Études phytochimiques et activités anti-inflammatoires

d’extraits de plantes médicinales du Congo Brazzaville

Ghislaine Boungou-Tsona

To cite this version:

Ghislaine Boungou-Tsona. Études phytochimiques et activités anti-inflammatoires d’extraits de
plantes médicinales du Congo Brazzaville. Chimie organique. Université Clermont Auvergne; Univer-
sité Marien-Ngouabi (Brazzaville), 2023. Français. �NNT : 2023UCFA0009�. �tel-04353429�

HAL Id: tel-04353429

https://theses.hal.science/tel-04353429
Submitted on 19 Dec 2023

HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d’enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.
 UNIVERSITE CLERMONT AUVERGNE

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES FONDAMENTALES

THESE
présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR D’UNIVERSITE
Spécialité : Chimie Organique

Par
Ghislaine BOUNGOU-TSONA

Diplômée du Master de Chimie de l’Université Marien Ngouabi

Études phytochimiques et activités anti-inflammatoires d’extraits de

plantes médicinales du Congo Brazzaville

Soutenue publiquement le 06/01/2023, devant le jury :

Prof. Florence CALDEFIE-CHEZET Examinatrice Université Clermont Auvergne

Dr. Marine PEUCHMAUR
Prof. Ange Antoine ABENA
Prof. Aubin Nestor LOUMOUAMOU
Prof. Pierre CHALARD
Dr. Isabelle RIPOCHE
Dr. Caroline DECOMBAT
Dr. Kévin BIKINDOU
Rapporteure Université Grenoble Alpes
Rapporteur Université Marien Ngouabi
Directeur de thèse Université Marien Ngouabi
Co-directeur de thèse Clermont Auvergne INP
Invitée Clermont Auvergne INP
Invitée Université Clermont Auvergne
Invité Université Marien Ngouabi
A Dieu soit la gloire !

In memoriam

Mon père Aloïse Boungou

Mon oncle Fidèle Goma-Tondo
Herald Robert Boungou
Herman Paty Makaya
 Dédicaces

A tous les BOUNGOU

A tous les neveux et nièces
A une étoile toujours présente
 Remerciements

Je tiens à remercier vivement le Professeur Aubin Nestor LOUMOUAMOU pour avoir cru en
moi, pour la confiance qu’il m’a accordée en acceptant ma candidature au sein de son
laboratoire et d’être le directeur de cette thèse. Je loue également votre implication sans faille
pour l’obtention d’un financement qui m’a permis de réaliser dans les bonnes conditions mes
recherches en France et au Congo. Vos multiples conseils m’ont toujours redonné le courage
d’avancer. Vous avez été présent tout au long de ces années de thèse. Soyez rassuré de toute
ma gratitude et ma reconnaissance.

Je tiens à remercier le Professeur Pierre CHALARD, d’avoir accepter d’être le directeur de

cette thèse, de m’avoir accueilli au sein de l’équipe CESMA. En vous rendant disponible durant
les trois années de stage à Clermont, vous m’avez vraiment guidé dans la réalisation de ce
travail qui n’aurait pu se faire sans vos compétences scientifiques. Votre rigueur dans le travail,
vos conseils, vos encouragements et votre sympathie (« Ghislaine pas de honte entre nous, tu
ne dois pas repartir avec tes questions et inquiétudes, n’hésite jamais à poser tes questions
même les plus idiotes… ») m’ont permis d’atteindre mes objectifs. J’ai beaucoup appris auprès
de vous Professeur et j’en suis très reconnaissant.

Mes vifs remerciements à Isabelle RIPOCHE, Maître de conférences, pour son dévouement
dans l’encadrement de ce travail de recherche malgré ses multiples occupations, sa simplicité,
sa bonne humeur et son sens d’humour en voulant me faire peur pendant les manips. Ce travail
n’aurait pu se réaliser sans vos connaissances scientifiques. Veuillez trouver ici l’expression de
mon immense gratitude et ma reconnaissance.

Je remercie également le Professeur Florence CALDEFIE-CHEZET pour m’avoir ouvert les

portes de son laboratoire, au sein de l’équipe ECREIN, pour la réalisation des tests biologiques
durant ces trois années de thèse. Malgré vos multiples occupations, vous avez accepté de
présider mon jury.

Je tiens à remercier le Professeur Ange Antoine ABENA qui, malgré ses multiples occupations,
a consacré une partie de son temps précieux pour examiner ce travail. Trouver ici, professeur,
l’expression de mon immense gratitude et mon respect.

Mes remerciements vont à l’endroit de Madame Marine PEUCHMAUR, Maître de

conférences, qui m’a fait l’honneur de lire et juger ce travail. Trouver ici l’expression de ma
gratitude.
Je tiens à remercier Laetitia DELORT et Caroline DECOMBAT, Maître de conférences, pour
leur encadrement et leur implication dans la réalisation des tests biologiques.

Mes remerciements vont aussi à l’endroit de Kévin BIKINDOU, Maitre-Assistant à l’université

Marien NGOUABI pour ses aides multiformes. Tu as toujours été présent depuis le début de ce
projet, tu as organisé les jours de récoltes de la matière végétales, tu as toujours tout assuré sans
rien attendre en retour. Merci d’être cette oreille qui écoute toujours mes doléances. Tu as
apporté beaucoup de tes connaissances scientifiques dans la réalisation de ce travail. Tu m’as
toujours rassuré que tout ira bien et tu me dis toujours « Ghis chaque thèse à son histoire ».
Trouve ici l’expression de ma profonde gratitude "Monsieur l’assistant du chef".

Je n’oublie pas Marion VERMERIE et Lucie LONGECHAMP, techniciennes au laboratoire

d’études fongiques pharmaceutiques, équipe ECREIN pour m’avoir initié aux techniques de
laboratoire.

Mes remeriements à l’endroit de Monsieur Martin LEREMBOURE de l’Université Clermont

Auvergne qui a réalisé les analyses de masse.

J’exprime ma gratitude à Isabelle ABRUNHOSA-THOMAS pour m’avoir montré pour la

première fois l’utilisation de la chromatographie flash.

Je dis merci au Docteur Mael GAINCHE a qui je posais des questions sur l’utilisation de
certains appareillages au laboratoire.

Mes remerciements à Ernest BITEMOU et Jaynereuse NOMBAULT mes amis de lutte qui sont
maintenant docteurs. Merci pour les moments de convivialité au laboratoire et même en dehors
du laboratoire. Votre soutien moral par vos appels m’a permis d’évacuer le stress à tout
moment.

Je n’oublie pas mon collègue doctorant Houzel-Mampouty BOUNKOSSO qui était toujours
présent pendant la période des collectes de la matière végétale même si tu nous avais poiroté en
fermant ton téléphone parce que tu avais jugé de ne pas partir à la récolte ce jour-là. Je n’oublie
pas mes amis sans distinction qui ont formulé d’énormes paroles d’encouragement à mon égard
durant ces années de thèse. Ils étaient présents de manière permanente, surtout pendant les
moments d’incertitude et de découragement.

Mes remerciements à Relian De-Filber MAKOUAGOU pour son soutien multiforme. Tes
conseils m’ont permis d’avancer et d’avoir confiance en moi-même. Merci pour ton
accompagnement tout au long de ce fastidieux parcours.
Mes remerciements à l’endroit de tous les enseignants de la formation doctorale Transformation
Alimentaire des Agroressources (T2A). Sans cette formation doctorale je n’aurai pas pu réaliser
mes travaux de thèse. Je rends hommage au Professeur Moutsamboté qui a quitté ce monde
avant la fin de cette thèse, pour les précisions sur la systématique des deux plantes étudiées.

J’adresse ma profonde gratitude à Monsieur Syviney Franck Laurel BAKANAHONDA pour

m’avoir aidé à confectionner la carte de la zone de récolte des espèces végétales qui ont fait
l’objet de cette thèse.

Je dis merci à tous les collègues de l’équipe CESMA pour des moments de convivialité passés
ensemble, surtout pendant les repas de midi.

J’adresse ma gratitude au Service de Coopération et d’Actions Culturelles de l’ambassade de

France au Congo-Brazzaville et à Campus France pour avoir mis en œuvre les différentes
mobilités.

En fin je remercie les héros dans l’ombre qui ont contribué de près ou de loin dans la réalisation
de ce travail.
 Sommaire
Pages

Introduction…………………………………………………………………………………………………………………… 1
Chapitre I : la douleur et l’inflammation………………………………………………………………………… 7
I. La douleur……………………………………………………………………………………………………………… . 9
I.1 - Les douleurs aigües…………………………………………………………………………………………… 9
I.2 - Les douleurs chroniques……………………………………………………………………………………. 10
I.3 - Les douleurs nociceptives………………………………………………………………………………….. 10
I.4 - Les douleurs neuroptahiques…………………………………………………………………………….. 11
I.5 - Les douleurs psychogènes…………………………………………………………………………………. 12
II. L’inflammation………………………………………………………………………………………………………… 12
II.1 - Etudes épidémiologiques de l’inflammation…………………………………………………….. 12
II.2 - Les différents processus inflammatoires………………………………………………………….. 13
II.3 - L’inflammation et les radicaux libres oxygénés………………………………………………… 15
II.4 - Les Traitements de la douleur et de l’inflammation…………………………………………. 16
II.4.1 - Les anti-inflammatoires de synthèse…………………………………………………………….. 16
II.4.1.1 - Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS)……………………………………….. 16
II.4.1.2 - Les anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS)………………………………………………... 18
II.4.2 - Les traitements à base de plantes…..…………………………………………………………….. 18
Chapitre II : Métabolites secondaires et potentiel anti oxydant / anti-inflammatoire…… 21
I. Les composés phénoliques………………………………………………………………………………………... 23
I.1 - Les acides phénoliques.……………………………………………………………………………………… 23
I.2 – Le flavonoïdes…………………………………………………………………………………………………… 24
II. Les alcaloïdes………………..………………………………………………………………………………………... 26
II.1 - Les alcaloïdes vrais…...………………………………………………………………………………………. 26
II.2 - Les pseudo-alcaloïdes……………………………………………………………………………………….. 27
II.3 - Les proto-alcaloïdes………………………………………………………………………………………….. 27
III. Les terpènes………………..……………………………………………………………………………………….... 27
III.1 - Les monoterpènes…...……………………………………………………………………………………… 28
III.2 - Les sesquiterpènes…………………………………………………………………………………………... 29
II.3 - Les diterpènes.…………………………………………………………………………………………………. 29
III.4 - Les triterpènes et les stéroïdes.……………………………………………………………………….. 29
Chapitre III : Vitex madiensis Oliv.…………………………………………………………………………………… 31
I. Le genre Vitex et Vitex madiensis Oliv.……………………………………………………………………... 33
I.1 - Eléments botaniques.…………………………………………………………………………………………. 33
I.1.1 - Le genre Vitex ………………………………………………………………………………………………. 33
I.1.2 - Vitex madiensis Oliv……………………………………………………………………………………… 33
I.2 - Utilisation de Vitex madiensis en médecine traditionnelle…………………………………. 35
I.3 - Phytochimie du genre Vitex et de Vitex madiensis……………………………………………… 38
I.3.1 - Phytochimie du genre Vitex………………………………………………………………………….. 38
I.3.2 - Phytochimie de l’espèce Vitex madiensis..…………………………………………………….. 45
II. Travaux réalisés sur Vitex madiensis.……………………………………………………………………….. 46
II.1 - Collecte du matériel végétal………………………………………………………………………………. 46
II.2 - Obtention des extraits……………………………………………………………………………………….. 46
II.3 - Dosage des polyphénols et des flavonoïdes totaux……………………………………………. 47
II.4 - Variation saisonnière du profil chimique des différents extraits………………………… 49
II.4.1 - Profils chimiques des extraits de feuilles.…………………………………………………….. 50
II.4.2 - Profil chimique des extraits des écorces de tronc ………………………………………… 55
II.4.3 - Profil chimique des extraits des écorces de racines ……………………………………… 58
II.4.4 - Profil chimique de l’extrait des fruits……………………..……………………………………… 62
 II.4.5 - Comparaison du profil phytochimique des quatre organes de V. madiensis..… 65
II.5 - Evaluation du potentiel antiradicalaire et antioxydant des extraits …………………… 67
II.5.1 - Evaluation du potentiel antiradicalaire par le piégeage du radical DPPH.……… 68
II.5.2 - Corrélation entre potentiel antiradicalaire et teneur en polyphénols totaux… 71
II.5.3 - Potentiel antioxydant des extraits de V. madiensis……………………………………….. 71
II.5.3.1 - Cinétique de la production des ROS dans les différents extraits………………. 72
II.5.3.2 – Impact des extraits sur la production de ROS.………………………… ……………………… 74
II.6 - Effet des extraits bruts sur la viabilité cellulaire……………………………..…………………… 77
II.7 - Etude bioguidée des extraits bioactifs…………………………………………………………………. 79
II.7.1 - Fractionnement de l’extrait VMFE1……………………………………………………………….. 79
II.7.1.1 - Profils phytochimiques des fractions………………………………………………………….. 81
II.7.1.2 - Potentiel antioxydant des fractions………………………………………………………….. 84
II.7.1.2.1 - Méthode intracellulaire de production de ROS des fractions………………. 84
II.7.1.2.2 - Effet des fractions sur la viabilité cellulaire………………………………………….. 86
II.7.1.3 - Fractionnement de la fraction E4-BuOH …………………………………………………... 87
II.7.1.4 - Détermination structurale des composés isolés………………………………………… 89
II.7.1.4.1 - Identification de la 20-hydroxyecdysone……………………………..………………. 89
II.7.1.4.2 - Identification de l’ajugastérone C…………………………………………………………. 90
II.7.1.4.3 - Identification de la vitexirone……………………………………………………………….. 91
II.7.1.4.4 - Identification de la pterostérone………………………………………………………….. 93
II.7.1.5 - Activité antioxydante et potentiel anti-inflammatoire des phytoecdystéroïdes
Isolés.…………………………………………………………………………………………………………. 95
II.7.1.5.1 - Méthode intracellulaire de production de ROS des phytoecdystéroïdes
Isolés.……………………………..………………………………………………………………………….. 95
II.7.1.5.2 - Effet des phytoecdystéroïdes isolés sur la viabilité cellulaire….…………….. 96
II.7.1.5.3 - Evaluation de l’activité anti-inflammatoire de la 20-hydroxyecdysone ... 96
II.7.2 - Fractionnement de l’extrait VMET1………………………………………………………………... 98
II.7.2.1 - Profils phytochimiques des fractions obtenues………………………………………….. 99
II.7.2.2 - Evaluation du potentiel antioxydant des fractions par la méthode de ROS... 103
II.7.2.3 - Effet des fractions sur la viabilité cellulaire………………………………………………... 104
II.7.3 - Fractionnement de l’extrait VMFR1………………………………………………………………... 105
II.8 - Evaluation du potentiel antiradicalaire par bioautographie HPTLC des extraits bruts,
des fractions et des phytoecdystéroïdes isolés……..……………………………………………….. 106
II.8.1 - Bioautographie HPTLC des extraits bruts …………………………………………………………… 107
II.8.2 - Bioautographie HPTLC des fractions issues de VMFE1………………………………………… 107
II.8.3 - Evaluation de l’activité antiradicalaire des phytoecdystéroïdes isolés par
bioautographie …………………………………………………………………………………………………… 108
II.9 - Dosage de la 20-hydroxyecdysone dans les extraits…………………………………………………. 109
II.9.1 - Dosage par HPLC………………………………………………………………………………………………… 109
II.9.2 - Dosage par HPTLC………………………………………………………………………………………………. 111
II.9.3 - Comparaison entre dosage par HPLC et HPTLC ………………………………………………….. 113
II.9.4 - Corrélation entre les activités biologiques et la teneur en 20-hydroxyecdysone
dans les différents extraits ………………………………………………………………………………….. 114
III. Discussion……………………………………………..………………………………………………………………………. 115
IV. Conclusion du chapitre..………………………..………………………………………………………………………. 116
Chapitre IV : Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) Benth……………………………………………..…. 121
I. Généralités sur Crossopteryx febrifuga …………………………………………………………………………... 123
I.1 - Eléments botaniques………...……………………………………………………………………………………… 123
I.2 - Description de la plante…...………………………………………………………………………………………. 123
I.3 - Répartition géographique…………………………………………………………………………………………. 124
I.4 - Utilisation en médecine traditionnelle………………………………………………………………………. 125
I.5 - Etudes phytochimiques décrites dans la littérature………………………………………………….. 127
 I.6 - Activités biologiques et pharmacologiques recensées dans la littérature………………….. 130
II. Travaux réalisés sur Crossopteryx febrifuga………………………………………….………………………... 131
II.1 - Collecte du matériel végétal……………………………………………………………………………………. 131
II.2 - Obtention des extraits bruts..…………………………………………………………………………………. 131
II.3 - Dosage des polyphénols et des flavonoïdes totaux………………………………………………….. 132
II.4 - Variation saisonnière du profil phytochimique des différents extraits…………………….. 134
II.4.1 - Profils chimiques des extraits de feuilles………………………………………………………….… 133
II.4.2 - Profils chimiques des extraits des écorces de tronc………………………………………….… 138
II.4.3 - Profils chimiques des extraits des écorces de racines…………………………………………. 142
II.4.4 - Profils chimiques des extraits de fruits…………………..……………………………………….…. 146
II.5 - Evaluation du potentiel antiradicalaire et antioxydant des extraits et tests de
Cytotoxicité……………………………………………………………………………………….…………………….. 152
II.5.1 - Evaluation du potentiel antiradicalaire par le piégeage du radical DPPH………….… 152
II.5.2 - Evaluation de l’activité antioxydante par la méthode intracellulaire de
production de ROS………………………………………………………………………………………………. 154
II.5.3 - Effet des extraits sur la viabilité cellulaire……………………………………………..………….… 156
II.6 - Séparation de l’extrait CFFR1 par extraction avec des solvants de polarité croissante. 158
II.6.1 – Profil phytochimique des fractions…………………………………………………………..……….… 159
II.6.2 - Potentiel antioxydant des fractions de CFFR1……………………………………..……….……… 165
II.6.3 - Evaluation de l’activité antiradicalaire de l’extrait CFFR1 et des fractions par
bioautographe HPTLC………..………………………………………………………………………………… 168
III. Discussion……………………………………..………………………………………………………………………………. 169
IV. Conclusion du chapitre……..…………………………………………………………………………………………… 171
Conclusion et perspectives……..………………………………………………………………………………………... 173
Partie expérimentale……..…………………………………………………………………………………………………. 179
Références……..…………………………………………………………………………………………………………………. 213
Annexes……..…………………………………………………………………………………………………………………. 241
 Table des figures
Pages

Figure 1 Zone de récolte des espèces végétales étudiées………………………………… 6

Figure 2 Mécanismes périphériques d’apparition de la douleur………………………… 11
Figure 3 Structures de l’acide arachidonique et des prostaglandines…………… 15
Figure 4 Structures des anti-inflammatoires non stéroïdiens…………………………… 17
Figure 5 Structures des antalgiques de palier 1 et palier 2……………………………… 17
Figure 6 Structures des anti-inflammatoires stéroïdiens………………………………… 18
Figure 7 Structures de quelques acides phénoliques possédant des propriétés antioxydants
et/ou anti-inflammatoires………………………………………………………………… 24
Figure 8 Structures des différentes familles des flavonoïdes…………………………… 25
Figure 9 Structures de la morphine, la caféine et l’atropine……………………………… 26
Figure 10 Structures des pseudo-alcaloïdes……………………………………………… 27
Figure 11 Exemple d’un proto-alcaloïde………………………………………………… 27
Figure 12 Structures du (-) menthol, de l’eugénol et du cholestérol…………………… 28
Figure 13 Structure des sesquiterpènes………………………………………………… 29
Figure 14 Vitex madiensis Oliv………………………………………………………… 34
Figure 15 Iridoïdes contenus dans les fruits de Vitex rotundifolia L.…………………… 38
Figure 16 Terpenoïdes et iridoïdes extraits des espèces du genre Vitex………………… 39
Figure 17 Flavonoïdes extraits des espèces du genre Vitex…………………………… 40
Figure 18 Acides phénoliques et dérivés extraits des espèces du genre Vitex…………… 40
Figure 19 Triterpenoïdes isolés des extraits de Vitex thyrsiflora………………………… 41
Figure 20 Schéma de biosynthèse de la 20-hydroxyecdysone chez les plantes…………. 42
Figure 21 Ecdystéroïdes trouvés dans les espèces du genre Vitex………………………. 44
Figure 22 Courbes d’étalonnages, A : polyphénols totaux, B : flavonoïdes totaux……… 48
Figure 23 Profils chromatographiques des échantillons des feuilles de Vitex madiensis…50
Figure 24 Chromatogrammes des écorces de tronc……………………………………… 55
Figure 25 Chromatogrammes des écorces de racines…………………………………… 58
Figure 26 Structure de shanzhiside identifié dans les extraits d’écorces de racine……… 59
Figure 27 Chromatogramme de l’extrait de fruits…...…………………………………… 62
Figure 28 Pouvoir inhibiteur des extraits de V. madiensis récoltés en saison des pluies à
différentes concentrations………………………………………………………………… 68
Figure 29 Pouvoir inhibiteur des extraits de V. madiensis récoltés en saison sèche…….. 69
Figure 30 Cinétique d’inhibition de la production de ROS par l’extrait de feuilles……... 72
Figure 31 Cinétique d’inhibition de la production de ROS par l’extrait d’écorces de tronc.73
Figure 32 Cinétique d’inhibition de la production de ROS par l’extrait de fruits………... 73
Figure 33 Cinétique d’inhibition de la production de ROS par l’extrait d’écorce de
racine……………………………………………………………………………………... 74
Figure 34 Production de ROS de leucocytes sanguins incubés avec les extraits de V. madiensis
pendant 2 h ………………………………………………………………………………. 75
Figure 35 Cytotoxicité des extraits sur la viabilité cellulaire……………………………. 78
Figure 36 Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante des feuilles de Vitex
madiensis…………………………………………………………………………… 80
Figure 37 Profil chimique de la fraction E1-cyclo……………………………………… 82
Figure 38 Profil chimique de la fraction E2-DCM……………………………………… 82
Figure 39 Profil chimique de la fraction E3-AcOE ...…………………………………… 83
Figure 40 Profil chimique de la fraction E4-BuOH……………………………………… 83
Figure 41 Profil chimique de la fraction E5-H2O………………………………………… 83
Figure 42 Production de ROS des leucocytes sanguins incubés avec les fractions des
feuilles…………………………………………………………………………………… 85
Figure 43 Effet des fractions des feuilles sur la viabilité cellulaire pendant 24 heures…. 86
Figure 44 Schéma de séparation et purification des composés…………………………. 88
Figure 45 Schéma de purification par HPLC-préparative en mode isocratique…………. 89
Figure 46 Structure de la 20-hydroxyecdysone ……………………………………. 90
Figure 47 Structure de l’ajugastérone C ……………………………………………… 91
Figure 48 Structure de la vitexirone…………………………………………………… 93
Figure 49 Structure de la pterostérone………………………………………………… 94
Figure 50 Effet de l’ajugastérone C, de la 20-hydroxyecdysone et de la vitexirone sur la
production de ROS après 2 heures………………………………………………………. 95
Figure 51 Effet de l’ajugastérone C, de la 20-hydroxyecdysone et de la vitexirone sur la
viabilité cellulaire après 2 heures……………………………………………………. 96
Figure 52 Impact de la 20-hydroxyecdysone sur l’expression relative de COX-2 ……… 97
Figure 53 Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante de l’extraits VMET1...98
Figure 54 Profil chimique de la fraction E1-cyclo……………………………………… 100
Figure 55 Profil chimique de la fraction E2-DCM……………………………………… 100
Figure 56 Profil chimique de la fraction E3-AcOEt………………………………… 101
Figure 57 Profil chimique de la fraction E4-BuOH……………………………………… 101
Figure 58 Profil chimique de la fraction E5-H2O…………………………………………102
Figure 59 Production de ROS des leucocytes sanguins incubés avec les fractions de
VMET…………………………………………………………………………………… 103
Figure 60 Viabilité cellulaire des fractions VMET1 pendant 2 heures………………… 104
Figure 61 Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante de l’extrait VMFR1… 105
Figure 62 Schéma de purification par chromatographie flash de la fraction E3-AcOEt… 106
Figure 63 Analyse HPTLC avec dérivatisation du DPPH………………………………. 108
Figure 64 Chromatogramme du standard (20-hydroxyecdysone) ……………………… 109
Figure 65 Chromatogramme HPLC des extraits bruts à 254 nm………………………… 110
Figure 66 Analyse HPTLC avec dérivatisation du standard et des extraits bruts……… 112
Figure 67 Photo de Crossopteryx febrifuga…………………………………………… 124
Figure 68 Structures des composés déjà isolés dans les organes de Crossopteryx
febrifuga………………………………………………………………………………. 129
Figure 69 Profils chromatographiques des feuilles de Crossopteryx febrifuga……………135
Figure 70 Profils chromatographiques des écorces de tronc de Crossopteryx febrifuga… 138
Figure 71 Profils chromatographiques des écorces de racine de Crossopteryx febrifuga…142
Figure 72 Profils chromatographiques des fruits de Crossopterys febrifuga ...................... 146
Figure 73 Structures des composés identifiés dans les organes de Crossopteryx febrifuga..151
Figure 74 Pouvoir inhibiteur des de Crossopteryx febrifuga à différentes concentrations
(saison des pluies)………………………………………………………………………… 152
Figure 75 Pouvoir inhibiteur des extraits de Crossopteryx febrifuga à différentes
concentrations (saison sèche) ............................................................................................. 153
Figure 76 Production de ROS de leucocytes sanguins incubés avec les extraits de
Crossopteryx febrifuga pendant 2 heures……………………………………………….... 155
Figure 77 Cytotoxicité des extraits de Crossopteryx febrifuga sur la viabilité cellulaire… 157
Figure 78 Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante de l’extrait CFFR1… 159
Figure 79 Profil chromatographique de la fraction E1-cyclo …………………………… 159
Figure 80 Profil chromatographique de la fraction E2-DCM…………………………… 160
Figure 81 Profil chromatographique de la fraction E3-AcOEt ………………………… 160
Figure 82 Profil chromatographique de la fraction E4-BuOB…………………………… 161
Figure 83 Profil chromatographique de la fraction E5-H2O…………………………… 161
Figure 84 Production de ROS des leucocytes sanguins incubés avec les fractions de
CFFR1……………………………………………………………………………. 166
Figure 85 Viabilité cellulaire des fractions de CFFR1 pendant 24 heures ……………… 167
Figure 86 Analyse HPTLC avec dérivatisation au DPPH visualisé à la lumière blanche.. 168
Figure 87 Phytoecdystéroïdes isolés à partir des feuilles de Vitex madiensis…………… 176
Figure 88 Photo de la plaque 96 puits pour le suivi de la cinétique de la production de
ROS..………………………………………………………………………………. 190
Figure 89 Photo de la plaque 96 puits pour le suivi de la viabilité cellulaire avec
de la résazurine……………………………………………………………………. 191
Figure 90 Spectre RMN 1H (400 MHz, MeOD) de la 20-hydroxyecdyso………… 251
Figure 91 Spectre RMN 13C (400 MHz, MeOD) de la 20-hydroxyecdysone ………...… 152
Figure 92 Spectre RMN 1H (400 MHz, MeOD) de l’ajugastérone C …...……………… 253
Figure 93 Spectre RMN 13C (400 MHz, MeOD) de l’ajugastérone C ………………… 254
Figure 94 Spectre RMN 1H (400 MHz, MeOD) de la vitexirone ……………………… 255
Figure 95 Spectre RMN 13C (400 MHz, MeOD) de la vitexirone ……………………… 256
Figure 96 Spectre RMN 1H (400 MHz, MeOD) de la pterostérone …………………… 257
Figure 97 Spectre RMN 13C (400 MHz, MeOD) de la pterostérone ………...………… 158
 Table des tableaux
Pages

Tableau 1 Usages de Vitex madiensis en médecine traditionnelle africaine…………… 35

Tableau 2 Rendements d’extraction……………………………………………………… 47
Tableau 3 Teneur en polyphénols et flavonoïdes totaux des différents extraits de Vitex
madiensis…………………………………………………………………………. 78
Tableau 4 Composés identifiés dans les extraits de feuilles de Vitex madiensis………… 52
Tableau 5 Composés identifiés dans les extraits d’écorces de tronc de Vitex madiensis... 56
Tableau 6 Composés identifiés dans les extraits des écorces de racine de V. madiensis… 60
Tableau 7 Composés identifiés dans l’extrait de fruits de Vitex madiensis……………… 61
Tableau 8 Ecdystéroïdes et autres composés identifiés dans les extraits des feuilles, écorces de
troncs, écorces de racine et fruits de Vitex madiensis……………………………………. 65
Tableau 9 Concentrations inhibitrices 50 (CI50) des extraits de Vitex madiensis et de la
vitamine C……………………………………………………………………………… 70
Tableau 10 Principaux composés identifiés dans l’extrait VMFE1……………………… 81
Tableau 11 Principaux composés identifiés dans l’extrait VMET1……………………… 99
Tableau 12 Quantité de la 20-hydroxyecdysone par HPLC dans les extraits de Vitex madiensis
récoltés pendant les deux saisons…………………………………………………. 111
Tableau 13 Concentration de la 20-hydroxyecdysone par HPTLC dans les extraits de Vitex
madiensis de deux saisons………………………………………………………… 113
Tableau 14 Comparaison du dosage de 20-hydroxyecdysone selon la méthode employée
(HPLC vs HPTLC)………………………………………………………………… 113
Tableau 15 Aperçu des usages de Crossopteryx febrifuga.…………………………. 125
Tableau 16 Rendements d’extraction des organes de Crossopteryx febrifuga…………… 132
Tableau 17 Teneur en polyphénols et flavonoïdes totaux des différents extraits de
Crossopteryx febrifuga…………………………………………………………………… 133
Tableau 18 Caractérisation des constituants des extraits des feuilles de Crossopteryx febrifuga
par LC-MS……………………………………………………………………………. 136
Tableau 19 Caractérisation des constituants des extraits des écorces de tronc de Crossopteryx
febrifuga par LC-MS………………………………………………………………. 140
Tableau 20 Caractérisation des constituants des extraits des écorces de racine de Crossopteryx
febrifuga par LC-MS……………………………………………………………… 144
Tableau 21 Caractérisation des constituants des extraits de fruits de Crossopteryx febrifuga
par LC-MS………………………………………………………………………… 148
Tableau 22 Concentrations inhibitrices 50 (CI50) des extraits de Crossopteryx febrifuga.. 154
Tableau 23 Constituants majeurs des cinq fractions de CFFR1…………………… 162
Tableau 24 Codage des échantillons ……………………………………………… 181
Tableau 25 Phase mobile d’élution pour la purification par HPLC-préparative………… 199
Tableau 26 Données RMN (MeOD, 400 MHz) de la 20-hydroxyecdysone…………… 200
Tableau 27 Données RMN (MeOD, 400 MHz) de l’ajugastérone C…...……………… 202
Tableau 28 Données RMN (MeOD, 400 MHz) de la vitexirone………………………… 204
Tableau 29 Données RMN (MeOD, 400 MHz) de la pterostérone………………… 206
Tableau 30 Récapitulatif des constituants majeurs des fractions de VMFE1 ……......... 242
Tableau 31 Résultats des tests de production de ROS à 2 h (VMFE1)………………… 245
Tableau 32 Résultats des tests de production de ROS à 2 h (VMFE2)………................ 245
Tableau 33 Résultats de viabilité cellulaire à 24 h (VMFE1)…………………………… 245
Tableau 34 Résultats de viabilité cellulaire à 24h (VMFE2) 2 h ……………………… 245
Tableau 35 Résultats production de ROS à 2h (VMET1)……………………………. 246
Tableau 36 Résultats production de ROS à 2 h (VMET2)……………………………… 246
Tableau 37 Résultats viabilité cellulaire à 24 h (VMET1)……………………………… 246
Tableau 38 Résultats viabilité cellulaire à 24 h (VMET2)……………………………… 246
Tableau 39 Résultats production de ROS à 2 h (VMRA1) ...…………………………… 247
Tableau 40 Résultats production de ROS à 2 h (VMFR1) ……………………………… 247
Tableau 41 Résultats viabilité cellulaire à 24 h (VMRA1)……………………………… 247
Tableau 42 Résultats viabilité cellulaire à 24 h (VMFR1)……………………………… 247
Tableau 43 Résultats production de ROS à 2 h (CFFE1)……………………………… 248
Tableau 44 Résultats production de ROS à 2 h (CFET1)...…………………………… 248
Tableau 45 Résultats production de ROS à 2 h (CFRA1) ……………………………… 248
Tableau 46 Résultats production de ROS à 2 h (CFFR1)………………………………. 248
Tableau 47 Résultats production de ROS à 2 h (CFFR2) ……………………………… 249
Tableau 48 Résultats viabilité cellulaire à 24 h (CFFE1)……………………………… 249
Tableau 49 Résultats viabilité cellulaire à 24 h (CFET1)……………………………… 249
Tableau 50 Résultats viabilité cellulaire à 24 h (CFRA1)……………………………… 249
Tableau 51 Résultats viabilité cellulaire à 24 h(CFFR2) ……………………………… 249
Tableau 52 Résultats viabilité cellulaire à 24 h (CFFR1) ……………………………… 250
 Abréviations

% Pourcentage
°C Degré Celsius
µg Microgramme
µL Microlitre
µM Micromole
µm Micromètre
Abs Absorbance
ACN Acétonitrile
AcOEt Acétate d’éthyle
AINS Anti-inflammatoires non stéroïdiens
AIS Anti-inflammatoires stéroïdiens
AlCl3 Chlorure d’aluminium
APG Angiosperm Phytogeny Group
ARN Acide ribonucléique
ATP Adénosine triphosphate
BuOH Butanol
CCM Chromatographie sur couche mince
CD3OD Méthanol déteuré
CGRP,SP Neuropeptides substance P and calcitonin gene-related peptide
CI50 Concentration inhibitrice 50
COX Cyclooxygénase
cyclo Cyclohexane
DAD Détecteur à barette de diode
DCM Dichlorométhane
DMAPP Pyrophosphate de diméthylallyle
DMSO Diméthylsulfoxyde
DPPH 2,2 diphényl-1-picrylhydrasyl
DRH123 Dihydrorhodamine 123
DW Dry extract weight ou poids extrait sec
EAG Equivalent d’acide gallique
ECREIN Environnement cellulaire, immunomodulation et nutrition
EDTA Acide éthylenediaminetétraacétique
EPS Etablissement français du sang
EQ Equivalent quercétine
ER Ecorce de racine
ET Ecorce de tronc
ev Électronvolt
Exp. Expérimentale
FB Formule brute
Fe Feuilles
g Gramme
Glu Glucose
GPS Global Position System
h Heure
HPLC Chromatographie liquide haute performance
HPTLC Chromatographie sur couche mine à haute performance
Hz Hertz
IASP Association Internationale pour l’Etude de la Douleur
IL Interleukine
IPP Pyrophosphate de d’isopentényle
IRSEN Institut National de Recherches en Sciences Exactes et Naturelles
j Jour
J Constante de couplage
Kg Kilogramme
kV Kilovolt
L Litre
LC-MS Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
LPS Lipopolysaccharide
M Masse
m/z Masse sur charge
MCC Milieu de culture complèt
MeOH Méthanol
mg Milligramme
MHz Mégahertz
min Minute
mL Millilitre
mM Millimole
mm Millimètre
MNT Maladies Non Transmissibles
MS Matière sèche
MS2 Masse couplée à la masse
NaNO2 Nitrite de sodium
NaOH Hydroxyde de sodium
Nav Canaux sodiques voltage-dépendants
nm Nanomètre
NO Monoxyde d’azote
NOS Espèces réactives de l’azote
OMS Organisation Mondiale de la Santé
ONU Organisation des Nations Unies
PAMP Pathogen Associated Molecular Patterns
PG Prostaglandine
PMA Phorbol myréstate acétate
ppm Partie par million
p Valeur du test statistique de student
PRR Pattern Recognition Recetor
qPCR Réaction de polymérase en chaine quantitative
RCA République centrafricaine
RDC République Démocratique du Congo
RMN Résonance Magnétique Nucléaire
ROS Espèces réactives de l’oxygène
RPMI Roswell Park Memorial Institute
Théo. Théorique
TNF-α Facteur nécrose tumorale alpha
tr Temps de rétention
UA Fluorescence absolue
UFR Unité de Formation et de Recherche
UV Ultra-violet
v Volume
VDr Vitex doniana fruits non murs
Vit C Vitamine C
VFr Vitex fischerii fruits non murs
VKr Vitex kiniensis fruits non murs
VOCCS Canaux calciques voltage-dépendants
δ Déplacement chimique
INTRODUCTION

1
2
 Le bassin du Congo, mosaïque de forêt, de savane, de marécages et de rivières, s’étend
au cœur de la région d’Afrique centrale sur près de 3,7 millions de km2 et couvre principalement
les pays comme le Congo, la République Démocratique du Congo, le Gabon, la centrafrique, le
Cameroun et la Guinée équatoriale. Il présente une diversité faunique mondialement connue à
travers, notamment, l’existence de nombreuses réserves animales dans les différents pays de la
région. Le bassin du Congo jouit également d’une très riche diversité florale avec plus de 10000
espèces de plantes tropicales (Mengho, 2017). Nombre de ces espèces végétales sont
endémiques. D’autres ont été introduites depuis des siècles et y ont trouvé un écosystème
favorable à leur survie grâce à un climat tropical marqué par une pluviométrie abondante. Les
populations autochtones ont toujours trouvé dans cette flore très riche un important réservoir
en ressources naturelles, pour des usages multiples notamment pour l’alimentation ou la
médecine traditionnelle. Malgré l’usage de plus en plus intense de la ʺmédecine moderneʺ, les
plantes constituent encore une ressource importante et bon marché que les natifs du bassin du
Congo exploitent pour leur besoin en santé. Selon l’OMS, à cause de la pauvreté et de
l’insuffisance des structures sanitaires, plus de 80% de la population des pays en voie de
développement ont recours aux plantes pour soigner les pathologies les plus courantes. Les
médicaments modernes ne sont pas toujours à la portée de tout le monde dans ces pays.

L’usage des plantes par l’homme pour différentes nécessités est bien connu depuis
l’antiquité. Cependant, l’intérêt des bienfaits des plantes sur la santé humaine n’a cessé de
croitre au cours du temps grâce notamment aux avancées scientifiques qui ont conduit
progressivement à des technologies permettant d’objectiver les vertus des plantes médicinales.
Ainsi, l’exploration scientifique de ces matrices végétales a révélé, au fil du temps, que les
plantes constituent un réservoir immense de molécules bioactives susceptibles d’améliorer la
qualité de vie de l’homme, sans toutefois méconnaitre leur éventuelle toxicité. Entre 1981 et
2019, parmi les 1328 nouvelles molécules reconnues comme médicaments par les instances
habilitées, 537 sont d’origine naturelle ou possèdent un pharmacophore issu de produits
naturels, 508 sont totalement issues de synthèse mimant un composé naturel (Newman et al.,
2020). La connaissance des propriétés des métabolites secondaires synthétisées par les plantes
est donc un enjeu majeur pour la santé. Par ailleurs, malgré un nombre important d’espèces
identifiées à travers le monde, il s’avère que seules 10% environ des 400 000 espèces végétales
recensées ont été étudiées sur le plan phytochimique et pharmacologique (Gurib-Fakim,
2008).

3
 Une des problématiques de santé parmi les plus importantes, qui mobilise les efforts de
nombreuses équipes de recherche à travers le monde, porte sur le traitement de la douleur et de
l’inflammation. En effet, l’accroissement de la population mondiale, d’une part, et le
vieillissement de plus en plus marqué de cette même population, d’autre part, font qu’un
nombre considérable de personnes développe des maladies liées aux processus inflammatoires.
Actuellement, les médicaments les plus prescrits au monde pour la prise en charge de la douleur
et de l’inflammation sont des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) avec 44% de
prescriptions notamment en France (Danton, 2017). Le plus souvent, on utilise l’aspirine (1 à
2 % de la population mondiale prend fréquemment au moins un comprimé d’aspirine chaque
jour) (Vergne et al., 2000), le diclofénac, l’ibuprofène et les corticoïdes qui sont les dérivés du
cortisol et de la cortisone (Sheiman, 1996 ; Wolfe et al., 1999). Ces médicaments très puissants
et très efficaces peuvent, cependant, avoir des effets secondaires néfastes sur la santé. Ils
présentent notamment une toxicité assez marquée dans le tube digestif en fonction de l’âge des
individus, de la dose prescrite, des antécédents de pathologie ulcéreuse ou de l’utilisation
prolongée ou répétée de ces thérapeutiques (Bardou et al., 2003). Il s’avère donc important de
disposer d’un ensemble thérapeutique suffisamment varié afin de trouver des alternatives à cette
problématique de santé publique sans cesse croissante. L’étude scientifique des plantes et de
leurs métabolites ayant des potentialités anti-inflammatoires sont susceptibles de contribuer au
développement des nouvelles molécules pour aider à la prise en charge des maladies afférentes.
Les produits naturels extraits à partir des plantes médicinales, et le respect d’une alimentation
équilibrée, représentent des sources d’agent antioxydant jouant un rôle majeur dans la
protection des lésions engendrées par les radicaux libres et la guérison de nombreuses maladies
liées à l’inflammation (Sen et al., 2011).

Le laboratoire de Chimie des Substances Naturelles de l’Institut National de Recherches

en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) de l’Université Marien Ngouabi du Congo
Brazzaville, en collaboration avec la thématique Conception Extraction et Synthèse de
Molécules Antalgiques (CESMA) de l’équipe Chimie Organique et Médicinale (COM) de
l’Institut de Chimie de Clermont-Ferrand (ICCF, France), a mis en place un programme de
recherche sur l’étude chimique des plantes médicinales utilisées dans la pharmacopée
traditionnelle congolaise pour le traitement des maladies inflammatoires. C’est dans ce cadre
que s’inscrivent nos travaux de recherche. Ainsi, notre démarche repose sur l’extraction des
métabolites secondaires des plantes utilisées par les populations et l’évaluation de leurs effets,
en particulier l’étude de leur potentiel anti-inflammatoire, dans le but de valider certaines des

4
pratiques des tradithérapeutes. Nous avons sélectionné pour cette études deux plantes
congolaises utilisées en médecine traditionnelle pour soulager la douleur et la fièvre :
Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) Benth. (Rubiaceae) et Vitex madiensis Oliv.
(Lamiaceae). En général, ces deux espèces poussent dans les régions tropicales et subtropicales
à travers le monde. On les trouve notamment dans les zones de savane des pays d'Afrique de
l'Ouest, de l'Est et du Centre (Salawu et al., 2008 ; Chantaranothai, 2011 ; Adjanohoum,
1988).

Vitex madiensis et Crossopteryx febrifuga poussent en zone de savane au Congo, pays

de 342 000 km² et comptant une population de 4 662 446 habitants. La zone du bassin du Congo
est parmi les dernières régions dans le monde à offrir une vaste continuité forestière d’une
importance écologique majeure. Le Congo est situé à cheval sur l’Equateur, entre la latitude
Nord 3° 30’ et la latitude Sud 5°, entre la longitude Est 11° et 18° 45’. Il est limité : au nord par
le Cameroun et la République Centrafricaine, à l’est par la République Démocratique du Congo,
à l’ouest par le Gabon et au sud par le Cabinda.
Les deux espèces végétales sélectionnées pour cette étude ont été collectées au sud du Congo
dans la zone du plateau des cataractes (figure 1). La zone est arrosée principalement par le
fleuve Congo et est caractérisée par le climat tropical humide de type bas congolais avec des
précipitations qui varient entre 1200 et 1700 mm (saison des pluies). Pendant la saison sèche
(juin-septembre), les températures les plus basses peuvent atteindre jusqu’à 9° C. Les sols du
plateau des cataractes sont ferrallitiques moyennement désaturés.

Notre étude s’inscrit dans un vaste programme qui vise à objectiver l'usage des pratiques
traditionnelles concernant les deux plantes étudiées et à proposer des axes d'amélioration de
cette médecine traditionnelle en réalisant des modes d'extractions spécifiques enrichissant les
extraits en principes actifs d'intérêt.

Le premier chapitre de ce mémoire sera consacré à une revue bibliographique sur la

douleur et l’inflammation. Le second chapitre donnera un descriptif des métabolites secondaires
que l’on rencontre dans certaines espèces végétales. Les deux chapitres suivants seront
consacrés à l’étude phytochimiques des extraits et du potentiel anti-inflammatoire des deux
espèces choisies, à savoir Vitex madiensis et Crossopteryx febrifuga.

5
Figure 1. Zone de récolte des espèces végétales étudiées

6
 Chapitre I

la douleur et l’inflammation

7
8
 La douleur et l’inflammation sont deux manifestations souvent indissociables
rencontrées dans plusieurs pathologies. L’inflammation constitue, de ce fait, la principale cause
de douleur. Les deux processus étroitement reliés représentent un problème de santé publique
majeur à travers le monde, car plus de 40% de la population mondiale présente des pathologies
impliquant l’un et/ou l’autre. Le fait de ressentir la douleur est en effet le premier motif de
consultation dans les services d’urgences ou chez les thérapeutes traditionnelles, ou encore
l’envie de le soulager soi-même (Mäntyselkä et al., 2001 ; Geenen et al., 2018). Elle touche
particulièrement les populations les plus vulnérables, notamment les personnes d’âge avancé.

I. La douleur

Selon la définition officielle de l’Association Internationale pour l’Etude de la Douleur

(IASP), la douleur est une "expérience sensorielle et émotionnelle désagréable associée à une
lésion tissulaire réelle ou potentielle ou décrite dans ces termes". La douleur représente plus de
90 % des causes de consultation (Le Bars et al., 2004), elle fait l’objet de nombreuses études,
aussi bien fondamentales que cliniques. Sur le plan physiologique, il est important d’éviter toute
confusion avec d’autres termes tels que la souffrance ou le stress qui sont cependant souvent
associés à la douleur. La douleur est une expérience subjective qui interfère autant avec le
psychique et le social qu’avec les fonctions physiques. Elle met des obstacles à
l’accomplissement des tâches quotidiennes et aux mouvements les plus élémentaires de
l’existence (Le Breton, 2017). La douleur est inhérente à la nature même de la vie, même si
son action est toujours à double tranchant et ambivalente. Il existe deux grands types de
douleurs : les douleurs aigües et les douleurs chroniques.

I.1- Les douleurs aigües

La douleur aigüe joue un rôle d’alarme qui va permettre à l’organisme de réagir et de se

protéger face à un stimulus mécanique, chimique ou thermique. Elle est liée à des stimulations
intenses qui déclenchent immédiatement un mécanisme de transmission d’informations depuis
les terminaisons nerveuses vers les récepteurs de la douleur appelés nocicepteurs (Calvino,
2007). Les douleurs aigües sont de courte durée et sont dues à une cause bien précise. Ces
douleurs disparaissent en principe lorsque l’on en supprime les causes. La douleur aigüe est une
douleur vive, soudaine et souvent limitée.

9
 I.2- Les douleurs chroniques

Ces douleurs s’inscrivent dans la durée, sur une période supérieure à trois mois. Ce sont
des maladies ʺà part entièreʺ qui nécessitent une prise en charge. Plus d’un milliard et demi de
personnes souffrent de douleurs chroniques dans le monde. Parmi elles, les personnes d’âge
plus avancé sont les plus touchées, de même que les femmes (Global Industry Inc., 2015 ;
Demyttenaere et al., 2006). Près de 20 millions de français, soit environ 30 % de la population
adulte, souffrent de douleurs chroniques ʺrebellesʺ. La France a été l’un des premiers pays
déterminés à lutter contre la douleur chronique en mettant en place plusieurs plans
gouvernementaux (Queneau et al., 2018). Cependant, moins de 3 % des patients bénéficient
d’une prise en charge dans des centres spécialisés lesquels manquent cruellement de moyens
(Livre blanc, 2017).

La catégorie des douleurs chroniques est hétérogène. Hormis le fait de son inscription
dans la durée, ce type de douleur peut être une simple gêne ou générer une souffrance terrible,
ne frapper que lors de certains mouvements ou à cause de la fatigue ou être là en permanence
en empêchant toute action. La douleur chronique peut être accompagnée de manifestations
psychopathologiques.

Dans la plupart des pays du monde, le nombre de personnes atteintes de pathologies

chroniques est en croissance. L’arthrose et la polyarthrite rhumatoïde sont responsables à elles
seules de 40 % des douleurs chroniques (APM News, 2004). Ce type de douleur résulte d’une
association de plusieurs facteurs notamment physiologiques, pathologiques, émotionnels,
psychologiques, cognitifs, environnementaux et sociaux (Rugiero, 2010).

I.3 – Les douleurs nociceptives

La douleur nociceptive est une douleur périphérique, due à un excès d’influx douloureux
dans le système nerveux et est sensible aux lésions tissulaires. Elle est ainsi liée aux
phénomènes inflammatoires. Les nocicepteurs sont stimulés par les médiateurs de
l’inflammation résultant de la réponse du système immunitaire (Basbaum et al., 2009 ; Chiu
et al., 2012). La stimulation des nocicepteurs est causée par plusieurs substances algogènes
telles que la bradykinine, les ions potassium, l’ATP, la sérotonine, l’histamine, les protons mais
aussi des cytokines, chemokines, médiateurs lipidiques et facteurs de croissance résultant du
système immunitaire (Bertin et al., 2019 ; Guirimand, 2003). La figure 2 présente les
mécanismes périphériques d’apparition de la douleur (Mooser, 2016).

10
 Figure 2. Mécanismes périphériques d’apparition de la douleur (Mooser, 2016).
L’arsenal thérapeutique permettant de traiter les douleurs nociceptives, s’il n’est pas exempt
d’effets secondaires néfastes, est relativement efficace. (Will et al., 2007 ; Caraceni et al.,
2011).

I.4 – Les douleurs neuropathiques

La douleur neuropathique répond à une multiplicité de mécanismes

physiopathologiques qui permettent de rendre compte de la grande diversité de leur expression
clinique (Bouhassira, 2005). Elle est fréquente en rhumatologie, souvent confondue avec les
douleurs nociceptives. Cependant, la physiopathologie des douleurs neuropathiques fait
intervenir des mécanismes périphériques qui sont très souvent exacerbés par le système
sympathique. La connaissance de ces mécanismes permet d’adapter des thérapies efficaces par
rapport à ces altérations (Perrot et al., 2002). Environ 4,5 % de la population mondiale souffre
des douleurs neuropathiques. Le taux d’incidence augmente avec l’âge (Global Industry
Analysts Inc., 2015). En France, d’après une étude épidémiologique, ces douleurs chroniques
neuropathiques touchent environ 7 % de la population adulte (Bouhassira et al., 2008). Les
douleurs neuropathiques se développent en impliquant de nombreux mécanismes
physiologiques complexes. En effet, nombre de mécanismes périphériques impliqués ont été

11
révélés par des analyses expérimentales réalisées sur des modèles animaux. Les plus marqués
sont l’apparition d’activités anormales au sein des nerfs lésés et les transformations
métaboliques susceptibles de conduire à une modification des fibres périphériques (Bouhassira
et al., 2006). Ainsi, les modèles lésionnels impliquent la surexpression des canaux sodiques
ʺvoltage-dépendantʺ (Nav) dans la croissance des douleurs neuropathiques. Ces modèles
mettent en évidence les mutations gains de fonction de gène SCN9A codant pour le canal
Nav1.7 dans les maladies telles que l’érythromélalgie et les syndromes de douleurs
paraxystiques extrêmes. Les canaux potassiques et les canaux calciques voltage-dépendants
(voltage dependant calcium channels [VOCCs]) participent aussi au développement de ces
douleurs (Bouchenaki et al., 2019).

I.5 – Les douleurs psychogènes

La douleur psychogène est liée à des troubles psychiques provoquant une sensation
douloureuse en l’absence de toute lésion apparente d’un organe. Cette douleur est due aux
facteurs psychologiques, émotionnels et comportementaux. Cette douleur, signe de dépression
est retrouvée chez 92 % des patients hospitalisés pour dépression (Serra, 2014). Cette douleur
peut être traitée par des antidépresseurs dont le mode d’action est réputé assez lent.

II- L’inflammation

L’inflammation est considérée comme le phénomène prédominant dans toutes les

pathologies. L’inflammation est une réaction normale du corps qui se protège en cas de lésions.
Elle peut se produire en cas de blessure, par exemple, suite à une entorse, entraine une douleur,
un gonflement, chaleur, rougeur, œdème et même la perte de fonctionnalité. Elle peut être
consécutive à une agression interne comme un cancer mais aussi externe comme une infection.
Cependant, l’inflammation est composée de toute une série de phénomènes, qui se passent dans
l’appareil circulatoire, en partie dans les tissus, se combinant entre eux d’une façon variée
(Ziegle, 1889).

II.1- Etudes épidémiologiques de l’inflammation

Il existe peu d’études épidémiologiques sur la mortalité et les pathologies liées aux
maladies inflammatoires chroniques. Quelques études récentes montrent que l’inflammation est
la cause de maladies chroniques graves, parmi les plus répandues à travers le monde. Ces
maladies sont le cancer, l’arthrite, l’obésité, et même les troubles de comportements (Susan et
al., 2013 ; Institut Pasteur de Lille, 2022). A ces affections s’ajoutent le diabète, l’arthrose,

12
l’infarctus du myocarde qui sont également considérés comme des affections liées au
phénomène inflammatoire. C’est ainsi que l’OMS considère ces affections comme des maladies
non transmissibles (MNT) qui représentent à ce jour près de 63 % des décès dans le monde, soit
37 millions en 2008 (OMS, 2013). L’OMS estime que dans les 63 % des décès causés par les
MNT en 2008 à travers le monde, 48 % de décès étaient principalement causés par des maladies
cardiovasculaires, 21 % dus aux cancers, 12 % aux affections respiratoires chroniques et 3,5 %
au diabète. Cependant, l’OMS met en garde : d’ici à 2030 le nombre de décès annuel dus à des
maladies non transmissibles pourrait atteindre 55 millions si aucune mesure n’est mise en place
à l’échelle mondial. Au vu de la situation accablante, en 2015, l’OMS en collaboration avec
l’ONU a élaboré un plan d’action mondial pour la lutte contre les maladies non transmissibles
à l’horizon 2030, qui consiste à prévenir et réduire d’un tiers le taux de mortalité prématurée
due à des maladies non transmissibles et promouvoir la santé mentale et le bien-être universel.
C’est ainsi qu’en janvier 2022, cette organisation a mis en place la feuille de route 2023-2030
pour accélérer l’application et atteindre durablement les neuf cibles mondiales dans lesquelles
figurent la lutte contre les MNT, pour que chaque individu bénéficie d’une couverture sanitaire
universelle dans le cadre de la prévention et le traitement des MNT (OMS, 2022). Cette décision
implique la lutte contre le diabète, la prévention et la prise en charge de l’obésité à tous les âges
et la malnutrition.

II.2 - Les différents processus inflammatoires

Le processus inflammatoire est induit après l’interaction de substances infectieuses avec

des substances membranaires, ce qui entraine la production de nombreux messagers notamment
les cytokines pro-inflammatoires, en particulier l’interleukine -1 (IL-1) et le tumor necrosis
factor alpha (TNF-). En même temps, les médiateurs de défense anti-inflammatoire se
produisent : c’est la réponse immunitaire (Guillot et al., 2011).

