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UNIVERSIT MONTPELLIER 2

LABORATOIRE CHARLES COULOMB


THSE
pour obtenir le titre de
DOCTEUR DE LUNIVERSIT MONTPELLIER 2
Discipline : Physique
Prsente par
Etienne Loiseau

APPROCHE BIOMIMTIQUE DE LA
VASO-OCCLUSION
DANS LA DRPANOCYTOSE :
PRODUCTION DE VSICULES ET MICROFLUIDIQUE

Soutenue publiquement le 9 dcembre 2011 devant le jury compos de


Mme. Patricia Bassereau Rapporteur
M. Damien Baigl Rapporteur
M. Jrome Bibette Examinateur
M. Jean Louis Viovy Prsident du jury
M. Vladimir Lorman Directeur de thse
Mme. Gladys Massiera Co-Directrice de thse
M. Manouk Abkarian Co-Directeur de thse
ii
iii
Remerciements
Je tiens remercier les directeurs successifs qui mont acceuillis au sein de leur
laboratoire, Walter Kob et Jean Louis Sauvajol.
Je remercie galement mes directeurs de thse : Vladimir Lorman qui a suivit
toute ma scolarit depuis ma premire anne duniversit et qui ma donn lenvie
de persvrer dans ltude de la physique puis de me diriger vers une carrire de
chercheur ; Manouk Abkarian et Gladys Massiera qui ont encadr mon travail de
thse tout au long de ces trois annes. Manouk pour ta passion communicative
et ton enthousiasme rsistant toutes preuves, parfois excessif mais tellement
motivant et moteur ! Gladys, merci pour ton suivi au quotidient, je sais que a na
pas toujours t vident mais tu as toujours t prsente et je ten suis grandement
reconnaissant.
Merci tous les deux pour les discussions scientiques enrichissantes, de mavoir
envoy en confrences et en cole dt, chaque fois jen suis revenu plus motiv.
Quand je regarde le chemin parcouru depuis ce mois de juillet 2008 lorsque vous
mavez con le dveloppement dune nouvelle mthode facile ;-) de fabrication
de vsicules, juste de quoi mamuser durant deux mois avant de mintresser
lanmie falciforme, je me rend compte de la chance que jai eu de travailler avec
vous. Finalement lamusement a dur un peu plus de deux ans et je ne le
regrette pas, tellement ce fut riche et passionant.
Merci Andrea Parmeggiani et Norbert Kern qui mont fait dcouvrir la bio-
physique durant mon stage de M1, et Miguel Manna et Serge Mora qui mont
encadr durant mon stage de M2, ils mont conrm dans mon choix de poursuivre
en thse.
Merci au Docteur Patricia Aguilar Martinez du laboratoire dhmatologie de
lhopital Saint Eloi ainsi qu toute son quipe de technicien(e)s qui mont mis
de ct les chantillons sanguins correspondant mes exigences pour aborder le
problme de lanmie falciforme.
Merci toutes les personnes qui mont facilit le quotidien dans le laboratoire :
toute lquipe administrative, les chimistes Raymond Aznard et Ty Phou ainsi que
les techniciens.
Merci aux amis kayakistes, les bons moments passs sur la rivire mont permis
de me ressourcer durant les weekends et les vacances.
iv
v
Rsum
Les vsicules sont des bicouches lipidiques refermes sur elles mme, sparant ainsi un
volume intrieur du milieu extrieur. Elles sont donc utilises dans de nombreuses appli-
cations ncessitant lencapsulation dune substance mais galement pour la construction
dobjets biomimtiques. Une nouvelle mthode simple, appele continuous Droplet Inter-
face Crossing Encapsulation (cDICE), a t dveloppe pour la fabrication de vsicules
de taille et de contenu nement contrls. Ainsi, des vsicules dans la gamme de taille
5-70 m de diamtre et encapsulant des solutions aussi varies que des collodes micro-
mtriques, protines, cellules, solutions visqueuses (40 mPas) ou solutions salines (>300
mosm), sont produites de faon continue et frquence leve ( 150 Hz). Des vsicules
drpanocytaires ont galement pu tre produites grace cette mthode.
La drpanocytose ou anmie falciforme est une maladie gntique dont la principale
consquence est la vaso-occlusion de la circulation sanguine. La conception de canaux
microuidiques se rapprochant au mieux des conditions physiologiques (vitesse dcou-
lement, concentration doxygne, hmatocrite...) de la microcirculation a permis une
approche biomimtique de la vaso-occlusion, mettant en vidence limportance de para-
mtres physiques tels que la gomtrie de lcoulement, le taux doxygne, la prsence de
globules blancs et lhmoglobine libre en solution sur la formation dagrgats cellulaires
qui pourraient jouer un rle dans la vaso-occlusion.
Mots cls : vsicules lipidiques gantes, cDICE, encapsulation, objets biomimtiques,
microuidique, drpanocytose, vaso-occlusion.
Title Biomimetic approach of sickle cell vaso-occlusion : production of vesicles and mi-
crouidics.
Abstract
Vesicles are spherical lipid bilayers which enclose an internal volume, there are
thus used in many applications such as encapsulation or design of biomimetic systems.
An original simple method called continuous Droplet Interface Crossing Encapsulation
(cDICE), have been developed to produce vesicles controlled in size and content. This
method allows the production of vesicles in the range 5-70 m in diameter with a high
eciency to encapsulate solutions as diverse as micrometric colloids, proteins, cells, vis-
cous solutions (40 mPas) or saline solutions (>300 mosm). Vesicles are then produced
continuously at high frequency ( 150 Hz). Furthermore, sickle vesicles have been
produced using this method.
Sickle cell anemia is a genetic disease which results in vaso-occlusive crisis of the
blood circulation. Microuidic channels designed to mimic physiological conditions (ow
velocity, oxygen concentration, hematocrit...) of the microcirculation were used to carry
out a biomimetic study at the cellular scale of sickle cell vaso-occlusion. This study has
shown that ow geometry, oxygen concentration, white blood cells and free hemoglobin
S are essential in the formation of cell aggregates which could play a role in the vaso-
occlusion event.
Keywords : giant vesicles, cDICE, encapsulation, biomimetic objects, microuidics, sickle
cell anemia, vaso-occlusion
vi
Table des matires
Introduction 1
I Mthode de fabrication de vsicules lipidiques gantes
par continuous Droplet Interface Crossing Encapsulation
(cDICE) 3
Introduction aux mthodes de production de vsicules 5
1 Vsicules lipidiques gantes 7
1.1 Mthodes par hydratation dun lm de lipide . . . . . . . . . . . . . 9
1.1.1 Gonement spontan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.1.2 Electroformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.1.3 Mthodes drives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2 Mthode de lmulsion inverse et transfert spontan . . . . . . . . . 11
1.3 Mthodes en microuidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.3.1 Jetting au travers dune bicouche prforme . . . . . . . . . 13
1.3.2 Double mulsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.3.3 Autres mthodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.4 Quelles techniques pour quelles applications ? Et aprs ? . . . . . . . 16
2 Mthodes exprimentales 17
2.1 Montage exprimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2 Dissolution des lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3 Prparation des capillaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.4 Mesure de tension de surface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4.1 Exprience de goutte pendante . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4.2 Analyse dimage pour dterminer la tension . . . . . . . . . 20
2.5 Dtermination des distributions de taille par analyse dimage . . . . 23
vii
viii TABLE DES MATIRES
3 cDICE 25
3.1 Principe de fonctionnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.2 Production des gouttelettes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2.1 Contrle de la taille . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2.2 Frquence de production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.3 Dispersion des lipides et lipides aux interfaces . . . . . . . . . . . . 32
3.3.1 Cintique dadsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.3.2 Dispersion des lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3.3 Couverture continue des interfaces . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.4 Passage de linterface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.4.1 Approche et zipping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.4.2 Dtachement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.5 Caractristiques des vsicules produites par cDICE . . . . . . . . . 45
3.5.1 Distribution de taille des vsicules . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.5.2 Encapsulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.5.3 Proprits de la membrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
II Une approche microuidique de la drpanocytose :
tude de la vaso-occlusion 53
Introduction une maladie gntique du sang : la drpanocytose 55
4 Hmoglobine S et tudes sur des cellules 59
4.1 Pathophysiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.2 Structure molculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.2.1 La molcule dhmoglobine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.2.2 Structure du polymre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.3 Etudes en solution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.3.1 Solubilit de lhmoglobine S . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.3.2 Cintique de polymrisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4 Etudes sur des cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.4.1 Gnralits sur le sang et la microcirculation sanguine . . . . 80
4.4.2 Morphologie des globules rouges drpanocytaires . . . . . . . 82
4.4.3 Proprits physiques des globules rouges drpanocytaires . . 86
4.4.4 Vaso-occlusion : scnarios proposs . . . . . . . . . . . . . . 91
5 Techniques exprimentales 95
5.1 Echantillons sanguins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
5.2 Purication de lhmoglobine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
TABLE DES MATIRES ix
5.3 Tri des globules par densit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.4 Microuidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
5.4.1 Gnralits propos de la lithographie . . . . . . . . . . . . 98
5.4.2 Construction des canaux en rsine photosensible . . . . . . . 100
5.4.3 Construction des canaux en PDMS . . . . . . . . . . . . . . 102
5.4.4 Dsoxygnation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
6 approche microuidique 105
6.1 Dispositif exprimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
6.2 Forme des globules rouges drpanocytaires sous coulement . . . . . 107
6.3 Formation dagrgats cellulaires dans des canaux microuidiques . . 108
6.3.1 Globules rouges drpanocytaires sous coulement . . . . . . 110
6.3.2 Rle de lhmoglobine S libre en solution . . . . . . . . . . . 110
6.3.3 Rle des globules blancs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
6.4 Vaso-occlusion ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
6.4.1 Vaso-occlusion et dsobstruction . . . . . . . . . . . . . . . . 115
6.4.2 La vaso-occlusion : une obstruction strique ? . . . . . . . . 117
6.4.3 Adhsion des globules drpanocytaires . . . . . . . . . . . . 117
6.4.4 Agrgats cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
6.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Conclusions et perspectives 123
Appendices
A rgime de Taylor 127
A.1 Gomtrie du problme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
A.2 Champs des vitesse et de pression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
A.3 Force rsistive exerce sur la sphre . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
A.4 Calcul de la vitesse en rgime de Taylor . . . . . . . . . . . . . . . . 130
B Dispersion des lipides 131
B.1 Contrle de lhumidit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
B.2 Dissolution des lipides dans le chloroforme mthanol . . . . . . . . . 131
B.3 Prparation de la LOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
B.3.1 Formation du lm de lipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
B.3.2 Dispersion dans lhuile minrale . . . . . . . . . . . . . . . . 132
Liste des abrviations 133
x TABLE DES MATIRES
Introduction
Cette thse comporte deux parties dcrivant respectivement la production de
vsicules par un procd original, et une approche microuidique de la drpanocy-
tose. Ces deux parties de la thse constituent en fait les deux voies que nous avons
choisi pour ltude de la vaso-occlusion par une approche biomimtique.
Lanmie falciforme ou drpanocytose est une maladie gntique de la micro-
circulation sanguine, qui touche environ cinquante millions de personnes de par
le monde, principalement sur le continent Africain, en Inde et au Moyen-Orient.
Les symptmes de la maladie se caractrisent par des crises anmiques qui se
traduisent par dintenses douleurs chroniques chez les patients et localises prin-
cipalement dans les extrmits des membres, la poitrine ou labdomen. Ces crises
sont en partie provoques par lobstruction de la circulation sanguine au niveau
de la microcirculation, on parle alors de vaso-occlusion.
Malgr un corpus rigoureux dexpriences qui ont fourni une comprhension
approfondie des mcanismes de polymrisation de lHbS lchelle molculaire
(revue dans [1]) et une comprhension plus approfondie des symptmes associs
aux pathologies mdicales de lanmie falciforme [2], la relation qui existe entre
ces deux chelles reste encore incertaine voire indtermine et peu explore. Il
manque en eet une comprhension claire des phnomnes qui ont lieu lchelle
msoscopique de la cellule en coulement.
La premire approche est de produire des objets biomimtiques ou globules
rouges articiels partir de vsicules, avec pour exigences dencapsuler lhmo-
globine S (HbS) des concentrations physiologiques dans des vsicules de taille
contrle proche de celle des globules rouges. La production de ces globules arti-
ciels a pour but de comparer leur comportement sous coulement celui des glo-
bules drpanocytaires, dune part, mais aussi dapprhender le rle des contraintes
lastiques et de connement sur la cintique de polymrisation de lHbS, ainsi
que les ventuelles interactions avec la membrane. Nous avons donc propos et
dvelopp une technique originale de fabrication de vsicules appele cDICE pour
continuous Droplet Interface Crossing Encapsulation, que nous prsenterons en
dtail dans la premire partie. Ce procd a prsent des challenges techniques et
des enjeux auxquels nous avons choisi de ddier une grande partie de cette thse.
1
La deuxime voie de recherche a consist en lutilisation des techniques de mi-
crouidiques pour approfondir la comprhension des phnomnes pouvant mener
la vaso-occlusion. De faon cohrente avec les rsultats connus sur la cintique
de polymrisation, nous avons conu des microcoulements qui nous permettent
de contrler la concentration dHbS et la pression partielle en oxygne, nous rap-
prochant ainsi des conditions physiologiques. Nous prsenterons les rsultats de ce
travail dans la seconde partie de ce manuscrit.
Premire partie
Mthode de fabrication de
vsicules lipidiques gantes par
continuous Droplet Interface
Crossing Encapsulation (cDICE)
3
Introduction aux mthodes de
production de vsicules
Une vsicule est une membrane referme sur elle mme, sparant ainsi un vo-
lume intrieur du milieu extrieur. Les lipides constituant les membranes biolo-
giques sont des molcules amphiphiles qui sassemblent en bicouche lintrieur
de laquelle les chaines aliphatiques hydrophobes se font face et les ttes polaires
hydrophiles sont en contact avec les milieux aqueux interne et externe.
Le travail de cette thse sur les vsicules est motiv par ltude de la drpano-
cytose, une maladie gntique aectant la circulation sanguine, qui sera prsent
dans la deuxime partie de ce manuscrit. Lapproche choisie est dutiliser les v-
sicules commme globules rouges modles. Les contraintes de fabrication tant un
contrle sur la taille et sur le contenu avec un haut rendement de production.
Lintrt pour la fabrication de substitut sanguin pour le transport de loxygne
par exemple [3] est fort, cependant, les techniques actuelles ne permettent pas
datteindre les tailles de vsicules qui nous intressent.
Lintrt et les fonctions dobjets tels que les vsicules est vaste. La comparti-
mentalisation a t une tape primordiale dans lvolution et la complexication
des organismes cellulaires, le recours aux vsicules comme moyen de transport in-
tra et inter-cellulaire fait partie de ce processus. Cest donc assez naturellement
que les vsicules sont utilises comme vecteur pour dlivrer in vivo des substances
actives ; de la simple molcule jusquaux cellules souches [46], des applications
cliniques sont dj oprationnelles. Plus gnralement, la capacit dencapsula-
tion entre dans un large champ dapplications [7, 8] : encapsulation de saveurs,
de complments alimentaires, agents antimicrobiens, pesticides... Les industriels
de la cosmtique, de lagroalimentaire ou encore de la chimie trouvent un moyen
avec les vsicules de protger un produit du milieu extrieur (incompatibilit chi-
mique, prvention de lvaporation, protection dun produit cher) et de contrler
son relargage (permabilit).
Dun point de vue plus fondamental les vsicules gantes unilamellaires, de
part leur tendue en tailles (1-100 m) qui couvre lensemble des tailles des cel-
lules biologiques, font dexcellentes candidates pour la construction dobjets biomi-
5
6
mtiques. De tels systmes modles permettent une meilleure comprhension des
membranes biologiques : proprits mcaniques, formation de domaines [9, 10] et
compositions htrognes, formes et stabilit [11] (pour une liste plus exhaustive
voir Peter Walde et al. [12] ). Par ailleurs, un champ dapplication trs novateur
est celui de la biologie synthtique avec la promesse daller plus avant dans la
comprhension de lorigine de la vie [13] ; cependant la conception et llaboration
de systmes articiels comportant les fonctions minimales dun organisme vi-
vant reprsente un vritable challenge tant intellectuel que technique encore loin
dtre rsolu. Une premire tape a t franchie cette dernire dcennie avec la pre-
mire dmonstration par Nomura et al. [14] de lexpression dune protine (rsGFP)
dans des vsicules gantes. Noireaux et Libchaber [15] ont amlior la technique
et maintiennent durant plusieurs jours la production de GFP grce lexpression
simultane de la GFP et de lalpha-hmolysine qui permet lapport extrieur des
nutriments ncessaires. La reconstruction du cytosquelette dans des vsicules [16
18] est trs intressante du point de vue systme modle pour ltude de la motilit
cellulaire, des proprits mcaniques, elle sera de plus trs certainement une des
pices pour la construction de cellules minimales.
Chapitre 1
Mthodes de fabrication de
vsicules lipidiques gantes
Les mthodes de production de vsicules sont nombreuses. On peut distinguer
principalement quatre types dapproches direntes : par hydratation dun lm
de lipides [1921], partir dune mulsion deau dans lhuile stabilise par une
monocouche de lipides [22, 23], partir de double mulsions stabilises [24] ou
la formation partir dune bicouche dj forme [2527]. Historiquement les pre-
mires descriptions de fabrication de vsicules par hydratation dun lm de lipides
sont faites par Bangham et al. en 1965 [19] et par Reeves et al. en 1969 [20]. Dans la
littrature, on les trouve indiremment sous le nom de gonement naturel ou
gonement spontan . En 1986, Angelova et Dimitrov [21] amliorent sensible-
ment cette mthode et inventent llectroformation, une hydratation contrle
par un champ lectrique externe. Le principal avantage de ces mthodes est la fa-
cilit de mise en oeuvre. Par contre, elles ne permettent pas un contrle de la taille
et sont assez inecaces pour des applications dencapsulation. Plus rcemment, les
techniques bases sur le passage une interface huile-eau dune mulsion stabilise
sont rapportes par Pautot et al. en 2003 [22] et par Yamada et al.[23] en 2006.
Ici, lencapsulation est ecace, le travail en conditions physiologiques est possible
ainsi que la fabrication de vsicules feuillets assymtriques [28]. En revanche, la
taille nest pas contrle et le rendement est faible. Avec le dveloppement de la
microuidique, plusieurs techniques ont vu le jour : methode dite du jetting par
Funakoshi et al. en 2007 [26] et Stachowiak et al. en 2008 [25] et la mthode de la
double mulsion par Shum et al. en 2008 [24]. Toutes ces techniques permettent la
production de vsicules monodisperses o lencapsulation est ecace mais le rende-
ment est faible et les rsidus de solvant organique dans la membrane peuvent tre
importants. Enn, la stabilit de ces vsicules peut tre remise en cause (vsicules
tendues).
Nous rappelons dans ce chapitre avec plus de dtails lensemble de ces tech-
7
8 CHAPITRE 1. VSICULES LIPIDIQUES GANTES
niques an dintroduire la mthode que nous avons dvelopp et expliquer en quoi
elle constitue une avance par rapport aux mthodes existantes.
E(t)
vaporation du
solvant
hy
d
r
a
t
a
t
i
o
n
z
i
p
p
i
n
g


u
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m
i
c
r
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f
l
u
id
iq
u
e




j
e
t
t
i
n
g
T=37C
gonflement spontan
lectroformation
double mulsion+vaporation
"jetting" au travers
d'une membrane
"zipping" par passage
d'interface
Fig. 1.1: Principales mthodes de fabrication de vsicules. a. Gonement spon-
tan : le lm de lipide rhydrat gone pour former des vsicules qui restent lies
au substrat par un tube lipidique [20]. b. Electroformation : la croissance des v-
sicules est contrle par un champ lectrique alternatif externe [21]. c. Emulsion
inverse : passage forc dune interface huile-eau par centrifugation dune mulsion
deau dans lhuile stabilise par des lipides [22] et [23]. d. Double mulsion deau
dans huile dans leau fabrique par technique microuidique. Les vsicules sont
obtenues aprs vaporation du solvant [24]. e. Microjet puls contre une bicouche
dj forme [26] et [25] .
1.1. MTHODES PAR HYDRATATION DUN FILM DE LIPIDE 9
1.1 Mthodes par hydratation dun lm de lipide
1.1.1 Gonement spontan
Ds 1965, Bangham et al. utilisent des vsicules obtenues par gonement spon-
tan pour ltude de la diusion dions travers les membranes [19]. Cependant,
la premire tude complte dcrivant la prparation de telles vsicules ainsi que
leur caractrisation est mene par Reeves et Dowben [20] en 1969.
La prparation est simple, dans une bouteille en verre, une solution de lipides
dissous dans un mlange chloroforme-mthanol est vapore sous un ux dazote
rsultant en un lm de lipide sur la surface de verre. Une solution aqueuse est alors
verse sur le lm et le tout est laiss au repos pendant plusieurs heures 37

