Microb Ecol

DOI 10.1007 / s00248-013-0230-3

MÉTHODES

Un nouveau cadre pour quantifier avec précision la diversité des

communautés bactériennes du sol de la DGGE

Jonathan Lalande et Richard Villemur et Louise Deschênes

Reçu: 19 décembre 2012 / Accepté: 11 avril 2013

# Springer Science + Business Media New York 2013

Abstrait L'électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE) a à partir de la quantification de bande. L'allongement de ces RAD
été et reste largement utilisée pour évaluer et surveiller les effets partiels à l'aide des PSR extraits des profils de la DGGE a
de divers traitements sur les communautés bactériennes du sol. En principalement permis d'estimer avec précision la vraie diversité
ne considérant que les phylotypes abondants, les estimations de des communautés. Pour tous les échantillons analysés, l'estimation
diversité produites par cette technique se sont avérées non de Shannon et Simpson ' s 1 / ré étaient précis à ± 10%. Les
corrélées à la vraie diversité communautaire. Le but de cet article estimations de richesse étaient moins précises, allant de - 11 à 31%
était de développer un cadre pour estimer une communauté ' s vraie des valeurs attendues. Le cadre a montré un grand potentiel pour
diversité de DGGE. Développé à l'aide de profils DGGE in silico étudier la structure et la diversité des communautés bactériennes
générés à partir d'ensembles de données de pyroséquençage du sol.
publiés, ce cadre allonge les distributions de rang-abondance (RAD)
tirées par quantification de bande en utilisant le paramètre de
rapport pic-signal (PSR), qui s'est avéré être lié à la richesse
introduction
bactérienne. La capacité de comparer les estimations de la diversité
basées sur la DGGE à la vraie diversité des communautés a conduit
Compte tenu de l'importance de la diversité en ce qui concerne le
à une occasion unique d'identifier les pièges potentiels lors de
fonctionnement des écosystèmes [ 1 ] et sa résistance et sa résilience
l'analyse des gels DGGE avec des logiciels d'analyse commerciaux et
aux perturbations [ 2 ], il est très important de pouvoir évaluer et
de mieux comprendre le processus de regroupement des bandes
comparer régulièrement la diversité des communautés
d'ADN dans les profils. La diversité bactérienne a été comparée à
microbiennes du sol sur une grande échelle de pratiques de gestion
travers la richesse, Shannon et Simpson ' s 1 / ré indices. Les résultats
et de traitements.
intermédiaires ont démontré que, même si les logiciels
En effet, les communautés microbiennes du sol sont parmi les plus
commerciaux d'analyse de gel n'étaient pas en mesure de produire
diversifiées et les plus abondantes sur Terre [ 3 ] et jouent un rôle clé dans les
des résultats cohérents dans tous les échantillons, un nouveau
écosystèmes terrestres [ 4 ]. Même si ces communautés peuvent être étudiées
cadre basé sur Matlab a démêlé les profils de dominance des
en profondeur grâce à la métagénomique moderne [ 5 ], les chercheurs ont
communautés.
toujours besoin de méthodes rentables pour estimer de manière fiable la
diversité de plusieurs échantillons. Des techniques d'empreintes digitales
Matériel supplémentaire électronique La version en ligne de cet article (doi: 10.1007 telles que l'électrophorèse sur gel à gradient dénaturant (DGGE) ont été
/ s00248-013-0230-3) contient des informations supplémentaires, qui sont à la
utilisées avec succès dans de nombreuses études sur la diversité [ 6 ].
disposition des utilisateurs autorisés.

J. Lalande (*): L. Deschênes Pour des communautés aussi complexes, interpréter les résultats des
École Polytechnique de Montréal, Département de génie
enquêtes sur la diversité basées sur la DGGE - même s'ils sont largement
chimique, CIRAIG, 2500 chemin de Polytechnique,
Montréal, QC, Canada H3T 1J4 utilisés - n'est pas une tâche facile. Initialement développé comme un
courriel: jonathan.lalande@polymtl.ca outil de détection de mutation, le DGGE peut théoriquement séparer les
séquences d'ADN qui diffèrent d'une seule paire de bases [ 7 , 8 ]. Par
R. Villemur
conséquent, dans l'estimation de la diversité communautaire à partir des
Groupe de recherche en microbiologie environnementale, INRS - Centre de
recherche de l'Institut Armand-Frappier, 531 boul. des Prairies, Laval, QC, profils DGGE, les bandes visibles sont implicitement associées à des
Canada H7V 1B7 phylotypes uniques. Puisque des auteurs dont Schmalenberger

