycorhiziennes

 Intitulé : Révélation des structures endomycorhiziennes

 Protocole :

 Principe:

Objectif du TP : Traitement, éclaircissement et coloration des racines selon la

méthodePhilips et Hayman ,1970.

T.P. N°02
 Matière: Les associations mycorhiziennes

 Intitulé : Mise en évidence des structures endomycorhiziennes

 Protocole :

 Principe:
 Objectif du TP : Observation des structures endomycorhiziennes et évaluation du taux
de mycorhization selon la méthode décrite par Trouvelotet ses coll(1986) permettant de
calculer les paramètres de l'infection endomycorhizogène.

T.P. N°03
 Matière: Les associations mycorhiziennes

 Intitulé : Extraction des spores

 Protocole :

 Principe:

Objectif du TP : Extraction des spores par tamisage humide selon la méthode de
Gerdemann et Nicholson (1963).

T.P. N°04
 Matière: Les associations mycorhiziennes

 Intitulé : Identification des spores

 Protocole :

 Principe:

Objectif du TP : Observation, comptage et identification deces spores

 Méthodologie (succincte):
Matériel et appareillage :

Bain-marie
Centrifugeuse avec tubes de centrifugation
Loupes binoculaires
Tamis superposés
Pinces
Scalpels
Lame porte objet en verre
Lamelle couvre objet en verre
Boites de Pétri en verre simples et quadrillées
Béchers différentes capacités
Pipettes différentes capacités
KOH
Acide lactique
Bleu de Trypan
Glycérol, Polyvinylalcohol
Saccharose