C. Au
cours du temps, le lm de lipide hydrat gone et donne naissance des structures
lipidiques dont des vsicules ( gure 1.1 a). Les vsicules ainsi obtenues ont des
tailles comprises principalement entre 0.5 et 10 m, certaines sont multilamellaires
et les plus grosses ont tendance renfermer de plus petites vsicules.
Facile mettre en uvre, cette mthode soure de nombreuses limitations ; la
taille nest pas contrle, il est dicile de travailler en conditions physiologiques,
lencapsulation est trs limite et le rendement est faible : peu de vsicules unila-
mellaires.
1.1.2 Electroformation
La mthode de llectroformation dveloppe par Angelova et Dimitrov en 1986
[21] permet grce lapplication dun champ lectrique extrieur de mieux contr-
ler la croissance des vsicules. Ici, le lm de lipide est form sur deux plaques
semiconductrices dITO (Indium Tin Oxyde) agences face face et espaces de 1
2 mm. Une fois ltanchit entre les deux plaques eectue, la chambre dlec-
troformation ainsi forme est remplie avec la solution aqueuse que lon souhaite
encapsuler. On applique alors une tension alternative (10 Hz) aux bornes des deux
plaques, dont on augmente graduellement lamplitude (de 0,1 2 V) tout au long
de la croisssance des vsicules sur plusieurs heures (gure 1.1b).
Dans le lm hydrat, les lipides sauto-arrangent en bicouches superposes.
Au dbut de la formation, on observe sur les plaques des domaines comportant
des milliers de vsicules micromtriques. Puis, sous leet de lagitation lectro-
osmotique produite par la tension alternative, ces vsicules fusionnent entre elles.
Le processus de croissance se fait donc par fusions successives de vsicules de plus
en plus grosses au fur et mesure que lintensit du champ augmente. Les vsicules
sont toujours relies au lm par un tube lipidique.
Contrairement au gonement spontan, les vsicules lectroformes peuvent
atteindre des tailles de plus de 100 m et le rendement est important. De plus
10 CHAPITRE 1. VSICULES LIPIDIQUES GANTES
les vsicules obtenues sont en trs grande majorit unilamellaires [29] et sans d-
faut membranaire. Par contre, la taille nest pas contrle. Il nest pas possible de
travailler en condition physiologique
1
et, de part le processus mme dhydratation
dun lm de lipide, lencapsulation est inecace car elle implique que les mol-
cules passent au travers de pores, ce qui rduit la probabilit dencapsulation de
macromolcules.
1.1.3 Mthodes drives
Vsicules en conditions physiologiques
Lutilisation des vsicules comme systme modle de membranes biologiques est
une motivation forte pour former des vsicules en solution physiologique (milieu
fortement salin). En eet, des processus comme linteraction lectrostatique entre
membrane et protine, la fusion de vsicules ou encore les proprits de conduc-
tance de canaux ioniques sont dpendants de la force ionique du milieu. Plusieurs
pistes ont ainsi t dveloppes pour lever cette limitation. La technique propose
par Horger et al. [30] consiste en un gonement spontan ralis sur un lm daga-
rose. Le principe serait le suivant : la prhydratation du lm de lipide due au lm
dagarose permet lauto-organisation des lipides en bicouches avant lajout de la
solution ionique ; puis le gonglement du lm dagarose gnre une force normale
aux bicouches, ce qui favorise la croissance des vsicules ; enn la forte densit de
vsicules serait responsable des fusions entre vsicules adjacentes.
Deux autres mthodes sont des modications de llectroformation. La pre-
mire propose par Estes et Mayer [31] est une lectroformation dans une chambre
ux ; la chambre dlectroformation est semblable celle dcrite prcdemment
mais avec une entre et une sortie permettant de changer continuellement le uide
lintrieur de la chambre. La croissance des vsicules se fait de faon analogue
une lectroformation classique, une fois la taille souhaite obtenue, la solution non
ionique est alors remplace progressivement par une solution saline physiologique.
Au cours de cet change, la solution ionique diuse lintrieur des vsicules par
les tubes lipidiques les rattachant au substrat. La deuxime mthode dcrite par
Pott et al. [32] modie plus en profondeur le protocole standard. La croissance des
vsicules ne se fait plus sur des plaques dITO mais sur des lectrodes de platine.
Le dpt de lipides sur les lectrodes se fait partir dune solution aqueuse concen-
tre en vsicules submicroniques (on parle de LUV) prpares par des techniques
usuelles (sonication, extrusion ...). Aprs vaporation, la chambre est remplie avec
une solution physiologique et mise sous tension. Compar une lectroformation
classique, le champ lectrique appliqu est plus fort et la frquence plus leve
1
Lorsque la tension est trop importante, ou bien la solution trop saline, un courant stablit
dans la chambre perturbant la formation des vsicules.
1.1. MULSION INVERSE ET TRANSFERT SPONTAN 11
pour prevenir la formation de courant dans la chambre (500 Hz contre 10 Hz habi-
tuellement). Il est noter que ce protocole permet aussi la formation de vsicules
gantes partir de dpts sur les lectrodes de globules rouges fantmes (globules
vids de leur hmoglobine) qui sous leet du champ fusionnent [33].
Contrle de la croissance, inuence sur la taille des vsicules
Un autre axe dinvestigation concerne ltude de linuence du substrat sur
lequel est form le lm de lipide et du contrle de lpaisseur de celui-ci. Estes et
al. [34], en talant par tournette une solution de lipides sur les plaques ITO ont
montr quune paisseur de lm dans la gamme 25-50 nm est optimale pour obtenir
une croissance homogne sur toute la surface des plaques. De plus, les vsicules
ainsi formes sont plus nombreuses et en majorit plus grandes que celles obtenues
par lectroformation classique. Toujours dans loptique de contrler lpaisseur et
lorganisation du lm de lipides, des expriences ont t menes sur linuence de
dirents traitements de surface sur des wafers de silicium [35] ; le dpt vitesse
xe sur des substrats composs dune structure de puits circulaires [36] permet
de contrler la vitesse dvaporation du solvant, inuant ainsi sur lorganisation
interne du lm. Ces tudes montrent que la gamme de tailles des vsicules obtenues
partir de ces dpts est plus troite que dans le cas du protocole standard.
1.2 Mthode de lmulsion inverse et transfert
spontan
La mthode dite de lmulsion inverse dveloppe par Pautot et al. en 2003
[22] est une ide lgante qui propose dans un premier temps la formation spare
de chaque feuillet de la bicouche, les vsicules obtenues rsultant de lassemblage
nal des deux monocouches (gure 1.1 c). La mise en uvre est simple, une mul-
sion deau dans lhuile stabilise par des lipides est prpare par sonication ou
vortex puis dpose dans un tube centrifuger sur une solution aqueuse crant
ainsi une seconde interface huile-eau recouverte son tour par les lipides. Ltape
nale consiste centrifuger le tout pendant quelques minutes ; les gouttelettes plus
denses que lhuile sdimentent et au passage de linterface les deux monocouches
sassemblent ( zippent ) pour former une bicouche se refermant sur elle mme.
Sous leet de lacclration, les vsicules se dtachent de linterface huile-eau et
sont rcupres la n dans la phase aqueuse.
Cette technique de passage dinterface par des gouttelettes prsente potentiel-
lement de nombreux avantages en plus de ceux dtre simple et rapide : lencapsu-
lation est ecace, il sut dincorporer la substance que lon souhaite encapsuler
dans la solution aqueuse destine lmulsion ; seulement quelques microlitres sont
12 CHAPITRE 1. VSICULES LIPIDIQUES GANTES
ncessaires pour former lmulsion permettant ainsi de prserver des produits rares
et/ou coteux. De plus la production de vsicules en conditions physiologiques est
facile et il est aussi possible de confectionner des membranes assymtriques [28].
Cependant, en raison de la grande polydispersit de taille des mulsions prpares
par sonication ou vortex, cette mthode ne permet pas un contle de la taille des
vsicules.
La dicult dissoudre les lipides dans lhuile est la principale source dir-
reproductibilit sans quune solution soit propose pour matriser ce point. De
plus, les vsicules obtenues (voir gure 1.2) sont en majorit petites (<5 m) [22]
et rsultent en partie de formation spontane linterface huile-eau. Centrifuger
une mulsion entire perturbe le passage de chaque goutte, attnuant sans doute
lecacit de production des vsicules.
Fig. 1.2: Image en contraste de phase de vsicules de POPC prpares par mulsion
inverse (Pautot et al. [22]).
Une autre mthode reposant sur le mme principe du passage une interface
huile/eau dune mulsion stabilise a t propose par Yamada et al. en 2006 [23].
La principale dirence rside dans le fait que la sdimentation de lmulsion se
fait sous laction de la pesanteur sans centrifugation. Au passage de linterface
lors de la formation de la bicouche, lacclration nest gnralement pas susante
pour dcrocher les vsicules qui restent donc attaches linterface. Pour cette rai-
son le montage exprimental se fait dans de petites chambres hautes de quelques
milimtres pour pouvoir observer les vsicules sous microscope (gure 1.3). Nan-
moins, Hamada et al. [37] ont observs quaugmenter la dirence de densit entre
la solution encapsule et la solution aqueuse externe favorise le dtachement de
linterface. Il est galement possible de fabriquer des vsicules assymtriques [37]
et plus gnralement les principaux points forts, mais aussi les limitations de la
mthode de lmulsion inverse sont aussi valable dans le cas du transfert spontan.
1.3. MTHODES EN MICROFLUIDIQUE 13
Fig. 1.3: Chambre de production et dobservation pour la mthode du transfert
spontan. A droite, image en contraste de phase des vsicules formes et attaches
linterface (Yamada et al. [23]).
1.3 Mthodes en microuidique
1.3.1 Jetting au travers dune bicouche prforme
Fig. 1.4: Schma de principe et squence dimages illustrant la formation dune
vsicule par la mthode de jetting : une bicouche est pralablement forme en
mettant deux gouttes de uide au contact dun lm de solvant contenant des
lipides puis un jet est puls contre la bicouche. Si la force et la vitesse du jet
ne sont pas parfaitement contrls, la formation dun long cou de uide et la
dstabilisation de celui-ci entranent la formation de vesicules satellites de plus
petite taille. (Funakoshi et al. [26]).
Dans la mthode du jetting rapporte en 2006 par Funakoshi et al. [26] puis
amlior par Stachowiak et al. en 2008 [25], un jet du uide encapsuler est puls
au travers dune bicouche dj forme dans une chambre microuidique (gure
1.4). Le montage exprimental est dlicat matriser, bien que permettant la pro-
duction de vsicules monodisperses. Il est cependant dicile datteindre des tailles
14 CHAPITRE 1. VSICULES LIPIDIQUES GANTES
infrieures 100 m. Le rendement est bon mais la frquence de production des
vsicules est faible (quelques Hertz) car il est ncessaire dattendre que la bicouche
se reforme aprs la formation de quelques vsicules. Lencapsulation est ecace
et le travail en conditions physiologiques ne pose pas de problme. Si le processus
de gnration du jet nest pas parfaitement contrl, la quantit dhuile rsiduelle
dans la bicouche peut tre importante (jusqu plusieurs microns dpaisseur [26]).
De plus, de part la formation de ces vsicules en rgime inertiel, la membrane des
vsicules est tendue, rsultant en une stabilit limit dans le temps.
1.3.2 Double mulsion
La technique permettant de gnrer des double mulsions monodisperses [38]
a t propose comme tape intermdiaire pour la fabrication de vsicules [24]. Le
principe consite former dans un systme de capillaires imbriqus une gouttelette
de la solution encapsuler dans une goutte dhuile contenant des lipides, le tout
tant dispers dans une solution aqueuse (gure 1.5). La double mulsion ainsi
obtenue est stabilise par les lipides et toute la dicult rside dans lvaporation
du solvant. Lencapsulation, la formation en conditions physiologiques et le contrle
de la taille ne prsentent pas de dicult particulire. En revanche, lvaporation
du solvant gnre de nombreux dfauts membranaires et le rendement est faible.
En eet, la production de double mulsion est ecace mais lors de lexpulsion du
solvant beaucoup de ces capsules clatent. Il parat par ailleurs dicile denvisager
de construire des membranes assymtriques par cette mthode.
Fig. 1.5: Formation dune double mulsion stabilise par des lipides : des goutte-
lettes de solution aqueuse encapsuler sont entoures par une couche de solvant
contenant des lipides, le tout est dispers dans une solution aqueuse. Les lipides
migrent aux deux interfaces solvant/solution aqueuse, le point limitant tant lva-
poration complte du solvant. (Shum et al. [24])
1.3. MTHODES EN MICROFLUIDIQUE 15
1.3.3 Autres mthodes
a.
b.
Fig. 1.6: a. Une bicouche est forme la jonction de deux canaux microuidiques
en faisant circuler successivement une solution aqueuse, une solution dhuile conte-
nant des lipides puis de nouveau une solution aqueuse. La bicouche tant forme,
on injecte la solution aqueuse du bas dans le canal suprieur sous coulement, les
vsicules sont dtaches sous cisaillement hauteur dun plot dans le canal princi-
pal. (Ota et al. [27]). b. Une mulsion monodisperse deau dans lhuile est produite
dans une branche de la puce microuidique, les lipides prsents dans lhuile sta-
bilisent les gouttelettes. Lmulsion forme et une solution aqueuse se rejoignent
dans le canal principal et les lipides couvrent la nouvelle interface huile/eau. Le
passage des gouttelette de linterface huile/eau est forc par un obstacle dans le
canal. (Matosevic et al. [39]).
Dautres techniques utilisant la microuidique comme moyen de produire des
gouttelettes monodisperses deau dans lhuile stabilises par des lipides sont pro-
poses [27, 39, 40]. La plus rcente, dveloppe par Matosevic et al. [39] propose
de forcer le passage une interface huile/eau dune mulsion stabilise dans un
canal microuique (gure 1.6b). La mthode rapporte par Ota et al. [27] est une
implmentation ingnieuse de la formation de vsicules partir dune bicouche
dj forme (gure 1.6a) et soure des mme limitations concernant le renouvel-
lement de la bicouche. Enn, Tan et al. [40] plongent une mulsion monodisperse
stabilise pralablement fabrique en microuidique, dans une solution dthanol.
16 CHAPITRE 1. VSICULES LIPIDIQUES GANTES
Un rarrangement des lipides conduit alors la formation dune bicouche. Toutes
ces mthodes napportent pas de grand changement, la taille est certes contrle
mais le rendement est faible et le problme de dissolution des lipides dans lhuile
nest pas rsolu.
1.4 Quelles techniques pour quelles applications ?
Et aprs ?
Chacune des mthodes dcrites prcdemment possde ses propres avantages
et limitations, ainsi suivant lapplication envisage une technique particulire sera
prfrentiellement choisie. Pour des tudes portant sur les transitions de phases ou
la dynamique des lipides dont la qualit de la bicouche est essentielle, on prfrera
llectroformation [21] qui donne des vsicules unilamellaires sans dfaut mem-
branaire. Pour des applications ncessitant lencapsulation de protines (recons-
titution du cytosquelette [16, 17], expression de GFP [15] ...), lmulsion inverse
[22] et le transfert spontan [23] seront les mthodes de choix ; simples mettre en
uvre et rapides, elle permettent de plus la fabrication de bicouches assymtriques
[28, 37]. Nanmoins leur principale limitation reste leur faible reproductibilit. Si
le contrle de la taille est recherch alors les techniques en microuidiques sont
toutes indiques [24, 39, 40], par contre les rsidus de solvant dans la bicouche
et/ou le faible rendement en limitent leur utilisation.
Dans la suite, nous prsenterons comment runir le maximum davantages en
une seule technique. Nous discuterons des possibilits quore cette nouvelle m-
thode ainsi que de ses limitations.
Chapitre 2
Mthodes exprimentales
Nous prsentons dans ce chapitre les direntes techniques exprimentales.
Nous dcrivons dabord le dispositif utilis pour la fabrication des vsicules, puis
le protocole pour dissoudre les lipides dans lhuile minrale ainsi que le moyen
pour caractriser la solution de lipides. Enn, nous terminons par expliquer la
technique danalyse dimage employe pour obtenir les distributions de tailles des
gouttelettes et des vsicules.
2.1 Montage exprimental
La chambre dans laquelle sont produites les vsicules est constitue de deux
couvercles
1
de bote de ptri (35 mm de diamtre) colls entre eux et dont lun
comporte en son centre un trou de 1 cm de diamtre (gure 2.1). Cette chambre est
alors xe sur un moteur dont on contrle la vitesse de rotation (typiquement entre
10 et 40 Hz). Une fois en rotation, la chambre est successivement remplie avec :
1 ml de la solution aqueuse dans laquelle on rcuprera les vsicules, 3.5 ml de la
solution dhuile contenant les lipides et 1 ml de la phase continue dans laquelle
sera introduit le capillaire pour la production de gouttelettes monodisperses. Le
capillaire de verre, rempli de la solution que lon souhaite encapsuler est connect
un systme de pression (mfcs-4c de Fluigent) pilot par ordinateur permettant
de xer la pression dinjection et donc la frquence de production des gouttelettes.
Il est ensuite introduit dans la phase continue tout en restant au plus prs de
linterface avec lair. Aprs quelques minutes de production, le capillaire est retir
et la rotation de la chambre stoppe progressivement pour limiter le cisaillement
linterface. Les vsicules sont rcupres en aspirant dlicatement la solution
aqueuse externe avec une micropipette.
1
Lutilisation de deux couvercles permet de limiter la hauteur de la chambre et donc le volume
de solution de lipides ncessaire.
17
18 CHAPITRE 2. MTHODES EXPRIMENTALES
Fig. 2.1: a. La chambre est xe sur le moteur. Le capillaire en verre contenant
la solution encapsuler est connect sur un tuyau de silicone lui mme reli au
contrleur de pression. Dans lencart, la chambre de production est compose de
deux couvercles de boite de ptrie de 35 mm de diamtre colls ; un trou de 15
mm de diamtre est eectu avec une perceuse de prcision sur lun des couvercle
avant dtre assembl. b. Vue rapproche du capillaire introduit dans la couche de
phase continue.
2.2. DISSOLUTION DES LIPIDES 19
2.2 Dissolution des lipides
La dissolution des lipides dans lhuile minrale est un point cl pour le succs de
la mthode et ncessite une attention particulire tout au long de la prparation.
En particulier, le contrle de lhumidit est critique et toute la dissolution est faite
dans une boite gants en plastique alimente par de lazote pour stabiliser le
taux dhumidit entre 8 et 12 %. Les lipides proviennent indiremment de chez
Sigma Aldrich ou Avanti Polar Lipids. Ds leur rception, ils sont dissous 50
mg/ml dans un mlange chloroforme/mthanol (proportion 9:1, v/v). On laisse
la solution mre reposer pendant trois semaines au conglateur avant de pouvoir
lutiliser durant cinq mois.
Une bouteille en verre de 25 ml, hermtique, pralablement sche lazote est
ouverte dans la boite gants. 160 l de la solution mre de lipides sont ajouts
200 l du mlange chloroforme/mthanol (9:1) de faon recouvrir compltement
le fond de la bouteille. Le solvant est alors vapor sous vide pendant une vingtaine
de minutes, rsultant en un lm de lipides trs blanc, opaque, sur le fond de la
bouteille. Le vide est alors cass dans la boite gants (toujours 8-12% dhumidit)
et 20 ml dhuile minrale (sigma aldrich #M3516) sont ajouts pour atteindre une
concentration nale en lipide de 0,5 mM. La bouteille, ferme hermtiquement est
laisse au repos sur la paillasse pendant une heure. Lhuile minrale imprgne alors
le lm de lipides que lon voit apparatre au cours du temps lgrement blanc sur
le fond. Finalement, la solution est vortexe durant une vingtaine de seconde avant
de la soniquer pendant une heure en maintenant la temprature du bain infrieure
40

C pour ne pas dgrader les lipides. Ds les premires secondes de sonication,


le lm de lipide doit commencer se dtacher du fond de la bouteille. Aprs la
sonication, la solution est compltement transparente et on la laisse reposer toute
une nuit durant laquelle elle volue et devient trouble. Il est prfrable, pour la
qualit des vsicules, de lutiliser dans les trois jours.
2.3 Prparation des capillaires
Les capillaires en verres sont dans un premier temps tirs (P-87 Sutter instru-
ment) puis le diamtre est ajust la taille dsire avec une microforge (microforge
de Fontbrune, Beaudouin 5462). Typiquement le diamtre est compris entre 3 et 30
m pour produire des vsicules dans la gamme 4-100 m. Pour faciliter lintroduc-
tion du capillaire dans la chambre, lextrmit est courbe angle droit au dessus
dune amme. An dviter des problmes de mouillage sur les parois externes du
capillaire et de les rendre hydrophobes, la pointe est traite au silane.
Le protocole de traitement est le suivant: un premier bain dans lacide sulfo-
chromique pour nettoyer, rinage leau pure et schage lazote, immersion de
20 CHAPITRE 2. MTHODES EXPRIMENTALES
la pointe 30 secondes dans la solution de silane (mlange de 90% mthanol, 10%
eau et 0.1% silane #435708 sigma) puis schage lazote pour expulser le uide
restant lintrieur du capillaire et cuisson pendant une heure 100

C.
2.4 Mesure de tension de surface
2.4.1 Exprience de goutte pendante
La mthode dite de la goutte pendante est la solution retenue pour mesurer la
tension de surface entre la solution encapsuler et la solution dhuile contenant
les lipides. Pas trop dicile mettre en uvre, elle donne des rsultats prcis (de
lordre de quelques mN/m). Lors dune exprience de mesure, une goutte du uide
le plus dense est gone au bout dun capillaire dans le uide le moins dense. La
forme de la goutte dpend alors de la comptition entre les forces de tension de
surface qui tendent garder la goutte sphrique et le poids de la goutte qui la
dforme.
En pratique, une goutte de 15 l est gone un dbit de 5500l/h dans une
solution dhuile avec des lipides. Au cours du temps, les lipides sadsorbant sur
la surface de la goutte, la tension de surface dcrot et la goutte se dforme jus-
qu casser lorsque le poids devient trop important. Pour viter des problmes de
mouillage, le capillaire est trait au silane (voir protocole prcdent). Lvolution
de la forme de la goutte est enregistre avec une camra sur laquelle est mont
un objectif macro sur souet pour obtenir une meilleure rsolution (idalement la
goutte dforme occupe la surface entire du capteur de la camra soit 600x800
pixels). La goutte est claire par derrire travers un matriaux diusant rsul-
tant ainsi en un fort contraste entre la goutte et larrire plan. Pour obtenir une
chelle de longueur et viter les aberrations optiques, une bille dacier de diamtre
connu est prise en photo dans la solution dhuile. Enn, lvolution de la tension
de surface est dtermine par analyse dimage du contour de la goutte.
2.4.2 Analyse dimage pour dterminer la tension
Pour une goutte pendante lquilibre, on peut crire en un point S(x,z) de la
surface lquation de Young-Laplace qui dcrit la dirence de pression linterface
due aux forces de tension de surface:
(P)
S
=
_
1
R
1
+
1
R
2
_
, (2.1)
o reprsente la tension de surface et R
1
= SM, R
2
= SN sont les deux rayons
de courbure principaux de la surface au point S (voir gure 2.2). A lapex (le point
le plus bas de la goutte) R
1
= R
2
= b et la dirence de pression scrit:
2.4. MESURE DE TENSION DE SURFACE 21
Fig. 2.2: a. Montage exprimental pour la mesure de tension de surface: une
seringue contenant la solution aqueuse est connecte un capillaire de verre trait
hydrophobe et xe sur un pousse seringue dispos verticalement; lextrmit du
capillaire trempe dans la solution dhuile contenant les lipides. Dans le cadre,
un zoom sur la goutte gone dans lhuile au bout du capillaire. b. Paramtres
gomtriques pour dcrire le contour dune goutte: R
1
= SM est le premier rayon
de courbure contenu dans le plan (xz), R
2
= SN est le second rayon de courbure
contenu dans le plan perpendiculaire (xz) passant par SN, ds est le dplacement
lmentaire le long de labcisse curviligne.
22 CHAPITRE 2. MTHODES EXPRIMENTALES
(P)
0
=
2
b
. (2.2)
En un point S(x,z) quelconque de la surface, on a la pression du ct de la
phase aqueuse P
a
= (P
a
)
0
+
a
gz et du ct de la phase huile P
h
= (P
h
)
0
+
b
gz,
avec (P
a
)
0
et (P
h
)
0
les pressions lapex dans chaque phase,
a
et
h
les densits
de la phase aqueuse et de la phase huile respectivement. Le saut de pression au
point S scrit alors:
(P)
s
=
2
b
+ gz. (2.3)
Par des condidrations gomtriques simples (voir gure 2.2), on peut crire
z = R
2
cos et dS = R
1
d, soit:
1
R
1
+
1
R
2
=
d
dS
+
cos
z
, (2.4)
o dS est llment innitsimal de dplacement de la coordonne curviligne. On
cherche exprimer R
1
et R
2
en coordonnes cartsiennes. On a (dS)
2
= (dx)
2
+
(dz)
2
, soit:
dS
dx
=

_
1 +
_
dz
dx
_
2
, (2.5)
de plus,
d
dS
=
d
dx
dx
dS
=
d
dx
1
(1 + z
2
)
1/2
. (2.6)
De dz = dS sin et dx = dS cos , on en dduit que
d
2
z
dx
2
=
d(tan )
dx
=
1
cos
2

d
dx
= (1 + z
2
)
d
dx
, (2.7)
soit en reportant dans 2.6:
d
dS
=
z
(1 + z
2
)
3/2
. (2.8)
Pour le rayon de courbure R
2
, il vient de dx = dS cos et de lquation 2.6:
1
R
2
=
cos
z
=
1
z(1 + z
2
)
1/2
. (2.9)
Finalement, en reportant 2.3, 2.8 et 2.9 dans lquation de Young-Laplace (2.1),
on obtient lquation direntielle suivante pour le contour de la goutte:
2.4. ANALYSE DIMAGE: DISTRIBUTION DE TAILLE 23
z
(1 + z
2
)
3/2
+
z
z(1 + z
2
)
1/2
=
2
b
+ gz; (2.10)
et g sont connu, le rayon de courbure lapex b est mesur sur les images et
la tension de surface est le paramtre dajustement.
Sur les images, le contour de la goutte ayant t extrait, on cherche une solution
polynomiale lquation 2.10 qui passe par les points du contour en utilisant une
mthode des moindres carrs.
2.5 Dtermination des distributions de taille par
analyse dimage
Les distributions de taille des gouttelettes et des vsicules sont obtenues par
traitement dimage partir de photos prises en champ clair pour les gouttelettes et
en contraste de phase pour les vsicules. Une variante pour faciliter le traitement
dimage dans le cas des vsicules consiste encapsuler une solution de billes uo-
rescentes de 20 ou 60 nm. Lors du traitement, un premier ltre sobel (un oprateur
qui calcule les variations dintensit) est appliqu pour dtecter les contours, ceux-
ci sont ensuite ans puis limage est binarise. Cette image constitue le point de
dpart pour la recherche des gouttes ou vsicules par la mthode de la transforme
de Hough. Le principe est le suivant: pour un cercle de rayon R connu, tous les
points (x,y) appartenant son primtre peuvent gnrer un cercle de centre (x,y)
et de rayon R, lintersection (a,b) commune tous ces cercles est le centre du
cercle recherch (voir gure 2.3); si le rayon est inconnu alors chaque point (x,y)
de limage appartenant un cercle, gnre un cne dans lespace paramtr de
dimension 3 (a,b,r); la recherche se ramne alors au problme prcdent en eec-
tuant une recherche dans chaque plan r = constante. En construisant pour chaque
valeur de r une matrice daccumulation (gure 2.3c) qui reprsente le nombre din-
tersections de cercles en chaque point et aprs un seuillage sur cette matrice, on
obtient nalement les triplets (a,b,R) pour chaque cercle de limage initiale. On
vrie la pertinence du traitement en superposant les cercles dtects avec limage
initiale (gure 2.3g).
24 CHAPITRE 2. MTHODES EXPRIMENTALES
Fig. 2.3: a. Chaque point de coordonnes (x,y) appartenant un cercle de rayon
R, gnre dans lespace paramtr un cercle de rayon R et de centre (x,y); le point
dintersection (a,b) de ces cercles correspond aux coordonnes du centre du cercle
recherch dans lespace gomtrique. b. Si les rayons ne sont pas connus, chaque
point du primtre gnre alors un cne dans lespace paramtr de dimension 3;
le problme se ramne deux dimensions pour chaque coupe r=R. c. Exemple
dune matrice daccumulation pour un R donn: en chaque point de lespace para-
mtr, le nombre dintersections est reporte. d. Image originale en champ clair de
gouttelettes. e. Dtection des contours aprs application du ltre sobel. f. Image
binaire et anage des contours. g. Superpositon de limage originale et des cercles
dtects
Chapitre 3
Continuous Droplet Interface
Crossing Encapsulation (cDICE):
des gouttelettes aux vsicules
Le principe du passage une interface huile/eau de gouttelettes stabilises par
des lipides, exploit dans la mthode de lmulsion inverse [41] et du transfert spon-
tan [23] est une ide lgante ncessitant dtre approfondie et sa mise en uvre
modie. En particulier, le manque de contrle de la production des gouttelettes,
du recouvrement en lipides des interfaces et du passage nal, est directement res-
ponsable du faible rendement et de la non reproductibilit de ces techniques de
passage dinterface. Partant de ce constat, nous proposons un dispositif expri-
mental simple permettant un contrle n de ces dirents points, levant ainsi les
principales limitations voques prcdemment.
3.1 Principe de fonctionnement
Lastuce est de concilier en une seule tape et sur un seul montage, la pro-
duction de gouttelettes monodisperses, la stabilisation de cette mulsion par des
lipides et le passage une interface huile/eau couverte de lipides pour lassemblage
nal de la bicouche. Le dispositif exprimental reprsent sur la gure 3.1, consiste
en une chambre cylindrique en rotation autour de son axe vertical dans laquelle
trois solutions sont successivement introduites: une solution aqueuse qui sera la so-
lution de suspension des vsicules produites (dans la suite on la notera DAS pour
Dispersing Aqueous Solution), une solution moins dense de lipides dissous dans
de lhuile (note LOS pour Lipid in Oil Solution) et un alcane servant de phase
continue (le plus souvent du dcane) de faible viscosit et de densit plus faible
que les solutions prcdentes et servant la production contrle des gouttelettes
25
26 CHAPITRE 3. CDICE
Fig. 3.1: Vue de ct de la chambre, le capillaire est xe et la chambre tourne la
vitesse angulaire . Les gouttelettes monodisperses de la solution encapsuler sont
produites dans la couche de dcane faible nombre capillaire C
a
et sous laction de
la force centrifuge transitent dans la LOS vers linterface LOS/DAS. Le temps
s
ncessaire pour que les lipides saturent la surface dune gouttelette doit tre plus
petit que le temps de vol
F
dans la LOS. Le passage linterface a lieu dans
un rgime pour lequel les forces inertielles sont faibles devant les forces de tension
de surface.
monodisperses. Ces trois couches de uides immiscibles, sous laction de la force
centrifuge, forment entre elles des interfaces verticales. Un capillaire contenant
la solution aqueuse que lon souhaite encapsuler (note EAS pour Encapsulated
Aqueous Solution) est introduit dans la phase continue (CP) en restant au plus
prs de linterface avec lair. LEAS est alors injecte dbit constant. Lorsque
les forces de tension de surface dominent les forces visqueuses, dnissant ainsi le
rgime dcoulement faible nombre capillaire C
a
=
cp
v
cp
d/d
i
1 (
cp
et v
cp
sont la viscosit et la vitesse de la phase continue, d et d
i
les diamtres respectifs
des gouttelettes et du capillaire et la tension de surface EAS/CP), les goutte-
lettes arraches de la pointe du capillaire ont une distribution de taille trs troite
(gure 3.5). Ces gouttelettes sont immdiatement soumises la force centrifuge
qui les pousse radialement vers linterface LOS/DAS. Durant leur trajet dans la
couche de LOS, les lipides sadsorbent sur la surface des gouttelettes. Lors de cette
tape, le temps
F
ncessaire aux gouttelettes pour traverser la couche de LOS
dpaisseur e, doit tre plus grand que le temps caractristique
s
pour saturer les
interfaces en lipides. Dans le rgime des faibles nombres de Reynolds, pour lequel
les forces inertielles sont ngligeables devant les forces visqueuses,
F
se dtermine
partir de lquilibre atteint en rgime stationnaire entre la force de Stokes et
la force centrifuge agissant sur la gouttelette:
F
= 9/(2R
2