et Tebbe [ 9 ] ont clairement démontré que les bandes DGGE peuvent
contenir de nombreuses unités taxonomiques opérationnelles (OTU)
différentes, cette considération générale est connue pour être fausse.
D'une manière générale, le niveau de similitude entre les marqueurs
génétiques de différents organismes constitue la base de la définition de
l'OTU dans la taxonomie microbienne moderne. Il a été déclaré que la
valeur minimale de 97% de similitude entre les séquences génétiques de
l'ARNr 16S proposée par Stackebrandt et Goebel [ dix ] peut ne pas avoir
le pouvoir de résolution de relier les bactéries au niveau de l'espèce [ 11 ],
en particulier pour les courtes séquences partielles. Si le niveau de
similitude à utiliser est discutable, le concept fournit toujours une base
utile et scientifiquement fondée pour estimer et comparer la diversité
des communautés bactériennes. Même s'il a été démontré que la
superposition de bandes d'ADN sur les profils DGGE se produit, on ne
sait pas si ce processus peut être lié au regroupement de séquences
d'ADN à un niveau de similitude ou si les deux processus donneront
systématiquement une représentation comparable des profils de
dominance des communautés bactériennes du sol.
Un autre aspect mal compris et apparemment négligé de la
DGGE est l'étape d'analyse de profil elle-même. Dans la littérature
scientifique, les modèles d'empreintes digitales ont été analysés à
l'aide de nombreux logiciels différents. Bien que pratiques, il faut
reconnaître que la plupart n'ont pas été spécifiquement développés
pour analyser des empreintes digitales aussi complexes que celles
produites par les communautés bactériennes du sol
(communications personnelles). Il semble que les différences entre
les logiciels et plus généralement leur capacité à démêler
quantitativement les communautés ' le véritable profil de
dominance des schémas de baguage n'a jamais été évalué.
De plus, des simulations numériques ont démontré qu'en ne permettant de
considérer que les phylotypes les plus abondants, les techniques de prise
d'empreintes fournissent une estimation inexacte de la vraie diversité des
communautés microbiennes [ 12 , 13 ]. Les indices de diversité couramment utilisés
pour quantifier la diversité sont influencés à la fois par la richesse (longueur) et le
modèle de dominance véhiculé par l'ensemble de données utilisé pour tracer la
distribution rang-abondance (RAD) de la communauté étudiée [ 12 , 14 ]. L'analyse
traditionnelle des schémas de bandes DGGE fournit théoriquement des informations
sur les profils de dominance communautaire mais pas sur la richesse. Cependant,
sur la base de communautés bactériennes simulées, Loisel et al. [ 15 ] a montré que le
pourcentage de fond de sous-unité (SBP), un indicateur extractible à partir des
profils DGGE, était lié à la richesse de la communauté. Le SBP peut être considéré
comme une mesure de la proportion de la communauté étudiée qui n'est pas prise
en compte lorsque seuls les pics visibles sont considérés. Malheureusement, la
relation entre le SBP et la richesse n'est pas simple et il a été démontré qu'elle
dépendait du modèle d'abondance pour générer les communautés bactériennes
simulées. Utilisé en conjonction avec des modèles d'abondance théoriques, le SBP
pourrait permettre d'inférer des RADs de toute la communauté à partir des schémas
de bandes DGGE. Les modèles les plus couramment utilisés pour
J. Lalande et coll.
décrire les communautés bactériennes du sol sont le log-normal [ 13 ,
15 - 18 ], la loi de puissance [ 19 , 20 ], et le géométrique [ 13 , 15 ], et ces
modèles d'abondance pourraient être utilisés pour allonger les RAD
partielles basées sur la DGGE à " ajouter " les OTU qui ne sont pas
suffisamment abondantes pour produire une bande visible sur le
gel. Le SBP fournirait un critère d'arrêt pour le processus
d'allongement, indiquant la longueur à laquelle la distribution est
terminée. Si une telle méthodologie pouvait être développée, elle
permettrait la caractérisation précise de la diversité des
communautés bactériennes du sol à partir des empreintes digitales
DGGE.
Le principal objectif de ce document était de développer un tel cadre.
Dans le processus d'élaboration de ce cadre, l'influence de certains
paramètres analytiques (soustraction du bruit de fond et quantification
des pics DGGE) et l'étendue du processus de regroupement des bandes
ont été évaluées. Pour ce faire, des ensembles de données de
pyroséquençage accessibles au public des communautés bactériennes
du sol [ 21 ] ont été utilisés pour générer des profils DGGE in silico. La
connaissance de la composition de la communauté a permis d'évaluer si
les estimations de la diversité basées sur la DGGE peuvent
théoriquement conduire à des conclusions similaires que des méthodes
plus robustes basées sur le séquençage et le regroupement de l'ADN.
Méthodes
Construction de profils In Silico DGGE
Les profils DGGE in silico ont été construits en utilisant des
ensembles de données de pyroséquençage des communautés
bactériennes du sol téléchargés à partir des archives de lecture de
séquence NCBI [ 22 ]. Cette méthodologie a été choisie pour éviter la
nécessité de choisir un modèle théorique approprié pour dériver les
RAD utilisés pour créer les profils. Les ensembles de données ont
été générés à l'aide d'ADN extrait de six sols différents et ciblant le
V2 - Région V3 du gène de l'ARNr 16S bactérien (environ 400 nt) [ 21 ].
Les séquences ont été traitées par les auteurs pour éliminer les
amorces et les régions présentant des scores de faible qualité et
variaient en longueur entre 200 et 300 nt.
Présentant différents modèles de richesse et de dominance initiaux,
trois de ces ensembles de données ont été sélectionnés pour une
analyse plus approfondie: FUG3 (prairies intensément fertilisées), BF2
(forêt de hêtres non gérée) et SAF1 (forêt d'épinettes). Chaque ensemble
de données a été aligné et regroupé en utilisant trois niveaux de
similitude (100, 97 et 95%) avec le pipeline de pyroséquençage RDP [ 23 ].
Les ensembles de données ont été encore simplifiés en associant
l'abondance relative de chaque OTU à une séquence représentative
unique, garantissant que chaque cluster génère une bande DGGE
unique dans le in silico profils. Au total, neuf communautés ont été
produites, d'une richesse variant entre 1895 et 17552 OTU et présentant
une abondance relative d'OTU la plus dominante entre
1,5 et 5,4%.
Quantification de la diversité des communautés bactériennes du sol à partir de la DGGE
Les OTU ont été positionnées dans les profils à l'aide d'ADN se-
quence températures de fusion théoriques ( T m) calculé avec
Khandelwal et Bhyravabhotla ' modèle prédictif
[ 24 ]. Ce modèle a été choisi car il a donné de bons résultats sur une
large gamme de longueurs de séquence (15 mers à génomique). Les
conditions de gel (gradient de dénaturation) ont été ajustées en
considérant que l'urée et le formamide réduisent les températures de
fusion des séquences d'ADN de 2,25 ° C / M et 0,6 ° C /% [ 25 ],
respectivement, en veillant à ce que toutes les séquences soient incluses
dans les profils. Les pics de DGGE ont été représentés dans les profils in
silico par des fonctions de densité de probabilité gaussiennes (PDF) (Eq. 1 ).
ré
xx 0 E 2
je ré X Þ ¼ p 2 σe2
UNEffiffiffiffiffiffiffi
2 p2
Le pic correspondant à chaque OTU était donc complètement
représenté par trois paramètres: position centrale
sur le gel ( X 0 en pixels, déterminé à partir de T m), amplitude ( UNE en
intensité en niveaux de gris proportionnelle au relatif OTU
abondance dans son jeu de données RAD) et la largeur du pic ( σ
en pixels, écart type). Sur la base des observations de gels
DGGE expérimentaux, l'écart type a été fixé à une valeur
moyenne de 2,0 pixels et forcé de varier au hasard pour chaque
OTU entre ± 10% de la valeur moyenne. Intensité de pointe Je (x)
a été évalué pour tous les pixels ( X valeurs) sur toute la
longueur verticale du gel (fixée à 1 024 pixels). Les profils in
silico ont été obtenus en additionnant l'intensité correspondant
à chaque OTU contenue dans un jeu de données donné pour
chaque pixel.
L'image représentant le gel DGGE in silico a été créée au format
TIFF non compressé 16 bits (valeur maximale en niveaux de gris de
65 535). Les intensités de tous les profils verticaux ont d'abord été
normalisées de sorte que la valeur maximale des niveaux de gris
pour chaque échantillon soit égale à 50 000. Cette étape a été
considérée comme analogue à l'ajustement du temps d'exposition
lors de la photographie de gels DGGE. Les profils bidimensionnels
ont été considérés comme ayant une largeur de 175 pixels, tous
remplis des profils unidimensionnels générés précédemment. Afin
de reproduire certaines des difficultés liées à l'analyse de vrais gels
DGGE, un bruit de fond supplémentaire calculé à partir du niveau
d'intensité moyen des profils et ajusté aléatoirement a été ajouté.
Analyse des profils
Les profils DGGE in silico ont été analysés à l'aide de quatre
logiciels différents: TotalLab Quant (TotalLab Ltd.,
Newcastle upon Tyne, UK), GelCompar II (Applied Maths,
Inc., Austin, TX, USA), BIO-1D advanced (Vilber Lourmat,
Marne-la-Vallée, France) et un programme basé sur Matlab
(The MathWorks Inc., Natick, MA, USA) spécialement
développé pour cet article. Les principales différences entre
les logiciels étaient principalement liées à leur
algorithmes de soustraction de fond ou de délimitation des pics.
Ces paramètres ont donc été étudiés plus avant.
Soustraction d'arrière-plan
Les algorithmes de soustraction de fond évalués dans cet article se
sont limités aux approches populaires de la boule roulante incluses
dans TotalLab, GelCompar II et BIO-1D, et à l'approche développée
pour le programme basé sur Matlab. TotalLab Quant et GelCompar
II intègrent pratiquement le même algorithme: une balle virtuelle
dont le diamètre est choisi par l'utilisateur roule sous les profils et
soustrait le signal situé sous le haut de la balle. BIO-1D ' L'algorithme
de s est légèrement différent puisqu'il soustrait d'abord le signal du
ré 1 E centre de la bille et demande ensuite à l'utilisateur de définir un
niveau de seuil pour ajuster les intensités de la ligne de base du
profil à zéro.
GelCompar II et BIO-1D proposent tous deux un " optimal "
la taille de la boule pour un gel donné (respectivement 41 et 72
pixels pour l'image synthétisée). Chaque profil a donc été analysé
avec chaque logiciel en utilisant des rayons de balle de 20, 41,
72 et 144 (94 pour BIO-1D car il s'agissait de la taille maximale
autorisée par le logiciel). TotalLab Quant et BIO-1D ne nécessitent
pas la redéfinition des pics lors de la modification de la taille de la
balle, et des rayons supplémentaires de 5 et 10 ont été ajoutés pour
ces logiciels.
La soustraction de fond avec le programme basé sur Matlab
fonctionnait différemment. Après avoir essayé de développer
une procédure de calcul automatisée pour dériver des profils
de bruit de fond à partir de gels DGGE, il a été observé qu'un
ajustement manuel était le meilleur et, peut-être, le seul moyen
de tracer correctement une ligne entre la zone des pics et
l'arrière-plan. Cet ajustement manuel était basé sur
l'observation attentive de l'image du gel. Les profils de fond ont
été obtenus en classant qualitativement les pics voisins de très
faible à très brillant. Il a été observé qu'un profil de fond très
proche des pics ' root donne plus de poids aux pics les plus
brillants et vice versa. Réglage du niveau de fond plus proche
ou plus éloigné des pics ' root a permis de dessiner l'image la
plus représentative de ce qui est visuellement véhiculé par
l'image. Il faut mentionner que ce processus est itératif.
Pendant le processus de quantification, si un pic est
disproportionné par rapport à ses voisins ou si son écart-type
optimisé est significativement différent de tous les autres pics,
il peut être nécessaire d'ajuster le profil de fond en
conséquence.
Délimitation et quantification des pics
Dans les quatre logiciels considérés, les pics ont été
quantifiés à l'aide de deux approches générales différentes.
L'approche partagée par TotalLab Quant et BIO-1D consiste
à délimiter les pics par deux droites. Les pics sont ensuite
quantifiés en additionnant l'intensité du fond.