La réponse immunitaire innée est induite par un signal de danger émis suite à
l’interaction spécifique entre des récepteurs appelés PRR (pour « Pattern Recognition
Receptors ») et des molécules appelées PAMP (pour « Pathogen Associated Molecular Patterns
») présentes au niveau des microorganismes, qu’ils soient pathogènes ou non. Il met
principalement en jeu les cellules immunitaires en particulier les neutrophiles, les monocytes et
les macrophages tissulaires. La réponse immunitaire adaptative est une forme de défense contre
les agents infectieux qui se met en place et active les lymphocytes. Ainsi, les cellules

13
immunitaires peuvent être définies comme l’ensemble des cellules impliquées dans la
reconnaissance et la défense du fonctionnement de l’organisme.

On distingue deux types différents de processus inflammatoires : l’inflammation aigüe

et l’inflammation chronique. Le processus inflammatoire aigu est d’une courte durée et il est
caractérisé principalement par l’exsudat de plasma et l’accumulation de lymphocytes.
L’inflammation chronique survient après l’inflammation aigüe, lorsque celle-ci n’a pas été
éliminée ou traitée pendant une période supérieure à trois mois. Les processus inflammatoires
engendrent une sur expression du système immunitaire.

Comme énoncé précédemment, le processus inflammatoire implique la production d’un

grand nombre des médiateurs chimiques qui sont présents dans le sang et les tissus parmi
lesquels se trouvent :

- les cytokines qui sont des petites protéines assurant les communications entre les
cellules. On distingue deux types de cytokines : les cytokines pro-inflammatoires
comme l’interleukine (IL-1, IL-6) et les cytokines anti-inflammatoires comme l’IL-10.
Sous l’action des cytokines, de nombreuses cellules produisent des médiateurs
lipidiques, des enzymes protéolytiques, des radicaux libres et autres facteurs
directement responsables des effets délétères observés. Ces cytokines servent donc de
médiation des différentes informations concernant l’inflammation et mobilisent les
ressources de défense notamment les cellules de l’immunité (Degos et al., 2009 ;
Tracey, 2007).
- les prostanoïdes (prostaglandines, prostacyclines et thromboxanes) qui sont des
substances issues du métabolisme de l’acide arachidonique (AA) (1), jouant un rôle
homéostatique. Les principaux prostanoïdes sont : PGE2 (2), PGI2 (3), PGF2 (4), PGD2
(5) et TXA2 (6).
Ces différents prostanoïdes sont biosynthétisés notamment par deux iso-enzymes : les
cyclooxygénases COX-1 et COX-2. La COX-1 est l’enzyme majeure qui permet de synthétiser
les différentes prostaglandines tandis que la COX-2 n’est pas directement exprimée à l’état
homéostatique (état basal). Elle est induite par les stimuli inflammatoires mais agit en synergie
avec la COX-1 dans les cellules inflammatoires (Tréchot et al., 2014 ; Vial, 2001 ; Jouzeau
et al., 2004). Ces prostaglandines sont en effet responsables de la douleur, de la fièvre et de
l’inflammation. Les structures des prostanoïdes et l’acide arachidonique (AA) sont représentées
dans la figure 3.

14
 Figure 3. Structures de l’acide arachidonique et des prostaglandines

II.3- L’inflammation et les radicaux libres oxygénés

Au cours du processus inflammatoire, les radicaux libres sont produits par

chimiotactisme des cellules immunitaires stimulés par les cytokines. Ils sont très instables et
très réactifs. Les radicaux libres sont de plusieurs types, c’est le cas notamment des espèces
réactives de l’oxygène (ROS) ou les espèces réactives de l’azote (NOS). Ces espèces sont des
messagers importants dans le processus inflammatoire. De plus, l’excès de radicaux libres est
toxique pour l’organisme. Ces radicaux libres sont ainsi considérés comme agents pathogènes
par les cellules. En effet, dans des situations physiopathologiques comme le cancer,
l’athérosclérose, l’asthme, les maladies rhumatismales et le vieillissement, la production de
ROS est plus importante et prolongée et la réponse antioxydante est insuffisante (Migdal et al.,
2001 ; Borel et al., 1988, Afonso et al., 2007). Cette augmentation de la production de ROS va
provoquer des lésions tissulaires associées à l’inflammation.

Par conséquent, le système immunitaire va donc déclencher une réponse inflammatoire

pour essayer de les éliminer. Ces radicaux libres, qui sont considérés comme un poison, vont
contribuer à la désorganisation des membranes cellulaires ce qui va entrainer la cytolyse
(Babior, 2000). Cependant, les radicaux libres produisent des phosphodiestérases responsables
de l’activation cellulaire et ils sont également à l’origine de l’activité microbicide des cellules
(Cavaillon, 2005).
15
 II.4- Les traitements de la douleur et de l’inflammation

II.4.1- Les anti-inflammatoires de synthèse

La prise en charge de la douleur et de l’inflammation vise à traiter de façon spécifique

et simultanée les deux pathologies. Trouver un traitement efficace est un problème très
complexe en raison de l’implication des nombreuses voies métaboliques qui participent à ce
phénomène. Néanmoins, des études suggèrent la prise en charge de ces pathologies par
l’utilisation d’anti-inflammatoires, bien que ces médicaments présentent des effets indésirables
notables. Deux grandes familles d’anti-inflammatoires sont utilisées notamment : les anti-
inflammatoire non stéroïdiens (AINS) et les anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS) ou
corticoïdes.

Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) sont déstinés à combattre les effets de
l’inflammation quelque soit son origine. Ils sont les plus utilisés, les plus répandus dans le
monde, et agissent sur les cyclooxygénases COX, ce qui peut générer des effets secondaires
parfois graves, car ces AINS non spécifiques entrainent l’inhibition de COX-1 qui joue un rôle
important dans le maintien des fonctions gastro-intestinales et rénales (Lombardi, 2007).

II.4.1.1- Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS)

La coexistence de deux cyclooxygénases COX permet d’identifier deux sous familles

d’AINS : les AINS classiques qui sont les inhibiteurs de COX-1 et les coxibs qui sont des
inhibiteurs sélectifs de COX-2. Les deux variétés d’AINS présentent la même efficacité et les
mêmes effets indésirables (effets gastro-intestinaux et rénaux). Les coxibs présentent moins de
risques intestinaux et rénaux mais ils augmentent les risques cardiovasculaires (Bannwarth,
2005). Les AINS les plus utilisés sont : l’acide acétylsalicylique appelé aspirine (7), le
diclofénac (8), l’indométacine (9), le méloxicam (10), l’ibuprofène (11), l’acide niflumique
(12), le célécoxib (13).

16
 Figure 4. Structure des anti-inflammatoires non stéroïdiens

Ces deux classes d’AINS sont qualifiées d’antalgiques de palier 1 d’après l’OMS. Dans
cette classe, on retrouve le paracétamol (14), médicament le plus prescrit dans le monde. Son
mécanisme d’action dans le traitement de la douleur est cependant mal connu à ce jour. Une
étude a montré qu’il agit essentiellement sur le système nerveux central par l’inhibition de la
production de prostaglandines mais n’agit pas directement sur les cyclooxygénases COX
comme les AINS (Danton, 2017).

Les antalgiques de palier 2 concernent la famille des opiacés faibles (opioïdes), ce sont :
la codéine (15) qui est le dérivé hémisynthétique de la morphine, la dihydrocodéine (16) et le
tramadol (17). Ces antalgiques sont destinés aux douleurs non soulagées par les AINS
(Queneau et al., 2004 ; Hantson, 2002 ; Boumendjel et al., 2013).

Figure 5. Structures des antalgiques de palier 1 et de palier 2

17
 II.4.1.2- Les anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS)

Les AIS, encore appelés corticoïdes, sont utilisés pour le traitement de la douleur et de
l’inflammation. Ils ciblent la phospholipase A2, enzyme issue du métabolisme de l’acide
arachidonique par la cyclooxygénase. Les corticoïdes sont dérivés du cortisol et de la cortisone
(18). Les plus connus sont : la prednisone (19), la prednisolone (20), la méthylprednisolone, le
bétaméthasone ou dexaméthasone. Ils ont une action plus large que les anti-inflammatoires non
stéroïdiens, action à la fois cytoplasmique et génomique, avec pour conséquence une
modulation de la transcription et de l’expression des médiateurs de l’inflammation (Orliague
et al., 2013).

Figure 6. Structures des anti-inflammatoires stéroïdiens

II.4.2- Traitements à base de plantes

Comme nous l’avons évoqué précédemment, la douleur et l’inflammation sont des

phénomènes complexes pour la santé qui sont au coeur des préoccupations actuelles de
différentes instances internationales comme l’OMS. Très souvent, les anti-inflammatoires de
référence mentionnés précédemment sont prescrits pour la prise en charge de ces pathologies.
Cependant, tous ces médicaments présentent des effets indésirables parfois très impactants. La
société tente de trouver des alternatives plus ʺnaturellesʺ en ayant recours aux extraits des
plantes ou molécules naturelles extraites des plantes ou, quelques fois à l’utilisation d’huiles
essentielles. En effet, certaines huiles essentielles sont utilisées pour leur vertu anti-
inflammatoire. C’est notamment le cas de l’huile essentielle de feuilles de Juniperus oxycedrus
(Cupressaceae) qui contient l’-pinène et est utilisée comme anti-inflammatoire dans le
traitement des maladies arthritiques. Cette huile inhibe l’activation de NF-kB induit par les
cytokines pro-inflammatoires IL-1 et la production de NO (Neves et al., 2010). Le linalol et
l’acétate de linalyle (composés monoterpéniques) présents dans certaines huiles essentielles
sont également utilisés comme anti-inflammatoire (Penea et al., 2002). La lavande, la

18
gaulthérie ou thé de bois sont utilisés pour soulager les tendinites. L’action du salicylate de
méthyle qu’elle contient justifie cet usage. L’huile essentielle de basilic est également utilisée
comme anti-inflammatoire. Ses constituants semblent bloquer l’activité des médiateurs de
l’inflammation (Baudoux, 2008). La curcumine, un diarylheptanoïde extrait de Curcuma longa
est une des molécules naturelles possédant des propriétés anti-inflammatoires (baisse de la
production de cytokines pro-inflammatoires), anti-cancéreuse (rôle protecteur) et antioxydante
remarquable (Prasad et al., 2014). La capsaïcine, un pseudo-alcaloïde extrait des espèces de
Capsicum (piment) est utilisée pour ses propriétés anti-inflammatoires. Elle agit en activant le
récepteur TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloid member 1). La TRPV1 est une
protéine jouant un role dans la transmission de la douleur (Haanpää et al., 2012).

Conclusion du chapitre

La douleur et l’inflammation sont deux pathologies qui se manifestent conjointement au

cours de l’apparition d’un processus inflammatoire. Les mécanismes physiologiques mis en jeu
sont très complexes. Si de nombreux traitements existent, la plupart d’entre eux ne sont pas
sélectifs ou engendrent des effets secondaires problématiques. D’autre part, certaines molécules
naturelles ont prouvé leur efficacité pour la prise en charge de ces pathologies. Ceci justifie nos
efforts pour investiguer des plantes utilisées en pharmacopée traditionnelle pour la prise en
charge des phénomènes inflammatoires et ou douloureux, ce qui pourrait permettre la mise en
évidence de molécules actives permettant d’enrichir l’arsenal thérapeutique.

19
20
 Chapitre II

Métabolites secondaires et potentiel

antioxydant/anti-inflammatoire

21
22
 Les végétaux ont une capacité exceptionnelle pour produire des substances naturelles
très variées. Outre les métabolites primaires classiques comme les glucides, les protides, les
lipides et les acides nucléiques, les végétaux accumulent également des métabolites dits
secondaires qui représentent une source importante de molécules utilisables dans les domaines
thérapeutiques, notamment la pharmacologie et l’agroalimentaire. Les métabolites secondaires
sont composés de familles chimiques distinctes telles que les composés phénoliques, les
terpènes, les alcaloïdes, les stéroïdes, les stérols... Un grand nombre de ces métabolites
possèdent des propriétés protectrices qui permettent d’améliorer la santé des plantes qui les
produisent à cette fin.

Cependant, ces métabolites secondaires ne participent pas directement au

développement de la plante mais interviennent dans les relations avec le stress biotiques,
abiotiques ou améliorent l’efficacité de reproduction et découlent de réactions chimiques
ultérieures (Agostini-Costa et al., 2012).

I - Les composés phénoliques

Les composés phénoliques constituent un groupe de molécules très importantes chez les
plantes. Ils représentent près de 8000 molécules divisées en une dizaine de classes chimiques
(Stalikas, 2007). Cette classe est caractérisée par la présence d’un noyau benzoïque auquel un
ou plusieurs hydroxyles sont directement liés (Macheix et al., 2005). On les retrouve dans tous
les organes de la plante (feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits, graines et bois). Ils favorisent la
santé cardiovasculaire en maintenant les tissus vasculaires (artères, vaisseaux, capillaires).
Ainsi, les métabolites secondaires de nature phénolique présentent un grand intérêt de par leurs
nombreux effets bénéfiques pour la santé humaine, notamment leurs propriétés
antibactériennes, antivirales, antiallergiques, antitumorales, antioxydantes, anti-
inflammatoires, antimicrobiennes… Les composés phénoliques regroupent plusieurs familles
chimiques.

I.1 - Les acides phénoliques

Ce sont des composés phénoliques possédant au moins une fonction carboxylique. C’est
le cas de l’acide para-hydroxybenzoïque (21), mais aussi de l’acide salicylique (22), de l’acide
protocatéchique (23), de l’acide caféique (24) et de l’acide chlorogénique (25) (Manuja et al.,
2013 ; Morishita et al., 2001), représentés dans la figure 7. Ces composés sont doués de
propriétés antioxydantes, antibactériennes et fongiques, antiseptiques urinaires et anti-
inflammatoires. Ce sont pour la plupart les dérivés de l’acide salicylique (Bruneton, 2009).
23
 Figure 7. Structure de quelques acides phénoliques possédant des propriétés antioxydantes
et/ou anti-inflammatoires

I.2 - Les flavonoïdes

Les flavonoïdes sont le groupe de composés phénoliques végétaux le plus courant et le
plus largement distribué, présents pratiquement dans toutes les parties de la plante, en
particulier les cellules végétales photosynthétiques. Les flavonoïdes font partie intégrante de
l'alimentation humaine et animale. Cependant, ils ne peuvent pas être synthétisés par les
humains et les animaux (Koes et al., 2005). Ainsi, les flavonoïdes trouvés chez les animaux
sont d'origine végétale plutôt que d'être biosynthétisés in situ. Les flavonoïdes dans les aliments
sont généralement responsables de la couleur, du goût, de la prévention de l'oxydation des
graisses et de la protection des vitamines et enzymes (Yao et al., 2004).

Les flavonoïdes, trouvés en plus grandes quantités dans l'alimentation humaine,

comprennent les isoflavones, les flavonols et les flavones. Ils ont des propriétés biologiques
très variées qui favorisent la santé humaine et aident à réduire le risque de maladies. A titre
d’exemple, la glabridine, isoflavane présente dans Glycyrrhiza glabra (Fabaceae), inhibe
l'oxydation des LDL (low-density lipoprotein) via un mécanisme de piégeage des radicaux
libres (Fuhrman et al., 1997). Certaines études ont montré que la consommation de thé vert ou
noir pouvait réduire les concentrations de cholestérol sanguin et la tension artérielle, offrant
ainsi une certaine protection contre les maladies cardiovasculaires. Les flavonoïdes sont
également connus pour influencer la qualité et la stabilité des aliments en agissant comme
aromatisants, colorants et antioxydants (Craig, 1999 ; Kumar et al., 2012).

24
 Cette famille de molécules, dotée de propriétés biologiques considérables possède une
diversité structurale importante (Ross et al., 2002 ; Cazarolli et al.,2008 ; Burta et al., 2008).
Ainsi, on distingue six principales sous classes de flavonoïdes : les flavones comme l’apigénine
(26), les flavonols comme la quercétine (27), et des dérivés comme la dihydroquercétine (28),
les flavanones comme l’hespérétine (29), les flavan-3-ols comme l’épicatéchine (30) et les
isoflavanes comme la glabridine (31) (figure 8).

Figure 8. Structure des différentes familles des flavonoïdes

De toutes les propriétés biologiques citées ci-dessus, la plus répertoriée est leur activité
antioxydante et leur capacité à piéger les radicaux libres notamment les radicaux hydroxyles
(OH•), anions superoxydes (O•2) et les radicaux libres peroxylipidiques (Burda et al., 2001).
Ces radicaux libres apparaissent plus souvent dans les situations de l’inflammation, de l’anoxie
et de l’auto-oxydation (Cao et al., 1997 ; Hanasaki et al., 1994 ; Ghedira, 2005). Les
flavonoïdes ont également des effets capillaro-protecteurs, c’est-à-dire qu’ils diminuent la
perméabilité des capillaires sanguins et augmentent ainsi leur résistance. Ces effets sont
recherchés dans le traitement des pathologies telles que les crises hémorroïdaires et les jambes
lourdes (Bruneton, 2009).

25
II - Les alcaloïdes
Les alcaloïdes sont des composés azotés hétérocycliques, extraits principalement à partir
des espèces végétales. Ils constituent un groupe varié avec des propriétés chimiques et
pharmacologiques diverses. On distingue les alcaloïdes vrais, les pseudo-alcaloïdes et les proto-
alcaloïdes.

II.1 - Les alcaloïdes vrais :

Dans les alcaloïdes vrais l’atome d’azote est intra-cyclique, ils sont biosynthétisés à partir
d’un acide aminé (figure 9). Ils peuvent être mono ou polycycliques et sont repartis en plusieurs
groupes selon leur noyau de base parmi lesquelles les quinolizidines, les quinoléines, les
isoquinoléines, les tropanes, les indoles, les tétrahydroisoquinoléine, les pyrrolizidine, les
imidazoles.

Ces molécules, possédant un remarquable spectre d’activités biologiques, sont à l’origine

de médicaments très efficaces mais également responsables des effets secondaires graves pour
la santé. La morphine (32), antalgique de référence, très puissant et le plus utilisé, agit en
activant les récepteurs opiacés en entrainant une forte analgésie. Cependant, la morphine
provoque une détresse respiratoire et une accoutumance pouvant conduire à la mort (Dewick,
2008). La caféine (33) est un alcaloïde très consommé et très abondant dans le café. On le
retrouve aussi en très faible quantité dans le cacao et le chocolat. C’est un excitant qui favorise
le fonctionnement du système nerveux. Il provoque également de l’hypertension artérielle, des
maux de tête et des palpitations cardiaques. L’atropine (34) est un antispasmodique utilisé pour
stimuler la fréquence cardiaque. Elle peut être utilisée comme antidote de certains gaz de
combat, notamment le gaz sarin (Bruneton, 2005).

Figure 9. Structures de la morphine, de la caféine et de l’atropine

26
 II.2 - Les pseudo-alcaloïdes :

Ils présentent le plus souvent les mêmes caractéristiques chimiques que les alcaloïdes
vrais mais leur biosynthèse n’inclue pas les acides aminés. Ils dérivent dans la majorité des cas
des isoprénoïdes comme l’aconitine (35) (Bruneton, 2009). On retrouve également dans le
règne végétal des substances azotées hétérocycliques dérivées de l’acétate comme la coniine
(36) de la ciguë et la capsaïcine (37) (figure 10).

Figure 10. Structure de pseudo-alcaloïdes

II.3 - Les proto-alcaloïdes :

Ce sont des amines simples dont l’azote est extra-cyclique, basiques, élaborés in vivo à
partir d’acide aminé, cas de la mescaline (38) (figure 11).

Figure 11. Exemple d’un proto-alcaloïde

III - Les terpènes

Les terpènes sont des métabolites secondaires qui se retrouvent dans le règne végétal et
dérivent de l’isoprène, unité à cinq atomes de carbone. Les terpénoïdes sont extraits le plus
souvent comme constituants d’huiles essentielles (Goodwin, 1971). Les terpénoïdes sont
répartis en quatre familles selon leur unité isoprénique : les monoterpènes (C10), les

27
sesquiterpènes (C15), les diterpènes (C20) et les triterpènes (C30). C’est à cette famille
qu’appartiennent les stéroïdes.

III.1 - Les monoterpènes

Les monoterpènes sont des composés formés à partir de deux unités isopréniques, ils sont
simples et existent le plus souvent à l’état libre. Ce sont des constituants des huiles essentielles.
Par rapport à l’origine biosynthétique, on parle des monoterpènes réguliers et des monoterpènes
irréguliers (Bruneton, 2009). De nombreux terpénoïdes comme le menthol (39), l’eugénol (40)
ou le cholestérol (41) (figure 12) possèdent des propriétés pharmacologiques importantes,
notamment des propriétés antioxydantes, antibactériennes, anti-inflammatoires, analgésiques et
anti-tumorales (Ludwiczuk et al., 2017 ; Kamatou et al., 2013 ; Marchese et al., 2017).

Figure 12. Structures du (-) menthol, de l’eugénol et du cholestérol

A titre d’exemple, des études épidémiologiques réalisées pendant plusieurs décennies ont
mis en évidence une corrélation entre le taux de cholestérol sanguin et les accidents
cardiovasculaires. Selon ces études, le cholestérol est le facteur de risque majeur responsable
de la forte mortalité cardio-vasculaire. En effet, le risque avec le cholestérol se traduit par une
glycémie élevée provoquant le stress oxydatif et inflammatoire sur les parois artérielles
(Hofvendahl et al., 1971 ; Kearns et al., 2016). Cependant, le cholestérol joue un rôle
indispensable dans la synthèse de nombreuses hormones. Cette même famille renferme en son
sein un groupe des stérols végétaux appelés phytostérols.

Parmi les monoterpènes, on trouve aussi :

* Les iridoïdes : ce sont des monoterpènes caractérisés par un squelette cyclopentapyranique.

Ils ont des effets analgésiques et antiinflammatoires (Güther et al., 2006).

28
* Les pyréthrines : sont des monoterpènes irréguliers que l’on rencontre pour certains dans les
huiles essentielles. Ils sont employés comme insecticides (Casida et al., 1995)

III.2 - Les sesquiterpènes

Ce sont des constituants des huiles essentielles des végétaux supérieurs. Ils dérivent de plus
de 100 squelettes différents. Dans cette catégorie, on peut citer le cadinène (42) et le
caryophyllène (43) (figure 13) isolés par Wallach à la fin du 19ème siècle (Bruneton, 2009). Ils
sont analgésiques et anti-inflammatoires (Tatsumi et al., 2004). Dans ce groupe on rencontre
aussi les lactones sesquiterpéniques tel que l’artémisinine isolée de l’Artemisia annua L. qui est
utilisée comme antipaludique (Bruneton, 2009).

Figure 13. Structure des sesquiterpènes

III.3 - Les diterpènes

Ce sont des composés en C20 très répandus dans le règne végétal particulièrement chez les
Lamiales et les Astérales avec plus de 1200 composés identifiés à ce jour. Quelques molécules
sont actuellement utilisées en thérapeutique comme anticancéreux. C’est le cas notamment du
paclitaxel et du docétaxel isolés des espèces de Taxus aussi appelées Ifs (Geney et al., 2005).

III.4 - Les triterpènes et les stéroïdes

Ce sont des composés en C30 doués d’effets pharmacologiques importants. Ils sont
potentiellement cytostatiques, antiviraux, analgésiques et anti-inflammatoires (Dzubak et al.,
2006).

29
Conclusion du chapitre
Les métabolites secondaires, d’une grande diversité structurale, possèdent également de
nombreuses activités biologiques, notamment comme anti-inflammatoires potentielles. C’est
dans cette démarche exploratoire que se situent nos travaux de recherche visant à mieux
connaitre le potentiel anti-inflammatoire d’extraits de plantes médicinales et d’identifier le cas
échéant les molécules d’intérêt responsables de cette activité.

30
Chapitre III

Vitex madiensis Oliv.

31
32
 Parmi les plantes que nous avons choisi pour notre étude, nous avons sélectionné Vitex
madiensis Oliv. Ce chapitre est dédié à l’étude de cette plante. Dans un premier temps nous
présenterons le genre Vitex, les caractéristiques botaniques de Vitex madiensis Oliv., ses usages
en pharmacopée traditionnelle et les études phytochimiques décrites dans la littérature.

La deuxième partie de ce chapitre sera consacrée à nos travaux concernant l’étude

phytochimique et les activités biologiques des extraits de cette plante.

I - Le genre Vitex et Vitex madiensis Oliv. : étude bibliographique

I.1 - Eléments botaniques
I.1.1 - Le genre Vitex

Le genre Vitex a été décrit par Linnaeus en 1753 avec quatre espèces (Vitex agnus-
castus, Vitex negundo, Vitex pinnata et Vitex trifolia). Actuellement, la littérature fait état
d’environ 270 espèces identifiées dans ce genre et la grande majorité pousse dans les régions
tropicales à travers le monde dont 110 espèces présentes en Afrique (Mabberley, 2017). Les
premières données sur la classification systématique place Vitex dans la famille des
Verbenaceae, sous-famille des Viticoideae (Briquet, 1895). L’accumulation progressive des
données sur les espèces a permis de revoir la systématique et de classer par la suite le genre
Vitex dans la famille des Lamiaceae, qui comprend environ 6000 espèces et près de 210 genres
(Harley et al., 2004).

I.1.2 - Vitex madiensis Oliv.

Vitex madiensis Oliv. se présente sous la forme d’un arbuste de régions tropicales et
subtropicales (figure 14). En Afrique, on la retrouve notamment au Congo Brazzaville, en
République Démocratique du Congo, au Mali, en Angola, au Gabon, au Sénégal sous une
altitude allant de 0 à 1500 m. Vitex madiensis peut atteindre 5 m de haut, avec un massif porte-
greffe ligneux souterrain. Les pointes de cette plante sont couvertes de longs poils fauves et les
feuilles numérisées composées de cinq folioles. Ces folioles sont obovales nettement plus
petites, vert foncé dessus, parfois très rugueuses ; plus pâles avec des poils plus doux ; sommet
arrondi, souvent avec une pointe courte et abrupte. Les fleurs sont à têtes axillaires, blanches
avec une lèvre bleu pâle à mauve foncé ; les lobes du calice sont densément couverts de poils
fauves. Le fruit est ellipsoïde-oblong, charnu, pendant sur de longues tiges, noir, souvent tacheté
de blanc, enveloppé dans le calice persistant.

33
 Figure 14. Vitex madiensis Oliv.

La classification botanique de Vitex madiensis Oliv. obéit à l’APG III (Angiosperm Phylogeny
Group 2009).

Taxon : Embryophytes ou plantes terrestres

Taxon : Spermatophytes ou plantes à graines
Embranchement : Angiospermes ou plante à ovaires
Règne : Plantae
Classe : Eudicots triaperturées et dicotylées
Sous classe : Evoluées, Asterideae, En-Asterideae
Ordre : Lamiales
Famille : Lamiaceae
Sous famille : Viticoideae
Genre : Vitex
Epithète : madiensis Oliv.
Espèce : Vitex madiensis Oliv.

34
 I. 2 - Utilisation de Vitex madiensis en médecine traditionnelle

Vitex madiensis fait partie des espèces d’arbres agroforestiers valorisés à des fins
alimentaires et médicinales en Afrique (Mapongmetsem, 2006 ; Mapongmetsem et al., 2003).
On retrouve l’espèce sous plusieurs noms vernaculaires selon les pays. En république
démocratique du Congo, la plante est appelée kifiyu ou kifilu (Kasulu et al., 1999 ; Kibungu,
2003), ti kinthandu (Delaude, 1978 ; Delaude et al., 1971). En république du Congo, elle porte
plusieurs appellations. Au sud du Congo, on la désigne sous les noms de mfilu wa makaanga,
mufili, mfilu nseke, tchifilu ; au nord du Congo esuabo, esawiri, echaocho, ésso, ikololo longo
(Bouquet, 1969 ; Kipouni et al., 2018). Au Sénégal, le peuple Peul de la région du Sine salum
l’appelle bummi (Pordie et al., 2001), bumé (Kerharo et al., 1964). Au Mali, on la retrouve
sous les noms suivants : koro dankele, dankelekele, korole (Malgras, 1992), à Bamako dans la
région de Djicoroni, on l’appelle koronifin (Danton, 2017), i silo-silo en Angola, dans les
régions de Bié, Chinguar, Katchiungo (Bossard, 1996).

Le tableau 1 résume les diverses utilisations des différentes parties (feuilles, fruits,
écorces des tiges et des racines) recensées dans la littérature (Danton et al., 2019 ; Latham,
2004).

Tableau 1. Usages de Vitex madiensis en médecine traditionnelle africaine

Usage Organe Mode de Posologie de Pays Références

préparation traitement
Fièvre, Écorce, Macération, - RDC, RCA, Kasuku et
paludisme, feuille, décoction Gabon, Mali al.,1999,
Lavage de la
anti pyrétique, racine, tige
tête avec Haxaire, 1979,
migraine feuilles
décoction Ondo et al.,
2012
Malgras, 1992
Diarrhée, Ecorce de Macération, 100 mL, 3x/J Congo, RCA, Bouquet, 1969
dysenterie, tronc, décoction 1L chez l’adulte Ouganda
Diafouka, 1997
cholera, fleurs, (Province du
1 cuillère à Haxaire, 1979
douleur feuilles Ngai, district
café chez Malgras, 1992
abdominale jeunes de Apac),
l’enfant
Mali
Maux
Mastiquer et
d’estomac
avaler le jus
Accouchement Feuilles Eau tiède bain Angola Bossard, 1996
difficile, (régions de

35
 douleur de Bié,
l’enfantement Chinguar,
Katchiungo)
Fertilité chez Feuilles Décoction 100 mL, 3 x/J Congo, RCA, Diafouka, 1997
la femme et dans 1L pendant 1 Angola Haxaire ,1949
Écorce
l’homme, d’eau mois (province de Lautenschläger
impuissance Uíge) et al., 2018
Bain de
sexuelle,
vapeur et bain
candidose
de bouche
buccale

Infection uro- Ecorce, Macération - Congo Bouquet, 1969,

génitale, feuilles, Arkinstall, 1979
maladies racine
urinaires,
cystite,
douleurs dans
les trompes,
kyste ovarien
Maux oreilles, Suc des Jus, 1goute/oreille, Congo, RCA, Bouquet, 1969,
surdité, feuilles, décoction 1goutte/œil, Mali, Angola Haxaire, 1979,
affections des écorces gargarismes Malgras, 199
yeux, Douleur raclées, froid Lautenschläger
dentaire, racine et al., 2018,
hémorragie
après
extraction
d’une dent
Anémie, Ecorce de Décoction, Bain Congo, RDC Bouquet, 1969
drépanocytose, tronc, infusion Delaude, 1978
malnutrition feuilles
séchées
Troubles Ecorce de Décoction, Bain Congo Bouquet, 1969
nerveux, tronc, aspersion
Jus, 2 gouttes Diafouka, 1997
épilepsie, feuilles
dans chaque
insomnie
narine, 1x/J
Troubles de Poudre de Délayer dans 20 mL/J, Congo, Mali, Diafouka, 1997
lactation, lait racine, l’eau et flictionner les Angola Malgras, 1992
maternel partie filtrer, seins avec les (régions de Bossard, 1996
souillé, interne de décoction feuilles pilées, Bié, Kibungu, 2003
l’écorce, bain, Chinguar,
Katchiungo),

36
 blessure, feuilles Jus de la application RDC, Catarino et al.,
cicatrices racine partie locale, Guinea- 2016
interne de Bissau,
l’écorce sur
la plaie

Mal de dos, Feuilles, Décoction 200 mL, 3x/J, Congo, Diafouka, 1997
arthrite, tige 1L d’eau, bain de Angola Lautenschläger
rhumatisme feuilles, aspersion, vapeur, (province de et al., 2018
écorce fumigation, massage avec Uíge)
infusion les feuilles
Diabète Racine, Décoction 100 mL, 3x/J Congo, RDC Diafouka 1997
écorce adulte, 1 Kibungu, 2003,
cuillère à café Mandango et
enfant al., 1990
Aliment Fruit - - Mali Malgas, 1992
Hémorroïde Racine, Racine en pommade Ouganda Okello et al.,
écorce brulée, sur l’anus (Province du 2007,
décoction Ngai, district
Delaude et al.,
de Apac),
1971,
RDC
Makumbelo et
al., 2008
Toux, Feuilles Décoction, - RDC, Angola Muluwa et al.,
bronchites, mastication (province de 2008,
affections Uíge) Makumbelo et
pulmonaires al., 2008 ,
Diafouka 1997,
Lautenschläger
et al., 2018
Troubles de Feuilles Macération - Guinée- Frazão-Moreira,
grossesse, Bissau, Mali 2016
soins durant la
Catarino et al.,
grossesse,
2016
trouble des
règles Danton, 2017
Hypotension Feuilles Décoction - Congo Kimpouni et al.,
artérielle 2018

37
 I.3 - Phytochimie du genre Vitex et de Vitex madiensis

I.3.1 - Phytochimie du genre Vitex

Les espèces du genre Vitex contiennent de nombreux métabolites secondaires. Parmi

ceux-ci, les iridoïdes constituent une classe importante qui possèderaient des activités anti-
inflammatoires (Masateru et al., 1997). Ils ont été identifiés notamment à partir des extraits de
fruits de Vitex rotundifolia, comme l’eucommiol (44), l’iridolactone (45), la pédicularislactone
(46), le vitéoïde I (47), le vitéoïde II (48), l’agnuside (49), le 10-O-vanilloy aucubin (50) et le
1-oxo-eucommiol (51).

Figure 15. Iridoïdes contenus dans les fruits de Vitex rotundifolia L. (Masateru et al., 1997)

D’autres études sur les extraits de fruits de Vitex agnus-castus, Vitex trifolia, Vitex
cannabifolia, Vitex negundo, Vitex rotundifolia (Lenbigye et al., 2018 ; Ono et al., 2002 ; Wu
et al., 2009) ont permis d’identifier : (i) des terpénoïdes comme le 8-épi-manoyloxyde (52),
le 8-épi-sclaréol (53), la viteagnusine B (54), la vitexilactone (55), l’acide 3-épi-maslinique
(56), l’acide 3-épi-corosolique (57), la vitetrifoline B (58), la vitetrifoline C (59), le rotundifaran
(60), la vitetrifoline H (61) ; (ii) des iridoïdes comme l’aucubine (62) ; (iii) des flavonoïdes
comme la casticine (63), la pendulétine (64), l’apigénine (65), 3-methylquercétine (66), la
lutéoline (67), le kaempférol (68), la 3,7-diméthylquercétine (69), la vitexine (70), l’orientine
(71), l’eupatorine (72), l’isoorientine (73), l’artemétine (74) ; (iv) les acides phénoliques et

38
leurs dérivés tels que l’acide 4-hydroxybenzoïque (75), l’acide gallique (76) et l’acide
chlorogénique (77). Ces composés ont également été identifiés dans d’autres espèces du genre
Vitex notamment Vitex pubescence, Vitex scabra, Vitex sereti, Vitex strickeri, Vitex thyrsiflora,
Vitex congolensis, Vitex diversifolia, Vitex doniana, Vitex negundo et Vitex heterophylla
(Ganapaty et al., 2005 ; Kobayakawa et al., 2004).

Figure 16. Terpenoïdes et iridoïdes extraits des espèces du genre Vitex

39
 Figure 17. Flavonoïdes extraits des espèces du genre Vitex

Figure 18. Acides phénoliques et dérivés extraits des espèces du genre Vitex

Cette présentation des molécules contenues dans les espèces du genre Vitex n’est pas
exhaustive.
Certains auteurs ont tenté de relier l’activité antioxydante, les activités
antimicrobiennes, antibactériennes et anti-inflammatoires (Sarr et al., 2015 ; Muanda et al.,
2019 ; Ngah et al., 2020 ; Traoré et al., 2019) aux constituants chimiques des extraits,
notamment les flavonoïdes ou polyphénols et les triterpénoïdes, sans que cette relation ne soit
clairement prouvée. D’autres études par contre ont montré une corrélation entre la présence de
composés comme l'acide 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-diène-26-oïque (78), la β-amyrine

40
(79), et le palmitate de β- sitostérol (80) et l’activité anti plasmodiale des écorces du tronc de
Vitex thyrsiflora (Kopa et al., 2016).

Figure 19. Triterpenoïdes isolés des extraits de Vitex thyrsiflora (Kopa et al., 2016).

Les phytoecdystéroïdes dans le genre Vitex

Une famille de composés très caractéristiques du genre Vitex a également été

identifiée : les phytoecdystéroïdes. Les phytoecdystéroïdes sont une famille de molécules
chimiques possédant des effets physiologiques importants chez les plantes, en particulier pour
leur défense contre les attaques d'insectes (Nguyen et al., 2018). Ils constituent un groupe de
cétostéroïdes polyhydroxylés. Leur squelette carboné est appelé cyclopentanoperhydro-
phénanthrène (Niranjan et al., 2021). Les plantes synthétisent les phytoecdystéroïdes à partir
de l’acide mévalonique via le cholestérol, à partir de l’acétyl-coenzyme A (acétyl-CoA) comme
précurseur ; les intermédiaires importants de la voie du mévalonate étant le pyrophosphate
d'isopentényle (IPP) et le pyrophosphate de diméthylallyle (DMAPP). Dans cette voie, les
réactions de condensation de six unités isoprène activées forment du squalène et subissent
ensuite une époxydation et une cyclisation pour former du lanostérol. De plus, les unités
subissent des étapes ultérieures pour former du cholestérol (Niranjan et al., 2021). La figure
20 représente le schéma de biosynthèse de la 20-hydroxyecdysone, le phytostéroïde le plus
couramment identifié dans les espèces végétales.

41
 Figure 20. Schéma de biosynthèse de la 20-HE chez les plantes (Niranjan et al., 2021)

C’est à partir des années 90 que les premiers phytoecdystéroïdes vont être isolés
d’extraits de plantes des espèces du genre Vitex. Kubo et collaborateurs en 1990 isolent la
vitexirone et la turkesterone à partir de l’extrait au méthanol de l’écorce de racine de Vitex
fisherii (Kubo et al., 1990). La 20-hydroxyecdysone et l’ajugasterone C sont extraits à partir
de l’écorce de tige de Vitex doniana Sweet et Vitex canescens et ont révélé une activité anti
inflammatoire prometteuse (Ochieng et al., 2013 ; Suksamrarn et al., 1997).
42
Une compilation des phytoecdystéroïdes identifiés dans une dizaine d’espèces du genre Vitex
est présentée dans la figure 21 (Sena et al., 2008 ; Suksamrarn et al., 2000).

(81) (82) (83)

(84) (85) (86)

(89)
(87) (88)

(90) (91) (92)

(93) (94) (95)

43
 (96) (97) (98)

(99) (101)
(100)

(102) (103) (104)

Figure 21. Ecdystréoïdes trouvés dans les espèces du genre Vitex (Sena et al., 2008).

(81): 20-Hyhydroxyecdysone; (82), Turkestérone; (83), Pinnatasterone ; (84), Canescenstérone; (85),

Shidasterone; (86), Ajugastérone C; (87), Ajugastérone C monoacetonide 20,22-monoacetonide; (88),
24-Epimakistérone A ;(89), Calonystérone ; (90), Abutasterone ; (91), 24-Epiabutastérone ; (92),
Vitexirone ; (93), Scabrastérone ; (94), 11α-Hydroxyecdysone ; (95), 11α, 20,26-Trihydroxyecdysone ;
(96), 20-Hyhydroxyecdysone 20,22-monoacetonide ; (97), (24R)-11α, 20,26-Trihydroxyecdysone ;
(98), 24-Epipinnatastérone ; (99), 20,26-Dihydroxyecdysone ; (100), 26- Hydroxypinnatastérone ;
(101), 24-Dehydromakistérone ; (102), Pterostérone ; (103), Polypodine B ; (104), Makistérone A.

Les études menées à ce jour ont donc montré que les plantes du genre Vitex ont des
activités comme hépatoprotectrices (Chandramu et al., 2003), anti-allergiques (Shin et al.,
2000), antimicrobiennes (Hossain et al., 2001), antioxydantes, anti-inflammatoires,
antibactériennes, antalgiques, antihistaminiques et antiasthmatiques (Meena et al., 2011 ;
Kopa et al., 2016 ; Embeya et al., 2019 ; Venkateswarlu, 2012). Ainsi, les espèces du genre
Vitex méritent une évaluation plus approfondie en tant que source de molécules bioactives.

44
 I.3.2 - Phytochimie de l’espèce Vitex madiensis

Les études chimiques concernant Vitex madiensis sont peu nombreuses. Kubo et al.,
(1984) isolent et identifient deux phytoecdystéroïdes à partir de l'écorce de racines, la 20-
hydroxyecdysone (81) et l'ajugastérone C (86), que l’on retrouve, par ailleurs, dans les autres
espèces du genre Vitex comme nous l’avons vu précédemment. Lengbiye et al. (2020) ont
montré que les extraits éthanoliques des feuilles possèdent un profil chimique où l’on identifie
des coumarines, des anthraquinones, des flavonoïdes, des acides phénoliques et des terpénoïdes
qui seraient responsables de l’activité antioxydante observée pour les extraits de feuilles de
cette espèce (Lengbiye et al., 2020).

Quelques études sur l’activité biologique d’extraits de Vitex madiensis ont été réalisées et ont
montré que les extraits méthanoliques des feuilles présentaient une activité analgésique
(Danton, 2017). Les extraits d’écorce de tronc ont présenté une activité antipaludique (Ondo
et al., 2012). D’autre études décrivent que l’extrait aqueux des feuilles de Vitex madiensis
possèderait une activité anti-inflammatoire (N’goha et al., 2018 ; Nsondé et al., 2020) et anti
diabétique (Tschibumbu et al., 2014).

Conclusion : Les espèces du genre Vitex et leurs différents organes sont utilisés en médecine
traditonnelle africaine. Elles possèdent des nombreux composés biologiquement actifs. C’est la
raison pour laquelle nous avons choisi de porter nos efforts de recherche sur une espèce utilisée
en médecine traditionelle au Congo Brazzaville: Vitex madiensis. Nous avons choisi de récolter
tous les organes de cette plante qui sont peu étudiés sur le plan phytochimique et
pharmacologique d’après les données de la littérature. Nous avons choisi de faire la collecte du
matériel végétal pendant deux grandes saisons recensées au Congo : la saison des pluies et la
saison sèche. En effet, il peut y avoir une variation de la composition chimique au cours des
saisons ce qui pourrait entrainer un impact sur les activités biologiques.

45
II- Travaux réalisés sur Vitex madiensis Oliv

II.1 - Collecte du matériel végétal

Les travaux concernant Vitex madiensis ont porté sur les feuilles (VMFE1 et VMFE2),
les écorces de tronc (VMET1 et VMET2) et de racines (VMRA1 et VMRA2) ainsi que les fruits
(VMFR1) récoltés à 25 km au sud de Brazzaville (Congo), aux environs du village Makana I,
les coordonnées GPS des points des récoltes sont les suivantes (X= 513406, Y= 9523032, Z=
3). Les récoltes ont été faites au cours de deux périodes de l’année, en saison des pluies en
décembre 2018 et en saison sèche en juillet 2019. Nous avons pris le soin de récolter le matériel
végétal au même endroit pour chaque saison. Il faut noter qu’en saison sèche, les pluies sont
rares et donc les plantes subissent un stress hydrique susceptible de modifier le métabolisme de
la plante. Aussi, la stratégie a consisté, dans un premier temps, en la comparaison des extraits
obtenus à partir des plantes récoltées pendant la saison des pluies et saison sèche. Un échantillon
de référence de cette plante a été identifié par les botanistes et conservé à l’herbier de l’Institut
de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) à Brazzaville sous le numéro T7041.

II.2 - Obtention des extraits

Après la récolte, le matériel végétal est séché à l’ombre à température ambiante pendant
7 jours puis broyé à l’aide d’un broyeur électrique jusqu’à l’obtention d’une poudre. Nous avons
choisi d’utiliser comme solvant d’extraction le méthanol qui permet d’extraire la majorité des
métabolites secondaires (Smolskaite et al., 2015). En effet, le méthanol a la capacité de briser
les parois cellulaires et donc d’extraire plus facilement les métabolites secondaires. De plus, le
méthanol étant moins polaire que l’eau, il va limiter l’extraction des sucres et des acides aminés.
Les différents extraits bruts sont obtenus en réalisant des macérations à température ambiante
dans le méthanol (ratio plante/ solvant : 1/10 pendant 24h). La suspension est ensuite filtrée et
le filtrat est évaporé sous pression réduite. Afin d’épuiser la matière végétale en métabolites
secondaires, cette extraction est répétée trois fois consécutivement pour chacun des organes
récoltés. Nous obtenons ainsi des extraits que nous dénommerons « extrait brut ». Les quantités
de matière obtenues sont représentées dans le tableau 2.

46
Tableau 2. Rendements d’extraction

Feuilles Ecorces de tronc Ecorces de racines Fruits

VMFE1 VMFE2 VMET1 VMET2 VMRA1 VMRA2 VMFR1 -

Poudre de
matière 400 200 600 200 115 200 300 -
végétale (g)

Extrait (g) 35,6 17,5 13,0 5,0 6,8 17,5 13,3 -

Rendement
d’extraction 9,0 8,7 2,2 2,5 6,0 8,0 5,0 -
(%)

Si d’une façon générale, les parties aériennes des plantes permettent d’extraire des
quantités importantes de métabolites secondaires par rapport aux parties souterraines, ceci n’est
pas le cas dans notre étude. En effet, les feuilles et les écorces de racines récoltés pendant les
deux saisons et les fruits récoltés pendant la saison de pluies permettent d’extraire des quantités
importantes de métabolites secondaires par rapport aux écorces de tronc qui donnent un
rendement très faible.

II.3 - Dosage des polyphénols et des flavonoïdes totaux

Les études bibliographiques montrent que beaucoup de molécules bioactives ayant des
effets anti-inflammatoires sont de la famille des polyphénols ou en dérivent (Boonsong et al.,
2016). C’est ainsi que nous nous sommes intéressés dans un premier temps au dosage des
polyphénols contenus dans les extraits de V. madiensis.

Courbes d’étalonnage

La courbe d’étalonnage est tracée en utilisant des standards comme référence. L’acide
gallique est pris comme référence pour la teneur en polyphénols totaux, ainsi, cette teneur est
exprimée en mg EAG/g.MS. Pour la teneur en flavonoïdes totaux, elle est standardisée par
rapport à la quercétine qui est pris comme référence et ainsi exprimée en mg EQ/g.MS. Les
deux courbes sont linéaires avec des coefficients de corrélation R2 > 0.99 (figure 22). Les

47
concentrations en polyphénols totaux et en flavonoïdes totaux pour les différents extraits sont
calculées à partir des équations de régression linéaire obtenues.

2 0,25
y = 7,894x - 0,1837 y = 0,6858x + 0,0045
0,2
1,5 R² = 0,9997 R² = 0,9905

Absorbance
Absorbance

0,15
1
0,1
0,5 0,05

0 0
0 0,1 0,2 0,3 0 0,1 0,2 0,3
Concentration (mg/mL) Concentration (mg/mL)
A B

Figure 22. Courbes d’étalonnage des dosages, A : polyphénols totaux, B : flavonoïdes totaux

Teneurs en polyphénols et flavonoïdes

Les teneurs en polyphénols et flavonoïdes totaux des extraits de différentes parties

récoltées pendant la saison des pluies et la saison sèche sont présentées dans le tableau 3.

Tableau 3. Teneur en polyphénols et flavonoïdes totaux des différents organes

Période Organe Teneur en polyphénols Teneur en flavonoïdes

totaux (mg EAG/g.MS) totaux (mg EQ/g.MS)

VMFE1 222,0 ± 0,06 102 ± 0,27

Saison des pluies VMET1 190,1 ± 0,70 98 ± 0,03

VMRA1 141,4 ± 0,40 61 ± 0,75

VMFR1 183 ± 0,20 104 ± 0,53

VMFE2 172,1± 0,06 93 ± 0,57

Saison sèche VMET2 150,0 ± 0,09 90,7 ± 0,75

VMRA2 140,8 ± 0,05 68,70 ± 0,05

Les résultats du tableau 3 montrent que les parties aériennes, récoltées pendant les deux
saisons contiennent des quantités assez importantes des composés phénoliques par rapport aux
48
parties souterraines. Les teneurs au cours des deux périodes de récolte varient de 222,0 ± 0,06
à 140,8 ± 0,05 (mg EAG/g.MS) pour les polyphénols totaux et de 104 ± 0,53 à 61 ± 0,75 (mg
EQ/g.MS) pour les flavonoïdes totaux. Par ailleurs, les feuilles récoltées en saison des pluies
sont plus riches en polyphénols totaux avec une teneur de 222,0 ± 0,06 mg EAG/g.MS par
rapport à l’échantillon des feuilles récoltées en saison sèche (172 ± 0,06). Cet extrait de feuilles,
récoltées en saison des pluies, riche en polyphénols totaux est aussi riche en flavonoïdes totaux,
avec une teneur de 102 ± 0,27 (mg EQ/g.MS), valeur légèrement supérieure à celle trouvée
dans l’échantillon récolté en saison sèche. La même tendance est observée au niveau de l’écorce
de tronc, récoltée en saison des pluies. L’extrait de racine possède des teneurs en composés
phénoliques similaires dans les deux saisons. Quant à l’extrait de fruits, il est riche en composés
phénoliques et en flavonoïdes.

Le dosage des polyphénols totaux et flavonoïdes totaux n’est pas suffisant en soi pour
caractériser les différents extraits, il est important d’étudier en détail le profil phytochimique de
chaque extrait.

II.4 - Variation saisonnière du profil chimique des différents extraits

Pour déterminer le profil phytochimique de chacun des extraits, une méthode HPLC a
été développée au laboratoire depuis quelques années pour investiguer la composition chimique
de matrices complexes. L’analyse est réalisée à partir d’une colonne en phase inverse (C18).
L’avantage de cette méthode est que le laboratoire dispose d’une base de données de standards
de composés présents dans les plantes. L’utilisation de cette méthode dans notre étude va
faciliter la caractérisation partielle des extraits. Les détails expérimentaux de cette méthode sont
décrits dans la partie expérimentale de ce mémoire.

Une fois l’analyse HPLC réalisée, l’échantillon est engagé dans une étude par LC-MS
en mode d’ionisation positif et négatif, puis éventuellement par LC-MS/MS en utilisant les
mêmes conditions.

La majorité des composés identifiés sont ionisés en mode négatif (ESI-), nous nous
intéresserons plus particulièrement à ce mode. Cependant, pour certains extraits comme les
feuilles, nous avons eu recourt aux deux modes d’ionisation (positif et négatif). Pour le même
organe, le profil de l’échantillon de la saison des pluies (A) est comparé à celui de la saison
sèche (B) pour identifier les éventuelles influences de l’environnement climatique, notamment
le stress hydrique, sur la biosynthèse des molécules.

49
 II.4.1 - Profils chimiques des extraits de feuilles

Les profils chromatographiques LC-MS des échantillons des feuilles de la saison des
pluies (A) et de la saison sèche (B) sont présentés sur la figure 23.

(A)

(B)

Figure 23. Profils chromatographiques des échantillons des feuilles

Le profil phytochimique a été réalisé par études des spectres de masse en utilisant une
base de données interne développée au laboratoire et en ayant recours aux données de la
littératures (réalisation de MS2). Le profil phytochimique des extraits de feuilles des deux
saisons apparait sensiblement identique (tableau 4).

Dans les deux profils, nous avons identifié : (i) des flavones glucosides comme la
vitexine, l’homoorientine, l’orientine, la vicenine ; (ii) des flavonoïdes comme la lutéoline, la
3,7-diméthylquercétine ; (iii) des iridoïdes tels que le 1-oxo-eucommiol, l’agnuside ; (iv) des
acides organiques comme l’acide quinique, acide citrique, l’acide dicaffeoyquinique et ses
isomères. Par ailleurs, les ecdystéroïdes, considérés comme les marqueurs taxonomiques du
genre Vitex (Sena et al., 2008), sont bien présents dans les deux échantillons des feuilles. Il

50
s’agit précisément de la 20-hydroxyecdysone, de l’ajugastérone C, de la vitexirone et de la
ptérostérone.

Pour certains composés comme l’agnuside, l’isovitéxirone ou l’eupatorine, on constate

une abondance relative plus faible pour l’extrait issu du matériel végétal récolté en saison des
pluies.

51
 Tableau 4. Composés identifiés dans les extraits de feuilles V. madiensis Oliv.

N° tr Composés FB M-H exp. M+H exp. MS2 exp. MS2 theo. VMFE1 VMFE2 Reference
(min)

1 3,25 Glucose C6H12O6 179,0555 + + Standard

2 3.90 Acide quinique C7H12O6 191,0553 191/85/127/93/85 191/85/192/127/87 + + Standard

3 6,91 Acide citrique C6H8O7 191,0189 191/129/111/87/85 111/87/85/191/129 + + Standard

4 7,72 1-oxo-eucommiol C9H14O5 201,0758 201/109/139 139/109 + + Masateru et al.,

1997

5 9,33 Acide 5-Ethylidene-2- C10H16O6 231,0866 231/213/169/125/157 231/213/187/185/169 + + Chen et al., 2015
hydroxy-2- /187/143 /159/151
hydroxyméthyl-3-
méthylhexanédioique

6 11,39 Acide C7H6O4 153,0179 109/153/110 153/109 + + Ganapaty et al.,

protocatéchique 2005 ; Chen et al,.
2015

7 14,72 Vicénine -1 C26H28O14 563,1413 563/353/383/297/473 473,2/443,24/383,34/ + + Elhawary et al.,

/443/297/325/503/54 353,32 2018 ; Raffaelli et
5 al., 1997

8 15,15 Homoorientine C21H20O11 447,0935 447/429/357/327/297 429/357/327 + + De Sousa Dias et al,.

/285 2013

9 15,77 Orientine C21H20O11 447,0937 369/357/327/299 369/357/327 + + De Sousa Dias et al.,

2013

10 16,04 Agnuside C22H26O11 465,1404 303/285/281/165/137 300/281/165/137/93 - + Ramakrishna et al.,

/121/93/89 2016 ; Nadeem et
al., 2020 ; Lin et

52
 al., 2015 ; Huang et
al., 2015

11 17,72 Vitexine C21H20O10 431,0986 311/283/341/341/413 413/383/353/341/311 + + Standard

/283

12 19,15 20-Hydroxyecdysone C27H44O7 525,3073 481,3152 445/371/165/427/125 463/ 445/ 427/ + + Kubo et al., 1984 ;
(M+HCOO-) /99/481 409/301 Wang et al., 2008

13 19,57 Lutéoline-7-O-β-D- C21H18O12 461,0734 285 285 + + Jeyadevi et al.,

glucuronide 2013

14 22,22 Acide 3,5- C25H24O12 515,1201 353/191/179 353/191/179 + + Standard

dicaffeoylquinique

15 23,84 Lutéoline-4'-O- C21H20O11 447,0939 285 447 /285 + + Khallouki et al.,

glucoside 2017

16 24,18 Isovitexirone C27H42O7 523,2917 479,2998 425/443/373/123/145 479/461/443/278 + + Vokáč et al.,

(M+HCOO-) /219303/407/461/479 2002 ; Olennikova
et al., 2019

17 26,57 Vitexirone C27H42O7 523,2917 479,2998 69/443/425/299/109/ 461 + + Kubo et al., 1990
(M+HCOO-) 407/479/461/281/311

18 27,84 Ptérostérone C27H44O7 525,3074 481,3152 445/ 427/ 371/ 125/ 462/444/ 426/ 408 + + Mahmoud et al.,
(M+HCOO-) 69 2019 ; Takemoto et
al., 1968

19 32,7 Ajugastérone C C27H44O7 525,3073 481,3152 427/445/81/409/299/ 481/445/427/409/311 + + Kubo et al., 1984 ;
(M+HCOO-) 311/481/ 463/189 Le Bizec et al.,
2002

20 38,57 Lutéoline C15H10O6 285,0405 + + Standard

21 40,99 3,7- C17H14O7 329,0664 314/299/271/243 314/299/271 - + Zhong et al., 2020

Diméthylquercétine

53
22 40,98 Acide rosmarinique C18H16O8 359,0777 344/329/359/314/286 359/344/329 - + El-Shazly et al.,
2021

23 41,82 Eupatorine C18H16O7 343,0824 328/298/270 343/328/298 + + Lengbiye et al.,

2018 ; Feng et al.,
2020

24 42,26 Acide C18H32O4 311,2232 293 293 - + Farag et al., 2022

octadécanédioïque

54
 II.4.2 - Profil chimique des extraits des écorces de tronc

Les profils chromatographiques LC-MS des échantillons des écorces de tronc de la

saison des pluies (A) et de la saison sèche (B) sont présentés sur la figure 24.