2
) ln(1 + e/r
0
)
1
,
1
A faible nombre de Reynolds, lquiblibre entre la force de Stokes et la force centrifuge revient
rsoudre lquation direntielle du premier ordre suivante:
4
3
R
3

2
r(t) 6R
dr
dt
= 0
3.2. PRODUCTION DES GOUTTELETTES 27
o est la viscosit de la LOS, la dirence de densit entre EAS/LOS, R
le rayon des gouttelettes, la vitesse angulaire de la chambre et r
0
la distance
au centre do sont produites les gouttelettes. Lorsque les gouttelettes atteignent
linterface LOS/DAS galement sature en lipides, les deux monocouches de lipides
sassemblent au cours du passage au travers de linterface pour former la bicouche
lipidique renfermant la solution encapsule. Les vsicules ainsi formes sont sus-
pendues dans la DAS. Nous dcrivons par la suite les dirents mcanismes qui
sous-tendent ces trois tapes.
3.2 Production des gouttelettes
3.2.1 Contrle de la taille
Le dispositif dinjection dans la chambre en rotation consiste en un capillaire
de verre introduit radialement dans la phase continue non aqueuse, lapplication
dune dirence de pression P permet alors dinjecter lEAS dans la CP (gure
3.2). Grce ce systme, des gouttelettes sont formes de faon continue: chaque
fois que les forces visqueuses lemportent sur les forces de tension de surface qui
maintiennent la goutte sur le capillaire, une gouttelette se dtache.
Fig. 3.2: a. Vue de dessus de la chambre, le capillaire est introduit dans la phase
continue (CP) et une gouttelette est sur le point dtre dtache (ux de la droite
vers la gauche). b. Exemple dmulsion produite avec le montage dcrit prcdem-
ment. Lchelle reprsente 30m dans les deux cas.
28 CHAPITRE 3. CDICE
Dans le cas du rgime C
a
1, les gouttelettes retenues la pointe du capillaire
par la tension de surface, gonent puis se dtachent au niveau de la pointe, formant
ainsi des gouttelettes monodisperses (gure 3.3a.). Au contraire, lorsque C
a
1,
les forces visqueuses tirent la goutte en formation en un long cou instable donnant
lieu un mcanisme de pincement loign de la pointe et alatoire (gure 3.3b.).
Forces de tension de surface
Forces visqueuses
flux
flux

polydispersit < 10 % C
a
1

polydispersit importante C
a 1
a.
b.
Fig. 3.3: a. A bas nombre capillaire, les gouttelettes grossissent sans grande d-
formation et se dtachent de la pointe du capillaire quand les forces visqueuses
excdent les forces de tension supercielles, rsultant en la production de gout-
telettes monodisperses. b. Lorsque le nombre capillaire nest plus susamment
faible, les forces visqueuses tirent la gouttelette dont la surface se dstabilise et
se dtache de faon irrgulire.
En crivant lquilibre des forces de tension de surface ( d
i
) et des forces
visqueuses ( 3dv), la taille des gouttelettes peut tre exprime en fonction du
nombre capillaire:
d
d
i
= A
1
C
a
, (3.1)
o d et d
i
sont respectivement le diamtre de la gouttelette et le diamtre interne
du capillaire. En considrant la force visqueuse gale, en premire approximation,
3.2. PRODUCTION DES GOUTTELETTES 29
la force de Stokes sappliquant sur une sphre de diamtre d, F
stokes
= 3
cp
dv
cp
,
alors A = 1/3. Nous avons mesur le rapport d/d
i
pour une grande gamme de
valeur de C
a
, les rsultats sont reprsents sur la gure 3.4 et lon trouve une
dcroissance en 1/C
a
avec une amplitude A
t
= 0, 11; du mme ordre de grandeur
que la valeur thorique donne par la loi de Stokes. La formule donne par Stokes
est valable pour un coulement autour dune sphre loigne de parois ce qui nest
pas le cas dans notre systme o les gouttelettes sont retenues la pointe dun
capillaire, modiant ainsi lcoulement autour de celles-ci. De plus langle des forces
capillaires nest pas forcment selon la verticale et il y a un coulement dans la
gouttelette.
Fig. 3.4: Diamtre des gouttelettes produites normalise par le diamtre interne
du capillaire en fonction du nombre capillaire. La courbe passant par les points
exprimentaux est un ajustement de la fonction
d
d
i
= A
1
C
a
avec A=0,11.
La taille des gouttelettes est donc contrle par deux paramtres: d
i
et C
a
. An
dobtenir une taille donne d, il est donc possible de faire varier les trois paramtres

cp
, v
cp
et d
i
(la tension de surface variant assez peu) tout en se plaant toujours
un C
a
faible. Changer la viscosit
cp
implique de trouver un uide non aqueux, de
densit infrieure la LOS et avec un contraste de viscosit important par rapport
la LOS pour ralentir leur mlange. La vitesse v
cp
est xe entre autre par , la
vitesse de rotation; celle-ci ayant galement une inuence sur la force centrifuge
30 CHAPITRE 3. CDICE
agissant sur les gouttelettes et donc sur les autres tapes de la formation, nous
viterons par la suite dutiliser ce paramtre pour le contrle de la taille. Le plus
simple reste dajuster la taille du capillaire d
i
. Ainsi pour des tailles de capillaires
comprises entre 4 et 30 m, des gouttelettes monodisperses peuvent facilement tre
produites dans lintervalle 4-100 m de diamtre (gure 3.5). Dans notre gomtrie
dinjection avec le capillaire introduit radialement la phase continue, le dbit ne
joue pas de rle sur la taille des gouttelettes. Des variations sont observes lorsque
le capillaire nest plus radial, il faut alors tenir compte de la vitesse relative entre
EAS et CP, et le rapport d/d
i
Q
1/3
avec Q le dbit dinjection [42].
Diamtre
Fig. 3.5: Distribution de taille des gouttelettes produites dans la gamme 4-70
m. La densit de probabilit (d) est reprsente en fonction du diamtre. Les
courbes correspondent des ajustements gaussiens avec d) = 3, 8 m et =
0, 2 m (triangles renverss orange); d) = 8, 5 m et = 0, 6 m (cercles bleu);
d) = 18, 2 m et = 1, 8 m (carrs vert); d) = 38 m et = 2 m (triangles
roses); d) = 67, 9 m et = 1, 2 m (losanges violet). Les gouttelettes ont t
produites dans lordre croissant des tailles, un nombre capillaire C
a
= 0, 2 et un
capillaire de 4 m; C
a
= 0, 06 et d
i
= 5 m; C
a
= 0, 035 et d
i
= 6 m; C
a
= 0, 035
et d
i
= 13 m et C
a
= 0, 04 et d
i
= 27 m.
3.2. PRODUCTION DES GOUTTELETTES 31
3.2.2 Frquence de production
Pour un nombre capillaire donn xant le diamtre des gouttelettes, la fr-
quence de production f
drop
est dtermine par le dbit dinjection Q qui dpend
de la dirence de pression applique:
Q =
P
R
H
, (3.2)
o P est la dirence de pression et R
H
la rsistance hydrodynamique du capil-
laire donne par la relation R
H
= 8L/R
4
dans le cas dun capillaire cylindrique
de rayon R et de longueur L avec la viscosit du uide inject.
Par ailleurs, pour des petits diamtres de capillaire, la pression de Laplace
P
L
= 4/d
i
sopposant la sortie du uide est non ngligeable: pour des pressions
dinjections infrieures la pression de Laplace, la production de gouttelettes cesse;
des pression suprieures P
L
, le dbit est proportionnel P et la frquence
de production des gouttelettes augmente linairement avec P.
Fig. 3.6: Frquence de production des gouttelettes en fonction de la dirence de
pression applique. Les gouttelettes sont produites dans du dcane avec un capil-
laire de 10,8 m et une vitesse de 30 trs/s, la tension de surface entre la solution
de sucrose 400 mM et le dcane est gale 52 mN/m. La ligne verticale 193 mbar
reprsente la pression de Laplace calcule, en bonne adquation avec la pression
de coupure P
c
= 190 mbar. La frquence de production crot linairement avec
la pression au dessus de P
c
.
32 CHAPITRE 3. CDICE
Exprimentalement, la pression de coupure P
c
en dessous de laquelle la pro-
duction de gouttelettes est stope, correspond comme attendu, la pression de
Laplace calcule (gure 3.6). La frquence de production sexprime donc F
drop
=
Pd
3
/6R
H
3.3 Dispersion des lipides et lipides aux inter-
faces
Le contrle de la couverture en lipides des interfaces eau-huile et en particulier
des gouttelettes durant leur traverse de la solution dhuile contenant les lipides
(LOS), est un point primordial pour le succs de la production de vsicules. La
surface des gouttelettes doit tre sature en lipides avant datteindre linterface
LOS/DAS en un temps
s
infrieur
F
, le temps pour traverser la couche dhuile.
3.3.1 Cintique dadsorption
Nous avons mesur la cintique dadsorption des lipides linterface eau-huile
par des expriences de goutte pendante [43]. Lvolution au cours du temps de la
tension de surface entre la solution aqueuse encapsuler (EAS) et la LOS est
reprsente sur la gure 3.7 pour direntes concentrations en Egg-PC.
Pour chaque concentration, dcroit pour atteindre une valeur nale de 11
mN/m lorsque, les forces de tension de surface ne pouvant plus contrebalancer le
poids de la goutte, celle-ci se dtache du capillaire. Pour chaque concentration,
il est possible dajuster les valeurs mesures par une exponentielle dcroissante,
cette fonction na quune valeur empirique mais permet nanmoins dextraire un
temps caractrisque
s
pour saturer linterface:
s
= 14 s 0,5 mM;
s
= 25 s
0,25 mM et
s
= 55 s 0,125 mM. Les modles dvelopps dans le cadre de la
cintique dadsorption contrle par la diusion molculaire des phospholipides
linterface chloroforme-eau [44, 45] ne permettent pas de dcrire nos expriences,
probablemant parce que les lipides disperss dans lhuile minrale forment des
agrgats micromtriques que nous allons dcrire dans le paragraphe suivant.
Les rsultats des expriences de goutte pendante montrent la forte dpendance
la concentration en lipides de la cintique dadsorption linterface eau-huile. La
cintique relativement rapide obtenue pour la concentration de 0,5 mM (
s
= 14 s),
est bien adapte aux contraintes gomtriques de notre chambre de production. En
eet, la taille restreinte de la chambre ne permet pas davoir une paisseur de LOS
importante (2-3 mm), le temps
F
tant par consquent court, il est ncessaire
dobtenir une cintique dadsorption rapide. Pour une taille de goutte donne, il
faut sassurer que la condition
F
>
s
est bien respecte.
F
peut tre ajust en
3.3. DISPERSION DES LIPIDES ET LIPIDES AUX INTERFACES 33
t=0s t=10s t=15s t=20s
t=25s t=30s t=33s t=33.4s
Temps
Fig. 3.7: Evolution de la tension de surface entre une solution de sucrose 400 mM
et des solutions direntes concentrations dEgg-PC dissous dans lhuile minrale:
0,5 mM (ronds rouge); 0,25 mM (carrs bleu); 0,125 mM (losanges vert) et huile
minrale seule (triangles noir). Les donnes sont ajustes par des exponentielles
dcroissantes desquelles on extrait le temps caractristique
s
pour saturer linter-
face:
s
(0, 5mM) = 14s;
s
(0, 25mM) = 25s;
s
(0, 125mM) = 55s. Le dcalage au
temps t=0 entre lhuile seule et les autres courbes est d au dbut dadsorption
des lipides durant le gonement de la goutte. Dans le cadre, les photos illustrent
la dformation de la goutte sous laction de son poids lorsque la tension de surface
diminue; cette srie correspond la dynamique pour une concentration de 0,5 mM
dEgg-PC (courbe rouge gauche).
modiant certains des paramtres dont il dpend: , , e (paisseur de la couche
de LOS) et
2
.
La dirence de densit entre EAS et LOS nest pas un paramtre que lon
peut faire varier de faon consquente car le gain sera trs faible au regard de la
dpendance linaire. An daccrotre
F
, il est possible daugmenter la viscosit
de la LOS. Pour cela, il faut soit dissoudre des lipides dans une huile plus visqueuse
que lhuile minrale ( = 30 mPas) tout en sassurant dune cintique dadsorp-
tion rapide, ou bien eectuer un mlange entre une solution dhuile minrale plus
concentre en lipides avec un autre alcane plus visqueux. Il est donc galement
dicile dobtenir une forte augmentation de
F
partir de la viscosit. La vitesse
de rotation est en revanche un levier important du fait de la dpendance en
2
de
F
. Cependant il faudra alors adapter en consquence le diamtre du capillaire
34 CHAPITRE 3. CDICE
et/ou la viscosit de la phase continue pour conserver le nombre capillaire initial
qui xe la taille des gouttelettes produites (se reporter la gure 3.4). Enn, on
peut galememt ajuster lpaisseur de la couche de LOS mme si la marge est faible
du fait des contraintes gomtriques. Enn, la stratgie consistant augmenter la
concentration de lipides pour diminuer
s
nest pas recommande. En eet, il est
prfrable de ne pas travailler des concentrations plus leves que 0,5 mM. Au
del, la vsiculation spontane aux interfaces eau-huile devient importante [41],
entranant par la mme, une dgradation de la qualit des vsicules.
Nous avons galement ralis des expriences de goutte pendante pour dautres
lipides ou mlange de lipides (gure 3.8). Pour 0,5 mM de POPS (lipide charg
ngativement) la dcroissance au cours du temps de la tension de surface nest plus
monotone. Nous observons une premire marche suivie dun long plateau avant de
dcrotre nouveau par une marche. Ce comportement pourrait sexpliquer par
la prsence dagrgats de lipide de taille importante (> 30m) dans la solution
dhuile: quand lun de ces agrgats rencontre la surface de la goutte, la grande
quantit de lipides prsents rsulte en une dcroissance soudaine de la tension
de surface qui stagne alors jusqu ce quun nouvel agrgat sadsorbe. Ce com-
portement peut certainement tre corrig en utilisant un protocole de dissolution
adquat (voir discussion de la section suivante).
Fig. 3.8: Evolution de la tension de surface pour 0.5 mM de lipides: Egg-PC
(cercles rouges), 95% Egg-PC et 5% Peg-PE (carrs bleu), POPS (losanges vert).
Idalement il serait ncessaire de mesurer la cintique dadsorption pour tous
3.3. DISPERSION DES LIPIDES ET LIPIDES AUX INTERFACES 35
nouveaux lipides ou mlange de lipides an de sassurer que la condition
F
>

s
puisse tre vrie. Le tableau 3.1 liste les dirents systmes prpars sans
modication du protocole dcrit dans la partie mthodes exprimentales, et avec
lesquels nous avons produit avec succs des vsicules avec la mthode cDICE.
Lipides seul Mlanges de lipides
Egg-PC Egg-PC + 10% POPS
DOPC Egg-PC + 10% DOPG (une charge -)
POPS (une charge -) Egg-PC + 10% PIP2 (3 charges -)
Egg-PC + 5% PEG-PE
Tab. 3.1: Lipides et mlanges de lipides utiliss pour la production de vsicules.
3.3.2 Dispersion des lipides
La dispersion des lipides dans lhuile minrale est une tape critique pour obte-
nir une cintique dadsorption rapide mais aussi pour dterminer la qualit nale
des vsicules (prsence de dfauts sur la membrane ou encapsulation de dbris
lipidiques). Dans les solutions dhuile minrale les lipides ne sont pas dissous indivi-
duellement, si tel tait le cas, la cintique dadsorption des lipides serait beaucoup
plus lente. La diusion des molcules de lipide (quelques nanomtres) dans lhuile
minrale (viscosit 30 mPas) engendrerait des temps de saturation suprieur la
minute [45], en dsaccord avec les cintiques dadsorption (15 s) obtenues. En
eet, pour les modles dadsorption limit par la diusion, le temps de saturation

s
1/D [46] avec D le coecient de diusion ( 1/). Il est trs probable que
la prsence en solution dagrgats micromtriques, vritables rservoirs de lipides,
permette les cintiques rapides mesures.
Lors de la dispersion des lipides dans lhuile minrale, une attention particu-
lire doit tre porte aux conditions dhumidit. Lobtention de solutions repro-
ductibles est conditionne par la dissolution des lipides sous atmosphre controle
10 % dhumidit tout au long de la prparation comme dcrit dans le chapitre
mthodes exprimentales . Ltat nal du lm de lipides aprs vaporation du
solvent est grandement dpendant de la teneur en eau due lhumidit (gure 3.9)
mais aussi de la cintique dvaporation: modier le rapport chloroforme/mthanol
rsulte en un aspect du lm dirent donc dorganisation interne dirente, res-
ponsable dun tat de dispersion dans lhuile minrale modi.
La taille des agrgats de lipides en solution a une rpercussion directe sur la qua-
lit des vsicules. La gure 3.10 illustre les dirences entre des vsicules produites
partir de trois LOS de 0,5 mM dEgg-PC. La solution contenant des agrgats de
taille infrieure 5 m donne les meilleurs rsultats, les vsicules ne comportent
36 CHAPITRE 3. CDICE
Fig. 3.9: Motifs de lm de lipides prpars dirent taux dhumidit: a. 10 %;
b. 23 % et c. 40 %. Lchelle reprsente 20 m.
pas de dfaut et sont stables plus dun mois temprature ambiante. Avec des
agrgats dont la taille est comprise entre 5 et 10 m, des dfauts apparaissent,
quelques vsicules renferment des rsidus de lipides ou possdent des dfauts sur
la membrane; quand les agrgats mesurent plus de 10 m, la plupart des vsicules
prsentent des dfauts sur leur membrane ou renferment des structures lipidiques.
Les dispersions de lipides dans lhuile minrale sont des systmes qui voluent
dans le temps. Les premiers agrgats micromtriques apparaissent une nuit aprs
la sonication et grossissent au cours du temps pour un chantillon laiss au repos.
Cest pour cette raison quil est prfrable dutiliser la LOS durant les quelques
jours qui suivent sa prparation.
3.3.3 Couverture continue des interfaces
Le renouvellement en lipides des interfaces est une condition essentielle lob-
tention dun rendement important (le nombre de gouttelettes produites qui de-
viennent eectivement des vsicules). La production de gouttelettes par goutte
goutte et le contrle de la frquence de production que nous autorise ce systme,
permet dindividualiser la trajectoire de chaque gouttelette dans la LOS jusquau
passage de linterface, optimisant ainsi la couverture en lipides des interfaces eau-
huile et le renouvellement des endroits dplts en lipides. En eet, aprs le passage
dune gouttelette linterface LOS/DAS, toute une zone se retrouve dplte en li-
pides. Si une gouttelette arrive sur linterface cet endroit avant que la zone aie eu
le temps de se regnrer en lipides, alors le zipping complet des deux monocouches
choue et la gouttelette se dilue dans la DAS (gure 3.11).
En plus dimpacter le rendement, le passage rt dune gouttelette laisse sur
linterface de nombreux dbris lipidiques qui sont lorigine de dfauts: lorsquune
gouttelette atteint linterface en un endroit prsentant des dbris, la majorit des
3.3. DISPERSION DES LIPIDES ET LIPIDES AUX INTERFACES 37
Fig. 3.10: Inuence de la taille des agrgats de lipides sur la qualit des vsicules.
Sur la range suprieure, photos de solutions contenant 0,5 mM dEgg-PC: agrgats
de 2 5 m en A, de 5 10 m en B et suprieur 10 m en C. Les photos de la
range infrieure correspondent aux vsicules produitent avec chaque solution: pour
les plus petits agrgats, les vsicules ne prsentent pas de dfauts; pour les agrgats
de taille suprieure en B, quelques vsicules possdent des dfaut sur la membrane
ou renferment des objets lipidiques (petits points noir); quand les agrgats sont
trop gros C, la plupart des vsicules comportent des dfauts. Lchelle reprsente
50 m et la densit de vsicule nest pas reprsentative de lecacit.
dbris se retrouvent encapsuls dans la nouvelle vsicule ou bien sur sa membrane
(gure 3.12).
Le renouvellement continu de la couverture en lipides des interfaces eau-huile,
directement responsable dun bon rendement, passe dabord pas lutilisation dune
LOS dont la cintique dadsorption des lipides est rapide (typiquement une quin-
zaine de secondes) et par le contrle de la frquence de production des gouttelettes.
Une frquence trop leve engendre invitablement une diminution du rendement
(voir donne carr bleu sur la gure 3.17).
38 CHAPITRE 3. CDICE
a
b
c
d
Fig. 3.11: a. Une gouttelette arrive sur linterface un endroit dplt en lipide
d la formation dune vsicule peu de temps auparavant. b. Dans ces conditions
le zipping des deux monocouches na pas lieu et la gouttelette fusionne avec la
DAS. c. Deux gouttelettes produites trop proche fusionnent dans la LOS. d. Le
succs du passage de cette gouttelette issu dune fusion rsulte en la formation
dune vsicule de plus grosse taille et une dpltion en lipide plus importante.
Fig. 3.12: Exemple extrme de vsicules renfermant des dbris lipidique. Ces v-
sicules ont t prpares par la mthode de lmulsion inverse, la photo illustre
bien un des principal dfaut de cette technique: des centaines de gouttelettes fran-
chissent linterface en mme temps et environ 99 % ne deviennent pas des vsicules,
linterface se retrouve alors tapisse de dbris qui sont leur tour encapsuls
lors de passages russis.
3.4. PASSAGE DE LINTERFACE 39
3.4 Passage de linterface
3.4.1 Approche et zipping
Approche de linterface
La dynamique dapproche et de passage de linterface est le point le moins ap-
profondi, en partie d au fait que lobservation sous microscope nest pas vidente.
Cependant des tudes thoriques [47, 48] et exprimentales [49] de lapproche dune
goutte une interface, nous permettent de mieux apprhender les paramtres phy-
siques importants qui gouvernent cette tape.
Fig. 3.13: Eet du nombre de Bond sur la dformabilit dune gouttelette lors du
son passage une interface uide/uide (Manga et al. [50]).
Le nombre sans dimension B
o
= aR
2
/ appel nombre de Bond (ou nombre
de Etvs), compare les forces inertielles aux forces de tension de surface, avec
la dirence de densit entre les deux uides, a lacclration, R le rayon de la
gouttelette et la tension de surface. Ce nombre est un bon critre pour valuer
la dformabilit des interfaces uides. Lorsque les forces de tension de surface
dominent, ce qui est le cas dans notre systme pour lequel B
o
= 10
4
10
3
pour des gouttelettes de taille comprise dans la gamme 10-100 m de diamtre, les
gouttelettes restent sphriques. Les simulations numriques du travail de thse de
Manga [47, 50] illustrent la relation entre nombre de Bond et dformation dune
goutte lapproche et pendant le passage dune interface uide, plus ce nombre
est faible et moins la goutte se dforme (gure 3.13).
A lapproche de linterface LOS/DAS, pour des distances gouttelette-interface
susament petites (de lordre du rayon de la gouttelette), la prsence de linterface
40 CHAPITRE 3. CDICE
Rgime de Stokes Rgime de Taylor
zipping
R
h
drainage
h<R h>R
v
stokes
R
2
v
TA
Rh
Fig. 3.14: Pour des distances linterface suprieures R, la gouttelette est dans
le rgime de Stokes caractris par une vitesse v
Stokes
R
2
. A des distances inf-
rieures R, la force visqueuse augmente due au drainage du lm dhuile entre la
gouttelette et linterface. Cette dissipation engendre un ralentissement de la gout-
telette et v
TA
Rh. Enn, lorsque le lm atteint un paisseur critique, les deux
monocouches de lipides zippent ensemble pour former la membrane.
gnre des modications de lhydrodynamique. La vitesse de la gouttelette diminue
due laugmentation de la friction visqueuse lors du drainage de lhuile entre
linterface et la gouttelette. Le rgime de Stokes caractris par la vitesse v
Stokes
=
2aR
2
/9 nest plus valide et la gouttelette entre dans le rgime dit de Taylor
2
avec une vitesse corrige [48] (calcul dtaill en annexe):
v
TA
=
2aRh
9
, (3.3)
o h est la distance entre la gouttelette et linterface. Le temps de drainage
d
est
dtermin en calculant lintgrale:

d
=
_
h
in
h
c
dh
v
TA
(h)
, (3.4)
o h
c
est lpaisseur critique du lm avant que le rgime de zipping ne commence
(de lordre dune dizaine de nanomtres) et h
in
est la distance initiale linterface
lorsque la gouttelette commence ralentir (typiquement h
in
= R). Lexpression
du temps de drainage est alors donne par:

d
=
9
2aR
ln
_
h
in
h
c
_
. (3.5)
2
Lorigine du nom de ce rgime reste mystrieuse, les papier faisant rfrence au rgime de
taylor citent tous une rfrence qui nexiste pas.
3.4. PASSAGE DE LINTERFACE 41
Dans notre systme, pour une gouttelette de 10 m de rayon subissant une acc-
lration de 40g, le temps de drainage
d
= 1, 2 s, que lon peut comparer aux 0,2
s ncessaire cette gouttelette pour parcourir la mme distance dans le rgime de
Stokes.
Temps caractristique de Zipping
On dcrit le rgime de zipping de la faon suivante: la gouttelette rentre en
contact avec linterface, lchelle macroscopique, elle est soumise aux forces de
tension interfaciale F

= 2r au niveau de la ligne de contact avec linterface qui


aident le passage de la goutte, la force centrifuge

F
centri
, et la force de friction
visqueuse

F
friction
qui soppose au mouvement. Lquilibre des forces scrit alors:

+

F
centri
+

F
friction
=

0. (3.6)
Avec F

= 2r sin selon laxe z. La force centrifuge en tenant compte


quune partie de la gouttelette se situe dans la DAS et lautre dans la LOS
sexprime de la faon suivante