profil soustrait entre ces lignes. En revanche, GelCompar II et le
framework basé sur Matlab ajustent les PDF gaussiens sous les pics
(Eq. 1 ). Cet ajustement est effectué manuellement dans GelCompar
II, tandis que le framework basé sur Matlab optimise
automatiquement et simultanément de nombreux pics. Pour le
cadre basé sur Matlab, les analyses de profil sont effectuées dans
de nombreux cycles d'optimisation. Dans une boîte de dialogue
interactive, l'analyste saisit des informations sur la position centrale
des pics à quantifier (moins de 10 pics pour chaque tour). Les
positions centrales sont déterminées directement à partir de
l'image du gel DGGE visualisé avec n'importe quel logiciel d'édition
d'image. Après la convergence de l'algorithme, les pics optimisés
sont tracés par rapport au profil analysé. L'analyste peut accepter
ou rejeter les résultats. Si elle est rejetée, la routine d'optimisation
peut être exécutée à nouveau avec différentes positions centrales
initiales ou avec moins ou plus de pics. Le programme est exécuté à
plusieurs reprises jusqu'à ce que les pics soient acceptés. Les
paramètres PDF résultants sont ensuite enregistrés et
l'optimisation passe à d'autres pics, jusqu'à ce que le profil entier
soit analysé. Les pics d'abondance sont finalement déterminés à
partir des amplitudes PDF.
Représentativité des profils de dominance basés sur le DGGE
Bien qu'un niveau de similitude de 97% soit choisi dans presque toutes
les enquêtes sur la diversité des communautés bactériennes basées sur
le séquençage, il est douteux que la valeur ait une signification lors de
l'analyse des modèles de bandes DGGE. Si toutes les bandes DGGE
étaient générées par une seule OTU, les RAD tirés de la quantification
des pics seraient très similaires aux RAD produits par séquençage d'un
ensemble de données regroupées au niveau de similitude de 100%.
Étant donné que les bandes DGGE sont connues pour se superposer
dans une certaine mesure, les ensembles de données utilisés pour
générer des profils in silico ont été ensuite regroupés à l'aide du pipeline
RDP [ 23 ], avec des niveaux de similitude allant de 96 à 100%. Cette étape
vise à déterminer si le processus de superposition de bandes d'ADN est
numériquement similaire au regroupement de séquences d'ADN à un
niveau de similitude spécifique. Par souci de simplicité, dans le contexte
particulier de cette publication, les RAD et les indices de diversité
calculés à partir des ensembles de données de pyroséquençage utilisés
pour générer les profils DGGE in silico seront appelés les vrais RAD et vraie
diversité pour un certain niveau de similitude.
Le rapport crête / signal (PSR = 1 - SBP), un paramètre
analogue au SBP introduit par Loisel et al. [ 15 ], a été extrait
de tous les profils DGGE in silico. Pour chaque échantillon,
le PSR a été calculé comme la surface sous tous les pics
divisée par la surface sous l'ensemble du profil. Le bruit de
fond ajouté sous les profils DGGE lors de la synthèse de
l'image a été soustrait avant le calcul des PSR. Ce paramètre
représente le pourcentage de toutes les séquences d'ADN
chargées dans un profil DGGE contenues dans les OTU les
plus abondantes (les pics). Le reste appartient aux OTU pas
assez abondantes pour produire un
J. Lalande et coll.
bande visible sur le gel. Ces OTU ne sont d'ailleurs pas
prises en compte dans les estimations de diversité
produites par la DGGE et seront traitées par le cadre
d'élongation (présenté ci-dessous).
Enfin, étant donné que les petits pics peuvent ne pas être très
représentatifs des véritables profils de dominance communautaire,
les RAD basés sur la DGGE ont été tronqués en soustrayant tous les
pics avec des abondances relatives inférieures à un certain seuil.
Puisqu'il était impossible de choisir objectivement un seuil
approprié, des pourcentages entre 0 et 3,0% (par incréments de
0,2%) ont été successivement utilisés afin d'identifier la valeur
optimale pour les analyses ultérieures. Cette troncature a été jugée
nécessaire car il a été observé que les radios réelles et basées sur la
DGGE s'écartaient à une certaine valeur d'abondance relative. Les
valeurs PSR ont été modifiées pour prendre en compte les pics qui
ont été supprimés des RAD basés sur la DGGE.
Pour comparer les profils de dominance communautaire basés sur le
DGGE et les véritables profils de dominance communautaire, les
véritables RAD ont dû être modifiés. Pour tous les échantillons, les vraies
distributions ont été tronquées en conservant le même nombre d'OTU
que le nombre de pics au-dessus du pourcentage de coupure. Les vrais
PSR ont ensuite été calculés comme le nombre de séquences dans les
RAD tronquées divisé par le nombre de séquences dans les distributions
complètes. Enfin, comme la quantification de la bande DGGE donne des
résultats en abondance relative, les vrais RAD ont été transformés en
conséquence. Cette troncature a conduit au calcul d'indices de diversité
biaisés et n'a été utilisée qu'à des fins de comparaison. La
représentativité des profils de dominance basés sur la DGGE a été
évaluée à l'aide de quatre indicateurs. Le premier indicateur a été utilisé
pour vérifier si les PSR peuvent être extraits avec précision des profils
DGGE:
1. Δ PSR: pourcentage d'écart des PSR basés sur la DGGE
par rapport aux vrais PSR calculés à partir du regroupement des ensembles de
données de séquençage;
Étant donné que l'objectif principal de cet article était de
déterminer si le DGGE pouvait être utilisé en toute confiance pour
évaluer la diversité des communautés bactériennes du sol, deux
indices de diversité omniprésents ont été calculés pour caractériser
les RAD représentant les communautés. ' profils de dominance. Ces
indices ont été calculés à l'aide du logiciel PAST [ 26 ].
2. Δ H ′: Pourcentage d'écart de Shannon basé sur DGGE
indices des valeurs attendues correspondantes;
3. Δ 1/ RÉ: Pourcentage d'écart de Simpson basé sur DGGE ' s
1/ ré indices à partir des valeurs attendues correspondantes.
Afin de caractériser davantage la similitude entre les profils de
dominance DGGE et basés sur le clustering, la distance euclidienne [ 27 ] a
été calculé. Contrairement aux deux indices de diversité précédents,
cette mesure associa chaque pic DGGE à son OTU sous-jacent principal.
Pour ce faire, les postes migratoires théoriques OTU ont été associés à
Quantification de la diversité des communautés bactériennes du sol à partir de la DGGE
emplacements réels des pics dans les profils in silico. Puisque la
mesure a été calculée en utilisant les RAD tronqués produits par
les deux approches, certains pics ne correspondaient à aucune
position théorique OTU et vice versa. Dans ces cas, l'abondance
relative du pic / OTU correspondant a été fixée à 0%.
4. ré EUCLIDEAN: Calculé à l'aide de l'Eq. 2 , où UNE DGGE
correspond aux intensités relatives de crête, UNE OTU représente
les abondances relatives OTU, et n correspond à RAD
longueurs.
q ffi X paramètres α et X min sont des fonctions des valeurs PSR et ont
ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi
n ré
ré EUCLIDÉAN ¼ UNE je DGGE UNE je OTU E 2 ré 2 E été déterminées à l'aide de relations dérivées du vrai
je ¼ 1
Utilisation des PSR pour améliorer les estimations de la diversité basées sur le DGGE
En utilisant les valeurs de PSR extraites des profils, un cadre empirique
pour estimer la vraie diversité communautaire de DGGE a été développé.
Étant donné que les profils de dominance basés sur le DGGE et le
pyroséquençage étaient très similaires lors du regroupement des
ensembles de données au niveau de 98%, le cadre a été développé pour
estimer la vraie diversité communautaire à ce niveau de similitude
particulier.
Tout d'abord, les RAD produits par le cadre basé sur Matlab
ont été tronqués en utilisant la valeur seuil optimale (1,0%).
Après la troncature, les RAD ont été normalisés (somme = 1),
multipliés par les PSR correspondants, puis multipliés par
35 000. Cette dernière étape visait à permettre de travailler en
termes d'abondance absolue plutôt que relative. La valeur
35 000 a été choisi parce qu'il était proche du nombre de lectures par
échantillon dans les ensembles de données de pyroséquençage utilisés dans
cette publication.
Les distributions ont ensuite été allongées pour " ajouter " les espèces
qui n'ont pas été prises en compte dans le processus de quantification
des pics. Ce cadre d'élongation a été conçu et calibré en utilisant
uniquement les véritables RAD communautaires. La méthode a ensuite
été appliquée sans autre modification sur les résultats du DGGE. Bien
que la log-normale, la loi de puissance et les distributions géométriques
soient les modèles d'abondance les plus couramment utilisés pour
décrire les communautés bactériennes du sol, elles n'ont pas été en
mesure d'ajuster correctement les véritables RAD. La distribution de la
loi de puissance (PLD, Eq. 3 ) a fourni un ajustement acceptable si un
paramétrage distinct du modèle est utilisé pour prédire les valeurs
d'abondance moyenne et faible. En commençant juste après le dernier
pic DGGE au-dessus de la valeur de coupure optimale, le cadre
d'élongation a donc été divisé en deux étapes distinctes, toutes deux
basées sur l'Eq. 3 .
PLD ré X Þ ¼ X min X une
La première étape a allongé les RADs basés sur DGGE tronqués
jusqu'à ce qu'une richesse de 699 soit atteinte en utilisant un
exposant PLD ( α) de 0,875 pour tous les échantillons. L'abscisse ( X
valeur en Eq. 3 ) produisant une abondance juste en dessous de celle du
dernier pic retenu a été sélectionné comme point de départ X valeur de
l'allongement. Cette abscisse initiale était distincte pour tous les
échantillons et une fois déterminée, elle était augmentée de un à chaque
fois qu'une espèce était ajoutée au RAD. L'autre paramètre
de l'Eq. 3 , X min, variait entre 500 et 3000 et a été optimisé pour
chaque échantillon afin d'assurer la continuité dans le
les valeurs d'abondance à la jonction des deux étapes d'élongation.
La deuxième étape d'élongation a produit des valeurs d'abondance
pour les espèces de rang 700 et plus. Dans cette deuxième étape, le
rang d'espèce correspondait aux valeurs d'abscisses. Le PLD
RAD communautaires (Eqs. 4 et 5 ). Pour les deux étapes
d'élongation, les valeurs d'abondance prévues ont été arrondies à
l'entier le plus proche. Considérant que le cadre d'élongation était
conçu pour fonctionner en abondance absolue, lorsqu'une valeur
de 1 était atteinte, des singletons étaient ajoutés jusqu'à ce que la
somme de l'abondance de toutes les espèces soit égale à 35 000.
Chiffre 1 présente une représentation schématique du cadre
d'allongement.
une ¼ 0: 267 PSR 0: 935 ré 4 E
X min ¼ 5; 034 PSR e 3; 656 ré 5 E
Il faut souligner que le cadre d'élongation produit des
distributions qui ne suivent pas un modèle d'abondance particulier.
En effet, les têtes RAD sont tirées de la quantification des pics et
sont sans distribution. Les valeurs d'abondance moyenne et faible
sont toutes prédites à l'aide du PLD, mais avec un paramétrage
différent du modèle. Par conséquent, les RAD résultantes ne suivent
généralement pas une loi de puissance.
À l'aide de ces RAD allongées, la diversité de la communauté
bactérienne a été caractérisée par trois indicateurs: la richesse de la
communauté (nombre d'espèces), Shannon et Simpson ' s 1 / ré
indices. Les diversités estimées ont été comparées à la vraie
diversité communautaire au niveau de similitude de 98% (RAD non
tronquées). Tous les indices ont été calculés à l'aide du logiciel PAST
[ 26 ].
Résultats
Représentativité des profils de dominance basés sur le DGGE
Des ensembles de données de pyroséquençage de séquences génétiques
d'ARNr 16S provenant de trois environnements différents ont été regroupés à
ré 3 E
un niveau de similarité de 95, 97 et 100%, générant neuf bactes «théoriques».
communautés riales. Basé sur la théorie T m d'une séquence
représentative unique sélectionnée pour chaque OTU, in silico
Les profils DGGE ont été dérivés (Fig. 2 ).

