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Introduction

I.Rappel sur les staphylocoques.

II.Antibiogramme.
A.Test de sensibilité aux antibiotiques.

1.détermination de la CMI par microdilution

2.méthode par diffusion en milieu gélosé

III.Phénotypes de résistance et tests complémentaires.

1.Staphylocoques et bêtalactamines

2.staphylocoques et tétracyclines

3.staphylocoques et MLS

4.autres résistances
 Famille: Micrococcaceae ;
 Genre: Staphylococcus ;
 Environ 44 espéces dont :
Chez l'homme, les espèces les plus couramment
isolées sont :
› Staphylococcus aureus, le plus pathogène,
› Staphylococcus epidermidis, souvent considéré comme un
opportuniste,
› Staphylococcus saprophyticus, responsable d'infections
urinaires chez la femme jeune (cystite)
› et à une fréquence moindre, St. haemolyticus, St. hominis,
St. capitis et St. auricularis.
 La transmission intra ou interhumaine s’opère généralement
par contact direct => manuportage
 Plus rarement, elle peut être indirecte à partir d’une source
environnementale (vêtements, draps, matériels médicaux).
 Responsable de plusieurs infections :
 Infections communautaires et nosocomiales
 Infections cutanéo-muqueuses (folliculite, furonculose,
anthrax)
 Septicémies, endocardites, méningites….
 Intoxications alimentaires
 Infections urinaires

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 Cocci à Gram positif groupés en amas , immobiles , non
sporulés et ne présentent pas de capsule visible au
microscope
 Aéro-anaérobie facultatif, non exigeant
 Ils se développent rapidement à 37°C sur les milieux
usuels : Gélose nutritive
 Milieux sélectifs: Chapman, Baird Parker
 Catalase +

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 La plupart des souches de S. aureus élaborent un
pigment qui donne une couleur jaune-orangé aux
colonies.
 Coagulase +
 Dnase (thermonuclease) +
 Staphorex (test d’agglutination ) +
1.détermination de la CMI par microdilution selon les
normes ISO standard 20776-1:

 Milieu: bouillon Mueller Hinton


 Inoculum: 5*10^5 UFC/ml
 Incubation: atmosphére normal 35 ± 2 °C 20 ± 4H
 Lecture: en absence d’indication particuliére, la CMI
correspond à la concentration la plus faible avec laquelle
la croissance bactérienne n’est pas visible.
 Contrôle de qualité: S.aureus ATCC 29213.
 Rq: la technique de dilution en gélose est la méthode de
référence pour la fosfomycine.
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2.méthode par diffusion en milieu gélosé:
 Milieu: gélose mueller hinton
 Inoculum: 0,5 McFarland
 Incubation: atmosphére normal 35 ± 2 °C 20 ± 4H
( La durée d’incubation peut être prolongée dans
certains cas :oxacilline, glycopeptides et macrolides)
 Contrôle de qualité: S.aureus ATCC 29213, souches
complémentaires staphylococcus haemolyticus CIP
107204,staphylcoccus aureus NCTC12493 résistante
à la méthicilline.

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 Il est préférable de ne pas mettre plus de 6 disques
d’antibiotiques sur une boîte de 90 mm de
diamètre. Les disques d’antibiotiques doivent être
espacés de 24 mm , centre à centre.
 Presser chaque disque d’antibiotique à l’aide d’une
pince bactériologique stérile pour s’assurer de son
application. Une fois appliqué, le disque ne doit pas
être déplacé.
 Tester la liste d’antibiotiques indiqués dans les
tableaux suivants:
 LISTE STANDARD:
 Pénicilline G
 Céfoxitine
 Gentamycine
 Erythromycine
 Clindamycine
 Quinupristine-dalfopristine
 Norfloxacine
 Fluoroquinolone
 Acide fusidique
 Cortimoxazole
 Rifampicine

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 Liste complémentaire:
› Tétracyclines
› Ceftaroline › Minocycline
› Vancomycine › Tigécycline
› Teicoplanine › Linézolide
› Kanamycine › nitrofurantoine
› Fosfomycine
› Tobramycine
› Oxacilline
› Netilmicine › Daptomycine
› Trimethoprime › mupirocine
› Chloramphénicol
 Mesurer avec précision les diamètres des zones
d’inhibition à l’aide d’un pied à coulisse métallique,
à l’extérieur de la boîte fermée.
 Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant
dans la table de lecture jointe.
 Classer la bactérie dans l’une des catégories :
 Sensible, Intermédiaire ou Résistante.
NB : La souche de contrôle ATCC 25923 doit être testée
dans les mêmes conditions.
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 Actuellement, environ 95% des souches sont résistantes à la
pénicilline G, aux aminopénicillines, aux Carboxypenicillines et
aux uréidopénicillines <=> productrices de Pénicillinase.
(Il n’existe pas de méthode fiable de détection de la production de
pénicillinase pour les espèces autres que S. aureus.)
 Depuis quelques années , les Staphylocoques ont développé une
résistance à la méthicilline par modification de la cible
(modification de la plp2a géne mecA) ; ces souches sont
communément appelées souches méti-R ou SARM (S. aureus
Résistant à la Méthicilline).
 En milieu hospitalier, 20 à 40% des souches sont SAMR (Ha-
SAMR )
 Les souches communautaires sont, en général, sensibles à la
méthicilline,, cependant depuis quelques années, nous
observons la diffusion de souches communautaires résistantes à
la méthicilline (Co SAMR)
 la ceftaroline (CS3G) et le ceftobiprole (CS5G) possèdent
une activité sur les staphylocoques résistants à l’oxacilline mais
leur activité doit être testée séparement.
 Les staphylocoques résistants à la méticilline sont souvent
résistants à de multiples familles d’antibiotiques; cependant,
certaines souches ont une résistance isolée à l’oxacilline,
notamment les souches possédant le gène mecC.
Autres résistances (plus rares):
 BORSA (Borderline Staphylococcus aureus) :
 hypersécrétion de pénicillinase provoquant une hydrolyse des
pénicillines M.
 On observe une résistance de bas niveau à l’oxacilline.
 Ces enzymes sont plus ou moins inhibés par les inhibiteurs de b-
lactamases.
 Ces souches restent sensibles aux céphalosporines,
carbapénèmes …