(A)

(B)

Figure 24. Chromatogrammes écorces de tronc (A) : saison de pluies ; (B) saison sèche

L’identification des composés, leur temps de rétention et leur masse sont représentés
dans le tableau 5. L’analyse de ces chromatogrammes montre que les profils sont constitués
essentiellement des phytoecdystérols, notamment la 20-hydroxyecdysone, l’ajugastérone C et
la vitexirone. On note une certaine variabilité des profils qui se traduit par la présence de
nouveaux composés dans l’extrait de la saison sèche mais absents dans l’extrait de la saison des
pluies. Dans l’extrait de la saison sèche, les phytostérols semblent être plus abondants tandis
que dans l’extrait de la saison des pluies, ils apparaissent comme des composés minoritaires et
au même niveau que les composés d’autres familles chimiques.

D’autre part, nous avons identifié la présence d’un composé à un temps de rétention de
27,59 min présente dans l’extrait de la saison sèche mais non identifiée en saison des pluies. Ce
composé pourrait correspondre à la pterostérone. L’acide chlorogénique (tr = 12,93 min.) et
l’agnuside (tr = 16,05 min.) semblent peu abondants dans l’extrait de la saison des pluies mais
moyennement abondants dans l’extrait de la saison sèche. La phytubérine (tr = 42,33 min.) est
présente dans l’extrait de la saison des pluies mais non identifiée en saison sèche.

55
 Tableau 5. Composés identifiés dans les extraits de l’écorce du tronc de V. madiensis Oliv.

N° tr Composés FB M-H exp. M+H exp. MS2 exp. MS2 théo. VMET1 VMET2 Reference
(min)
1 3,3 Dulcitol C6H14O6 181,0708 + + Ganapaty et al.,
2005

2 3,87 Acide quinique C7H12O6 191,0549 191/85/127/93/87 191/85/127/93/87 + + Standard

3 4,01 Saccharose C12H22O11 341,1087 + + Standard

4 6,89 Acide citrique C6H8O7 191,0189 191/129/111/87/85 111/87/85/191/129 + + Standard

5 7,74 1-oxo-eucommiol C9H14O5 201,0758 201/109/139 139/109 + + Masateru et al.,

1997

6 12,93 Acide C16H18O9 353,088 191/353/85/161/179 + + Standard

chlorogénique

7 13,76 Non identifé C20H28O8 395,1709 349/331/315 + -

8 14,58 Polypodine B C27H44O8 541,3016 497,3109 461/ 443/ 425/ 369/ 479/461/ 443/ 425/ 369 + + Malinski et al.,
(M+HCOO-) 327/ 299/ 165/ 99/ 81 2021 ; Le Bizec
et al. 2002

9 15,15 Homoorientine C21H20O11 447,0931 447/429/357/327/297 429/357/327 + + De Sousa Dias et

/285 al., 2013

10 15,79 Orientine C21H20O11 447,0931 369/357/327/299 369/357/327 + + De Sousa Dias et

al., 2013

11 16,05 Agnuside C22H26O11 465,1401 303/285/281/165/137 300/281/165/137/93 - + Ramakrishna et

/121/93/89 al., 2016 ;
Nadeem et al.,
2020 ; Lin et al.,
2015 ; Huang et
al., 2015

56
12 17,71 vitexine C21H20O10 431,0983 311/283/341/341/413 413/383/353/341/311/283 + + Standard

13 18,96 20- C27H44O7 525,3071 481,3152 445/371/165/427/125 463/ 445/ 427/ 409/301 + + Kubo et al.,
Hydroxyecdysone (M+HCOO-) /99/481 1984 ; Wang et
al., 2008

14 20,64 Acide 1,3- C25H24O12 515,1197 353/191/179 353/191/179 + + Standard

dicaffeoylquinique

15 22,1 Acide 3,5- C25H24O12 515,1197 + + Standard

dicaffeoylquinique

16 24,24 Acide 1,5- C25H24O12 515,1197 + + Standard

dicaffeoylquinique

17 26,52 Vitexirone C27H42O7 523,2916 479,2998 69/443/425/299/109/ 461 + + Kubo et al.,

(M+HCOO-) 407/479/461/281/311 1980

18 27,59 Pterostérone C27H44O7 525,3071 481,3152 445/ 427/ 371/ 125/ 462/444/ 426/ 408 - + Mahmoud et al.,
(M+HCOO-) 69 2019 ;
Takemoto et al.,
1968

19 32,47 Ajugastérone C C27H44O7 525,3071 481,3152 427/445/81/409/299/ 481/445/427/409/311 + + Kubo et al.,

(M+HCOO-) 311/481/ 463/189 1984 ; Le Bizec
et al., 2002

20 40,63 Chrysoeriol (3′- C16H12O6 299,0561 299/284/253 299/284 + + Uysal et al.,

méthoxy-4′,5,7- 2021
trihydroxyflavone)

21 42,33 Phytubérine C17H26O4 293,1759 236/221/293 236/221 + - Serralheiro et

al., 2020

57
 II.4.3 - Profil chimique des extraits des écorces de racines

Les profils chimiques correspondants aux extraits de racine sont repris dans la figure 25
et les données correspondant à leur identification sont présentées dans le tableau 6.

(A)

(B)

Figure 25. Chromatogrammes des écorces des racines (A) : saison des pluies ; (B) saison
sèche

Les profils des deux échantillons ne laissent pas apparaître de différences significatives.
Il est à noter que nous avons identifié parmi les métabolites secondaires présents dans les deux
extraits le shanzhiside (105), un iridoïde glycoxylé, qui n’avait jamais été jusqu’alors identifié
dans des extraits du genre Vitex. Cette molécule semblerait posséder des activités antioxydante
et anti-inflammatoire (Shan et al., 2019 ; Senger et al., 2016). On observe également la
présence d’un autre phytoecdystérol, la turkesterone, composé minoritaire dans les deux
extraits.

Dans l’extrait de la saison sèche, l’acide dicaffeoylquinique et ses isomères semblent très
abondants à la différence de l’extrait obtenu en saison des pluies.

58
Figure 26. Structure du shanzhiside identifié dans les extraits de racine

59
 Tableau 6. Composés identifiés dans les extraits des écorces de racine de V. madiensis Oliv.

N° tr Composés FB M-H exp. M+H exp. MS2 exp. MS2 theo. VMRA1 VMRA2 Reference
(min)

1 3,42 Acide gluconique C6H12O7 195,0496 129/89/87/85/75 129/89/87/85/75 + + Standard

2 3,96 Acide quinique C7H12O6 191,0549 191/85/127/93/87 191/85/192/127/93 + + Standard

3 4,08 Saccharose C12H22O11 341,1087 + + Standard

4 6,93 Acide citrique C6H8O7 191,0188 191/129/111/87/85 111/87/85/191/129 + + Standard

5 7,7 1-oxo-eucommiol C9H14O5 201,0757 201/109/139 139/109 + + Masateru et

al., 1997

6 8,39 Shanzhiside C16H24O11 391,1245 391/345/183/165/139/101 183/165/139/101 + + Serralheiro et

al., 2020

7 11,26 Acide C16H18O9 353,0872 - + Standard

Neochlorogénique

8 12,91 Acide C16H18O9 353,0872 191/353/85/161/179 - + Standard

chlorogénique

9 13,92 Non identifié C23H28O10 463,1585 112/ 68 112/ 68 + -

539/493/476/475/ 498/478/477/459/

457/389/377/ 446/441/425/422/409/ Ramazanou et

10 14,51 Carthamostérone A C28H44O10 539,2861 - +
343/327/335/ 317/299/251/ 239/83 379/361/343/326/ al., 1997

325/317/316/99/81

11 14,71 Polypodine B C27H44O8 541,3014 497,3098 461/ 443/ 425/ 369/ 327/ 299/ 165/ 479/461/ 443/ 425/ + + Malinski et
(M+HCOO-) 99/ 81 369 al., 2021 ; Le
Bizec et al.,
2002

60
12 15,04 Turkestérone C27H44O8 541,3014 497,3098 541/495/477/335//251/239/83 541/495/477/335/251/2 + + Massbank
(M+HCOO-) 39/83

13 16,04 Agnuside C22H26O11 465,1395 303/285/281/165/137/121/93/89 300/281/165/137/93 - + Ramakrishna

et al., 2016

14 19,31 20-Hydroxy C27H44O7 525,3065 481,315 445/371/165/427/125/99/481 463/445/ 427/ 409/301 + + Kubo et al.,
ecdysone (M+HCOO-) 1984 ; Wang
et al., 2008

15 20,7 Acide 1,3- C25H24O12 515,1201 + + Standard

dicaffeoylque

16 22 Acide 3,5- C25H24O12 515,1201 - + Standard

dicaffeoylquinique
(isomère)

17 24,42 Acide 1,5- C25H24O12 515,1201 - + Standard

dicaffeoylquinique

18 26,88 Vitexirone C27H42O7 523,2909 479,2994 69/443/425/299/109/ 461 + + Kubo et al.,

(M+HCOO-) 1990
407/479/461/281/311
19 27,66 Pterostérone C27H44O7 525,3065 481,315 445/427/371/125/69 462/444/ 426/ 408 - + Mahmoud et
(M+HCOO-) al., 2019 ;
Takemoto et
al., 1968

20 32,86 Ajugastérone C C27H44O7 525,3065 481,315 427/445/81/409/299/311/481/ 481/445/427/409/311 + + Kubo et al.,

(M+HCOO-) 463/189 1984 ; Le
Bizec et al.,
2002

21 40,33 Non identifié C28H44O8 507,2963 507/461/ 443/ 209 + -

22 41,74 Non identifié C11H18O4 213,1125 169 + -

61
 II.4.4 - Profil chimique de l’extrait des fruits

Les fruits de V. madiensis ne sont présents qu’à une seule période de l’année : la saison
des pluies. Le profil chimique de l’extrait des fruits est représenté dans la figure 27.

Figure 27. Chromatogramme des fruits

Parmi les composés identifiés (tableau 7), on retrouve les phytostéroïdes également
présents dans les autres organes, la 20-hydroxyecdysone, l’isovitexirone et la vitexirone. Nous
avons également identifié la présence de la kaladastérone, phytoecdystéroïde non recensé à ce
jour dans le genre Vitex. On observe un composé dont la structure n’a pas pu être identifiée à
ce jour en raison d’une trop faible quantité de composé isolé à tr = 32.46 minute. Dans cet
extrait, sont également présents des acides gras comme l’acide 9-hydroxyhexadécénoïque,
l’acide 2- décylénique, qui se présente de façon majoritaire dans l’extrait, l’acide
dihydroxyhexadécénoïque.

Enfin, il convient de noter la présence de flavones : la vitexine et la lutéoline.

62
 Tableau 7. Composés identifiés dans l’extrait de fruits.

N° tr Composés FB M-H exp. M+H exp MS2 exp. MS2 theo. Reference
(min)
1 3,9 Acide quinique C7H12O6 191,0549 191/85/127/93/87 191/85/127/93/85 Standard
2 6,91 Acide citrique C6H8O7 191,0186 191/129/111/87/85 111/87/85/191/129 Standard
3 7,79 1-oxo-eucommiol C9H14O5 201,0758 201/109/139 139/109 Masateru et al.,
1997
4 9,41 Acide 5-Ethylidene-2- C10H16O6 231,0868 231/213/169/125/157/18 231/213/187/185/16 Chen et al., 2015
hydroxy-2- hydroxymethyl- 7/143 9/159/151
3-méthylhexanedioïque
5 13,32 Non identifié C16H18O11 385,0775 177/112
6 13,86 Acide p-hydroxybenzoïque C7H6O3 137,0232 137 137/93 Ganapaty et al.,
2005 ; Vallverdú-
Queralt et al.,
2015
7 17,92 Vitexine C21H20O10 431,0978 Standard
8 18,21 Non identifié C20H28O7 379,176 333/315
9 19,12 20-Hydroxyecdysone C27H44O7 525,3064 481,3152 445/371/165/427/125/99/ 463/ 445/ 427/ Kubo et al.,
(M+HCOO-) 481 409/301 1984 ; Wang et
al., 2008
10 22,27 Acide 3,4- C25H24O12 515,1197 Standard
dicaffeoylquinique
11 24,41 Isovitexirone C27H42O7 523,2909 479,2998 461/443/425/407/369/278 479/461/443/278 Vokáč et al.,
(M+HCOO-) 2002 ;

63
 Olennikova et al.,
2019
12 26,77 Vitexirone C27H42O7 523,2909 479,2998 425/443/373/123/145/219 461 Kubo et al., 1990
(M+HCOO-) 303/407/461/479
13 29,08 Non identifié C27H26O13 557,1297 395/335/179/135
14 32,46 Non identifié C27H38O7 473,2539 123
15 33,56 Kaladastérone C27H42O7 523,2909 479,2998 477/459 477/460/445/183 Bourne et al.,
(M+HCOO-) 2002
16 38,59 Lutéoline C15H10O6 285,0405 Standard
17 40,02 Non identifié C28H42O9 521,2753 475/457/331/315/123
18 40,23 Non identifié C27H36O7 471,2383 427/123
19 40,85 Acide 9-Hydroxy- C16H30O5 301,2018 283/265/221
hexadécan-1,16-dioïque
20 41,07 Acide C16H32O4 287,2226 287/269/241 287/269/241 Elaskary et al.,
dihydroxyhexadécénoïque 2020
21 41,7 Acide 2-décylénique C10H18O2 169,1223 169
22 42,04 Acide octadécanédioïque C18H32O4 311,2226 293 293 Farag et al., 2022

64
 II.4.5 - Comparaison du profil phytochimique des quatre organes de V. madiensis

Comme nous l’avons détaillé précédemment, nous avons observé la présence des
phytoecdystéroïdes dans chacun des extraits. C’est la raison pour laquelle nous présentons la
comparaison du profil phytochimique des extraits selon un tableau comprenant une
classification à part pour cette famille chimique (tableau 8).

Tableau 8. Ecdystéroïdes et autres composés identifiés dans les extraits des feuilles, écorces de tronc,
écorces de racines et fruits de Vitex madiensis

M-H M +H Ms2
Composés tr (min)
(m/z) (m/z) (m/z) Fe ET ER Fr

Ecdystéroides
539/493/476/475/45
7/389/377/343/327/ - - + -
carthamostérone A 14,56 539,2861 335/317/299/83
461/ 443/ 425/ 369/
541,3016 327/ 299/ 165/ 99/ - + + -
14,64
polypodine B (M+HCOO-) 497,3098 81

541,3016 541/495/477/335//
turkestérone 15,04 - - + -
(M+HCOO-) 497,31098 251/239/83

463/ 445/ 427/ 409/

525,3065 481,3152 371/ 165/ 127/ 125/ + + + +
20-hydroxyecdysone 19,12
(M+HCOO-) 81/ 69

523,2909 461/443/425/407/36
isovitexirone 24,41 479,2998 + - - +
(M+HCOO-) 9/278

523,2908
vitexirone 26,77 461 + + + +
(M+HCOO-) 479,2998

525,3065 445/ 427/ 371/ 125/

ptestostérone 27,82 481,3152 + - - -
(M+HCOO-) 69

525,3061
ajugastérone C 32,75 481,3152 427/409/311/ 299 + + + -
(M+HCOO-)

523,2909
kaladastérone 33,56 479,2998 477/459 - - - +
(M+HCOO-)

Autres composés
acide quinique 3,90 191,0553 191/85/127/93/87 + + + +

acide citrique 6,91 191,0189 191/129/111/87/85 + + + +

1-oxo-eucommiol 7,77 201,0757 139/109 + + + +

65
 391/345/183/165/13
shanzhiside 8,67 391,1245 - + - -
9/101

orientine 15,91 447,0928 369/357/327/299 + + - -

vitexine 17,90 431,0981 + + - -

lutéoline 38,87 285,0405 + - - +

+ : présence du composé dans l’extrait ; - : Absence du composé dans l’extrait

Les analyses des échantillons des différents organes récoltés en saison des pluies et en
saison sèche ont permis d’identifier neuf phytoecdystéroïdes : la 20-hydroxyecdysone,
l’ajugastérone C, la carthamostérone A, la polypodine B, la turkestérone, l’isovitexirone, la
vitexirone, la pterostérone et la kaladastérone. Cette famille chimique, que l’on retrouve dans
d’autres espèces du genre Vitex, est présente dans les extraits, en abondance relative variable,
confirmant ainsi l’hypothèse que les ecdystéroïdes sont des marqueurs taxonomiques du genre
Vitex (Sena et al., 2008). En accord avec les données de la littérature, la 20-hydroxyecdysone
est présente dans nos extraits comme dans la plupart des espèces de Vitex (Sena et al., 2008 ;
Suksamrarn et al., 1997). L’ajugastérone C, la turkestérone et la vitexirone ont été identifiés
dans Vitex fisherii (Kubo et al., 1990), Vitex leptobotrys (Thuy et al.,1998), Vitex polygama
(dos Santos et al., 2001) et Vitex scabra (Suksamrarn et al., 2002) ; la polypodine B et la
pterostérone dans Vitex scabra (Suksamrarn et al., 2002). A notre connaissance, la
carthamosterone A et la kaladasterone ne sont pas encore identifiées dans les espèces du genre
Vitex. Cependant, elles ont été isolées des extraits de Leuzea carthamoides (asterceae), pour la
première (Girault et al., 1988), dans des espèces d’Ipomoea (convolvulaceae) pour la seconde
(Canonica et al., 1973).

La présence de ces phytoecdystéroïdes au niveau de chaque organe est variable. Certains

composés sont présents et abondants dans certains organes mais absents ou peu abondants dans
d’autres. Les feuilles, les écorces de tronc et les écorces de racines sont caractérisées
majoritairement par la présence de la 20-hydroxyecdysone, de l’ajugastérone C et de la
vitexirone tandis que les fruits sont caractérisés majoritairement par la présence de la 20-
hydroxyecdysone et de l’isovitexirone. L’ajugastérone C semble en revanche absente de cet
extrait qui présente un composé que nous n’avons jusqu’à présent pas pu identifier. Ce composé
possède un temps de rétention comparable à l’ajugastérone C.

Outre les phytoecdystéroïdes, des composés d’autres familles ont été identifiés dans les
différents extraits. Le 1-oxo-eucommiol, composé de la famille des iridoïdes est présent dans
tous les organes étudiés et très abondant dans les extraits des feuilles tandis que dans les autres
66
organes, il est moins abondant. Cet iridoïde a été isolé et identifié pour la première fois dans
l’extrait méthanolique des fruits de Vitex rotundifolia (Masateru et al., 1997). Mais c’est pour
la première fois qu’il est identifié dans V. madiensis. Le shanzhiside n’a été identifié que dans
les extraits de racine. Il n’avait jamais été identifié dans les extraits de V. madiensis ni dans
d’autres espèces du genre Vitex. Les flavonoïdes comme la vitexine, l’homoorientine,
l’orientine, la lutéoline, la vicénine 1 et la 3,7-diméthylquercétine ont été identifiés dans les
différents extraits. Ces flavonoïdes sont présents dans plusieurs espèces du genre Vitex (Hirobe
et al., 1997 ; Briggs et al., 1958 ; Seikel et al., 1966 ; Webster et al., 2011 ; Yamasaki et al.,
2008). Cependant, aucun composé de la famille des alcaloïdes et des tanins n’a été identifié
dans les différents extraits étudiés. Ainsi, l’absence des alcaloïdes dans les différents organes
récoltés confirme les nombreuses études réalisées sur le criblage phytochimique des espèces du
genre Vitex. C’est notamment ce que mettent en évidence les travaux réalisés par (Muanda,
2010) et (Ochieng et al., 2013) qui ont étudié des extraits de V. doniana, sans avoir pu mettre
en évidence la présence d’alcaloïdes.

II.5 - Evaluation du potentiel antiradicalaire et antioxydant des extraits

L’étude du profil chimique a montré que, qualitativement, il n’y a pas de différences

significatives sur la composition chimique entre les échantillons de la saison des pluies et ceux
de la saison sèche pour un même organe. Nous avons évalué le potentiel antiradicalaire et
antioxydant des extraits récoltés pendant les deux saisons afin de mettre en évidence les
similitudes observées au niveau des profils chimiques des extraits. Pour cela nous avons eu
recourt à deux méthodes.

La première consiste à mettre en évidence la capacité des extraits à inhiber le radical

libre DPPH par transfert de proton par un phénomène d’oxydation (activité antiradicalaire). En
présence d’un composé antiradicalaire, le DPPH violet en solution change de coloration et vire
au jaune (Prior et al., 2005). Ce radical absorbe à l’UV visible à 517 nm, il est stable à
température ambiante. Cette activité antiradicalaire est une méthode de mesure quantitative de
CI50 et pourrait être reliée à l’activité anti-inflammatoire (Krimat et al., 2017).

La deuxième méthode est celle qui consiste à mesurer la production de ROS induit par
les cellules sanguines en présence des extraits. En effet, les ROS sont considérés comme des
molécules toxiques du métabolisme cellulaire normal du corps et sont impliqués en cas
d’inflammation prolongée et chronique (Mital et al., 2014). Ainsi, une diminution de la
production de ROS stimulée par le PMA aura donc un effet positif dans l’organisme, ce qui va

67
 protéger l’organisme contre l’exposition aux dommages causés par ces derniers. Cette méthode
met en évidence le pouvoir antioxydant et le potentiel anti-inflammatoire des différents extraits.

Afin de mettre en application les différents extraits comme traitement potentiel dans le
cas d’une inflammation, il est indispensable d’étudier l’activité cytotoxique des extraits vis-à-
vis des cellules sanguines (leucocytes). Cette analyse consiste à incuber les leucocytes du sang
humain en présence des extraits et la résazurine avec du PMA et à observer la viabilité
cellulaire.

II.5.1 – Evaluation du potentiel antiradicalaire par le piégeage du radical DPPH

Le potentiel antiradicalaire des extraits est représenté sur les figures 28 et 29. Les
extraits des feuilles, des écorces de tronc et des fruits de Vitex madiensis inhibent de façon
significative le radical DPPH.

Vitex madiensis
120

100
% d'inhibition

80
VMRA1
60 VMFR1
vitc
40
VMET1
20 VMFE1

0
0 200µg/ml 600µg/ml 1000µg/ml 1200µg/ml

concentration

Figure 28. Pouvoir inhibiteur des extraits de la saison des pluies à différentes concentrations

68
 Vitex madiensis
120

100
% d'inhibition

80

60

40

20

0
0 200µg/ml 600µg/ml 1000µg/ml 1200µg/ml

Concentration
VMRA2 vitc VMET2 VMFE2

Figure 29. Pouvoir inhibiteur des extraits de la saison sèche à différentes concentrations

A partir des pourcentages d’inhibition des différents extraits obtenus, nous avons
déterminé les concentrations inhibitrices 50 (CI50) des extraits pour mieux caractériser le
pouvoir antioxydant.

Les CI50 des échantillons de la saison des pluies sont de l’ordre de 110 µg/mL pour
l’extrait des feuilles, de 125 µg/mL pour l’extrait d’écorces de tronc, de 210 µg/mL pour
l’extrait des fruits et de 980 µg/mL pour l’extrait d’écorces de racine (Tableau 10). Certaines
sont proches de celle de la vitamine C (CI50 =102 µg/mL). Pour les échantillons de la saison
sèche, les CI50 sont de l’ordre de 116 µg/mL pour l’extrait des feuilles, de 157 µg/mL pour
l’extrait d’écorces de tronc et 329 µg/mL pour l’extrait d’écorces de racine. Les feuilles, les
écorces de tronc et les fruits récoltés pendant les deux saisons ont inhibés le radical DPPH de
manière significative. Cependant l’extrait des feuilles récoltés en saison des pluies est plus actif
que l’échantillon de la saison sèche mais la différence n’est pas significative entre les deux
échantillons par rapport à la vitamine C prise comme référence. De même pour les écorces de
tronc, l’échantillon de la saison des pluies est plus actif que celui de la saison sèche mais la
différence n’est pas significative. Quant aux extraits des écorces de racine récoltées pendant les
deux saisons, aucun effet significatif n’a été observé sur le radical DPPH, leurs CI50 sont
largement supérieures par rapport à celle de la vitamine C (CI50= 980 µg/mL pour l’échantillon
de la saison des pluies et IC50 = 329 µg/mL pour l’échantillon de la saison sèche) (Tableau 9).

69
 Tableau 9. Concentrations inhibitrices des extraits et de la vitamine C

Vitamine C
Feuilles Ecorce de tronc Ecorce racines Fruits
(µg/mL)
SP SS SP SS SP SS SP
Echantillons
VMFE1 VMFE2 VMET1 VMET2 VMRA1 VMRA2 VMFR1 102
CI 50
110 116 125 157 980 329 210
(µg/ml)

Les extraits de Vitex madiensis récoltés pendant les deux saisons se sont révélés très
actifs en inhibant le radical DPPH de manière significative, c’est le cas des feuilles, des écorces
de tronc et, dans une moindre mesure, des fruits. Des études ethnopharmacologiques antérieures
ont montré que les extraits de Vitex madiensis ont des effets antiradicalaires (Lengbiye et al.,
2018), ce qui est cohérent avec les résultats obtenus.

Les organes les plus étudiés quant à leur activité antiradicalaire pour le genre Vitex sont
les feuilles et les fruits (Kubo et al., 1984 ; Lenbiye et al., 2018 ; Sena Fhilo et al., 2008 ;
Girault et al., 1988). Dans la littérature, les auteurs ont étudié l’activité antiradicalaire par la
méthode du radical DPPH des fruits murs et non matures de trois espèces de Vitex notamment
V. doniana, V. kenensis et V. fischeri du Kenya dans les différents solvants comme le méthanol
et l’acétone (Ochieng et al., 2010). L’étude a montré que les extraits de fruits murs ont une
bonne activité antioxydante avec des CI50 proches de la vitamine C pris comme référence (VDr
0,58 ± 0,028 µg/mL ; VKr 0,47 ± 0,017 µg/mL ; VFr 0,46 ± 0,006 µg/mL; Vit C 0,249 ± 0,06
µg/mL), ce que corrobore parfaitement nos résultats qui montrent un effet anti radicalaire
significatif de l’extrait des feuilles et fruits sur le radical DPPH en comparaison avec la vitamine
C. Dans une étude similaire, Adjei a montré que l’extrait méthanolique des fruits de V. doniana
a des effets antiradicalaires (Adjei et al., 2021). Par ailleurs, les extraits de feuilles et écorces
de tronc inhibent de manière significative le radical DPPH avec des CI50 (110 et 125 µg/mg)
très proches de la vitamine C. Nos résultats corroborent des études menées sur l’extrait
éthanolique des feuilles de V. doniana (extraction au soxhlet) et ses différentes fractions
obtenues par extraction liquide-liquide par solvants de polarité croissante qui ont révélé un
pouvoir antioxydant significatif (extrait brut 84,14 ± 0,03 % ; fraction hexanique 78,45 ± 0,01
% ; fraction acétate d’éthyle 92,03 ± 0,02% ; fraction aqueuse 88, 15 ± 0,01% ; Vitamine C
98,24 ± 0,05%) (Sarr et al., 2015). Les mêmes résultats ont été observés dans les travaux

70
réalisés sur les extraits hydro alcooliques (eau/méthanol à 50%) des feuilles, écorces de tronc
et écorces de racine de V. doniana (Fe 2,9 µg /mg ; ET 2,9 µg/ mg ; ER 2,9 µg/mg) (Muanda,
2010). Cependant, l’extrait de racine de Vitex madiensis n’a pas inhibé le radical DPPH bien
qu’il contienne les mêmes phytostérols, composés majoritaires présents dans les extraits des
feuilles, écorces de tronc et fruits. Cette observation pourrait être due par la présence de
composés d’autres familles chimiques agissant en synergie dans les autres extraits mais absents
dans cet extrait de racine.

II.5.2 - Corrélation entre potentiel antiradicalaire et teneur en polyphénols totaux

L’étude du potentiel antiradicalaire des extraits a permis d’établir une corrélation entre
les teneurs en polyphénols totaux et flavonoïdes totaux et l‘activité des extraits. Ainsi, les
extraits riches en composés phénoliques présentent des effets antioxydants significatifs. En
effet, les activités antiradicalaires observées pour les extraits dans cette étude concordent avec
les fortes teneurs en polyphénols et flavonoïdes totaux contenues dans les extraits. Les extraits
des feuilles, des écorces de tronc et fruits riches en composés phénoliques présentent une forte
capacité inhibitrice du radical DPPH par rapport à l’extrait de racine qui n’a pas présenté d’effet
significatif. Plusieurs auteurs ont rapporté une corrélation entre les teneurs en polyphénols des
extraits de Sechium edule, Glossogyne tenuifolia, Desmodium adscendens, Ficus capensis,
Stevia rebaudiana et Daniella oliveri, par rapport à leur capacité inhibitrice du radical DPPH
(Hsu et al., 2005 ; Ordoñez et al., 2006, Muanda, 2010).

Compte tenu des résultats encourageants concernant l’activité antiradicalaire des

extraits, nous avons souhaité évaluer le potentiel antioxydant et la cytotoxicité de ces extraits.

II.5.3 - Potentiel antioxydant des extraits de V. madiensis

Le potentiel antioxydant des extraits a été déterminé par le test de production de ROS.
Ce test a été réalisé sur des cellules sanguines (leucocytes) de donneurs par consentement à
l’EFS de la ville de Clermont-Ferrand. Les mesures d’activité antioxydante sont réalisées en
présence des extraits avec quatre concentrations (10, 25, 50, 100 µg/mL). Un témoin constitué
de cellules seules stimulées par le PMA est également ajouté en parallèle à chaque série de test.
Cette mesure est réalisée sur une microplaque 96 puits toutes les 5 min pendant 2 heures à
37 °C.

Les résultats sont exprimés en unités de fluorescence relative (RFU). Les résultats pour
chaque extrait sont exprimés en pourcentage moyen (± écart-type moyen) par rapport au témoin

71
fixé à 100 %. Une analyse de la variance (ANOVA) est réalisée par comparaison au témoin
selon la méthode de Dunnett. Selon l’intervalle de confiance à 95% choisi, un résultat sera
significatif lorsque p < 0,05.

II.5.3.1 - Cinétique de la production des ROS dans les différents extraits

Le PMA stimule l’augmentation de la production des ROS induit par des leucocytes du
sang total. Cette augmentation devient significative au cours du temps. Les différentes courbes
cinétiques des quatre échantillons de la matière végétale récoltées en saison des pluies, incubés
avec les leucocytes du sang et le PMA présentent la même allure. La cinétique se fait avec un
accroissement de la fluorescence des extraits et du témoin au cours du temps, de façon générale,
puis d’un abaissement de la fluorescence des extraits incubés avec les leucocytes à différentes
concentrations par rapport à la fluorescence du témoin qui continue d’augmenter. Cette
diminution de fluorescence par rapport au témoin se fait en trois phases. Une première phase,
entre 0 et 30 minutes qui correspond à une cinétique de diminution lente de la production des
ROS en présence des extraits pour toutes les concentrations par rapport au témoin, une seconde
phase entre 30 et 90 minutes qui correspond à une forte cinétique d’inhibition de la production
des ROS en présence des extraits par rapport au témoin, suivie de la troisième phase entre 90
et 120 minutes qui correspond à une cinétique maximale d’inhibition toujours par rapport au
témoin jusqu’à ce que l’équilibre soit atteint (figures 30, 31, 32 et 33).

45000
40000
Fluorescence (UA)

35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Temps (min)

Témoin +PMA 10 µg/mL +PMA 25 µg/mL +PMA

50 µg/mL +PMA 100 µg/mL +PMA

Figure 30. Cinétique d’inhibition de la production de ROS par VMFE1

72
 60000

Fluorescence (UA)
50000

40000

30000

20000

10000

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Temps (min)

Témoin +PMA 10 µg/mL +PMA 25 µg/mL +PMA

50 µg/mL +PMA 100 µg/mL +PMA

Figure 31. Cinétique d’inhibition de la production de ROS par VMET1

50
Fluorescence (UA)

40

30

20

10

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Temps (min)

Témoin +PMA 10 µg/mL +PMA 25 µg/mL +PMA

50 µg/mL +PMA 100 µg/mL +PMA

Figure 32. Cinétique d’inhibition de la production de ROS par VMFR1

73
 40

Fluorescence (AU)
30

20

10

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Temps (min)

Témoin +PMA 10 µg/mL +PMA 25 µg/mL +PMA

50 µg/mL +PMA 100 µg/mL +PMA

Figure 33. Cinétique d’inhibition de la production de ROS par VMRA1

La réaction de réduction de la production de ROS par les extraits est maximale, proche
de l’équilibre après 90 minutes pour toutes les concentrations et pour tous les échantillons.
Cependant, la production des ROS a diminué par rapport au témoin positif dès la plus faible
des concentrations utilisées pour les extraits VMFE1 et VMET1 (figures 30 et 31) et à partir
des fortes concentrations pour les extraits VMFR1 et VMRA1.

II.5.3.2 – Impact des extraits sur la production de ROS

L’inpact des extraits de Vitex madiensis sur la production de ROS incubés avec les
leucocytes du sang total et stimulés par le PMA (1 µM) a été calculé à 2 heure. Les valeurs sont
exprimées en pourcentage du témoin (cellules incubées avec du PMA et sans extraits). Les
données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM (n = 3- 6).

L’effet sur l’inhibition de la production des ROS induit par les leucocytes sanguins est
significatif pour *p ˂ 0,05 ; **p ˂ 0,01 et ***p ˂ 0,001 par rapport au témoin normalisé à 100
%. En effet, l’évaluation du potentiel antioxydant et anti inflammatoire par l’inhibition de la
production des ROS a montré qu’à différentes concentrations (10, 25, 50 et 100 µg/mL), les
extraits des feuilles et des écorces de tronc récoltées pendant la saison des pluies et pendant la
saison sèche ont inhibé la production de ROS dès la concentration la plus faible, par contre les
fruits récoltés en saison des pluies ont montré un effet à la plus forte concentration (figure 34).

74
 120
(a) 140 (b)

Prroduction de ROS (%)

production de ROS (%)
100 120

** 100
80
* 80 *
60 * ***
*** *** 60 ***
40 *** * **
*** 40 ***
20 20
0 0
Témoin 10 25 50 100 Témoin 10 25 50 100

Concentration (µg/mL) Concentration (µg/mL)

VMFE1 VMFE2 VMET1 VMET2

160 160
(c) (d)
140 140
Production de ROS (%)

Production de ROS (%)

120 120
100 100
80 80
60
*
60
40 40
20 20
0 0
Témoin 10 25 50 100 Témoin 10 25 50 100
Concentration (µg/mL) Concentration (µg/mL)
VMFR1 VMRA1

Figure 34. Production de ROS de leucocytes sanguins à 2 h (a) : feuilles récoltées en saison de
pluies et en saison sèche ; (b) : écorces de tronc récoltées en saison de pluies et en saison
sèche ; (c) : fruits récoltés en saison de pluies ; (d) : racines récoltées en saison de pluies.

Dès une concentration de 10 µg/mL, les extraits des deux échantillons de feuilles ont
montré des effets significatifs, dose-dépendante avec des pourcentages de production de ROS
respectifs de 73 et 77 %. A 100 µg/mL, les deux échantillons ont montré un pourcentage de
production de ROS de moins de la moitié par rapport au témoin, soit 41 % pour l’échantillon
de la saison des pluies et 32 % pour l’échantillon de la saison sèche. L’échantillon de l’écorce
de tronc, récolté en saison sèche a montré un effet significatif "dose dépendante" dès 10 µg/mL
avec une valeur de 73 % tandis que pour celui de la saison de pluies, l’effet "dose dépendante"
est observé à partir de 50 µg/mL avec un pourcentage de production de ROS de 63 %. Quant à
l’extrait de fruits, l’effet significatif est observé à 100 µg/mL, le pourcentage de production de
ROS est alors de 57 %. On observe aux concentrations 25 et 50 µg/mL une tendance de

75
réduction de la production de ROS par rapport au témoin mais cette tendance donne un effet
non significatif par rapport à l’analyse statistique qui montre un test student p > 0,05. Par
ailleurs, l’extrait de racine n’a pas montré d’effet significatif à toutes les concentrations testées
bien qu’une tendance de diminution de la production de ROS est observée à 100 µg/mL et cette
tendance à diminuer les ROS donne un pourcentage de 72 % de production avec une valeur
statistique non significative, p > 0,05.

Selon les résultats observés pour les échantillons de feuilles qui sont sensiblement
similaires au cours de deux saisons, à 10 µg/mL (73 et 77 %) comme à 100 µg/mL (41 et 32%),
nous pouvons conclure que les facteurs exogènes, notamment le stress hydrique, n’ont pas eu
d’effets significatifs sur les activités biologiques de cet organe. Cependant, au niveau des
échantillons des écorces de tronc, il a été montré que l’échantillon de la saison sèche est plus
actif sur la production de ROS avec une valeur de 73 % dès 10 µg/mL et 36 % à 100 µg/mL.
L’échantillon de la saison de pluies, à 10 µg/mL, n’a pas présenté d’activité antioxydante (117%
de production de ROS contre 58 % à 100 µg/mL concentration à laquelle on observe une forte
activité).

Ainsi, nos résultats sont similaires aux travaux réalisés par Dufour (2006) sur l’extrait
méthanolique des feuilles de Ledum groenlandicum Retzius. Cet auteur utilise cependant une
technique différente de la nôtre. Il utilise les radicaux libres oxygénés produits par les cellules
L-929. Les résultats de Dufour ont montré une forte capacité antioxydante des extraits. Les
travaux d’autres auteurs réalisés en utilisant la même méthode que celle utilisée dans cette étude
ont montré que les extraits bruts méthanoliques des plantes peuvent être utilisés comme
réducteurs des radicaux libres oxygénés en raison de leur fort pouvoir antioxydant sur la
production des ROS induit par les leucocytes sanguins (Gainche et al., 2020 ; Cholet et al.,
2019).

Les effets observés pour nos extraits pourraient être dus aux phytoecdystéroïdes qui
caractérisent majoritairement nos différents extraits en synergie avec d’autres composés comme
les composés phénoliques identifiés dans les extraits des feuilles, des écorces de tronc et de
fruits et même dans les racines. On peut estimer que V. madiensis réduit la production des ROS
en modulant l’activité enzymatique ayant lieu dans la transduction de voie, cas de protéine
Kinase C, phospholipase C et bien d’autres. Peu d’études dans la littérature expliquent
l’efficacité des espèces du genre Vitex dans la réduction des ROS induit par les leucocytes

76
humains et leur participation dans le processus de l’inflammation par la technique que nous
avons utilisé dans cette étude.

II.6 - Effet des extraits bruts sur la viabilité cellulaire

En évaluant les activités antioxydantes et le potentiel anti inflammatoire des différents

extraits bruts, il est important d’étudier en parallèle leur activité cytotoxique sur la viabilité
cellulaire.

La viabilité des leucocytes humains a été évaluée par le test de la résazurine. Les extraits
sont incubés avec les leucocytes totaux stimulés par le PMA et la résazurine pendant 24 h. Les
résultats montrent qu’à la concentration la plus élevée (100 µg/mL), il y a une diminution
significative de la viabilité cellulaire de 40 % d’après les analyses statistiques réalisées (p ˂
0,05) pour l’extrait des feuilles récoltés en saison sèche (figure 35A), de même pour l’extrait
de racine, à la plus forte concentration, 100 µg/mL, une diminution de la viabilité cellulaire de
37 % est observée (p ˂ 0,05) (figure 35C). Ces résultats suggèrent que ces extraits ont une
activité cytotoxique modérée à la concentration 100 µg/mL. Contrairement aux extraits des
feuilles récoltées en saison des pluies, les écorces de tronc récoltées pendant les deux saisons
ainsi que les fruits, aucune modification significative de la viabilité cellulaire n’est observée
quelle que soit la concentration testée (figure 35).

77
 150

Viabilité cellulaire (%)

100
*
50
(A)
0
Témoin 10 25 50 100
Concentration (µg/mL)

VMFE1 VMFE2

150
Viabilité cellulaire (%)

100

50 (B)

0
Témoin 10 25 50 100
Concentration(µg/mL)

VMET1 VMET2

150
Viabilité cellulaire (%)

100
*
50
(C)
0
Témoin 10 25 50 100
Concentration (µg/mL)

150
Viabilité cellulaire (%)

100

50
(D)

0
Témoin 10 25 50 100
Concentration

Figure 35. Cytotoxicité des extraits sur la viabilité cellulaire. (A) : extraits des feuilles
récoltées pendant les deux saisons ; (B) : écorce de tronc récoltée pendant les deux saisons ;
(C) : racine saison des pluies ; (D) : fruits récoltés en saison des pluies. Les résultats sont la
moyenne ± SEM (n=4-6 expériences indépendantes)

78
 Les différents extraits présentent un potentiel antioxydant et anti-inflammatoire à toutes
les concentrations, car l’effet observé sur la viabilité cellulaire à 100 µg/mL est modéré par
rapport au témoin qui est normalisée à 100 %. Pour la suite de nos travaux, nous nous sommes
focalisés sur les extraits VMFE1, VMET1 et VMFR1, car leur activité antiradicalaire et leur
potentiel à inhiber la production de ROS sont les plus significatifs.

L’activité antioxydante peut être due aux phytoecdystéroïdes comme décrit dans la littérature.
Nous allons donc nous intéresser plus particulièrement à cette famille de composés dans la suite
de nos travaux.

II.7 - Etude bioguidée des extraits bioactifs

Nous avons donc poursuivi nos travaux en concentrant nos efforts sur l’étude des
extraits bioactifs, VMFE1, VMET1 et VMFR1, afin de mettre en évidence les molécules
d’intérêt. Ces extraits ont été fractionnés par extraction liquide / liquide par des solvants
organiques de polarité croissante selon le schéma de fractionnement de la figure 36.

II.7.1 - Fractionnement de l’extrait VMFE1

Les solvants organiques utilisés par ordre de polarité croissante sont le cyclohexane, le
dichlorométhane, l’acétate d’éthyle et le n-butanol. L’extrait VMFE1 est dissout dans de l’eau.
La phase aqueuse obtenue est extraite successivement trois fois avec chacun des solvants
précisés précédemment suivant le schéma de la figure 36.

79
 Figure 36. Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante des feuilles de Vitex
madiensis

Le profil LC-MS des cinq fractions E1-cyclo, E2-DCM, E3-AcOEt, E4-BuOH et E5-H2O a
permis de déterminer les familles des composés contenues dans ces fractions.

80
 II.7.1.1 - Profils phytochimiques des fractions

Afin d’identifier les profils de différentes fractions, nous représentons dans le tableau
10 les principaux composés identifiés dans l’extrait brut.

Tableau 10. Principaux composés identifiés dans l’extrait brut

Pic tr (min) Composé FB M-H exp (m/z)

1 3,90 Acide quinique C7H12O6 191,0548

2 6,91 Acide citrique C6H8O7 191,0186

3 7,77 1-oxo-eucommiol C9H14O5 201,0756

4 9,40 Acide 5-Ethylidene-2-hydroxy- C10H16O6 201,0756

2- hydroxyméthyl-3-
méthylhexanedioïque

5 11,49 3,4-acide hydroxybenzoïque C7H6O4 153,0179

6 14,76 Vicénine-1 C26H28O14 563,1404

7 15,15 Homoorientine C21H20O11 447,0928

8 15,91 Orientine C21H20O11 447,0928

9 17,90 Vitexine C21H20O10 421,0977

10 19,12 20-hydroxyecdysone C27H44O7 525,3065

(M+HCOO-)

11 22,22 Acide 3,5-dicaffeoylquinique C25H24O12 515,1190

12 23,84 Lutéoline-4'-O-glucoside C21H20O11 447,0930

13 24,36 Isovitexirone C27H42O7 523,2908

(M+HCOO-)

15 26,78 Vitexirone C27H42O7 523,2908

(M+HCOO-)

16 27,84 Ptérostérone C27H44O7 525,3065

(M+HCOO-)

17 32,70 Ajugastérone C C27H44O7 525,3065

(M+HCOO-)
18 38,57 Lutéoline C15H10O6 285,0403

19 40,99 3,7-Diméthylquercétine C17H14O7 329,0664

20 41,82 Eupatorine C18H16O7 343,0824

81
 Comme on pouvait s’y attendre, les fractions obtenues au cyclohexane et
dichlorométhane contiennent des composés apolaires type flavonoïdes et, compte tenu de leur
polarité, les phytoecdystéroïdes, comme on pouvait s’y attendre sont présents dans les fractions
obtenues avec l’acétate d’éthyle et le butanol.

Les figures 37 à 41 présentent les profils chimiques des cinq fractions obtenues.

Acide 17-hydroxylinolénïque Acide octadécanédioïque

Chrysosplenol D
Acide 16-hydroxyhexadécanoïque

20-hydroxyecdysone
lutéoline

Figure 37. Profil chimique de la fraction E1-cyclo

3,7-diméthylquercétine 3-O-méthylkaempférol

eupatorine
Chrysosplénol D

Figure 38. Profil chimique de la fraction E2-DCM

82
 Acide 3,5-dicaffeoylquinique
lutéoline
20-hydroxyecdysone

Ajugastérone C
Isorhamnétine

Vitexirone
Orientine

Isovitexirone
Acide para-hydroxybenzoïque

Ptérostérone
3,4-acide hydroxybenzoïque

Figure 39. Profil chimique de la fraction E3-AcOEt

20-hydroxyecdysone

Vitexine

Lutéoline -4-O-glucoside
Orientine
Vitexirone
Isovitexirone Ajugastérone C
Homoorientine

Figure 40. Profil chimique de la fraction E4-BuOH

Acide quinique

1-oxo-eucommiol 20-hydroxyecdysone
Acide citrique

Vicénine homoorientine

Figure 41. Profil chimique de la fraction E5-H2O

83
 L’analyse chromatographique des profils chimiques de chaque fraction montre que la
fraction E1-cyclo contient des quantités importantes des acides gras, une petite quantité de 20-
hydroxyecdysone et deux flavonoïdes : la lutéoline et le chrysosplénol D en faible quantité. La
fraction E2-DCM contient une quantité importante de 3,7-diméthylquercétine, de l’eupatorine,
du chrysosplénol D et le 3-O-méthylkaempférol. La fraction E3-AcOEt est caractérisée par une
très grande quantité de la lutéoline qui représente le composé majoritaire de cette fraction et
elle est connue pour ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. On observe également
la 20-hydroxyecdysone et l’ajugastérone C en quantité assez importante, la vitexirone, et des
acides organiques comme l’acide para-hydroxybenzoïque et l’acide 3,4-hydroxybenzoique.
Quant à la fraction E4-BuOH, elle est caractérisée par la présence majoritaire de 20-
hydroxyecdysone mais aussi, en abondance moindre de vitexirone, d’ajugasterone C et de
ptérostérone. La fraction E5-H2O est caractérisée essentiellement par les composés très polaires
comme l’acide gluconique, l’acide citrique, une quantité importante d’acide quinique (composé
majoritaire de la fraction) et de 1-oxo-eucommiol.

Nous avons ensuite évalué l’activité antioxydante et le potentiel anti-

inflammatoire des cinq fractions E1-cyclo, E2-DCM, E3-AcOEt, E4-BuOH et E5-H2O afin
d’identifier les familles chimiques les plus actives et mettre en évidence le ou les composés
chimiques responsables des activités observées.

II.7.1.2 - Potentiel antioxydant des fractions

L’activité antioxydante et le potentiel anti-inflammatoire des cinq fractions obtenues a

été évaluée par la méthode intracellulaire de production de ROS induit par les leucocytes
sanguins stimulés par le PMA ainsi que par la méthode bioautographique HPTLC avec le DPPH
comme révélateur des composés actifs.

II.7.1.2.1 - Méthode intracellulaire de production de ROS des fractions

Les cinq fractions ont été testées pour leur activité antioxydante par la technique
intracellulaire de ROS induit par les leucocytes sanguins, stimulés par le PMA. Les résultats
montrent que les fractions E1-cyclo, E3-AcOEt et E4-BuOH ont pu diminuer de manière
significative la production des ROS induit par les leucocytes sanguins à différentes
concentrations testées (figure 42). La fraction possédant la meilleure activité est E3-AcOEt avec
une inhibition de 47 % dès la concentration la plus faible (10 µg/mL). Avec respectivement 44
et 37 % d’inhibition, les fractions E1-cyclo et E4-BuOH possèderaient également une activité
intéressante.
84
 % de production de ROS (Témoin = 100%) 160

140

120

100

80
***
**
60

40

20

0
E1-cyclo E2-DCM E3-AcOEt E4-BuOH E5-H2O
E5-H2O

10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL

Figure 42. Production de ROS des leucocytes sanguins, incubés avec les fractions et stimulés
avec du PMA (1 µM) pendant 2h. les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± SEM
(n=3), *p< 0,05, **p< 0,01 et ***p< 0,001 par rapport au témoin normalisé à 100%.

L’analyse des profils chromatographiques de ces trois fractions actives montre la

présence commune de la 20-hydroxyecdysone et l’ajugastérone C. À ces composés majoritaires
s’ajoutent, pour la fraction E3-AcOEt, la lutéoline et l’acide 3,5-dicaffeoylquinique qui sont
caractéristiques de cette fraction. Cependant, la 20-hydroxyecdysone est largement majoritaire
dans la fraction butanol aussi bien que dans la fraction E3-AcOEt. Ainsi, l’activité antioxydante
observée dans ces trois fractions pourrait être due à la 20-hydroxyecdysone et l’ajugastérone C
dont les propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires ont été démontrées par plusieurs
auteurs (Dinan et al., 2021 ; Hu et al., 2012 ; Cai et al., 2002 ; Arif et al., 2022) en synergie
avec la lutéoline et l’acide 3,5-dicaffeoylquinique très répandus dans la fraction E3-AcOEt dont
les propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires sont également connues (Vargaa et al.,
2018 ; Mizuno et al., 2017 et Seeling et al., 2008). Par ailleurs, les fractions E2-DCM et E5-
H2O n’ont pas montré d’effet inhibiteur sur la production de ROS. Cette différence des résultats
entre les fractions peut s’expliquer par la composition chimique de ces dernières.

85
 II.7.1.2.2 - Effet des fractions sur la viabilité cellulaire

Les cinq fractions ont été testées pour leur effet sur la viabilité des leucocytes sanguins
incubés avec du PMA et la résazurine pendant 24 h. Il est important d’étudier l’activité
cytotoxique des fractions sur la viabilité des cellules, ce test permet de mettre en corrélation
l’effet des fractions sur la production de ROS et la viabilité cellulaire afin d’évaluer si le
potentiel antioxydant des extraits pourrait être valorisé sans danger pour les cellules. Les
résultats de l’étude sont présentés dans la figure 43. Il a été montré qu’à la concentration la plus
élevée, 100 µg/mL, on observe un effet significatif sur la viabilité cellulaire, soit un pourcentage
de viabilité cellulaire de 48 % pour la fraction E3-AcOEt ; en revanche les autres fractions E1-
cyclo, E2-DCM, E4-BuOH et E5-H2O n’ont pas montré d’effet sur la viabilité cellulaire
quelque soit la concentration testée.

La fraction E3-AcOEt présente ainsi une activité antioxydante et anti-inflammatoire dès

la concentration 10 µg/mL jusqu’à la concentration 50 µg/mL ; à partir d’une concentration
beaucoup élevée, 100 µg/mL, cette fraction devient cytotoxique pour la viabilité des leucocytes
sanguins.
140
% de viabilité cellulaire (Témoin = 100%)

120

100

80

60
*
40

20

0
E1-cyclo E2-DCM E3-AcOEt E4-BuOH E5-H₂O

10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL

Figure 43. Effet des fractions sur la viabilité cellulaire pendant 24 h. Les résultats sont la
moyenne ± SEM (n=3 expériences indépendantes), *p < 0,05 par rapport au Témoin
normalisé à 100 %.

86
 La fraction Butanol (E4-BuOH) contenant une quantité importante de
phytoecdystéroïdes majoritaires et étant active et non cytotoxique à toutes les concentrations
testées sera engagée dans une nouvelle démarche de fractionnement afin d’en isoler les
composés actifs.

II.7.1.3 - Fractionnement de la fraction E4-BuOH

La fraction E4-BuOH est fractionnée par chromatographie flash en phase inverse avec
une colonne C18 et éluée par le mélange eau et acétonitrile (v/v). 8 fractions ont été collectées
après un suivi par CCM (phase C18) avec un éluant constitué d’un mélange eau/acétonitrile
(70/30) comme representé sur la figure 44. Chaque fraction collectée a été solubilisée dans du
méthanol (HPLC grade) à la concentration de 1 mg/mL puis analysée en LC-MS. Les fractions
ont ensuite été analysées en RMN mono dimensionnelle (1H et 13
C) et bi dimensionnelle
(COSY, HSQC, HMBC). Les spectres de masse expérimentaux ont été comparés avec ceux de
la littérature.

L’analyse des chromatogrammes (LC-MS) et des spectres RMN (1H, 13C) des fractions
issues de la première purification a permis d’isoler puis d’identifier dans la fraction F3 (figure
44) la 20-hydroxyecdysone (42 mg ; tr = 19,12 min, HRM-ESI [M+H]+ C27H44O7, m/z calculée
481,3159 pour m/z expérimentale 481,3152).

Les autres fractions n’étant pas suffisamment pures, elles ont été rassemblées en une
même fraction nommée E4-BuOHP1 qui a été par la suite engagée dans une deuxième
purification par chromatographie flash dans les mêmes conditions. A l’issu de cette deuxième
purification, 9 fractions ont été collectées et analysées par LC-MS et RMN. La fraction F’9 a
permis d’isoler et d’identifier l’ajugastérone C (21 mg ; tr = 32,75 min, HRM-ESI [M+H]+
C27H44O7, m/z calculée 481,3159 pour m/z expérimentale 481,3152). Les autres fractions
contenant un mélange de composés ont été rassemblées en une fraction appelée E4-BuOHP2.
Elle a été à nouveau engagée dans une purification par chromatographie flash suivant les mêmes
conditions opératoires précédemment utilisées, 9 nouvelles fractions ont été collectées et
soumises à des analyses LC-MS et RMN. Les fractions F’’4 et F’’9 ont permis de nouveau
d’isoler et d’identifier respectivement la 20-hydroxyecdysone et l’ajugastérone C.

87
 Fraction butanolique (E4-BuOH)

Première purification
300 mg

F1 F2 F4 F5 F6 F7 F8 F3
75 mg 35 mg 20 mg 31 mg 7 mg 5 mg 9 mg 42 mg
20 HE

Deuxième purification
Fraction butanolique
E4-BuOHP1 (182 mg)

F’1 F’2 F’3 F’4 F’5 F’6 F’7 F’8 F’9

33,2 mg 35 mg 11 mg 2,4 mg 23 mg 7 mg 5,6 mg 2,2 mg 21 mg
ajugastérone
C

Fraction butanolique E4-BuOHP2

(119,3 mg)

Troisième purification
F’’1 F’’2 F’’3 F’’4 F’’5 F’’6 F’’7 F’’8 F’’9
7,8 mg 12 mg 11 mg 14 mg 16 mg 18 mg 13 mg 11 mg 7 mg
ajugastérone
20 HE C

Prep1

Figure 44. Schéma de séparation et purification des composés

En raison de la complexité des constituants des fractions F’’1 à F’’8, celles-ci ont été
rassemblées en Prep1 et engagées dans une purification par HPLC-préparative en mode
isocratique.