F
centri
= (
1

EAS/LOS
+
2

EAS/DAS
)a o

1
et
2
sont les fractions de volume de la goutte immerge dans lhuile mi-
nrale et dans la DAS respectivement et a le vecteur acclration. Aprs un
peu de gomtrie daprs la gure 3.15, cette force sexprime comme F
centri
=
4
3
R
3
a(
1
2
(1 +cos )
DAS/LOS
+
EAS/DAS
). Il faut alors choisir la bonne expres-
sion pour la dissipation visqueuse. En premire approximation nous avons consi-
dr la force de Stokes sur une sphre dans de lhuile minrale

F
Stokes
= 6R

Z e
z
mais dans ce cas le temps caractristique de zipping est trs largement sous-
estime (gure 3.16). Nous avons donc considr la friction de la ligne de contact
value par Huh et Scriven [51]. La gomtrie du problme rend lestimation de
la friction complique, nous avons choisis de ne considrer leet de la gomtrie
que sur la variation du primtre, mais nous utilisons lexpression de la force sur
un coin comme si la sphre tait un cylindre et la force navait quune composante
verticale selon z. Dans ces conditions, une estimation grossire de cette force est
donne par:

F
friction
2r
3l

Z e
z
, (3.7)
avec l un facteur logarithmique l = ln(R/b) qui dpend dune longueur de coupure
maximale R (rayon de la gouttelette) et dune longueur de coupure aux tailles
molculaires pour viter la divergence du gradient de vitesse quand lpaisseur du
uide tend vers zro. Dans lapproximation des petit angles,
D
= (6l

Z/)
1/3
(loi
dHomann), et en remplaant dans lquation 3.7, nous obtenons:
42 CHAPITRE 3. CDICE

F
friction

3
6
1/3
2r(l
1/2
)
2/3

Z
2/3
e
z
(3.8)
R
Z
r
0

z
LOS
DAS
LOS
DAS

D
Dissipation visqueuse
EAS
EAS
F
friction
Fig. 3.15: Gomtrie du passage de la gouttelette linterface huile/eau.
Nous adimensionnalisons lquilibre des forces en posant X(t) = Z(t)/R et
=

R
t. Dans le terme de la force centrifuge, il y a un nombre de Bond qui apparait
(R
2

DAS/LOS
a/), ce nombre est de lordre de 10
4
pour notre systme, nous
ngligerons donc ce terme par la suite et considrerons que le rgime de zipping
est uniquement contrl par le mouillage. Finalement, nous obtenons lquation
direntielle suivante:
(1 X(t)
2
)
1/2
= K(

X(t))
2/3
, (3.9)
o K = 3l
2/3
/6
1/3
. Aprs intgration numrique de cette quation (gure 3.16),
nous trouvons un temps caractristique de passage de lordre de 3 ms, assez loi-
gn des temps de passage 300 ms rapports pour des expriences de transfert
spontan [23] mais plus grand que si nous avions considr la friction visqueuse de
Stokes.
Lorsque nous adimensionnalisons les donnes [23] dcrivant le passage de lin-
terface par des gouttelettes en transfert spontan, nous pouvons ajuster la solution
numrique en changeant lchelle des dun facteur 120 (gure 3.16). Cest comme
si nous avions une tension de surface eective de 0,1 mN/m au lieu de la valeur
de 12 mN/m dtermine par lexprience de la goutte pendante. Cependant, nous
navons pas tenu compte, par exemple, que lcoulement sur la surface de la gout-
telette durant sa traverse de la LOS peut compresser les lipides plus que lors
de lquilibre atteint en goutte pendante, rsultant en une tension de surface plus
basse mais surement pas susamment pour atteindre 0,1 mN/m.
De toute faon, lobservation en vue de dessus du passage spontan est dicile
car nous navons pas de rfrence prcise pour le temps initial du dbut du zip-
3.4. PASSAGE DE LINTERFACE 43
Fig. 3.16: A gauche, comparaison de lvolution de cos en fonction de lorsque
lon prend pour la force de dissipation visqueuse la foce de Stokes (courbe bleu)
ou la dissipation de la ligne triple dans un coin (courbe rouge). Au dbut, le
zipping commence doucement puis acclre jusqu lquateur puis diminue
jusqu la n. A droite, comparaison entre les donnes de Yamada et al. [23] pour
des vsicules de dirents diamtres, adimensionnalises et un ajustement de la
solution numrique. Les points exprimentaux suivent bien lallure gnrale de la
courbe lexception des donnes pour une goutte de rayon R=13,8 m (carrs
turquoise) et pour une goutte de rayon R=7,4 m (cercles bleu).
ping . Pour comprendre la cintique de passage, il serait ncessaire deectuer des
sries de mesures en transposant notre dispositif sous microscope pour lmer le
passage en camra rapide, le suivit dune gouttelette tant possible condition de
synchroniser la frquence dacquisition de la camra sur la vitesse de rotation de la
chambre. Une autre possibilit consiste pour des expriences de transfert spontan,
coucher le microscope lhorizontale pour avoir une vue de ct de la chambre.
Ces montages permettraient alors de suivre le passage complet des gouttelettes au
travers de linterface.
3.4.2 Dtachement
A la n de lassemblage des deux feuillets, il faut que la vsicule se dtache de
linterface. Trs probablement, cela consiste en la rupture dun tube de lipides de
taille molculaire. Nous ne connaissons pas les mcanismes qui pilotent cette tape.
Nanmoins, certaines observations nous donnent des indices. Le dtachement de
linterface est aid par la centrifugation; en eet dans le cas du transfert spontan,
44 CHAPITRE 3. CDICE
sous laction de la gravit, les vsicules restent suspendues linterface pendant
de longues heures tandis que dans notre cas une partie des vsicules passent avec
succs linterface et nous les rcuprons dans la DAS. La dirence de densit
entre EAS et DAS semble galement tre une cl du succs: le rendement, cest-
-dire le pourcentage de gouttelettes qui deviennent eectivement des vsicules,
augmente linairement avec la dirence de densit EAS/DAS dans la gamme
teste 4.10
3
0, 65 g/cm
3
jusqu atteindre 60% (gure 3.17). Pour quantier le
rendement, nous avons produit des vsicules pendant une minute tout en lmant la
production des gouttelettes la pointe du capillaire pour dterminer prcisment la
frquence de production. La DAS contenant les vsicules est alors dpose dans une
chambre dobservation sous microscope et nous comptons le nombre de vsicules
produites.
Fig. 3.17: Rendement (pourcentage de gouttelettes qui deviennent eectivement
des vsicules) en fonction de la dirence de densit entre EAS/DAS. Le ren-
dement augmente linairement avec de 1% pour un correspondant des
solutions de sucrose/glucose de 62 mM jusqu 61% pour des solutions de su-
crose/glucose de concentration 1 M. La frquence de production joue un rle im-
portant sur le rendement nal: pour le mme = 0, 033 g/cm
3
, lecacit est
de 34% 450 Hz et chute 23% (carr bleu) lorsque la frquence de production
augmente 775 Hz
3.5. CARACTRISTIQUES DES VSICULES PRODUITES PAR CDICE 45
3.5 Caractristiques des vsicules produites par
cDICE
3.5.1 Distribution de taille des vsicules
Les distributions de taille sont dtermines par analyse dimage. La densit
de probabilit est reprsente en fonction du diamtre des gouttelettes et des
vsicules (gures 3.18 et 3.19). La comparaison des deux distributions permet de
sassurer que les deux sont centres sur la mme valeur moyenne, cest--dire que
les vsicules obtenues sont bien issues de la couverture des gouttelettes par une
bicouche. En revanche la distribution des vsicules prsente un lger paulement
pour les plus grands diamtres (gure 3.18a). Cet paulement peut sexpliquer par
la fusion de gouttelettes durant leur traverse de la LOS ou sur linterface, et ce
malgr le contrle de la frquence de production.
La taille des vsicules peut tre facilement slectionne en variant la taille du
capillaire tout en gardant une faible polydispersit /d) < 11% dans la gamme
10-40 m, et d) tant lcart type et le diamtre moyen (gure 3.18b).
Il est possible de descendre vers de plus petites tailles. Nanmoins, comme
voqu prcdemment, nous sommes limits au niveau de la taille du capillaire des
valeurs denviron 4 m de diamtre. Il faut donc augmenter le nombre capillaire en
changeant la viscosit de la phase continue et la vitesse de rotation pour atteindre la
gamme des valeurs hautes de C
a
de la gure 3.4. Par exemple, avec un capillaire
de 4 m, en utilisant de lhexadecane ( = 3, 3mPa.s) comme phase continue et en
tournant 40 tours par seconde, C
a
= 0, 2 et lon produit ainsi des vsicules de 4
m de diamtre (gure 3.19a). Gouttelettes et vsicules possdent la mme valeur
moyenne, mais la polydispersit augmente /d) = 17 %. Llargissement sur les
tailles suprieures provient probablement de la fusion des gouttelettes en solution,
llargissement vers les tailles plus petites est quant lui plus surprenant.
La production de vsicules de grande taille (>40 m) demande de diminuer la
vitesse de rotation 10 trs/s pour que la condition
F
>
s
soit respecte. Avec
un capillaire de 6 m et un C
a
= 0, 04, des vsicules de 68 m sont produites;
la polydispersit est plus importante, /d) = 25, 8 % (gure 3.19b).
3.5.2 Encapsulation
La solution aqueuse que lon souhaite encapsuler lintrieur des vsicules
cDICE peut contenir divers objets aussi varis que des collodes, des globules
rouges, des protines, des tampons de force ionique comparable aux conditions
physiologiques (>150 mM), de lADN marqu (25 bases), une solution de sucrose
concentre 1M ou bien du dextran 2MW 8% w/w de viscosit 40 mPa.s. Un
46 CHAPITRE 3. CDICE
Fig. 3.18: a. Superposition de la distribution de taille des gouttelettes produites
(losanges bleu), avec celle des vsicules obtenues (cercles rouges); (d) est la densit
de probabilit en fonction du diamtre. Les deux distributions sont centres sur la
mme valeur moyenne d) = 18 m. Au niveau de lpaulement de la distribution
des vsicules, les ches indiquent les valeurs de diamtres correspondant la
fusion de 2, 3 et 4 gouttelettes. b.Distributions de taille pour des vsicules de
d) = 8 m et = 1 m (losanges vert); d) = 18m et = 2 m (cercles rouge);
d) = 37 m et = 3 m (carrs bleu). Les vsicules ont t produites avec un
capillaire de 5 m C
a
= 0, 06 (losanges vert) et C
a
= 0, 035 avec des capillaires
de 6 et 13 m pour les tailles 18 et 37 m respectivement.
aperu est donn sur la gure 3.20.
Pour parvenir encapsuler ecacement une solution, il faut veiller deux
principaux points: lajustement de la pression osmotique entre EAS et DAS et la
dirence de densit entre ces deux solutions.
An de prvenir les risques de formation de bouchons lors de lencapsulation de
collodes micromtriques, lintrieur des capillaire doit tre trait. La colle optique
NOA61 (Norland) est une bonne candidate, la polymrisation dune ne couche
de colle sur une longueur denviron 300 m la pointe du capillaire permet de
limiter ladhsion des collodes sur les parois internes. Les interactions entre les
particules collodales et la membrane de lipide peuvent galement tre minimises
en utilisant des LOS contenant 5% mol/mol de lipides PEG.
Pour lencapsulation des globules rouges, nous avons ajust la densit de la
solution de suspension avec celle des globules pour viter leur centrifugation dans
les gouttelettes lors de la traverse de la LOS. La distribution de la concentration
3.5. CARACTRISATION DES VSICULES 47
Fig. 3.19: Superposition des distributions de taille des gouttelettes et des vsicules
obtenues. a. Gouttelettes et vsicules sont centres sur la mme valeur moyenne
d) = 3, 8 m et produites C
a
= 0, 2. Pour les vsicules = 0, 6 m. b. Distribu-
tion de tailles des vsicules centre sur d) = 68 m avec = 17 m, production
C
a
= 0, 04.
,
dhmoglobine intracellulaire rsulte en une distribution de densit des globules de
1,085 g/cm
3
pour les plus jeunes jusqu plus de 1,112 g/cm
3
. Nous avons alors
prpar une solution de dextran 1,09 g/cm
3
et ajust la pression osmotique
300 mosm avec du glucose, aprs centrifugation de globules sur cette solution,
nous avons prlev quelques microlitres sur le dessus que nous avons utilis pour
lencapsulation.
Direntes collaborations nous ont amenes encapsuler diverses protines:
lactine (groupe dAndreas Bausch, Munich) et lezrine (Nada Khalifat), compo-
sants du cytosquelette; FtsZ (groupe de Petra Schwille, Dresde), protine impli-
que dans le mcanisme de division cellulaire des bactries. Pour lencapsulation
de lactine, nous avons dilu les monomres dactine 15 M dans le tampon de
polymrisation juste avant de lintroduire dans le capillaire et de commencer lin-
jection. Eectue rapidement, cette tape demande 30 s auxquelles il faut ajouter
5-10 minutes de production de vsicules, du mme ordre de grandeur que le temps
ncessaire pour que la polymrisation dbute. Comme le tampon de polymrisation
est ionique, nous utilisons une solution de glucose ajuste osmotiquement comme
DAS, condition ncessaire pour que le passage linterface se droule correctement.
Pour encapsuler lhmoglobine, protine responsable du transport de loxygne
dans lorganisme, dont la densit est importante, nous ajustons la densit de la DAS
48 CHAPITRE 3. CDICE
a. b.
c.
d.
e.
Fig. 3.20: Exemples dencapsulation. a. collodes de 1 m 4% v/v; b. globule
rouge; c. protine FtsZ 0,5 M qui se lie au POPS de la membrane constitue de
90% Egg-PC+10% POPS; d. et e. faisceaux dactine + fascine. Lchelle reprsente
10 m.
avec du percoll de manire obtenir un de lordre de 2.10
2
2.10
3
g/cm
3
,
nous utilisons galement des capillaires trait la colle pour limiter ladhsion sur
les parois.
Lencapsulation de uides visqueux demande dappliquer une surpression plus
importante du fait de la rsistance hydrodynamique qui augmente avec la viscosit;
pour une solution de dextran 2Mw concentr 8% w/w dont la viscosit avoisine
les 40 mPas, nous appliquons une pression de 800 mbar lorsque lon injecte dans
un capillaire de 10 m de diamtre.
3.5.3 Proprits de la membrane
Observe au microscope avec un objectif x100 immersion et grande ouverture
numrique (N.A.= 1,3), permettant ainsi datteindre une rsolution denviron 0,25
m, la membrane ne prsente pas de dfaut (gure 3.21). Lorsque nous suspendons
3.5. CARACTRISATION DES VSICULES 49
les vsicules dans une solution lgrement hypertonique, les vsicules se dgonglent
et leur membrane uctue indiquant que la membrane est bien permable leau.
Cependant, par manque de temps, nous navons pas caractris les uctuations
permettant de dterminer le module de courbure de la membrane pour le comparer
avec les donnes existantes sur des vsicules lectroformes [? ] . La question de
la prsence de solvant rsiduel dans la bicouche est pertinente, en particulier pour
ltude des proprits physico-chimiques de la membrane comme par exemple la
formation de domaines. La prsence dhuile dans la bicouche peut modier les
proprits de diusion des lipides dans la membrane ou encore les transitions de
phase dans les mlanges. Caractriser prcisment de faibles quantits dhuile reste
dlicat, cependant nous avons ralis plusieurs contrles qui tendent montrer que
si prsence dhuile il y a, cest uniquement ltat de traces.
Fig. 3.21: a. Image en champ clair dune vsicule avec un objectif x100 (N.A. 1,3)
et un condenseur (N.A. 1,1). b. Partie de membrane marque au PKH (sigma) et
image en piuorescence (x100, N.A. 1,3).
Le premier test consiste encapsuler une solution de uorescine puis dajouter
a posteriori de lalpha-hmolysine dans la solution dans laquelle sont suspendues les
vsicules. Cette protine est connue pour former des nanopores dans les membranes
[? ]. En pratique, 1 l dalpha-hemolysine 1 mg/ml dans 10 mM Hepes et 150
mM KCl est dilu dans 100 l de glucose (ajust osmotiquement avec lEAS).
Ces 100 l sont ensuite ajouts dans la chambre dobservation contenant 200 l de
suspension de vsicules. Des photos en uorescence sont prises avant et aprs ajout
de lalpha-hmolysine: au dpart lintensit lintrieur des vsicules atteint 2000
ua (unit arbitraire) et celle de la solution de suspension 225 ua; trois heures plus
tard, les pores forms par lalpha-hmolysine ont permis un change entre EAS et
solution extrieure et lintensit dans les vsicules est tombe 325-330 ua tandis
que dans le mme temps lintensit de la solution extrieure a augment autour de
50 CHAPITRE 3. CDICE
310-315 ua. Cette protine transmembranaire est donc bien fonctionnelle.
a.
b.
Fig. 3.22: Vsicules contenant de la uorescine, avant (a.) et 3h aprs (b.) ajout
dalpha-hmolysine. Les prols dintensit correspondant sont reprsents droite
de chaque photo. Avant ajout dalpha-hmolysine, le fond prsente une intensit
de 225 ua (unit arbitraire) tandis que lintensit lintrieur de la vsicule atteint
environ 2000 ua. 3 heures aprs ajout de lalpha-hmolysine , des nanopores se sont
constitus dans les membranes autorisant un change entre EAS/DAS: lintensit
du fond a maintenant augment 310-315 tandis que lintensit dans la vsicule a
chut 325-330. Lintensit de la photo b. a t rechelonne pour lachage.
Le deuxime test, plus direct, consiste mesurer lpaisseur de la bicouche en
microscopie force atomique (AFM). Ces mesures ont t ralises en collabora-
tion avec Pierre Emmanuel Milhiet et Cdric Godefroy (CBS, UMR 5048 CNRS,
UMR554 INSERM). Un choc osmotique hypotonique est appliqu pour faire cla-
ter les vsicules et en prsence dions Ca
2+
(3 mM CaCl
2
) les membranes sont
plaques sur le substrat de mica. Le tout est rinc avec le tampon dimagerie (Tris
10 mM, KCl 150 mM, MgCl
2
5 mM pH 7,4). Un premier point positif est lhomo-
gnit de la membrane (voir gure 3.23 A), indiquant quil ny a pas de dfaut
sur la membrane ou de goutte dhuile emprisonne dans la bicouche. De plus les
hauteurs mesures sur 40 sections donnent une valeur moyenne de 4, 280, 62 nm,
similaire aux hauteurs (4-5 nm) mesures par AFM pour une bicouche supporte
de DOPC prpare par fusion de SUV (small unilamellar vesicles) [? ] et proche de
la valeur mesure par rayons X de 3,69 nm [? ]. La dirence avec la mesure rayons
X provient de la prsence dune ne couche molculaire deau entre la surface de
3.5. CARACTRISATION DES VSICULES 51
mica et les ttes polaires des lipides [? ].
Fig. 3.23: Caractrisation par AFM dune bicouche degg-PC sur du mica prove-
nant de lclatement dune vsicule CDICE. A. Membrane image en mode peak
force tapping (mode oscillant), lchelle de couleur qui code pour la hauteur st-
tend sur 30 nm et la barre dchelle reprsente 10 m. La ligne horizontale au milieu
correspond une perte dinterraction pointe chantillon. B. Image quadrature
qui rend compte de la dirence dinteraction entre la pointe et lchantillon se-
lon que lon se trouve sur le mica ou la membrane. C. Distribution des hauteurs
mesures sur 40 sections avec une valeur moyenne de 4,28 0,62 nm
52 CHAPITRE 3. CDICE
3.6 Conclusion
La mthode que nous avons dvelopp prsente de nombreux avantages. Simple
mettre en uvre, elle permet la production de vsicules de taille contrle avec
une distribution de taille pique: /d) < 11% dans la gamme 4-40 m de diamtre
et plus large sur une gamme tendue de 4-70 m. La formation individuelle de
chaque feuillet puis leur assemblage nal lors du passage des gouttelettes au travers
de linterface huile/eau, est un processus ecace autorisant lencapsulation de
substances varies, en veillant ce que losmolarit des solutions interne et externe
soit quilibre et lEAS lgrement plus dense que la DAS.
La production de gouttelettes monodisperses par goutte goutte et le contrle
de la frquence de production des gouttelettes permet doptimiser la couverture
continue des interfaces huile/eau, rsultant en un rendement important: environ
150 vsicules par seconde produites avec un seul capillaire et de faon continue (>20
min). Ceci nest possible qu la seule condition que la cintique dadsorption des
lipides aux interfaces soit susament rapide. La mise au point du protocole de dis-
persion des lipides dans lhuile minrale a demand de nombreux ajustements mais
il est maintenant reproductible et applicable de nombreux lipides et mlanges de
lipides.
De par ltendue des tailles accessibles 4-70 m qui couvre les tailles des cellules
biologiques, de lecacit dencapsulation, de la diversit des lipides que nous
avons utilis et la possibilit de travailler en conditions salines physiologiques, nous
pensons que cette nouvelle technique est une mthode de choix pour la conception
de systmes biomimtiques.
De faon plus gnrale, cette mthode ainsi que le concept plus gnral de
production de capsules dpaisseur contrle a fait lobjet dun dpot de brevet.
Deuxime partie
Une approche microuidique de
la drpanocytose: tude de la
vaso-occlusion
53
Introduction une maladie
gntique du sang: la
drpanocytose
Lanmie falciforme ou drpanocytose est une maladie gntique de la micro-
circulation sanguine qui touche environ cinquante millions de personnes de part le
monde, principalement sur le continent Africain, en Inde et au Moyen Orient. Son
caractre hrditaire est dmontr par James Neel en 1949 [52] et la mme anne
Linus Pauling [53] en dcouvre lorigine molculaire: une stucture anormale de la
protine dhmoglobine la rendant moins soluble. Cest la premire fois que le lien
est fait entre une maladie gntique et un dysfonctionnement au niveau molcu-
laire. Lhmoglobine, contenue dans les globules rouges, est la protine responsable
du transport de loxygne dans lorganisme. La forme responsable de cette mala-
die est appele hmoglobine S (HbS). Elle est le rsultat dune mutation gntique
impliquant la substitution dun seul acide amin qui la rend moins soluble. En
absence doxygne, le changement conformationnel de la protine rend possible
lagrgation des monomres dHbS. Ce phnomne est compltement rversible et
ds que la concentration doxygne est susante les bres dHbS dpolymrisent.
La pathophysiologie de la drpanocytose est complique par son caractre multi-
chelle et reste inexplique: au niveau molculaire, lHbS polymrise en quelques
millisecondes pour former des bres qui peuvent atteindre plusieurs microns;
lchelle du globule rouge, les dformations apparaissent en quelques secondes; en-
n plus grande chelle, la vaso-occlusion est responsable des crises anmiques
rptitives [1].
Une premire approche consiste tudier la cintique de polymrisation de
solutions puries dHbS. Lexistence dun temps de latence entre le moment o
lhmoglobine est compltement dsoxygne et la formation des bres a ainsi t
mis en vidence [54], ce temps dpend grandement de la concentration initiale
dHbS. Les mesures sur la cintique ont aussi permis de proposer deux types de
mcanismes pour la formation des polymres [55]; une nuclation initiale homogne
suivie par une nuclation htrogne sur le polymre dj existant. Ce modle de
55
56
double nuclation permet dexpliquer les dpendances extrmes la concentration
dHbS du taux de nuclation [56], et du taux de formation de domaines [57] .
Dautres tudes ont aussi t menes sur la cintique de polymrisation pour des
saturations partielles en oxygne [58] ou encore sur la cintique de dpolymrisation
[59]. Toujours sur des solutions dHbS, la nuclation, la croissance de bres et
de domaines ont t observs par microscopie contraste interfrentiel [60, 61],
observations conrmant le modle de double nuclation. Enn Wang et al. [62] ont
mesur le module de courbure et la longueur de persistence de bre individuelle.
Lextrme variabilit et le fait que lon ne puisse pas prvoir les crises parmi
des patients ayant le mme gnotype HbSS sont la preuve que le processus encore
indtermin conduisant la vaso-occlusion est complexe. Stephen H. Embury [63]
et Robert P. Hebbel [64] font chacun une analyse critique du dogme de la poly-
mrisation et dformation des globules rouges comme uniques facteurs importants
menant la vaso-occlusion. Pour aller plus avant dans la comprhension de la pa-
thophysiologie et des mcanismes impliqus dans la vaso-occlusion de nombreuses
tudes ont t menes sur des globules rouges in vitro mais aussi in vivo. Lh-
trognit de la concentration en HbS dans les globules rouges est responsable
dune riche morphologie [65] et de comportements rhologiques dirents [66]. La
capacit dun globule rouge se dformer est un facteur important lors du passage
dans les capillaires sanguins les plus petits, la polymrisation intracellulaire et la
rptition des cycles de dformation altrent la dformabilit des direntes popu-
lations de globules; les plus denses, souvent irrversibles (gardent leur dformation
mme en condition normale doxygnation) sont ceux qui deviennent le moins d-
formables tandis que les rticulocytes les moins denses sont les plus dformables et
moins rigides [67]. Il a t montr que la dtrioration des proprits mcaniques
concide avec la dshydratation des globules et laugmentation de la viscosit due
laugmentation de la concentration intracellulaire dhmoglobine [6870]. Dshy-
dratation et dformation sont intrinsquement lies car la dsoxygnation et la
dformation qui laccompagne induisent une augmentation de la permabilit de
la membrane pour les cations (K
+
, Na
+
et Ca
2+
) [71] et dune perte deau [72].
Les expriences de micropipettes [67, 73, 74] ont permis de mesurer les propri-
ts mcaniques sur des cellules drpanocytaires individuelles dmontrant ainsi que
mme en condition normale doxygnation ces globules possdent une dformabi-
lit moindre et une rigidit plus importante que les globules normaux. Les globules
anmis ont aussi la particularit dtre plus adhrents sur les cellules endothliales
[75], Barabino et al. ont aussi tudi les proprits dadhsion grce une chambre
ux recrant mieux les conditions physiologiques dcoulement [76]; de plus, cette
plus grande adhsion a aussi t observe in vivo [77].
Plus rcemment, la dmocratisation des techniques de lithographie a permis
la construction de puces microuidiques pour dsoxygner rapidement des cellules
57
[78] ou bien pour ltude en gomtrie conne du ux dune solution de globules
anmis [79].
58
Chapitre 4
Pathophysiologie, Hmoglobine S
et tudes sur des cellules
4.1 Pathophysiologie
Les crises anmiques, caractrises par dintenses douleurs pouvant durer plu-
sieurs jours et localises principalement dans les extrmits des membres, la poi-
trine ou labdomen [80], sont pourtant la consquence dune unique mutation sur
un seul acide amin de la molcule dhmoglobine.
Langle dapproche pour comprendre ces aspects pathophysiologiques jusque
dans le milieu des annes 90 consistait considrer le problme de la vaso-occlusion,
responsable des crises douloureuses, comme tant le rsultat dune obstruction
strique de la microcirculation due la dicult de passage dans les capillaires
sanguins les plus ns (quelques microns) des globules rouges fortement dforms
en absence doxygne, par la polymrisation de lhmoglobine S in cellulo. Cette
approche a dbouch sur toutes les tudes ralises sur des solutions dhmoglobine
S purie. Cependant, cette seule explication soure de plusieurs contradictions.
Tout dabord parce que la vaso-occlusion arrive frquemment dans les artres cr-
brales ( 20% des cas chez les enfants [81]), loin de limage des capillaires obstrus
par quelques globules falciformes. La vaso-occlusion a lieu galement au niveau de
la circulation pulmonaire, donc par des globules ne contenant pas de polymre
et par consquent prsentant pour la plupart leur forme discocyte normale. Le
syndrome thoracique aigu concerne les deux tiers des personnes aectes par la
drpanocytose, il est responsable de 20% des cas de dcs [82].
Le dogme de la polymrisaton au niveau molculaire comme seule responsable
des symptmes observs lchelle de lorganisme, a commenc tre remis en
cause partir des annes 90 mais surtout dans les annes 2000 [63, 64]. La grande
disparit dun malade lautre dans loccurence des crises anmiques et le caractre
59
60 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
non prvisible de celles-ci, a men la rexion sur la recherche des autres facteurs
pouvant tre impliqus, et guid les tudes raliss lchelle de la cellule et sur les
observations de la circulation dans des modles in-vivo. La vision moderne qui
se dgage au regard de ces rcentes tudes, implique ncessairement un processus
multi-chelles (molculaire, cellulaire, et circulation) et multi-tapes qui seront
discuts dans la dernire partie de ce chapitre.
4.2 Structure molculaire
4.2.1 La molcule dhmoglobine
La molcule dhmoglobine dont la principale fonction est le transport de loxy-
gne des poumons jusque dans les tissus profonds, tient une place particulire dans
lhistoire de la chimie des protines; de par son abondance et sa facilit lisoler de
nombreux scientiques se sont penchs sur son tude. On doit la premire obser-
vation de la cristallisation dune protine Friedrich Hnefeld qui en 1840 laissa
svaporer lentement une goutte de sang entre deux lamelles [83]. Lhmoglobine
fut la premire protine caractrise par ultracentrifugation [84], qui permit de
dmontrer que la molcule contient quatre atomes de fer et que cest un matriau
homogne, rsultats fondamentaux une poque o la nature des protines tait
encore inconnue. Cest aussi la premire fois dans le cas de lanmie falciforme que
la nature molculaire dune maladie a t prouve, Linus Pauling faisant le lien en
1949 [85] entre mutation gntique et le changement dun seul acide amin dans
la structure de lhmoglobine. Les premires structures tridimentionnelles de pro-
tines dtermines par rayons-X furent celles de la myoglobine (monomre) puis
peu de temps aprs de lhmoglobine par Perutz en 1959 [86].
La molcule dhmoglobine est un htrottramre compos de deux sous-units
alpha et deux sous-units beta (voir gure 4.2) qui sont apparentes la myoglobine
(protine monomrique responsable du transport de loxygne dans les muscles),
chacune de ces sous-units est lie de faon non covalente un hme (gure 4.1).
Molcule planaire, lhme contient en son centre un atome de fer II qui est respon-
sable de la couleur rouge du sang et sur lequel se lie une molcule de dioxygne
(gure 4.1).
Les chaines de polypeptides sont arranges de telle sorte que les interactions
les plus importantes ont lieu entre sous-units direntes: lassociation
1