 MODSA (Modified Staphylococcus aureus) :


 modification des PLP autre que la PLP2a. Ces souches présentent
une résistance isolée et de bas niveau à l’oxacilline.
 La sensibilité des staphylocoques aux
carbapénèmes est déduite de celle à la
céfoxitine.
Pénicilline G ATB + inhibiteur
Pénicilline A de Pénicilline M Céphalosporines
Mécanisme
Carbox/ Uréido bêtalactamase Carbapénèmes

Phénotype
sauvage S S S S
Pénicillinase
R S S S
Modification
de PLP2a R R R R
gène mecA
BORSA
Pase R R R S
hyperproduite
Souches
borderline
MODSA
Modif. PLP (non S S R S
2a) 24
Absence de Pase
Technique Contrôle de Observation
qualité
Test à la -Antibiogramme S.aureus ATCC 25923 Normes NCCLS:
-MH S.aureus: R si ≤ 19mm
cefoxitine (30µg)
-0,5 Mc Farland SCN: R si ≤ 24mm

Screening test -MH 4% NaCl S.aureus ATCC 29213 Test peu reproductible pour
-Oxacilline à 6µg/ml S.aureus ATCC 43300 les SCN
MRSA
-0,5 Mc Farland S.aureus ATCC
-Ensemencement / 43866
spot

Recherche de la -Agglutination Contrôle selon Kit Technique rapide,


recommandée en cas de
PLP2a diagnostic d’urgence et ou
d’infection grave.

CMI à l’oxacilline -MH 2% NaCl S.aureus ATCC 29213 Technique de référence


-0,5 Mc Farland Obligatoire pour la
confirmation des SCN MetiR.

Recherche du PCR Selon technique Très sensible, rapide. Pas


toujours une expression
gène mec A phénotypique
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Souche à tester

S.aureus ATCC 43866


S.aureus ATCC 29213

S.aureus ATCC 43300


Screening test

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 Milieu : Gélose MH additionné de 4% de NaCl et de 6µg d’oxacilline.

 Préparation de la solution d’oxacilline :


 Diluer 6 mg d’oxacilline (poudre injectable d’un flacon de 1g) dans
10 ml d’eau distillée stérile, puis faire une dilution au 1/10ème.
 Prendre 2 ml de cette solution dans une boîte de Pétri de 90mm de
diamètre.
 ajouter 18ml de gélose MH additionnée de 4% de NaCl.
 Mélanger en faisant des mouvements rotatoires.
 Laisser solidifier puis sécher les boîtes à l’étuve.

 Inoculum : A partir d’une culture pure de 18 h sur milieu d’isolement,


préparer une suspension bactérienne en eau physiologique à 0,9% d’une
opacité équivalente à 0,5 Mc Farland.
 L’ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation
de l’inoculum.
 Ensemencement : L’ensemencement se fait par spot, en
appliquant verticalement ,sur la gélose, l’extrémité d’un
écouvillon trempé dans la suspension bactérienne (ou
ensemencer un cadran entier).
 Les souches de référence doivent être testées dans les mêmes
conditions :
 S.aureus ATCC 29213 sensible à l’oxacilline .
 S.aureus ATCC 43300 résistant à l’oxacilline.

 Incubation : 24h à 35°C en atmosphère ordinaire.