Purification du mélange Prep1 par HPLC-préparative

Le mélange Prep1 (88,7 mg) a été purifié par HPLC préparative en mode isocratique
avec une colonne C18 et un éluant composé d’un mélange d’eau et d’acétonitrile (80/20). Le

88
débit de la phase mobile a été fixé à 17 mL/min et la détection des composés a été réalisée à
254 nm.

Quatre (4) fractions ont été collectées et analysées par LC-MS et RMN (1H et 13
C) comme
illustré sur la figure 45.

Prep1 (88,7 mg)

PrepF1 PrepF2 PrepF3 PrepF4

1,8 mg 5,3 mg 1,9 mg 3,1 mg
vitexirone ptérostérone

Figure 45. Schéma de purification par HPLC-préparative en mode isocratique

L’analyse des résultats des spectres de masse et RMN (1H et 13C) a permis d’identifier la
vitexirone dans la fraction PrepF2 (tr = 26,77 mn, HRM-ESI [M+H]+ C27H42O7, m/z calculée
479,30033 pour m/z expérimentale 479,2998) et la ptérostérone dans la fraction PrepF4 (tr =
27,82 min, HRM-ESI [M+H]+ C27H44O7, m/z calculée 481,3159 pour m/z expérimentale
481,3152).

II.7.1.4 - Détermination structurale des composés isolés

II.7.1.4.1 - Identification de la 20-hydroxyecdysone

Le spectre LC-MS enregistré en mode d’ionisation positive de la fraction F3, produit obtenu
sous forme de poudre verte, montre un ion de pic moléculaire m/z 525,3065 [M+HCOO-] ; soit
une masse [M+H] + 481,3152, correspondant à la formule brute C27H44O7, figure 46.

L’étude des différents spectres RMN (1H et 13C) de la fraction F3 nous a permis de confirmer
la structure de la 20- hydroxyecdysone. On observe les signaux de 27 noyaux de carbone après
l’observation et l’analyse du spectre RMN 13 C (400 MHz, CD3OD), dont :
- Un carbonyle à 206,5 ppm.
- Un carbone quaternaire éthylénique à 168,2 ppm.
- Un carbone éthylénique (CH) à 122,1 ppm.
Le spectre RMN 1H (400 MHz, CD3OD) révèle la présence de :
- 5 signaux des protons de méthyle sous forme des singulets
- Un proton H-7 sous forme de doublet à =5,80 ppm, de constante J= 2,4Hz.

89
 - Deux protons H-11 formant chacun un multiplet à =1,81 et 1,70 ppm.
Les analyses RMN 1D (1H et 13
C) sont cohérentes avec celles publiées par (Malinski et al.,
2021 ; Budèsinsky et al., 2008).

Figure 46. Structure de la 20-hydroxyecdysone

II.7.1.4.2 - Identification de l’ajugastérone C

La fraction F9 a permis d’isoler et de confimer la structure l’ajugastérone C (21 mg ; tr =

32,75 min, HRM-ESI [M+H]+ C27H44O7, m/z calculée 481,3159 pour m/z expérimentale
481,3152), figure 47. Après analyse des spectres de masse et RMN, la détermination structurale
du composé est confirmée par comparaison les données obtenues avec celles de la littérature
(Larguet, 2011 ; Budèsinsky et al., 2008).

13
Les analyses RMN C et 1H (400 MHz, CD3OD) confirment la présence de 27 atomes de
carbone dans ce composé avec les caractéristiques principales suivantes :

- Un carbonyle de cétone à =206,6 ppm.

- Un carbone quaternaire éthylénique à =165,7 ppm.
- Un carbone éthylénique (CH) à =122,7 ppm

Sur le spectre 1H, on localise :

- Un proton H-7 sous forme de doublet à =5,79 ppm avec une constante J=2,4 Hz. Le
proton H-7 montre une tache de corrélation avec un proton résonant sous forme d’un
doublet de doublets à =3,06 ppm, de constante J= 8,9 et 2,4 Hz. Ce proton est attribué
à H-9.

90
 - Le proton H-9 montre une tache de corrélation avec le proton H-11 résonant sous forme
d’un multiplet à = 4,09 ppm. Sa valeur du déplacement chimique indique la présence
d’un hydroxyle en C-11.

Les caractéristiques détaillées en RMN 13C et 1H (400 MHz, CD3OD) sont représentées dans la
partie expérimentale de ce mémoire.

Figure 47. Structure de l’ajugastérone C

II.7.1.4.3 - Identification de la vitexirone

L’analyse des différents spectres RMN enregistrés dans le méthanol deutéré de la

fraction prepF2 montre la présence d’un composé présentant le squelette carboné des
phytoecdystéroïdes (Kubo et al., 1990).

L’analyse de la fraction prepF2 en LC-MS a montré un pic correspondant à un composé

dont le spectre de masse indique un ion moléculaire à m/z 479,2998, correspondant à [M+H]+
C27H42O7.

L’étude du spectre RMN 13C enregistré montre la présence des signaux de 21 noyaux
de carbone et 36 signaux de protons observés sur le spectre RMN 1H. Il manque 6 protons et
carbones. Les 6 protons manquant sont liés aux oxygènes pour former les groupements
hydroxyles et les 6 carbones manquants sont des carbones quaternaires par déduction du spectre
HMBC. Ces analyses permettent d’identifier la vitexirone (figure 48) après comparaison des

91
déplacements chimiques obtenus avec ceux observés dans la littérature bien que le solvant
utilisé pour réaliser l’analyse RMN dans notre étude ne corresponde pas à celui utilisé dans la
littérature (Kubo et al., 1990).

Les différents spectres révèlent les caractéristiques suivantes :

- Sur le spectre RMN 1H, le proton H-7 est identifié à δ = 5,80 ppm formant un doublet
avec une constante de couplage J=2,6 Hz. Sur le spectre COSY, ce proton H-7 montre
une tache de corrélation avec un proton H-5 résonant sous forme d’un doublet de doublet
à δ= 2,34 ppm (J= 13,1 et 3,5 Hz). Sur le même spectre COSY, le proton H-5 présente
deux taches de corrélation avec le proton H-4 et H-7. La valeur du déplacement
chimique de proton H-11, δ= 4,10 ppm formant un multiplet montre que le C-11 a un
substituant hydroxyle, ce proton H-11 présente deux taches de corrélation avec H-9 et
H-12.
- La présence du proton H-24 oléfinique à δ= 5,26 ppm sous forme d’un triplet (J= 6,8
Hz). Le spectre COSY indique que ce proton H-24 présente une tache de corrélation
avec les protons d’un groupe de vinyl méthyle Me-27 formant un singulet à δ= 1,65
ppm et une autre tache de corrélation avec le proton H-23 avec δ= 2,28 et 1,97 ppm
formant chacun un multiplet.
- Les protons H-1 forment un doublet de doublet à δ= 2,60 ppm (J= 12,5 et 4,1 Hz) et un
d’un multiplet à δ= 1,76 ppm. Ces protons présentent une tache de corrélation COSY
avec le proton H-2.
- Le proton H-2 à δ= 4,00 ppm forme un triplet de doublet (J = 11,8 et 4,1 Hz). Ce proton
corrèle avec H-1 et H-3.
L’analyse du spectre HMBC permet de localiser le carbone C-9 à δ = 42,60 ppm par sa
corrélation avec le proton H-9 résonant sous forme d’un doublet de doublet à δ= 3,15 ppm (J =
8,5 et 2,0 Hz). Ce carbone C-9 permet d’identifier les protons Me-19 formant un singulet à δ=
1,06 ppm (δ = 24,3 ppm). Ainsi donc, les protons Me-19 présentent des taches de corrélation
avec les protons H-1 du groupement CH2 (C-1 à δ= 38,8 ppm). Le proton H-5 à δ= 2,34 ppm
se présente sous forme d’un doublet de doublet (J= 13,1 et 3,5 Hz), porté sur le carbone C-5 à
δ = 52,2 ppm.

92
 Figure 48. Structure de la vitexirone

II.7.1.4.4 - Identification de la pterostérone

L’analyse de la fraction prepF3 en LC-MS a montré un pic correspondant à un composé

dont le spectre de masse indique un ion moléculaire à m/z 481,3152, correspondant à (tr = 27,82
min, HRM-ESI [M+H]+ C27H44O7.

Les différents spectres RMN enregistrés dans le méthanol deutéré de la fraction prepF4
montre la présence d’un composé présentant le squelette carboné des phytoecdystéroïdes
(Mahmoud et al., 2019). Les données obtenues sont identiques à celles publiées par
(Suksamrarn et al., 1999 ; Mahmoud et al., 2019), ce qui conduit à l’identification de la
ptérostérone, figure 49.

Les différents spectres révèlent les caractéristiques suivantes :

- Un carbonyle à = 205,3 ppm

- Un carbone quaternaire éthylénique à 167,6 = ppm
- Un carbone éthylénique (CH) à = 121,4 ppm
Le spectre RMN 1H (400 MHz, CD3OD) montre la présence de :

- Deux protons H-1 formant chacun un multiplet à = 1,25 ppm et = 1,54 ppm. Ce sont
les protons du groupement CH2 portés sur le carbone C-1 ( = 34,9 ppm). Le spectre
COSY montre une tache de corrélation avec le proton H-2 à = 3,58 ppm du carbone C-
2 ( = 67,9 ppm). Sur le spectre COSY, le proton H-2 montre des taches de corrélation

93
 avec les protons H-1 et H-3. Le proton H-3 résonne sous forme d’un multiplet à = 3,81
ppm et présente des taches de corrélation sur le spectre COSY avec H-2 et H-4.
- Sur le spectre RMN 1H, on localise le proton H-7 à = 5,80 ppm, sous forme d’un
doublet (J= 2,2 Hz). Ce proton corrèle avec le proton H-9 résonnant sous forme d’un
multiplet à = 3,13 ppm. Ainsi donc, ce dernier corrèle avec les protons H-11.
- Le carbone C-9 permet de localiser les protons du groupement méthyle Me-19, résonant
sous forme d’un singulet.
- Un groupe de protons de méthyle Me-26, formant un doublet à = 0,89 ppm (J= 6,5 Hz).
- Un groupe de protons de méthyle Me-27 sous forme d’un doublet à = 0,96 ppm (J= 6,5
Hz).
Ces protons Me-26 et Me-27 corrèlent avec le proton H-25 du carbone C-25 ( = 51,4 ppm)
sous forme d’un mutiplet.

Figure 49. Structure de la pterostérone

94
 II.7.1.5 - Activité antioxydante et potentiel anti-inflammatoire des
phytoecdystéroïdes isolés

Comme pour les fractions obtenues par solvants de polarité croissante, la 20-
hydroxyecdysone, l’ajugastérone C et la vitexirone ont été testé pour leur activité antioxydante
par la méthode intracellulaire de production de ROS. Nous avons également évalué leur effet
sur la viabilité des leucocytes sanguins. La quantité trop faible de ptérostérone obtenue ne nous
a pas permis de réaliser les tests biologiques sur ce composé.

II.7.1.5.1 - Méthode intracellulaire de production de ROS des

phytoecdystéroïdes isolés

Les résultats obtenus pour chaque molécule sont exprimés en pourcentage moyen (±
écart-type moyen) par rapport au témoin fixé à 100 % (le témoin étant les cellules seules
stimulées par le PMA). La figure 50 traduit une diminution significative de la production de
ROS par les leucocytes totaux après 2 h d’incubation en présence d’ajugastérone C, de 20-
hydroxyecdysone ou de vitexirone. Cet effet est retrouvé respectivement dès les concentrations
de 1 µM, 5 µM, 10 µM ou 25 µM.

Témoin
Production de ROS à 120 min 1 µM
5 µM
150
10 µM
***
Production de ROS (%)

125 25 µM

100
**
*** **
75

50

25

0
Ajugastérone
AjugastéroneC 2020E
HE Vitexirone
n=4 n=5 n=3
Figure 50. Effet de l’ajugastérone C, de la 20HE et de la vitexirone sur la production de ROS
après 2 h d’incubation en présence de PMA. Les valeurs sont obtenues par mesure de la
fluorescence induite par la rhodamine 123. Les résultats sont exprimés en pourcentage de
variation par rapport au témoin. * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001

95
 II.7.1.5.2 - Effet des phytoecdystéroïdes isolés sur la viabilité
cellulaire

La 20-hydroxyecdysone, l’ajugastérone C et la vitexirone ont été testées à 1, 5, 10 et 25

µM pour leur effet sur la viabilité cellulaire. La figure 51 montre qu’aucun effet significatif sur
la viabilité cellulaire n’est observé en présence des trois molécules étudiées.

Témoin
Viabilité cellulaire à 120 min 1 µM

150 5 µM
10 µM
Viabilité cellulaire (%)

125 25 µM

100

75

50

25

0
Ajugastérone C
Ajugastérone 20HE
20E Vitexirone
n=4 n=5 n=3

Figure 51. Effet de l’ajugastérone C, de la 20-hydroxyecdysone et de la vitexirone sur la viabilité

cellulaire après 2 h d’incubation en présence de PMA. Les résultats sont exprimés en pourcentage de
moyenne ± SEM par rapport au témoin.

II.7.1.5.3 - Evaluation de l’activité anti-inflammatoire de la 20-

hydroxyecdysone (20-HE)

La 20-hydroxyecdysone ayant les meilleurs résultats en terme d’activité antioxydante,

nous avons souhaité évaluer son potentiel anti-inflammatoire. Nous avons ainsi mesuré son
impact, à une concentration de 1 µM, sur l’expression de l’enzyme COX-2 par les leucocytes
totaux stimulés cette fois-ci par le LPS pendant 4 h. Les leucocytes sont isolés comme
précédemment décrit. Les résultats obtenus pour l’échantillon provenant de cellules stimulées
et exposées à la 20-hydroxyecdysone sont exprimés en pourcentage moyen (± écart-type) par
rapport au témoin ramené à 100 % (le témoin étant l’échantillon provenant de cellules seules
96
 stimulées). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test de Student (vs Témoin) dont
le seuil de l’intervalle de confiance a été fixé à 95 %, soit un résultat significatif lorsque
p < 0,05. La mise en présence de 20-hydroxyecdysone sur les leucocytes totaux stimulés par le
LPS pendant 4 h provoque une réduction significative de l’expression relative de la COX-2 par
les cellules de plus de 70 % par rapport au témoin comme le montre la figure 52. Ceci confirme
le potentiel anti-inflammatoire de cette molécule.

Expression de COX-2 à 4 h en présence de LPS

100
Expression de COX-2 (%)

50
**

0
Témoin 20HE
20E
n=3

Figure 52. Impact de la 20-HE sur l'expression relative de COX-2. Les résultats mesurés par qPCR sont exprimés en
pourcentage d'expression par rapport au témoin (leucocytes stimulés par le LPS, sans 20-HE) fixé à 100 %. ** : p < 0,01

97
 II.7.2 - Fractionnement de l’extrait VMET1

Comme pour l’échantillon VMFE1, l’extrait VMET1 est fractionné en utilisant des solvants de
polarité croissante ainsi qu’illustré dans le schéma de la figure 53.

Extrait méthanolique VMET1 (11,00 g)

440 mL H2O +3 x 110 mL cyclohexane

E1-cyclo
0,42 g H2O

E2-DCM 2,973gx 110 mL CH2Cl2

0,50 g
H2O
E3-AcOEt 3 x 110 mL AcOEt
2,40 g 2,97 g
H2O
E4-BuOH 3 x 110 mL BuOH
3,51 g 2,97 g
E5-H2O résiduelle
2,27 g

Figure 53. Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante de VMET1

Le profil LC-MS des cinq fractions E1-cyclo, E2-DCM, E3-AcOEt, E4-BuOH et

E5-H2O a été réalisé et a permis de déterminer les familles des composés contenues dans ces
fractions.

98
 II.7.2.1 - Profils phytochimiques des fractions obtenues

Afin d’identifier les profils de différentes fractions, nous représentons dans le tableau
11 les principaux composés identifiés dans l’extrait brut.

Tableau 11. Principaux composés identifiés dans l’extrait brut

Pic tr (min) Composé FB M-Hexp (m/Z)

1 3,87 Acide quinique C7H12O6 191,0549
2 6,89 Acide citrique C6H8O7 191,0189
3 7,74 Acide 5-Ethylidene-2- C9H14O5 201,0759
hydroxy-2-
hydroxyméthyl-3-
méthylhexanedioïque

4 13,13 Inconnu C20H28O8 395,1710

5 14,58 Polypodine B C27H44O8 541,3017
(M+HCOO-)
6 15,09 Homoorientine C21H20O11 447,0931
7 15,79 Orientine C21H20O11 447,0931
8 17,71 Vitexine C21H20O10 431,0981
9 18,96 20-hydroxyecdysone C27H44O7 525,3065
(M+HCOO-)
10 20,64 Acide 1,3- C25H24O12 515,1193
dicaffeoylquinique
11 24,24 Acide 3,5- C25H24O12 515,1193
dicaffeoylquinique
12 26,52 Vitexirone C27H42O7 523,2908
(M+HCOO-)
13 32,47 Ajugastérone C C27H44O7 525,3065
(M+HCOO-)
14 40,63 3-O-méthylkaempférol C16H12O6 299,0561
15 42,33 Phytubérine C17H26O4 293,1759

Les figures 54 à 58 présentent les profils chimiques des cinq fractions obtenues.

99
 Acide hexadécanédioïque

cannabifolin C

Acide 1β,2α,3α-trihydroxyurs-12-ène-28-oïque

Figure 54. Profil chimique de la fraction E1-cyclo

Acide hexadécanédioïque

Acide 17-hydroxylinolénique

Chrysosplénol D

Figure 55. Profil chimique de la fraction E2-DCM

100
 Vitexirone

20-hydroxyecdysone
Homoorientine
Acide p-hydroxybenzoïque

DCQ
Acide 3,4-hydroxybenzoïque

Orientine

DCQ
Calonystérone

DCQ
Ajugastérone C

Figure 56. Profil chimique de la fraction E3-AcOEt

20-hydroxyecdysone
Homoorientine

Orientine

DCQ

DCQ
Isovitexirone Vitexirone
Polypodine B

Ajugastérone
C

Figure 57. Profil chimique de la fraction E4-BuOH

101
 Acide quinique

Acide citrique

1-oxo-eucommiol

Acide glucocafféique
Polypodine B
20-hydroxyecdysone

Figure 58. Profil chimique de la fraction E5-H2O

L’analyse chromatographique des profils chimiques de chaque fraction montre que la

fraction E1-cyclo contient des quantités importantes d’acides gras notamment l’acide
hexadécanédioïque et l’acide 1β, 2α, 3α-trihydroxyurs-12-ène-28-oïque. La fraction E2-DCM
contient essentiellement des acides gras et des flavonoïdes notamment le chrysosplénol D. La
fraction E3-AcOEt est caractérisée majoritairement par la présence d’acide dicaffeoylquinique
et de ses isomères, l’homoorientine et orientine (flavonoïdes), la 20-hydroxyecdysone, la
vitexirone et l’ajugastérone C (phytoecdystéroïdes). La fraction E4-BuOH est majoritairement
caractérisée par la présence de phytoecdystéroïdes, d’acides dicaffeoylquiniques et de
flavonoïdes. Enfin, la fraction aqueuse E5-H2O est constituée notamment de l’acide quinique
et du 1-oxo-eucommiol (iridoïde).
Comme pour VMFE1, nous avons ensuite évalué l’activité antioxydante des cinq fractions E1-
cyclo, E2-DCM, E3-AcOEt, E4-BuOH et E5-H2O. Cependant les fractions les plus actives
issues de VMET1 ne feront pas l’objet d’un fractionnement chromatographique approfondi du
fait qu’elles présentent pour la plupart les profils chimiques similaires avec ceux issus de
VMFE1, décrit précédemment.

102
 II.7.2.2 – Evaluation du potentiel antioxydant des fractions par la
méthode de ROS

Les cinq fractions E1-cyclo, E2-DCM, E3-AcOEt, E4-BuOH et E5-H2O ont été testées
pour leur activité antioxydante par la méthode intracellulaire de production de ROS induit par
les leucocytes sanguins. Les résultats ont montré que les fractions E1-cyclo, E3-AcOEt et E4-
BuOH ont inhibé la production de ROS de manière significative à différentes concentrations
(figure 59). La fraction E3-AcOEt est la plus active avec un pourcentage de production de ROS
de 74 %, soit une inhibition de 26 % à la concentration moyenne de 25 µg/mL contre une
inhibition de 54 % à la concentration de 50 µg/mL pour la fraction E1-cyclo et 32 % pour la
fraction E4-BuOH à 50 µg/mL. Il faut noter qu’à 10 et 25 µg/mL, les fractions E1-cyclo et E4-
BuOH ont montré une tendance d’inhibition de la production des ROS mais avec aucun effet
significatif par rapport au témoin (p > 0,05). La fraction E5-H2O a montré une tendance à
inhiber la production de ROS à toutes les concentrations testées mais avec un effet non
significatif (p> 0,05) tandis que la fraction E2-DCM a montré une prolifération de la production
de ROS à toutes les concentrations testées.

10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL

160
% de production de ROS (Témoin = 100 %)

140

120

100

80 ** **
**
** **
60
* *
40

20

0
E1-cyclo E2-DCM E3-AcOEt E4-BuOH E5-H2O
E5-H2O

Figure 59. Production de ROS des leucocytes sanguins, incubés avec les fractions et stimulés
avec du PMA (1 µM) pendant 2h. Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± SEM
(n=3), *p< 0,05, **p< 0,01 et ***p< 0,001 par rapport au témoin normalisé à 100%.

103
 II.7.2.3 - Effet des fractions sur la viabilité cellulaire

Les fractions E1-cyclo, E2-DCM, E3-AcOEt, E4-BuOH et E5-H2O ont été testées pour
leur effet sur la viabilité des leucocytes sanguins incubés avec du PMA et la résazurine pendant
24 h. Les résultats de l’étude sont présentés dans la figure 60. Il a été montré qu’à la
concentration la plus élevée, 100 µg/mL, on observe un effet significatif sur la viabilité
cellulaire pour la fraction E2-DCM. Cette perte de viabilité cellulaire est de 38 % bien que la
fraction n’ait pas montré d’effet inhibiteur sur la production de ROS. Quant aux fractions E1-
cyclo, E3-AcOEt, E4-BuOH et E5-H2O, aucun effet n’a été observé sur la viabilité cellulaire.

160

140
% de viabilité cellulaire (Témoi = 100 %)

120

100

80
*
60

40

20

0
E1-cyclo E2-DCM E3-AcOEt E4-BuOH E5-H2O
E5-H2O

10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL

Figure 60. Viabilité cellulaire des fractions pendant 24 h des fractions VMET1. Les résultats
sont la moyenne ± SEM (n=3 expériences indépendantes), *p < 0,05 par rapport au Témoin
normalisé à 100 %.

Il est notable que les fractions VMET1 issues de l’écorce de tronc possèdent un pouvoir
antioxydant moindre et une cytotoxicité plus élevée par rapport aux fractions issues de VMFE1.

104
 II.7.3 - Fractionnement de l’extrait VMFR1

L’extrait VMFR1 étant actif sur la production des ROS induit par les leucocytes du
sang, il a été fractionné par extraction liquide-liquide (figure 61) afin d’isoler et d’identifier le
composé inconnu (composé 14, tableau 8) qui pourrait être un composé de la famille des
ecdystéroïdes et présenter des propriétés biologiques intéressantes. Ce composé inconnu
présente un temps de retention identique à celui de l’ajugastérone C identifiée dans les autres
extraits bruts mais ne possède pas la même masse molaire. Les fractions issues de cet extrait
n’ont pas fait l’objet d’études biologiques. Compte tenu de la polarité du composé étudié, le
fractionnement au butanol n’a pas été réalisé.

Extrait méthanolique brut (10,00 g VMFR1)

400 mL H2O +3 x100 mL cyclohexane

E1-cyclo H2O

2,97 g
3 x 100 mL CH2Cl2
E2-DCM

H2O
E3-AcOEt
2,12 g 2,97 g3 x 100 mL AcOEt

H2O résiduelle

2,97 g
Figure 61. Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante de VMFR1

Comme attendu, l’analyse des fractions par HPLC, montre que le composé cible est
présent dans la fraction E3-AcOEt.

La fraction E3-AcOEt est ainsi purifiée par chromatographie flash en phase inverse avec une
phase mobile constituée d’un mélange d’eau et d’acétonitrile (v/v). A l’issu de ce
fractionnement, 4 fractions ont été collectées après un suivi par CCM (phase C18) avec l’éluant
eau/acétonitrile (70/30) comme schématisé sur la figure 62.

105
 E3-AcOEt (400,0 mg)

F1 F2 F3 F4
4,2 mg 3,2 mg 4 mg 1,3 mg

Figure 62. Schéma de purification par chromatographie flash de la fraction E3-AcOEt

Les 4 fractions collectées ont été analysées en HPLC. Les chromatogrammes

obtenus des différentes fractions montrent que le composé attendu est présent dans la fraction
F1 avec une bonne pureté. Cependant la pureté et la quantité de composé obtenu ne sont pas
suffisantes pour déterminer la structure de ce composé par RMN. Il aurait été nécessaire de
purifier une plus grande quantité d’extrait de fruits pour identifier ce composé, mais faute de
temps nous n’avons pas pu réitérer cette purification.

II.8 - Evaluation du potentiel antiradicalaire par bioautographie HPTLC des

extraits bruts, des fractions et des phytoecdystéroïdes isolés

Un des axes de recherche de notre laboratoire consiste à développer l’utilisation de

l’HPTLC comme outil d’analyse du profil phytochimique de matrices complexes mais aussi de
ʺscreeningʺ d’activités biologiques directement sur une couche mince. Cette technique qui est
en plein essor est appelée ʺbioautographieʺ. Ainsi, nous avons souhaité confirmer les résultats
obtenus pour l’étude des extraits bioactifs en utilisant cette technique.

Pour cette étude, notre choix s’est orienté vers une technique de mésure d’activité
antiradicalaire que nous avons déjà utilisé par ailleurs impliquant le DPPH. Dans cette méthode,
le DPPH est un de révélateur des composés ayant des effets antiradicalaires, l’activité
antiradicalaire des composés se manifestera par l’apparition de taches jaunes sous fond violet
sur la plaque (inhibition des radicaux). Les analyses par bioautographie HPTLC ont été réalisées
sur les extraits bruts, les fractions et les phytoecdystéroïdes.

106
 II.8.1- Bioautographie HPTLC des extraits bruts

L’analyse par bioautographie a montré que les extraits VMFE1, VMFE2, VMET1,
VMET2 et VMFR1 présentent une activité antiradicalaire. En revanche, les extraits VMRA1 et
VMRA2 ne semblent pas être actifs (figure 63).

Pour les extraits qui ont eu des effets antiradicalaires, sur la ligne de dépôt, nous remarquons la
présence de composés très polaires qui pourraient être des acides phénoliques et les flavonoïdes
glycosylés. Sur le front du solvant, on observe également certains composés possédant une
activité antiradicalaire plus ou moins marquée qui pourraient être des flavonoïdes ou des
flavones.

Les extraits méthanoliques des feuilles, écorces de tronc et fruits présentent donc des
composés chimiques possédant des effets antiradicalaires comparables au témoin utilisé (extrait
méthanolique de Reine-des-prés). En effet, l’activité semble très significative pour les extraits
de feuilles et les écorces de tronc récoltés pendant les deux saisons. Ces observations confirment
ainsi l’hypothèse que les parties aériennes sont dotées d’un grand pouvoir antioxydant. Au
demeurant, ce sont bien ces parties que les tradipraticiens prescrivent en médecine traditionnelle
(Danton, 2017 ; Lautenschläger et al., 2018 ; Ondo et al., 2012). Les fruits, consommable
aussi, ont un pouvoir antiradicalaire mais peu significatif par rapport aux feuilles et aux écorces
de tronc.

II.8.2 - Bioautographie HPTLC des fractions issues de VMFE1

Nous avons réalisé l’analyse par bioautographie HPTLC sur les cinq fractions issues
de VMFE1 (figure 63).

Les fractions possédant le plus grand potentiel antiradicalaire sont E3-AcOEt, E4-
BuOH et E5- H2O (figure 63B). En revanche, les fractions constituées des composés les moins
polaires E1-cyclo et E2-DCM ne semblent pas actives. Ceci confirme les résultats obtenus avec
le test ROS pour la fraction E2-DCM. Les composés ayant manifesté une activité antiradicalaire
dans la fraction E3-AcOEt pourraient être des flavonoïdes. En effet, nous avons remarqué les
taches jaunes intenses au milieu de la plaque et sur le front du solvant. Quant aux fractions E4-
BuOH et E5-H2O, les composés actifs sur le radical libre DPPH seraient des acides phénoliques
et des flavonoïdes glycosylés.

107
 II.8.3 - Evaluation de l’activité antiradicalaire des phytoecdystéroïdes isolés
par bioautographie

Le test réalisé par bioautographie HPTLC sur les phytoecdystéroïdes isolés s’est révélé
négatif. Les composés ne semblent donc pas inhiber le radical DPPH (figure 63B). Ce résultat,
contraire à ceux obtenus par le test ROS, montre la limite de ce type de test antiradicalaire pour
évaluer un potentiel antioxydant.

Figure 63. Analyse HPTLC avec dérivatisation du DPPH, A : à 254 nm ; B : à 366 nm

108
 II.9 - Dosage de la 20-hydroxyecdysone dans les extraits

Le fractionnement des extraits des feuilles et des écorces de tronc de V. madiensis nous
ont permis de mettre en évidence des phytoecdystéroïdes dont les activités sur la production de
ROS sont très intéressantes. Afin d’établir une corrélation entre les activités de ces extraits et
la présence de ces métabolites secondaires nous avons voulu réaliser un dosage de la 20-
hydroxyecdysone dans les différents extraits.

La comparaison des chromatogrammes des échantillons a montré que la 20-

hydroxyecdysone est le phytoecdysteroïde que l’on retrouve dans les extraits des feuilles, des
écorces de tronc, des écorces de racines et dans les extraits de fruits du V. madiensis. Il est
également présent dans la plupart des espèces du genre Vitex. Compte tenu de l’activité anti-
inflammatoire de ce phytostérol, il nous a semblé important d’évaluer sa concetration dans les
quatre organes par les dosages HPLC et HPTLC

II.9.1 - Dosage par HPLC

La 20-hydroxyecdysone a été dosée par HPLC. L’analyse est réalisée sur une colonne
en phase inverse (C18). Les détails de la méthode sont décrits dans la partie expérimentale.

Une gamme de quatre étalons de 0,05 ; 0,1 ; 0,2 et 0,3 mg/mL a été réalisée avec un standard
isolé à partir de la fraction butanol des feuilles récoltées pendant la saison des pluies, puis des
solutions des différents extraits sont préparées à une concentration de 1 mg/mL, sauf pour
l’extrait VMET1 qui a été préparé à une concentration de 5 mg/mL. Un coefficient de
corrélation R2 ˃ 0,99 est obtenu.

La figure 64 montre le chromatogramme du composé standard, la 20-hydroxyecdysone pure, la

longueur d’onde d’absorption est de 254 nm. Son temps de rétention est 18,16 min.

Figure 64. Chromatogramme du standard (20-hydroxyecdysone)

109
 Concentration de 20-hydroxyecdysone dans les différents extraits

Une droite d’étalonnage est tracée, puis la concentration de 20-hydroxyecdysone dans

les différents extraits est déterminée en utilisant l’équation de la droite de régression linéaire
obtenue en fonction de l’aire du pic correspondant à la 20-hydroxyecdysone dans chaque
échantillon. Les chromatogrammes de chaque échantillon sont représentés sur la figure 65.

20 HE
20 HE
VMFE1 VMFE2

20 HE 20 HE
VMET1
VMET2

20 HE 20 HE
VMRA1 VMRA2

20 HE VMFR1

Figure 65. Chromatogrammes HPLC des extraits bruts à 254 nm

110
 Les résultats sont donnés en g/mL de 20-hydroxyecdysone dans les extraits (tableau 12).

Tableau 12. Quantité de la 20-hydroxyecdysone par HPLC dans les extraits bruts récoltés
pendant les deux saisons
Feuilles Ecorce de tronc Ecorce racines Fruits

Echantillons SP* SS* SP* SS* SP* SS* SP*

VMFE1 VMFE2 VMET1 VMET2 VMRA1 VMRA2 VMFR1

Concentration 202 135 119 140 199 221 145

(g/mL)

SP* : saison des pluies ; SS* : saison sèche

La concentration en 20-hydroxyecdysone dans les extraits varie de 119 à 221 g/mL au
cours des différentes saisons et en fonction de la partie de la plante. Une plus grande
concentration en 20-hydroxyecdysone est trouvée dans les extraits des feuilles récoltées en
saison des pluies et dans les extraits de racines récoltés pendant les deux saisons. Les autres
extraits présentent une concentration en 20-hydroxyecdysone relativement proche en dehors de
l’extrait de VMET1 qui présente une forte variation entre les deux saisons et les autres
échantillons. Le VMET1 possède une concentration plus faible que VMET2 (119 g/mL pour
la saison des pluies et 140 g/mL en saison sèche.

Les résultats du tableau 12 montrent une concentration globalement plus importante en

20-hydroxyecdysone dans les extraits d’écorce de racines et dans les feuilles.

II.9.2 - Dosage par HPTLC

La quantification de 20-hydroxyecdysone dans les extraits bruts de la matière végétale

récoltée en saison des pluies et en saison sèche a été également réalisée par la méthode d’analyse
HPTLC afin de comparer avec les résultats obtenus par HPLC. La courbe d’étalonnage a montré
un coefficient de corrélation linéaire R2 ˃ 0,99 dans la gamme d’étalon de 200 à 1400 ng/ dépot
mise en œuvre.

L’analyse quantitative par HPTLC de la 20-hydroxyecdysone dans les différents extraits bruts
est présentée sous forme d’empreintes chromatographiques (figure 66) aux longueurs d’onde
de 254 et 366 nm.

111
 A

Figure 66. Analyse HPTLC avec dérivatisation du standard et extraits bruts. A : 254 nm et
B : 366 nm
La concentration en 20-hydroxyexdysone est sensiblement similaire dans les feuilles, les
écorces de tronc et des racines. Elle est légèrement plus faible dans les fruits (tableau 13).

112
Tableau 13. Concentration de la 20-hydroxyecdysone dans les extraits bruts (HPTLC)
Feuilles Ecorce de tronc Ecorce racines Fruits

Echantillons SP SS SP SS SP SS SP

VMFE1 VMFE2 VMET1 VMET2 VMRA1 VMRA2 VMFR1

Concentration 203 136 178 193 180 199 141

(µg/ml)

Selon les résultats obtenus, il semble que la période de récolte ait une influence sensible
sur la concentration des extraits en 20-hydroxyecdysone. Cette différence est surtout notable
pour l’extrait de feuilles qui présente un taux réduit lors de la saison sèche. A l’inverse, pour
les autres organes de la plante, la saison sèche semble être optimale en ce qui concerne le taux
en 20-hydroxyecdysone. Il est cependant notable que le taux de chaque extrait en 20-
hydroxyecdysone reste assez important quelle que soit la saison de récolte.

II.9.3 - Comparaison entre dosage par HPLC et HPTLC

La détermination de la quantité de la 20-hydroxyecdysone dans les extraits bruts à partir
de ces deux méthodes d’analyse permet d’évaluer et ou de comparer leur efficacité. Le tableau
14 présente la corrélation des teneurs en 20-hydroxyecdysone obtenues à partir de ces deux
méthodes.

Tableau 14. Comparaison du dosage en 20-HE selon la méthode employée (HPLC vs

HPTLC)

HPLC HPTLC

SP SS SP SS

Nom éch. Conc. Nom éch. Conc. Nom éch. Conc. Nom éch. Conc.

(µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL)

VMFE1 202 VMFE2 135 VMFE1 203 VMFE2 136

VMET1 119 VMET2 140 VMET1 178 VMET2 193

VMRA1 200 VMRA2 221 VMRA1 180 VMRA2 199

VMFR1 145 VMFR1 141 - -

113
 Les deux méthodes donnent sensiblement les mêmes résultats, les valeurs des
concentrations en 20-hydroxyecdysone obtenues dans les feuilles, les racines et les fruits par
HPTLC sont sensiblement égales pour les unes et assez proches pour les autres.
Il convient toutefois de noter une différence entre les résultats obtenus par HPLC et HPTLC
pour l’extrait d’écorces de tronc. Ce résultat pourrait s’expliquer par une instabilité de cet
échantillon. En effet, cet extrait a montré une relative instabilité de son profil au cours du temps.
Ces variations pourraient être dues aux interférences avec d’autres phytostérols qui ne sont pas
présents dans l’extrait récolté en saison sèche et dans d’autres parties de la plante. De ce fait, il
a fallu concentrer la solution à injecter pour pouvoir trouver les données permettant le dosage
du composé cible en HPLC.

II.9.4 - Corrélation entre les activités biologiques et la teneur en 20-

hydroxyecdysone dans les différents extraits

Les phytoecdystéroïdes sont des marqueurs taxonomiques des espèces du genre Vitex.
Les extraits des différents organes de V. madiensis que nous avons testés dans cette étude
contiennent principalement la 20-hydroxyecdysone, la vitexirone et l’ajugastérone C. Les
résultats du dosage de la 20-hydroxyecdysone dans les extraits bruts ont montré que ce composé
représente une grande quantité de la composition chimique des extraits.

L’étude de l’activité antioxydante et le potentiel anti-inflammatoire par la méthode

intracellulaire de production de ROS induit par les leucocytes sanguins incubés avec le PMA
des différents extraits et phytoecdystéroïdes a permis de mettre en évidence un potentiel anti-
inflammatoire des extraits. Nous avons analysé la composition chimique des extraits
méthanoliques par LC-MS et par la suite nous avons quantifié la 20-hydroxyexdysone par
HPLC et HPTLC. Relativement, la forte teneur en 20-hydroxyecdysone trouvée dans
l’ensemble des extraits permettrait d’expliquer en partie l’activité biologique observée. Les
extraits ont montré une tendance à inhiber la production de ROS de façon générale aux
différentes concentrations testées. Certains ont montré des effets inhibiteurs significatifs, dose-
dépendante dès la plus faible concentration testée. D’autres, en revanche, ont montré une
tendance à diminuer la production de ROS mais avec un effet non significatif comme observé
pour l’extrait de racine. D’autre part la 20-hydroxyecdysone a inhibé la production de ROS de
manière significative dose-dépendante dès la plus faible concentration testée (1 µM). Des
études rapportent les propriétés biologiques que possède la 20-hydroxyecdysone dans de

114
nombreux extraits de plantes (Cai et al., 2002 ; Buniam et al., 2020 et Hu et al., 2012). Ceci
est cohérent avec nos observations.

III - Discussion

Notre présent travail est axé sur la caractérisation de métabolites secondaires à partir
d’extraits de V. madiensis, présentant un potentiel antioxydant.

L’étude préliminaire a montré des teneurs importantes en composés phénoliques. De plus,

l’étude phytochimique des différents extraits réalisés par LC-MS a permis d’identifier plusieurs
composés parmi lesquels des phytoecdystéroïdes constituants majoritaires des différents
extraits, des iridoïdes, des acides phénoliques et des flavonoïdes.

Les tests d’activité biologique ont révélé que les extraits des feuilles, des écorces de
tronc et même de fruits ont présenté une activité antioxydante dose-dépendante sur les ROS
induit par les leucocytes. Outre les teneurs importantes en composés phénoliques trouvées dans
les extraits, le potentiel antioxydant observé dans les extraits des feuilles, des écorces de tronc
et des fruits semblent être due à la présence des phytoecdystéroïdes dans les différents extraits,
dont les activités sur la production de ROS sont très intéressantes. Ces résultats sont plus
particulièrement reliés à la quantité importante de la 20-hydroxyecdysone dans les extraits.

Nos résultats ne semblent pas être confirmés par certains travaux décrits dans la
littérature. En effet, plusieurs activités biologiques réalisées sur les espèces du genre Vitex ont
été corrélées à la présence de flavonoïdes. C’est le cas notamment des travaux réalisés sur les
extraits de feuilles de V. doniana et V. agnus-castus (Muanda, 2010 ; Hajdú et al., 2007).
D’autre part, les activités antioxydantes et anti-inflammatoires des extraits de feuilles de V.
nengungo ont été reliées par la présence des flavonoïdes et polyphénols (Tiwari et al., 2007 ;
Koirala et al., 2020).

Les phytoecdystéroïdes isolés dans nos différents extraits n’ont pas présenté d’effets
cytotoxiques sur la viabilité cellulaire tandis que des flavonoïdes isolés dans les extraits de Vitex
agnus-castus ont présentés des effets cytotoxiques contre les cellules MTT (Hirobe et al., 1997
Niroumand et al., 2018 ; Ohyama et al., 2003). Il a été rapporté dans la littérature que
l’ajugastérone C possède des effets anti-inflammatoires par l’inhibition des œdèmes de la patte
induite par la gélose chez le rat (Ochieng et al., 2013) et la 20-hydroxyecdysone présente des
effets antioxydants et anti-inflammatoires sur plusieurs lignées cellulaires (Hu et al., 2012 ;

115
Cai et al., 2002). Nos résultats ont montré que la 20-hydroxyecdysone a provoqué la réduction
significative de l’expression relative de la COX-2 induit par les cellules de l’immunité,
confirmant son potentiel anti-inflammatoire.

De plus, l’analyse de l’activité anti-radicalaire par la méthode du piégeage du radical

DPPH par spectrophotométrie a permis d’évaluer la capacité antioxydante des extraits par la
mesure quantitative des CI50 des extraits tandis que l’analyse de l’activité antiradicalaire par la
méthode bioautographique HPTLC en utilisant le DPPH a permis d’évaluer la qualité des
composés possédant des effets antioxydants dans les extraits. Ces deux méthodes d’évaluation
de l’activité antiradicalaire pourraient être corrélées à l’activité antioxydante.

A notre connaissance, aucune donnée de la littérature ne précise les activités biologiques

associées à l’ajugastérone C et à la vitexirone.

IV - Conclusion du chapitre

Dans cette étude, nous avons évalué la composition chimique et le potentiel antioxydant
de différentes parties de V. madiensis. Nous avons utilisé le méthanol comme solvant
d’extraction pour obtenir des extraits bruts, en raison de son efficacité pour extraire un large
panel de métabolites secondaires (Smolskaite et al., 2015). Les résultats ont montré une forte
teneur en polyphénols totaux dans les extraits, ce qui corrobore les travaux réalisés sur les
extraits de différents organes de V. doniana et de V. nengundo (Muanda, 2010 ; Koirala et al.,
2020 ; Ganapaty et al., 2005).

La teneur en flavonoïdes totaux a été réalisée par la méthode du chlorure d’aluminium

et les résultats ont montré des quantités assez importantes des flavonoïdes dans les différents
extraits, ce qui est en parfait accord avec les travaux antérieurs réalisés sur les extraits aqueux
des feuilles de V. madiensis dans lesquels une teneur importante en flavonoïdes a été trouvé
(Ngoka et al., 2018).

Le profil chimique des différents extraits a été réalisé par LC-MS/MS et les
phytoecdystéroïdes, notamment la 20-hydroxyecdysone, la vitexirone, l’ajugastérone C, la
polypodine B, la turkestérone, l’isovitexirone et la ptérostérone ont été identifiés comme
composés majoritaires dans l’ensemble des extraits étudiés. Ces phytoecdystéroïdes sont
présents dans la plupart des espèces du genre Vitex (Sena et al., 2008 ; Kubo et al., 1984 ;
Kubo et al., 1990) ; Suksamrarn, 2002). D’autres phytoecdystéroïdes comme la

116
carthamosterone et la kaladasterone présents dans les espèces de Leuzea carthamoïdes
(astreceae) et certaines espèces d’Ipomea (Girault et al., 1988 ; Canonica et al., 1973) ont été
identifiés dans les extraits étudiés. Des flavonoïdes ont également été identifiés dans les
différents extraits. C’est le cas de la vitexine, de l’homoorientine, de l’orientine, de l’eupatorine,
de la 3,7- diméthylquercétine et de la vicénine-1. Dans les différents extraits, on note la présence
d’acides organiques comme l’acide quinique et l’acide citrique ; d’acides phénoliques comme
l’acide chlorogénique, l’acide 3,4- hydroxybenzoïque, l’acide p-hydroxybenzoïque, l’acide 1,3-
dicaffeoylquinique et ses isomères. Ces flavonoïdes et les acides phénoliques ont déjà été
identifiés dans les espèces de V. doniana (Mouanda, 2010) et dans d’autres espèces du genre
Vitex (Ganapaty et al., 2005 ; Lengbig et al., 2018). Un iridoïde, le 1-oxo-eucommiol, a été
identifié dans tous les extraits étudiés. Ce composé (de la famille des iridoïdes) a été identifié
pour la première fois dans l’extrait méthanolique des fruits de V. rotundifolia L. (Masateru et
al., 1997). C’est pour la première fois que le shanzhiside (iridoïde) est identifié dans les extraits
de V. madiensis.

Pour identifier les familles chimiques des molécules les plus actives, nous avons réalisé
les extractions liquide-liquide par des solvants organiques de polarité croissante : le
cyclohexane, le dichlorométhane, l’acétate d’éthyle, le butanol et l’eau.

Nous avons tout d’abord évalué l’activité antiradicalaire des différents extraits bruts par
piégeage du DPPH, méthode utilisée de façon classique (Ramirez-Anguiano et al., 2007 :
Kalyoncu et al., 2010 ; Kozarski et al., 2012). Nous avons noté une très bonne inhibition des
radicaux par les extraits de feuilles, d’écorce de tronc et de fruits. Seul l’extrait des écorces de
racines semble inactif. S’il est difficile de comparer les valeurs obtenues avec celles de la
littérature en raison d’une trop grande variabilité des paramètres expérimentaux d’un auteur à
l’autre (méthodes d’extraction, concentration, temps de réaction…), nos résultats sont cohérents
avec ceux obtenus par Ngoka (Ngoka et al., 2018) et Sarr (Sarr et al., 2015) sur des extraits
aqueux de V. madiensis et V. doniana.

Nous avons également confirmé ces résultats en développant une méthode de

bioautographie HPTLC. Cette méthode complète notre étude en ciblant dans les extraits actifs,
les métabolites antiradicalaires.

L’activité antioxydante de ces extraits a été évaluée selon le test ROS induit par les
leucocytes sanguins stimulés par le PMA. Les extraits de feuilles et d’écorces de tronc ont

117
révélé les meilleures activités en inhibant la production de ROS de manière significative ʺdose
dépendanteʺ dès la plus faible concentration testée (10 µg/mL).

Les fractions issues de l’extrait de feuilles et de l’extrait d’écorce de tronc, obtenues en

utilisant des solvants de polarité croissante : cyclohexane (E1-cyclo), dichlorométhane (E2-
DCM), acétate d’éthyle (E3-AcOEt), butanol (E4-BuOH) et eau (E5-H2O) ont également été
évaluées pour leur activité antioxydante.

Les fractions issues de l’utilisation de cyclohexane, d’acétate d’éthyle et de butanol ont

montré de bons résultats.

D’autre part, nous nous sommes intéressés aux phytoecdystéroïdes présents dans ces
fractions. C’est la raison pour laquelle nous avons isolé et identifié ceux-ci.

Nous avons ainsi pu obtenir et caractériser trois d’entre eux, la 20-hydroxyecdysone,

l’ajugastérone C et la vitexirone, en quantité suffisante pour réaliser les tests d’activité
antioxydante. Ces trois composés présentent une activité intéressante, plus particulièrement la
20-hydroxyecdysone active dès la concentration 1 µM. D’autre part, ces composés n’ont pas
présenté de cytotoxicité particulière.

Compte tenu de ce résultat, nous avons dosé nos extraits en 20-hydroxyecdysone afin
d’établir une corrélation éventuelle entre l’activité antioxydante observée et le taux de 20-
hydroxyecdysone de l’extrait. Ce dosage a été réalisé selon deux méthodes, par HPTLC et par
HPLC. Les résultats obtenus sont globalement cohérents entre eux. Il apparait effectivement
que les fractions riches en 20-hydroxyecdysone possèdent aussi une bonne activité
antioxydante, sans qu’il soit possible d’attribuer celle-ci à l’unique présence de ce composé ou
même des phytoecdystéroïdes.

Si la 20-hydroxyecdysone semble être en grande partie responsable de l’activité de ces

extraits ou fractions, ses propriétés biologiques potentielles comme l’activité anti-
inflammatoire ont été validées par des tests d’inhibition de l’expression de la COX-2.

Il est toutefois fort probable que les ecdystéroïdes agissent dans les extraits en synergie
avec d’autres composés, comme la lutéoline, connue pour ses propriétés antioxydantes, anti-
inflammatoires et même antiprolifératives (Trenin et al., 1999 ; Mizuno et al., 2017 ;
Seelinger et al., 2008 ; Dinan et al., 2021 ; Romaniuk-Drapala et al., 2021).

118
 En conclusion, nous avons démontré que V. madiensis pouvait être une plante d’intérêt,
notamment dans le traitement de l’inflammation, probablement en raison de l’activité des
phytoecdystéroïdes présents dans les différents organes de la plante. La 20-hydroxyecdysone,
phytoecdystéroïde majoritaire dans cette plante, possède des propriétés remarquables comme
souligne notre étude ainsi que les travaux d’autres auteurs (Dioh et al., 2021).

Cette étude offre de nouvelles perspectives thérapeutiques pour l’utilisation de cette

plante dans la prise en charge de maladies chroniques impliquant des processus inflammatoires.
Cependant, des études complémentaires devraient être engagées, notamment pour investiguer
l’action des phytoecdystéroïdes sur les cytokines anti-inflammatoires (COX-1) afin de mieux
comprendre leur mode d’action protecteur des processus oxydatifs et anti-inflammatoires.

119
120
 Chapitre IV

Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G.

Don) Benth.

121
122
 De même que Vitex madiensis, Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) Benth.
est une plante utilisée par les tradithérapeutes pour traiter la douleur.

La première partie de ce chapitre sera consacrée à la présentation de la plante, son utilisation

traditionnelle et à la synthèse de travaux antérieurs réalisés sur cette plante. La deuxième partie
sera consacrée aux travaux que nous avons réalisés et qui portent sur l’étude comparative du
profil chimique des extraits bruts des différentes parties de plante récoltées et l’évaluation des
activités antiradicalaire et antioxydante par différentes techniques.

I - Généralités sur Crossopteryx febrifuga

I-1- Eléments botaniques
Crossopteryx febrifuga est une espèce de la famille des Rubiaceae, une grande famille de
630 genres et 10200 espèces présentes dans le monde, en particulier dans les régions tropicales
et les régions chaudes (Dalziel, 1957).

La classification adoptée obéit à l’APG III (Angiosperm Phylogeny Group 2009). Elle se
présente comme suit :

Taxon : Embryophytes ou plantes terrestres

Taxon : Spermatophytes ou plantes à graines
Embranchement : Angiospermes ou plante à ovaires
Classe : Equisetopsida
Sous classe : Magnoliidae
Ordre : Gentianales
Famille : Rubiaceae
Genre : Crossopteryx
Espèce : Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) Benth.

I-2- Description de la plante

Crossopteryx febrifuga se présente sous la forme d’un arbuste qui peut atteindre six
mètres de hauteur. La plante possède des feuilles ovales et opposées qui sont souvent rouges à
la base. Ces fleurs blanches très parfumées, donnent des fruits ronds et verts, qui deviennent
noirs à maturité. Son écorce est lisse, très finement écailleuse, grise à brun clair (Kerharo et
al., 1974 ; Orwa et al., 2009).

123
 Figure 67. Photo de l’arbre et fruits Crossopteryx febrifuga

I-3- Répartition géographique :

Crossopteryx febrifuga est une plante endémique qui pousse dans les savanes d’Afrique
centrale et d’Afrique de l’Ouest. On retrouve la plante notamment au Congo Brazzaville, en
République Démocratique du Congo, au Cameroun, au Mali, au Nigeria, en Angola, au Sénégal,
au Benin et au Burkina Faso. Crossopteryx febrifuga a pour synonyme Rondeletia africana T.
Winterb (Madango et al., 1990). Comme toutes les plantes répandues sur une large zone
géographique, Crossopteryx febrifuga possède plusieurs appellations vernaculaires. Au
Sénégal, elle est appelée Korom Kondome (Socé) par les populations des Iles du Saloum
(Kerharo et al., 1964) ; Laloyi chez le peuple Peul de la région du Sine Salum au Sénégal
(Pordié et al., 2001). Au Benin, elle est appelée Gbatogbatogololoe dans la région du Fon au
nord du pays, Lamadjogahi ou Rimadjogahi chez le peuple peuhl (Dassou et al., 2014), Peuk
bobian chez les Bariba (Assogba, 1984), Késan chez les Kabiyé, Kiingouehoum chez les
Malinko, Krokro chez les Baoulé (Berhaut, 1975). Au Mali, chez le peuple bambara, elle est
connue sous le nom de balembo (Nordeng et al., 2013 ; Danton, 2017), tekei pour le peuhl et
inekinemorgo au Sonrai (Adjanahoun 1981). Au congo Brazzaville, les populations soundi au
sud du pays l’appelle Mouvala (Adjanahoun et al., 1988), Mukakati chez le peuple kamba
(Kimpouni et al., 2018). En République Démocratique du Congo, la plante est connue sous le
nom de Milolo ou Muwala (Kasuku et al., 1999 ; Dimongu, 1984), Mbinzo en lingala
(Kibungu, 2003) et dans la region de mbanza-ndunga, elle est connue sous le nom de
Mvala/Mpala mbaki (Nzuki Bakaye et al., 2013). Ces multiples appellations témoignent de

124
 son aire de répartition et de la popularité de cette plante réputée pour ses multiples usages dans
différentes ethnies.

I-4- Utilisation en médecine traditionnelle

Crossopteryx febrifuga est une espèce utilisée traditionnellement pour soigner plusieurs
pathologies. Les différentes parties notamment, les feuilles, les fruits, l'écorce des tiges et des
racines ont des usages multiples en médecine traditionnelle africaine. Les propriétés
pharmacologiques de la plante ont d’ailleurs été exploitées au Mali pour la mise au point d’un
médicament traditionnel amélioré, dénommé "Balembo", utilisé sous la forme d’un sirop contre
la toux (Sutovská et al. 2009). Les différents usages selon les pays sont résumés dans le tableau
15.

Tableau 15. Aperçu des usages de Crossopteryx febrifuga en médecine traditionnelle africaine

Usage Organe Mode de Posologie de Pays Références

préparation traitement

Amibiase, Racine, Décoction - Guinée-Bissau Keita et al., 1999

bilharziose, Feuilles dans l’eau,
Frazão-Moreira,
cysticercosis, macération
2016
anchocercose,
troubles de Catarino et al.,
grossesse, troubles 2016
de règle, trouble
de lactation

Stérilité de la Ecorce de Décoction 100 mL/J Tanzanie Maregesi et al.,

femme, toux racine, dans l’eau 2007
pneumonie,
Jus feuilles Diafouka, 1997
bronchite, 2 gouttes dans Congo
affections Feuilles Décoction chaque narine
pulmonaires, x 3/J pendant
maladies 3J
vénériennes
1 cuillère à
café/J pour
enfant et 2
cuillère/J pour
adulte

Antiseptique, Ecorce de tige Décoction - Guinée Madassouba et al.,

désinfectant, dans l’eau Conakry 2007
cicatrisant, anti-
infectieuse

Migraine, Feuilles Décoction 1 cuillère à Congo Diafouka, 1997

céphalée, troubles café 6x/J
Jus feuilles
nerveux,

125
insomnie, douleur Racine Décoction 1 goutte dans
dentaire chaque œil
1x/J
1L d’eau bain
de bouche

Hernie, diarrhée, Ecorce, Décoction 50 mL, 3x/J Congo Diafouka, 1997

fièvre, douleur feuilles
Kimpouni et al.,
générale
2018

Trouble de Écorce Macération Sénégal Kerharo et al., 1964

lactation, ascite

Anémie, Feuilles - Bain + Cote d’Ivoire Koné et al., 2002

malnutrition manger un
enfant œuf/J.