1
(et
son quivalence par symmtrie
2

2
) implique 35 rsidus tandis que lassocia-
tion
1

2
(et
2

1
) met en jeux 19 rsidus. En plus de ces interactions de
nature hydrophobe, il existe de nombreuses liaisons hydrogne et paires dions. Les
interactions entre sous-units similaires (
1

2
et
1

2
) sont quant elles peu
nombreuses, ceci sexplique par le fait que ces sous-units se font face de part et
4.2. STRUCTURE MOLCULAIRE 61
Fig. 4.1: Formule de la molcule dhme, le dioxygne se xe sur latome de fer
au centre (wikipedia)
dautre dun canal de 20 de diamtre sur 50 de long (voir gure 4.2).
Fig. 4.2: A gauche, reprsentation de la structure de la molcule dhmoglobine
forme des quatre sous units
1
,
2
,
1
et
2
renfermant chacune un hme (plan
rouge). Le canal form au centre du ttramre est rempli de solvent. A droite, le
changement de conformation entre la forme oxygne et dsoxygne consiste en
une rotation de 15

des deux dimres (Eaton et al. [87])


En 1968 Perutz et al. [88] ont tabli par diraction aux rayons-X les structures
haute rsolution de loxy et deoxyhmoglobine. Ces observations ont montr
que laxe de symtrie dordre 2 est prserv et que le changement de conformation
induit par la dioxygne implique une rotation de 15

du dimre
1

1
par rapport
au dimre
2

2
rsultant en un dplacement de 6 de certains atomes linterface

2
(gure 4.2). Habituellement, la forme dsoxygne est not T (pour "tense")
62 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
et la forme oxygne R (pour "relaxed").
La liaison de lhmoglobine avec les molcules de dioxygne est un processus
coopratif ou allostrique, lanit de liaison est aecte par la saturation en oxy-
gne de la molcule: la xation de la premire molcule entrainant un changement
de conformation de lhmoglobine qui augmente lanit de liaison de la seconde
et ainsi de suite. Le caractre coopratif est caractris par une courbe danit en
fonction de la pression partielle en oxygne en forme de sigmode (gure 4.3). La
capacit de lhmoglobine xer loxygne dcroit avec la prsence de monoxide
de carbone qui se lie prfrentiellement la place de loxygne.
arterial pressure
veneous pressure
Fig. 4.3: Pourcentage de sites saturs en O
2
dune solution dhmoglobine en
fonction de la pression partielle dO
2
, les lignes noires verticales reprsentent res-
pectivement la pression partielle dans les veines et dans les artres. (adapt de
Voet et al. [89])
De nombreuses variantes anormales de lhmoglobine existent, plus de 860 mu-
tants ont t rpertoris ce jour et 5 % de la population mondiale est porteur
dune variante hrditaire. Lhmoglobine S (HbS) responsable de lanmie falci-
forme est le rsultat dune mutation impliquant la substitution dun seul acide
amin: la sixime position des chaines , le glutamate charg ngativement est
remplac par une valine neutre et hydrophobe. Localise sur la surface de la mol-
4.2. STRUCTURE MOLCULAIRE 63
cule, cette substitution na pas deet majeur sur la conformation de la protine.
Cependant, moins soluble que lhmoglobine normale (HbA), lHbS dans sa forme
dsoxygne peut sagrger pour former un polymre.
4.2.2 Structure du polymre
La premire mise en vidence que lHbS forme des structures ordonnes est
mettre au crdit de Sherman [90] qui observa en 1940 la birfringence de solutions
de globules dsoxygns. Les nombreuses tudes de microscopie lectronique [91
93] ont permis de dterminer la structure molculaire des bres dHbS, celles ci
consistent en 7 double brins arrangs en un rseau hexagonal compact torsad; le
diamtre dune bre est de 21 nm (voir gures 4.5 et 4.4).
Fig. 4.4: Modle de la section dune bre dHbS, les sphres reprsentent les dif-
frents rsidus. Les rsidus impliqus dans des contacts inter double brin, intra
double brin en latral et intra double brin en axial, sont respectivement colors en
rouge, vert et bleu. (Voet et al. [89])
Les dirents contacts intermolculaires dans un double brin sont reprsents
sur la gure 4.6; seule la valine substitue de la sous unit
2
intervient dans un
contact intermolculaire. Elle se loge alors dans une poche de la sous unit

1
de la molcule adjacente dont la valine en 6
me
position ne participe pas dans
un contact. Cette poche est absente lorsque lhmoglobine S est oxygne. Le
fait que lhmoglobine A dsoxygne ne polymrise pas indique que le contact
impliquant la valine est essentiel pour la formation de bres. Limportance des
autres contacts intermolculaires a t dmontr en ralisant des expriences de
copolymrisation avec dautres mutants [94, 95] qui ont permis de dresser la carte
des principaux rsidus impliqus.
64 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.5: La photo de gauche est un clich de microscopie lectronique dune bre
dHbS xe en solution, le diamtre moyen dune bre est de 21 nm. A droite,
modle dune bre dHbS reconstitu partir des images de microscopie, chaque
sphre reprsente un molcule dhmoglobine.(Dykes et al. [91])
4.2. STRUCTURE MOLCULAIRE 65
Fig. 4.6: Shma reprsentant les contacts intermolculaires dans un double brin,
les rsidus en lettre blanche participent aux contacts les plus important. La valine
la sixime position de la chaine
2
est la seule tre implique dans un contact
intermolculaire, la valine de la chaine
1
est libre. (Voet et al. [89])
66 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
4.3 Etudes en solution
4.3.1 Solubilit de lhmoglobine S
Ds le dbut des annes 70 de nombreuses tudes sont menes sur des solu-
tions puries dHbS pour comprendre la cintique de polymrisation. Le systme
tudi, constitu dune solution de monomres et dune phase polymre est appel
gel et le processus conduisant la formation de polymre, glation ou polymrisa-
tion. Une description thermodynamique simple dun gel revient considrer que la
phase polymre se comporte comme un cristal en quilibre avec une solution dh-
moglobine monomrique (voir gure 4.7). La concentration dHbS dans la phase
solution est alors la solubilit.
Fig. 4.7: Schma reprsentant les deux phases en quilibre dans un gel dhmo-
globine S dsoxygne: solution de monomres-polymre (Eaton et al. [1])
La sdimentation par ultracentrifugation de gel de deoxyHbS (hmoglobine S
dsoxygne) permet de sparer la phase gel de la phase polymre, la solubilit est
dtermine en mesurant la concentration dHbS du surnageant. En 1976 Hofrichter
et al. [96] ont dmontr que la solubilit est indpendante de la concentration
initiale totale dhmoglobine , ce rsultat fondamental est cohrent avec le modle
dquilibre entre cristal et monomres: pour former du polymre, la solution doit
pralablement tre sature puis toute molcule dHbS supplmentaire se retrouve
dans le polymre.
4.3. ETUDES EN SOLUTION 67
Par des expriences de sdimentation lquilibre, Williams [97] a dmontr
que la phase monomrique ne comporte pas dagrgat molculaire: une solution de
deoxyHbS de concentration infrieure la solubilit est centrifuge vitesse plus
faible, les forces de sdimentation et de diusion atteignent un quilibre rsultant
en un prol de concentration apparent stable au cours du temps. La comparaison
de donnes obtenues pour une solution de deoxyHbS et de carbonmonoxyHbS qui
ne forme pas dagrgats (complexe soluble jusqu 0, 5 g/cm
3
) permet de conclure
labsence dagrgats en solution (voir gure 4.8), rsultat en accord avec la des-
cription dun quilibre solution-polymre. Labsence dagrgat en solution a t
vrie une dizaine dannes plus tard par Kam et Hofrichter [98] en diusion de
lumire.
Fig. 4.8: Rsultats dexprience de sdimentation lquilibre pour une solution
dhmoglobine S 20

C. Le poids molculaire apparent est reprsent en fonction


de la concentration en hmoglobine le long du prol de sdimentation. Les carrs
sont les donnes pour une solution dHbS stabilise par du monoxyde de carbone
et les triangles pour une solution de deoxyHbS; le fait que les deux courbes se
superposent indique quil ny a pas dagrgats dans la phase solution dun gel. La
barre verticale correspond la concentration maximale de la solution de deoxyHbS.
(Williams [97])
68 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.9: Dpendance la temprature dune solution dHbS dsoxygne. La
courbe qui passe par les points mesurs est un ajustement utilisant la formule
empirique, c
s
= 0, 319 0, 00883T + 0, 000125T
2
, avec la temprature exprime en
degr centigrade. (Ross et al. [99])
Eet de la temprature
Un des paramtres importants pour ltude de la polymrisation est la temp-
rature. Un gel peut tre prpar en chauant une solution de deoxyHbS et liqu
en le refroidissant. Les tudes de solubilit (gure 4.9) permettent de bien rendre
compte de ce phnomne. Ainsi la solubilit est maximale 0, 32 g/cm
3
0

C et
atteint un minimum de 0, 16 g/cm
3
35

C avant de crotre nouveau. A la tem-


prature physiologique de 37

C, on est donc proche du minimum de solubilit


comparer avec la concentration moyenne dhmoglobine dans les globules rouges
qui varie autour de 0, 30 0, 32 g/cm
3
. Pour une concentration totale infrieure
0, 16 g/cm
3
, une solution de deoxyHbS reste liquide quelque soit la tempra-
ture; entre 0, 16 g/cm
3
et 0, 32 g/cm
3
on peut eectuer des cycles rversibles de
polymrisation-dpolymrisation par chauage et refroidissement successif de la
solution.
A partir des donnes de solubilit de la gure 4.9, on peut calculer la fraction
dhmoglobine polymrise en considrant la conservation de la masse:
4.3. ETUDES EN SOLUTION 69
Fig. 4.10: Fraction polymrise de solutions dHbS dsoxygnes en fontion de
la temprature et calcule partir des donnes de solubilit de la gure 4.9 et
de lquation de conservation de la masse (q. 4.2), avec c
p
= 0, 69 g/cm
3
. Les
courbes sont calcules pour des concentrations initiales variant de 0, 20 g/cm
3
pour
la courbe la plus basse 0, 45 g/cm
3
pour la plus leve.
c
p
v
p
+ c
s
(1 v
p
) = c
0
, (4.1)
o c
p
, c
s
, c
0
sont respectivement la concentration de lhmoglobine dans la phase
polymre (c
p
= 0, 69 g/cm
3
), en solution et la concentration totale initiale (avant
glation), v
p
le volume occup par la phase polymre et c
s
la solubilit. La fraction
dhmoglobine polymrise en fonction de la temprature et de la concentration
initiale est dtermine parir de 4.1:
x
p
=
c
p
v
p
c
0
=
1 c
s
/c
0
1 c
s
/c
p
. (4.2)
Eet du pH
Les tests de solubilit dcrits jusqu prsent ont tous t eectus dans un
tampon de phosphate de potassium 0,15 M et 0,05 M de dithionite de sodium
70 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.11: Eet du pH sur la solubilit de lhmoglobine S dsoxygne 25

C
(Golderb et al. [100])
1
(sel qui sert xer loxygne pour la conservation des chantillons) un pH
= 7,1. Ces conditions exprimentales relvent plus de lhabitude par rapport aux
premires tudes entreprises. Goldberg et al. [100] ont regard linuence du pH
sur la solubilit de la deoxyHbS, les donnes sont reprsents sur la gure 4.11:
entre les pH 6,0 et 7,0 la solubilit varie peu mais augmente rapidement pour
des pH plus acide ou basique, le minimum de solubilit est atteint pour un pH
de 6,5, valeur proche du pH isolectrique
2
de lordre de 7 pour la deoxyHbS; le
principal eet dun pH plus lev ou moins lev est de dstabiliser le polymre par
une augmentation des interactions lectrostatiques rpulsives entre les molcules.
Chez les humains le pH du sang varie entre 7,35 et 7,45 soit dans la gamme de pH
pour lesquels la solubilit augmente.
1
en solution, le dithionite de sodium ragit avec loxygne et soxyde en ions sulphite et
sulphate selon la raction: S
2
O
2
4
+ O
2
+ 2OH

SO
2
3
+ SO
2
4
+ H
2
O
2
pH pour lequel la molcule est sous forme zwitterionique
4.3. ETUDES EN SOLUTION 71
Fig. 4.12: Solubilit de lHbS en fonction de la saturation en oxygne (points
rouge) et monoxyde de carbone (points bleu) 23, 5

Cet25

C respectivement. La
courbe en rouge est un ajustement des donnes pour loxygne avec la fonction
empirique c
s
= 0, 183 + 0, 0924y
s
+ 0, 0980y
3
s
+ 0, 235y
15
s
. ( partir des donnes de
Sunshine et al. [102] pour loxygne et Hofrichter pour le CO [103])
Eet de la concentration doxygne
La concentration en oxygne est le paramtre le plus critique pour la poly-
mrisation de lHbS. Historiquement, le fait quune solution dHbS compltement
dsoxygne polymrise tandis quune solution pleinement oxygne reste stable
t dcouvert par Harris en 1950 [101]. Pour avoir des donnes de solubilit entre
ces deux extrmits il a fallu attendre une trentaine danne car faire des mesures
prcises sur des chantillons des saturations partielles doxygne est dlicat du
fait de la faible stabilit du systme dans le temps. Les donnes de solubilit
23, 5

C pour loxygne et 24, 5

C pour le monoxyde de carbone sont reprsentes


sur la gure 4.12. A des saturations leves en oxygne, la solubilit augmente ra-
pidement pour atteindre des valeurs suprieures 0, 4 g/cm
3
90 % de saturation.
72 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Il nexiste pas de mesures prcises saturation partielle doxygne pour di-
rentes tempratures par contre il en existe pour le monoxide de carbone qui forme
un systme stable avec lhmoglobine. Ces donnes [103] montrent que les courbes
de solubilit en fonction de la saturation sont approximativement parallles, cest-
-dire quelles sont dcales pour chaque saturation, par la dirence de solubilit
saturation nulle. De plus comme la solubilit en fonction de la saturation est
identique pour loxygne et le monoxide de carbone (voir gure 4.12), il est admis
que la solubilit en fonction de la saturation doxygne suit le mme dcalage. La
solubilit peut alors tre calcule pour une temprature et une saturation doxy-
gne donne en regroupant les fonctions empiriques prcdemment utilises pour
ajuster les donnes des gures 4.9 et 4.12:
c
s
= 0, 321 0, 00883T + 0, 000125T
2
+ 0, 0924y
s
+ 0, 0980y
3
s
+ 0, 235y
15
s
, (4.3)
o y
s
est la saturation en oxygne dans la phase solution et T la temprature
exprime en degr Celsius. La fraction polymrise est alors calcule en injectant
ces donnes dans lquation 4.2. Pour une temprature de 37

C, la fraction de po-
lymre pour plusieurs concentrations initiales dHbS en fonction de la saturation
en oxygne, est reprsente sur la gure 4.13: on remarquera que pour une concen-
tration totale de 0, 45 g/cm
3
, qui correspond la concentration intracellulaire des
globules les plus denses, du polymre est prsent jusqu une saturation en oxygne
de 95%.
Les courbes danit pour loxygne des direntes phases permettent de com-
plter la description. Pour la phase solution, les mesures ont montr que le compor-
tement est le mme que pour de lhmoglobine A (voir gure 4.14), les monomres
dhmoglobine S se lient donc loxygne normalement.
La gure 4.15 compare lanit pour loxygne du polymre, de la phase solu-
tion et du gel total: lanit du polymre est beaucoup plus faible que celle de la
solution, contrairement la solution, il se lie de faon non cooprative loxygne.
Ces donnes mesures confortent le modle deux phases composes dune solu-
tion monomrique dHbS et dune phase polymre de concentration totale dHbs
c
p
= 0, 69 g/cm
3
, les points de lanit du gel total sajustent la courbe danit
calcule partir de la relation de conservation de la masse doxygne:
y
t
= y
p
x
p
+ y
s
(1 x
p
), (4.4)
avec y
t
la saturation du gel et y
p
la saturation du polymre donne par y
p
= K
p
p/(1 + K
p
p)
o p est la pression partielle en oxygne.
4.3. ETUDES EN SOLUTION 73
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
Saturation O2
F
r
a
c
t
i
o
n

p
o
l
y
m

r
i
s

e
Fig. 4.13: Fraction dHbS polymrise en fonction de la saturation en oxygne
de la solution 37

C. Donnes calcules partir des quations 4.2 et 4.3 pour


des concentrations initiales variant de 0, 20 g/cm
3
0, 45 g/cm
3
par incrment de
0, 05 g/cm
3
. (adapt de Eaton et al. [1])
Fig. 4.14: Comparaison de lanit pour loxygne de lhmoglobine A et lhmo-
globine S 25

C . La fraction dhmoglobine sature est reprsent en fonction de


la pression doxygne en torr. Les carrs sont les donnes pour lHbS 0, 15 g/cm
3
;
les croix pour lHbA 0, 16 g/cm
3
et les cercles pour lHbA 0, 35 g/cm
3
. (Gill et
al. [104])
74 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.15: Courbes danit pour loxygne de la phase solution, du polymre et
du gel. La courbes qui passe par les points exprimentaux pour le gel t calcules
en utilisant lquation 4.4 . (Eaton et al. [1])
4.3. ETUDES EN SOLUTION 75
Fig. 4.16: Courbe typique de suivi de la cintique de polymrisation de lHbS.
Le temps de retard est dni par lintersection entre la pente maximum de la
courbe de suivi et laxe des abscisses, le temps correspondant 10 % du signal
maximum est en pratique trs proche du temps de retard du fait de lexplosivit
de la raction. (Eaton et al. [1])
4.3.2 Cintique de polymrisation
La cintique de polymrisation de lHbS est caractrise par une trs grande
dpendance avec la concentraton initiale et la temprature. Lallure dune courbe
permettant de suivre lavancement de la polymrisation est reprsente sur la gure
4.16: le dbut de la polymrisation est prcd dun temps appel temps de
retard durant lequel aucun signal caractristique dune agrgation nest dtect.
Pass ce dlai, il y a formation explosive de polymre. Un autre paramtre utile
pour caractriser une exprience de suivi de polymrisation est le temps requis pour
atteindre 10 % du signal maximum nal.
Pour eectuer le suivi de la cintique de polymrisation, deux mthodes sont
privilgies: la technique dite du saut de temprature et la technique par photolyse.
Une exprience de saut de temprature consiste amener la temprature souhai-
te une solution dHbS pralablement dsoxygne 0

C (solution de monomres)
et de suivre lvolution au cours du temps de la turbidit de la solution par spectro-
mtrie. Lors dune exprience par photolyse, une solution dHbS est sature avec
du monoxide de carbone (complexe stable dans le temps) puis la polymrisation
76 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.17: Suivi de la cintique de polymrisation par mesure de la turbidit lors
dexpriences de saut de temprrature de 0 37

C. La variation au cours du temps


de la densit optique (OD) est reporte pour plusieurs concentrations de deoxyHbS:
(a) 0, 255 g/cm
3
, (b) 0, 236 g/cm
3
, (c) 0, 227 g/cm
3
, (d)0, 218 g/cm
3
. (e-h) zoom
sur le dbut des courbes du dessus. (Ferrone et al. [54])
est dclenche en clairant la solution avec un laser de longueur donde 514 nm qui
photodissocie lHbS du CO, la mesure au cours du temps de lintensit diuse par
lchantillon permet de suivre lavancement de la polymrisation. Dans la pratique
la mthode du saut de temprature est utilise pour des solutions prsentant un
temps de retard suprieur dix secondes, temps ncessaire pour atteindre lqui-
libre thermique et la mthode par photolyse pour les cintiques plus rapides. Une
tude systmatique a t mene par Ferrone en 1985 [54] pour des solutions dHbS
de concentration variant de 0, 2 g/cm
3
0, 4 g/cm
3
dans la gamme de tempra-
ture 5 50

C, les courbes de cintique de polymrisation sont reprsentes sur les


gures 4.17 et 4.18 et montrent bien lextrme dpendance la concentration du
temps de retard qui varie de quelques millisecondes plusieures heures pour les
concentrations les plus faibles.
La variation du temps ncessaire pour atteindre 10 % du signal nal est repr-
sente (voir gure 4.19) sur la gamme de concentration 0, 2 0, 4 g/cm
3
pour
direntes tempratures. Ce temps passe de quelques millisecondes plus de
10000 secondes (plus de 2h30) lorsque la concentration dhmoglobine S dimi-
4.3. ETUDES EN SOLUTION 77
Fig. 4.18: Suivi de la cintique de polymrisation par mesure de diusion de la
lumire lors dexpriences de photolyse 24, 9

C. Lintensit diuse au cours du


temps est reporte pour des chantillons de concentration: (a) 0, 373 g/cm
3
, (b)
0, 331 g/cm
3
, (c) 0, 310 g/cm
3
, (d) 0, 269 g/cm
3
. Le dtail du dbut des courbes
est reprsent sur les gures (e-h). (Ferrone et al. [54])
78 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.19: Dpendance du temps pour atteindre 10 % de lavancement de la r-
action en fonction de la concentration dHbS pour direntes tempratures:15