 Lecture : La culture de plus d’une colonie de la souche
test indique une résistance à l’oxacilline, impliquant la
résistance à toutes les bêta-lactamines.
 Test d’agglutination

 Réactifs : Slidex MRSA detection (biomerieux).


ou PBP2’ Test (OXOÏD).
Souche MRSA + Souche MRSA –
Présence d’agglutination Absence d’agglutination
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 Les souches sensibles à la tétracycline sont aussi
sensibles à la doxycycline et la minocycline.
 Par contre, certaines souches résistantes à la
tétracycline peuvent être sensibles à la minocycline
et/ou la doxycycline.
 Pour les souches résistantes à la tétracycline, la
sensibilité à la doxycycline doit être vérifiée si
nécessaire par une mesure de la CMI.
 Pour la Tigécycline , les souches ayant des CMI au
dessus de la concentration critiques sont très rares.
 Les souches présentant de tels résultats doivent être
vérifiées puis adressées pour confirmation dans un
laboratoire référent.
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 Dans environ 90% des cas, la résistance aux MLS des
staphylocoques dorés est de type MLSB (plutôt
constitutive chez les SARM et plutôt inductible chez
les SAMS).
 Le phénotype MLSB constitutif touche aussi les
kétolides (dérivés de l'érythromycine produits par
hémisynthèse );
 La résistance à la pristinamycine est rare, elle
s’acquiert par association de mécanisme de
résistance (ex : MLSB + SA) En cas de résistance au
composé B des synergistines, leur activité ne repose
plus que sur le composé A, on ne peut donc pas
affirmer le caractère bactéricide de la synergistine.
 La résistance inductible à la clindamycine ne peut être
détectée qu'en présence d'un macrolide.
 Elle est mise en évidence sur l'antibiogramme par une image
d'antagonisme entre la clindamycine et l'érythomycine (D-
test).
 En cas de résistance à la clindamycine, l'activité de la
pristinamycine est diminuée.
 Devant une souche résistante à l’érythromycine et sensible à
la clindamycine, rechercher le caractère inductible de cette
résistance (antagonisme érythromycineclindamycine).
 En l’absence d’induction, répondre sensible à la
clindamycine, spiramycine et lincomycine.
 En présence d’induction, répondre sensible à
spiramycine,lincomycine et clindamycine avec le message
suivant : de rares échecs cliniques ont été rapportés par
selection de mutants constitutifs résistants.
Mécanisme Phénotype Erythro Linco Clinda Pristina
Azithromycine

Phénotype Sensible S S S S
sauvage

Modification MLSbi R S S S
de la cible
MLSbc R R R S
Inactivation L S R s S
enzymatique LSa S s/R S ?
Sa S S S ?

Efflux LSa S S/I/R S/I/R S/R


E R S S S
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 Résistance principalement par acquisition d’enzymes
inactivant l’aminoside.
 La gentamicine est l’aminoside le plus souvent actif sur le
staphylocoque doré. En cas de résistance à la
gentamicine, la bactérie sera résistante à tous les
aminosides (phénotype KTG) sauf streptomycine.
 L’utilisation de kanamycine et de tobramycine dans
l’antibiogramme sert à détecter les phénotypes K et
KT.
 phénotype K : présence d’une APH(3’)-III
 phénotype KT : présence d’une ANT-(4’)
 phénotype KTG : présence d’une APH(2’’) – AAC(6’)
 Environ 80% des SARM (Staphylococcus aureus résistant à
la méticilline) sont de phénotype KT.
 En cas d’indisponibilité du disque kanamycine 30
μg, les souches présentant un diamètre
d’inhibition de 6 à 12 mm autour d’un disque de
kanamycine 30 UI (24 μg) pourront être
caractérisées résistantes à l’amikacine.
 Les souches résistantes à la tobramycine sont
résistantes à la kanamycine et à l'amikacine.
Kanamycine
Phenotype Mécanisme Tobramycine Gentamicine
Amikacine
Inactivation enzymatique
Sauvage S S S

K R S S

KT R R S

KTG R R R

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 Le principal mécanisme de résistance du
staphylocoque doré aux fluoroquinolone est une
mutation de la cible (ADN gyrase ou topoisomérase
IV). Il confère une résistance croisée à toutes les
fluoroquinolones.
 D’autres mécanismes d’efflux ou de défaut de
pénétration sont plus rares.
 Les souches catégorisées sensibles à la norfloxacine
peuvent être rendues sensibles à la ciprofloxacine, à
la lévofloxacine, à la moxifloxacine et à l'ofloxacine.
 Pour les souches non sensibles à la norfloxacine,
chaque fluoroquinolone doit être testée
individuellement.
 VISA (Vancomycin Intermediate Staphylococcus
aureus), GISA (Glycopeptide
Intermediate Staphylococcus aureus) :

 Depuis 1997, des souches présentant une sensibilité


diminuée aux glycopeptides ont été décrites
 résistance rare, généralement de bas niveau et chez des
sujets ayant eu des traitements au long court par
glycopeptides.
 Des souches avec des CMI très élevées pour les
glycopeptides ont été décrite : VRSA, GRSA
 Les linézolides (Zivoxid®) restent, en général, actifs
sur les GISA.
 La détermination de la sensibilité aux
glycopeptides ne doit pas être réalisée par
diffusion en milieu gélosé.
 La méthode de référence pour la détermination
des CMI des glycopeptides est la microdilution
en milieu liquide (référence ISO 20776)
 www.sante.dz/aarn/documents/word/staph-
ammari.doc

 EUCAST : Société Française de Microbiologie Ed ;


2018: p.55-63.

 Clinical and Laboratory Standards Institute 2015

 Annales du contrôle national de qualité des


analyses de biologie médicale