Antifongique, Feuilles, Décoction 1L + Cote d’Ivoire Koné et al., 2008

maladie de la écorce de tige application
RDC Koni et al. 2008
peau, herpès, locale
paludisme, Nzuki, 2013
infection uro-
génitale, activité Bia kouakou et al.,
antivirale, 2015
problèmes
psychologiques
Conjonctivite, Feuilles, Décoction Mali Traoré, 2008
gastro-entérite, fruits
Danton, 2017
toux, asthénie
physique, maux de Nordeng, 2013
tête

Menace Feuilles, - - Cameroun Jiofack et al., 2009

d’avortement, écorce
stérilité, kyste
ovarien, syphilis

Fièvre, palu, Décoction Boisson, voie Burkina Faso Jansen et al., 2010
purgatif, anale,
Feuilles, RDC Kibungu, 2003
constipation, instillation
écorce,
diarrhée, nasale, bain Makumbelo, 2008
racine,
hémorroïde, de siège
Ouôba et al., 2006

Blessure, maux Feuilles, Application - Mozambique Bruschi et al., 2011

d’estomac, maux racine, écorce locale,
Zimbabwe Maroyi, 2013
de dos, diarrhée, macération
fièvre, paludisme dans l’eau, Ngarivhume, 2015
infusion
froide

126
Infertilité homme, Racine, Décoction Lavement, Angola Lautenschläger et
impuissance feuilles, goutte dans al., 2018
sexuelle, diabète, écorce les narines,
fièvre, douleur
générale, maux de
tête, paludisme

Trypanosomiase, Fruits, Décoction 1L x/J Benin Dassou, 2014

infection feuilles,
Ogni et al., 2016
bactérienne écorce

I.5 - Etudes phytochimiques décrites dans la littérature

Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) Benth. a fait l’objet d’un nombre limité
d’études sur le plan phytochimique. Ces études ont cependant permis l’identification de
plusieurs composés dans les différents organes de la plante, notamment un iridoïde glycosylé,
l’ester méthylique de shanzhiside (106), isolé des écorces des racines (Erdelmeier et al., 1987).
L’acide bétulinique (107), la vitexine (108), l’isovitexine (109), l’orientine (110), l’isoorientine
(111), la myricétine 3-galactoside (112), la quercétine 3-arabinoside (113), la quercétine 3-
glucoside (114), la quercétine 3-rutinoside (115) et la quercétine 4’-glucoside (116) ont été
identifiés dans l’extrait de feuilles (Tomás-Barberán et al., 1988). Deux saponines
bisdésmosidiques ont été isolées à partir des racines par HPLC en phase inverse, l’acide 3-O-
[-D-glucopyranosyl-2,3,6,16,23-pentahydroxyoléane-12-ène-28-oïque 28-O-[-L-
rhamnopyranosyl(1→3)][-D-xylopyranosyl(1→4)] [-L-rhamnopyranosyl(l→2)-L-
arabinopyranoside et l’acide 3-O-[-D-apiofuranosyl(1→3)]-D-glucopyranosyl-
2,3,6,16,23-pentahydroxyoléane-12-ène-28-oïque 28-O-[-L-rhamnopyranosyl(1→3)]
[-D-xylopyranosyl(l→4 [-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-L-arabinopyranoside (Gariboldi et
al., 1990). Les crossoptines A (117) et B (118) ont également été isolées à partir des extraits
d'écorces (Foresta et al., 1988). Deux autres saponines ont été isolées de l’extrait au n-butanol
d’écorces des racines, le glycoside de l’acide 3β-(α-L-rhamnopyranosyloxyl) -28-O-(β-D-
glucopyranosyl)urs-12,20(30)-diène-27,28-dioïque (119) et l’acide 3β-O-(β-D-
glucopyranosyl)-28-O-(β-D-glucopyranosylester)-20(30)-ènequinovique (120) (Babady-Bila
et al., 1991 ; Chouna et al., 2015).

Muluh et al., (2019) ont isolé un phytostérol, le Spinasterol (stigmasta-7,22-diène-3-ol) (121)

de l’extrait à l’acetate d’éthyle de l’écorce de tige, récoltée au Nigeria par chromatographie
liquide sous vide. D’autres composés comme l’acide oléanolique (122), le D mannitol (123) et
le 11-méthylixoxide (124) ont été isolés des extraits des feuilles, des écorces de tronc et des

127
écorces des racines (Bealem et al., 2021). En 2018, Nma et collaborateurs avaient identifié par
GC-MS, dans la fraction acétate d’éthyle de l’extrait brut méthanolique des feuilles, divers
composés comme le 2H-1-Benzopyrane-3, 4-diol-2-(3,4-diméthoxyphényl)-3,4-dihydro-6-
méthyle (125); le Cyclopentane[1,3]cyclopropane [1,2]cycloheptène-3 (3aH)-one, 1, 2, 3b, 6,
7, 8– hexahydro-6, 6-diméthyl ; 10, 11-dihydro -10- dihydroxy-2, 3-diméthoxy-dibenzène (b,
f) Oxepine (126) (Nma et al., 2018). Les structures des composés isolés dans les études
antérieures sont présentées dans la figure 68.

128
Figure 68. Structures des composés déjà isolés dans les organes de Crossopteryx
febrifuga (Afzel ex G. Don) Benth. (Aubréville 1949) 129

botanique
 I.6- Activités biologiques et pharmacologiques recensées dans la littérature

Les travaux antérieurs ont montré que les extraits des différentes parties de
Crossopteryx febrifuga possèdent des propriétés biologiques variées. L’extrait méthanolique
des racines contenant les crossoptines A et B a montré une activité anti-inflammatoire sur
l’œdème de la patte induit par la carraghénane chez le rat. Cette activité in vivo prometteuse,
corrélée aux deux saponines, a été brevetée en 1988 (Foresta et al., 1988). Pour l’extrait
méthanolique de l’écorce de tige, il a été observé des activités analgésiques et anti-
inflammatoires significatives (Salawu et al., 2008 ; Adeola et al., 2011). Les tests réalisés sur
l’activité antimicrobienne in vitro d’un extrait méthanolique de l’écorce de tige contre les
bactéries de types entérobacter aérogène ATCC13048, Escherichia coli ZTCC8739, Klebsiella
pneumoniae ATCC11296, Staphylococcus aureus et les champignons de types Candida
parapsilosis, Candida albicans ATCC9002 et Crytococcus neoformans IP90526, ont révélé des
activités antibactériennes et antifongiques intéressantes (Sanogo et al., 1998 ; Halilu et al.,
2012 ; Chouna et al., 2015). L’activité antivirale des extraits de cette espèce a également été
démontrée (Ouedraogo et al., 2019). Par ailleurs, les activités antiamibiennes et
spasmolytiques ont été rapportées sur les extraits des différentes parties de la plante (Tona et
al., 2000). D’autres études ont signalé l’activité antipaludique in vitro de l’extrait éthanolique
de l’écorce de tige (Elufioye et al., 2004), les activités hypoglycémiques et hypolipidémiques
chez les rats diabétiques traités avec l’extrait éthanolique de racine (Ojewale et al., 2013) et
l’effet cytoprotecteur sur le tractus gastro-intestinal chez le rat traité avec l’extrait méthanolique
d’écorce de tige (Adeola et al., 2011). Les extraits aqueux et hydroéthanoliques des fruits
possèdent des effets sur la toux et des maladies broncho-pulmonaires (Kodio et al., 1986 ;
Sanago et al., 1999 ; Sutovska et al., 2009). L’extrait de fruits et l’extrait d’écorce de tige
obtenus par un mélange de chlorure de méthylène et de méthanol ont montré un effet
antioxydant in situ par la réduction de l’oxygène moléculaire de l’air en milieu aprotique (DMF
anhydre) et autres radicaux libres (Maiga et al., 2006 ; Bealem et al., 2021). Par ailleurs, les
études sur la toxicité aigüe et subaigüe de l’extrait méthanolique de l’écorce de tige réalisées
sur les rats ont montré une toxicité possible sur le foie, les poumons, les reins, les testicules et
l’utérus à 1000 mg/kg et l’administration orale ne produit pas d’effets toxiques graves à des
doses inferieurs ou égales à 500 mg d’extrait/ kg de poids corporel (Salawu et al., 2009).

130
Conclusion : Crossopteryx febrifuga possède de nombreux usages en médecine traditionnelle
africaine. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi de porter nos efforts de recherche sur
cette plante utilisée traditionnellement au Congo pour soulager les douleurs et cependant
relativement peu étudiée d’un point de vue phytochimique. Afin de réaliser une étude
phytochimique la plus complète possible, nous avons décidé de collecter les différents organes
de la plante (feuilles, écorces de tronc, écorces de racines et fruits) lors des deux grandes saisons
climatiques du Congo (saison sèche et saison des pluies).

II - Travaux réalisés sur Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) Benth.

II.1 - Collecte du matériel végétal
Les travaux concernant Crossopteryx febrifuga ont porté sur les organes : les feuilles
(CFFE1 et CFFE2), les écorces de tronc (CFET1 et CFET2), les écorces de racine (CFRA1 et
CFRA2) et les fruits (CFFR1 et CFFR2), récoltés à Makana I, situé à environ 25 km au sud de
Brazzaville. Les coordonnées GPS des points des récoltes sont les suivantes A (X= 513407, Y=
952288, Z= 3) et B (X= 513030, Y= 9522670, Z= 3). Les récoltes ont été faites en saison des
pluies en décembre 2018 et en saison sèche en juillet 2019 dans la perspective d’une étude
comparative concernant le profil chimique et les activités biologiques. Un échantillon de
référence de cette plante a été identifié par les botanistes et conservé à l’herbier de l’Institut de
Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) à Brazzaville sous le numéro B434.

II.2 - Obtention des extraits bruts

Après la récolte, le matériel végétal est séché à l’ombre à température ambiante pendant
au moins 7 jours et broyé à l’aide d’un broyeur électrique jusqu’à l’obtention d’une poudre. Les
différents extraits bruts sont obtenus en faisant des macérations à température ambiante dans le
méthanol (ratio plante/ solvant : 1/10) pendant 24 h. Pour chaque organe récolté, l’extraction
est reprise trois fois successivement jusqu’à l’épuisement de la matière végétale en métabolites
secondaires. Nous obtenons ainsi après filtration et évaporation du solvant, des extraits que
nous dénommerons « extraits bruts ». Les rendements d’extraction sont représentés dans le
tableau 16.

131
 Tableau 16. Rendements d’extraction

Feuilles Ecorces de tronc Ecorces de racines Fruits

CFFE1 CFFE2 CFET1 CFET2 CFRA1 CFRA2 CFFR1 CFFR2
Poudre de
matière végétale 200 200 200 150 200 200 112 250
(g)

Extrait (g) 29,7 31,3 21,7 14,0 28,0 22,6 3,8 10,1

Rendement
14,8 15,6 10,8 7,0 14,0 11,3 3,4 4,0
d’extraction (%)

De façon générale, les parties aériennes des plantes permettent d’extraire des quantités
plus importantes de métabolites secondaires par rapport aux parties souterraines, ce qui n’est
visiblement pas le cas dans notre étude. En effet, les feuilles, les écorces de tronc et de racines
récoltées pendant les deux saisons permettent d’extraire des quantités plus importantes de
métabolites secondaires que les fruits qui donnent un rendement très inférieur.

II.3 - Dosage des polyphénols et des flavonoïdes totaux

Dans la littérature, de nombreuses études montrent que nombre de molécules naturelles
présentant des effets anti-inflammatoires sont des polyphénols ou des flavonoïdes. C’est la
raison pour laquelle nous nous sommes intéressés au dosage des composés polyphénoliques
contenus dans les extraits de Crossopteryx febrifuga.

Courbes d’étalonnage
La courbe d’étalonnage est tracée en utilisant des standards comme référence. L’acide
gallique est pris comme référence pour déterminer la teneur en polyphénols totaux exprimée en
mg équivalent d’Acide gallique par gramme de matière sèche (mgEAG/g.MS). Pour la teneur
en flavonoïdes totaux, elle est standardisée par rapport à la quercétine qui est pris comme
référence et est exprimée en mg EQ/g.MS. Les deux courbes de dosages sont linéaires avec des
coefficients de corrélation R2 > 0.99 (figure 69). Les teneurs en polyphénols totaux et en
flavonoïdes totaux pour les différents extraits sont calculées à partir des équations de régression
linéaire obtenues.

132
 2 (A) 0,25 (B)
y = 7,894x - 0,1837 y = 0,6858x + 0,0045
0,2
1,5 R² = 0,9997 R² = 0,9905

Absorbance
Absorbance

0,15
1
0,1
0,5 0,05

0 0
0 0,1 0,2 0,3 0 0,1 0,2 0,3
Concentration (mg/mL) Concentration (mg/mL)

Figure 69. Courbes d’étalonnage des dosages (A) : polyphénols totaux ; (B) flavonoïdes totaux

Les teneurs en polyphénols et flavonoïdes totaux des différents extraits récoltés pendant les
deux saisons sont présentées dans le tableau 17.

Tableau 17 : Teneur en polyphénols et flavonoïdes totaux des différents extraits

Teneur en polyphénols Teneur en flavonoïdes

Période Organe
totaux (mg EAG/g.MS) totaux (mg EQ/g.MS)
CFFE1 233,89 ± 0,80 153,06 ± 0,37
CFET1 222,42 ± 0,70 30,20 ± 0,03
Saison des pluies CFRA1 193,45 ± 0, 49 73,29 ± 0,45
CFFR1 165,72 ± 0,26 100,12 ± 0,53
CFFE2 150,07 ± 0,03 104,81 ± 0,12
Saison sèche CFET2 90,25 ± 0,13 70,39 ± 0,56
CFRA2 135,46 ± 0,76 89,59 ± 0,04
CFFR2 147,78 ± 0,29 85,86 ± 0,11

Le dosage des composés phénoliques totaux a été répété trois fois et les résultats sont
présentés sous forme de moyennes. Les résultats montrent que les différents extraits contiennent
des quantités importantes en composés phénoliques. De façon générale, les extraits de la saison
des pluies sont plus riches en polyphénols totaux par rapport aux extraits de la saison sèche.
Les feuilles constituent la partie de la plante qui contient la plus grande teneur en polyphénols.
Il faut noter que les teneurs trouvées dans cette étude sont nettement supérieures à celles
trouvées dans d’autres études pour cette même plante. En effet, Edewor et al., 2015 ont trouvé,
pour l’extrait méthanolique des feuilles de Crossopteryx febrifuga une teneur de 63,71 ± 0,02

133
mgEAG/g.MS et Ngenge et al., 2022 ont obtenus une teneur de 56,41± 0,89 EAG/g.DW, alors
que nos valeurs sont bien supérieures.
Les extraits des deux saisons sont riches en flavonoïdes totaux quelle que soit la partie de la
plante considérée. Les extraits des feuilles et fruits récoltés pendant la saison des pluies sont
plus riches en flavonoïdes totaux que les extraits des écorces de tronc et de racine de la même
saison.
De plus, une différence significative est observée entre l’extrait de l’écorce de tronc récoltée en
saison sèche qui est plus riche en flavonoïdes totaux par rapport à l’extrait récolté en saison de
pluies. Il faut également noter que pour la plupart des organes, les flavonoïdes totaux
représentent plus de la moitié des composés phénoliques. Ces résultats sont cohérents avec
ceux rapportés dans d’autres études qui soulignent des teneurs importantes des flavonoïdes dans
les extraits de Crossopteryx febrifuga (Tona et al., 2000 ; Kouassi et al., 2018 ; Muluh et al.,
2019). Il convient de souligner que Edewor et al., (2015) ont cependant observé une teneur
inférieure en flavonoïdes, soit 81 mg EQ/g.MS en étudiant l’extrait méthanolique des feuilles.
D’autre part, Ngenge (Ngenge et al.,2022) ont obtenu un dosage de 8,56 ± 0,25 mg QE/g DW
dans l’extrait méthanolique de l’écorce de tige de cette plante.

II.4 - Variation saisonnière du profil chimique des différents extraits

Comme lors de l’étude de V. madiensis, le profil phytochimique de chaque extrait a été
déterminé à partir d’une méthode HPLC développée au laboratoire. L’étude LC-MS/MS a été
également réalisée suivant les mêmes conditions que celles que nous avons utilisées pour V.
madiensis. Nous allons nous intéresser essentiellement au mode d’ionisation négatif. Pour le
même organe, le profil de l’échantillon de la saison des pluies (A) est comparé à celui de la
saison sèche (B) pour identifier les différences éventuelles provenant de la saisonnalité sur la
biosynthèse des métabolites secondaires.

II.4.1 - Profils chimiques des extraits de feuilles

Les profils chromatographiques LC-MS des échantillons des feuilles de la saison des
pluies (A) et de la saison sèche (B) sont présentés sur la figure 69.

134
 (A)

(B)

Figure 69. Profils chromatographiques des feuilles (A) : saison de pluies ; (B) : saison sèche

De façon générale, les profils chimiques sont sensiblement similaires pour les extraits
des deux saisons, les principaux composés sont présents dans les deux échantillons. L’étude des
profils LC/MS en comparaiosn avec des standards disponibles au laboratoire et des données de
la littérature ont permis l’identification d’une dizaine de composé. Leurs temps de rétention et
leurs masses sont présentés dans le tableau 18.

Dans les deux profils, nous avons identifié : (i) l’acide quinique ; (ii) des iridoïdes glucosides,
comme l’acide géniposidique, la loganine et l’ester méthylique de shanzhiside et (iii) un
flavonoïde notamment l’isorquecétine/hyoéroside. On note également la présence de
phytubérine, un sesquiterpenoïde lactonique, présent dans l’échantillon de la saison des pluies
mais non détecté dans l’échantillon de la saison sèche.

135
 Tableau 18. Caractérisation des constituants des extraits des feuilles par LC-MS/MS (mode ESI-)

tr
N° Composé FB M-H exp. MS2 exp. MS2 Theo. CFFE1 CFFE2 Reference
(min)
75/195/129/87/99/ 129/89/87/85/75
1 3,34 Acide gluconique C6H12O7 195,0499 + + Standard
89/85

2 3,87 Acide quinique C7H12O6 191,0547 191/85/127/93/87 191/85/192/127/97 + + Standard

Méthyl-O- α-D-
191/179/161/137/
3 4,1 galactopyranosyl-(1→3)-α- C13H24O11 355,1245 309/191/137/125 + + Guo et al., 2021
136/135/125/113
D-galactopyranoside

4 6,84 Non identifié C11H22O9 297,119 179/161/135/101 + +

massbank,
123/149/211/167/ 211/193/167/149/ Zhang et al.,
5 10,03 Acide géniposidique C16H22O10 373,1135 123 + + 2018
373/193

Ester méthylique de Spectrum

6 12,23 C18H28O13 451,1454* 243/101/405/451 243/101/59/405 + + Bruker_HCD_li
shanzhiside brary000649

Xue et al.,2021 ;
7 14,69 Loganine C18H28O12 435,1504* 227/ 101/139/435 227 + +
Sun et al., 2015

300/463/271/255/ 300/463/201/271/
8 18,39 Isoquercétine/Hypéroside C21H20O12 463,0881 + + Standard
179 255

136
 587/455/483/179/
9 39,84 Non identifié C42H66O14 793,4384 + +
89/59

Serralheiro et
10 42,34 Phytubérine C17H26O4 293,1758 236/221 236/221 + -
al., 2020

(+) présence du composé, (-) composé non détecté, * composé identifié par rapport à l’adduit (M+HCOO-).

137
 Au vu des résultats, il semble que les facteurs exogènes liés à l’environnement
climatique n’ont pas fait varier la composition chimique des feuilles tout au long de l’année ;
les deux profils sont très semblables.

Si plusieurs métabolites secondaires comme l’acide quinique (127), l’acide gluconique

(128), l’acide géniposidique (129) et l’ester méthylique de shanzhiside (106) sont présents dans
plusieurs espèces végétales, en revanche la loganine (130) et la phytubérine (131) sont
identifiées pour la première fois dans Crossopteryx febrifuga. La loganine qui est un iridoïde
glucoside a été isolée pour la première fois dans les graines de Strychnos nux-vomiva, une plante
de la famille de Loganiaceae (Heywood, 1978). Elle a été également trouvée dans Alstonia
boonei de la famille d’Apocynaceae (Adotey et al., 2012). La phytubérine, un sesquiterpénoïde
lactonique a été isolée pour la première fois à partir de la pomme de terre (Coxon et al., 1974),
elle a été également identifiée dans l’extrait de Verbascum betonicifolium (Serralheiro et al.,
2020).

II.4.2 - Profils chimiques des extraits des écorces de tronc

Les profils chromatographiques LC-MS des échantillons des écorces de tronc de la
saison des pluies (C) et de la saison sèche (D) sont présentés sur la figure 70.

(C)

(D)

Figure 70. Profils chromatographiques des écorces de tronc (C) : saison de pluies ; (D) :
saison sèche

138
 Les profils chimiques des extraits ne varient pas quelle que soit la période de récolte.
L’identification des constituants majeurs, leurs temps de rétention et leurs masses sont présentés
dans le tableau 19.

Les constituants majeurs de ces deux profils sont les iridoïdes glucosides (l’acide
géniposidique, le 11-méthylixoside (124) et l’ixoside (132)), les acides phénoliques (l’acide
quinique et l’acide chlorogénique (133)) et les sucres. Toutefois, l’ester méthylique de
shanzhiside et le 11-méthylixoside ont été déjà identifiés dans l’extrait des racines de
Crossopteryx febrifuga dans un mélange de chlorure de methylene et du méthanol (Bealem et
al., 2021). Le 11-méthylixoside a été isolée pour la première fois dans les feuilles et tiges de
Tarenna kotoensis Kan. Et Sas. Var. gyokushinka (Takeda et al., 1976) et dans les écorces de
tige et racine de Feretia apodanthera (Bailleul et al., 1979).

139
 Tableau 19. Caractérisation des constituants des extraits des écorces de tronc par LC-MS/MS (mode d’ionisation négative)

tr
N° Composé FB M-H exp. MS2 Exp. MS2 Théo. CFET1 CFET2 Reference
(min)
1 3,25 Sorbitol C6H14O6 181,0707 + + Standard

2 3,88 Acide quinique C7H12O6 191,0579 191/85/127/93/87 191/85/192/127/93/87 + + Standard

3 4,09 Saccharose C12H22O11 341,1088 89/59/341/179/71 + + Standard

4 10,04 Acide 373,1137 123/149/211/167/373/193 211/193/167/149/123 + + Massbank,

C16H22O10 Zhang et al.,
géniposidique
2018

181/93/343/89/59/137/163/119/71 Ibekwe et al.,

5 10,24 Ixoside C16H20O11 387,0936 343 + +
/101/205/387 2019

Spectrum
Ester méthylique de Bruker_HCD
6 12,24 C18H28O13 451,1455* 243/101/405/451 243/101/59/405 + +
shanzhiside _library0006
49

Acide
7 12,98 C16H18O9 353,0878 191/179/353/85/161 353/191/179/161/85 + - Standard
chlorogénique

Baelem et
al., 2021 ;
8 15,03 11-méthylixoside C17H22O11 401,1086 101/137/401/195/93/239/221 240/222/194/149/138 + +
Jangwan et
al. 2013

140
9 35,1 ND C42H64O15 807,4185 601/643/685/439/179/59 + +

10 38,25 ND C42H66O15 809,4336 603/809/645/617/441/59/179/89 + +

11 39,87 791,4239 747/585/791/567/439/113/101/71/ + +

ND C42H64O14
59

12 40,63 ND C25H56O13N6 647,3801 603/602/554/323/101/85/71/59 + +

13 42,22 Phytubérine C17H26O4 293,1759 236/221 236/221 + - Serralheiro et

al., 2020

(+) présence du composé, (-) composé non détecté, * composé identifié par rapport à l’adduit (M+HCOO-).

141
 II.4.3 - Profils chimiques des extraits des écorces de racines
Les profils chimiques correspondants aux extraits de racine sont repris dans la figure 71
et les données correspondant à leur identification sont présentées dans le tableau 20.

(E)

(F)

Figure 71. Profils chromatographiques des écorces de racine (E) : saison de pluies ; (F)
saison sèche

De façon générale, ces profils chimiques sont caractérisés par la présence de l’acide
gluconique, du sorbitol, du sucrose, de l’acide quinique, du shanzhiside, de l’acide
géniposidique, de l’ixoside, de l’ester méthylique de shanzhiside, du rehmannioside A (134),
du 11-méthylixoside, de l’acide 3,4-dicaffeoylquinique (135) et de l’acide 20(30)-ène
quinovique (136). La caractérisation des deux profils est présentée dans le tableau 20.

En comparant les profils LC-MS des échantillons issus de la saison des pluies et de la
saison sèche, on constate une certaine variation. En effet, le shanzhiside, élué à tr=9,75 min
dans l’échantillon récolté en saison des pluies n’est pas identifié dans l’extrait de la saison
sèche. De même l’acide géniposidique, élué à tr=9,93 min, est présent dans l’échantillon récolté
en saison sèche mais absent dans l’échantillon de la saison des pluies ; l’acide 3,4-
dicaffeoylquinique élué à tr = 24,89 est présent dans l’échantillon de la saison des pluies mais

142
absent dans l’échantillon de la saison sèche. Ainsi, il apparaît que pour cette partie, la plante ne
synthétise pas les mêmes composés au cours des différentes saisons. Les structures des
composés identifiés sont présentées sur la figure 73.

143
 Tableau 20. Caractérisation des constituants des extraits des écorces de racine par LC-MS/MS (mode d’ionisation négative)

tr
N° Composé FB M-H exp. MS2 exp. MS2théo CFRA1 CFRA2 Reference
(min)
1 3,32 Acide gluconique C6H12O7 195,0495 75/195/129/87/99/89/85 + - Standard

2 3.36 Sorbitol C6H14O6 181,0708 - + Standard

3 3,93 Acide quinique C7H12O6 191,0546 191/85/127/93/87 191/85/192/127/87 + + Standard

4 4,11 Saccharose C12H22O11 341,1085 89/59/341/179/71 89/59/341/179/71 + + Standard

5 6,7 Acide citrique C6H8O7 191,0184 191/129/111/87/85 111/87/85/191/129 - + Standard

Wang et al.,
229/211/193/185/149/121 167/149/185/121/229
6 9.75 Shanzhiside C16H24O11 391,1241 + - 2016 ; An et
/119/109/89 /109/193
al., 2020

Zhang et al.,
7 9,93 Acide géniposidique C16H22O10 373,1135 211/193/167/149/123 211/193/167/149/123 - +
2018

Ibekwe et al.,
8 10,4 Ixoside C16H20O11 387,0927 343/205/181/163/137 343 + +
2019

Spectrum
Ester méthylique de Bruker_HCD_
9 12.29 C18H28O13 451,1451* 243/101/405/451 243/101/59/405 + +
shanzhiside library000649

293/89/233/71/125/477 477/293/233 + + Maoyuan et

10 13.47 Rehmannioside A C21H32O15 523,1664
al., 2020

239/195/137/101/93 239/195/137/101/94 + + Baelem et al.,

11 15,15 11-méthylixoside C17H22O11 401,1081
2021

12 24.89 Acide 3,4-dicaffeoylquinique C25H24O12 515,1189 + - Standard

144
13 35,93 Non identifié C42H64O15 807,4173 601/643/685/439/179/59 + +

603/809/645/617/441/59/ + +
14 39,06 Non identifié C42H66O15 809,4329
179/89

747/585/791/567/439/113 + +
15 39,87 Non identifié C42H64O14 791,4229
/101/71/59

Acide 3β-urs-12,20 (30) - 439/454/269/255/230/169 Baelem et al.,

16 42.01 C30H44O5 483,3111
diène-27,28-dioïque /139/82 2021

Babady et al.,
17 42.24 Acide 20(30)-ène quinovique C30H46O5 485,3266 441 + -
1991
585/493/498/112/59259/7 - +
18 41,14 Non identifié C29H58O14 629,3691
3

(+) présence du composé, (-) absence du composé

145
 Le shanshiside, le 11-méthylixoside, l’acide 3β-urs-12,20 (30) -diène-27,28-dioïque et
l’acide 20 (30) - ène quinovique ont déjà été isolés et identifiés à partir des différents extraits
de Crossopteryx febrifuga (Babady et al., 1991 ; Baelem et al., 2021 ; Clemens et al., 1987).

Cependant, le rehmannioside A et l’acide 3,4-dicaffeoylquinique sont identifiés pour la

première fois dans Crossopteryx febrifuga dans cette étude, mais on les retrouve dans de
nombreuses espèces végétales (Maoyuan et al., 2020).

II.4.4 - Profils chimiques des extraits de fruits

Les fruits ont été trouvés sur l’arbre de Crossopteryx febrifuga pendant les deux périodes
de l’année, ce qui a permis la comparaison des profils chimiques des extraits (figure 72).

(H)

(I)

Figure 72. Profils chromatographiques des fruits (H) : saison de pluies ; (I) saison sèche

L’analyse comparative des profils chimiques montre une variation au niveau des
profils de ces deux échantillons. Plusieurs composés présents dans l’échantillon de la saison de
pluies ne se retrouvent pas dans l’échantillon récolté en saison sèche. C’est le cas de l’acide
fumarique (137) à tr = 7,34 min, de la rehmaglutine C (138) éluée à tr= 10,53 min, de l’acide

146
protocatéchique (139) à tr = 11,43 min, de l’acide 4-hydroxybenzoïque (140) à tr =13,80 min,
de l’acide vanillique (141) élué à tr= 19,78 min et de l’acide azelaïque (142) élué à tr= 26,71.
L’isoquercétine (143) est présente dans les deux profils. Tous les composés identifiés sont
présentés dans le tableau 21.

De même, pour l’échantillon de la saison sèche, on identifie des composés qui ne sont
pas présents dans l’échantillon de la saison des pluies. A tr = 10,21 min on identifie l’ixoside,
à tr = 11,33 min l’acide néochlorogénique à tr = 12,92 min l’acide chlorogéniques et l’acide
3,4-dicaffeoylquinique à tr = 24,52 min qui sont présents dans cet échantillon récolté en saison
sèche mais absents dans l’échantillon de la saison des pluies.

On note que c’est la première fois que les acides chlorogéniques, la rehmaglutine C,
l’acide 4-hydroxybenzoïque et l’acide caféique sont identifiés dans les fruits et dans les autres
organes de Crossopteryx febrifuga. En revanche l’acide protocatéchique avait déjà été identifié
dans l’extrait méthanolique des feuilles de Crossopteryx febrifuga (Ngenge et al., 2022). Les
structures des molécules identifiées sont présentées dans la figure 73.

147
 Tableau 21. Caractérisation des constituants des extraits des fruits par LC-MS/MS (mode d’ionisation négative)

tR
N° Composé FB M-H exp. MS2 exp. MS2 théo. CFFR1 CFFR2 Reference
(min)

1 3,28 Sorbitol C6H14O6 181,0708 + - Standard

2 3,35 Acide gluconique C6H12O7 195,0498 75/195/129/87/99/85 - + Standard

3 3,84 Acide quinique C7H12O6 191,0549 191/85/127/93/87 191/85/192/127/97 + + Standard

4 4 Saccharose C12H22O11 341,1085 + - Standard

5 6,8 Acide citrique C6H8O7 191,0187 191/129/111/87/85 111/87/85/191/129 + + Standard

6 7,34 Acide fumarique C4H4O4 115,0032 71/115/72/51 71 + - Said et al., 2017

199,0602 Zhao et al.,

7 10,53 Rehmaglutine C C9H12O5 155/137/125/107 155/137 + -
2021

181/83/343/89/59/137/163 Ibekwe et al.,

8 10,21 Ixoside C16H20O11 387,0936 343 - +
/119/71/101/205/387 2019

Acide
9 11,33 C16H18O9 353,0881 - + Standard
néochlorogénique

10 11,43 Acide protocatéchique C7H6O4 153,0177 109/153/110 109 + - Sun et al.,2015

11 12,92 Acide chlorogénique C16H18O9 353,0881 - + Standard

148
 Vallverdú-
Acide 4-
12 13,8 C7H6O3 137,0238 137/109/ 93/81/65 137/93 + - Queralt et al.,
Hydroxybenzoïque
2015

13 14,66 Acide caféique C9H8O4 179,0343 179/135 135 - + Standard

14 18,21 Isoquercétine C21H20O12 463,0882 300/463/271/301/255 300/463/301/271/255 + + Standard

15 18,71 Hypéroside C21H20O12 463,0882 300/271/436/255 300/463/301/271/255 + + Standard

16 19,78 Acide vanillique C8H8O4 167,0338 167/152/111 167/152 + - Massbank

Acide 3,4-
17 24,52 C25H24O12 515,1201 - + Standard
dicaffeoylquinique

187/125/126/169/143
18 26,71 Acide azélaïque C9H16O4 187,0966 125/187/169/126/97/143 + - Massbank
/97

Goufo et al.,
2020; Buzgaia
19 27,41 Phlorizdine C21H24O10 435,1299 273/167/179/123/125/119/93 273/167/229/297 - + et al., 2021 ;
Nie et al.,
2021

20 38,2 Non identifié C42H66O15 809,4346 603/809/765/689/89/59 + +

21 39,46 Non identifié C27H44O14 591,2657 406/340/113 + -

149
 747/707/705/619/572/473/16
22 40,16 Non identifié C42H66O17 841,4225 3/247/277/559/407/205/113/ + -
71
23 40,46 Non identifié C29H58O15 645,3655 439/453/457/59/89 + +

24 40,65 Non identifié C29H60O15 647,3807 603/602/554/323/101/85/71/ + +

59

25 40,75 Acide 311/293/229/211/171 329/211/229/171/183 + + massbank

C18H34O5 329,2329
trihydroxyoctadécénoïque

26 42,15 Acide 20(30)-ène 441 + + Babady et al.,

C30H46O5 485,3265
quinovique 1991

27 42,86 Acide octadécanédioïque C18H34O4 313,2381 313 + - massbank

(+) présence du composé, (-) absence du composé

150
Figure 73. Structures des composés identifiés dans les organes de Crossopteryx. febrifuga

151
 II.5 - Evaluation du potentiel antiradicalaire et antioxydant des extraits et tests
de cytotoxicité
Nous avons évalué le potentiel antiradicalaire et antioxydant des extraits de deux saisons afin
de vérifier des éventuelles variations sur les activités biologiques par rapport aux profils
chimiques dont nous avons évoqué précédemment les points de similitudes et de divergences.

L’activité antiradicalaire et le potentiel antioxydant ont été évalués suivant deux méthodes. La
méthode du piégeage du radical DPPH par mesure de la CI50 à partir d’un spectrophotomètre
UV visibles et la méthode intracellulaire de production de ROS.

II.5.1 - Evaluation du potentiel antiradicalaire par le piégeage du radical

DPPH
L’activité antiradicalaire a été réalisée sur les feuilles, les écorces de tronc, les racines et les
fruits récoltés pendant les deux saisons. Les extraits des feuilles, des écorces de tronc et de
racine de C. febrifuga ont inhibé de façon significative le radical DPPH comme le montre les
figures 74 et 75.

Crossopteryx febrifuga
120

100

80
% d'ihibition

CFET1
60 CFFR1
CFFE1
40
CFRA1
20
Vit c
0
0 200µg/ml 600µg/ml 1000µg/ml 1200µg/ml
concentration

Figure 74. Pouvoir inhibiteur des extraits de C. febrifuga à différentes concentrations (saison des pluies)

152
 Crossopteryx febrifuga
120

100

80

% d'ihibition
CFET2
60 CFFR2
CFFE2
40
CFRA2
20
Vit c
0
0 200µg/ml 600µg/ml 1000µg/ml 1200µg/ml
concentration

Figure 75. Pouvoir inhibiteur des extraits de C. febrifuga à différentes concentrations (saison sèche)

A partir des pourcentages d’inhibition des différents extraits, nous avons déterminé
les CI50 de chaque extrait afin de mieux caractériser le pouvoir antioxydant.

Les CI50 des échantillons de la saison des pluies des extraits de feuilles, des écorces
de tronc, des racines et des fruits sont respectivement de l’ordre de 100, 110, 200 et 710 µg/mL.
Certaines CI50 des extraits sont très proches de celle de la vitamine C (CI50 =102 µg/mL, pris
comme référence). Pour les échantillons de la saison sèche les CI50 des extraits de feuilles, des
écorces de tronc, des racines et des fruits sont respectivement de l’ordre de 106, 111, 163 et 329
µg/mL. Les feuilles, les écorces de tronc et les racines récoltés pendant les deux saisons ont
inhibés le radical DPPH de manière significative.

On note que l’extrait des feuilles de la saison des pluies est plus actif avec une CI50
proche à celle de la vitamine C par rapport à l’échantillon de la saison sèche. L’extrait de
l’écorce de tronc de la saison des pluies est plus actif que celui de la saison sèche avec une CI50
de 111 µg/mL contre 163 µg/mL en saison sèche. L’extrait de racine récolté en saison sèche
(CI50 de 106 µg/mL) est plus actif que l’échantillon de la saison des pluies (CI50 200 µg/mL).
Quant aux extraits des fruits récoltés pendant les deux saisons, aucun effet significatif n’a été
observé sur le radical DPPH, leurs CI50 sont largement supérieures par rapport à celle de la
vitamine C (tableau 22).

153
 Tableau 22. Concentrations inhibitrices (CI50) des extraits

Vit C
Feuilles Ecorces de tronc Ecorces des racines Fruits
(µg/mL)
SP SS SP SS SP SS SP SS
Echantillon
CFFE1 CFFE2 CFET1 CFET2 CFRA1 CFRA2 CFFR1 CFFR2 102

CI 50
100 111 110 163 200 106 710 329
(µg/ml)

Ces résultats corroborent les travaux de certains auteurs qui ont observé une activité
antioxydante intéressante des extraits méthanoliques et à l’acétate d’éthyle des feuilles de
Crossopteryx febrifuga (Ouedraogo et al., 2019 ; Edwor et al., 2015 ; Ngenge et al., 2022).
Cependant, les résultats sur les extraits de fruits sont contraires à ceux obtenus par Maiga
(Maiga et al., 2006) qui ont observé une activité significative sur les extraits de fruits obtenus
par extraction au soxhlet (extraction à chaud). Mais, il est tout aussi probable que la méthode
d’extraction est susceptible d’expliquer les résultats contraires observés. L’extraction à froid,
utilisée dans notre étude, et l’extraction à chaud ne conduisent certainement pas aux mêmes
types d’extraits sur le plan de la composition chimique.

II.5.2 - Evaluation de l’activité antioxydante par la méthode intracellulaire

de production de ROS
La technique utilisée est identique à celle utilisée pour les extraits de V. madiensis. On
réalise la mesure en présence des extraits aux quatre concentrations déjà préparées (10, 25, 50
et 100 µg/mL).

L’impact des extraits de C. febrifuga sur la production des ROS incubés avec les
leucocytes du sang total et stimulés par le PMA (1 µM) a été mesuré à 2 heures (figure 76). Les
résultats sont exprimés en pourcentage par rapport au témoin (cellules incubées avec du PMA
et sans extraits). Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM (n = 3- 6), l’effet
sur l’inhibition de la production des ROS est significatif pour *p ˂ 0,05 ; **p ˂ 0,01 et ***p ˂
0,001 par rapport au témoin normalisé à 100 %. Les résultats de la figure 76 traduisent une
diminution significative de la production de ROS induit par les leucocytes totaux après 2h
d’incubation en présence des extraits de fruits récoltés en saison des pluies et en saison sèche.
Cet effet est observé respectivement dès les concentrations 10 µg/mL jusqu’à 100 µg/mL pour
l’échantillon de la saison sèche et à partir de 50 µg/mL pour l’échantillon de la saison des pluies.

154
 140 A

production de ROS (%)

120
100
80 ** *
60 ** ***
***
40 ***
20
0
Témoin 10 25 50 100

Concentration (µg/mL)
CFFR1 CFFR2

120 B
production de ROS (%)

100
80
60
40
20
0
Témoin 10 25 50 100

Concentration (µg/mL) CFFE1

150 C
production de ROS (%)

100

50

0
Témoin 10 25 50 100
Concentration (µg/mL)
CFET1

160 D
production de ROS (%)

140
120
100
80
60
40
20
0
Témoin 10 25 50 100
Concentration (µg/mL)
CFRA1

Figure 76. Production de ROS de leucocytes sanguins pendant 2h. A : fruits récoltés en saison des
pluies et en saison sèche ; B : feuilles saison des pluies ; C : écorces de tronc saison des pluies ; D :
écorces de racines saison des pluies

155
 Dès la concentration la plus faible, 10 µg/mL, l’extrait de fruit récolté en saison sèche
a montré un effet significatif "dose-dépendante" avec un pourcentage de production de ROS de
76 % tandis que l’échantillon de la saison des pluies a montré un effet significatif "dose-
dépendante" à 50 µg/mL avec un pourcentage de production de ROS de 67 %. A la plus forte
concentration, 100 µg/mL, les deux échantillons ont montré une réduction significative de la
production de ROS.

Les extraits des feuilles, des écorces de tronc et de racines récoltés pendant la saison des pluies
n’ont pas montré d’effet significatif sur la production de ROS induit par les leucocytes à toutes
les concentrations testées. Les extraits de l’écorce de tronc et de racine ont même présenté une
tendance à augmenter la production de ROS à 100 µg/mL.

Les effets inhibiteurs des deux extraits de fruits sur la production de ROS pourraient être dus
aux différents composés chimiques présents dans leurs profils chimiques. Certains de ces
composés sont connus pour leurs propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires, c’est le cas
de l’acide protocatéchique qui est connu pour ses propriétés antioxydantes (Phanthong et al.,
2015), l’acide chlorogénique connu pour ses propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires,
hépatoprotectrices et antivirales (Naveed et al., 2018 ; Sato et al., 2011 ; Kono et al., 1998 ;
Hwang et al., 2014). Il conviendrait cependant de confirmer ces résultats en ciblant ces
composés dans les fractions où ils seraient majoritaires.

II.5.3 - Effet des extraits sur la viabilité cellulaire

En évaluant l’activité antioxydante des différents extraits bruts, il est important
d’étudier en parallèle leur effet sur la viabilité cellulaire. Ce test permet d’évaluer l’innocuité
ou la cytotoxicité de nos extraits aux concentrations utilisées pour mettre en évidence leur
potentiel antioxydant.

Comme pour V. madiensis, la viabilité des leucocytes humains a été évaluée par le test de
fluorescence à la résazurine, les différents extraits sont incubés avec les leucocytes totaux
stimulés par le PMA et la résazurine pendant 24 h d’incubation à 37 °C, les résultats sont
présentés dans la figure 77.

156
 250

viabilité cellulaire (%)

E
200

150

100
* *
50 *
0
Témoin 10 25 50 100
Concentration (µg/mL)

CFFR1 CFFR2

120
F
viavilité cellulaire (%)

100
80 *
60
*
40
20
0
Témoin 10 25 50 100
Concentration (µg/mL)
CFFE1

160
140
H
viabilité cellulaire (%)

120
100
80
60 *
40 *
20
0
Témoin 10 25 50 100
Concentration (µg/mL)
CFET1

140
I
viabilité cellulaire (%)

120
100
80
60
40
20
0
Témoin 10 25 50 100
Concentration (µg/mL)
CFRA1

Figure 77. Viabilité cellulaire des extraits. E : extraits de fruits récoltés pendant les deux
saisons ; F : feuilles saison des pluies ; H : écorces de tronc saison des pluies ; I : racine
saison des pluies. Les résultats sont la moyenne ± SEM (n=4 expériences indépendantes) 157
 L’analyse des résultats montre qu’aux différentes concentrations testées, l’extrait de
fruits récolté en saison des pluies n’a pas présenté d’effet sur la viabilité cellulaire, aucune
différence significative n’a été observée par rapport au témoin (figure 77). Quant à l’extrait de
fruits récoltés en saison sèche, un effet significatif est observé sur la viabilité des leucocytes à
partir de la concentration 25 µg/mL et cet effet va dans le même sens que la diminution de la
production de ROS. En effet pour cet extrait de la saison sèche plus la production de ROS
diminue, plus l’effet sur la viabilité cellulaire est important, cela indique que cet extrait de la
saison sèche est cytotoxique pour les leucocytes sanguins et cette cytotoxicité de l’extrait
pourrait être à l’origine de la diminution significative de la production de ROS observée à partir
de 25 µg/mL jusqu’à la plus forte concentration, 100 µg/mL (figure 77).

Les extraits des feuilles et écorces de tronc ont montré un effet significatif sur la
viabilité cellulaire à 50 et à 100 µg/mL tandis que l’extrait des racines n’a pas montré d’effet
sur la viabilité cellulaire.

Ainsi, l’extrait de fruits de la saison des pluies possèdent des effets antioxydants aux
concentrations 50 et 100 µg/mL tandis que l’extrait de saison sèche a un effet antioxydant et à
la concentration 10 µg/mL. C’est la raison pour laquelle nous avons concentré nos efforts sur
l’étude de cet extrait de fruits de la saison des pluies.

II.6 – Séparation de l’extrait CFFR1 par extraction avec des solvants de

polarité croissante
L’extrait CFFR1 étant le plus actif en inhibant la production de ROS et non cytotoxique
sur la viabilité cellulaire a été fractionné par extraction liquide-liquide avec des solvants de
polarité croissante suivant le schéma décrit sur la figure 78, afin de réaliser une première
séparation des molécules.

158
 Extrait CFFR1 : 3,00 g

120 mL H2O + 3 x 30 mL cyclohexane

E1-cyclo
0,67 g H2O

E2-DCM 2,97 g 3x 30 mL CH2Cl2

0,39 g
H2O
E3-AcOEt 3 x 30 mL AcOEt
0,11 g 2,97 g
H2O

E4-BuOH 3 x 30 mL BuOH
2,97 g
0,28 g
E5-H2O résiduelle
0,71 g

Figure 78. Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante des fruits (CFFR1)

II.6.1 - Profil phytochimique des fractions

Les profils LC-MS de cinq fractions sont présentés dans les figures 79 à 83. La
caractérisation des composés majeurs de ces cinq fractions est présentée dans le tableau 23.

Figure 79. Profil chromatographique de la fraction E1-cyclo

159
 Figure 80. Profil chromatographique de la fraction E2-DCM

Figure 81. Profil chromatographique de la fraction E3-AcOEt

160
Figure 82. Profil chromatographique de la fraction E4-BuOH

Figure 83. Profil chromatographique de la fraction E5-H2O

161
 Tableau 23. Constituants majeurs des cinq fractions de CFFR1

N° tR (min) Composés FB M-H exp. MS2-exp. MS2 théo. E1- E2- DCM E3- E4- E5- Reference
cyclo AcOEt BuOH H2O
1 3,87 Acide quinique C7H12O6 191,0546 - - - - + Standard
1 6,79 Acide citrique C6H8O7 191,0184 191/129/11 111/87/85/ - + - - + Standard
1/85/87 191/129
2 7,31 Acide fumarique C4H4O4 115,0022 71 71 - + - - +
3 8,51 Acide gallique C7H6O5 169,013 125/169/97 125/169/12 - - + - Standard
/79/126 6/170/97
4 9,98 Acide géniposidique C16H22O10 373,1135 211/193/16 211/193/16 - - - + - massbank,
7/149/123 7/149/123 Zhang et al.,
2018
5 10,45 Rehmaglutine C C9H12O5 199,06 155/137/12 155,0704/1 - + - - + Zhao et al.,
5/107 37,0596 2021
6 11,34 Acide protocatéchique C7H6O4 153,0176 109/153/11 109 - + +++ +++ - Sun et al.,
0 2015
7 12,97 Acide chlorogénique C16H18O9 353,0873 - - - + - Standard
8 13,69 Acide para- C7H6O3 137,0225 - + ++ + - Sun et al.,
hydroxybenzoïque 2015
9 13,96 Eucommidiol C9H12O4 183,0652 183/139 139/93 - + - + - Zhao et al.,
2021
10 15,21 Non identifié C15H22O5 281,1393 281/237/17 - - - + -
1/123/189/
207
11 16,76 Acide sébacique C10H18O4 201,1123 201/183/15 183/157/13 - - + + - Uysal et al.,
5/157/139/ 9/137/11 2021
113/111/13
7
12 18,29 Isoquercétine C21H20O12 463,0881 300/463/27 300/463/20 - + + + - Standard
1/255/179 1/271/255
13 19,5 Acide vanillique C8H8O4 167,0337 167/152 167/152 - - ++ - - Dias et al.,
2013

162
14 19,89 Non identifié C20H22O8 389,124 165/193/15 - - + - -
0/134/341
15 20,29 3- C14H26O5 273,1707 - - - + -
hydroxytetradécanédio
ïque
16 24,33 Non identifié C20H22O7 373,1289 165/177/15 - + - - -
0/195
17 25,04 Non identifé C20H22O7 373,129 165/177/15 - + - - -
0/195/122
18 25,04 4-hydroxy-3 C10H10O3 177,0548 - + - - - Massbank
méthoxycinnamaldehy
de
19 26,36 Acide azélaïque C9H16O4 187,0963 169/143/12 187/125/12 - + ++ + - Massbank
6/125/97/5 6/169/143/
7 97
20 30,99 Acide C9H12O4 183,0653 139 139.0769 - + + + - Bajoub et al.,
décarboxyméthyl 2016
élénolique
21 35,66 Ether de diméthyle C18H16O5 311,0924 281/296/31 146/296/16 - + - - - Massbank
sappanone 1/253/265/ 1/181/311/
146 253
22 38,44 Quercétine C15H10O7 301,035 301/151/17 301/151/17 - - + - - Standard
8/121/273 8/273/121
23 39,49 Non identifié C27H44O14 591,266 406/519/34 - + - +++ -
0
24 39,95 Non identifié C20H18O5 337,108 - + - - -
40,19 Non identifié C42H66O15 809,4346 603/809/76 + -
5/689/89/5
9
25 40,62 Acide Trihydroxy C18H34O5 329,233 329/171/21 329/229/21 + + ++ - - Yang et al.,
octadécénoïque 1/229/139/ 1/209/171/ 2020
127 139/127
40,70 Non identifié C29H60O15 647,3807 + + -
26 41,15 Non identifié C18H34O6 345,2278 345 - + + + -
27 41,36 30-Norhedéragénine C29H44O4 455,3162 - + - -

163
28 41,42 Acide 9,12,13- C18H32O5 327,2173 327/209/17 327/291/22 + + - - + Rinaldi de
Trihydroxy-10,15- 1/197/291/ 9/171 Alvarenga et
octadécanédioïque 309/ al., 2020
29 41,75 Acide C18H34O4 313,2382 313 313 + + - - - Massbank
octadécanédioïque
30 42,12 Acide 20(30)-ène- C30H46O5 485,3266 441 + - - + - Babady et
quinovique al., 1991
31 42,56 21- C30H44O5 483,3109 439 + - - + -
Hydroxyisoglabrolide
32 42,72 Acide 9,10 C18H34O4 313,2381 313/183/29 313/295/20 + + - - - Massbank
dihydroxyoctadécé-12- 5/201 1
dioïque
33 43,12 Galangine C15H10O5 269,0455 269 269,26 - + - - - Masbank
- : absence du composé ; + : présence du composé ; ++ : composé abondant ; +++ : composé très abondant

164
 L’analyse chromatographique des profils chimiques de chaque fraction montre
que la fraction E1-cyclo contient des acides gras. La fraction E2-DCM contient des acides
phénoliques (acide protocatéchique) et une proportion abondante d’acides gras (acide
trihydroxyoctadécenoïque et acide 9,10-dihydroxyoctadécanedioïque). Les flavones sont peu
abondants. La fraction E3-AcOEt est caractérisée par la présence majoritaire d’acide
protocatéchique. Dans cette fraction, on retrouve ainsi de l’acide para-hydroxybenzoïque, de
l’acide vanillique, de l’acide azelaïque et de l’isoquercétine. La fraction butanolique E4-BuOH
est caractérisée aussi par la présence de l’acide protocatéchique en abondance. La fraction E5-
H2O est caractérisée majoritairement par la présence d’acides, dont les acides quinique, citrique
et fumarique sont les plus abondant.

II.6.2- Potentiel antiradicalaire et antioxydant des fractions de CFFR1

Les cinq fractions ont été testées pour leur activité antioxydante et anti-
inflammatoire par la méthode intracellulaire de production de ROS et par la méthode
bioautographique HPTLC avec le DPPH comme revelateur des composés actifs.

- Méthode intracellulaire de production de ROS

Les cinq fractions ont été testées pour leur pouvoir à inhiber la production de ROS
induit par les leucocytes du sang suivant le protocole identique à celui utilisé pour les extraits
bruts aux quatre concentrations déjà préparées (10, 25, 50 et 100 µg/mL). Cette mesure est
réalisée pendant 2 h à 37 °C. Les résultats de l’analyse sont présentés sur la figure 84.

165
 350

production de ROS (%) 300

250

200

150

100
**
**
50 *** ***

0
10 25 50 100

Concentration (µg/mL)

E1-cyclo E2-DCM E3-AcOEt E4-BuOH E5-H2O

E5-H2O

Figure 84. Production de ROS des leucocytes sanguins, incubés avec les fractions et stimulés
avec du PMA (1 µM) pendant 2h. Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± SEM
(n=3), *p< 0,05, **p< 0,01 et ***p< 0,001 par rapport au témoin normalisé à 100%.

La fraction E3-AcOEt a réduit la production de ROS de manière significative "dose-

dépendante" dès 10 µg/mL (avec une diminution de 30 %) et à 100 µg/mL (une diminution de
55 %) par rapport au témoin (témoin normalisé à 100%). Cet effet sur les ROS serait dû à la
présence des composés comme l’acide protocatéchique, l’acide para-hydroxybenzoïque, l’acide
azélaïque, l’acide vanillique ou l’isoquercétine qui pourraient agir en synergie dans cette
fraction. La fraction E2-DCM a montré une tendance à réduire la production de ROS à toutes
les concentrations testées mais ces résultats semblent statistiquement discutables (p ˃ 0,05 à
toutes les concentrations testées), tandis que les fractions E1- cyclo, E4-BuOH et E5-H2O ont
montré une augmentation de la production de ROS de manière significative à différentes
concentrations.

- Effet des fractions sur la viabilité cellulaire

Il est important d’étudier l’activité sur la viabilité des cellules en présence des
différentes fractions, elle permet de faire une corrélation entre l’effet sur la production de ROS
et la viabilité cellulaire mais aussi pour savoir la concentration à laquelle la fraction présente
un potentiel antioxydant. La viabilité cellulaire après exposition aux fractions testées est

166
déterminée en utilisant le test de fluorescence à la résazurine. La technique est identique à celle
réalisée sur les extraits. Les résultats de cette analyse pour chaque concentration de chacune
des fractions sont exprimés en pourcentage et présentés dans la figure 85.

120
production de ROS (%)

100
*
80 *
*
* * * *
60

40

20

0
10 25 50 100

Concentration (µg/mL)

E1-cyclo E2-DCM E3-AcOEt E4-BuOH E5-H2O

E5-H2O

Figure 85. Viabilité cellulaire des fractions pendant 24 h. Les résultats sont la moyenne ±
SEM (n=3 expériences indépendantes), *p < 0,05 par rapport au Témoin normalisé à 100 %.