Fig. 1 Représentation schématique du cadre d'élongation. Le cadre a été
développé avec des ensembles de données de pyroséquençage contenant
environ 35 000 séquences par échantillon. Les RAD allongées étaient donc
considérées comme complètes lorsque l'abondance de toutes les espèces
était additionnée à cette valeur. L'exemple est donné à titre d'exemple
Chaque profil in silico a été analysé de 17 manières (programmes
logiciels et tailles de billes), et les RAD résultants ont été tronqués à
l'aide de diverses valeurs de coupure et comparés aux ensembles de
données de pyroséquençage correspondants regroupés en utilisant cinq
niveaux de similitude différents (de 96 à 100%). Cette méthodologie a
généré une quantité importante de données, et les résultats complets
sont présentés sous forme de ressources en ligne (ESM 1 .xlsx). Pour
synthétiser les résultats, les paramètres jugés optimaux pour tout
l'échantillon - les paires de logiciels sont présentées dans le tableau 1 . Les
paramètres optimaux correspondent à la taille de la balle et au niveau
de similitude qui ont permis de répondre à des critères prédéfinis ( Δ PSR, Δ
H ′, et Δ 1/ ré ≤ ± 10%) sur la plus large plage de valeurs de coupure. La
stabilité des indicateurs pour différentes valeurs seuils a été considérée
comme un aspect très important à prendre en compte car le hasard seul
peut donner de bons résultats pour un pourcentage seuil spécifique.
Une version plus complète de Table 1 , qui présente également les
valeurs moyennes du
Fig. 2 Image du gel synthétisée à
partir des ensembles de données
publiés par Nacke et al. [ 21 ]
J. Lalande et coll.
BF 100%, et les résultats du processus d'élongation peuvent être comparés avec
le vrai RAD. Les résultats ne sont présentés que pour le rang d'espèce sous
1200 pour la lisibilité, mais la richesse réelle de cet échantillon était d'environ
9 500
indicateurs sur l'ensemble de la plage de coupure rapportée, est
présentée sous forme de ressources en ligne (ESM 2 .pdf). Tableau 2 présente
également les paramètres jugés optimaux pour chaque logiciel.
Cependant, comme l'analyse de profil DGGE implique
traditionnellement l'utilisation d'une seule taille de boule pour tous les
échantillons chargés sur un gel donné, les paramètres présentés dans le
tableau 2 ont été sélectionnés en considérant les neuf échantillons
simultanément. Le pourcentage de coupure optimal était également
limité à une seule valeur. Chiffre 3 présente le
moyenne Δ PSR, Δ H ′, Δ 1/ RÉ, et ré EUCLIDÉAN valeurs produites par
chaque logiciel lorsque les paramètres présentés dans
Tableau 2 sont utilisés.
Les différences dans les résultats présentés dans les tableaux 1 et 2
pour les trois logiciels commerciaux sont remarquables. En prenant
TotalLab Quant comme exemple, un rayon de balle de 20 n'a jamais été
jugé optimal lorsque l'on considère les échantillons individuellement.
Pourtant, cette taille de balle a été sélectionnée comme la meilleure
Quantification de la diversité des communautés bactériennes du sol à partir de la DGGE