C
pour les carrs, 25

C pour les cercles et 35

C pour les triangles. Les donnes ont


t obtenues par saut de temprature pour les symboles vides et par photolyse
pour les symboles pleins. (Ferrone et al. [54])
nue dun facteur 2. La dpendance la concentration du temps 10 % nest pas
constante et augmente dautant plus que la concentration diminue: dans linter-
valle 0, 3 0, 4 g/cm
3
, le temps 10 % est inversement proportionel la puissance
15 [54] de la concentration dHbS tandis que dans lintervalle 0, 2 0, 3 g/cm
3
la
dpendance augmente la puissance 35 [54].
Ces rsultats trouvent une explication dans le mcanisme de nuclation propos
par Ferrone et al. en 1985 [55]. Le premier polymre en solution se forme par un
mcanisme de nuclation homogne (voir gure 4.20) puis crot par laddition de
monomres aux deux extrmits, les surface latrales du polymre peuvent alors
servir de support pour la nuclation de nouveaux polymres appele nuclation
htrogne (voir gure 4.20). Les interactions noyaux-surface sont favorables la
nuclation htrogne. Durant la polymrisation, la surface du polymre crot au
cours du temps, rsultant en laugmentation du taux de nuclation htrogne. Ce
4.3. ETUDES EN SOLUTION 79
Fig. 4.20: Schma reprsentant le mcanisme de nuclation homogne-htrogne.
La taille critique du noyau correspond la concentration minimale de monomres
agrgs pour laquelle le noyau est stable, le processus daddition de monomres sur
le noyau devient alors favorable. Deux types de nuclation sont possible: en solu-
tion, appele nuclation homogne ou sur la surface dun polymre dj existant,
appele nuclation htrogne. (Ferrone et al. [55])
mcanisme explique le caractre autocatalytique de la raction qui se manifeste
par un temps de retard suivi de lexplosion de la polymrisation.
Les temps de retards mesurs par Ferrone et al. sont comparables ceux me-
surs par Coletta et al. [105] sur des globules drpanocytaires. Ces temps doivent
tre compars aux temps de circulation des globules dans la microcirculation (0,5
2 s) et dans la circulation totale (10 40 s), si bien que la majorit des globules
rouges sont roxygns au niveau des poumons avant que la polymrisation ait lieu.
Lexplication de la vaso-occlusion rsultant uniquement de lobstruction striques
de la microcirculation par des globules fortement dforms cause de la polym-
risation de lHbS nest pas raisonnable. Les tudes lchelle cellulaire permettent
dapporter des lments nouveaux dans la comprhension de cette maladie.
80 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
4.4 Etudes sur des cellules
4.4.1 Gnralits sur le sang et la microcirculation san-
guine
Compostition
Le sang est une suspension de cellules dans une solution appele plasma, com-
pose 90% deau en poids, le reste tant principalement des protines. Les cellules
contenues dans le sang sont pratiquement toutes des globules rouges, avec des glo-
bules blancs (responsables de la rponse immunitaire) comptant pour 0,1% et des
plaquettes (facteur de coagulation) comptant pour environ 5% du total des cellules
sanguines [106]. On appelle hmatocrite la fraction volumique des globules rouges.
En condition normale, lhmatocrite est lgrement infrieur 50%. En revanche,
chez les personnes atteintes de la drpanocytose, lhmatocrite se situe aux alen-
tours de 30% cause de lhmolyse (clatement des globules rouges) prmature:
au bout de 30 jours contre 120 jours en moyenne pour des globules sains [1].
Rhologie du sang
Le sang est un uide rhouidiant, cest--dire que sa viscosit diminue lorsque
le taux de cisaillement augmente (gure 4.21). Ce comportement vient du fait
qu faible taux de cisaillement les globules rouges sarrangent en rouleaux (une
pile de globules) en raison de la prsence de brinogne (protine du plasma qui
favorise la coagulation). Lorsque le taux de cisaillement augmente, les rouleaux ont
tendance se casser et la viscosit du sang diminue. A des taux de cisaillement
plus importants, les globules se dforment, ce qui facilite la mobilit des uns par
rapport aux autres ainsi que la mobilit de la membrane par rapport au centre
de masse en un mouvement de chenille de char ce qui rsulte en une nouvelle
diminution de la viscosit.
La uidit du sang des taux de cisaillement > 100 s
1
, lorsquil ny a plus
dagrgation, est compare avec dautres types de suspensions dont des globules
drpanocytaires dsoxygns ou des sphres dures (gure 4.22). Pour une fraction
volumique de 50% la solution de sphres dures cesse de scouler tandis que le sang
sain reste uide mme des fractions volumiques suprieures 80%. Lvolution
de la viscosit pour des globules drpanocytaires dsoxygns suit la mme allure
que celle des sphres dures. Cest lobservation de ce comportement qui a amen
Higgins et al. [79] sintresser lcoulement de globules drpanocytaires dans des
canaux microuidiques pour essayer de comprendre si lorigine de la vaso-occlusion
ntait pas rhologique.
4.4. ETUDES SUR DES CELLULES 81
Fig. 4.21: Viscosit relative en fonction du taux de cisaillement pour trois types
de solutions 50% dhmatocrite: NP, glocules Normaux dans du Plasma; NA,
globules Normaux dans 11% dAlbumine (en absence de brinogne favorisant
lagrgation) et HA, globules articiellement rigidis (xs au glutaraldehyde)
dans 11% dAlbumine. (Chien [107])
Microcirculation
La microcirculation est compose principalement par les artrioles, les veinules
et les capillaires sanguins. Lcoulement du sang dans la microcirculation a lieu en
rgime de bas nombre de Reynolds (coulement laminaire).
Les capillaires sanguins sont les plus petits vaisseaux du corps, leurs diamtres
sont de taille similaire celle des globules rouges (2-5 m )et la vitesse des glo-
bules est de quelques centaines de microns par seconde. Les capillaires se jettent
dans les veinules post-capillaires dont le diamtre est compris entre 8-30 m. La
vitesse des globules y est galement plus leve que dans les capillaires sanguins
et atteint jusqu quelques millimtres par seconde. Lhmatocrite dans la micro-
circulation est compris dans la gamme 10-25%. Cette diminution de lhmatocrite
rsulte de lcoulement dune couche de plasma contre les parois des vaisseaux
sanguins, les globules scoulant au milieu du ux (eet Fahraeus-lindqvist). Au
niveau de la microcirculation, lpaisseur de cette couche dplte en globules de
lordre de quelques microns nest plus ngligeable devant les diamtres caractris-
tiques des vaisseaux. Dans les veinules post-capillaires, lhmatocrite varie entre
20-25% [106].
82 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.22: Comparaison de la viscosit relative en fonction de la fraction volumique
pour direntes suspensions: sang normal, globules drpanocytaires dsoxygns,
sphres dures, gouttelettes et disques rigides. (Goldsmith [108]).
Ces donnes sont ncessaires pour concevoir des canaux microuidiques se rap-
prochant au mieux dun coulement physiologique.
4.4.2 Morphologie des globules rouges drpanocytaires
Le globule rouge est une membrane composite compose dune bicouche lipi-
dique, de protines membranaires et dun cytosquelette sous-jacent lorigine des
proprits lastiques de la membrane (gure 4.23). Celui-ci est form par un r-
seau compos principalement de spectrine reli la membrane par lankyrine via
des interactions avec la protine band 3 (protine transmembranaire). Les globules
rouges sains prsentent une morphologie unique appele discocyte, un disque bi-
concave denviron 8 m de diamtre et 2 m de haut. Le volume moyen est de
90 m
3
pour une surface denviron 140 m
2
, ce qui reprsente un excs de surface
de prs de 50 % compar la surface dune sphre renfermant le mme volume
[89]; cette caractristique confre au globule rouge une dformabilit importante lui
permettant de ngocier le passage des capillaires sanguins les plus petits ( 5 m).
La polymrisation de lHbS dans les globules drpanocytaires (ou SRBC pour
4.4. ETUDES SUR DES CELLULES 83
Fig. 4.23: Stucture de la membrane du globule rouge. La bicouche lipidique
contient de nombreuses protines. Le cytosquelette, rseau de spectrine bidimen-
tionel, est ancr la membrane par lintermdiaire de lankyrine et band 3.
sickle red blood cell) est lorigine des dformations de la membrane du glo-
bule. Ltude mene par Corbett et al. en 1995 [65] est la premire dresser une
carte dtaille de cette riche morphologie. La concentration corpusculaire moyenne
dhmoglobine (CCMH) tant responsable dune grande disparit dans la cintique
de polymrisation, les auteurs ont spar les globules sur un gradient de densit
(voir chapitre techniques exprimentales) en quatre fractions correspondant des
CCMH respectives de 31, 2 g/cm
3
, 34, 5 g/cm
3
, 38, 7 g/cm
3
et +40 g/cm
3
. Les cel-
lules dsoxygnes sont images par microscopie polarisation direntielle ce qui
permet de dterminer la quantit dhmoglobine totale, la quantit dhmoglobine
polymrise et lorientation du polymre (voir gure 4.24).
Ces mesures ont permis dtablir la classication suivante:
cellules contenant 1 3 domaines, ces cellules contiennent un, deux ou trois
domaines distincts contenant des polymres aligns, elles reprsentent jus-
qu environ 50 % des globules de la fraction la moins dense. Dans cette
catgorie, on peut distinguer deux types particuliers: les cellules constric-
tion centrale et les sphrulites. Les cellules constriction centrale contiennent
une faible quantit de polymre au centre mais cette quantit augmente ra-
pidement le long dun axe vers les bords de la cellule (voir gure 4.25 B);
cette morphologie semble tre le rsultat dune unique nuclation homogne
au centre suivi de multiples nuclations htrognes le long dun axe. Les
sphrulites proviennent aussi dune nuclation centrale suivie de nombreuses
84 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.24: En bas droite: image dabsorption (proportionnelle lhmoglobine
totale) de globules rouges. En bas gauche le mme champ que prcdement, lin-
tensit est proportionnelle la quantit de polymre (dirence dabsorption). Sur
la partie suprieure, les couleurs codent pour lorientation du polymre. (1) cellule
simple domaine, (2) cellules contenant trois domaines, (3) cellule domaines mul-
tiples, (4) pas de dtection de polymre, (5) et (6) cellules constriction centrale,
et (7) sphrulite. (Corbett et al. [65])
4.4. ETUDES SUR DES CELLULES 85
Fig. 4.25: Schma illustrant larrangement des polymres lintrieur des SRBC.
(A) forme classique un faucille dune cellule un seul domaine, (B) cellule
constriction centrale, (C) sphrulite, (D) cellules contenant trois domaines dis-
tincts et (E) cellules domaines multiples. (Corbett et al. [65])
nuclations htrognes partant dans toutes les directions (gure 4.25 C).
cellules domaines multiples: ces cellules contiennent plus de trois domaines
mais moins de 10, elles ont souvent un aspect grumeleux.
cellules contenant une myriade de domaines, renfermant plus de 10 domaines
et de forme patatode , ces cellules sont majoritaires dans la fraction la
plus dense.
Une classe de cellules particulires concerne un pourcentage de SRBCs dit
irrversibles car restant dforms mme en condition oxygne. Ces cellules ne
contiennent plus de polymre. La persistance de leur dformation proviendrait du
dcouplage du rseau de spectrine avec la membrane [109]. Enn pour complter
la description, certains globules rouges gardent leur forme discocyte mme dsoxy-
gns, renfermant seulement quelques petits domaines de polymre en priphrie.
Cette classication est tablie partir de cellules dsoxygnes au repos puis
xes. Il nexiste pas de donnes sur des cellules dsoxygnes sous cisaillement, il
nest pas certain que toute cette riche morphologie se retrouve en coulement, ce
que nous allons montrer dans le chapitre suivant.
86 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
4.4.3 Proprits physiques des globules rouges drpanocy-
taires
Dformabilit
Laptitude des globules rouges changer de forme est cruciale pour la traver-
se de la microcirculation compose de capillaires de taille infrieure celle des
globules. Parmi les dirents facteurs qui dterminent ou impactent cette dforma-
bilit, on peut citer les proprits de la membrane, la viscosit du cytoplasme (qui
augmente avec la concentration dhmoglobine), la dshydratation ou la concentra-
tion doxygne (responsable de la polymrisation). La dformabilit des globules
rouges a t tudie par de nombreuses techniques: les tudes de ltration, dek-
tacytomtrie (tude par diraction) et viscosimtrie qui permettent de sonder un
comportement moyen sur lensemble des cellules, ont dmontr que les SRBCs
possdent une dformabilit moindre que celle des globules sains et ce, mme en
condition normale doxygnation [110115]; les techniques de micropipettes per-
mettent quand elles de mesurer les proprits mcaniques de cellules individuelles
[116122].
Evans et al. [119] ont compar les proprits mcaniques de globules rouges
sains et de SRBCs oxygns en fonction de la concentration en hmoglobine par
des expriences de micropipette. Ces expriences permettent de mesurer le module
lastique de cisaillement de la membrane R
2
d(P)/dL, o R est le rayon
interne de la micropipette, P la dirence de pression applique et L la longueur
de la langue du globule rouge pntrant dans la micropipette. Les rsultats (gure
4.26) montrent que cette quantit reste constante pour des globules sains dans la
gamme de concentration 0, 32 0, 45 g/cm
3
. Tandis que pour les SRBCs la rigidit
est semblable celle des globules sains dans la gamme 0, 32 0, 38 g/cm
3
, mais
elle augmente progressivement avec la concentration jusqu marquer une forte
augmentation pour les globules les plus denses (0, 48 g/cm
3
) avec une rigidit huit
fois suprieure celle correspondant aux cellules les moins denses.
Un autre paramtre intressant, la capacit recouvrer sa forme initiale aprs
une dformation longationnelle, a t caractrise partir du temps ncessaire
un globule tir par deux extrmits laide de micropipettes retrouver son rap-
port longueur/hauteur initial. Les rsultats de la gure 4.27 montrent quil ny a
pas de dirence entre les globules sains et les SRBCs. Par contre, ce temps carac-
tristique est fortement dpendant de la concentration dhmoglobine, atteignant
des valeurs 20 fois suprieures pour les SRBCs irrversibles (dforms en condition
normale doxygnation). Lhypothse avance, des concentrations importantes
dHbS, celle ci pourrait former un gel associ la membrane, comme une sorte de
crote.
Ces rsultats sont replacer dans le contexte de la pathophysiologie de la drpa-
4.4. ETUDES SUR DES CELLULES 87
P
R
L
a.
b.
II III
IV
Fig. 4.26: a. Schma reprsentant une exprience de micropipette: un globule
rouge est aspir par une dirence de pression P lentre dun capillaire de dia-
mtre R, la longueur de la langue dans le capillaire est not L. b. Module lastique
normalis par la valeur mesure pour un globules sain de concentration 0, 32 g/cm
3
en fonction de la concentration intracellulaire dhmoglobine. Les mesures eec-
tues sur les globules sains sont reprsentes par les cercles et sur les SRBCs par
les triangles. Les lignes pointilles verticales indiquent les concentrations moyennes
dHbS dans les globules pour les direntes fractions tries (voir le chapitre suivant
techniques exprimentales). La mesure 0, 48 g/cm
3
a t faite sur un irrversible.
(Evans et al. [119])
nocytose qui rsulte en une distribution de densit et donc de concentration intra-
cellulaire dhmoglobine plus large que pour les globules sains. Le pourcentage de
globules ayant une concentration suprieure 0, 37 g/cm
3
chez des personnes souf-
frant de la drpanocytose peut atteindre 50 % tandis que pour des globules rouges
normaux, 90 % ont une concentration dhmoglobine comprise dans la gamme
0, 29 0, 35 g/cm
3
. La forte dpendance la concentration de la dformabilit des
globules oxygns est donc un facteur important pour une meilleur comprhension
de la maladie. De plus, dans la microcirculation o la pression en oxygne dimi-
nue, la formation de polymre dans les globules dsoxygns aecte davantage la
dformabilit de ces derniers [120].
88 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.27: Temps caractristiques de recouvrement dune dformation longa-
tionnelle normalis par la valeur mesure pour un globule sain de concentra-
tion 0, 32 g/cm
3
en fonction de la concentration intracellulaire dhmoglobine. Les
cercles sont les mesures sur les globules sains et les triangles sur les SRBCs (Evans
et al. [119])
Adhsion
Les globules rouges drpanocytaires sont connus pour tre plus adhsifs que
leurs homologues sains, ils participeraient de nombreuses interactions cellules-
cellules et cellules-protines par lintermdiaire de lexpression anormale de pro-
tines et rcepteurs sur leur membrane, qui rsulterait de laltration de celle-ci
par le processus de polymrisation [63]. Des tudes ont montr que ladhsion des
SRBCs sur les cellules endothliales implique des changement de la membrane et
de la forme [75, 123], dpend de la densit des globules et a lieu majoritairement
4.4. ETUDES SUR DES CELLULES 89
dans les vnules postcapillaires [77, 123]. Kaul et al. [123] ont observ in vivo chez
le rat les dirents comportements adhsifs de SRBCs tris par densit: les SRBCs
discocytes oxygns et articiellement dshydrats pour atteindre la densit des
globules les plus denses, adhrent moins puis retrouvent leur capacit dadhsion
une fois rhydrats; les SRBCs les plus denses (comprenant de nombreux irr-
versibles dforms) adhrent moins mais retrouvent de ladhrence lorsquils sont
hydrats articiellement. Ces observations tendent prouver que les irrversibles
sont moins adhrents plus du fait de leur CCMH leve (donc plus rigides) et une
forme anormale que par un manque de potentiel dadhsion.
Il a aussi t observ que les globules blancs jouent un rle important dans le
processus dadhsion des globules drpanocytaires, des expriences sous ux dans
une chambre microuidique ont montr que les globules blancs provenant de per-
sonnes atteintes de la drpanocytose, sont plus adhrents aux cellules endothliales
que les globules blancs sains [124]. De plus les SRBCs interagiraient plutt avec
les globules blancs adhrs que directement avec lendothlium [125]. Des tudes
cliniques font le lien entre un nombre lev de globules blancs et la svrit de la
pathologie [126].
90 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.28: Illustration de leet de la densit sur ladhrence des SRBCs sur len-
dothlium. (A et B) Mlange 1:1 de SRBCs discocytes (marqus FITC) et SRBCs
discocytes dshydrats, le sens du ux est indiqu par la grosse che. En A des
globules sont adhrs; en B le mme champ que A clair en piuorescence montre
que la majorit des globules adhrs sont les discocytes non dshydrats, seuls 3
discocytes dshydrats sont adhrs (reprs par des petites ches en A). (C et
D) Mlange 1:1 de SRBCs discocytes dshydrats (marqus FITC) et de ISCs.
En C, le globule irrversible est reconnaissable sa forme anormale. En D, le
mme champ clair en piuorescence permet de reprer un discocyte dshydrat
adhr. (E et F) Mlange 1:1 de ISCs articiellement hydrats (marqus FITC)
et de discocytes. En E, huit globules sont adhrs lendothlium; en F, le mme
champ clair en piuorescence montre quil y a un nombre identique de ISCs
hydrats adhrs que de discocytes. (Kaul et al.[123])
4.4. ETUDES SUR DES CELLULES 91
4.4.4 Vaso-occlusion: scnarios proposs
Vaso-occlusion rhologique
La seule tude microuidique mene dans le but de comprendre la vaso-occlusion
lchelle de la microcirculation est celle de Higgins et al. [79]. Les auteurs pr-
sentent un diagramme de phase dcrivant les conditions ncessaires lobservation
de la vaso-occlusion en fonction de la concentration doxygne, de la pression pour
maintenir lcoulement et de la largeur des canaux. Lhypothse retenue est celle
du changement rhologique dune solution de globules dsoxygns, susant pour
modier lcoulement jusqu compltement le stopper (gure 4.29).
Fig. 4.29: A gauche, prol de vitesse en absence doxygne (croix) et lors de la
dsobstruction (cercle) en prsence doxygne. A droite, espace des phases de la
vaso-occlusion. Lisosurface reprsente en chaque point les conditions exprimen-
tales ncessaires (pression dinjection, taux doxygne et largeur du canal) pour
que la vaso-occlusion ait lieu au bout de 500 s.(Higgins et al. [79]).
Leur coulement consiste en une gomtrie branche avec un canal initial de
250 m de large qui se ramie successivement en canaux de 60, 30, 15 et 7 m
de large puis se reconnectent pour aboutir un canal nal de 250 m. La vitesse
des globules est mesure au niveau du canal nal: en absence doxygne, la vitesse
diminue jusqu sarrter compltement pour des temps caractristiques de 8-10
92 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
minutes puis, en prsence doxygne le ux se remet en coulement (gure 4.29).
Scnarios multi-tapes et multi-facteurs
Toutes les tudes rcentes prsentes prcdemment ont permis de mieux com-
prendre les dirents paramtres et mcanismes pouvant entrer en jeu dans la
pathophysiologie de la drpanocytose, remettant en cause le paradigme dvelopp
depuis les annes 1970 consistant ne considrer que le phnomne de polymri-
sation intracellulaire comme responsable de lobstruction strique des vaisseaux.
Robert Hebbel compte parmi les premiers auteurs avoir list les dirents l-
ments susceptibles de jouer un rle, et donn des pistes pour les tudes venir
[64, 127]. Toutes ces nouvelles donnes ont favoris llaboration de nouveaux sc-
narios qui proposent une explication des direntes tapes pouvant conduire la
vaso-occlusion. On peut citer les propositions de Frenette [125], de Kaul et al. [128]
ou encore Switzer et al. [81] (gures 4.30, 4.31 et 4.32)
Fig. 4.30: Squence propose par Kaul et al.[128], occlusion rtrograde: Ladhsion
des globules de densit faible et normale (rticulocytes et discocytes) dans les
vnules post capillaires, induit une rduction locale du ux permettant le pigeage
des globules de forte densit, en particulier les irrversibles, pouvant mener la
vaso-occlusion.
Le premier scnario propos (gure 4.30) considre ladhsion pralable sur les
cellules endotheliales des vnules post capillaires, de globules rouges majoritaire-
ment de faible densit (concentration corpusculaire dhmoglobine faible) donc les
4.4. ETUDES SUR DES CELLULES 93
plus dformables. Laccumulation de ces globules en adhsion, modierait susam-
ment le ux pour que des globules irrversibles (peu dformables) se retrouvent
pigs et obstruent la circulation. Le bouchon se propage de proche en proche en
remontant jusquau niveau des capillaires.
Fig. 4.31: Squence propose par Frenette [125], agrgation initie par les globules
blancs. Ecoulement in vivo chez le rat. (1) et (2) Dans les vnules post capillaires
les globules blancs adhrent lendothlium. (3) Ces globules blancs interagissent
avec les globules rouges, formant des agrgats cellulaires. (4) aprs injection de
TNF-alpha, molcule implique dans linamation de lendothelium, les adhsions
globules rouges-globules blancs augmentent rduisant le ux sanguin jusqu la
vaso-occlusion.
Le second scnario propos (gure 4.31), rsultant dobservations in-vivo chez
le rat, envisage le rle pouvant tre jou par les globules blancs. Ceux-ci adhrent
lendothlium dans les vnules post-capillaires et interagissent avec les globules
rouges pour former des agrgats cellulaires. Ltat inamatoire, caractristique de
la drpanocytose, promeut ladhsion globules blancs-endothlium mais galement
ladhsion globules blancs-globules rouges. La formation dagrgats cellulaires pou-
vant aller jusqu la vaso-occlusion par accumulation.
Enn, le dernier scnario, multifacteurs (gure 4.32), imagin partir de nom-
breuses observations indpendantes, est le plus complexe et fait intervenir lHbS
libre en solution. Ladhsion des globules rouges sur les cellules endothliales et la
plus forte concentration dHbS libre dans le plasma sanguin, sont responsables dun
tat inammatoire qui favorise ladhsion de globules blancs ainsi que lagrgation
de plaquettes. De plus lhmoglobine libre en solution xe le monoxyde dazote qui
joue un rle de vasodilatateur [129]. La secrtion par lendothlium vasculaire de
lendothline, stimulant de la prolifration cellulaire, de linammation et ayant
94 CHAPITRE 4. HMOGLOBINE S ET TUDES SUR DES CELLULES
Fig. 4.32: Squence propose par Switzer et al. [81]: La vaso-occlusion, processus
multi-facteurs. Ladhrence des SRBCs sur lendothelium (1) et lhmolyse plus
importante des SRBCs du fait de la fragilit de leur membrane (2), induisent un
tat inamatoire qui se caractrise par ladhsion de globules blancs (3) et lagrga-
tion de plaquettes (6). La xation du monoxyde dazote (molcule vasodilatatrice)
par lhmoglobine en solution et laugmentation de la concentration dendothe-
line (molcule vasoconstructrice) rsulte en la vasoconstriction de lartre (4) et la
proliferation de cellules (5), pouvant mener jusqu la vaso-occlusion (8)
des eets vasoconstricteurs, diminue le diamtre du vaisseau sanguin. Tous ces
eets combins (adhsion, inamation, vasoconstriction) pourraient mener jusqu
la vaso-occlusion.
Chapitre 5
Techniques exprimentales
Dans ce chapitre, nous dcrivons dabord les prcautions pour la conservation
des chantillons sanguins ainsi que le protocole pour la sparation des globules
rouges sur gradient de densit. Dans un second temps, nous dcrivons les direntes
tapes ncessaires pour la conception des puces microuidiques. Nous terminons
par les direntes stratgies pour dsoxygner les globules.
5.1 Echantillons sanguins
Les chantillons sanguins proviennent du laboratoire dhmatologie de lhopital
Saint Eloi de Montpellier. Pour chaque tubes, la concentration globulaire moyenne
dhmoglobine (CGMH) ainsi que le pourcentage dhmoglobine S est dtermin
par le laboratoire dhmatologie. Ds rception, les globules rouges sont lavs par
centrifugations successives dans une solution de phosphate buered saline (PBS)
et 5 mM glucose ajuste 300 mosm. Resuspendus 50 % dhmatocrite, les
chantillons sont utiliss au plus tard une semaine aprs prlvement.
5.2 Purication de lhmoglobine
Lhmoglobine est extraite des globules rouges an de lencapsuler dans les
vsicules, permettant ainsi lobtention dobjets modles contrls en taille et en
contenu. La purication de lhmoglobine se fait en deux tapes principales que
sont la lyse des globules rouges dans un premier temps puis la ltration an de
reconcentrer lhmoglobine.
A partir dun chantillon prpar comme dcrit prcdemment, 500 l de culot
(hmatocrite 100%) sont prlevs et mlangs 1.5 ml deau dsionise. Sous
leet du choc osmotique les globules rouges clatent, librant ainsi lhmoglobine
en solution. Aprs 20 minutes, le mlange est centrifug 15000 g pendant 20
95
96 CHAPITRE 5. TECHNIQUES EXPRIMENTALES
minutes, les membranes sdimentent et le surnageant est rcupr. Pour recon-
centrer lhmoglobine, nous utilisons des tubes de ltration Millipore de 3 kDa
(amicon ultra 0,5ml 3k). Les tubes sont pralablement rincs, pour cela 500 l
deau dsionise sont introduits dans le compartiment de ltrage puis centrifugs
15000 g pendant 20 minutes, leau passe alors travers la membrane de ltration
puis est rcupre dans la deuxime partie du tube. Enn 500 l de la solution
dhmoglobine dilue sont centrigugs 15000 g, aprs 20 minutes lhmoglobine
concentre est rcupre dans le compartiment de ltration.
5.3 Tri des globules par densit
Pour sparer les globules en direntes fractions suivant leur densit (et donc
en fonction de la concentration en hmoglobine), nous eectuons un gradient de
densit sur du Percoll
R _
(sigma #77237 ): une solution collodale de particules de
silice de 15 30 nm recouvertes par une couche monoatomique de polyvinylpyrro-
lidone, non toxique pour les objets biologiques. Prparer une solution de densit d
et dosmolarit 300 mosm ncessite un mlange de Percoll
R _
, deau dsionise et
de chlorure de sodium 1,5 M pour ajuster la pression osmotique. Le calcul des
proportions de chaque constituant se fait partir de la formule suivante
1
:
V
o
= V
d 1/11 1, 058 (1 1/11)
1, 13 1
, (5.1)
o V
o
est le volume de Percoll
R _
non dilu, V le volume total nal, d la densit
dsire, 1/11 est la fraction du volume total en solution de chlorure de sodium
concentr 1,5 M et de densit 1,058, enn 1,13 est la densit de la solution mre
de Percoll
R _
. On complte alors avec de leau dsionise pour arriver au volume
nal V.
Le choix dun gradient discontinu est dict par le souhait de sparer les glo-
bules rouges en quatre fractions principales comme dcrit dans Corbett et al. [65].
Cinq solutions de densits respectives 1,085, 1,092, 1,101, 1,107 et 1,122 sont alors
prpares. Dans un tube centrifuger de 15 ml, 2 ml de chacune de ces solutions
sont dposs successivement avec une seringue le plus dlicatement possible pour
prvenir tout mlange entre deux couches et obtenir des sparations nettes. Pour
nir, 2 ml de sang lav 50 % dhmatocrite sont dposs sur le dessus et le tout
est centrifug 4000 g pendant une heure. Aprs centrifugation nous obtenons
quatre bandes de sang bien dnies (voir gure 5.1), chacune de ces couches est
prleve avec une micropipette puis lave trois fois dans une solution de PBS plus
5 mM de glucose ajust 300 mosm pour liminer le Percoll
R _
.
1
Cell separation media: methodology and applications, GE Healthcare, 2007
5.3. TRI DES GLOBULES PAR DENSIT 97
1,085
1,092
1,101
1,107
1,122
I
II
III
IV
CGMH
(g/cm
3
)
0,31
0,34
0,38
0,42
Fig. 5.1: Gradient de densit avant (gauche) et aprs centrifugation (droite), les
bandes de sang se sont formes aux interfaces des couches de Percoll
R _
. La fraction
la moins dense I contient en majorit les globules qui se dformeront en faucille, la
fraction II est constitue de globules qui donneront les sphrulites et plus gnra-
lement ceux dont la polymrisation sera htrogne, la fraction III est une fraction
intermdiaire et la fraction IV la plus dense contient en majorit les irrversibles.
Les correspondances densit-concentration dhmoglobine sont tires de [65]
98 CHAPITRE 5. TECHNIQUES EXPRIMENTALES
5.4 Microuidique
5.4.1 Gnralits propos de la lithographie
La conception des puces microuidiques commence par le dessin des canaux
laide dun logiciel de conception assist par ordinateur que lon fait ensuite
imprimer soit sur un lm plastique pour des structures gomtriques suprieures
10m (impression 25000 dpi, Outputcity), soit sur des plaques de quartz par
dpot de chrome pour des lments de plus grande nesse. La ralisation des canaux
sur wafer de silicium a lieu en salle blanche an de se protger de la poussire, le
processus de fabrication demande de suivre un certain nombre dtapes dtailles
ci-aprs.
dpt dune couche de rsine photosensible sur le wafer de silicium
une premire cuisson pour durcir la rsine
insolation aux UV de la rsine travers le masque
un recuit pour nir de durcir la rsine
passage dans un bain de dvelopeur pour dissoudre la rsine non polymrise
rinage au xateur
La premire tape consiste dposer une couche de rsine photosensible sur le
wafer de silicium (gure 5.2a). La socit MicroChem propose toute une gamme
de rsines de direntes viscosits, utilises suivant lpaisseur que lon souhaite
atteindre. On retiendra la SU8-2025 pour la confection de canaux de 30 m dpais-
seur destins ltude de la circulation grande chelle. Etaler la tournette la
vitesse de 3000 tours par minute pendant 30 secondes quelques mililitres de rsine
sur le wafer permet dobtenir une couche homogne de la hauteur souhaite.
Une premire cuisson permet de durcir la rsine: 2 minutes 65