Ces résultats montrent que la fraction E2-DCM possède un effet significatif sur la
viabilité cellulaire à partir de 25 µg/mL, la fraction E3-AcOEt quant à elle a montré un effet
significatif sur la viabilité cellulaire à 50 et 100 µg/mL. De même pour la fraction E5-H2O, un
effet significatif sur la viabilité cellulaire a été observé à 50 et 100 µg/mL. Cependant, la
fraction E4-BuOH n’a pas montré d’effet sur la viabilité cellulaire, aucun effet significatif n’a
été observé.

Ainsi, la fraction E3-AcOEt qui a inhibé la production de ROS de manière significative "dose-
dépendante" dès 10 µg/mL est cytotoxique vis-à-vis des cellules sanguines à 50 et 100 µg/mL.
Cette fraction possède une activité antioxydante à 10 et 25 µg/mL. Par ailleurs, la tendance de
la réduction de la production de ROS observée pour la fraction E2-DCM serait due à l’effet
cytotoxique observé à partir de 25 µg/mL, étant donné que la réduction de la production de
ROS va dans le même sens que la diminution de la viabilité cellulaire.

167
 II.6.3 - Evaluation de l’activité antiradicalaire de l’extrait CFFR1 et des
fractions par bioautographe HPTLC

Afin de comparer les résultats obtenus pour l’activité de l’extrait des fruits et des
fractions réalisées à partir de l’extrait de fruits CFFR1 avec l’activité antiradicalaire, nous avons
décidé de réaliser un test par bioautographie HPTLC.

Cette technique permet d’identifier les métabolites réactifs d’intérêt sur un test
(physicochimique, comme nous le faisons avec le DPPH, ou enzymatique, antibactérien…)
réalisé sur une plaque CCM.

Nous avons ainsi réalisé les plaques HPTLC de l’extrait brut et des fractions en
utilisant le même protocole que celui développé dans le cas des extraits de V. madiensis.

La figure 86 traduit la présence des composés possédant les effets antiradicalaires

dans l’extrait CFFR1 et les fractions E3-AcOEt, E4-BuOH et même la fraction E2-DCM. Ces
effets sont marqués par l’apparition des taches jaunes sur fond violet sur la plaque. Les fractions
E1-cyclo et E5-H2O ne semblent pas actives sur le DPPH.

Figure 86. Analyse HPTLC avec dérivatisation au DPPH visualisée à la lumière blanche.

L’extrait CFFR1 a montré une activité antiradicalaire qui s’est manifestée par la
présence des taches jaunes aux différents Rf, qui pourraient correspondre aux acides

168
phénoliques (taches jaunes sur la ligne de dépôt) et les acides gras (tache jaune très intense sur
le front du solvant) présentant une forte activité antioxydante comparable à l’extrait
méthanolique des feuilles de Reine-des-prés (Filipendula ulmaria) pris comme standard de
référence dans cette étude.

Comme il était prévisible, les composés apolaires des fractions E2-DCM et E3-
AcOEt ainsi que la fraction E4-BuOH présentent une activité anti-radicalaire significative. Ceci
confirme bien les résultats observés avec le test ROS sur les fractions.

III. Discussion

L’étude phytochimique des différents extraits réalisés par LC-MS a permis d’identifier
plusieurs composés parmi lesquels certains ont été identifiés pour la première fois dans C.
febrifuga. Les parties de la plante ont été caractérisées par les acides organiques comme l’acide
gluconique, l’acide quinique, les acides phénoliques comme l’acide protocatéchique, l’acide
para-hydroxybenzoïque, l’acide vanillique ; les composés dérivés des sucres comme le sucrose
et le méthyl-O- α-D-galactopyranosyl-(1→3)-α-D-galactopyranoside. Il convient également de
noter la présence des iridoïdes tels le shanzhiside et l’ester méthylique de shanzhiside. On note
la présence des iridoïdes glycosylés identifiés pour la première fois dans cette plante notamment
l’acide géniposidique (présent dans tous les extraits des différentes parties étudiées), la loganine
(présent dans les extraits de feuilles), l’ixoside (présent dans presque tous les extraits) et
d’autres iridoïdes déjà identifiés dans la plante notamment le 11-méthylixoside (présent dans
les extraits des écorces de tronc et de racine) (Bealem et al., 2021), le shanzhiside et l’ester
méthylique de shanzhiside (Erdelmeier et al., 1987). L’ester méthylique de shanzhiside semble
présent en quantité importante dans la plupart des extraits. le rehemannioside A (identifié pour
la première fois dans la racine de cette plante) ; la présence des flavonoïdes comme
l’isoquercétine (dans les fruits et les feuilles), les acides phénoliques (dans les extraits des
feuilles et des fruits) notamment les acides chlorogéniques et ses isomères, les acides
dicaffeoylquinique et isomères, la rehmaglutine C ; les terpénoïdes comme la phytubérine
(présente dans les feuilles et les écorces de tronc et identifiée pour la première dans la plante),
l’acide 20(30)-ène quinovique (présent dans les fruits et racine), l’acide 3β-urs-12,20 (30) -
diène-27,28-dioique (présent dans les racines).

L’évaluation des activités antiradicalaires et antioxydantes des différents extraits

nous ont permis de comparer celles-ci aux données de la littérature et de tenter une
interprétation de ces activités au regard du profil phytochimique de ces extraits. Le test avec le

169
DPPH a montré que les extraits des feuilles, des écorces de tronc et des racines présentent des
capacités antiradicalaires prometteurs, confirmant ainsi les travaux réalisés par (Edwor et al.,
2015 ; Ngenge et al., 2022 ; Ouedraogo et al., 2019). Nous soulignons que nos résultats sur
les CI50 sont relativement élevés par rapport à ceux obtenus pour certaines espèces végétales,
ayant une activité antioxydante importante notamment pour les espèces suivantes : Daniella
oliveri (Et= 2,9µg/ml, Er= 2,8µg/ml, Fe= 2,7µg/ml) ; Vitex doniana Sweet (Et= 2,9µg/ml, Er=
2,9µg/ml, Fe= 2,9µg/ml ; Desmodium adscendens Sw (Fe= 4µg/ml) ; Ficus capensis (Et=
2,9µg/ml, Er= 8,8µg/ml, Fe= 10,2µg/ml) ; Stevia rebaudiana Bertoni (Et= 2,9µg/ml) ;
Securidaca longependuculata Fresen (Er= 5,5µg/ml) (Muanda, 2010) et même ceux obtenus
pour les différents extraits de Crossopteryx febrifuga par certains auteurs (Edwor et al., 2015 ;
Ngenge et al., 2022 ; Ouedraogo et al., 2019). Cependant, il faut relativiser ces comparaisons
directes car, très souvent, les méthodes utilisées ne sont pas strictement identiques (on ne teste
pas toujours aux mêmes conditions et concentrations et aussi la durée de la réaction de dosage
n’est pas toujours la même).

Il faut également souligner que le fait que les extraits des feuilles, des écorces de
tronc et des racines sont globalement plus riches en polyphénols totaux et en flavonoïdes,
explique probablement leur meilleure activité antiradicalaire.

Les extraits des feuilles, des écorces de tronc et de racines récoltés pendant les deux
saisons possédant les effets antiradicalaires intéressants avec le DPPH par mesure de CI50 ne le
sont pas avec la méthode intracellulaire de production de ROS. Aucun effet significatif n’a été
observé sur les ROS pour ces extraits. Cette différence des résultats sur les deux méthodes
montre les limites de chacune des méthodes. La première une méthode dans laquelle la réaction
antiradicalaire est purement une réaction chimique tandis que la deuxième est une méthode au
cours de laquelle la réaction est biologique et se rapproche du fonctionnement de l’organisme
humain.

Le test ROS réalisé sur les extraits de fruits récoltés pendant les deux saisons et les
cinq fractions testées ont montré que les fruits des deux saisons et la fraction E3-AcOEt issue
de CFFR1 ont significativement diminué la production de ROS induit par les leucocytes
sanguins dès la concentration la plus faible 10 µg/mL. L’extrait de fruits de la saison sèche et
la fraction E3-AcOEt ont présenté une cytotoxicité sur la viabilité des cellules respectivement
à 25 µg/mL pour l’extrait CFFR2 et à partir de 50 µg/mL pour la fraction E3-AcOEt.

170
 L’extrait CFFR1 possède un potentiel antiradicalaire et antioxydant à toutes les
concentrations testées tandis que l’extraits CFFR2 est antiradicalaire et antioxydant à 10 µg/mL
et la fraction E3-AcOEt possède un potentiel antiradicalaire et antioxydant à 10 et 25 µg/mL.
L’extrait CFFR1 et la fraction E3-AcOEt sont caractérisés majoritairement par les acides
phénoliques tels que l’acide protocatéchique, l’acide para-hydroxybenzoïque, l’acide gallique,
l’acide vanillique et l’acide azélaïque et des flavonoïdes notamment l’isoquercétine et la
quercétine dont les propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires sont connues (Ngenge et
al., 2022 ; Manuja et al., 2013 ; Morishita et al., 2001), ce qui pourrait expliquer les résultats
observés.

Plusieurs auteurs dans la littérature affirment que l’activité antioxydante et anti-

inflammatoire d’un extrait dépend de sa quantité en composés phénoliques (El Guiche et al.,
2015 ; Guettaf et al., 2016 ; Bamba et al., 2021). De plus, les flavonoïdes constituent la classe
la plus importante des polyphénols ayant montré des meilleurs potentiels activités biologiques
telles que l’activité antioxydante, anti-inflammatoire, antibactérienne, anticancéreuse et
antiallergique (Anyasor et al., 2010 ; Ghedadba et al., 2015). C’est ainsi qu’il nous semble
probable que cette hypothèse confirme l’activité observée dans les extraits de fruits. Mais le
potentiel antioxydant peut aussi dépendre cependant d’autres composés chimiques (Bouyahya,
2016).

IV. Conclusion du chapitre

Nos résultats ont montré que l’extrait de fruits de C. febrifuga possédait un potentiel
antioxydant prometteur. Sa toxicité vis-à-vis des cellules humaines n’est atteinte qu’avec des
concentration supérieures à celles nécessaires pour déclencher une activité antioxydante
significative.

Des études plus approfondies sont néanmoins indispensables pour une description plus
exhaustive du profil phytochimique et pour confirmer le potentiel anti-inflammatoire de cet
extrait.

171
172
CONCLUSION ET
PERSPECTIVES

173
174
 Les travaux de recherche faisant l’objet de ce mémoire ont été réalisés dans le cadre
d’une thèse en cotutelle internationale entre l’Université Marien Ngouabi (Congo) et
l’Université Clermont Auvergne (France). L’objectif de cette thèse concerne l’étude
phytochimique et l’évaluation du potentiel biologique d’extraits de plantes médicinales
congolaises. Ces travaux s’inscrivent dans une stratégie générale de valorisation de la flore
congolaise, qui regorge un nombre important d’espèces végétales très peu étudiées
scientifiquement, et la validation et rationnalisation, le cas échéant, l’usage traditionnel de ces
plantes.

La première étape a consisté en la sélection des plantes médicinales faisant l’objet de

notre étude. Nous avons ciblé les plantes utilisées en médecine traditionnelle pour la prise en
charge de maladies chroniques impliquant des processus inflammatoires. Une enquête
ethnobotanique complétée par des recherches bibliographiques nous ont permis de sélectionner
deux plantes : Vitex madiensis et Crossopteryx febrifuga. En effet, relativement peu
investiguées scientifiquement, ces deux plantes sont souvent prescrites par les tradithérapeutes
pour traiter les douleurs et la fièvre. Les populations autochtones leur attribuent des vertus anti-
inflammatoires.

Les différents échantillons de chacune des plantes ont été récoltés pendant deux grandes
saisons du Congo en saison des pluies et en saison sèche, nous avons pris le soin de récolter la
matière végétale au même endroit pour tenter d’étudier la variation climatique sur le profil
phytochimique et son impact sur les activités biologiques. Huit extraits de plantes, réalisés par
macération dans le méthanol, ont fait l’objet de nos travaux de recherche. L’évaluation de
l’activité biologique a été réalisé en effectuant des tests antiradicalaires (DPPH), antioxydant
(ROS) et, dans le cas de composés d’intérêt isolés, anti-inflammatoire (COX). Des tests de
viabilité cellulaire ont également été réalisés pour évaluer la cytotoxicité des extraits.

Concernant les travaux réalisés sur Vitex. madiensis, l’étude du profil phytochimique
des différents extraits, déterminé par LC-MS, a révélé la présence de phytoecdystéroïdes,
d’iridoïdes, de polyphénols et de flavonoïdes. La plupart des familles chimiques trouvées dans
les extraits sont connues pour leurs propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. De plus,
nous avons constaté une certaine variation du profil phytochimique des extraits selon les
organes sélectionnés, mais aucune différence majeure en fonction de la saison de récolte. Il
convient de noter que certains composés, tels que les phytoecdystéroïdes, sont présents en
quantité variable dans presque tous les extraits réalisés.

175
 Les tests d’activité antioxydante des deux extraits récoltés en saison des pluies (l’extrait
des feuilles et l’extrait d’écorces de tronc) ont révélés des résultats prometteurs. Ces extraits
ont donc fait l’objet d’un fractionnement par solvant de polarité croissante pour identifier les
biomarqueurs. Une fraction bioactive et non cytotoxique contenant majoritairement les
phytoecdystéroïdes a été purifiée. Nous avons ainsi isolé quatre phytoecdystéroïdes (figure 87).

Figure 87. Phytoecdystéroïdes isolés à partir des feuilles de V. madiensis

Si la faible quantité de pterostérone isolée n’a pas permis d’évaluer son potentiel anti-
inflammatoire, les trois autres phytoecdystéroïdes (20-hydroxyecdysone, ajugastérone C,
vitexirone) ont été testés pour leurs propriétés antioxydante sur les marqueurs de l’inflammation
ROS et leur activité cytotoxique sur les leucocytes sanguins a été également évaluée. Un d’entre
eux, la 20-hydroxyecdysone a inhibé la production de ROS de manière significative, "dose-
dépendante" dès 1 µm/mL (73 % de production de ROS). Compte tenu de ces résultats très
prometteurs, le potentiel anti-inflammatoire de ce composé a été évalué sur l’expression
génique de COX-2 étudiée par qPCR. La 20-hydroxyecdysone a montré de très bonnes

176
propriétés anti-inflammatoires avec une réduction significative de l’expression relative de la
COX-2 par les cellules de plus de 70 % par rapport au témoin.

Les résultats encourageants de la 20-hydroxyecdysone nous ont amené à réaliser un

dosage de ce composé dans les différents extraits bruts. La concentration de la 20-
hydroxyescdysone la plus élevée a été trouvée dans l’extrait des feuilles récolté pendant la
saison des pluies (202 µg/mL) et les extraits de racine récoltés pendant les deux saisons (199 et
221 µg/mL). Cette classe de composé semblerait donc posséder des activités anti-
inflammatoires intéressantes et pourrait expliquer l’usage traditionnel de cette plante pour
soigner les maladies impliquant le processus inflammatoire. Il conviendrait toutefois de
confirmer cette probabilité par des études sur la constitution chimique des décoctions prescrites
par les tradithérapeutes.

Concernant Crossopteryx febrifuga, nous avons constaté que les extraits de cette plante
sont caractérisés essentiellement par la présence d’acides organiques, d’iridoïdes glycosylés, de
polyphénols, de flavonoïdes et de terpènes. La loganine, la phytubérine, le rehmannioside A, la
rehmaglutine C et l’acide azelaïque, ont été identifiés pour la première fois dans les extraits de
cette plante. Nous avons également évalué les propriétés antiradicalaires et antioxydantes des
différents extraits par le test au DPPH et le test de production de ROS induit par les leucocytes
du sang humain. L’extrait des fruits récoltés en saison des pluies présente des activités
intéressantes sur l’inhibition de la production de ROS. Les extraits des feuilles, des écorces de
tronc et des racines ont montré des résultats prometteurs sur l’inhibition du radical DPPH.

Enfin, nous avons réalisé un fractionnement par solvants de polarité croissante de

l’extrait de fruits récolté en saison des pluies. Une fraction bioactive a été identifiée. Faute de
temps, nous n’avons pas pu isoler les molécules d’intérêt, potentiellement responsables des
activités observées.

177
 Perspectives

Nos travaux constituent une première approche pour valider l’usage traditionnel de Vitex
madiensis et de Crossopteryx febrifuga pour la prise en charge de maladies inflammatoires.

Plusieurs perspectives thérapeutiques s’ouvrent pour l’utilisation de ces plantes dans le

cas d’une maladie inflammatoire.

L’extrait de fruits de V. madiensis contient des composés inconnus que nous n’avons
pas pu identifier en raison de la faible quantité du produit recueilli pour le premier, cet extrait
pourrait alors faire l’objet d’une étude approfondie afin d’identifier les composés inconnus et
de déterminer leurs propriétés biologiques.

Compte tenu de la variation saisonnière des profils phytochimiques observée pour

certains extraits de Crossopteryx febrifuga et leur impact sur les activités biologiques, il serait
important de concentrer les efforts sur le fractionnement, l’isolement et l’identification des
molécules bioactives présentes dans les extraits de cette plante et évaluer d’autres propriétés
biologiques comme les propriétés anticancéreuses.

Il serait intéressant d’orienter ces études vers la détermination des mécanismes d’action
moléculaires et cellulaires des composés actifs des extraits de chacune des plantes.

L’élaboration de médicaments traditionnels « améliorés » à partir de ces deux plantes

pourrait enrichir l’arsenal thérapeutique des tradithérapeutes et soulager une population aux
revenus modeste n’ayant pas accès aux médicaments vendus en pharmacie.

178
 PARTIE
EXPERIMENTALE

179
180
 I. Matériel et méthodes
I.1- Matériel végétal
Le matériel végétal est constitué des feuilles, des fruits, des écorces de tronc et des
écorces de racines des deux espèces sélectionnées : Vitex madiensis Oliv. et Crossopteryx
febrifuga (Afzel ex G. Don) BENTH collectées à Makana 1 à 25 km, au sud de Brazzaville. Les
différentes parties de chaque plante ont été collectées pendant la saison des pluies (octobre-mai)
et la saison sèche (juin-septembre).

Après les collectes des échantillons, un spécimen de chaque espèce végétale a été
authentifié et conservé à l’herbier de l’Institut National de Recherche en Sciences Exactes et
Naturelles (IRSEN) de Brazzaville sous le numéro T7041 pour Vitex madiensis Oliv. et B434
pour Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) BENTH.

La matière végétale a été séchée à l’ombre pendant 7 à 14 jours puis broyée à l’aide
d’un broyeur électrique. Un code a été affecté à chaque échantillon pour faciliter le traitement
des données (tableau 24).

Tableau 24. Codages des échantillons

Espèces Vitex madiensis Crossopteryx febrifuga

Feuilles VMFE1 VMFE2 CFFE1 CFFE2
Ecorces de tronc VMET1 VMET2 CFET1 CFET2
Ecorces de racines VMRA1 VMRA2 CFRA1 CFRA2
Fruits VMFR1 - CFFR1 CFFR2
1 : saison des pluies ; 2 : saison sèche

Vitex madiensis :

Feuilles Ecorces de tronc Ecorces de racine Fruits

181
 Crossopteryx febrifuga :

Feuilles Ecorces de tronc Ecorces de racine Fruits

I.2- Matériel animal

Le matériel animal constitué des leucocytes du sang humain (prélevé sur les
volontaires sains, n=3) a été fournis par l’Etablissement Français du Sang (EFS) de la ville de
Clermont-Ferrand d’après le contrat n°16-21-62 (conformément aux articles suivants L1222-1,
L1222-8, L1243-4 et R1243-61 du code de la santé publique). Les leucocytes ont été obtenus
par choc hémolytique à froid en utilisant le mélange constitué par une solution de chlorure
d’ammonium (NH4Cl, 155 µM), de bicarbonate de sodium (NaHCO3 12 µM) et de l’EDTA
(0,01 µM). Le mélange a ensuite été centrifugé pendant 10 minutes à 1300 tours par minute à
température ambiante. Le surnageant a été éliminé avec une pipette pasteur connectée à une
pompe. Le culot des leucocytes obtenus a été repris dans le RPMI (suspension à environ 106
cellules/mL) supplémenté avec le sérum fœtal bovin (FBS) 10 %, de la gentamicine 50 µg/mL
et la glutamine à 2 mM (Cholet et al., 2019).

I.3- Réactifs, solvants et produits chimiques

Le butanol normal a été acheté auprès de Carlo-Erba Reagents. Le cyclohexane, le

dichlorométhane, le méthanol et l’acétate d’éthyle ont été achetés auprès de VWR Chemicals.
L’acétate d’éthyle a été distillé avant utilisation. L’acétonitrile de qualité HPLC a été également
acheté auprès de VWR Chemicals. L’eau utilisée pour HPLC a été obtenue à partir d’un appareil
milli-Q.

Tous les étalons chimiques utilisés ont été achetés chez Extrasynthèse (Lyon, France),
Sigma-Aldrich (Allemagne) ou Carbosynthese (Royaume-Uni).

Tous les produits chimiques et réactifs ont été achetés chez Sigma-Aldrich
(Allemagne).

182
 I.4- Equipements

HPLC

Toutes les analyses HPLC ont été effectuées sur un appareil de type Agilent, série 1260
Infinity, muni d’un réservoir contenant une phase mobile, d’une pompe, d’un détecteur DAD
équipé d’une colonne Uptisphere C18-3 (250 x 4.6 mm, 5 µm) Iterchim (Montluçon, France).

HPLC-MS

Les analyses LC-MS ont été réalisées sur une chaîne UHPLC Ultimate 3000 RSLC et
Orbitrap Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific Inc., MA, Etats-Unis) avec la même colonne
Uptisphere que HPLC décrite précédemment.

HPLC-préparative

La chromatographie préparative a été réalisée avec une chaine Varian Prepestar modèle
SD-1 sur une colonne semi-préparative Uptisphere C18-3 (250 x 21,6 mm, 5 µm) Interchim,
avec un détecteur monochromateur.

Chromatographie flash

La chromatographie flash a été réalisée avec un appareil Flash SPOT Ultimate (Armen
Instrument, Saint-Avé, France) avec un détecteur monochromatique.

HPTLC

Les analyses HPTLC ont été effectuées à l’aide de plaques analytiques HPTLC en verre
de 0,20 mm de gel de silice 60 (20 x 10 cm) (Merck, Darmstadt, Allemagne). L’appareil
comprend un système CAMAG HPTLC (Muttenz, Suisse) équipé d’un échantillonneur
automatique de TLC (ATS4), d’une chambre de développement automatique (ADC2) avec
contrôle de l’humidité, d’un visualiseur TLC, du logiciel VisionCATS et pour la dérivatisation,
d’un dispositif d’immersion de plaques CID III et TLC plaque chauffante III.

Spectrophotomètre UV-visible et fluorescence

Les analyses UV-visible ont été réalisées sur un spectrophotomètre Jasco.

Les analyses en plaque 96 puits ont été réalisées sur un TECAN Infinity F200 PRO
(flurorescence) et Fluoroskan Ascent FL® apparatus (ThermoFisher Scientific, IIIkirch,
France).

183
 RMN

Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont été enregistrés sur un
spectromètre Avance 400 (Bruker) avec du méthanol deutéré comme solvant. Les déplacements
chimiques sont rapportés en ppm par rapport au signal résiduel de solvant (1H, 13
C). Les
constantes de couplages (J) sont données en Hertz (Hz). Les abréviations suivantes sont
utilisées : s (singulet), d (doublet), dd (doublet de doublet), td (triplet de doublet), dt (doublet
de triplet).

II. Méthodes

II.1- Protocole général d’obtention des extraits bruts

La matière végétale constituée soit des feuilles, soit des fruits, soit des écorces de tronc
ou des écorces de racines de chaque espèce a été macérée dans le méthanol pendant 24 heures.
A chaque fois, le mélange a ensuite été filtré sous vide à l’aide d’une pompe. L’extraction a été
répétée trois fois sur chaque lot de matière végétale. Les filtrats ont été mélangés et évaporés à
sec au moyen d’un évaporateur rotatif de marque Buchi. Les extraits séchés ont été conservés
à 4 ºC.

II.2- Extraction liquide-liquide avec des solvants organiques de polarité

croissante

Ce processus d’extraction a été réalisée par épuisements successifs sur les extraits
méthanoliques les plus actifs. L’extrait brut est repris dans de l’eau distillée et cette phase
aqueuse est extraite trois fois successivement avec chaque solvant organique de polarité
croissante suivant l’ordre cyclohexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle et le n-butanol. Le
ratio entre volume de phase aqueuse et solvant est de 4/1 (v/v). Les phases organiques sont
séparées de la phase aqueuse, séchées sur Na2SO4 sous pression réduite.

II.3- Dosage des polyphénols totaux

- Principe

La teneur en polyphénols totaux de chaque échantillon a été déterminée par

spectrophotométrie UV-Visible en suivant le protocole décrit par Singleton et al., (1965), Sapis
et al., (1968) avec quelques modifications. La méthode consiste à traiter les échantillons avec
le réactif de Folin–Ciocalteu qui est un mélange d’acides phosphomolybdique (H3PMo12O40) et
phosphotungistique (H3PW12O40). La méthode repose sur le transfert d’électron en milieu

184
alcalin qui se traduit par l’oxydation des phénols en oxydes bleus de tungstène et de molybdène.
Les absorbances sont mesurées par rapport à un blanc à l’aide d’un spectrophotomètre UV-
visible à 760 nm.

- Protocole
300 µL de chaque extrait préalablement dilué dans l’eau distillée (0,1 g d’extrait dissout
dans 100 mL d’eau distillée) sont introduits dans un tube à essai, auquel on ajoute 1200 µL
d’une solution de carbonate de sodium (Na2CO3) à 7,5 % puis on ajoute 1500 µL du réactif de
Folin-Ciocalteu dilué 10 fois. Le tube est agité et laissé pendant 2 h dans l’obscurité à
température ambiante et on mesure l’absorbance à 760 nm. La coloration bleue est
proportionnelle à la quantité des polyphénols totaux dans l’extrait. La teneur en polyphénols
totaux est exprimée en milligramme équivalent d’acide gallique par gramme de matière sèche
(mg EAG/g MS). La courbe d’étalonnage a été tracée à partir d’une gamme de concentrations
d’une solution d’acide gallique (0,1 ; 0,15 ; 0,2 et 0,25 mg/mL). Les échantillons et les témoins
ont été traités dans les mêmes conditions. L’expérience est répétée trois fois pour chaque
échantillon pour la répétabilité des résultats (moyenne ± SEM).

II.4 Dosage des flavonoïdes totaux

- Principe
Le dosage des flavonoïdes totaux a été réalisé selon le protocole décrit par (Zhuang et
al., 1992) avec quelques modifications. La méthode est basée sur la formation d’un complexe
brunâtre très stable qui traduit l’oxydation des flavonoïdes par le tétrachlorure d’aluminium. Ce
complexe absorbe à 510 nm. L’absorbance est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre UV
visible en comparaison d’un « blanc ».

- Protocole
Dans un tube à essai, on introduit 1 mL d’une solution de l’extrait cible préalablement
préparée (0,1 g d’extrait dissout dans 100 mL d’eau distillée). On ajoute 4 mL d’eau distillée,
puis on ajoute 300 µL d’une solution de NaNO2 à 5 %. Après 5 minutes, on ajoute 300 µL
d’une solution d’AlCl3 à 10 % sous agitation. Après 6 minutes, on ajoute 2 mL d’une solution
de NaOH à 1 N puis à nouveau 2,5 mL d’eau distillée. Le mélange est laissé dans l’obscurité
pendant 30 minutes. Les absorbances sont mesurées à 510 nm. Les résultats sont exprimés en
milligramme équivalent de quercétine par gramme de matière sèche (mg EQ/g MS).
L’expérience a été répétée trois fois pour chaque échantillon, les résultats sont présentés sous
forme de moyenne ± SEM. Pour déterminer la teneur en flavonoïdes totaux contenus dans les

185
extraits, une courbe d’étalonnage est élaborée à partir d’une solution de quercétine à des
concentrations de (0,1 ; 0,15 ; 0,175 ; 0,2 ;0,25 0,275 mg/mL). Les échantillons et les solutions
témoins ont été traités dans les mêmes conditions.

II.5- Méthodes chromatographiques

La combinaison de plusieurs méthodes chromatographiques a été utilisée pour

l’identification des profils phytochimiques des extraits et la purification des composés.

II.5-1- Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

Les analyses HPLC ont été réalisées pour identifier et quantifier les composés
présents dans les différents extraits. La phase mobile utilisée est un mélange d’eau et d’acide
formique à 0,1 % (v/v) et d’acétonitrile. Le gradient exprimé en pourcentage de phase mobile
(eau) est 100 % (0 minute), 80 % (10 minutes), 73 % (35 minutes), 0 % (40-50 minutes), 100
% (51-60 minutes). Le débit a été fixé à 0,800 mL/min et le volume de l’injection est de 10 µL.
La longueur d’onde de détection 254 nm.

II.5-2- Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

(LC-MS et MS2) en phase inverse

Le profil chimique des extraits bruts a été déterminé par chromatographie en phase
liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS et MS2) en utilisant la même méthode et
le meme type de colonne que pour la méthode HPLC. La détection est réalisée par un
spectromètre de masse en mode d’ionisation électrospray positif (ESI+) ou négatif (ESI-) (80-
1200 g/mol) (Fen et al., 1989). Les paramètres de la source sont les suivantes : 3 kV de tension
de spray, température du capillaire 320 °C, température du gaz auxiliaire 400 °C, gaz (azote)
d’enveloppe, de balayage et auxiliaire à un débit de 50, 10 et 2 unités arbitraires, respectivement
et une cellule de collision avec une énergie comprise entre 10 et 50 eV. Les données d’analyse
complète du spectre ont été obtenues avec une résolution de 70.000 tandis que celles de la MS2
ont été obtenues avec une résolution de 17500. L’analyse des spectres s’est faite à l’aide du
logiciel « Xcalibur, Thermo Fisher Scientific Inc., MA, Etats-Unis ». L’identification des
composés s’est faite selon leur temps de rétention et leur spectre de masse en utilisant les bases
de données du laboratoire et par comparaison avec les données de la littérature.

La préparation d’échantillon est la suivante : 5 mg de l’extrait méthanolique sont dilués dans 5

mL de méthanol de qualité HPLC. La solution est ensuite filtrée avec un filtre PTFE 0,45 µm.
Une partie du filtrat est placée dans un vial pour l’analyse.

186
 II.5-3- Chromatographie Flash

Certains des extraits ont été purifiés par chromatographie flash en phase inverse
(colonne C18 ec) préconditionnée avec des caractéristiques suivantes : chromabond flash
(Interchim) RS80 (Marcherey-Nagel, Hoerst, France), volume de la colonne 145 mL, Trepical
Flow rate : 30-65 mL/min ; pression maximale 15 bar/218 psi avec une capacité de 86 mg -1,72
g. La phase mobile est constituée par un mélange d’eau (phase A) et d’acétonitrile (phase B)
(v/v). La détection des composés a été réalisée à 254 nm.

II.5-4- HPLC préparative

L’HPLC préparative a été réalisée en utilisant une colonne Agilent prep C18 avec
comme éluant le mélange Eau/ACN (70/30), pendant 30 minutes. La fraction à purifier est
solubilisée dans l’eau milli-q puis injectée dans la vanne d’injection de l’appareil. Les fractions
sont collectées après réalisation de CCM.

II.5-5- HPLC préparative en mode isocratique

Les fractions ont été purifiées en HPLC préparative, mode isocratique avec la même
colonne utilisée précédemment et un éluant constitué du mélange Eau/ACN (80/20). L’éluant
est préparé après le dégazage sous vide des solvants afin d’éviter la formation de bulles dans la
pompe. La fraction à séparer est solubilisée dans l’éluant utilisé. Les fractions ont été collectées
au cours de l’analyse, celles qui présentaient le même profil CCM ont été mélangées.

III. Evaluation du potentiel antioxydant et anti-inflammatoire

III.1- L’activité antiradicalaire par le piégeage du radical DPPH par

spectrophotomètre UV-visible

Le potentiel antiradicalaire des extraits a été évalué au sein du laboratoire de chimie

des substances naturelles, à l’Institut de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles
(IRSEN), du ministère de la recherches scientifique du Congo.

- Principe
L’activité antiradicalaire in vitro a été évaluée par la méthode du piégeage du radical 2,2
diphényl -1-picrylhydrasyl (DPPH). Le protocole utilisé est celui décrit par Brand-Williams
et al., (1995) et Sanchez-Moreno (2002) avec quelques modifications.

187
 - Mode opératoire
Les solutions d’extraits et de la vitamine C de concentration 200, 600, 1000 et 1200
µg/mL ont été préparées dans le méthanol. La solution de DPPH 0,18 mM a été également
préparée dans le méthanol. 300 µL des solutions constituées soit des extraits ou de la vitamine
C prise comme référence, préparés dans les mêmes conditions ont été mélangé avec 3 mL d’une
solution de DPPH. Les absorbances sont immédiatement mesurées en cinétique pendant 45
minutes à 517 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Visible en comparaison à "un blanc"
constitué uniquement de méthanol. Les expériences ont été répétées trois fois puis la moyenne
a été calculée. Les paramètres du potentiel antioxydant suivant ont été déterminés :

- Pourcentage d’inhibition (% I)
% I = [(Abs contrôle – Abs Extrait) / Abs contrôle] x 100

- Concentration inhibitrice 50 (CI50)

La CI50 est la concentration de l’extrait ou de la molécule potentiellement antiradicalaire
nécessaire pour inhiber 50 % du radical libre DPPH. Elle est déterminée soit graphiquement,
soit par la formule suivante :

Concentration de l’extrait x 50
CI50 =
%I

Plus la valeur de la CI50 est faible, plus l’activité antiradicalaire est importante (Sahgal et al.,
2009).

III.2- Bioautographie HPTLC avec radical DPPH

- Procedure générale pour HPTLC

Les échantillons ont été préparés en dissolvant 1 mg de chaque extrait ou fraction dans
1 ml de méthanol. Pour les molécules isolées, une solution de 0,05 mg/mL a été préparée pour
chacune des molécules. 14 µL de chaque échantillon ont été appliqués sur des bandes de 8 mm,
à 8 mm du bord inférieur de la plaque. La phase mobile était un mélange d'acétate d'éthyle, de
dichlorométhane, d'acide formique, d'acide acétique et d'eau (100 : 25 : 10 :10 : 11). Les plaques
ont été développées sur une distance de 70 mm à partir du bord inférieur à l'aide d'une chambre
en verre à double auge saturée pendant 20 min avec une phase mobile sous humidité contrôlée

188
(HR : 33 %). Après développement, les plaques ont été séchées sous un courant d'air froid
pendant 10 min.

- Bioautographie HPTLC avec radical DPPH

Le test d’inhibition du radical DPPH par HPTLC a été réalisé sur les extraits bruts, les
fractions et les molécules isolées.

Après migration et développement, la plaque a ensuite été plongée dans une solution de
DPPH (0,6 mM) pendant 5 secondes, et maintenue pendant 2 minutes à l'obscurité. Après avoir
pris une photo sous lumière blanche, la plaque a été chauffée pendant 2 minutes à 110 °C et une
nouvelle photo a été prise dans le même état. Les composés antioxydants apparaissent sous la
forme d'une tache jaune sur un fond violet.

III.3- Potentiel antioxydant et anti-inflammatoire par la méthode

intracellulaire de production des espèces réactives de l’oxygène (ROS).

L’activité a été réalisée au sein du laboratoire de l’UFR de Pharmacie, Université

Clermont Auvergne, Unité de Nutrition Humaine (UNH), équipe ECREiN.

III.3.1- Cinétique de la production de ROS induits par les leucocytes du

sang stimulés par le PMA

- Préparation des solutions des différents extraits et molécules isolées

Une solution mère de 10 mg/mL de chaque extrait a été préparée par dilution dans du
DMSO avec le milieu de culture complet (MCC) dans un tube Eppendorf de 2 mL. Des dilutions
sérielles de la solution mère ont été préparées dans le DMSO et le milieu de culture complet
pour faire une gamme de quatre concentrations de 10, 25, 50 et 100 µg/ mL et homogénéisées
au vortex. Ces concentrations ont été préparées à trois reprises pour réaliser trois ou quatre
répétitions intra-tests sur l’inhibition de la production de ROS induits par les leucocytes du sang
humain et l’effet des extraits sur la viabilité cellulaire.

Pour les molécules isolées, une solution mère de chacune des molécules purifiées à 50
mM a été préparée par dilution dans du DMSO, aliquotée puis congelée à -20 °C. Lors de
chaque utilisation, un aliquot est décongelé puis dilué dans du milieu de culture complet afin
d’obtenir une solution intermédiaire à 10 mM. On réalise alors les dilutions à 1, 5, 10 et 25 µM
dans du MCC.

189
 - Protocole expérimental
Les leucocytes extraits du sang humain sont placés dans chaque puits de la plaque
polystyrène 96 puits. 200 µL d’une suspension de leucocytes sanguins est déposé par puits, on
ajoute 20 µL des différentes concentrations d’extraits (10 à 100 µg/ mL) dans chacun des puits,
10 µL de la rhodamine 123 qui s’oxyde en dihydrorhodamine 123 (DHR 123, 1 µM) pour
produire les ROS et enfin 10 µL d’acétate de phorbol 12-myristate (PMA, 1 µM) qui stimule la
protéine kinase C. La plaque est constituée d’une rangée de puits témoins négatifs ne contenant
ni cellules ni extraits ; d’une rangée des puits témoins positifs contenant des cellules seules (200
µL) plus du PMA, et des rangées des puits contenant des cellules, des différentes concentrations
d’extraits et du PMA comme présenté sur la figure 88. Cette mesure est réalisée à 37 °C toutes
les 5 minutes pendant 2 heures.

Les résultats sont exprimés en unités de fluorescence relative (RFU). Les résultats pour
chaque extrait sont exprimés en pourcentage moyen (± écart-type moyen) par rapport au témoin
fixé à 100 % (le témoin étant les cellules seules stimulées par le PMA).

Figure 88. Photo de la plaque 96 puits pour le suivi de la cinétique de production de ROS

La lecture de fluorescence est réalisée (excitation/émission : 485/535 nm) à l’aide d’un

Fluoroskan. Ces expériences ont été répétées trois ou quatre fois puis le pourcentage de
production des ROS induits par les leucocytes sanguins en présence des extraits est calculé par
la formule ci-dessous. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne.

190
 Fluo extrait X 100
% Production de ROS =
Fluo témoin
positif

III.3.2- Evaluation de l’activité cytotoxique des extraits

La viabilité cellulaire après exposition aux extraits testés est déterminée en utilisant
le test de fluorescence à la résazurine.

Les cellules des mêmes donneurs ont été placées dans des plaques 96 puits suivant
le même protocole que celui du test de production des ROS mais cette fois-ci en absence du
DHR 123. Après une incubation de la plaque pendant 24 heures à 37 °C, on ajoute 20 µL de la
résazurine (25 µg/ mL) dans chaque puits. La plaque est de nouveau incubée pendant 2 heures
(figure 89), et on observe la viabilité cellulaire et la cytotoxicité des différents extraits par
lecture de la fluorescence (excitation/ émission : 530/ 590 nm) à l’aide d’un Fluoroskan Ascent.
On calcule le pourcentage de la viabilité cellulaire.

Figure 89. Photo de la plaque 96 puits pour le suivi de la viabilité cellulaire avec la
résazurine

Le pourcentage de la viabilité cellulaire est calculé suivant la formule ci-dessous.

Les résultats sont présentés sous forme de moyenne.

191
 Fluo Extrait - Fluo témoin négatif
% Viabilité = X 100
Fluo témoin positif - Fluo témoin
négatif

Les résultats obtenus pour chaque concentration d’extraits et des molécules sont exprimés en
pourcentage moyen (± écart-type moyen) par rapport au témoin ramené à 100% (le témoin étant
les cellules seules stimulées par le PMA).

III.3.3- Analyse statistique

Un traitement statistique a été effectué pour chaque essai. Les résultats ont été
exprimés sous forme moyenne ± SEM. Une analyse de la variance (ANOVA) est réalisée par
comparaison au témoin selon la méthode de Dunnett. Selon l’intervalle de confiance à 95 %
choisi, un résultat sera significatif lorsque * P ≤ 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.

III. 3.4- Evaluation du potentiel anti-inflammatoire

L’activité anti-inflammatoire a été réalisée sur la 20-hydroxyecdysone isolée dans

l’extrait de feuilles récoltées pendant la saison des pluies. L’effet de cette molécule à une
concentration de 1 µM est étudié sur l’inflammation à travers son impact sur l’expression de
l’enzyme COX-2 par les leucocytes totaux stimulés cette fois-ci par le LPS pendant 4 h.

Protocole expérimental

Les leucocytes sont isolés comme précédemment décrit. Les cellules sont alors incubées
en présence ou non de 20-hydroxyecdysone, avec ou sans agent stimulant (PMA ou LPS) dans
une plaque 96 puits. Après 4 h d’incubation dans l’étuve (37 °C, CO2 5 %), les surnageants sont
récupérés et les plaques congelées pour réaliser la qPCR. Ce procédé permet de mesurer la
quantité d’acides ribonucléiques messagers produits à partir de certains gènes dans les cellules
étudiées. Les surnageants sont centrifugés à 1000 g durant 8 min. Le culot cellulaire est mis en
présence de 50 µL de thiocyanate de guanidium (Life Technologies) à -80 °C.
Afin de récupérer les acides nucléiques restant dans les cellules adhérentes au fond des
puits, on ajoute 150 µL de thiocyanate de guanidium.

On sépare alors les acides ribonucléiques (ARN) des cellules en ajoutant du chloroforme
(0,2 mL pour 1 mL de trizol, Acros Organics) dans le lysat décongelé puis en centrifugeant afin
de récupérer la phase aqueuse. Du glycogène et de l’isopropanol (0,5 mL pour 1 mL de trizol)
sont ajoutés afin de faire précipiter les ARN. Ils sont lavés à l’éthanol 70 % (1 mL pour 1 mL
de thiocyanate de guanidium, Cristalco). Ensuite, les tubes sont centrifugés et l’éthanol est retiré

192
en totalité. Finalement, les ARN sont dissous dans de l’eau traitée au diéthyl pyrocarbonate
(eau DEPC). Le dosage des ARN messagers est ensuite effectué à trois lectures d’absorbance à
230, 260 et 280 nm. La pureté de l’échantillon obtenu peut être évaluée à l’aide du calcul des
260 𝑛𝑚 260 𝑛𝑚
ratios d’absorbance et 230 𝑛𝑚.
280 𝑛𝑚

Un traitement à la désoxyribonucléase est alors réalisé afin d’éliminer l’acide

désoxyribonucléique (ADN) génomique des échantillons. On ajoute 1 µL de
désoxyribonucléase et le même volume de tampon pour l’enzyme dans 8 µL de solution
contenant les ARN. Cette étape est suivie d’une incubation à température ambiante durant 15
min puis d’un ajout d’1 µL d’EDTA. La solution contenant les ARN est chauffée à 65 °C
pendant 10 min puis congelée à -80 °C avant de réaliser une rétrotranscription.

Pour réaliser la rétrotranscription des ARN dans les 11 µL de solution, on ajoute

2 µL de tampon, 0,8 µL de mix de désoxynucléotides triphosphates, 2 µL d’amorces
quelconques, 1 µL de transcriptase inverse et 4,2 µL d’eau DEPC. Le programme de
rétrotranscription est précédé d’une brève centrifugation.

Enfin, la PCR quantitative (qPCR) sur la séquence nucléotidique codant pour la

transcription des enzymes est effectuée. Dans chaque puits seront ajoutés 18 µL de mix pour la
PCR avec 2 µL d’échantillon d’ARN. Pour 18 µL de mix, sont mélangés 10 µL de Master Mix
SYBERGreen, 0,7 µL d’amorces sens et 0,7 µL d’amorces antisens et 6,6 µL d’eau DEPC. Des
amorces de la séquence codant pour chaque enzyme sont utilisées pour notre analyse dont les
résultats sont exprimés par rapport à la quantité d’ARN codant pour la glycéraldéhyde-3-
phosphate déshydrogénase (GAPDH) (gène de ménage). Il est donc nécessaire d’étudier
l’expression de cette seconde enzyme afin de disposer d’une référence. Lors de cette étape une
augmentation de la fluorescence est associée à la hausse de quantité de SYBR Green se fixant
à l’ADN double brin naissant. Plus la fluorescence est élevée, plus le nombre de molécules
d'ADN synthétisées est grand, et donc plus l’expression du gène d’intérêt est forte.

Les résultats obtenus pour l’échantillon provenant de cellules stimulées et exposées

à la 20-hydroxyecdysone sont exprimés en pourcentage moyen (± écart-type) par rapport au
témoin ramené à 100 % (le témoin étant l’échantillon provenant de cellules seules stimulées).
L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test de Student (vs Témoin) dont le seuil de
l’intervalle de confiance a été fixé à 95 %, soit un résultat significatif lorsque p < 0,05.

193
 IV. Analyse quantitative et dosage par HPLC et HPTLC de la 20-
hydroxyecdysone dans les extraits bruts de Vitex madiensis

Le but de ces analyses est de déterminer la quantité de 20-hydroxyecdysone présente

dans les différents extraits bruts de V. madiensis.

IV.1- Analyse quantitative par HPLC

IV.1.1- Préparation et injection de solutions étalons

Cette préparation permet de tracer une courbe d’étalonnage en prenant la 20-

hydroxyecdysone comme standard.

Le standard utilisé est la 20-hydroxyecdysone purifiée et isolée à partir de la fraction

butanolique des feuilles de V. madiensis récoltées pendant la saison des pluies. Une solution
mère de 1 mg/mL a été préparée à partir de 5 mg du standard (20-hydroxyecdysone) dissout
dans 5 mL de méthanol et agitée à l’aide d’une cuve ultrason pendant quelques minutes. Les
dilutions ont été réalisées à partir de cette solution mère. Une gamme de concentrations de 0,05 ;
0,1 ; 0,2 et 0,3 mg/mL a été préparée et 10 µL de chaque étalon ont injectés dans l’appareil
HPLC pour l’analyse.

IV.1.2- Préparation et injection des différents extraits

1 mg de chaque extrait est solubilisé dans 1 mL de MeOH et placé dans une cuve
ultrason. Les échantillons ont été filtrés (0,45 µm) et introduits dans les vials HPLC (Gainche
et al., 2021 ; Merck, 2018).

IV.1.3- Condition opératoire

Le volume d’injection est de 10 µL. A la fin de l’analyse, les données

chromatographiques HPLC de chaque étalon sont recueillies sous forme d’un tableau contenant
le numéro du pic, son temps de rétention et son aire. L’aire du pic est mesurée par intégration
du signal du pic. Ces aires correspondent aux différents étalons et le pic du composé à doser
pour chaque extrait. On trace la courbe d’étalonnage par la représentation des différentes aires
des pics des étalons en ordonnées (Y) en fonction des concentrations injectées en abscisse (X,
mg/mL). La droite a été tracée sur une feuilles Excel.

La teneur de la 20-hydroxyecdysone dans chaque extrait a été calculée en utilisant

l’équation de la droite de régression linéaire obtenue.

194
 IV.2- Analyse quantitative par HPTLC

IV.2.1- Préparation et injection de solutions étalons

La solution étalon concentrée à 0,3 mg/mL de 20-hydroxyecdysone, préparée pour

le dosage quantitatif par HPLC est utilisée pour diluer 1 mL de cette solution dans 5 mL de
méthanol afin de donner une solution de 0,06 mg/mL. Cette solution a été utilisée comme
référence (solution standard). Les volumes allant de 2, 4, 6, 8, 10,12 et 14 µL de cette solution
standard ont été déposés sur des bandes de 8 mm à 8 mm du bord inferieur de la plaque HPTLC
pour obtenir la concentration finale de 200 à 1400 ng/spot.

IV.2.2- Préparation des extraits

Les échantillons ont été préparés suivant le protocole général décrit précédemment.
2 µL de chaque solution d’extraits ont été déposés sur le bord inferieur de la plaque.

IV.2.2.1- Condition opératoire

Sur la plaque, nous avons déposé sept étalons de la solution de référence (stantard)
et six dépôts des différents extraits bruts. La plaque a été développée et éluée dans la même
phase mobile suivant le protocole général décrit précédemment. La numérisation des profils
densitométriques de la plaque a été effectuée à l’aide d’un scanner 3 à la lumière blanche, à 254
et 366 nm à l’aide du logiciel VisionCATS.

A la fin de l’analyse, les chromatogrammes ont été générés, les aires des pics du
standard ont été mesurées ainsi que celles des différents extraits bruts.

La courbe de régression linéaire de la 20-hydroxyecdysone a été tracée par rapport

aux concentrations correspondantes en fonction des aires des pics (ThiKieu, 2016). L’équation
de la droite de régression ainsi que le coefficient de corrélation ont été déterminés et la
concentration en 20-hydroxyecdysone dans chaque extrait a été calculée automatiquement.

V. Etude des extraits

V.1-Etude des extraits de Vitex madiensis Oliv.

V.1-1- Extraits des feuilles récoltés à la saison des pluies (VMFE1)

400 g des feuilles séchées et broyées récoltées en saison des pluies ont été extraites
selon la procédure standard d’obtention des extraits bruts pour obtenir 35,6 g d’extrait brut
VMFE1.

195
 V.1.1.1- Extraction liquide-liquide (solvants organiques de polarité croissante)

11 g de l’extrait brut VMFE1 sont engagés dans une partition liquide-liquide selon le
protocole général décrit précédemment. Les masses obtenues pour chaque fraction sont
précisées dans la figure 36.

Figure 36: Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante de VMFE1

A l’issu des résultats des différentes activités biologiques réalisées, la fraction E4-
BuOH a été soumise à un fractionnement par différentes méthodes chromatographiques afin
d’en séparer et isoler les molécules d’intérêt.

V.1.1.2- Fractionnement et purification de la fraction E4-BuOH

La purification sur colonne de la fraction E4-BuOH a été réalisée par chromatographie

flash en phase inverse avec une colonne C18, selon le protocole expérimental suivant :

300 mg de F4-BuOH sont solubilisés dans 5 mL du méthanol. 500 mg de silice polygoprep 60-
50 C18 sont ajoutées puis le solvant est évaporé. Le mélange est alors déposé sous forme solide

196
dans la précolonne puis élué par la phase mobile. Celle-ci est constituée par un mélange d’eau
(phase A) et d’acétonitrile (phase B) (v/v) suivant le gradient 100/0 (0 à 15 min) ; 70/30 (15 à
40 min) et 0/100 (40 à 55 min). La détection des composés a été réalisée à 254 nm. Après
élution, les fractions ont été collectées puis rassemblées après l’analyse des plaques CCM.

A l’issu de cette séparation, 8 fractions ont été collectées après un suivi par CCM (figure
44).

L’analyse des chromatogrammes (LC-MS) et des spectres RMN (1H, 13C) des fractions
issues de la première purification a permis d’isoler puis d’identifier dans la fraction F3 (figure
45) la 20-hydroxyecdysone (42 mg ; tr = 19,12 min, HRM-ESI [M+H]+ C27H44O7, m/z calculée
481,3159 pour m/z expérimentale 481,3152).

Les autres fractions contenant des mélanges des composés ont été rassemblées en une
fraction E4-BuOHP1 qui a été par la suite soumise à une séparation par chromatographie flash
dans les mêmes conditions. A l’issu de cette deuxième purification, 9 fractions ont été
collectées. La fraction F’9 a permis d’isoler et d’identifier l’ajugastérone C (21 mg ; tr = 32,75
min, HRM-ESI [M+H]+ C27H44O7, m/z calculée 481,3159 pour m/z expérimentale 481,3152).

Les autres fractions contenant un mélange des produits ont été rassemblées en une seule
fraction E4-BuOHP2. Elle a été soumise à une nouvelle séparation par chromatographie flash
suivant les mêmes conditions opératoires précédemment utilisées. 9 nouvelles fractions ont
ainsi été collectées. Les fractions F’’4 et F’’9 ont permis de nouveau d’isoler et d’identifier
respectivement le 20-hydroxyecdysone et l’ajugastérone C.

197
 Fraction butanolique (E4-BuOH)
300 mg

Première purification
F1 F2 F4 F5 F6 F7 F8 F3
75 mg 35 mg 20 mg 31 mg 7 mg 5 mg 9 mg 20-
hydroxyec
dysone
42 mg

Fraction butanolique

Deuxième purification
E4-BuOHP1 (182 mg)

F’1 F’2 F’3 F’4 F’5 F’6 F’7 F’8 F9

33,2 mg 35 mg 11 mg 2,4 mg 23 mg 7 mg 5,6 mg 2,2 mg ajugastérone
C
21 mg

Fraction butanolique E4-BuOHP2

(119,3 mg)

Troisième purification
F’’4
F’’1 F’’2 F’’3 20- F’’5 F’’6 F’’7 F’’8 F’’9
7,8 mg hydroxyecd
12 mg 11 mg ysone 16 mg 18 mg 13 mg 11 mg Ajugastérone
14 mg C
7 mg

Prep1

Figure 44. schema de separation et purification des composés de E4-BuOH

En raison de la complexité du mélange de constituants qu’elles possèdent et de la

difficulté à isoler et à identifier la majorité des composés, les fractions issues de la troisième
purification ont été mélangées Prep1 (88,7 mg) et engagées dans une séparation par HPLC-
préparative en mode isocratique.

- Purification du mélange Prep1 (88,7 mg) par HPLC-préparative

Le mélange Prep1 (88,7 mg) a été chromatographié en HPLC préparative en mode
isocratique avec une colonne C18 et un éluant composé d’un mélange eau/ acétonitrile suivant

198
la proportion 80/20. Le débit de la phase mobile a été fixé à 17 mL/min, la pression moyenne a
été de 137 bars et la détection des composés a été réalisée à 254 nm.

Tableau 25. Phase mobile d’élution pour la purification par HPLC Prep.
Temps (min) H2O /ACN (%)
0 80/20
15 80/20
20 80/20
40 80/20

4 fractions ont été collectées et analysées par LC-MS et par la RMN (1H et 13
C;
méthanol deutéré comme solvant) comme illustré sur la figure 45.

Prep1 (88,7 mg)

PrepF1 PrepF2 PrepF3 PrepF4

1,8 mg 5,3 mg 1,9 mg 3,1 mg
vitexirone pterostérone

Figure 45: schéma de purification par HPLC-préparative en mode isocratique

L’analyse des résultats des spectres de masse et RMN (1H et 13C) a permis d’identifier
la vitexirone dans la fraction PrepF2 (tr = 26,77 mn, HRM-ESI [M+H]+ C27H42O7, m/z calculée
479,30033 pour m/z expérimentale 479,2998) et la pterostérone dans la fraction PrepF4 (tr =
27,82 min, HRM-ESI [M+H]+ C27H44O7, m/z calculée 481,3159 pour m/z expérimentale
481,3152).