Tableau 1 Paramètres optimaux

obtenus pour tout l'échantillon - Programme informatique Goûter Taille de balle optimale Niveau de similitude le plus proche Plage de coupure

paires de logiciels
Cadre basé sur Matlab FUG 100% - 98% 0,4 - 3.0
BF 100% - 98% 0,4 - 3.0
SAF 100% - 98% 0,4 - 1,8
FUG 97% - 98% 0,6 - 3.0
BF 97% - 97% 1.2 - 3.0
SAF 97% - 98% 0,6 - 3.0
FUG 95% - 98% 0,4 - 3.0
BF 95% - 98% 0,4 - 3.0
SAF 95% - 98% 0,2 - 3.0
TotalLab Quant FUG 100% dix 96% 2.2 - 3.0
BF 100% 5 100% 0,8 - 3.0
SAF 100% dix 98% 0,8 - 2.2
FUG 97% 5 100% 2,8 - 3.0
BF 97% 5 96% 2,0 - 3.0
SAF 97% 5 97% 2,8 - 3.0
FUG 95% Rien - -
BF 95% dix 98% 1.0 - 3.0
SAF 95% dix 97% 1.0 - 3.0
GelCompar II FUG 100% 41 96% 0,6 - 1,8
BF 100% 72 96% 1.0 - 3.0
SAF 100% 72 97% 0,4 - 1,6
FUG 97% 20 96% 0,6 - 3.0
BF 97% 20 96% 0,6 - 0,8
SAF 97% 72 96% 1.0 - 3.0
FUG 95% 20 96% 0,2 - 3.0
BF 95% 20 100% 0,4 - 3.0
SAF 95% 20 98% 0,6 - 3.0
BIO-1D FUG 100% Rien - -
BF 100% 5 99% 0,4 - 3.0
SAF 100% dix 100% 0,8 - 3.0
FUG 97% Rien - -
BF 97% 41 97% 0,0 - 3.0
Les valeurs de taille de balle et de niveau
SAF 97% 41 99% 0,8 - 3.0
de similarité ont été sélectionnées comme
celles générant simultanément Δ PSR,
FUG 95% 20 97% 0,0 - 0,2
Δ H ′, et Δ 1/ ré valeurs inférieures BF 95% Rien - -
à ± 10% sur la plus large plage SAF 95% 41 100% 0,6 - 3.0
de valeurs de coupure

compromis lors de l'examen simultané de tous les échantillons. Le cadre basé sur Matlab s'est avéré donner des résultats très stables
Cette observation est également vraie pour le niveau de sur tous les échantillons. En effet, les RAD basés sur la DGGE et les vrais
similitude qui a permis de minimiser les différences entre DGGE RAD étaient très proches lorsqu'un niveau de similitude de 98%
et RAD à base de pyroséquençage. a été choisi - la seule exception étant BF 97% pour lequel le

Tableau 2 Paramètres permettant de

minimiser les valeurs des indicateurs Programme informatique Taille de balle optimale Valeur limite optimale Niveau de similitude le plus proche

lorsqu'ils sont simultanément

considérant tous les échantillons Cadre basé sur Matlab - 1,0% 98%
TotalLab Quant 20 1,6% 96%
GelCompar II 41 1,0% 96%
BIO-1D 41 0,4% 98%

