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BURNICHON Nelly

TEXIER Anthony

DES bactriologie Semestre t 2003


Expos du 20 juin 2003

L ANTIBIOGRAMME :
LA DETERMINATION DES SENSIBILITES
AUX ANTIBIOTIQUES

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DES bactrio / t 2003
Sommaire

I. Introduction

II. Bactriostase
II.1 Dfinition
II.2 Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)
II.3 Dtermination de la CMI

III. Notion de Sensibilit/Rsistance


III.1 Dfinition de la rsistance
III.2 Dtermination des catgories S/I/R
III.3 Etablissement des valeurs critiques dlimitant les catgories cliniques
III.4 Relation avec la CMI

IV. Notion de spectre

V. Mthodes dtudes in vitro


V.1 Antibiogramme
V.1.1 Principe
V.1.2 Techniques classiques
V.1.3 Standardisation
V.1.4 Rsultats
V.1.5 Autres techniques
V.1.6 Limites de lantibiogramme
V.2 Autres mthodes
V.2.1 Recherche des bta-lactamases
V.2.2 Recherche de la mticillino-rsistance chez les staphylocoques
V.2.3 Recherche des bta-lactamases spectre tendu (BLSE)
V.2.4 Apport de la biologie molculaire
VI. Cas particulier de lantibiogramme automatis

VII. Conclusion

Annexe : Epreuves de synergie

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Lantibiogramme :
La dtermination des sensibilits aux
antibiotiques

I. Introduction
Le but de la ralisation dun antibiogramme est de prdire la sensibilit dun germe
un ou plusieurs antibiotiques dans une optique essentiellement thrapeutique. Il sert
galement :
- la surveillance pidmiologique de la rsistance bactrienne ;
- lidentification bactrienne par la mise en vidence de rsistances naturelles.
Sa ralisation est laisse linitiative du biologiste. Il doit tre pratiqu en raison de la
qualit, de la densit de lespce ou des espces isoles, soit de ltat clinique du patient ou du
sige de linfection sur les espces susceptibles dengendrer un processus infectieux (arrt du
30 juillet 1997-J.0. du 12 aot 1997 fixant la nomenclature des actes de biologie mdicale).

Il faut garder lesprit quen pratique, on tudie leffet des antibiotiques in vitro le
plus souvent et dans des conditions normalises de culture. Ainsi, il faut dterminer des
corrlations afin de prsumer de lefficacit in vivo de lantibiotique et donc de la russite (ou
de lchec) du traitement sur la base de donnes biologiques in vitro.

II. Bactriostase

II.1 Dfinition

La bactriostase correspond un ralentissement de la croissance dune population


bactrienne, pouvant aller jusqu' l'arrt de la croissance. Ceci ne vaut que si la bactrie tait
en phase de croissance avant le contact. Dans le cas contraire une absence de dveloppement
peut aussi correspondre une augmentation trs prononce du temps de latence.
La bactriostase peut tre tudie en milieu liquide par exemple par un suivi
photomtrique de la croissance des microorganismes en prsence de concentrations varies
d'antibiotiques.
II.2 Concentration Minimale Inhibitrice = CMI

Le paramtre le plus souvent utilis pour valuer leffet dun antibiotique est la CMI.
Elle correspond la concentration minimale dantibiotique qui inhibe la croissance visible du
germe en 24H. La CMI explore donc leffet bactriostatique seulement, ce qui nest pas
limitatif sachant quen bactriologie clinique, le but le plus souvent recherch est linhibition
de la prolifration bactrienne, dans la mesure o lorganisme est capable de se dfendre
contre les bactries (notons que son emploi nest pas justifi chez un malade
immunodprim).
On note de bonnes corrlations biologico-cliniques de l'emploi de la CMI, qui, aprs
plusieurs dizaines d'annes d'exprience savre tre un bon prdicateur de l'efficacit de la
thrapeutique antibiotique : Quand elle excde une certaine valeur l'chec thrapeutique est
habituel : quand elle est infrieure une autre valeur le succs est pratiquement assur. Entre
les deux valeurs prcdentes, la prdiction est impossible.

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II.3 Dtermination de la CMI
La CMI n'est pas, pour une bactrie donne, une constante biologique. Elle est dfinie
par le Comit de lAntibiogramme de la Socit Franaise de Microbiologie (CA-SFM)
comme tant la plus faible concentration dune gamme de dilutions dantibiotique de demi en
demi qui entrane linhibition de toute croissance bactrienne visible.
La mthode par dilution successive en milieu solide est la mthode de rfrence pour
dterminer la sensibilit bactrienne aux antibiotiques. Cette dtermination exige une
standardisation rigoureuse du protocole exprimental (influence de l'inoculum, du dlai
sparant ensemencement et observation, milieu de culture), toute modification des conditions
exprimentales rendant linterprtation difficile.
Dautres mthodes sont applicables : dilutions successives en milieu liquide
(croissance bactrienne apprcie par lapparition dun trouble) ; E-Test (bandelettes
imprgnes dun gradient dantibiotique).

III. Notion de Sensibilit / Rsistance

III.1 Dfinition de la rsistance

La rsistance des bactries aux antibiotiques est soit naturelle, soit acquise.
La rsistance naturelle dune espce ou dun genre est :
- Une caractristique propre, concernant lensemble des souches de lespce ou du
genre ;
- Porte par un chromosome donc toujours transmissible la descendance : transmission
verticale ;
- Un caractre permettant de dfinir le phnotype sauvage ou sensible de lespce ;
- Une aide lidentification dune espce.