C suivi de 5
minutes 95

C pour lpaisseur de 30 m. La succession de 65

C et 95

C permet
une monte en temprature plus douce an de minimiser les contraintes dans le
matriau.
La rsine est alors insole aux UV travers le masque sur lequel sont dessins les
canaux, les parties non masques polymrisent (gure 5.2b). Le dosage de lnergie
est important; une trop longue exposition rsulte en des murs obliques tandis que
dans le cas contraire les canaux nadhrent pas au wafer. Aprs une srie dessais,
210 mJ/cm
2
pour une paisseur de 30 m donnent des rsultats convenables.
Une fois linsolation eectue, le wafer est directement plac sur plaque chauf-
fante pour nir de durcir la rsine: 1 minute 65

C suivi de 5 minutes 95

C pour
30 m.
Ltape de dveloppement permet de dissoudre la rsine non polymrise, le
wafer est plong dans un bain de dveloppeur vendu par MichoChem durant 4-5
minutes (gure 5.2d). Agiter le wafer dans le bain permet daider le dveloppement
des stuctures les plus connes.
5.4. MICROFLUIDIQUE 99
rsine SU8
wafer de silicium
UV
m
a
s
q
u
e
dveloppeur fixateur
cuisson
cuisson
a.
b.
c.
d.
e.
Fig. 5.2: a. Couche de rsine SU8 dpose par spin coating sur un wafer de silicium.
b. Aprs une premire cuisson pour durcir la rsine, exposition au UV de la rsine
travers le masque sur lequel sont dessins les canaux. c. Aprs un recuit, on voit
apparatre les canaux sur la rsine. d. Passage dans un premier bain de dveloppeur
pour liminer la rsine non expose, puis dans un second bain de xateur. e. Au
nal on obtient les canaux sur le wafer de silicium.
100 CHAPITRE 5. TECHNIQUES EXPRIMENTALES
Pour nir, un rinage lisopropanol permet darrter le dveloppement et de
xer la rsine polymrise et aprs un schage lazote, on vrie la qualit des
canaux sous microscope.
5.4.2 Construction des canaux en rsine photosensible
Lutilisation de la colle NOA81 (Norland) pour la confection des canaux micro-
uidiques se justie par le besoin dobtenir un matriau tanche aux gaz. De plus
elle prsente de bonnes qualits optiques en faisant ainsi la candidate idale pour
notre application. La mise en uvre avec cette colle nest pas aussi directe que
dans le cas traditionnel du polydimethylsiloxane (PDMS); dnomme microuidic
stickers cette lgante technique t dveloppe par Denis Bartolo et al. [130] en
2008.
En premier lieu, ltape de lithographie prcdemment dcrite est eectue, les
canaux devant apparaitre en creux dans la rsine SU8. Du PDMS liquide (sylgard
184) est vers sur les canaux, dgaz puis cuit 70

C pendant une heure. Une fois


rticul le PDMS est dmoul et les canaux apparaissent alors en positif, ce pav
de PDMS constitue le moule initial pour la fabrication des canaux en colle.
UV
UV
moule de PDMS
bloc de PDMS
colle UV
fine couche non
polymrise
lamelle
a. b.
c.
d.
e.
f.
Fig. 5.3: a. La colle est dpose sur le bloc de PDMS plat et le moule est pos
par dessus. b. Insolation aux UV pendant trois minutes. c. Le moule de PDMS
est retir, laissant apparatre une ne couche de colle non polymrise. d. Le tout
est coll contre une lamelle de verre. e. Insolation aux UV pour polymriser la ne
couche de colle en contact avec le verre. f. Le bloc de PDMS est nalement retir.
Un bloc de PDMS plat est utilis comme substrat et des calles en PET de
250 m dpaisseur sont disposes sur le pourtour. De la colle NOA81 est verse
sur cette surface puis le moule de PDMS est dpos dlicatement, pour viter la
5.4. MICROFLUIDIQUE 101
Fig. 5.4: Canaux en polymre photosensible colls sur une lamelle de verre. Des
connectiques NanoPort de chez Upchurch scientic sont utilises pour lentre et
la sortie
formation de bulles dair, face canaux sur la colle. On a ainsi une couche de colle
dpaisseur contrle de 250 m prise entre deux blocs de PDMS, le tout est insol
aux UV pendant trois minutes pour faire polymriser la colle. A linterface colle-
PDMS, la porosit du PDMS loxygne, inhibiteur de la polymrisation, laisse
une ne couche de quelques centaines de nanomtre de colle non polymrise. Le
moule de PDMS sur la face suprieure peut donc tre retir, laissant apparaitre
les canaux dans la colle; les trous dans la colle pour eectuer la future connectique
sont raliss ce stade laide dun emporte pice de 1 mm de diamtre (dans
notre cas un trpan biopsie).
La phase nale consiste coller sur une lamelle de verre pralablement traite
au plasma doxygne, la face encore collante comportant les canaux. Aprs une
exposition supplmentaire de 15 minutes aux UV pour nir de polymriser la
colle, le substrat de PDMS peut tre retir et la puce microuidique ainsi obtenue
est laiss une nuit 70

C pour consolider les proprits mcaniques de la colle.


La connectique doit tre la moins poreuse possible au gaz, les tubes et connec-
teurs fabriqus en polythertherctone (Upchurch Scientic) rpondent ce cri-
tre. Les connecteurs sont colls sur la puce avec de la NOA81.
102 CHAPITRE 5. TECHNIQUES EXPRIMENTALES
5.4.3 Construction des canaux en PDMS
Le PDMS tant poreux loxygne [131], la mthode retenue pour contrler
le taux doxygne consiste superposer deux rseaux de canaux: le premier com-
portant les canaux pour faire circuler les globules rouges et, coll dessus, le second
dans lequel est inject le gaz ou mlange gazeux souhait. La gomtrie est la
suivante: aprs linjection le uide passe par "la chambre de dsoxygnation", une
section longue de 2 cm et large de 4 mm soutenue par de nombreux plots pour
viter un eondrement, puis par une srie de seize canaux en parallle long de 1
cm et large de 30 m. Le canal de gaz se compose dun unique serpentin de 500
m de large et 80 m de haut couvrant toute la surface de la puce (voir gure
5.5).
a.
b.
entre
sortie
chambre d'change gazeux
Fig. 5.5: a. Gomtrie du masque des canaux pour la circulation des globules
rouges, lchange gazeux lieu dans la chambre de dsoxygnation. Dans le cadre,
zoom de la partie comprenant les canaux de 30 m. Les plots assurent le bon
maintien du PDMS. b. Masque pour la fabrication du canal de gaz superpos sur
les canaux de circulation des globules. Lchelle en bleu reprsente 2 mm
5.4. MICROFLUIDIQUE 103
Pour la confection de cette puce, les deux coulements sont mouls sparment.
La partie pour les globules rouges devant tre ne an de favoriser les changes
gazeux, on tale la tournette du PDMS (sylgard 184) sur le wafer 1000 trs/min
pendant 30s ce qui permet datteindre une paisseur denviron 60 m. Le canal
de gaz est quant lui moul dans une paisseur de 5 mm. Le PDMS est ensuite
rticul en le faisant cuire 70

C pendant une heure. Une fois temprature


ambiante la membrane de 60 m est dlicatement dcolle puis transfre sur une
surface plastique qui nadhre pas au PDMS. Le canal de gaz est lui aussi dcoll
et lon perce les trous dentre et sortie du gaz. On traite alors au plasma la face
contenant le canal de gaz pendant 30s ainsi que le dessus de la membrane pendant
moins dune seconde, on dpose alors le canal de gaz sur la membrane qui grce au
traitement plasma adhrent ensemble. On dcolle facilement les deux paisseurs
de la surface plastique et lon perce les trous pour linjection et lvacuation des
globules. La surface de la membrane contenant les canaux est son tour traite
au plasma moins dune seconde puis le tout est colle sur une lamelle de verre
pralablement nettoye lacide sulfochromique et trait 30s au plasma. La puce
ainsi obtenue est laisse 70

C pendant au minimum une heure pour naliser les


liaisons Si-O-Si . La modication induite par le traitement plasma, de la surface
du PDMS, rend celui ci plus impermable loxygne [131]; pour cette raison le
traitement de la membrane est rduit au minimum de temps.
Fig. 5.6: Puce confectionne en PDMS, les deux rseaux dcoulement pour les
globules et le gaz sont superposs et colls sur une lamelle de verre.
104 CHAPITRE 5. TECHNIQUES EXPRIMENTALES
5.4.4 Dsoxygnation
Pour optimiser le taux dchange gazeux dans les puces en PDMS, la surface
dchange doit tre la plus importante possible et lpaisseur de PDMS sparant
le liquide du gaz, ne. Les canaux ayant une hauteur de 30 m, lpaisseur de
la membrane sparant lcoulement des globules du canal de gaz est denviron 30
m. Avant dinjecter la solution de globules, on laisse circuler le gaz pendant 30
minutes an de saturer le PDMS. Ce dispositif permet de dsoxygner les globules
sous cisaillement.
Dans les puces en colle NOA, la dsoxygnation se fait en statique: on injecte
le gaz par la connectique de sortie de la puce, le gaz circule dans lcoulement
purgeant par la mme occasion la puce, ressort par lentre et ni par buller dans
la chambre de pressurisation o sont stocks les globules. On laisse le gaz circu-
ler pendant 30 minutes avant dinverser la dirence de pression pour mettre en
coulement les globules.
Chapitre 6
Drpanocytose: une tude
microuidique de la
vaso-occlusion
Dans ce chapitre, nous rapportons les observations eectues lors de lcoule-
ment de globules drpanocytaires dans les canaux microuidiques. Ensuite, nous
discutons ces observations dans le contexte des tudes dj ralises et prcisons
quels sont, selon nous, les paramtres importants qui pourraient jouer un rle dans
la vaso-occlusion.
6.1 Dispositif exprimental
Lobservation des globules en coulement dans les puces microuidiques sac-
complit sous microscope, la temprature autour de la puce tant maintenue 37

C
par un ux dair chaud. Les puces en PDMS comprennent quatre entres-sorties
desservant le circuit de gaz et les microcanaux pour lcoulement des globules.
Le canal de gaz est aliment directement partir dun contrleur de pression
(Fluigent) et les globules sont injects via une chambre de pressurisation.
Les globules rouges sont suspendus 25 % dhmatocrite (fraction volumique)
dans une solution de PBS + 5 mM de glucose ajuste 300 mosm. Sauf cas
contraire clairement explicit, les globules rouges utiliss proviennent de la frac-
tion n

2 du gradient de densit. Dune concentration moyenne de 0, 34 g/cm


3
en
hmoglobine, ces globules une fois dsoxygns statiquement, adoptent en majorit
des formes en faucille et en feuille drable (nuclation htrogne).
La gomtrie de lcoulement a dj t dcrite dans le chapitre Techniques ex-
primentales . Brivement, les globules circulent dabord dans une section longue
de 2 cm et large de 4 mm qui permet deectuer lchange gazeux. La partie cen-
105
106 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
Fig. 6.1: Dispositif exprimental: la puce microuidique, xe sur la platine du
microscope, comporte quatre connectiques dentre (E)-sortie (S). La solution de
globules est injecte partir de la chambre de pressurisation, elle mme relie au
contrleur de pression. Le canal de gaz est aliment en azote directement partir
du contrleur de pression.
trale de lcoulement consiste en 15 canaux parallles long de 1 cm et large de
30 m. Ces canaux sont prcds et suivis par une section longue de 1 mm et
contenant un rseau de plots triangulaires de 60 m darte dont la fonction est
dviter leondrement de la surface suprieure sur la lamelle de verre, lpaisseur
des canaux mesurant seulement 30 m.
Les canaux ont t conus de faon recrer un coulement proche des condi-
tions dhmatocrite et de vitesse de la microcirculation. Les vitesses caractris-
tiques des globules rouges dans les canaux de 30 m sont de lordre 0,8-2 mm/s
pour mimer la circulation dans les veinules post-capillaire. Au niveau du rseau de
plots triangulaires, les vitesses sont de lordre de 100-300 m/s comme pour un
coulement dans les capillaires sanguins.
6.2. FORME DES GLOBULES ROUGES DRPANOCYTAIRES SOUS COULEMENT107
1cm
flux
flux
Fig. 6.2: Gomtrie de la partie centrale de lcoulement pour les globules. La
partie gauche est relie lchangeur de gaz et la partie droite la sortie. La
rpartition de lcoulement entre les 15 canaux de 30 m se fait partir de la
section prcdente en forme dentonnoir et longue de 1 mm. Les plot triangulaires
prviennent londrement de la structure. La mme gomtrie est utilise la
sortie des canaux pour canaliser le ux vers la sortie. Lchelle reprsente 200 m.
6.2 Forme des globules rouges drpanocytaires
sous coulement
La reprsentation de globules drpanocitaires polymriss en forme de faucille,
majoritaires dans la microcirculation, et responsables dune obstruction strique
nest pas dle un coulement physiologique. La comparaison que nous avons
ralise entre un coulement de globules dsoxygns pralablement la mise
en coulement et des globules dsoxygns durant leur coulement, illustre bien
la dirence de morphologie des globules lorsque la dsoxygnation des globules
seectue sous cisaillement (gure 6.3). Lorsque les globules sont dsoxygns au
repos, lhmoglobine S polymrise et forme de longues bres qui dforment les
globules. Une fois en coulement ces globules gardent leur forme allonge (gure
6.3a). Au contraire, lorsque les globules sont dsoxygns sous cisaillement durant
leur coulement, les formes en faucilles sont rares et la trs grande majorit des
globules garde une forme discocyte avec un aspect grumeleux pour certains
(gure 6.3b). Les images provenant dtudes in vivo [123, 125] montrent bien que
les globules possdent dans leur trs grande majorit une forme discocyte et seuls
quelques rares globules prsentent la forme en faucille. Ce qui nexclut pas que des
globules fortement dforms se retrouvent pigs dans un bouchon mais ce nest
pas le passage dun ux de globules en faucille senchevtrant qui est lorigine
108 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
de la vaso-occlusion. Dailleurs lorsque nous avons fait circuler une telle solution
de globules dans des canaux de 30 m, aucun moment nous navons observ
la formation de bouchons. Dans la suite de notre tude nous utiliserons donc les
puces microuidiques deux niveaux qui permettent de dsoxygner les globules
au cours de leur coulement dans les canaux.
a.
b.
Flux
Flux
Fig. 6.3: Globules drpanocytaires (fraction 2, chantillon global 79,7% dHbS)
en coulement dans des canaux un hmatocrite de 25%. a. Les globules ont
t dsoxygns pralablement leur mise en coulement: on observe la prsence
de trs nombreux globules adoptant la forme caractristique en faucille. b. Les
globules sont dsoxygns durant leur coulement: les formes en faucille sont rares
(indiqu par les ches). Lchelle reprsente 10 m
6.3 Formation dagrgats cellulaires dans des ca-
naux microuidiques
Lide initiale tait de vrier si le changement de la rhologie de globules
drpanocytaires dsoxygns tait susante pour initier la vaso-occlusion. Mais,
lobservation de la formation dagrgats certains endroits de lcoulement nous
a amen sintresser de plus prs ces structures.
Lors de lcoulement de globules drpanocytaires, des agrgats se forment
partir des plots triangulaires de soutnement. Pour dterminer les facteurs pou-
vant favoriser cette agrgation nous avons fait varier plusieurs paramtres comme
6.3. FORMATION DAGRGATS CELLULAIRES 109
le nombre de globules blancs, la prsence dhmoglobine libre S ou A en solution.
Dans chaque cas, nous avons galement ralis lexprience avec des globules sains
comme tmoins. Les schmas de la gure 6.4 rcapitulent les dirents cas rencon-
trs. An de comparer les direntes structures, nous avons mesur la longueur
de ces agrgats au cours du temps, en prenant comme rfrence la base du plot
triangulaire (gure 6.5).
Globules drpanocytaires Globules sains
HbS libre en
solution
HbA libre en
solution
+ 0.1%
globules blancs
PBS+5mM
glucose
Fraction 2
flux
flux
flux
flux
flux
flux
Fig. 6.4: Cartographie des dirents types dagrgats de globules qui se forment
durant lcoulement, le ux se dirige de la gauche vers la droite. Les globules sains
ne forment pas dagrgats sauf lorsque lon rajoute de lHbS en solution. Avec des
globules drpanocytaires, la morphologie est trs dpendante de la prsence de
globules blancs.
110 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
6.3.1 Globules rouges drpanocytaires sous coulement
Nous avons suivi la formation dagrgats dans le cas de globules rouges drpano-
cytaires appartenant la fraction 2, injects 25% dhmatocrite qui correspond
lhmatocrite dans les veinules. Les globules sont dsoxygns durant lcoulement.
La gure 6.5 illustre la morphologie des agrgats au cours du temps et lvolution
de la longueur est reporte sur la gure 6.6. Au dpart, seulement deux ou trois
globules sont en adhsion derrire le plot (gure 6.5a), et ce pendant les 15 20
premires minutes (gure 6.6). Un agrgat se dveloppe partir de chacun des
deux coins du plot comme reprsent sur 6.5b. Aprs une heure dcoulement les
deux se rejoignent pour ne former plus quun. Cet agrgat continue de crotre pour
nalement atteindre une longueur stable pouvant atteindre une cinquantaine de
microns (gure 6.5c). De rares globules prsentant une dformation importante
sont visibles dans les agrgats.
Nous avons galement test le rle de loxygne sur la formation de tels agr-
gats. En partant de lagrgat form en condition dsoxygne, nous injectons de
lair la place de lazote dans le canal de gaz. Dans un premier temps lagrgat
change de forme, probablement en raison de la dpolymrisation de lHbS dans
les globules. Une partie des globules se dtachent de lagrgat qui diminue en
taille (gure 6.6), puis, lagrgat se reconstitue jusqu recouvrer sa taille prc-
demment atteinte en absence doxygne (gure 6.6). Plus gnralement, la prsence
doxygne nempche pas la formation dagrgats dans lcoulement: mme lorsque
lcoulement dbute en condition oxygne, nous observons la croissance dagr-
gats. Le caractre adhsif des globules drpanocytaires ne dpend donc pas des
conditions doxygnation.
La ralisation de la mme exprience avec des globules sains de mme concen-
tration globulaire moyenne dhmoglobine, 0, 34 g/cm
3
(fraction 2), montre quil
ny a pas de formation dagrgat mais juste 2-3 globules adhrs au plot de PDMS
(gure 6.6). Cest donc bien la nature adhsive des globules drpanocytaires qui
est responsable de la formation de ces agrgats.
6.3.2 Rle de lhmoglobine S libre en solution
Une des caractristiques des personnes atteintes de la drpanocytose est la
concentration plus leve dHbS libre dans le plasma. Cette HbS xe le monoxyde
dazote, molcule vasodilatatrice, entrainant ainsi la vasoconstriction des vaisseaux
sanguins. Nous avons voulu tester si lHbS libre tait aussi un facteur pouvant
modier les proprits dadhsion des globules rouges.
Nous avons suivi la formation dagrgats pour des globules sains suspendus
25% dhmatocrite dans le surnageant de globules drpanocytaire: aprs trois-
quatre jours de conservation de globules HbS dans du PBS+5 mM glucose, cer-
6.3. FORMATION DAGRGATS CELLULAIRES 111
a.
b.
c.
flux
l
Fig. 6.5: Formation dun agrgat au cours du temps pour des globules provenant
de la fraction 2 (chantillon global 58% HbS), le ux est de gauche droite. a.
t=5 min, les globules en adhsion derrire le plot de PDMS sont indiqus par les
ches. b. t=35 min, chaque extrmit du plot un agrgat sest form (dlimit
par les pointills), on distingue un globule en forme de faucille en bout dagrgat
(che). c. t=80 min, les deux agrgats se sont rejoints pour nen former quun seul
qui garde alors un taille stable (les ches signalent les formes en faucille visibles
dans lagrgat). La longueur mesure correspond la longueur maximale. Lchelle
reprsente 20 m.
112 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
N2
O2
injection O2
globules drpanocytaires
globules sains
Fig. 6.6: Evolution au cours du temps de la longueur des agrgats de globules.
Cercles rouge, donnes pour des globules drpanocytaires de la fraction 2 (chan-
tillon global 58% HbS), lagrgat crot jusqu atteindre une valeur denviron 44
m. Lorsque lazote est remplace par de lair 81 minutes, lagrgat se rarran-
geant, de nombreux globules se dtachent, puis lagrgat crot de nouveau pour
nalement atteindre la mme longueur que dsoxygn. Triangles bleu, exprience
tmoin avec des globules sains de densit similaire aux globules HbS prcdent,
seulement un ou deux globules adhrent au plot de PDMS.
tains shmolysent, relachant leur HbS en solution qui donne une couleur rose au
surnageant. Cest donc cette solution contenant de lHbS libre qui a t utilise
pour suspendre les globules sains. La gure 6.7 rapporte lvolution de la formation
dagrgats dans de telle conditions. Tout comme pour les globules drpanocytaires,
les agrgats commencent crotre signicativement quaprs une vingtaine de mi-
nutes, puis atteignent une valeur stable au bout de 80 minutes. Il est noter que
la longueur nale, 181, 5 m, reste infrieure aux tailles observes dans le cas
de globules drpanocytaires (une cinquantaine de microns). La mme exprience
ralise avec de lHbA libre en solution la place de lHbS, montre que lon na pas
de formation dagrgats comparables ceux obtenus prcdemment (gure 6.7).
Il semblerait donc que la nature mme de lHbS confre au globules des propri-
6.3. FORMATION DAGRGATS CELLULAIRES 113
HbS
HbA
Fig. 6.7: Rle de lHbS libre en solution: volution de la longueur des agrgats
cellulaires au cours du temps. Cercles rouges, globules sains (fraction 2) auxquels
le surnageant de globules HbS contenant de lhmoglobine libre a t ajout. Un
agrgat se forme et atteint une longueur moyenne stable de 18 m (longueur
moyenne sur 10 agrgats). Triangles bleus, globules sains auxquels a t ajout
de lHbA en solution. Seulement un ou deux globules adhrent derrire le plot de
PDMS.
ts dadhsion plus forte que la normale. LHbS libre a certainement interagi avec
la membrane des globules, sinon nous naurions pas observ la formation dagrgats
comme dans le cas avec lHbA. Toutefois la prsence dHbS libre en solution est
insusante pour obtenir des structure de taille comparable celles obtenues avec
des globules drpanocytaires. Leur caractre adhsif, encore mal compris, rsulte
donc de nombreux autre paramtres comme par exemple la prsence de protines
pro adhsives sur la surface de leur membrane, rsultant de laltration de celle-ci
par les cycles de polymrisation-dpolymrisation [64].
114 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
6.3.3 Rle des globules blancs
Ces dernires annes, la recherche des nombreux facteurs, autre que la poly-
mrisation, pouvant jouer un rle dans la pathophysiologie de la drpanocytose,
a amen dirent groupes sintresser aux globules blancs. Il a dj t observ
in vivo que les interactions globule rouge-globule blanc sont importantes durant
la circulation dans les vnules post capillaire [125]. De plus les globules blancs
provenant de personnes atteintes de la drpanocytose seraient plus adhsif que la
normale [124].
Nous avons donc ajout aux globules drpanocytaires provenant de la fraction 2,
environ 0,1% de globules blancs rcuprs lissue de lopration de tri par gradient
de densit. Une fois sous coulement, les structures formes sont radicalement
direntes de celle obtenues dans les expriences prcdentes. La gure 6.8 illustre
la morphologie typique de ces structures formant de longues tranes partir des
plots de PDMS et dont les globules sont agencs en grappe . Il est possible
de distinguer des globules blancs dans lagrgat mais un marquage uorescent de
leurs membranes serait plus indiqu pour pouvoir reprer leurs positions dans ces
structures.
Ces structures pouvant atteindre plusieurs centaines de microns de long, uc-
tuent dans le ux. Une autre observation interessante concerne le fait que lorsque
les globules arrivent dans lcoulement, ils ne sont jamais dj en adhsion entre
eux, cest donc dans lcoulement et certains endroits uniquement (au coins des
plots) que les globules sagrgent entre eux.
Sur la gure 6.9 est reporte la longueur de ces longues tranes, avec comme
rfrence lvolution dun agrgat en absence de globules blancs et le test tmoin
avec uniquement des globules sains. Les donnes pour la longueur des agrgats en
prsence des globules blancs ne reprsentent pas lvolution au cours du temps du
mme agrgat mais la longueur de dirents agrgats forms un temps donn. En
eet, il est dicile de suivre lvolution dun agrgat car contrairement au cas des
globules drpanocytaire seuls, ces tranes se constituent ds les premires minutes
de lcoulement et croissent en quelques secondes. Leur longueur est toujours de
plusieurs fois suprieure que lorsquil ny a pas de globules blancs, dmontrant que
les globules blancs sont bien un des facteurs prendre en compte.
Ces longs agrgats peuvent galement casser mais il ny a pas eu de formation
de bouchons lors de leur traverse des canaux de 30 m de large. Toutefois la
vitesse dans le canal a fortement diminu, et la prsence dun tel agrgat dans le
canal fait oce de ltre, les globules saccumulant en amont de lagrgat tandis
quen aval, le canal se dplette en globules.
6.4. VASO-OCCLUSION? 115
flux
l
Fig. 6.8: Globules provenant de la fraction 2 (chantillon global 58% dHbS) aux-
quels 0, 1% de globules blancs ont t ajouts. Les agrgats forms en prsence
de globules blanc forment de longues tranes pouvant atteindre plusieurs centaines
de microns de long. Ces agrgats se forment mi-hauteur du canal et uctuent
dans le courant. Nous distinguons sur la photo le tube de membrane entre le plot
de PDMS et le premier globule ainsi quun globule blanc au milieu de lagrgat
(che). La photo a t prise la n lorsquil ny a plus de globules dans lcoule-
ment, ce qui permet de bien discerner les globules constituant lagrgat. Lchelle
reprsente 20 m.
6.4 Vaso-occlusion?
6.4.1 Vaso-occlusion et dsobstruction
Bien que de nombreux facteurs jouant un rle dans la pathophysiologie de la
drpanocytose aient t identis et discuts [64, 127, 128, 132], la vaso-occlusion
reste toujours inexplique et imprvisible. Une tude de la vaso-occlusion dans des
canaux microuidiques a dj t mene [79], cependant plusieurs points mritent
dtre claircis. Premirement, les globules dans lcoulement circulent en amas
composs dune dizaine de globules environ (voir gure 6.10), ce qui est plutt
116 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
globules HbS + globules blancs
globules HbS
globules sains
Fig. 6.9: Comparaison de la longueur dagrgats lorsque 0, 1% de globules blancs
sont ajouts (losanges vert) avec comme rfrence lvolution pour un agrgat de
globules HbS (cercles rouge) et seulement des globules sains (triangles bleu). Les
donnes concernant le cas avec globules blancs ne correspondent pas lvolution
au cours du temps dun mme agrgat, mais la longueur dagrgats observs
un temps donn.
surprenant car nous navons jamais observ ce genre de comportement. Cepen-
dant le sang quils utilisent est parfois ancien (jusqu 60 jours) donc les globules
sont certainement altrs. En absence doxygne, les auteurs observent un ralen-
tissement progressif du ux jusqu larrt complet aprs une dizaine de minutes.
Par contre, les sites de vaso-occlusion ne sont pas dcrits, ni le mcanisme menant
cette vaso-occlusion (initiation partir dadhsion sur les parois, obstruction
strique, rle des amas dans lcoulement ...). Nous pensons que des globules dr-
panocytaires rigidis par la prsence de polymre et circulant en amas dune
trentaine de microns dans des microcanaux de taille comparable nest pas tran-
gre larrt de lcoulement. Le ux repart lorsque de loxygne est inject la
place de lazote.
Nous avons observ deux reprises ce type de comportement avec des chantillons
sanguins contenant plus de 90% dHbS: une partie des canaux sest obstrue sans
6.4. VASO-OCCLUSION? 117
Fig. 6.10: Globules en coulement dans un canal microuidique, les globules
forment des amas qui circulent dans lcoulement (Higgins et al. [79]).
que lon observe comment cela sest produit, mais lorsque nous avons roxygn
lcoulement, toute la partie larrt sest remise en coulement. Il semblerait que
la dpolymrisation rendant les globules plus dformables, modie susamment
les interactions entre eux pour que le bouchon se remette en coulement. Cepen-
dant on peut sinterroger sur la pertinence dun tel scnario in vivo. En eet si
lon pense quun tel bouchon de globules rendus rigides par la prsence de po-
lymre sest form dans une partie de la circulation o la pression partielle en
oxygne est trs faible, quelles seraient alors les sources doxygne ncessaires la
dpolymrisation?
6.4.2 La vaso-occlusion: une obstruction strique ?
Le bouchage de la microcirculation, et en particulier des capillaires sanguins
les plus ns par des globules fortement dforms est peu probable. Nous avons
observ que la morphologie des globules dsoxygns sous coulement est assez
dirente de celle au repos. En coulement, les globules drpanocytaires gardent
une forme quasi-discocyte avec pour certains, un aspect grumeleux. A une chelle
de 30 m, correspondant au diamtre typique des veinules post capillaires, nous
navons jamais observ docclusion engendre par une obstruction strique. Que
ce soit lors de la circulation de globules dsoxygns en coulement ou bien mme
lors de lcoulement de globules pralablement dsoxygns et donc adoptant en
trs grande majorit la forme caractristique en faucille (gure 6.3).
6.4.3 Adhsion des globules drpanocytaires
Les globules rouges drpanocytaires sont rgulirement dcrits comme tant
plus adhsifs que leurs homologues sains [75, 123, 127]. Les expriences que nous
avons menes avec des globules sains en prsence dHbS libre en solution montrent
que les globules sains sont aussi capables de former des agrgats cellulaires alors
118 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
que dans le cadre de globules sains avec de lHbA libre en solution nous nob-
servons pas la formation de telles structures. LHbS semble jouer un rle dans
les proprits adhsives des globules drpanocytaires. Des tudes montrent que
lHbS interagit avec la membrane des globules [133, 134] et peut se lier de faon
irrversible la membrane mme en conditions doxygnation [134]. Deux types
dinteraction seraient impliqus: une interaction lectrostatique avec la protine
band III de la membrane du globule rouge et une interaction hydrophobe impli-
quant trs certainement la valine substitue situe la position 6. La valine 6
est situe sur la surface de la protine, la molcule dhmoglobine comporte deux
rsidus succeptibles de se lier avec la membrane dun globule rouge. Dans ce cas,
on peut imaginer que les globules drpanocytaires puissent adhrer entre eux pour
former des agrgats.
6.4.4 Agrgats cellulaires
La morphologie des agrgats cellulaires est trs dpendante de la prsence de
quelques globules blancs dans lcoulement (gure 6.11). Bien que lon observe la
prsence des globules blancs dans les agrgats, nous ne savons pas si ils sont
la base de la structure. Nanmoins une tude rcente [135] montre que les glo-
bules blancs adhrent prfrentiellement au niveau des bifurcations, de plus cette
prfrence est indpendante de ltat de lendothlium et rsulterait de lhydrody-
namique au niveau des bifurcations.
Fig. 6.11: Dirence de morphologie des agrgats cellulaires en prsence de glo-
bules blancs ( gauche) et en absence de globules blancs ( droite). Lchelle re-
prsente 20 m.
Les dirences observes en prsence de globules blancs ne sont pas compl-
tement inattendues: la drpanocytose est caractrise par un tat inammatoire
chronique [132]. De plus, plusieurs tudes cliniques rapportent que la svrit de
cette maladie est directement lie au taux de globules blancs [136138]. A noter
que le nombre de globules blancs est plus faible chez les populations africaines. Il
6.4. VASO-OCCLUSION? 119
est raisonnable dimaginer quun taux plus faible rsulterait dun avantage volutif
pour des populations concernes par une haute prvalence de la mutation HbS.
La formation dagrgats que nous avons pu observer est conditionne par la
prsence dun coulement en coin. Il ny a pas dadhsion entre globules initie
partir de la surface du verre ou de la surface de PDMS suprieure. Le fait que
ces structures se forment partir dun mur au niveau de changement de direction
important du ux, rappelle les observations dcrivant ladhsion de globules au
niveau de bifurcations [125, 128] in vivo (gure 6.12). La photo de la gure 6.12b
est intressante car langle de la bifurcation est similaire langle que lon retrouve
au niveau des plots de PDMS, lagrgat qui en rsulte est assez important.
flux
flux
a. b.
270 330
Fig. 6.12: a. Adhsion de globules drpanocytaires au niveau dune bifurcation
dans une veinule post capillaire. Les cellules marques dun astrisque sont des
globules blancs (Frenette et al. [125]). b. Formation dun agrgat au niveau dune
bifurcation, les ches indiquent le sens de lcoulement (Kaul et al. [128]).
Nous ne connaissons pas les mcanismes lorigine de la croissance de ces
agrgats. Cependant, des tudes rcentes portant sur la croissance de biolms de
bactries, dnomms streamers , dj observe dans des canaux microuidiques
[139, 140], fait penser par plusieurs aspects la croissance des agrgats cellulaires
en prsence de globules blancs: ces streamers dbutent leur croissance au niveau
de changements de direction important du ux, et plus le changement de direction
est brusque plus les streamers qui se dveloppent sont importants en taille pour
une chelle de temps donne (gure 6.13).
De faon similaire nous observons la formation dagrgats de globules au ni-
veau des coins des plots de PDMS qui reprsentent un angle de 320