Fig. 3 Valeurs de l'indicateur
obtenu en utilisant les paramètres
présentés dans le tableau 2 , rapportée
comme la moyenne des neuf échantillons.
Barres d'erreur correspondent au
maximum et au minimum
valeurs. Toutes les mesures de diversité
ont été calculées à l'aide de RAD
tronquées
Le niveau de 97% a donné de meilleurs résultats. Ce cadre a permis une
extraction précise des échantillons de PSR à partir des profils.
Parmi les indices testés, H ′ a présenté une très bonne correspondance entre les
RAD basés sur DGGE et les vrais RAD. Cependant, il a été constaté que cet indice était
davantage influencé par la longueur des RAD que par les profils de dominance
communautaire. Étant donné que, à des fins de comparaison, les longueurs de
distribution ont été forcées d'être égales pour les deux approches, il n'est pas
surprenant que H ′
présentait une très faible variabilité pour tous les échantillons et
programmes logiciels. En tant qu'indice de dominance, Simpson ' s 1 / ré était communauté, les indices de diversité présentés jusqu'à présent ne sont
beaucoup plus dynamique et est donc un meilleur indicateur que
H ′ pour comparer des logiciels. En moyenne, le framework basé
sur Matlab a mieux performé que les autres logiciels avec Δ 1/ ré proche
et Simpson ' s 1 / ré indices calculés à partir des profils de dominance
de ± 5% pour tous les échantillons, sauf
BF 97%. Les quatre logiciels ont donné une valeur de distance
euclidienne moyenne similaire autour de 10 - 12%.
Utilisation des PSR pour améliorer les enquêtes sur la diversité basées sur la DGGE
Sur la base de communautés simulées, Loisel et al. [ 15 ] a montré
que le pourcentage de fond de sous-unité, un indicateur analogue
au PSR, était lié à la richesse de la communauté. Chiffre 4
montre la relation entre les PSR extraits de la DGGE
Fig. 4 PSR extraits des profils DGGE in silico à l'aide du cadre basé sur
Matlab par rapport à la véritable richesse communautaire à un niveau de
similitude de 98%
J. Lalande et coll.
profils utilisant le cadre basé sur Matlab et une véritable richesse
communautaire à un niveau de similitude de 98%. Ce niveau de
similitude a été choisi car il s'est avéré être celui qui correspondait
le mieux à l'étendue de l'agrégation des pics de DGGE. Considérant
qu'une relation entre le RPS et la richesse est clairement visible, ce
paramètre peut être considéré comme utile pour estimer la
diversité communautaire à partir de RAD partiels basés sur la
DGGE.
Calculés uniquement à partir du profil de dominance de la
pas corrélés à la diversité de l'ensemble de la communauté [ 16 ]. Tableau 3
illustre la comparaison entre la richesse, Shannon H ′,
basés sur la DGGE ou allongés à l'aide des PSR avec les indices réels
correspondants (RAD non tronqués) à un niveau de similitude de
98%.
Discussion
Représentativité des profils de dominance basés sur le DGGE
À la lumière des résultats complets produits pour cet article (ressources
en ligne ESM 1 .xlsx), on peut conclure que les paramètres analytiques
influencent fortement les enquêtes de diversité basées sur la DGGE des
communautés bactériennes complexes. L'algorithme utilisé pour mettre
en œuvre la méthode de soustraction de fond de boule roulante, le
rayon de boule choisi et la façon dont les pics sont délimités et quantifiés
influencent tous les résultats dans une certaine mesure. L'étape la plus
influente est sans aucun doute la soustraction du bruit de fond. En effet,
en partageant le même algorithme de balle roulante, TotalLab Quant et
GelCompar II se sont comportés de manière similaire alors que BIO-1D
était complètement différent. En outre, les valeurs des indicateurs
étaient très dynamiques pour les modifications de la taille de la balle
pour tous les logiciels. Il faut souligner qu'aucune taille de boule ne
convient également à tous les échantillons.
Comme présenté dans le tableau 1 , la similitude correspondante la plus proche
le niveau n'était pas le même pour tous les échantillons lorsque le bruit
de fond du profil DGGE était soustrait à l'aide d'approches à billes
roulantes. Cette observation implique principalement qu'il est
Quantification de la diversité des communautés bactériennes du sol à partir de la DGGE
Tableau 3 Écart des estimations de diversité basées sur la DGGE par rapport aux indices calculés à l'aide des RDA réels non tronqués
Indice de diversité Méthodologie analytique Écart relatif par rapport à l'indice réel
Moyenne
Richesse Quantification des pics - 99,3%
Cadre d'allongement 4,5%
Shannon Quantification des pics - 52,6%
Cadre d'allongement 2,9%
Simpson 1 / ré Quantification des pics - 88,6%
Cadre d'allongement 3,7%
Les indices basés sur la DGGE ont été calculés uniquement à partir des pics quantifiés (avec un seuil de 1,0%) ou en utilisant les RAD allongés. Les résultats sont présentés
comme la moyenne, le minimum et le maximum des neuf échantillons, ainsi que la pente et le coefficient de détermination générés par l'analyse de régression linéaire
impossible de savoir sur quelle base les échantillons sont comparés
lorsque les profils DGGE sont analysés à l'aide d'algorithmes
automatisés de soustraction de fond. Les conclusions qui peuvent
être tirées des études de diversité basées sur la DGGE des
communautés bactériennes du sol - au moins lorsque les profils sont
analysés à l'aide des trois logiciels commerciaux testés dans cette
publication - sont donc très limités. Il n'a pas été possible d'identifier
une relation entre la véritable diversité de la communauté et le
rayon de balle optimal.
Les résultats produits par le cadre basé sur Matlab qui a été développé
étaient complètement différents. En effet, les valeurs moyennes des
indicateurs associés à cette méthodologie étaient toutes très proches de zéro
(sauf pour les distances euclidiennes, discutées plus loin) et ont généré des
barres d'erreur plutôt étroites. De plus, les résultats étaient stables sur une
large gamme de valeurs seuils et cohérents dans tous les échantillons. Plus
important encore, c'est la seule méthodologie qui a permis d'extraire des PSR
précis des profils DGGE. La capacité de ce cadre à correspondre de manière
cohérente aux échantillons ' le véritable profil de dominance à un niveau de
similitude de 98% ne doit pas être considéré comme une coïncidence.
L'utilisation de PDF gaussiens optimisés pour délimiter et quantifier les pics
était une fonctionnalité intéressante car elle permettait de déterminer les
bandes générées par deux OTU presque en cours de migration. Cependant, la
cohérence du cadre était principalement associée à l'ajustement manuel des
profils d'arrière-plan qui permettait de traiter chaque échantillon de manière
égale, tandis que les approches à billes roulantes se sont avérées fortement
dépendantes de la façon dont les pics se superposaient dans les profils. Il faut
reconnaître que cette approche a été longue et difficile au début et a donc
nécessité une certaine formation. Travailler avec des gels DGGE in silico s'est
avéré être un très bon moyen de produire de tels ensembles de formation. En
effet, les vrais gels DGGE partageaient beaucoup de similitudes avec les profils
in silico,
La valeur seuil qui devait être appliquée aux RAD basés sur DGGE afin de
correspondre aux vrais RAD était étonnamment élevée:
1,0% pour le framework basé sur Matlab. En effet, plus de
Régression linéaire
Min Max Pente R2
- 99,7% - 98,3% - 4.5E - 05 0,006
- 10,8% 30,5% 0,93 0,969
- 59,2% - 41,5% - 3.7E - 02 0,075
0,4% 7,1% 1,16 0,992
- 95,7% - 74,2% 3.1E - 03 0,009
- 3,2% 9,3% 0,94 0,996
la moitié des pics quantifiés sont soustraits lors de l'utilisation d'une telle
valeur de coupure élevée. En fait, on a trouvé que la superposition des
bandes se produisait assez localement et que les profils d'arrière-plan
variaient de manière irrégulière sur les longueurs de profil. Pour les
ensembles de données utilisés pour cette publication, le contexte était
élevé au niveau des profils ' centre mais bas à leurs débuts et fins. Par
conséquent, les OTU plutôt rares généreront des pics distincts dans les
régions où le bruit de fond est faible, tandis que les OTU plus
abondantes migrant dans les régions de fond élevé ne le seront pas. Ces
bandes faibles ont donc généré des divergences entre les RAD basés sur
la DGGE et les véritables RAD et ont dû être soustraites.
Un objectif important de cet article était d'évaluer l'étendue du
regroupement des bandes DGGE. À partir des profils DGGE in silico
produits ici, lors de l'étude de communautés bactériennes complexes du
sol, les événements de co-migration peuvent être considérés comme la
norme plutôt que comme l'exception. Comme l'ont démontré sans
ambiguïté d'autres auteurs [ 9 ], on peut s'attendre à ce que toutes les
bandes DGGE contiennent de nombreux OTU différents. Travailler avec
des profils in silico a conduit à l'observation que les pics sont
effectivement formés par l'ajout d'un phylotype dominant et de
nombreux phylotypes rares. Même si un grand nombre d'OTU avaient le
exactement le même calculé T m et donc co-migré sur les profils
in silico (les positions OTU ont été prédites à partir du
séquences calculées T m), cas dans lesquels deux dominants
Les OTU partageaient le même T m n'ont été observés dans aucun échantillon. Il est
important de garder à l'esprit que cette situation pourrait
se produisent dans d'autres échantillons. Pour tous les échantillons, il
était encore possible d'identifier certains pics formés par la co-migration
exacte de nombreux phylotypes mi-dominants, conduisant à l'apparition
d'une bande DGGE dominante. Les valeurs de distance euclidienne
présentées à la Fig. 3 étaient principalement attribuables à la présence
de certains pics importants sans OTU dominantes correspondantes.
Pour certains échantillons, la présence d'une OTU très abondante dans
les vrais RAD associés à une bande DGGE ayant une abondance relative
beaucoup plus faible a également eu un impact significatif sur les
distances euclidiennes résultantes. Cette