199
V-1-2. Description des composés isolés

Tableau 26. Données RMN (MeOD, 400 MHz) de la 20-hydroxyecdysone

δC (ppm) APT δH (ppm) Multiplicité J (Hz)

1 37,5 CH2 1,78 m

1,43 m

2 68,8 CH 3,83 dt (11,7 ; 3,7)

3 68,6 CH 3,96 m

4 32,8 CH2 1,72 m

1,69 m

5 51,7 CH 2,38 dd (12,7 ; 4,5)

6 206,5 Cq - -

7 122,1 CH 5,81 d (2,4)

8 168,2 Cq - -

9 35,0 CH 3,16 t (8,5)

200
10 39,2 Cq - -

11 21,7 CH2 1,81 m

1,70 m

12 32,5 CH2 2,14 td (13,3 ; 4,5)

1,88 m

13 48,7 Cq - -

14 48,7 Cq - -

15 31,8 CH2 1,96 m

1,60 m

16 21,4 CH2 1,98 m

1,72 m

17 50,5 CH 2,39 dd (8,2 ; 4,6)

18 18,0 CH3 0,89 s

19 24,3 CH3 0,96 s

20 77,8 Cq - -

21 21,1 CH3 1,20 s

22 78,4 CH 3,33 m

23 27,3 CH2 1,65 m

1,28 m

24 41,9 CH2 1,79 m

1,42 m

25 71,3 Cq - -

26 28,9 CH3 1,18 s

27 29,7 CH3 1,19 s

201
 Tableau 27. Données RMN (MeOD, 400 MHz) de l’ajugastérone C

δC (ppm) APT δH (ppm) Multiplicité J (Hz)

1 39,0 CH2 2,59 dd (12,8 ; 4,1)

1,38 t (12,8)

2 68,9 CH 4,02 dt (11,8 ; 4,1)

3 68,6 CH 3,96 m

4 33,3 CH2 1,79 m

1,68 m

5 52,6 CH 2,34 dd (12,8 ; 4,1)

6 206,7 Cq - -

7 122,7 CH 5,79 d (2,4)

8 165,7 Cq - -

9 42,8 CH 3,15 dd (8,9 ; 2,4)

10 39,8 Cq - -

202
11 69,4 CH 4,09 m

12 43,7 CH2 2,21 m

2,17 m

13 48,7 Cq - -

14 84,8 Cq - -

15 31,8 CH2 1,97 m

1,59 m

16 21,4 CH2 1,71 m

1,99 m

17 50,2 CH 2,41 m

18 18,8 CH3 0,87 s

19 24,7 CH3 1,05 s

20 77,7 Cq -

21 20,7 CH3 1,19 s

22 77,8 CH 3,34 m

23 30,4 CH2 1,57 m

1,22 m

24 37,7 CH2 1,47 m

1,23 m

25 29,2 CH 1,58 m

26 22,6 CH3 0,91 d (6,4)

27 23,5 CH3 0,92 d (6,4)

203
 Tableau 28. Données RMN (MeOD, 400 MHz) de la vitexirone

δc (ppm) DEPT δH Multiplicité J (Hz) COSY HMBC

(ppm)
1 38,8 CH2 2,60 dd (12,5 ; 4,1)
1,76 m
2 68,7 CH 4,00 dt (11,8 ; 4,0) H1 /H3
3 66,2 CH 3,95 m H2 /H4
4 33,0 CH2 1,71 m
1,65 m
5 52,2 CH 2,34 dd (13,1 ; 3,5) H4 /H7
6 206,2 Cq - - H5 /H9 /H4
7 122,4 CH 5,80 d (2,6) H5 / H7
8 165,4 Cq - H9 /H12
9 42,6 CH 3,15 dd (8,8 ; 2,6) H11 / H7
10 39,5 Cq - - H1 /H5 /H9 /H1/ H19
11 69,2 CH 4,10 m H9 / H12
12 43,5 CH2 2,26 m
2,16 m

204
13 48,1 Cq - - H12 / H15 / H18
14 84,3 Cq - - H7 /H12 /H15 /H18
15 31,4 CH2 2,32 m
1,58 m
16 21,3 CH2 1,97 m
1,77 m
17 50,3 CH 2,46 m H16
18 18,6 CH3 0,86 s
19 24,3 CH3 1,06 s
20 77,2 Cq - - H18 /H21 /H22 /H25
21 20,7 CH3 1,21 s
22 77,7 CH 3,35 dd (10,0 ;2,5) H23
23 31,6 CH2 2,28 m
1,97 m
24 122,9 CH 5,26 t (6,8) H23
/H27
25 133,2 Cq - - H23 /H26 /H27
26 25,7 CH3 1,71 s
27 17,8 CH3 1,65 s

205
 Tableau 29. Données RMN (MeOD, 400 MHz) de la pterostérone

δC DEPT δH Type, J COSY HMBC

(ppm) (ppm) (Hz)

1 35,0 CH2 1,25 m H2 H2/H10/H19

1,54 m

2 68,0 CH 3,58 m H1/H3

3 67,8 CH 3,81 m H2/H4

4 31,0 CH2 1,46 m H3/H5

1,79 m

5 48,9 CH 2,32 m H4 H6

6 205,3 Cq - -

7 121,4 CH 5,80 d (2,2) H9 H5/H9/H14

8 167,6 Cq - -

206
9 31,7 CH 3,13 m H11 H7

10 49,5 Cq - -

11 38,5 CH2 1,62 m H9/H12

1,54 m

12 40,1 CH2 1,70 m H11

1,99 m

13 40,0 Cq - -

14 84,4 Cq - -

15 33,3 CH2 1,42 m

1,56 m

16 23,6 CH2 1,66 m

1,88 m

17 48,0 CH 2,32 m H17 H13/H15/H16/H18

18 17,3 CH3 1,21 s H12/H14/H17

19 20,8 CH3 1,34 s H5/H9/H10

20 76,8 Cq - -

21 18,6 CH3 1,05 s H21/H20

22 76,7 CH 3,61 m H23 H17/H20

23 36,6 CH2 1,25 m H22/H24

1,58 m

24 77,0 CH 1,26 m H23

25 51,4 CH 1,60 m H26/H27

26 16,2 CH3 0,89 d (6,5) H25 H24/H26/H27

27 20,2 CH3 0,96 d (6,5) H26 H24/H25/H26

207
 V.1-2. Extraits de feuilles récoltées à la saison sèche (MVFE2)

200 g des feuilles séchées et broyées récoltées en saison sèche ont été extraites selon la
procédure standard d’obtention des extraits bruts pour obtenir 17,5 g d’extrait brut VMFE2.

IV.2- Extraits des écorces du tronc (VMET1 et VMET2)

IV.2-1- Extraits des écorces du tronc récoltées à la saison des pluies (VMET1)

Les écorces du tronc de Vitex madiensis séchées et broyées (600 g) récoltés en saison
de pluies ont été extraites pour obtenir 13,0 g d’extrait brut VMET1.

- Extraction liquide-liquide (solvant de polarité croissante)

11g de l’extrait brut méthanolique (VMET1) a été extrait avec des solvants organiques de
polarité croissante suivant le même protocole décrit précédemment (figure 53).

Extrait VMET1 : 11,00 g

440 mL H2O +3 x 110 mL cyclohexane

E1-cyclo
0,42 g H2O

E2-DCM 2,973gx 110 mL CH2Cl2

0,50 g
H2O
3 x 110 mL AcOEt
E3-AcOEt 2,97 g
2,40 g H2O
3 x 110 mL BuOH
E4-BuOH 2,97 g
3,51 g E5-H2O résiduelle
2,27 g

Figure 53: Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante de VMET1

IV.2-2- Extraits des écorces du tronc récoltées à la saison sèche (VMET2)

200 g des écorces du tronc de Vitex madiensis séchées et broyées, récoltées en saison de
pluies ont été extraites pour obtenir 5,0 g d’extrait brut VMET2.

208
 IV.3- Extraits des écorces des racines (VMRA1 et VMRA2)

IV.3-1- Extraits des écorces des racines récoltées à la saison des pluies (VMRA1)

115 g des écorces de racine récoltées en saison de pluies et broyées ont été extraites
suivant le protocole général pour obtenir 6,8 g d’extrait brut VMRA1.

IV.3-2- Extraits des écorces des racines récoltées à la saison sèche (VMRA2)

200 g des écorces de racine récoltées en saison sèche et broyées ont été extraites suivant
le protocole général pour obtenir 17,5 g d’extrait brut VMRA2.

IV.4- Extraits des fruits (VMFR1)

Les fruits de Vitex madiensis séchés et broyés (300 g) ont été extraits suivant le protocole
général. 13,3 g d’extrait brut VMFR1 ont été obtenus.

VI.4-1- Extraction liquide-liquide (solvant de polarité croissante)

10 g d’extrait brut méthanolique de VMFR1 a été extrait avec des solvants organiques de
polarité croissante suivent le protocole décrit précédemment, les masses de chaque fraction
obtenue sont présentées da la figure 61. Le but de cette extraction est de faire une séparation
grossière des molécules par polarité pour pouvoir identifier la fraction contenant le composé
inconnu présent dans le profil LC-MS de l’extrait but (tr = 32,85 min), l’isoler et l’identifier.
Pour cette extraction, nous nous sommes arrêtés au niveau de l’extraction à l’acétate d’éthyle
car en analysant les premières fractions obtenues par HPLC, le pic du composé cible apparait
dans la fraction E3-AcOEt. Les fractions obtenues ne feront pas l’objet des études approfondies.

Extrait VMFR1 : 10,00 g

400 mL H2O +3 x100 mL cyclohexane

E1-cyclo H2O

2,97 3g x 100 mL CH2Cl2

E2-DCM

H2O
E3-AcOEt
2,12 g 2,97 g3 x 100 mL AcOEt

H2O résiduelle

209
Figure 61 : Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante 2,97 g
de VMFR1
 - Fractionnement et purification de la fraction (E3-AcOEt)
La purification sur colonne de la fraction E3-AcOEt a été réalisée par chromatographie
flash en phase inverse (chromabond flash, Interchim RS40C18, Macherey-Nagel, GmbH,
Allemagne). Volume de la colonne 71 mL, débit : 20-45 mL/min ; pression maximale 21
bar/305 psi avec une capacité de 55 mg-860 mg).

La procédure suivante a été utilisée : 400 mg de l’extrait E3-AcOEt sont solubilisés dans 5 mL
de méthanol. 2 g de polygoprep 60-50 C18 ont été ajoutés puis le solvant est évaporé. Le
mélange est alors déposé sous forme solide dans la précolonne puis élué par la phase mobile
constituée par un mélange d’eau (phase A) et d’acétonitrile (phase B) (v/v) suivant le gradient
90/10 (0 à 15 minin) ; 80/20 (15 à 35 min) ; 70/30 (35 à 45 min) et 50/50 (45 à 60 min). La
détection des composés a été réalisée à 254 nm. A l’issu de ce fractionnement, 4 fractions ont
été collectées après un suivi par CCM (phase C18) avec l’éluant eau/acétonitrile (70/30) comme
indiqué sur la figure 62.

E3-AcOEt (400 mg)

F1 F2 F3 F4
4,2 mg 3,2 mg 4,0 mg 1,3 mg

Figure 62: schéma de purification par chromatographie flash de la fraction E3-AcOEt

La fraction F1 semble contenir le composé cible. L’analyse des spectres RMN est en cours.

210
 IV.2- Etude des extraits de Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) BENTH

IV.2-1- Extraits des fruits (CFFR1 et CFFR2)

IV.2-1-1- Extrait des fruits récoltés à la saison des pluies (CFFR1)

112 g de fruits de Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) BENTH récoltés en

saison de pluies broyés sont extraits suivant le protocole général pour obtenir 3,8 g d’extrait
brut CFFR1.

IV.2-1-2- Extraction liquide-liquide (solvants de polarité croissante)

L’extrait brut de l’échantillon récolté en saison des pluies (CFFR1) est fractionné par
extraction liquide-liquide avec les solvants de polarité croissante selon la figure 78.

Extrait CFFR1 : 3,00 g

120 mL H2O + 3 x 30 mL cyclohexane

E1-cyclo
0,67 g H2O

E2-DCM 2,97 g 3x 30 mL CH2Cl2

0,39 g
H2O
E3-AcOEt 3 x 30 mL AcOEt
0,11 g 2,97 g
H2O

E4-BuOH 3 x 30 mL BuOH
2,97 g
0,28 g
E5-H2O résiduelle
0,71 g

Figure 78 : Schéma d’extraction par solvants de polarité croissante des fruits de

Crossopteryx febrifuga (CFFR1)

211
 IV.2-1-2- Extrait des fruits récoltés à la saison sèche (CFFR2)

250 g de fruits de Crossopteryx febrifuga récoltés en saison sèche broyés sont extraits
suivant le protocole général pour obtenir 10,1 g d’extrait brut CFFR2.

IV.2-2- Extrait de feuilles (CFFE1 et CFFE2), écorces du tronc (CFET1 et

CFET2) et écorces des racines (CFRA1 et CFRA2)

200 g de la matière végétale constitués soit des feuilles, des écorces du tronc ou des
écorces des racines récoltées en saison des pluies (ou en saison sèche) ont été mis en macération
dans le méthanol suivant le protocole décrit précédemment pour obtenir les extraits bruts
CFFE1(29,7 g), CFFE2 (31,3 g), CFET1 (21,7 g), CFET2 (14,0 g), CFRA1 (28,0 g) et CFRA2
(22,6 g). Ces extraits ne feront pas l’objet d’une étude approfondie.

212
REFERENCES

213
214
Adeola S.O., Yahaya T.A., Hafsatou B., Chinwe N.A., Ezeonu M.C., Igwe S., Ndukuba M.A.
(2011). Effet gastro-protecteur de Crossopteryx febrifuga chez le rat Wistar. Journal africain
des médecines traditionnelles complémentaires et alternatives, 8(3).

Adjanohoun E., Ahyi M.R.A., Ake Assi L., Baniakina J., Chibon P., Cusset G., Doulou V.,
Enzanza A., Eymé J., Goudoté E., Keita A., Mbemba C., Mollet J., Moutsamboté J.-M., Mpati
J., Sita P. (1988). Contribution aux études ethnobotaniques et floristiques en Republique
populaire du Congo. Agence de coopération culturelle et technique, (A,C.C.T.), Paris, 605 p

Adjanohoun E., Ahyi M.R.A., Floret J.J., Guinko S., Koumaré M., Raynal J. (1981).
Contribution aux études ethnobotaniques et floristiques au Mali. Agence de coopération
culturelle et technique (A.C.C.T.), Paris, 291 p.

Adjei S., Kingsley Amponsah I., Oppong Bekoe S., Kingsley Harley B., Boadu Mensah K.,
Yeboah Mensah A., Kwesi Baah M. ETFosu-Mensah G., (2021). Fruits of Vitex doniana sweet:
toxicity profile, anti-inflammatory and antioxidant activities, and quantification of one of its
bioactive constituents oleanolic acid. Heliyon 7, e07910.

Adotey Kwaku J.P., Adukpo Etornam G., Opoku Boahen Y., Ato Armah F. N. (2012). A
Review of the Ethnobotany and Pharmacological Importance of Alstonia boonei De Wild
(Apocynaceae). International Scholarly Research Network, 587160, 9 p.

Afonso V., Champy R., Mitrovic D., Collin P., Lomri A. (2007). Radicaux libres dérivés de
l’oxygène et superoxydes dismutases : rôle dans les maladies rhumatismales. Revue du
Rhumatisme, 74 : 636-643.

Agostini-Costa, T., Roberto V., Humberto B., Silveira D., et Gimenes M. (2012) « Secondary
Metabolites », https://doi.org/10.5772/35705.

Ajah K., U., Ozioma A. O., Ifedigbo C. P., Chidubem Umeh K. C., Obidiegwu O. C.,
Anwuchaepe A. A., Okoye N. N., Omoriri M. A., Basden Chiedu O.F. (2021). Evaluation of
the antioxidant potentials of extract and fractions of Vitex doniana fruit and identification of
the bioactive metabolites using HPLC-DAD-MS analysis. GSC Biological and Pharmaceutical
Sciences, 17(1) : 160-175.

Ali-Rachedi F., Meraghni S., Touaibia N., Sbrina M. (2018). Analyse quantitative des
composés phénoliques d’une endémique algérienne Scabiosa atropurpurea Sub-Maritima L.
Bulletin de la Société Royale des Sciences de Liège, 87 : 13-27.

An L., Yu X.-A., Liu W., Li J., Chang Y.-X. (2020). Identification and Screening of Natural
Neuraminidase Inhibitors from Reduning Injection via One-Step High-Performance Liquid
Chromatography-Fraction Collector and UHPLC/Q-TOF-MS. Hindawi International Journal
of Analytical Chemistry, Article ID 8838025, 11 p.

Anyasor G.N., Olusola Ogunwenmo K., Oyelana O.A., Akpofunure B.E. (2010).
Phytochemical constituents and antioxidant activities of aqueous and methanol stem extracts of
Costus afer Ker Gawl. (Costaceae). African Journal of Biotechnology, 9 (31): 4880-4884.

APG III. (2009). A phylogenetic classification of the land plants to accompany APG III », Bot.
J. Linn. Soc., vol. 161, p. 122-127.

215
APG III. (2009). An update of the Angiosperm phylogeny group classification for the orders
and families of flowering plants: APG III. Bot. J. Linn. Society, 161, pp 105-121.

APM News, la Journée mondiale contre la douleur, 2004.

Arif Y., Singh P., Bajguz A., Hayat S. (2022). Phytoecdysteroids: Distribution, Structural
Diversity, Biosynthesis, Activity, and Crosstalk with Phytohormones. International Journal of
Molecular Sciences, 23 : 8664.

Assogba M.N. (1984). Quelques enquêtes sur la pharmacopée traditionnelle vétérinaire en

République populaire du Bénin. 13ème Conférence de la Société ouest africaine de
pharmacologie, 23-24-25 fevrier, Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche
scientifique. Collège polytechnique universitaire, 107 p.

Aubréville A. (1949). Climats, forêts et désertification de l’Afrique tropicale. Société

d’Éditions Géographiques, Maritimes et Coloniales, Paris (France).

Available online: https:// mona.fiehnlab.ucdavis.edu/ spectra/ display/

Bruker_HCD_library000649 (consulté le 22 Decembre 2022).

Ba Bardou M., Rahme E., Guenard P., Barkun A.N. (2003). Tolérence digestive des anti-
inflammatoires non stéroidiens selectifs ou non de la COX-2. Quelles conclusions tirer des
essais cliniques ? Lettre du pharmacologue, 17(5) : 149-153.

Babady-Bila, Ngalamulume T., Kilonda A., Toppet S., Compernolle F., Hoornaert G. (1991).
An ursadienedioic acid glycoside from Crossopteryx febrifuga. Phyrochemistry, 30(9): 3069 -
3072.

Bailleul F., Rabaron A., Koch M., Delaveau P. (1979). New iridoids of Feretia apodanthera.
Journal of Medicinal Plant Research, 37: 316-324.

Bajoub A., Pacchiarotta T., Hurtado-Fernández E., Olmo-García L., García-Villalba R.,
Fernández-Gutiérrez A., Mayboroda O.A., Carrasco-Pancorb A. (2016). Comparing two
metabolic profiling approaches (liquid chromatography and gas chromatography coupled to
mass spectrometry) for extra-virgin olive oil phenolic compounds analysis : A botanical
classification perspective. Journal of Chromatography A, 1428 : 267-279.

Bamba B., Benie Comoé K.D., Ouattara A., Doukourou D.N., Kamou K. R., Ouattara K.
(2021). Teneurs en phénols totaux, activités antioxydantes des macérés et décocté des feuilles
de Uvaria chamae P. Beauv. (Annonaceae). Int. J. Biol. Chem. Sci., 15(1) : 54-67.

Bannwarth B. (2005). Traitements anti-inflammatoires. Place des AINS classiques et des

coxibs. EMC. Médecine 2: 524-5231.

Barthes J (2014). Revetments surfaciques à base de polymers et de composants naturels:

applications à la mise au point de surfaces mécano-sensibles et de substrats cellulaire
nourriciers. Thèse de doctorat, 235 p.

216
Basbaum A.L., Bautista D.M., Scherrer G., Julius D. (2009). Cellular and molecular
mechanisms of pain. Cell, 139: 267-84.

Baudoux B. (2008). Se soigner par les huiles essentielles. L’aromathérapie, éditions Amyris.

Bealem A., Sakava P., Favier L., Hauchard D., Guegan J.-P., Nyemb J.N., Talla E., Henoumont
C., Laurent S., Atchade De Theodore A., Mbafor Tanyi J. (2021). Chemical Constituents of
Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) Benth (Rubiaceae), their Phytotoxicity and
Antioxidant activities. Nat Prod Chem Res., 9:1000416.

Berhaut J. (1971-1975). Flore illustrée du Sénégal, 5 tomes. Gouvernement du Sénégal,

Ministère du développement rural et de l’hydraulique, Direction des eaux et forêts, Dakar.

Bertin P., Vergne-Slle P. (2019). Douleur et inflammation. Revue du rhumatisme 86S, A25-
A29.

Bia kouakou B., Trebissou J.N.D., Bide A., Assi yapo J., Zirihi-Guede N., Djaman A.J. (2015).
Étude ethnopharmacologique des plantes antipaludiques utilisées chez les Baoulé-N’Gban de
Toumodi dans le Centre de la Côte d’Ivoire. Journal of Applied Biosciences, 85 :7775- 7783.

Bior B.M. (2000). Phagocytes and oxidative stress. American Journal Medicine, 109 (1) : 33-
44.

Boonsong S., Klaypradit W., Wilaipun P. (2016). Antioxidant activities of extracts from five
edible mushrooms using different extractants. ANRES, 50 : 89-97.

Borel J.-P., Monboisse J.-C., Bellon G. (1988). Inflammation, collagène et radicaux libres
oxygénés. Médecine /sciences, 5(4) : 304-310.

Bossard E. (1996). La médecine traditionnelle au centre et à l'ouest de l'Angola.

Ministério da ciênciae da tecnologia. Instituto de investigaçâo cientifica tropical. Lisboa -
(ISBN : 972-672-858-4) p. 531.

Bouchenaki H., Bégou M., Maggy L., Hajj R., Demiot C. (2019). Les traitements
pharmacologiques des douleurs neuropathiques. Pharmacologie clinique, 1-22. Version of
Record : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040595719300691.

Bouhassira D., Attal N. (2007). Les douleurs neuropathiques. La Lettre du Neurologue,7 : 226-
232. https://www.edimark.fr/Front/frontpost/getfiles/12398.pdf.

Bouhassira D., Lantéri-Minet M., Attal N., Laurent B., Touboul C. (2008). Prevalence of
chronic pain with neuropathic characteristics in the general population. Pain ;136 : 380-387.

Bouhasssira D. (2005). Physiopathologie des douleurs neuropathiques. La lettre du

pharmacologue, 19(4) : 134-137.

Boumendjel A., Stoing Taiwe G., Ngo Bun E., Chabrol T., Beney C., Sinniger V., Haudecoeur
R., Marcourt L., Challal S., Ferreira Queiroz E., Souard F., Le Borgne M., Lomberget T.,
Depaulis A., Lavaud C. RobinR., Wolffender J., Bonaz B., De Waard M. (2013). Occurrence

217
of the synthetic Analgesic Tramadol in an African Medicinal plant. Angewandte Chemie
International, 52(45) : 11780-11784.

Bouquet A. (1969). Féticheurs et médecines traditionnelles du Congo (Brazzaville).

Mém. O.R.S.T.O.M., 36, 282 p.

Bourne C.P., Whiting P., Dhadialla S.T., Hormann E.R., Girault J.-P., Harmatha J., Lafon
R., Laurence Dinan L., (2002). Ecdysteroid 7,9(11)-dien-6-ones as potential photoaffinity labels
for ecdysteroid binding proteins, 2: 11.

Bouyahya A. (2016) Alicaments : des aliments aux médicaments, quel apport pour la santé ?
Ann Sci Sante 1 :1-3.

Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C. (1995). Use of free radical method to evaluate
antioxidant activity. Lebensm. Wiss-Technol 28 :25-30.

Briggs H.L. and Cambie R.C. (1958). The extractives of Vitex lucens-I. Tetrahedron, 3 : 269-
273.

Briquet J.I. (1895). Verbenaceae In. : A. Engler et K. Prantl (eds), Die Natürlichen
Pflanzenfamilien 4 (3a) : 132-182. W. Engelmann, Leipzig.

Bruneton J. (2005). Pharmacognosie ; phytochimie ; plantes médicinales (4e édition), 1269p.

Bruneton J. (2005). Plantes toxiques : végétaux dangereux pour l’homme et les animaux 2005,
3è ED. Tec & Doc, 618p.

Bruschi P., Morganti M., Mancini M., Signorini M.A. (2011). Traditional healers and
laypeople: A qualitative and quantitative approach to local knowledge on medicinal plants in
Muda (Mozambique). Journal of Ethnopharmacology, 138: 543- 563.

Budĕšĭskӯ M., Vokáč K., Hamartha J., Cvačka J., (2008). Additional minor ecdysteroid
components of Leuzea carthamoides. Steroids, 73: 502-514.

Buniam J., Chukijrungroat N., Rattanavichit Y., Surapongchai J., Weerachayaphom J., Bupha-
Intr T., Saengsirisuwan V., (2020). 20-Hydroxyecdysone ameliorates metabolic and
cardiovascular dysfunction in high-fathigh-fructose-fed ovariectomized rats. BMC
Complementary Medicine and Therapies, 20: 140.

Burda S., Oleszek W. (2001). Antioxidant and antiradical activities of flavonoids. J. Agric Food
Chem, 49: 2774-9.

Burta O., Tulea F., Burda O.L., Syed Minnatullah Q. (2008). Phytotherapy in cardiovascular
diseases: From ethnomedicine to evidence based medicine. Journal of Biological Sciences,
8(2): 242-247.

Buzgaia N., Lee Y.S., Rukayadi y., Abas F., Shaari K. (2021). Antioxidant Activity, α-
Glucosidase Inhibition and UHPLC-ESI-MS/MS Profile of Shmar (Arbutus pavarii Pamp).
Plants, 10, 1659.
218
Cai Y.-J., Dai J.-G., Fang L.-P., Ma L.F., Hou L.Y., Liu Z.L. (2002). Antioxidative and free
radical scavenging effects of ecdysteroids from Serratula stangula. Can. J. Physiol. Pharmacol,
80: 1187-1194.

Calvino B. (2007). Les mécanismes de la douleur. Psycho-Oncologie, 2: 81-87.

Canonica L., Danieli B., Ferrari G., Haimova M.A., Krepinsky J., (1973). The structure of a
new phytoecdysone kaladasterone: An application of13C magnetic resonance spectroscopy to
structural problems. Experientia, 29(9) : 1062-1063.

Cao G, Sofic E., Prior R.L. (1997). Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids:
Structure-activity relationships. Free Radic Biol Med., 22: 749-60.

Caraceni A., Pigni A., Brunelle C. (2011). Is oral morphine still the first choice opioid for
moderate to severe cancer pain ? A systematic review within the European Palliative Care
Research Collaborative guidelines project. Palliat Med., 25 : 402-9.

Casida J.E., Quistad G.B. (1995). Pyrethrum flowers : Production, Chemistry, Toxicology and
Uses. University Press, New York.

Catarino L., Havik P.J., Romeiras M.M. (2016). Medicinal plants of Guinea-Bissau:
Therapeutic applications, ethnic diversity and knowledge transfer. Journal of
Ethnopharmacology, 183 : 71-94.

Cavaillon J.-M. (2005). Médiateurs de l’inflammation. Sepsis sévère et choc septique, 23-49.

Cazarolli L.H., Zanatta L., Alberton H. E., Santos M.R., Figueiredo B., Folador P., Guollo
Damazio R., Geraldo Pizzolatti M., Regina F. (2008). Flavonoids: Prospective Drug
Candidates. Mini Rev. Med. Chem., 8(13): 1429-1440.

Chandramu C., Manohar R.D., Krupadanam L.G.D., Dashavantha V.R. (2003). Isolation,
Characterization and Biological Activity of Betulinic Acid and Ursolic Acid from Vitex
negundo L. Phytotherapy research, 17: 129-134.

Chantaranothai P. (2011). A revision of the genus Vitex (Lamiaceae) in Thailand. Trop. Nat.
Hist., 11:91-118.

Chen P., Yi W., Lulin C., Wei J., Yan N., Qing S., Lu G., Quancheng Z., Licheng Y., Shufang
W., (2015). Comparison of the anti-inflammatory active constituents and hepatotoxic
pyrrolizidine alkaloids in two Senecio plants and their preparations by LC-UV and LC-MS.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 115: 260-271.

Cholet J., Decombat C., Vareille-Delarbre M., Gainche M., Berry A., Senejoux F., Ripoche I.,
Delort L., Vermerie M., Fraisse D., Felgines C., Ranouille E., Berthon J.-Y., Priam J., Saunier
E., Tourrette A., Troin Y., Thebaud G., Chalard P., Caldefie-Chezet F. (2019). In Vitro Anti-
Inflammatory and Immunomodulatory Activities of an Extract from the Roots of Bupleurum
rotundifolium. Medicines 6(101) : 1-14.

219
Chouna R.J., Tamokou J.-d.-D., Nkeng-Efouet-Alango P., Lenta B.N., Sewald N. (2015).
Antimicrobial triterpenes from the stem bark of Crossopteryx febrifuga. Z. Naturforsch, 70(7-
8) c: 169-173.

Chui I.M., Von Hehn C.A., Woolf C.J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous
system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci 2012, 15 : 1063-7.

Coxon D.T., Curtis R.F., Price K.R., Haward B. (1974). Phytuberin: A novel antifungal
terpenoid from potato. Tetrahedron Letters, 15 (27): 2363-2366.

Craig W. J. (1999). Health-promoting properties of common herbs. The American Journal of

Clinical Nutrition, 70 (3): 491-499.

Dalziel J.M. (1957). The useful plants of West Tropical Africa. 2nd edition. Crown agents,
London, 396 p.

Danton O. (2017). Extraction des substances naturelles antalgiques à partir des plantes utilisées
dans la pharmacopée traditionnelle au Mali. Thèse de doctorat. Université Clermont Auvergne,
DU2788, 257p.

Danton O., Somboro A., Fofana B., Diallo D., Sidibé L., Rubat-Coudert C., Marchand F.,
Eschalier A., Ducki S., Chalard P. (2019). Ethnopharmacological survey of plants used in the
traditional treatment of pain conditions in Mali. Journal of Herbal Medicine.100271.

Dassou H., Ogni A.C.G., Yedomonhan H., Adomou A.C., Toussou M., Dougnon J.T.,
Akoegninou A. (2014). Diversité, Usages Vétérinaires et vulnérabilité des plantes médicinales
au Nord-Bénin. Int. J. Biol. Chem. Sci., 8(1) : 189-210.

Déclaration de l’Organisation Mondiale de la Santé du 27 mai 2013 ; WHA66.10

Degos V., Chhor V., Gressens P., Mantz J. (2009). Neuro-inflammation aiguë et stratégies
neuroprotectrices. Réanimation, 18: 556-565.

Delaude C. (1978). Les végétaux du Zaïre : Matériel médico-magique des guérisseurs et

sources de recherches phytochimiques. Université de Liège. Editions du Centre de Coopération
au Développement (CECODE). Imprimerie George Michel S.A., rue de la paix n°6, 4000 Liège,
164p.

Delaude C., Breyne H. (1971). Plantes médicinales et ingrédients magiques du grand marché
de Kinshasa. Africa - Tervuren, 17, 93-103.

Demyttenaere K., Bonnewyn A., Bruffaerts R., Brugha T., De Graaf R., Alonso J. (2006).
Comorbid painful physical symptoms and depression: Prevalence, work loss, and help seeking.
Journal of Affective Disorders 92: 185-193.

Dewick P.M. (2008). Medicinal Natural Products. A Biosynthetic Approach, 3rd Edition.

Diafouka A. J. P. (1997). Analyse des usages des plantes médicinales dans 4 régions de Congo-
Brazzaville. Thèse de doctorat, Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences, Laboratoire
de Botanique Systématique et de Phytosociologie, 431p.

220
Dias Aécio L.S., Rozet E., Larondelle Y., Hubert P., Rogez H., Quentin-Leclercq (2013).
Development and validation of an UHPLC-LTQ-Orbitrap MS method for non-anthocyanin
flavonoids quantification in Euterpe oleracea juice. In: Analytical and Bioanalytical
Chemistry, 405(28): 9235-9249.

Dimongu L. (1984). L’art de guérir chez les Kongo du Zaire, discour magique ou Science
médical ? Les cahiers du CEDAF, Série 1, Anthropologie, 3 : 71p.

Dinan L., Dioh W., Veillet S., Lafont R. (2021). 20-Hydroxyecdysone, from Plant Extracts to
Clinical Use: Therapeutic Potential for the Treatment of Neuromuscular, Cardio-Metabolic and
Respiratory Diseases. Biomedicines, 9 : 492.

Dioh W., Chabane M., Tourette C., Azbekyan A., Morelot-Panzini C., Hajjar L.A., Lins M.,
Nair G.B., Whitehouse T., Mariani J., Latil M., Camelo S., Lafont R., Dilda J.P., Veillet S.,
Agus S. (2021). Testing the efficacy and safety of BIO101, for the prevention of respiratory
deterioration, in patients with COVID-19 pneumonia (COVA study) : a structured summary of
a study protocol for a randomised controlled trial. Trial, 22-42.

Djamilatou Z.S., Djibo A.K., Sahabi B., Seini S.H. (2021). Screening phytochimique, dosage
des polyphénols et détermination de l’activité antioxydante de deux plantes anti-hypertensives
du Niger. European Scientific journal ESJ, 17(17) : 335-349.

Dos Santos T.C., Monache F.D., Leitão S.G. (2001). Ecdysteroids from two Brazilian Vitex
species. Fitoterapia, 72, 215-220.

Dufour D. (2006). Évaluation de l'activité biologique du Ledum groenlandicum Retzius.

Mémoire présenté à l'université du Québec à Chicoutimi comme exigence partielle de la
maîtrise en ressources renouvelables, 81 p.

Edewor T.I., Oluyori P., Owa S.O. (2015). Evaluation of Some Nigerian Savannah Plants for
Antioxidant Activity, and Total Phenolic and Flavonoid Contents. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res.,
34(2): 75-81.

El Guiche R., Tahrouch S., Amri O., Al Mehrach K., Hatimie A. (2015). Antioxidant Activity
and Total Phenolic and Flavonoid Contents of 30 Medicinal and Aromatic Plants Located in
the South of Morocco. International Journal of New Technology and Research, ISSN: 2454-
4116, 1(3): 07-11.

El hawary S.S., Younis Y.I., El Bishbishy M.H., Khattab R.A. (2018). LC-MS/MS-based
chemometric analysis of phytochemical diversity in 13 Ficus spp. (Moraceae): Correlation to
their in vitro antimicrobial and in silico quorum sensing inhibitory activities. Industrial Crops
& Products 126, 261-27.

Elaskary I.H., Sabry M.O., Khalil M.A., El Zalabani M.S. (2020). UPLC-PDA-ESI-MS/MS
Profiling of Clerodendrum inerme and Clerodendrum splendens and Significant Activity
Against Mycobacterium tuberculosis. Pharmacogn J. 12(6) Suppl:1518-24.

El-Shazly M.A.M., Hamed A. A., Kabary H.A., Ghareeb A. M. (2021). LC-MS/MS profiling,
antibiofilm, antimicrobial and bacterial growth kinetic studies of Pluchea dioscoridis extracts.
Acta Chromatographica, 1-13.

221
Elufioye T.O., Agbedahunsi J.M. (2004). Activités antipaludiques de Tithonia diversifolia
(Asteraceae) et de Crossopteryx febrifuga (Rubiaceae) sur des souris in vivo. Journal of
ethnopharmacology, 93 (2-3) 167-171.

Embeya V.O., Mavungu G.N. (2019). Evaluation de l’activité antipyrétique, analgésique et

anti-inflammatoire de l’extrait méthanolique de Vitex congolensis De Wild. & T. Durand. Int.
J. Biol. Chem. Sci. 13(7): 3066-3078.

Erdelmeier Clemens A.J., Douglas Kinghorn A., Farnsworth R.N. (1987). On-plate injection in
the preparative separation of alkaloids and glycosides using overpressured layer
chromatography. Journal of Chromatography, 389: 345-349.

Farag M.A., Kabbash E.M., Mediani A., Döll S., Esatbeyoglu T., Afifi S.M. (2022).
Comparative Metabolite Fingerprinting of Four Different Cinnamon Species Analyzed via
UPLC-MS and GC-MS and Chemometric Tools. Molecules, 27, 2935.

Feng R., Luya L., Zhang X., Zhang Y., Chen Y., Feng X., Zhang L., Zhang G. (2020).
Assessment of a developed HPLC-MS/MS approach for determining plasma eupatorin in rats
and its application in pharmacokinetics analysis. RSC Adv., 10, 32020.

Fenn, J.B., Mann M.M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse M.C. (1989). Electrospray
ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science, 246(4926): 64-71.

Foresta P., Ghirardi O., Gabetta B., Cristoni A. (1988). Triterpene saponins having anti-
inflammatory, mucolytic and antiedemic activities, process for the preparation thereof and
pharmaceutical compositions containing them, Eur Pat Appl, EP0251197B1.

Fuhrman B., Buch S., Vaya J., Belinky A.P., Coleman R., Havek T. and Aviram M. (1997).
Licorice extract and itsmajor polyphenol glabridin protect low-density lipoprotein against lipid
peroxidation: in vitro and ex vivo studies in humans and in atherosclerotic apolipoprotein E-
deficient mice. The American Journal of Clinical Nutrition, 66(2) : 267-275.

Gainche M., Ogeron C., Ripoche I., Senejoux F., Cholet J., Decombat C., Delort L., Berthon
J.-Y., Saunier E., Caldefie Chezet F., Chalard P. (2021). Xanthine Oxidase Inhibitors from
Filipendula ulmaria (L.) Maxim. and Their Efficient Detections by HPTLC and HPLC
Analyses. Molecules, 26, 1939.

Gainche M., Ripoche M., Senejoux F., Cholet J., Ogeron C., Decombat C., Danton O., Delort
L., Vareille-Delarbre M., Berry A., Vermerie M., Fraisse D., Felgines C., Ranouille E., Berthon
J.-Y., Priam J., Saunier E., Tourrette A., Troin Y., Caldefie-Chezet F., Chalard C. (2020). Anti-
Inflammatory and Cytotoxic Potential of New Phenanthrenoids from Luzula sylvatica.
Molecules, 25, 2372.

Ganapaty S., Vidydhar K.N. (2005). Phytoconstituents and biological activities of Vitex-a
review. Journal of natural remedie, 5(2): 75-95.

Gariboldi P., Verotta L., Gabetta B. (1990). Saponins from crossopteryx febrifuga,
Phytochemistry; 29(8): 2629-2635.

222
Geenen R., Overman L.C., Christensen R., Åsenlöf P., Capela S., L Huisinga L.K., Husebø
P.E.M., Köke A.J.A., Paskins Z., Pitsillidou A.I., Carine Savel C., Austin J., Hassett L.A.,
Severijns G., Stoffer-Marx M., Vlaeyen S.W.J., Fernández-de-las-Peñas C., Ryan J.S.,
Bergman S. (2018). EULAR recommendations for the health professional’s approach to pain
management in inflammatory arthritis and osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases,
77(6) :797-807.

Geney R., Chen J., Ojima I. (2005). Recent advances in the new generation taxane anticancer
agents, Medicinal Chemistry 1: 125-39.

Ghedadba N., Hambaba L., Ayachi A., Aberkane M.C., Bousselsela H., Oueld-Mokhtar S.M.
(2015). Polyphénols totaux, activités antioxydante et antimicrobienne des extraits des feuilles
de Marrubium deserti de Noé. Phytothérapie, 13 : 118-129.

Ghedira K. (2005). Les flavonoïdes : structure, propriétés biologiques, rôle et emplois en

thérapeutique. Phytothérapie, 4: 162-169.

Girault J.P., Lafont R., Varga E., Hajdu Zs., Herke I., Szendrei K. (1988). Ecdysteroids from
leuzea carthamoides. Phytochemistry, 27(3): 737 -741.

Global Industry Analysts Inc. Global Pain Management Market to Reach US$60 Billion by
2015, According to a New Report by Global Industry Analysts, Inc., 2011.
htt://www.prweb.com/pdf download/8052240.pdf (17/07/2022).

Goodwin T.W. (1971). Aspects of terpenoids chemistry and biochemistry. Academic Press,
London.

Goufo P., Singh K.R., Cortez I. (2020). A Reference List of Phenolic Compounds (Including
Stilbenes) in Grapevine (Vitis vinifera L.) Roots, Woods, Canes, Stems, and Leaves.
Antioxidant, 9, 398.

Guettaf S., Abidli N., Kariche S., Bellebcir L., Bouriche H. (2016). Phytochemical screening
and antioxidant activity of aqueous extract of Genista saharae (Coss. & Dur.). Der Pharmacia
Lettre, 8 (1) : 50-60.

Guillot X., Semerano L., Decker P., Falgarone G., Boissier M.-C. (2011). Douleur et immunité.
Revue du rhumatisme 78 : 503-511.

Guirimand F. (2003). Physiologie de la douleur : données récentes. Néphrologie, 24(7) : 401-

407.

Guo Y.-P., Yang H., Wang Y.-L., Chen X.-X., Zhang K., Wang Y.-L., Sun Y.-F., Huang J.,
Yang L., Wang J.-H. (2021). Determination of Flavonoids Compounds of Three Species and
Different Harvesting Periods in Crataegi folium Based on LC-MS/MS. Molecules, 26, 1602.

Gurib-Fakim A. (2008). Toutes les plantes qui soignent : Plantes d’hier, Médicaments
d’aujourd’hui, Editions Michel Lafon : Neuilly-Sur-Seine, 577p.
Güther M., Laufer S., Schmidt P.C. (2006). High anti-inflammatory activity of harpagoside-
enriched extracts obtained from solvent-modified super and sub critical carbon dioxide
extractions of the roots of Harpagophytum procumbes. Phytochem, Anal., 17: 1-7.

223
Haanpää M., Treede R.-D. (2012). Capsaicin for Neuropathic Pain : Linking Traditional
Medicine and Molecular Biology. European Neurology, 68 : 264-275.

Hajdú Z., Hohmann J., Forgo P., Martinek T., Dervarics M., Zupkó I., Falkay G., Cossuta D.,
Máthé I. (2007). Diterpenoids and flavonoids from the fruits of Vitex agnus-castus and
antioxidant activity of the fruit extracts and their constituents. Phytother Res; 21: 391-394.

Halilu M.E., Abubakar A., Garba M.K., Isah A. A. (2012). Antimicrobial and Preliminary
Phytochemical studies of Methanol Extract of Root Bark of Crossopteryx febrifuga
(Rubiaceae). Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2 (12): 066-070.

Hanasaki Y., Ogawa S., Fukui S. (1994). The correlation between active oxygens scavenging
and antioxidative effects of flavonoids. Free Radic Biol Med., 16 : 845-50.

Hantson P. (2002). Efficacité et sécurité de l’association paracétamol-codéine dans le traitement

de la douleur. Revue médicale de Liège, 57 (10) : 645-650.

Harley R.M., Atkins S., Budantsev A.L., Cantino P.D., Conn B.J., Grayer R., Harley M.M., De
Kok R.P.J., Krestovskaja T., Morales R., Paton A.J., Ryding O., Upson T. (2004). Labiatae.
The Families and Genera of Vascular Plants; K. KUBITZKI (Ed), Springer-Verlag, Berlin,
Heidelberg, New York, 6: 167-275.

Heywood, Vernon H. (ed.) (1978). Flowering plants of the world. Oxford University Press,
Oxford.

Hirobe C., Qiao Z.-S., Takeya K., Itokawa H. (1997). Cytotoxic flavonoids from Vitex agnus-
castus. Phytochemisto, 46(3) : 521 524.

Hofvendahl S. (1971). Coronary Heart Disease in seven countries. Edited by Ancel Keys, phD.
Acta Medica Scandinavica, 190 (5): 1-6.

Hossain M.M., Paul N., Sohrab M.H., Rahman E., Rashid M.A. (2001). Antibacterial activity
of Vitex trifolia. Fitoterapia 72, 695-697.

Hsu H.F., Houng J.Y., Chang C.L., Wu C.C., Chang F.R., Wu M.C. (2005). Antioxydant
activity, cytotoxicity, and DNA information of Glossogyne tenuifolia. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 53(15): 6117-6125.

Hu J., Luo C.X., Chu W.H., Shan Y.A., Qian Z-M., Zhu G., Yu B.Y., Feng H. (2012). 20-
Hydroxyecdysone Protects against Oxidative Stress Induced Neuronal Injury by Scavenging
Free Radicals and Modulating NF-kB and JNK Pathways. PLoS ONE 7(12) : e50764.

Hu Y., Zhang Q., Xin H., Qin L.-P., Lu B.-R., Rahman K., Zheng H. (2007). Association
between chemical and genetic variation of Vitex rotundifolia populations from different
locations in China: its implication for quality control of medicinal plants. Biomedical
Chromatography, 21: 967-975.
Huang M., Zhang Y., Xu S., Xu W., Chu K., Xu W., Zhao H., Lu J. (2015). Identification and
quantification of phenolic compounds in Vitex negundo L. var. cannabifolia (Siebold et Zucc.)
Hand.-Mazz. Using liquid chromatography combined with quadrupole time-of-flight and triple

224
quadrupole mass spectrometers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 108 :11-
20.

Hwang J.S., Kim Y.-W., Park Y., Lee H.-J., Kim K.-W. (2014). Anti-inflammatory effects of
chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells. Inflammation Research,
63 :81-90.

Ibekwe N.N., Adesomoju A.A., Igoli J.O., Barry III C.E., Okogun J.I. (2019). An iridoid
glucoside from the leaves of Pavetta crassipes. J. Chem Soc. Nigeria 2019, 44(4): 629 -632.

Institut Pasteur de Lille. Maladies infectieuses et inflammatoires 2022. https://pasteur-

lille.fr/centre-de-recherche/thematiques-de-recherche/maladies-infectieuses-et inflammatoires/
(Consulté le 03/08/2022).

Jangwan S.J., Aquino P.R., Mencherini T., Singh R. (2013). Isolation and in vitro cytotoxic
activity of 11-methylixoside isolated from bark of Randia dumetorum Lamk. Herba polonica,
59(1) : 44-52.

Jansen O., Angenot L., Tits M., Nicolas J.P., De Mol P., Nikiéma J.-B., Frédérich M. (2010).
Evaluation of 13 selected medicinal plants from Burkina Faso for their antiplasmodial
properties. Journal of Ethnopharmacology, 130: 143-150.

Jeyadevi R., Sivasudha T., Rameshkumar A., Dinesh Kumar L. (2013). Anti-arthritic activity
of the Indian leafy vegetable Cardiospermum halicacabum in Wistar rats and UPLC-QTOF-
MS/MS identification of the putative active phenolic components. Inflammation Research, 62
:115-126.

Jiofack T., Ayissi I., Fokunang C., Guedje N., Kemeuze V. (2009). Ethnobotany and
phytomedicine of the upper Nyong valley forest in Cameroon African Journal of Pharmacy and
Pharmacology, 3(4): 144-150.

Jouzeau J.-Y., Daouphans M. Benani A., Netter P. (2004). Pharmacologie et classification des
inhibiteurs de la cyclooxygénase. Gastroenterol Clin Biol., 28: C7-17.

Kabran G.R.M., Ambeu N’ta C., Mamyrbékova-Bétro J.K., Bétro Y.-A. (2012). Phénols et
Flavonoïdes totaux dans les extraits organiques de dix plantes utilisées dans la Trathérapie du
Cancer du sein en Côte d’Ivoire. European journal of Scientific Research, ISSN 4150-216X,
68(2) : 182-190.

Kalyoncu F., Oskay M., Kayalar H. (2010). Antioxidant activity of the mycelium of 21 wild
mushroom species. Mycology,1(3): 195-199.

Kamatou Poungoue G.P., Vermaak I., Viljoen Alvaro M., Lawrence B.M. (2013). Menthol : a
simple with remarkable biological properties. Phytochemistry, 96: 15-25.
Kasuku W., Lula F., Paulus J., Ngiefu N., Kaluila D. (1999). Contribution à l'inventaire des
plantes utilisées pour le traitement du paludisme à Kinshasa (R.D.C.).
Rev. Méd. Pharm. Afr., 13: 95-102.
Kearns C.E, Schmidt L.A., Glantz S.A. (2016). Sugar Industry and Coronary Heart Disease
Research A. Historical Analysis of Internal Industry Documents. JAMA Inter. Med., 176(11):
1680-1685.

225
Keita S.M. (1999). Etude ethnopharmacologique traditionnelle de quelques plantes médicinales
anthelminthiques de la Haute-Guinée (République de Guinée). Rev. Méd. Pharm. Afr., 13: 49-
65.

Kerharo J., Adam J.G. (1964). Les plantes médicinales, toxiques et majiques des Niominka et
des Socé des Iles du Saloum (Sénégal). Acta. Tropica, Suppl., 8 : 279-334.

Kerharo J., Adam J.G. (1974). La pharmacopée Sénégalaise traditionnelle : plante médécinales
et toxiques, Paris.

Khantouche L., Abderabba M. (2018). Dosage des polyphénols et étude de l’activité

antioxydante et antimicrobienne des différents extraits des feuilles du Globularia alypum L.
IOSR Journal of Environmental Science, Toxicology and Food Technology (IOSR- JESTFJ),
12(1) : 68-74.

Kibungu Kembelo A.O. (2003). Quelques plantes médicinales du Bas-Congo et leurs usages
198 p.

Kim D., Chun O., Kim Y., Moon H. et Lee C. (2003). Quantification of phenolics and their
antioxidant capacity in fresh plums J. Agric. Food Chem., 51: 6509.

Kimpouni V., Lenga-Sacadura M.-Y., Mamboueni J.C., Mikoko E.N. (2018). Phytodiversite et
Pharmacopée Traditionnelle de la communauté Kaamba de Madingou (BouenzaCongo)
European Scientific Journal, 14(3) : 191-220.

Kobayakawa J., Sato-Nishimori F., Moriyasu M, Matsukawa Y. (2004). G2-M arrest and
antimitotic activity mediated by casticin, a flavonoid isolated from Viticis Fructus (Vitex
rotundifolia Linne fil. Cancer Letters 208, 59-64.

Kodio A. (1986). Contribution à l’étude de la consommation des sirop antitussifs en république

du Mali : évaluation du besoin et amélioration de la mise au point du Balembo sirop, Thèse
Pharmacie, Bamako, 55 p.

Koes R., Verweij W., Quattrocchio F. (2005). Flavonoids: a colorful model for the regulation
and evolution of biochemical pathways. Trends in Plant Sciences, 10(5) : 236-242.

Koirala N., Dhakal C., Munankarmi N.N., Waseem S.A., Aneela H., Natalia M., Sharifi-Rad
J., Muhammad I., Muhammad A.A., Hanif M.S., Basnyat R.C., Bahare S. (2020). Vitex
negundo Linn. : Phytochemical composition, nutritional analysis and antioxydant and
antimicrobial activity. Cell Mol Biol (Noisy le Grand), 66 (4) :1-7.

Koné M.W., Atindehou K.K. (2008). Ethnobotanical inventory of medicinal plants used in
traditional veterinaty medicine in Northern Côte d'Ivoire (West Africa). South African Journal
of Botany, 74 : 76 - 84.

Koné M.W., Atindehou K.K., Terre H., Tyraore D. (2002). Quelques plantes médicinales
utilisées en pédiatrie traditionnelle dans la région Ferkessedougou (Cote d’Ivoire). BIOTERRE,
Rev. Inter. Sci. De la Vie et de Terre, N° spécial.

226
Koni Muluwa J., Bostoen K. (2008). Noms et usages des plantes utiles chez les Nsong.
Göteborg Africana Informal, Series - N° 6, 71p. Department of Oriental and African Languages.
University of Gothenburg (ISSN 1404-8523).

Kono Y., Kashine S., Yoneyama T., Sakamoto Y., Matsui Y., Shibata H. (1998). Iron Chelation
by Chlorogenic Acid as a Natural Antioxidant. Biosci. Biotechnol, Biochem., 62(1): 22-27.

Kopa T. K., Tane P., Wabo K.H., Tala F.M., Tchinda T.A., Zofou D., Ning-Hua T. (2016).
Activité antiplasmodiale in vitro des composés isolés des écorces du tronc de Vitex thyrsiflora.
Comptes Rendus Chimie 19 : 807-811.

Kouassi K.E., Djadji A.T, Amenan K.S., N'guessan J.D., Kouakou-Siransy G. (2018).
Antipyretic activity of aqueous extract of Crossopteryx febrifuga stem barks in wistar rats.
World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 7(9): 190-200.

Kozarski M., Klaus A., Jakovljevic D., Todorovic N., Vunduk J.J., Petrovic P., Niksic M., Vrvic
M.M., van Griensven L.J.L.D. (2012). Antioxidative activities and chemical characterization
of polysaccharide extracts from the widely used mushrooms Ganoderma applanatum,
Ganoderma lucidum, Lentinus edodes and Trametes versicolor. J. Food Compos. Anal., 26,
144–153.

Krimat S., Metidji H., Tigrine C., Dahmane D., Nouasri A., Dob T. (2017). Analyse chimique,
activités antioxydante, anti-inflammatoire et cytotoxique d’extrait hydrométhanolique
d’Origanum glandulosum Desf. Phytothérapie, 1-8.
Kubo I.; Asaka Y.; Stout M.J.; Nakatsu T. (1990). Structure of a novel phytoecdysteroid,
vitexirone, and efficient isolation of phytoecdysteroids from Vitex fisherii. Journal of Chemical
Ecology, 16, 2581–2588.

Kubo I., Matsumoto A., Ayafor J. F. (1984). Efficient Isolation of a Large Amount of 20-
Hydroxyecdysone from Vitex madiensis (Verbenaceae) by Droplet Counter-Current
Chromatography. Agricultural and Biological Chemistry, 48(6): 1683-1684.

Kumar S., Sharma U. K., Sharma A. K., Pandey A. K. (2012). Protective efficacy of Solanum
xanthocarpum root extracts against free radical damage: phytochemical analysis and
antioxidant effect. Cellular and Molecular Biology, 58(1): 171-178.

Lagnika L. (2005). Etude phytochimique et activité biologique de substances naturelles isolées

de plantes béninoises Thèse de doctorat, Université Louis Pasteur, Strasbourg, 249p.

Larguet H. (2011). Les molécules terpéniques (ecdysteroides) des fleurs de Sarratula

cichoracea : recherche d’activités anti microbienne et antioxydante. Mémoire de Magistère,
Université Mentouri Constantine, 74p.

Latham P. (2004). Useful plants of Bas-Congo province, Democratic Republic of the Congo.
DFIG, London, United Kingdom, 320p.

227
Lautenschläger T., Monizi M., Pedro M., Mandombe J.L., Bránquima M.F., Heinze C.,
Neinhuis C. (2018). First large-scale ethnobotanical survey in the province of Uíge, northern
Angola Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, 14: 51.

Le Bars D., Willer J.-C. (2004). Physiologie de la douleur EMC-Anesthésie Réanimation 1,

227-266.

Le Bizec B., Antignac J.-P., Monteau F., Andre F. (2002). Ecdysteroids: one potential new
anabolic family in breeding animals. Analytica Chimica Acta 473 : 89-97.

Le Breton D. (2017). Douleur chronique et réinvention de soi. Editions Métaillé, Paris, ISBN :
979-10-226-0557-1.

Lengbiye E.M., Koto-te- Nyiwa N., Bongo N.G., Messi L. M., Noté P.O., Mbing N.J.
Pegnyemb E., Mpiana T.P. (2018). Vitex madiensis Oliv. (Lamiaceae): Phytochemistry,
pharmacology and future directions, a mini-review. Journal of pharmacognosy and
phytochemistry, 7(2): 244-251.

Lengbiye E.M., Koto-te-Nyiwa N., Messi L.M., Rasoazanany E.O., Lukoki Luyeye F., Ngo
Mbing J., Mutwale Kapepula P., Kabamba Ngombe N., Pegnyemb D.E., Tshimankinda Mpiana
P. (2020). Microscopic Studies, Mineral composition and Bioactivity of Vitex madiensis Oliv.
(Lamiaceae). Discovery Phytomedicine; 7(4): 177-185.

Lin Y., Xu W., Huang M., Xu W., Li H., Ye M., Zhang X., Chu K. (2015). Qualitative and
Quantitative Analysis of Phenolic Acids, Flavonoids and Iridoid Glycosides in Yinhua
Kanggan Tablet by UPLC-QqQ-MS/MS. Molecules, 20: 12209-12228.