. Ailleurs
dans lcoulement o il y a galement des changements de direction mais plus
faible comme lentre ou la sortie des canaux de 30 m, nous nobservons pas
de telles structures. De plus les streamers se dveloppent mi hauteur dans
120 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
Fig. 6.13: Images confocale de streamers sous ux illustrant limportance de langle
sur leur croissance. Lchelle reprsente 200 m (Rusconi et al. [139])
Fig. 6.14: Schma des lignes de courants autour dun plot de PDMS illustrant
lhypothse dun ux secondaire local comme initiateur de ladhsion mi hauteur
de lcoulement.
lcoulement. Lexplication propose [140] est la suivante: bien qutant faible
nombre de Reynolds, il existe une perturbation locale du ux au niveau des coins,
dont lamplitude est proportionelle limportance de langle de changement de
direction du ux. Cette perturbation gnre un ux secondaire avec une compo-
sante verticale dirige du bas vers le milieu de lcoulement et une autre dirige du
haut vers le milieu de lcoulement, initiant ainsi la croissance des streamers
mi-hauteur. La gure 6.14 illustre ce que pourrait donner cette perturbation locale
dans le cas de la croissance des agrgats de globules au niveau des plots de PDMS,
sachant que nous observons eectivement que les agrgats contenant en particulier
des globules blancs, ottent dans lcoulement.
6.5. CONCLUSION 121
hmoglobine S
libre en solution
globules blancs
agrgats cellulaires vaso-occlusion
?
coulement en coin
Fig. 6.15: Rle jou par les dirents paramtres tests.
6.5 Conclusion
Notre tude permet de bien dcoupler linuence des dirents paramtres (oxy-
gne, globules blancs, hmoglobine libre, gomtrie), la gure 6.15 rsume le rle
jou par chacun. Les globules drpanocytaires sont naturellement plus adhsifs que
les globules sains. Lhmoglobine S libre en solution est pour partie responsable de
cette caractristique. De plus les globules blancs sont un facteur dterminant dans
la formation de longues structure dans lcoulement. Ces structures lorsquelles
cassent peuvent ralentir drastiquement la vitesse de lcoulement mme si cela na
jamais conduit lobstruction totale dun canal.
Quelle est la pertinence de la gomtrie de nos canaux ? Lide de dpart tait
de tester si nous pouvions observer lobstruction strique de globules en forme
de faucille enchevtrs dans des canaux de petite taille (30 m) pour vrier le
scnario si souvent dcrit pour avancer une explication la vaso-occlusion. Les
plots de PDMS tant destins uniquement au soutnement de la puce. Ce scnario
a vite t cart et la formation inattendue dagrgats cellulaire au niveau des
plots nous a conduit nous interesser ces structures.
Les expriences ralises nont pas permis de conclure quant aux mcanismes
menant jusqu la vaso-occlusion, nanmoins les rles de certains paramtres ont
t mis en lumire. Il serait interessant par exemple de contruire des coulements
microuidiques comportant un rseau de bifurcations avec des canaux de largeur
dirente se jetant les uns dans les autres et dobserver le comportement des
agrgats cellulaires dans une telle gomtrie.
122 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
Conclusions et perspectives
Le travail eectu durant cette thse a permis de dvelopper tous les outils
ncssaires ltude de la vaso-occlusion dans le cas dune maladie gntique: la
drpanocytose.
La premire partie relative la fabrication de vsicules pour la conception de
globules rouges articiels sest rvle plus riche que prvu. Le travail ralis au
cours de cette thse a consist pour la majeure partie du temps, la mise au point
de cette technique qui, de par ses nombreux avantages, est toute indique pour
la construction de systmes biomimtiques. Simple et rapide mettre en uvre,
elle permet la production haut rendement de vsicules contrles en taille et en
contenu. Les vsicules ainsi formes, possdent une membrane sans dfaut dont
nous avons fait varier la composition parmi une gamme importante de lipides. De
plus, il est possible de travailler des concentration salines physiologiques. Cette
mthode est utilise dans plusieurs laboratoires, pour ltude de la dynamique
du cytosquelette (groupe dAndreas Bausch), pour la reconstruction de divisomes
(groupes de Petra Schwille et German Rivas), pour lencapsulation dADN (Annie
Viallat)...
La deuxime partie constitue une tude prliminaire de la vaso-occlusion lie
la drpanocytose. Lemploi des techniques microuidiques nous a permis de recrer
des coulements mimant les conditions physiologiques, et de dcoupler linuence
des dirents paramtres (taux doxygne, prsence des globules blancs, hmoglo-
bine libre, gomtrie). Nous avons montr que la gomtrie de lcoulement est une
condition ncssaire pour la formation dagrgats cellulaires. Le caractre adhsif
des globules drpanocytaires est en partie d lhmoglobine libre en solution
rsultant de lhmolyse plus importante de ces globules malades. La morphologie
des agrgats est grandement dpendante de la prsence en solution des globules
blancs dans lcoulement, les structures formes pouvant mesurer jusqu plusieurs
centaines de microns de long.
Bien que nous nayons jamais observ de vaso-occlusion initie par ces agrgats
cellulaires, il serait intressant de construire des microcanaux reproduisant plus
dlement des portions stratgiques de la microcirculation. Par exemple, conce-
voir des puces comportant un rseau de bifurcations avec des canaux de largeurs
123
124 CHAPITRE 6. APPROCHE MICROFLUIDIQUE
direntes se jetant les uns dans les autres an dobserver le comportement
des agrgats cellulaires dans une telle gomtrie.
Nous avons galement observ que les globules dsoxygns sous coulement
ne se dforment pas en faucille. Nous pourrions utiliser des vsicules encapsulant
des solutions dHbS de concentration bien calibre pour observer la formation de
polymres sous cisaillement.
Appendices
125
Annexe A
Dtermination de la vitesse
dapproche en rgime de Taylor
Aux faibles nombres de Bond, on peut condidrer les interfaces uides (EAS/LOS
et LOS/DAS) comme non dformables et se ramener ainsi au problme de lap-
proche dune sphre dure sur un plan rigide.
A.1 Gomtrie du problme
R
r
hO
h(r,t)
z
R
V(t)

hO
a
Fig. A.1: Schma reprsentant une sphre de rayon R approchant un plan des
petites distances: h
O
R, avec h
O
la distance minimale entre la sphre et le plan.
La dynamique dapproche est gouverne par le dplacement du uide dans
lespace compris entre la sphre et le plan. La pression est maximum lorsque r=0
et dcroit rapidement lorsque r R, nous pouvons donc imaginer que la gomtrie
proche du minimum (r 0) sera la plus importante. Daprs la gure A.1 on peut
crire:
R + h
O
= h(r, t) +

R
2
r
2
, (A.1)
127
128 ANNEXE A. RGIME DE TAYLOR
soit pour r R:
h(r, t) R + h
O
R
_
1
1
2
_
r
R
_
2
+
1
8
_
r
R
_
4
_
h
O
_
1 +
r
2
2Rh
O

1
8
r
4
R
3
h
O
_
.
(A.2)
A partir de lquation A.2, nous pouvons dterminer une longueur caractristique
pour laquelle la gomtrie de lespace entre la sphre et le plan varie de faon
signicative (cest--dire la distance pour laquelle h varie dun facteur 2):
h(r, t)
h
O
= 1 +
r
2
2Rh
O
longueur caractristique l =
_
Rh
O
(A.3)
A.2 Champs des vitesse et de pression
Pour des distances sphre-plan R, en utilisant lapproximation de lubrica-
tion, nous considrons donc le champ de vitesse u = (u
r
, u
z
) avec [u
r
[ [u
z
[. Dans
de telles conditions, lquation de Navier Stokes et la condition dincompressibilit
scrivent respectivement:

p
r
+

2
u
r
z
2
= 0, (A.4)
p
z
= 0, (A.5)
1
r
(ru
r
)
r
+
u
z
z
. (A.6)
Lquation A.5 indique que la pression ne varie pas dans la hauteur sphre-plan,
par consquent p(r,t). En intgrant lquation A.4, nous obtenons le champ des
vitesses:
u
r
(r, z, t) =
1
2
p
r
z
2
+ C
1
(r, t)z + C
2
(r, t). (A.7)
En tenant compte des conditions aux limites u
r
= 0 z = 0 et u
r
= 0 z = h(r, t),
les fonctions C
1
et C
2
peuvent tre explicits et nous obtenons:
u
r
(r, z, t) =
1
2
p
r
z(z h). (A.8)
Nous intgrons prsent la condition dincompressibilit dans linterstice:
A.3. FORCE RSISTIVE EXERCE SUR LA SPHRE 129
_
h(r,t)
0
1
r
(ru
r
)
r
dz + V (t) = 0, (A.9)
avec V (t) = u
z
(r, h, t) =
dh
O
dt
la vitesse de la sphre. En injectant lquation A.7
dans cette expression, nous obtenons:
1
r

r
_
rh
3
p
r
_
= 12V (t), (A.10)
que nous intgrons une premire fois:
h
3
p
r
= 6V r. (A.11)
En utilisant lexpression A.2, nous dterminons compltement le gradient de pres-
sion dans lespace entre la sphre et le plan:
p
r
=
6V r
h
3
0
_
1 +
r
2
2Rh
O
_
3
. (A.12)
Finalement, en intgrant lquation prcdente, nous obtenons le champ de pres-
sion:
p(r, t) = C
3V R
h
2
O
_
1 +
r
2
2h
O
R
_
2
. (A.13)
Pour des distances caractristiques suprieures

Rh
O
, la fonction dans le terme
de droite diminue rapidement. En consquence nous choisirons comme pression de
rfrence constante p
O
, la pression pour r = R, ainsi:
p(r, t) p
O
=
3V R
h
2
O
_
1 +
r
2
2h
O
R
_
2
. (A.14)
A.3 Force rsistive exerce sur la sphre
La principale contribution la force hydrodynamique rsistive qui sapplique
sur la sphre est due la pression dans lespace entre la sphre et le plan et peut
tre calcule de la faon suivante:
130 ANNEXE A. RGIME DE TAYLOR
F
_
gap
(p p
O
)n e
z
dS

3V R
h
2
O
.2
_
R
0
r
_
1 +
r
2
2h
O
R
_
2
dr

6V R
2
h
O
.
(A.15)
A.4 Calcul de la vitesse en rgime de Taylor
La vitesse dune sphre approchant un plan rigide, peut tre explicit en cri-
vant lquilibre entre la force rsistive calcule prcdemment et la force centrifuge
(4/3 R
3
a), et nous obtenons nalement:
V =
2aRh
9
. (A.16)
Cest cette vitesse, caractristique du rgime de Taylor, que nous utilisons pour
dcrire lapproche de gouttelettes dune interface uide dans le cadre des faibles
nombres de Bond.
Annexe B
Protocole dtaill de dispersion
des lipides dans lhuile minrale
B.1 Contrle de lhumidit
La dispersion des lipides dans lhuile minrale est un point critique pour la
production de vsicules, une matrise ne de cette tape permet de plus lobtention
de vsicules sans dfaut et en grande quantit. Une attention particulire doit tre
porte aux conditions dhumidit tout au long du processus de dispersion. Pour cela
nous utilisons une poche gant (atmosbag Sigma Aldrich) dans laquelle lhumidit
relative est maintenue autour de 10% en insuant de lazote.
B.2 Dissolution des lipides dans le chloroforme
mthanol
Dans la poche gants, nous commenons par dissoudre les lipides achets sous
forme de poudre dans un mlange chloroforme/mthanol 9:1 v/v 50 mg/ml pour
de lEgg-PC. Cette solution est conserve 20

C et nous lutilisons uniquement


aprs trois semaines de repos. Nous avons dtermin ce delais de faon empirique,
lutilisation de cette solution pralablement ce repos rsulte en lchec de la
dispersion des lipides dans lhuile minrale, en outre cette solution est utilisable
pendant plusieurs mois aprs dissolution.
131
132 ANNEXE B. DISPERSION DES LIPIDES
B.3 Prparation de la LOS
B.3.1 Formation du lm de lipides
Pour la formation du lm de lipides nous utilisons un acon en verre de 25 ml.
Pour le rendre compltement tanche nous enroulons du ruban de ton sur le pas
de vis. Juste avant de lutiliser, nous souons de lazote lintrieur pour le scher
compltement et le fermons hermtiquement. Une fois dans la poche gants, 160 l
dEgg-PC de la solution mre (prcdemment dcrite) sont dposs dans le acons
ainsi quenviron 200 l de mlange chloroforme/mthanol an de sassurer que le
fond du acons soit compltement recouvert de uide. Le acon est alors dpos
dans un dessicateur (sassurer que le robinet est en position ferme avant douvrir
la poche gant), et le vide est fait pendant une vingtaine de minutes. Rapidement
( 5 min), un lm de lipide de couleur blanche devrait apparaitre sur le fond
du acon. Aprs 20 minutes, ce lm est clairement visible et possde un aspect
blanc givr . Si tel nest pas le cas, alors inutile de continuer, laisser sous vide
pendant plus longtemps (mme plusieurs heures) ne rsoudra pas le problme.
B.3.2 Dispersion dans lhuile minrale
Le dessicateur tant ramen dans la poche gant, nous pouvons casser le vide
et dposer sans attendre les 20 ml dhuile minrale (Sigma Aldrich # M3516) sur
le lm de lipides an dobtenir une concentration nale en lipides de 0,5 mM. Le
acon est alors hermtiquement ferm et laiss au repos sur la paillasse pendant
une heure. Lhuile minrale va alors goner le lm de lipides que lon devrait voir
apparatre de plus en plus clairement au cours du temps.
Pour disperser les lipides dans lhuile minrale, nous vortexons la solution une
vingtaine de secondes puis la sonicons pendant une heure en sassurant que la
temprature ne dpasse pas les 40

C en ajoutant de la glace si besoin. Ds les pre-


mires minutes de sonication, nous pouvont observer le lm de lipides se dtacher
du fond. En sortie de sonication la solution doit tre compltement transparente,
celle-ci est alors laisse au repos lambiante pendant toute une nuit avant utili-
sation. Le lendemain la solution doit tre trouble, cest le signe que des agrgats
de lipides de taille micromtrique se sont forms. La solution est alors prte pour
utilisation.
Au cours du temps les agrgats de lipides voluent, leur taille augmentant ils
nissent par sdimenter au fond de la solution au bout de 3 jours environs. Il est
possible de soniquer nouveau cette solution pour resuspendre les lipides, mais la
qualit des vsicules produites est moindre, et cette solution moins stable dans le
temps. De faon plus gnrale ce protocole peut tre utilis sans ajustement pour
dissoudre de nombreux lipides (voir tableau 3.1).
Liste des abrviations
CDICE Continuous Droplet Interface Crossing Encapsulation
HbS Hmoglobine S
oxyHbS Hmoglobine S dans la conformation oxygne
deoxyHbS Hmoglobine S dans la conformation dsoxygne
HbA Hmoglobine A
LOS Lipid in Oil Solution
DAS Dispersing Aqueous solution
EAS Encapsulated Aqueous Solution
CP Continuous Phase
NA Numerical Aperture
AFM Atomic Force Microscopy
SRBC Sickle Red Blood Cell
CCMH Concentration Corpusculaire Moyenne dHmoglobine
PBS Phosphate Buered Saline
PDMS PolyDiMethylSiloxane
133
134 ANNEXE B. DISPERSION DES LIPIDES
Bibliographie
1. Sickle cell hemoglobin polymerization., vol. 40, pp. 63279. Adv Protein
Chem, 1990.
2. H. Bunn, Mechanisms of disease - pathogenesis and treatment of sickle cell
disease, NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, vol. 337, pp. 762
769, SEP 11 1997.
3. H. Sakai, K. Sou, H. Horinouchi, K. Kobayashi, and E. Tsuchida, Review of
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