s'est produit lorsque deux OTU, toutes deux dominantes à 100% de
similitude, se sont regroupées lors du choix d'un niveau inférieur. Les
bandes DGGE correspondant à ces OTU ne se sont pas regroupées sur le
gel. Compte tenu du manque de pouvoir de résolution des séquences
génétiques de l'ARNr 16S pour identifier les bactéries au niveau de
l'espèce [ 11 ], il est impossible de déclarer sans ambiguïté que ces OTU
doivent être regroupées. Pourtant, les distances euclidiennes, des
valeurs relativement faibles indiquent clairement que la plupart des pics
de DGGE étaient associés à une OTU dominante ayant une abondance
relative quantitativement comparable.
On peut donc en conclure que les pics DGGE et les séquences d'ADN
se regroupent de deux manières différentes. Les pics se regroupent sur
la base de leurs propriétés de fusion plus que sur la base de la similitude
des séquences base à base. Bien entendu, les propriétés de fusion sont
liées à la composition des séquences mais une forte similitude base à
base ne garantit pas que deux séquences migreront à une position
similaire, au moins dans les profils DGGE in silico. Bien que de nature
différente, les deux processus ont systématiquement donné des profils
de dominance comparables à un niveau de similitude de 98%, une valeur
qui pourrait légèrement changer pour les gels DGGE expérimentaux.
Utilisation des PSR pour améliorer les enquêtes sur la diversité basées sur la DGGE
Sur la base de simulations numériques ou d'études de pyroséquençage,
une RAD d'une communauté bactérienne du sol typique peut être
décrite avec certitude comme longue [ 3 , 19 , 28 ], plutôt raide pour les
phylotypes les plus abondants, puis décroissant lentement vers une
valeur d'abondance relative asymptotique (doubletons et singletons) [ 13 ,
17 , 20 ]. Le cadre d'élongation développé pour cet article visait à
reproduire ces caractéristiques. Comme présenté sur la Fig. 4 , la capacité
à extraire avec précision les PSR des profils est une condition préalable
importante pour estimer la véritable diversité communautaire à partir
de la DGGE.
Le cadre d'élongation présenté ici a été développé en utilisant neuf
échantillons provenant de seulement trois ensembles de données de
pyroséquençage distincts. Les nombreuses étapes de regroupement
impliquées peuvent avoir modifié la forme des RAD résultants. En
utilisant plus d'ensembles de données, couvrant de nombreux
environnements différents et contenant suffisamment de lectures par
échantillon pour atteindre le plateau des courbes de raréfaction, il serait
possible de développer un cadre plus robuste ajustable aux nombreux
types de sols / environnements différents que les chercheurs peuvent
étudier. Bien que très empirique, ce cadre plutôt simple s'est avéré très
efficace pour prédire la véritable diversité communautaire en utilisant à
la fois les modèles Shannon et Simpson. ' s 1 / ré indices. Comme présenté
dans le tableau 3 , toutes les estimations de diversité étaient exactes à ±
10% et fortement corrélées avec les vrais indices à 98% de similitude.
Ces valeurs sont bien meilleures que celles produites avant l'élongation
RAD, même si ces distributions partielles se sont révélées être
hautement représentatives des véritables profils de dominance
communautaire à 98% de similitude.
J. Lalande et coll.
Pour certains échantillons, la divergence de la richesse
communautaire était supérieure à ± 10%. Pour certains
échantillons, la divergence de la richesse communautaire était
supérieure à ± 10%. Ces différences en soi n'ont pas été considérées
comme une lacune importante puisque le cadre d'élongation ne
visait pas spécifiquement à prédire avec précision la richesse de la
communauté. L'utilité du cadre réside dans sa capacité à considérer
la véritable domination de la communauté et à apporter H ′ et 1/ ré
calcul des indices à des valeurs de richesse plus élevées et plus
réalistes. Les résultats de Narang et Dunbar, entre autres, ont
montré que les indices de diversité sont moins sensibles à la
richesse à ces valeurs élevées [ 13 ]. Pour 1/ RÉ, le cadre d'élongation
présenté ici est quelque peu similaire à la méthodologie publiée par
Loisel et al. [ 29 ]. Ces auteurs ont proposé l'utilisation d'un facteur
de correction, également basé sur le niveau de bruit de fond, pour
estimer avec précision 1 / ré valeurs des empreintes digitales. En
tant qu'indice de dominance, 1 / ré s'est avérée très sensible aux
OTU ayant les plus fortes abondances. Son calcul peut donc être
considéré comme assez robuste au cadre d'allongement mais doit
s'appuyer sur une étape précise de quantification des pics.
Comme indiqué par Hill et al. [ 12 ], H ′ donne plus de poids
que 1 / ré à des espèces rares et constitue essentiellement un
intermédiaire entre la richesse de la communauté et l'indice de
Simpson. Cet indice est donc moins affecté par le pas de
quantification des pics que 1 / ré mais nécessite une estimation
acceptable de la richesse de la communauté pour être précise.
Au cours de l'élaboration du cadre d'allongement, il a été
observé que la précision de H ′ dépendait davantage du nombre
d'espèces rares que de la trajectoire des RAD. Par conséquent,
tant que la richesse prédite était assez précise, l'utilisation de
telle ou telle distribution d'abondance pour l'étape d'élongation
RAD n'a pas changé. H ′ de plus de ± 10%, même si la
correspondance entre les RAD allongé et vrai n'était pas très
bonne. Il sera donc important de valider que le cadre
d'allongement proposé est capable de produire des prédictions
de richesse communautaire acceptables sur des - et plus difficile - échantillon
avant d'utiliser ces valeurs. Cependant, il sera toujours possible
d'adapter le paramétrage du modèle à différentes situations
(paires d'amorces, environnements étudiés, etc.) chaque fois
que nécessaire.
Une question qui demeure est l'utilité des enquêtes de diversité
traditionnelles basées sur la DGGE qui reposent uniquement sur les pics
quantifiés. Tableau 3 montre clairement que ces enquêtes sous-estiment
fortement la diversité des communautés bactériennes du sol. Plus
important encore, à partir des indices de diversité présentés sous forme
de ressources en ligne (ESM 3 .pdf), il a été observé que ces études sont
susceptibles de conduire à des conclusions écologiques erronées, ne
montrant souvent aucune différence entre les échantillons lorsque des
échantillons importants existent ou prédisant parfois le contraire.
En conclusion, le cadre présenté dans cet article s'est
avéré très efficace pour estimer la vraie communauté
Quantification de la diversité des communautés bactériennes du sol à partir de la DGGE
diversité des neuf profils DGGE in silico analysés. Bien que seulement
Shannon et Simpson ' s 1 / ré les indices ont été évalués, la très bonne
correspondance entre tous les RAD basés sur la DGGE et les vraies
communautés RAD à 98% de similitude conduit à l'hypothèse que le
cadre estimera avec précision tout indice de diversité influencé par la
structure communautaire plus que la richesse. De nature imparfaite, les
gels DGGE expérimentaux sont beaucoup plus difficiles à analyser que
l'image synthétisée ici. Par conséquent, lorsqu'on travaille avec des
résultats expérimentaux, on peut s'attendre à ce que les écarts par
rapport à la vraie diversité communautaire soient plus élevés. Pour le
moment, il n'est pas possible de fournir une estimation quantitative de
l'écart attendu. Des biais potentiellement importants dans les ensembles
de données de séquençage, souvent liés au contenu de la séquence GC,
ont été signalés [ 30 - 33 ]. Tant que ces problèmes ne seront pas résolus,
la question de savoir si les plates-formes de séquençage de nouvelle
génération offrent ou non une base plus solide que la DGGE pour
estimer quantitativement la diversité de la communauté bactérienne du
sol reste une question ouverte qui mérite une plus grande attention.
Remerciements Les auteurs reconnaissent le soutien financier du
Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada. Le
CIRAIG tient également à remercier ses partenaires industriels pour leur
soutien financier: ArcelorMittal, Bell Canada, Bombardier, Cascades,
Mouvement des caisses Desjardins, Groupe Électricité de France / Gaz de
France, Eco Entreprises Québec, Hydro-Québec, Johnson & Johnson,
Groupe Louis Vuitton Moët Hennessy, Michelin, Nestlé, Recyc-Québec,
Rio Tinto Alcan, RONA, Société des alcools du Québec, Solvay, Total,
Umicore et Veolia Environnement.
Les références
1. Hooper DU, Chapin FS, Ewel JJ, Hector A, Inchausti P, Lavorel S, Lawton JH,
Lodge DM, Loreau M, Naeem S, Schmid B, Setälä H, Symstad AJ,
Vandermeer J, Wardle DA (2005) Effects de la biodiversité sur le
fonctionnement des écosystèmes: un consensus des connaissances
actuelles. Ecol Monogr 75 (1): 3 - 35. doi: 10.1890 / 04-0922
2. Girvan MS, Campbell CD, Killham K, Prosser JI, Glover LA (2005) La diversité
bactérienne favorise la stabilité de la communauté et la résilience
fonctionnelle après une perturbation. Environ Microbiol 7 (3): 301 -
313
3. Roesch LFW, Fulthorpe RR, Riva A, Casella G, Hadwin AKM, Kent AD,
Daroub AH, Camargo FAO, Farmerie WG, Triplett EW (2007) Le
pyroséquençage énumère et met en contraste la diversité
microbienne du sol. ISME J 1: 283 - 290
4. Van der Heijden MGA, Bardgett RD, Van Straalen NM (2008) La majorité
invisible: les microbes du sol comme moteurs de la diversité végétale et
de la productivité dans les écosystèmes terrestres. Ecol Lett 11 (3): 296 - 310.
doi: 10.1111 / j.1461-0248.2007.01139.x
5. Simon C, Daniel R (2011) Analyses métagénomiques: tendances passées et
futures. Appl Environ Microbiol 77 (4): 1153 - 1161. doi: 10.1128 /
aem.02345-10
6. Nakatsu CH (2007) Analyse de la communauté microbienne du sol
par électrophorèse sur gel à gradient dénaturant. Soil Sci Soc Am J
71: 562 - 571. doi: 10.2136 / sssaj2006.0080
7. Myers RM, Maniatis T, Lerman LS (1987) Détection et localisation des
changements de base unique par électrophorèse sur gel en gradient
dénaturant. Dans: Ray W (ed) Methods in enzymology, vol 155.
Académique, San Diego, pp 501 - 527. doi: 10.1016 / 0076-6879 (87)
55033-9
8. Sheffield VC, Cox DR, Lerman LS, Myers RM (1989) La fixation d'une
séquence riche en G + C de 40 paires de bases (GC-clamp) à des
fragments d'ADN génomique par la réaction en chaîne par polymérase
permet d'améliorer la détection des -base change. Proc Natl Acad Sci 86
(1): 232 - 236
9. Schmalenberger A, Tebbe CC (2003) Diversité bactérienne dans les
rhizosphères de maïs: conclusions sur l'utilisation de profils génétiques
basés sur des gènes d'ARNr partiels de petites sous-unités amplifiés par
PCR dans les études écologiques. Mol Ecol 12 (1): 251 - 262. doi: 10.1046 / j
.1365294X.2003.01716.x
10. Stackebrandt E, Goebel BM (1994) Note taxonomique: une place pour
l'ADN - Réassociation de l'ADN et analyse de la séquence de l'ARNr 16S
dans la présente définition d'espèce en bactériologie. Int J Syst Bacteriol
44 (4): 846 - 849. doi: 10.1099 / 00207713-44-4-846
11. Rosselló-Mora R, Amann R (2001) Le concept d'espèce pour les
procaryotes. FEMS Microbiol Rev 25 (1): 39 - 67. doi: 10.1111 / j.1574-
6976.2001.tb00571.x
12. Hill TCJ, Walsh KA, Harris JA, Moffett BF (2003) Utilisation de mesures
de diversité écologique avec des communautés bactériennes. FEMS
Microbiol Ecol 43: 1 - 11
13. Narang R, Dunbar J (2004) Modélisation de l'abondance des espèces bactériennes
à partir d'enquêtes sur de petites communautés. Microb Ecol 47 (4): 396 - 406.
doi: 10.1007 / s00248-003-1026-7
14. Magurran AE (2004) Mesure de la diversité biologique. Blackwell
Science, Oxford
15. Loisel P, Harmand J, Zemb O, Latrille E, Lobry C, Delgenès JP, Godon JJ
(2006) Denaturing gradient electrophoresis (DGE) and single-brand
conformation polymorphism (SSCP) Molecular fingerprintings
revisited by simulation and used as a tool pour mesurer la diversité
microbienne. Environ Microbiol 8 (4): 720 - 731. doi: 10.1111 /
j.1462-2920.2005.00950.x
16. Blackwood CB, Hudleston D, Zak DR, Buyer JS (2007) Interprétation des indices de
diversité écologique appliqués aux données de polymorphisme de longueur des
fragments de restriction terminale: aperçus de communautés microbiennes simulées.
Appl Environ Microbiol 73 (16): 5276 -
5283. doi: 10.1128 / aem.00514-07
17. Doroghazi JR, Buckley DH (2008) Preuve de GC-TRFLP que les communautés
bactériennes dans le sol sont distribuées de façon log-normale. PLoS One 3 (8):
e2910. est ce que je: 10.1371 / journal.pone.0002910
18. Dunbar J, Barns SM, Ticknor LO, Kuske CR (2002) Diversité bactérienne
empirique et théorique dans quatre sols de l'Arizona. Appl Environ
Microbiol 68 (6): 3035 - 3045. doi: 10.1128 / aem.68.6.3035-3045.2002
19. Gans J, Wolinsky M, Dunbar J (2005) Les améliorations informatiques révèlent une grande
diversité bactérienne et une forte toxicité des métaux dans le sol. Science 309 (5739):
1387 - 1390. doi: 10.1126 / science.1112665
20. JE nceo g lu Ö, Al-Soud WA, Salles JF, Semenov AV, van Elsas JD
(2011) Analyse comparative des communautés bactériennes dans un champ de
pommes de terre telles que déterminées par pyroséquençage. PLoS One 6 (8): e23321.
est ce que je: 10.1371 / journal.pone.0023321
21. Nacke H, Thürmer A, Wollherr A, Will C, Hodac L, Herold N, Schöning I,
Schrumpf M, Daniel R (2011) Évaluation basée sur le pyroséquençage de
la structure des communautés bactériennes le long de différents types de
gestion dans les sols forestiers et de prairies allemands. PLoS One 6 (2):
e17000. est ce que je: 10.1371 / journal.pone.0017000
22. The NCBI Sequence Read Archive (SRA) (2012) Consulté le 1er
août 2012
23. Cole JR, Wang Q, Cardenas E, Fish J, Chai B, Farris RJ, KulamSyed-Mohideen AS, McGarrell
DM, Marsh T, Garrity GM, Tiedje JM (2009) The Ribosomal Database Project: des
alignements améliorés et de nouveaux outils pour Analyse d'ARNr. Acides nucléiques
Res 37 (1): 141 -
145. doi: 10.1093 / nar / gkn879
24. Khandelwal G, Bhyravabhotla J (2010) Un modèle phénoménologique pour
prédire les températures de fusion des séquences d'ADN. PLoS One 5 (8):
e12433. est ce que je: 10.1371 / journal.pone.0012433