Livre blanc 2017. Etat des lieux et propositions pour un système de santé éthique, moderne et
citoyen.

Lombardi M. C. (2007). Chronic Nonsteroidal Anti-inflammatory Drug Use. Complications in

Anesthesia, 2nd : 273-277.

Ludwiczuk A., Skalicka-Wozniak K., Georgiev M.L. (2017). Terpenoids. Pharmacognosy.

Fundamentals, Applicatins and Strategies, 11: 233-266.

Mabberley J. D. (2017). Mabberley’s Plant-Book : A Portable Dictionary of Plants, their

Classification and Uses, 4th Edition. Cambridge University Press, 1102p.

Macheix J.J., Fleuriet A., Jay-Allemand C. (2005). Les composés phénoliques des végétaux.
Un exemple de métabolites secondaires d’importance économique. Presses polytechniques et
universitaires Romandes, 192p.

Madango M.A., Boemu L., Bongombola M. (1990). Plantes antidiabétiques de Kinshasa

(Zaire). Mitt. Inst. Allg. Bot. Hamburg, 23b : 1021-1031.

Magassouba F.B., Dialloa A., Kouyaté M., Mara F., Bangoura O., Camara A., Traoré S., Diall
A.K., Barry M.S., Donzo M., Camara K., Toté K., Vanden Berghe D., Totté J., Pieters L.,
Vlietinck A.J., Baldé A.M. (2007). Ethnobotanical survey and antibacterial activity of some
plants used in Guinean traditional medicine. Jour of Ethnopharmacology, 114 : 44-53.

228
Mahmoud M.S., Mostafa E.A., Genady M.A.E., Ismail K.S. (2019). Phytochemical and
Biological study of Adintum capillus-veneris L. Growing in Egypt. Az. J. Pharm Sci. 59.

Maiga A., Malterud K.E., Diallo D., Paulsen B.S. (2006). Antioxidant and 15-lipoxygenase
inhibitory activities of the malian medicinal plants Diospyros abyssinica (Hiern) F. white
(Ebenaceae), Lannea velutina A. Rich (Anacardiaceae), Crossopteryx febrifuga (Afzer) Benth
(Rubiaceae). Journal of Ethnopharmacology, 104: 132-137.

Makumbelo E., Lukoki L., Paulus J.J.S.J., Luyindula N. (2008). Stratégie de valorisation des
espèces ressources des produits non ligneux de la savane des environs de Kinshasa : II. Enquête
ethnobotanique (aspects médicinaux). Tropicultura, 26 (3): 129-134.

Malgras, D. (R.P.) (1992). Arbres et arbustes guérisseurs des savanes maliennes.

Editions Karthala, 22 - 24, boulevard Arago, 75013 Paris, 480 p.

Malinski P. M., Budzianowski J., Kikowska M., Derda M., Jaworska M. M., Mlynarczyk T. D.,
Szukalska M., Florek E., Thiem B. (2021). Two Ecdysteroids Isolated from Micropropagated
Lychnis flos-cuculi and the Biological Activity of Plant Material. Molecules, 26, 904.

Mäntyselkä P., Kumpusalo E., Ahonen R., Kumpusalo A., Kauhanen J., Viinamäki
H., Halonen P. and Takala J. (2001). Pain as a reason to visit the doctor: a study in Finnish
primary health care. Pain, 89(2-3): 175-180.

Manuja R., Sachdeva S., Jan A., Chaudhary J. A comprehensive Review on Biological
Activities of p-hydroxybenzoic acid and its derivatives. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res. 2013, 20:
109-115.

Maoyuan W., Qinglong W., Qing Y., Xiaoxia Y., Shixiu F., Zhunian W. (2020). Comparison
of Anthraquinones, Iridoid Glycosides and Triterpenoids in Morinda officinalis and Morinda
citrifolia Using UPLC/Q-TOF-MS and Multivariate Statistical Analysis. Molecules, 25, 160.

Mapongmetsem P.M. (2006). Domestication of Vitex madiensis Oliv. (Verbenaceae) :

phenology and propagation. Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakűltesi Dergisi. pp. 269-278.

Mapongmetsem P.M., Lona B.B., Nkongmeneck B.A., Foko J. (2003). Caracterisation physico-
chimique des fruits de quatre essences locales: Vitex doniana, Vitex madiensis Oliv., Olax
subscorpioides Oliv. et Ximenia americana L. Journal of the Cameroon academy of Sciences ,
3(3) : 213-218.

Marchese A., Barbieri R., Coppo E., Orhan Erdogan I., Daglia M., Nabayi S.F., Izadi M.,
Abdollahi M., Ajami M., Nabavi M.S. (2017). Antimicrobial activity of eugenol and essential
oils containing eugenol: A mechanistic viewpoint. Crit.Rev. Microbiol, 43(6): 668-689.
Maregesi S.M., Ngassapa O.D., Pieters L., Vlietinck A.J. (2007). Ethnopharmacological suvey
of the Bunda district, Tanzania: Plants used to treat infectious diseases. Journal of
Ethnopharmacology, 113: 457-470.

Maroyi, A. (2013). Traditional use of medicinal plants in south-central Zimbabwe: review and
perspectives Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, 9: 31.

229
Masateru O., Yasuyuki I., Satoko K., Toshihiro N. (1997). Two news iridoids from Viticis
trifoliae Fructus (Fruit of Vitex rotundifolia L.). Chem. Pharm. Bull, 45 (6) : 1094-1096.

MasseBank NGA05221, https://massbank.eu/MassBank/RecordDisplay?id=MSBNK-

RIKEN_NPDepo-NGA05221

Meena A.K., Niranjan U.S., Rao M.M., Padhi M.M., Babu R. (2011). A review of the important
chemical constituents, medicinal uses of Vitex genus. Asian Journal of Traditional Medicines,
6 (2) : 54-60.

Mengho B.M. (2017). La géographie du Congo. L’Harmattan-Bibliothèque Africaine du Xxie

Siècle, Sciences humaines et Sociales, 334p.

Merck F. (2017). La biodiversité végétale au service des ingrédients naturels: Étude des
propriétés antimicrobiennes et antioxydantes d’extraits végétaux et développement d’un
conservateur naturel pour l’industrie cosmétique. Thèse de doctorat, 320p.

Migdal C., Serres M. (2011). Espèces réactives de l’oxygène et stress oxydant. Med Sci (Paris),
24: 405- 412.

Mittal M., Siddiqui R.M., Tran K., Reddy P.S., Malik B.A. (2014). Reactive Oxygen Species
in inflammation and tissue injury. Antioxidants and Redox Signaling, 20(7): 1126-1167.

Mizuno M., Yamashita S., Hashimoto T. (2017). Enhancement of anti-inflammatory and anti-
allergic activities with combination of luteolin and quercetin in in vitro co-culture system. Food
Sci. Technol. Res, 23: 811-818.

Mohammed Tahard B.M., Redouane A.C., Lekhal S., Bounab A., Hadef Y. (2022). Dosage des
comopsés phénoliques et détermination de l’activité antioxydante des extraits méthanoliques
de Brocchiacinerea VIS de l’Algérie b(Sud-Est). Algerian journal of pharmacy, 4(1) : 2602-
975X.

Mooser F. Douleur nociceptive. HEdS-FR, ©2015-2016.

Morishita H., Ohnishi M. (2001). Absorption metabolisme and biological activities of

chlorogenic acids and related compound. Studies in Natural Products Chemistry, 25 : 919-953.

Muanda N.F. (2010). Identification de polyphenols, évaluation de leur activité antioxydante et

Etude de leurs propriétés biologiques. Thèse de doctorat, Université Paul Verlaine, 294 p.

Muanda N.F. (2019). Study on the biological activities and chemicals compositions of Vitex
doniana leaves extracts. Annales Africaines de Médecine, 12(3) : e3313- e3320.
Muluh E.K., Adebayo S.A., Terumon Amon T.-A., Alexander A. (2019). Isolation and
characterization of spinasterol from Crossopterxy febrifuga stem bark. Progress in Chemical
and Biochemical Research, 2(2): 66-73.

N’goka V., Nsonde Ntandou G.F., N’goka V., Boumba S.L., Abena A.A. (2018). Chemical
Screening, Acute Toxicity and Analgesic Effect of the Aqueous Extracts of Vitex madiensis
Oliv. (Lamiaceae-Viticoïdeae) and Phytolacca dodecandra L’Hérit. (Phytolaccaceae) Leaves.
International Journal of Sciences, 7 (1): 1-9.

230
Nadeem M., Mumtaz W.M., Danish M., Rashid U., Mukhtar H., Irfan A. (2020). Antidiabetic
functionality of Vitex negundo L. leaves based on UHPLC-QTOF- MS/MS based bioactives
profiling and molecular docking insights. Industrial Crops & Products 152 : 112445.

Naveed M., Hejazi V., Abbas M., Kamboh A.A., Khan J.G., Shum Zaid M., Ahmad F., Baba
Zaded D., Fang Fang X., Modarresi-Ghazani F., Wen Hua L., Hui X.Z. (2018). Chlorogenic
acid (CGA): A pharmacological review and call for further research. Biomedicine and
Pharmacotherapy, 97: 67-74.

Neves A., Rosa S., Gonçalves J., Rufino A., Judas F., Salgueiro L., Lopes C.M., Cavaleiro C.
et Mendes A.F. (2010). Screening of Five essential Oils for identification of potential inhibitors
of IL-1-induced NF-kB activation and NO production in human chondrocytes: Characterization
of the inhibitory activity of -pinene. Planta Med, 76(3): 303-308.

Newman D.J., Cragg G.M. (2020). Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly
Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products, 83 : 770-803.

Ngah L., Songue L.J., Longue Ekon J.P., Tékapi Tsopgni D.W., Langat K.M., Mpondo Mpondo
E., Jean Wansi D., Ndom J.C., Alain François Kamdem Waffo F. (2020). The chemistry and
biology activities of Vitex phaseolifolius Hildbr. Journal of Pharmacognosy and
Phytochemistry; 9(6): 745-749.

Ngarivhume T., Van’t Klooster C., De Jong Joop. T.V.M., Van der Westhuizen J.H. (2015).
Medicinal plants used by traditional healers for the treatment of malaria in the Chipinge district
in Zimbabwe Journal of Ethnopharmacology, 159: 224-237.

Ngenge Tamfu A., Ndoubalem R., Munvera A., Mfifen Selcuk K., Monde G., Botezatu A.V.,
Mehmet E.D., Dnica R.M. (2022). Phenolic composition, antioxidant and enzyme inhibitory
activities of Parkia biglobosa (Jacq.) Benth., Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray, and
Crossopteryx febrifuga (Afzel.) Benth. Arabian Journal of Chemistry, 15, 103675.

Nguyen T.K.T., Ninh K.B., Do Thi T., Tran M.L., Vu Huong G., Nguyen X. N., Phan V.K.
(2018). Ecdysteroids from leaves of Vitex trifolia, Vietnam Journal of Chemistry, 56(2): 162-
166.

Nie R., Zhang Y., Jin Q., Zhang S., Wu G., Chen L., Zhang H., Wang X. (2021). Identification
and characterisation of bioactive compounds from the seedkernels and hulls of Paeonia
lactiflora Pall by UPLC-QTOF-MS. Food Research International 139, 109916.

Niranjan D., Siddhartha Kumar M., Anusha B., Eunu ̈s S. A., Anupam B. (2021). The
phytochemical, biological, and medicinal attributes of phytoecdysteroids: An updated review.
Acta Pharmaceutica Sinica B,11(7) :1740 -1766.

Niroumand C.M., Heydarpour F., Farzaei H.M. (2018). Pharmacological and Therapeutic
Effects of Vitex agnus-castus L.: A Review. Pharmacognosy Reviews, 12(23): 103-114.

Nma N.Y., Mann A., Muhammad B.M. (2018). GC-MS Analysis of Bioactive Compounds in
the Ethyl Acetate Fraction of Crossopteryx febrifuga Leaves. Journal of Chemical and
Pharmaceutical Research, 10(3) :75-79.

231
Nordeng H., Al-Zayadi w., Diallo D., Ballo N., Paulsen B.S. (2013). Traditional medicine
practitionets’sknoroledge and views on treatment of pregnant women in three regions of Mali.
Journal of Etnobiology and Ethnomedicine, 9 : 67.

Nsonde Ntandou G.F., Dianzitoukoulou Matsima L.D., Ingabire J., Makemba Nkounkou G.S.,
Nkundineza J.C., ABENA A.A. (2020). Anti-Inflammatory and Central Analgesic Effect of the
Aqueous Extract of the Leaves of Vitex Madiensis Oliv. (Lamiaceae-Viticoïdeae). Sch Int J
Tradit Complement Med, 3(1): 12-17.

Nzuki Bakaye F., Termote C., Kibungu K., Van Damme P. (2013). Identification et importance
locale des plantes médicinales utilisées dans la region de Mbanza-Ngungu, République
Démocratique du Congo. Bois et Forêts des Tropiques, 316(2).

Ochieng C.O, Nandwa B.O. (2010) Proximate composition, phenolic content and antioxidant
activities of three black plum (Vitex sp.) fruits : preliminary results. Journal of Food
Technology, 8(3): 118-125.

Ochieng C.O., Ishola O. I., Opiyo S. A, Manguro L. A. O., Owuor P. O., Keng-Chong W.
(2013). Phytoecdysteroids from the Stem Bark of Vitex doniana and Their Anti-Inflammatory
Effects. Planta Med., 79: 52-59.

Ohyama K., Akaike T., Hirobe C., Yamakawa T. (2003). Cytotoxicity and Apoptotic
Inducibility of Vitex agnus-castus Fruit Extract in Cultured Human Normal and Cancer Cells
and Effect on Growth. Biol. Pharm. Bull., 26(1): 10-18.

Ojewale A.O., Olaniyan O.T., Yemitan O.K., Odukanmi O.A., Dare B.J., Nnaemeka W.S.,
Adebari A.O. (2013). Activités hypoglycémiques et hypolipidémiques d’extrait de racines
éthénoliques de Crossopteryx febrifuga chez des rats diabétiques induits par l’alloxane. Tirage
J Pharm Med Sci, 2: 1-4.

Olennikova D. N., Kashchenkoa N. I. (2019). Phytoecdysteroids of Serratula centauroides

Herb from Cisbaikalia. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 45(7) : 913-919.

OMS (2013). Suivi de la Déclaration politique de la Réunion de haut niveau de l’Assemblée

générale sur la prévention et la maîtrise des maladies non transmissibles du 27 mai ;
WHA66.10.

OMS (2022). Déclaration politique de la troisième réunion de haut niveau de l’Assemblée

générale sur la prévention et la maîtrise des maladies non transmissibles. Rapport du Directeur
général, EB150/7.

Ondo J.P., Lekana-Douki J.P., Bongui J.B., Zang Edou E.S., Zatra R., Toure-Ndoua F.S.,
Elombi A., Lebibi J., Seguin E. (2012). In vitro antiplasmodial activity and cytotoxicity of
extracts and fractions of Vitex madiensis, medicinal plant of Gabon. Trop. Med. Int. Health,
17 :316-321.

Ono M., Yanaka T., Yamamoto M., Ito Y., Nohara T. (2002). New Diterpenes and
Norditerpenes from the Fruits of Vitex rotundifolia. Journal of Natural Products, 65(4) : 537-
571.

232
Ordoñez A.A.L., Gomez J.D., Vattuone M.A., Isla M.I. (2006). Antioxidant activities of
Sechium edule (Jacq.) Swartz extracts. Food Chemistry, 97 (3): 452-458.

Orliaguet G., Gall O., Benabesses-Lambert F. (2013). Nouveautés concernant les anti-
inflammatoires stéroïdiens et non stéroïdiens. Le praticien en anesthésie réanimation, 17 : 228-
237.

Ouedraogo V., Compaoré E., Rouamba A., Compaoré M., Kiendrebeogo M. (2019). Anti-
virulence Activity of Three Medicinal Plants: Cassia occidentalis L., Crossopteryx febrifuga
(Afzel ex G. Don) Benth. and Zanthoxylum zanthoxyloides (Lam) Zep. and Timl. Microbiology
Research Journal International, 29(1): 1-7.

Ouôba P., Lykke A.M., Boussim J., Guinko S. (2006). La flore médicinale de la Forêt Classée
de Niangoloko (Burkina Faso). Etudes flor. vég. Burkina Faso, 10: 5-16.

Peana A.T., D’Aquila P.S., Panin F., Serra G., Pippia P., Moretti M.D.L. (2002). Anti-
inflammatory activity of linalol and linalyl acetate constituents of essential oils. Phytomédicine,
9 : 721-726.

Perrot S., Trèves R. (2002). Les douleurs neuropathiques en rhumatologie. Rev Rhum [E ́ d Fr],
69 : 961-70.

Phanthonga p., Moralesb N. P., Chancharuneec S., Mangmoold S., Anantachokea N., Nuntavan
B. (2015). Biological Activity of Dolichandrone serrulata Flowers and Their Active
Components. Natural Product Communications, 10 (8) : 1387-1390.

Pitt, J.J. (2009). Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in

clinical biochemistry. Clin Biochem Rev, 30(1): 19-34.

Pordié, L., Magaud M. (2001). Soins vétérinaires populaires en pays peul. Le cas de la
trypanosomiase animale. Ethnopharmacologia. Bulletin de la société française
d'ethnopharmacologie et de la société européenne d'ethnopharmacologie, 27 : 12-30.

Prasad S., Gupta Subash C., Tyagi Amik K., Aggarwal Bharat B. (2014). Curcumin, a
component of golden spice: From bedside to ben and bact. Biotechnologie Advances, 32(6):
1053-1064.

Prior L.R., Wu X., Schalch K. (2005). Standardized Methods for the Determination of
Antioxidant Capacity and phenolics in Foods and Dietary Supplements. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 53: 4290-4302.

Queneau P., Ostermann G. (2014). Le médecin le malade et la douleur, Masson.

Queneau P., Serrie A., Trèves R., Bontoux D. (2018). Au nom du groupe de travail “Douleurs
chroniques rebelles”. Les douleurs chroniques en France. Recommandation de l’Académie
nationale de médecine pour une meilleure prise en charge des maladies. Douleurs Evaluation
Diagnostic- Traitement, 19 : 265-272.

233
Raffaelli A., Moneti G., Mercati V., Toja E. (1997). Mass spectrometric characterization of
flavonoids in extracts from Passiflora incarnata. Journal of Chromatography A, 777: 223-231.

Ramakrishna R., Bhateria M., Singh R., Puttrevu K.S., Bhatta S.R. (2016). Plasma
pharmacokinetics, bioavailability and tissue distribution of agnuside following peroral and
intravenous administration in mice using liquid chromatography tandem mass spectrometry.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 125 : 154-16.

Ramazanov N.S., Makshimov E.S., Saatov Z., Mamatkhanov A.U., Abdullaev N.D. (1997).
Phytoecdysteroids of Plants of the Genus Rhaponticum I. Carthamosterone a FromRh.
Carthamoides. Chemistry of Natural Compounds, 33(3) : 301-302.

Ramirez-Anguiano A.C., Santoyo S., Reglero G., Soler-Rivas C. (2007). Radical scavenging
activities, endogenous oxidative enzymes and total phenols in edible mushrooms commonly
consumed in Europe. Journal of the Science of Food and Agriculture, 87(12): 2272-2278.

Rinaldi de Alvarenga J.F., Quifer-Rada P., Hurtado-Barroso S., Illan M., Torrado-Prat X.,
Lamuela-Raventos R.M. (2020). Cuisinomics : MS-based untargeted approach reveals
chemical modulation by a recipe during home cooking. Food Research International 138,
109787.

Romaniuk-Drapala A., Lisiak n., Totoń E., Matysiak A., Nawrot Z., Nowak G., Kaczmarek M.,
Rubiś B. (2021). Proapoptotic and proautophagic activity of 20-hydroxyecdysone in breast
cancer cells in vitro. Chemico-Biological Interactions, 342, 109479.

Ross A.J., Kasum Dietary C.M. (2002). Flavonoids: Bioavailability, Metabolic Effects and
Safety. Annu. Rev. Nutr., 22 : 19-34.

Rugiero F. (2010). Les canalopathies de la douleur chez l’homme. Med Sci (Paris), 26(12) :
1015-1017.
Saffidine K. (2015). Etudes analytiques et biologiques des composés phénoliques des extraits
de Carthamus caeruleus L. et de Plantago major L. Thèse de doctorat, Université Ferhet Abbas
Setif, 131p.

Sahgal G., Ramanathan S., Sasidharan S., Mordi M.N., Ismail S., Mansor S.M. (2009). In vitro
antioxidant and xanthine oxidase inhibitory activities of methanolic Swietenia mahagoni seed
extracts. Molecules, 14(11) : 4476-4485.

Said A.A.H., Abuotabl E.A., Raoof G.F.A. (2017). Identification of Constituents from
Pleiogynium timorense (Dc.) Leenh Pericarp and Seeds Using High-Performance Liquid
Chromatography with Electrospray Ionization Mass Spectrometry. AASCIT Journal of
Chemistry, 3(4): 30-36.

Salawu O.A., Chindo A. Y., Tijani A.B., Adzu B. (2008). Analgesic, anti-inflammatory,
antipyretic and antiplasmodial effects of the methanolic extract of Crossopteryx febrifuga.
Journal of Medicinal Plants Research, 2(8): 213-218.

Salawu O.A., Chindo B.A., Tijani A.Y., Obidike I.C., Salawu T.A., Akingbasote A.J. (2009).
Acute and sub-acute toxicological evaluation of the methanolic stem bark extract of

234
Crossopteryx febrifuga in rats. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 3(12) : 621-
626.

Sanchez-Moreno C. (2002). Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in
foods and biological systems. Int. J. of Foods Sci. Tch. 3 : 121- 137.

Sanchez-Moreno C. (2002). Review: Methods Used to Evaluate the Free Radical Scavenging
Activity in Food and Biological Systems. International Journal Of Food Science and
Technology, 3 : 121-137.

Sanogo R. (1999). Pharmacognosie et pharmacodynamie de plantes utilisées dans la médecine

traditionnelle au Mali, Thèse de Doctorat de recherche, Faculté de Pharmacie, Université de
Messine, Italie, 195p.

Sanogo R., Crisafi G., Germano M. P., De Tommasi N. Pizza C., Aquino R. (1998). Evaluation
of Malian traditional medecines: screening for antimicrobial activity. Phytotherapy Research:
An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural
Product Derivatives, 12: 154-156.

Sapis J.C., Ribéreau-Gayon P. (1968). Transformation des composés phénoliques au cours du

brunissement. Conn. Vigne Vin, 4 : 323-348.

Sarr S.O., Fall A.D., Ngueye R., Diop A., Diatta K., Diop N., Ndiaye B., Diop Y.M. (2015).
Etude de l’activité antioxydante des extraits des feuilles de Vitex doniana (Verbenacea). Int.J.
Biol.Chem. Sci, 9(3) : 1263-1269.

Sato Y., Itagaki S., Kurokawa T., Ogura J., Kobayashi M., Hirano T., Sugawara M., Iseki K.
(2011). In vitro and in vivo antioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid.
International Journal of Pharmaceutics 403 (1-2): 136-138.

Scheiman J.M. (1996). NSAIDs, gastrointestinal injury, and cytoprotection. Gastroenterol Clin
North Am; 25(2): 279-98.

Seelinger G., Merfort, I., Schempp C. (2008). Anti-oxydant, anti-inflammatory and anti-allergic
activities of luteolin. Planta Med., 74, 1667-1677.

Seikel K.M., Chow Juliana H.S., Feldman L. (1966). The glycoflavonoid pigments of Vitex
lucens wood. Phytochemistry, 5 : 439-455.

Sen S., Chakraborty R. (2011). The role of antioxidants in human health. In Oxidative Stress:
Diagnostics, Prevention and Therapy, Andreescu S, Hepel M (eds). ACS symposium series:
Washington, DC, 1-37.

Sena Filho J.G., Duringerc J., Maiaa G.L.A., Tavaresa J.F., Haroudo X.H.S, Sobral da Silvaa,
M., Em.dio da-Cunhaa V. L., Barbosa-Filhoa J.M. (2008). Ecdysteroids from Vitex Species:
Distribution and Compilation of Their 13C-NMR Spectral Data. Chemistry & Biodiversity, 5 :
707-713.

Senger D.R., Hoang M.V., Kim K.H., Li C., Cao S. (2016). Anti-inflammatory activity of
Barleria lupulina : Identification of active compounds that activate the Nrf2 cell defense

235
pathway, organize cortical actin, reduce stress fibers, and improve cell junctions in
microvascular endothelial cells. Journal of Ethnopharmacology 193 : 397-407.

Serra E. (2014). La dépression dans la douleur. Aspects cliniques et implications

thérapeutiques. Douleur -Evaluation -Diagnostic-Traitement, 15: 98-105.

Serralheiro M.L., Guedes R., Fadel S.R., Bendif H. (2020). Data on identification of primary
and econdary metabolites in aqueous extract of Verbascum betonicifolium. Data in Brief, 32,
106146.

Shan M.-Q., Wang T.-J., Jiang Y.-L., Yu S., Yan H., Zhang L., Wu Q.-N., Geng T., Huang W.-
Z., Wang Z.-Z., Xiao W. (2019). Comparative analysis of sixteen active compounds and
antioxidant and anti-influenza properties of Gardenia jasminoides fruits at different times and
application to the determination of the appropriate harvest period with hierarchical cluster
analysis. Journal of Ethnopharmacology 233 : 169-178.

Shin T.-Y., Kim S.-H., Lim J.-P., Suh E.-S., Jeong H.-J., KIM B.-D., Park E.-J., Hwang W.-J.,
Rye D.-G., Baek S.-H., An N.-H., Kim H.-M. (2000). Effect of Vitex rotundifolia on immediate-
type allergic reaction. Journal of Ethnopharmacology 72 : 443-450.

Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventos R.M. (1999). Analysis of total phenols and
other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods
Enzymol, 299 :152-178.

Sinleton V.L., Rossi J.A. (1965). Colorimetry of total phenolics with

phosphomolybdicphosphotungstic acid reagents. Am J. Enol Vitic, 16: 144-158.

Smolskaite L., Venskutonis P.R., Talou T. (2015). Comprehensive evaluation of antioxidant

and antimicrobial properties of different mushroom species. LWT-Food Science and
Technology, 60 (1): 462-471.

Stalikas C. D. (2007). Extraction, separation and detection methods for phenolic acids and
flavonoids. Journal of Separation Science, 30 (18) : 3268-3295.

Suksamrarn A., Kumpun S., Yingyongnarongkul B. (2002). Ecdysteroids of Vitex scabra

Stem Bark. J. Nat. Prod., 65(11): 1690-1692.

Suksamrarn A., Promrangsan N., Chitkul B., Homvisasevongsa S., Sirikate A. (1997).
Ecdysteroids of the root bark of Vitex canescens. Phytochemistry 45(6) : 1149-1152.

Suksamrarn A., Promrangsan N., Jintasirikul A. (2000). Highly oxygenated ecdysteroids from
Vitex canescens root bark. Phytochemistry 53 : 921-924.

Suksamrarn A., Yingyongnrongkul B., Charoensuk S. (1999). Regioselective Synthesis of 24-

epi-Pterosterone. Tetrahedron 55, 255-260.

Sun H., Liu M., Lin Z., Jiang H., Niu Y., Wang H., Chen S. (2015). Comprehensive
identification of 125 multifarious constituents in Shuang-huang-lian powder injection by

236
HPLC-DAD-ESI-IT-TOF-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 115: 86-
106.

Susan L., Prescot M.D. (2013). Early-life environnemental determinants of allergic diseases
and the wider pandemic of inflammatory non communicable diseases; journal of Allergy and
Clinical Immunology, 131 (1): 23-30.

Sutovská M., Fraňová S., Prisežnaková L., Nosáľová G., Togola A., Diallo D., Paulsen B.S.,
Capek P. (2009). Antitussive activity of polysaccharides isolated from the Malian medicinal
plants, Int. J. Biol. Macromol, 44: 236-239.

Takeda Y., Nishimura H., Inouye H. (1979). Studies on Monoterpenes Glucosides and Related
Natural Products. XXXII. Iridoids Glucosides of Tarenna kotoensis var. gyokushinka. Chem.
Pharm. Bull, 24(6): 1216-1218.

Takemoto T., Arihara S., Hikino Y., Hikino H. (1968). Structure of pterosterone. A novel
insect-moulting substance from Lastrea thelypteris and Onoclea sensibilis. Tetrahedron Letters,
3: 375-378.

Tatsumi S., Mabuchi T., Abe T., Xu L., Minami T., Ito S. (2004). Analgésic effect of extracts
of Chinese medicinal herbs Moutan cortex and Coicis semen on neuropathic pain in mice.
Neuroscience Letters, 370: 130-134.

Thi Kieu T. D., (2016). Evaluation des performances de la chromatographie sur couche mince
haute performance (hptlc) dans l'analyse (qualitative et quantitative) des métabolites
secondaires dans les extraits naturels. Thèse de doctorat, 183p.

Thuy T.T., Porzel A., Ripperger H., Sung T.V., Adam G. (1998). Chalcones and ecdysteroids
from Vitex leptobotrys. Phytochemistry, 49(8): 2603-2605.

Tiwari P.O., Tripathi B.Y. (2007). Antioxidant properties of different fractions of Vitex
negundo Linn. Food Chemistry 100 : 1170-1176.

Tomás-Barberán F.A., Hostettmann K. (1988). A Cytotoxic Triterpenoid and Flavonoids

from Crossopteryx febrifuga. Planta Med., 54(3): 266-267.

Tona L., Kambu K., Ngimbi N., Mesia K., Penge O., Lusakibanza, Cimaga K., De Bruyne T.,
Apers S., Totte J., Pieters L., Vlietinck A.J. (2000). Activités antiamibiennes et spasmolytiques
d’extraits de préparations antidiarrhéiques traditionnelles utilisées à Kinshasa, Congo.
Phytomedecine, 7 (1) : 31-38.

Tracey K.J. (2007). Physiology and immunology of the cholinergic antiinflammatory pathway.
J. Clin. Invest., 117 : 289-96.

Traoré K., Haidara M., Denou A., Kanadjigui F., Nyoni Sogoba M., Diarra B., Maiga S. et
Sanogo R. (2019). Criblage Phytochimique et Activités Biologiques de Quatre Plantes Utilisées
au Mali dans la Prise en Charge du Paludisme Chez les Enfants. European Scientific Journal,
15(6) : 210-226.

237
Traoré M. Le Recours à la Pharmacopée Traditionnelle Africaine dans le Nouveau Millénaire :
<< Cas des Femmes Herboristes de Bamako >> (Proposition de communication). Bamako,
CEAD, 16 p.

Tréchot P., Jouzeau J.-Y. (2014). Bases chimiques et pharmacologiques des AINS. Revue
française d’allergologie, 54 : 212-217.

Trenin D.S., Volodin V.V. (1999). 20-Hydroxyecdysone as a Human Lymphocyte and

Neutrophil Modulator: In Vitro Evaluation. Archives of Insect Biochemistry and Physiology,
41: 156-161.

Tschibumbu K.E., Ngoie K.M., Ndibualongui B.B.V., Mwamba M.F., Bakadia B.M., Kasamba
I.E. (2014). Evaluationof antidiabetic activity of aqueous extract of Vitex madiensis in
phytotherapy. Revue Médicale des Grands Lacs, 3(2): 254-267.

Uysal A., Zengin G., Mahomoodally M.F., Picot-Allain C., Jeko J., Cziaky Z., Rodrigues M.R.,
Ak G., Polat R., Urusan Z., Sinan K.I., Luisa Custodio. (2021). A comparative study on
biological properties and chemical profiles of different solvent extracts from Centaurea
bingoelensis, an endemic plant of Turkey. Process Biochemistry 102 : 315-324.

Uysal S., Zengin G., Sinan I.K., Ak G., Ceylan R., Mahomoodally F.M., Uysal A., Sadeer B.N.,
Jekő J., Cziáky Z., Rodrigues J.M., Yıldıztugay E., Elbasan F., Custodio L. (2021). Chemical
characterization, cytotoxic, antioxidant, antimicrobial, and enzyme inhibitory effects of different
extracts from one sage (Salvia ceratophylla L.) from Turkey: open a new window on industrial
purposes. RSC Adv., 11: 5295.

Vallverdú-Queralt A., Boix N., Piqué E., Gómez-Catalan J., Medina-Remon A., Sasot G.,
Mercader-Martí M., Llobet M.J., Lamuela-Raventos M.R. (2015). Identification of phenolic
compounds in red wine extract samples and zebrafish embryos by HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap-
MS. Food Chemistry 181: 146-151.

Vargaa M., Jójárt R., Fónad, P., Mihály R., Palágyi A. (2018). Phenolic composition and
antioxidant activity of colored oats. Food Chem., 268: 153-161.

Venkateswarlu K. (2012). Vitex negundo : Medicinal Values, Biological Activities, Toxicity

Studies and Phytopharmacological Actions. International Journal of Pharmaceutical and
Phytopharmacological Research, 2(2) : 126-133.

Vergne P., Bertin P., Trèves R. (2000). Aspirine, douleur et inflammation. Rev. Méd. Interne,
21(1) : 89-96.

Vial T. (2001). Pharmacologie des anti-inflammatoires non stéroïdiens. In. Aspirine et AINS :
intolérance et allergie. Montrouge, France : John Libbey Eurotext : 55-60.

Vokáč K., Budĕšǐnskў M., Harmatha J. (2002). Minor Ecdysteroid Components of Leuzea
carthamoides. Collect. Czechoslov. Chem. Commun, 67 : 124-139.

Vrvic M.M., Griensven L.V. (2015). Antioxidants of Edible Mushrooms. Molecules, 20:19489-
19525.

238
Wang L., Liu S., Xing J., Liu Z., Song F. (2016). Characterization of interaction property of
multi-components in Gardenia jasminoides with aldose reductase by microdialysis combined
with liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Rapid Communications in Mass
Spectrometry, 30 (Suppl. 1): 87-94.

Wang Y.-H., Avula B., Jadhav N.A., Smillie J.T., Khan A.I. (2008). Structural characterization
and identification of ecdysteroids from Sida rhombifolia L. in positive electrospray ionization
by tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom; 22: 2413-2422.

Webster E.O., He T., Chen S.-N., Pauli F.G., Farnsworth R.N., Wang Z.J. (2011). Opioidergic
mechanisms underlying the actions of Vitex agnus-castus L. Biochemical Pharmacology 81:
170-177.

Wiff en P.J., Mcquay H.J. (2007). Oral morphine for cancer pain. Cochrane Database Syst Rev.,
4 : CD003869.

Wolfe M.M., Lichtenstein D.R. et Singh G. (1999). Gastrointestinal toxicity of nonsteroidal

anti-inflammatory drugs. N Engl J Med., 340 (24) : 1888-99.

Wu J., Zhou T., Zhang D.-W., Zhang X.-H., Xuan L.-J. (2009). Cytotoxic Terpenoids from
the Fruits of Vitex trifolia L. Letter… Planta Med; 75: 367-370.

Xue G., Zhu M., Meng N., Guan J., Zhang J., Yang J., Wang Y., Cui Y., Chai X. (2021).
Integrating Study on Qualitative and Quantitative Characterization of the Major Constituents
in Shuanghuanglian Injection with UHPLC/Q-Orbitrap-MS and UPLC-PDA. Journal of
Analytical Methods in Chemistry, Article ID 9991363, 11p.

Yamasaki T., Kawabata T., Mosuaka C., Kinja J., Ikeda T., Nohara T., Ono M. (2008). Two
new lignan glucosides from the fruit of Vitex cannabifolia. J. Nat. Med., 62 : 47-51.

Yang L., Fang Y., Liu R., He J. (2020). Phytochemical Analysis, Anti-inflammatory, and
Antioxidant Activities of Dendropanax dentiger Roots. BioMed Research International, Article
ID 5084057, 13p.

Yao L.H., Jiang Y.M., Shi J., Tomas-barberan F.A., Datta N., Singanusong R., Chen S.S.
(2004). Flavonoids in food and their health benefits. Plant Foods for Human Nutrition, vol.
59(3) : 113-122.

Yimta F. (2017). Enquête ethnobotanique sur les plantes medicinales utilisees dans la region de
l’ouest Cameroun. Etude phytochimique et pharmacologique d’Afzelia africana J.E. Smith ex
Pers. Thèse de l’Université D’Aix- Marseille, Faculté de Pharmacie, 289 p.

Zhang X., Pi Z., Zheng Z., Liu Z., Song F. (2018). Comprehensive investigation of in-vivo
ingredients and action mechanism of iridoid extract from Gardeniae Fructus by liquid
chromatography combined with mass spectrometry, microdialysis sampling and network
pharmacology. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 1076: 70-76.

Zhao Y., Dong X., Wang Z., Dong R., Bu R., Feng Q., Xue P., Qu B. (2021). Applying Four-
Step Characteristic Ion Filtering with HPLC-Q-Exactive MS/MS Spectrometer Approach for
Rapid Compound Structures Characterization and Major Representative Components

239
Quantification in Modified Tabusen-2 Decoction. Hindawi Evidence-Based Complementary
and Alternative Medicine, Article ID 9255305, 20 p.

Zhishen T., Mengcheng T., Jianming W. (1999). The determination of flavonoid contents in
mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. J Food Chem, 64: 555.

Zhong B., Robinson A.N., Warner D.R., Barrow J.C., Dunshea R.F., Suleria Hafiz A.R., (2020).
LC-ESI-QTOF-MS/MS Characterization of Seaweed Phenolics and Their Antioxidant
Potential. Marine Drugs, 18: 331.

Zhuang X.P., Lu Y.Y., Yang G.S. (1992). Extraction and determination of flavonoid in ginkgo.
Chinese Herba, 23 :122-124.

Ziegle M. (1889). Lehrbuch der patholog. Anatomie, 6- édition, t.I, 186 p.

240
 ANNEXES

241
 Tableau 30. Récapitulatif des constituants majeurs des fractions de VMFE1

N° tR Composés FB M-H exp. M+H exp. E1-cyclo E2-DCM E3-AcOEt E4-BuOH E5-H2O
(min)
1 3,36 Acide gluconique C6H12O7 195,0493 - - - - +

2 3,84 Acide quinique C7H12O6 191,0551 - - - - +++

3 6,86 Acide citrique C6H8O7 191,0187 - - - - +

4 7,72 1-oxo-eucommiol C9H14O5 201,0757 - - - - ++

5 9,33 Acide 5-Ethylidene-2- C10H16O6 231,0866 - - ++

hydroxy-2-
hydroxyméthyl-3-
méthylhexanedioïque
6 11,38 Acide 3,4- C7H6O4 153,0179 - - + -
dihydroxybenzoïque
7 13,97 Acide p- C7H6O3 137,0228 - - + -
hydroxybenzoïque
8 14,67 Vicenine-1 C26H28O14 563,1402 - - - + +

9 14,71 Acide cafféïque C9H8O4 179,0339 - - + - -

10 15,09 Homoorientine C21H20O11 447,0933 - - - + +

11 15,87 Orientine C21H20O11 447,0928 - - + + +

242
12 17,82 Vitexine C21H20O10 431,0981 - - + + -

13 18,97 20-Hydroxyecdysone C27H44O7 525,3065 481,3152 + - ++ +++ ++

(H+COO)
14 19,57 5,7,3'-Trihydroxy- C20H20O10 419,098 - - + - -
3,6,8,4',5'-
pentaméthoxyflavone
15 22,23 Acide 1,5- C25H24O12 515,119 - - +++ + -
dicaffeoylquinique
16 23,67 Lutéolin-4-O-glucoside C21H20O11 447,0928 - - + + -

17 24,24 Isovitexirone C27H42O7 523,2906 479,2998 - - + + -

(H+COO)
18 24,56 Acide 3,4- C25H24O12 515,1188 - - + - -
dicaffeoylquinique
19 26,64 Vitexirone C27H42O7 523,2906 479,2998 - - + + -
(H+COO)
20 27,71 Pterostérone C27H44O7 525,3065 481,3152 - - + + -
(H+COO)
21 30,74 Acide feruloyl C26H26O12 529,134 - - + - -
caffeoylquinique
22 32,55 Ajugastérone C C27H44O7 525,3065 481,3152 - - ++ + -
(H+COO)
23 37,85 Néobignonoside C28H24O13 567,1138 - - + - -

243
24 39,89 Isorhamnétine C16H12O7 315,0508 - - + - -

25 38,46 Lutéoline C15H10O6 285,0405 + - +++ - -

26 40,98 Chrysosplénol D C18H16O8 359,0764 + ++ + - -

27 41,31 3-O-méthylkaempférol C16H12O6 299,0556 - ++ + - -

28 43,17 Acide 17- C18H30O3 293,2123 + - - - -

Hydroxylinolénique
29 44,06 Acide octadécanedioïque C22H44O9 451,2918 + - - - -
3,3,16,16-tétraméthyl-
30 44,22 Acide 16- C16H32O3 271,2278 + - - - -
Hydroxyhexadécanoïque
- : absence du composé, + : présence du composé ; ++ : composé abondant ; +++ : composé très abondant

244
 Tableau 31. : Résultats des tests de production de ROS à 2 h (VMFE1) Tableau 32. Résultats des tests de production de ROS à 2 h (VMFE2)

% de prod ROS - VMFE1 % de prod ROS- VMFE2

N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL N Témoin 10 µg/mL 25 µgmL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 61,8596 50,8265 54,2875 52,0045 1 100 69 54 41 36
2 100 87,5747 78,1417 42,5552 33,0821 2 100 77 59 40 34
3 100 70,5518 36,2158 41,8881 40,0019 3 100 78 53 41 31
Moyenne 100 73,329 55,061 46,244 41,696 Moyenne 100 77 56 41 32
SEM 0 8,552 12,287 4,027 5,528 SME 0 5 3 1 3
Test T 0,05166339 0,0129592 0,00556378 0,00886929 Test T 0,01161184 0,00128296 0,00002524 0,00057815

Tableau 33. Résultats de viabilité cellulaire à 24 h (VMFE1) Tableau 34. Résultats de viabilité cellulaire à 24h (VMFE2)
% de viabilité cellulaire- % de viabilité cellulaire-
VMFE1 VMFE2
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 111,646 163,311 71,672 92,419 1 100 85 62 64 47
2 100 104,513 86,247 91,107 94,681 2 100 92 81 76 57
3 100 87,128 121,937 125,343 125,329 3 100 106 98 77 77
4 100 109,198 93,996 107,113 98,288 Moyenne 100 94 80 72 60
Moyenne 100 103,121 116,373 98,809 102,679 SEM 0 11 18 8 15
SEM 0 5,533 17,422 11,434 7,646 Test T 0,45832657 0,19851361 0,07444726 0,04481016
Test T 0,612 0,417 0,924 0,749

245
 Tableau 35. Résultats production de ROS à 2h (VMET1)
Tableau 36. Résultats production de ROS à 2 h (VMET2)
% de prod % de prod
ROS- ROS- VMET2
VMET1
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 68 51 40 31
1 100 99,8271 93,8509 66,0017 53,7242
2 100 134,4913 92,8586 74,1227 68,6631 2 100 72 54 46 45
3 100 94,2488 79,9624 56,2716 56,5639 3 100 79 53 38 32
4 100 141,8920 113,4908 56,8034 54,2839 Moyenne 100 73 52 41 36
Moyenne 100 117,615 95,041 63,300 58,309 SEM 0 5 2 4 7
ESM 0 12,030 6,916 4,243 3,506 Test T 0,01352656 0,00038668 0,00156705 0,00455035
Test T 0,23933699 0,52510292 0,00325062 0,00127848
Tableau 37. Résultats viabilité cellulaire à 24 h (VMET1) Tableau 38. Résultats viabilité cellulaire à 24 h (VMET2)
% de viabilité % de viabilité
cellulaire-VMET1 cellulaire-VMET2
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 162,942 90,226 87,040 90,035
1 100 100 101 93 64
2 100 96,708 56,533 50,642 102,634
2 100 113 109 97 82
3 100 84,754 89,134 90,764 147,204
3 100 77 70 51 42
4 100 103,92 100,213 94,117 80,304
Moyenne 100 96 93 80 63
Moyenne 100 112,081 84,027 80,641 105,044
SEM 0 18 20 25 20
ESM 0 10,822 9,497 10,103 14,778
Test T 0,49921165 0,63599476 0,31004030 0,08493366
Test T 0,700 0,608 0,151 0,755

246
 Tableau 39. Résultats production de ROS à 2 h (VMRA1) Tableau 40. Résultats production de ROS à 2 h (VMFR1)
% de prod % de prod
ROS- VMRA1 ROS-VMFR1
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 69,6553 54,9146 44,5984 31,7256 1 100 76,0931 63,8851 44,8127 33,5224
2 100 110,3874 81,3876 78,0622 60,9688 2 100 153,9371 109,5337 68,7543 76,5306
3 100 158,9799 173,0984 155,4471 125,8704 3 100 109,1332 105,8778 99,8770 48,4246
Moyenne 100 113,008 103,134 92,703 72,855 4 100 110,1332 97,377 116,3423 69,3650
ESM 0 25,819 35,807 32,826 27,819 Moyenne 100 113,054 93,099 82,447 52,826
Test T 0,66441975 0,93823879 0,84471175 0,432094 ESM 0 22,557 14,645 15,941 9,828
Test T 0,62125986 0,68387854 0,2120144 0,02459598
Tableau 41. Résultats viabilité cellulaire à 24 h (VMRA1)
% de viabilité Tableau 42. Résultats viabilité cellulaire à 24 h (VMFR1)
% de viabilité
cellulaire-VMRA1 cellulaire-VMFR1
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 141,2792 100,5948 116,9093 66,0627 1 100 101,2924 100,4592 83,7787 155,6118
2 100 89,3092 57,4981 69,3629 61,4288 2 100 86,4760 103,9056 72,3841 82,0324
3 100 75,5857 81,0501 61,3868 62,7269 3 100 65,5295 106,4417 87,2314 83,0554
Moyenne 100 102,058 79,714 82,553 63,406 Moyenne 100 84,433 103,602 81,131 106,900
ESM 0 20,007 12,459 17,332 1,380 ESM 0 10,374 1,734 4,486 24,358
Test T 0,927 0,245 0,420 0,001 Test T 0,272 0,173 0,062 0,804

247
 Tableau 44. Résultats production de ROS à 2 h (CFET1)
Tableau 43. Résultats production de ROS à 2 h (CFFE1)
% de prod % de prod
ROS-CFFE1 ROS-CFET1
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 71,4958 36,2692 80,7122 64,9785 1 100 92,2626 91,410 68,6886 67,0791
2 100 90,3619 79,0240 84,6734 106,2349 2 100 90,5366 94,0585 131,9649 149,8786
3 100 97,0945 104,3081 108,5282 109,6351 3 100 95,5789 89,5397 117,935 131,9334
4 100 125,2074 111,9859 97,2136 101,6390 Moyenne 100 92,7927 91,6694 106,1965 116,2970
Moyenne 100 96,0399 82,8968 92,7818 95,62193 ESM 0 1,4795 1,3108 19,1862 25,1483
ESM 0 11,1299 17,0629 6,3180 10,34501 Test T 0,0396 0,0238 0,7773 0,5834
Test T 0,7455 0,3900 0,3361 0,7006
Tableau 46. Résultats production de ROS à 2 h (CFFR1)
Tableau 45. Résultats production de ROS à 2 h (CFRA1)
% de prod % de prod
ROS-CFFR1
ROS-CFRA1
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 132,2478 127,7663 88,2034 57,950
1 100 60,4930 78,6202 50,6051 50,7364
2 100 113,7516 100,6122 45,6578 59,8545
2 100 128,7783 112,5144 106,3645 122,9486
3 100 95,5878 89,9243 61,5244 61,5467
3 100 117,5182 69,2910 98,1961 131,2437
4 100 124,6194 104,3323 72,2138 51,0034
4 100 105,0161 139,34236 117,1334 170,0799
Moyenne 100 116,5516 105,6588 66,8999 57,5887
Moyenne 100 102,9514 99,9420 93,0748 118,7521
ESM 0 7,9518 7,9767 8,9544 2,3147
ESM 0 14,9616 16,0845 14,6780 24,8903
Test T 0,1288 0,5292 0,0344 0,0003
Test T 0,8562 0,9973 0,6692 0,5059

248
 Tableau 47. Résultats production de ROS à 2 h (CFFR2) Tableau 48. Résultats viabilité cellulaire à 24 h (CFFE1)

% de prod % de viabilit2
cellulaire-CFFE1
ROS- CFFR2
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 5 0µg/mL 100µg/mL
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 104,129 90,910 74,524 45,196
1 100 74 58 45 31
2 100 86,821 62,339 64,683 18,167
2 100 73 56 46 33
3 100 55,066 63,687 66,632 37,985
3 100 80 64 52 33
4 100 139,104 125,724 68,411
Moyenne 100 76 60 48 32
Moyenne 100 96,280 85,665 68,613 42,440
SEM 0 4 4 3 1
SEM 0 17,520 14,887 3,009 10,373
Test T 0,00855139 0,00380773 0,00142979 0,00014634

Tableau 49. Résultats viabilité cellulaire à 24 h (CFET1) Tableau 50. Résultats viabilité cellulaire à 24 h (CFRA1)
% de viabilité % de viabilité
cellulaire-CFET1 cellulaire-CFRA1
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 117,677 58,560 64,576 49,169 1 100 60,094 91,870 60,100 51,111
2 100 97,608 95,555 39,827 18,332 2 100 73,095 73,095 117,158 151,202
3 100 152,335 109,181 42,719 45,503 3 100 89,823 117,158 104,713 55,813
Moyenne 100 122,540 87,765 49,041 37,668 4 100 64,638 90,170 108,534 154,750
SEM 0 15,984 15,123 7,813 9,726 Moyenne 100 71,912 93,073 97,626 103,219
Test T 0,294 0,503 0,023 0,023 SEM 0 6,550 9,079 12,777 28,752
Test T

249
 Tableau 51. Résultats viabilité cellulaire (CFFR2) à 24 h Tableau 52. Résultats viabilité cellulaire à 24 h (CFFR1)
% de viabilité % de viabilité
cellulaire-CFFR2 cellulaire-CFFR1
N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL N Témoin 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL
1 100 77 68 39 28 1 100 187,2522 161,8774 151,9170 167,1405
2 100 84 60 46 31 2 100 158,6644 89,5965 258,0662 168,6677
3 100 105 64 66 43 3 100 109,3044 137,7272 103,8852 119,3404
Moyenne 100 89 64 51 34 4 100 101,1428 104,8132 103,6096 101,4429
SEM 0 14 4 14 8 Moyenne 100 139,091 123,504 154,370 139,148
Test T 0,30208858 0,00318213 0,02521410 0,00480311 SEM 0 20,473 16,263 36,383 17,002
Test T 0,1522224 0,24415633 0,23193566 0,10474955

250
Annexe : Spectres RMN des composés isolés

MeOH

251
1
Figure 90. Spectre RMN H (400 MHz, MeOD) de la 20-hydroxyecdysone
 MeOH

252
Figure 91. Spectre RMN 13C (400 MHz, MeOD) de la 20-hydroxyecdysone
 MeOH

253
Figure 92. Spectre RMN H (400 MHz, MeOD) de l’ajugastérone C
1
 MeOH

Figure 93. Spectre RMN 13C (400 MHz, MeOD) de l’ajugastérone C 254
 MeOH

Figure 94. Spectre RMN 1H (400 MHz, MeOD) de la vitexirone 255

 MeOH

256
Figure 95. Spectre RMN 13C (400 MHz, MeOD) de la vitexirone
 MeOH

257
1
Figure 96. Spectre RMN H (400 MHz, MeOD) de la pterostérone
 MeOH

Figure 97. Spectre RMN 13C (400 MHz, MeOD) de la pterostérone 258
 Résumé

Cette thèse s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche portant sur l’étude phytochimique de plantes
médicinales utilisées dans la pharmacopée traditionnelle congolaise pour le traitement des maladies inflammatoires. Elle
a été réalisée grâce à la collaboration entre le laboratoire de Chimie des Substances Naturelles de l’Institut National de
Recherches en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) et de l’Université Marien Ngouabi du Congo Brazzaville et
l’équipe Chimie Organique et Médicinale (COM) de l’Institut de Chimie de Clermont-Ferrand (ICCF), Université
Clermont Auvergne, France.
Lors de nos travaux nous avons étudié des extraits méthanoliques de Vitex madiensis Oliv. (Lamiaceae) et de
Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G. Don) Benth. (Rubiaceae), deux plantes utilisées en médecine traditionnelle au
Congo Brazzaville. Nous avons réalisé une étude du profil chimique des extraits méthanoliques issus de différents
organes (feuilles, écorce de tronc, écorce de racine et fruits) récoltés en saison sèche et en saison des pluies. La
comparaison des profils phytochimiques nous a permis de confirmer l’hétérogénéité de composition des différents
organes mais une relative similarité des extraits obtenus en saison sèche et en saison des pluies pour un même organe.
L’évaluation de l’activité antiradicalaire (dpph) et antioxydante (ROS) a révélé que l’extrait le plus actif concernant
Vitex madiensis était celui obtenu à partir des feuilles. Cette activité a pu être reliée à une famille de composés chimique
marqueurs du genre Vitex : les phytoecdystéroïdes. Plusieurs d’entre eux ont été isolés et identifiés, dont la 20-
hydroxyecdysone, dont l’activité anti-inflammatoire, très prometteuse, a été évaluée. Cette classe de composés
semblerait donc posséder des activités anti-inflammatoires intéressantes et pourrait expliquer l’usage traditionnel de
cette plante. Les extraits de Crossopteryx febrifuga ont démontré une activité moindre que ceux de Vitex madiensis.
Seul l’extrait des fruits semblerait présenter une activité antioxydante intéressante.
Mots-clés : Vitex madiensis, Crossopteryx febrifuga, activité antioxydante et anti-inflammatoire, phytoecdystéroïdes,
profils phytochimiques.

Abstract

This work is part of a research program focused on the phytochemical study of medicinal plants used by traditional
healers in Congo Brazzaville for the treatment of inflammatory diseases. This programm was carried out thanks to the
collaboration between the laboratory of Chemistry of Natural Substances (National Institute for Research in Exact and
Natural Sciences, Marien Ngouabi University of Congo Brazzaville) and the Organic and Medicinal Chemistry team
from the Institute of Chemistry of Clermont-Ferrand (ICCF, Clermont Auvergne University, France).
We have studied methanolic extracts of Vitex madiensis Oliv. (Lamiaceae) and Crossopteryx febrifuga (Afzel ex G.
Don) Benth. (Rubiaceae), two plants used in traditional medicine in Congo Brazzaville. We have carried out a study of
the chemical profile of methanolic extracts from different organs (leaves, trunk bark, root bark and fruits) harvested in
the dry season and in the rainy season. The comparison of the phytochemical profiles allowed us to confirm the
heterogeneity of composition of the different organs but a relative similarity of the extracts obtained in the dry season
and in the rainy season for the same organ. The evaluation of the antiradical (dpph) and antioxidant (ROS) activities
revealed that the most active extract concerning Vitex madiensis was the ones obtained from the leaves. This activity
could be linked to a family of compounds specific of the genus Vitex : the phytoecdysteroids. Among them several have
been isolated and identified, including 20-hydroxyecdysone, whith very promising anti-inflammatory activity has been
evaluated. This class of compounds would therefore seem to have interesting anti-inflammatory activities and could
explain the traditional use of this plant. Extracts of Crossopteryx febrifuga demonstrated less activities than those of
Vitex madiensis. Only the fruit extract seems to present an interesting antioxidant activity.
Key words : Vitex madiensis, Crossopteryx febrifuga, antioxidant and anti-inflammatory activity, phytoecdysteroids,
phytochemical profile.