25. Hutton JR (1977) Cinétique de renaturation et stabilité thermique de l'ADN
dans des solutions aqueuses de formamide et d'urée. Acides nucléiques
Res 4 (10): 3537 - 3555. doi: 10.1093 / nar / 4.10.3537
26. Hammer O, Ryan P, Harper D (2001) PAST: progiciel de statistiques
paléontologiques pour l'éducation et l'analyse des données.
Paléontol Electron 4 (1): 9
27. Legendre P, Legendre L (1998) Écologie numérique. Deuxième édition
anglaise. Développements dans la modélisation environnementale 20.
Elsevier, Amsterdam
28. Fierer N, Breitbart M, Nulton J, Salamon P, Lozupone C, Jones R,
Robeson M, Edwards RA, Felts B, Rayhawk S, Knight R, Rohwer
F, Jackson RB (2007) Les analyses d'ARNr métagénomiques et de petites
sous-unités révèlent la diversité génétique des bactéries, des archées, des
champignons et des virus dans le sol. Appl Environ Microbiol 73 (21): 7059 - 7066
29. Loisel P, Hamelin J, Godon JJ, Haegeman B, Harmand J (2009) Une
méthode pour mesurer la diversité biologique d'un échantillon.
Brevet européen EP20553401
J. Lalande et coll.
30. Dohm JC, Lottaz C, Borodina T, Himmelbauer H (2008) Des biais substantiels dans
des ensembles de données de lecture ultra-courtes provenant du séquençage
d'ADN à haut débit. Acides nucléiques Res 36 (16): e105. est ce que je: 10.1093 /
nar / gkn425
31. Jaenicke S, Ander C, Bekel T, Bisdorf R, Dröge M, Gartemann K-
H, Jünemann S, Kaiser O, Krause L, Tille F, Zakrzewski M, Pühler
A, Schlüter A, Goesmann A (2011) Analyse comparative et conjointe de deux
ensembles de données métagénomiques d'un fermenteur de biogaz obtenu
par pyroséquençage au 454. PLoS One 6 (1): e14519. est ce que je: 10.1371 /
journal.pone.0014519
32. Pinard R, de Winter A, Sarkis G, Gerstein M, Tartaro K, Plant R,
Egholm M, Rothberg J, Leamon J (2006) Evaluation du biais induit par
l'amplification du génome entier par séquençage massivement
parallèle du génome entier à haut débit . BMC Genomics 7 (1): 216
33. Pinto AJ, Raskin L (2012) Les biais de PCR déforment la structure des communautés
bactériennes et archéennes dans les ensembles de données de pyroséquençage. PLoS
One 7 (8): e43093. est ce que je: 10.1371 / journal.pone.0043093