La rsistance acquise, pour sa part :


- Ne concerne quune proportion plus ou moins importante, variable dans le temps, de
souches dune espce ;
- Rsulte dune modification gntique par mutation ou par acquisition de plasmides ou
transposons, (rsistance extra chromosomique) transmissible horizontalement, parfois
entre espces diffrentes ;
- Dfinit des phnotypes rsistants .

Les rsistances croises sexpriment, elles, au sein dune mme classe dantibiotiques
et sont dues au mme mcanisme de rsistance.

III.2 Dtermination des catgories S/I/R

A la suite des recommandations du Comit d'Experts de Standardisation biologique de


l'OMS (1979), la Socit Franaise de Microbiologie a cr un Comit de l'Antibiogramme
(CA-SFM) charg de dterminer les valeurs critiques qui dlimitent les catgories cliniques et
de proposer un guide pour la dtermination de la sensibilit des bactries aux antibiotiques.
Les valeurs critiques dfinies pour les concentrations et les diamtres des zones d'inhibition,
ainsi que les recommandations spcifiques certaines espces ou certains groupes
d'antibiotiques sont publies dans un communiqu annuel par le CA-SFM.

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Trois catgories cliniques ont t retenues pour l'interprtation des tests de sensibilit
in vitro : Sensible (S), Rsistant (R) et Intermdiaire (I).

Les souches catgorises S sont celles pour lesquelles la probabilit de succs


thrapeutique est forte dans le cas d'un traitement par voie systmique avec la
posologie recommande dans le rsum des caractristiques du produit (RCP).

Les souches catgorises R sont celles pour lesquelles il existe une forte
probabilit d'chec thrapeutique quels que soient le type de traitement et la dose
d'antibiotique utilise.
Les souches catgorises I sont celles pour lesquelles le succs thrapeutique est
imprvisible. Ces souches forment un ensemble htrogne pour lequel les
rsultats obtenus in vitro ne sont pas prdictifs d'un succs thrapeutique.

En effet, ces souches :


- Peuvent prsenter un mcanisme de rsistance dont l'expression in vitro est faible, avec pour
consquence leur classement dans la catgorie S. Cependant, in vivo, une partie de ces
souches apparat rsistante au traitement ;

- Peuvent prsenter un mcanisme de rsistance dont l'expression n'est pas suffisante pour
justifier un classement dans la catgorie R, mais suffisante pour favoriser l'apparition d'une
rsistance in vivo en cours de traitement ;

- Peuvent prsenter un mcanisme de rsistance dont l'expression n'est pas suffisante pour
justifier un classement dans la catgorie R, mais suffisamment faible pour esprer un effet
thrapeutique dans certaines conditions (fortes concentrations locales ou posologies accrues) ;
la catgorie intermdiaire est aussi une zone tampon qui tient compte des incertitudes
techniques et biologiques.

III.3 Etablissement des valeurs critiques dlimitant les catgories


cliniques
Les concentrations critiques des antibiotiques sont tablies sur la base des
concentrations sriques obtenues aprs administration dune posologie usuelle
(concentration critique infrieure c) et de la posologie maximale tolre (concentration
critique suprieure C). Le calcul de c et C met en uvre une formule incluant le pic srique, la
concentration au bout dune demi-vie, la concentration aprs 4h et le taux de liaison aux
protines plasmatiques, respectivement aprs administration de la posologie normale ou
leve. Chaque antibiotique a ses concentrations critiques propres.
La mthode par diffusion ralise le classement en utilisant la relation entre CMI et
diamtre dinhibition autour dune source dantibiotique, la lecture est donc relativement
directe. Pour une bactrie et un antibiotique donns, le diamtre dinhibition mesur est
compar aux diamtres critiques :
- En dessous dun diamtre critique infrieur d, la souche est classe R.
- Au dessus du diamtre critique suprieur D, la souche est classe S.
Les diamtres critiques d et D correspondent respectivement aux concentrations critiques
hautes C et basses c.
Les valeurs des concentrations et des diamtres critiques dfinies pour chaque antibiotique

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sont tablies en tenant compte de plusieurs paramtres :
La distribution des concentrations minimales inhibitrices (CMI) pour des
populations de souches dfinies et appartenant chacune des espces bactriennes
impliques en pathologie humaine ;

Les concentrations humorales et tissulaires qui sont obtenues avec les posologies
recommandes dans le rsum des caractristiques du produit (RCP) rdig par
l'Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Produits de Sant (AFSSAPS) ;

La confrontation des rsultats obtenus in vitro et des rsultats obtenus in vivo


(essais cliniques) ;

La variabilit statistique des mthodes utilises pour mesurer les CMI et les
diamtres des zones d'inhibition.

III.4 Relation avec la CMI

Aux regards des concentrations et des diamtres critiques sont considres comme :

Sensibles (S), les souches pour lesquelles la CMI de l'antibiotique test est
infrieure ou gale la concentration critique basse (c), ce qui quivaut un
diamtre suprieur ou gal au diamtre critique D;

Rsistantes (R), les souches vis--vis desquelles la CMI de l'antibiotique test est
suprieure la concentration critique haute C, correspondant un diamtre
infrieur au diamtre critique d;

De sensibilit intermdiaire (I), les souches vis--vis desquelles la CMI de


l'antibiotique test et du diamtre correspondant sont compris entre les deux
concentrations critiques et les deux diamtres critiques.

Catgories CMI (mg/L) Diamtre (mm)


Sensible CMI c Diamtre D
Rsistant CMI > C Diamtre < d
Intermdiaire c < CMI C d Diamtre < D

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IV. Notion de spectre
chaque antibiotique est associe une liste d'espces bactriennes qui constitue le
"spectre d'activit" de la molcule. Le spectre naturel, tabli dans les premires tudes avant
tout emploi en thrapeutique, reste stable par dfinition puisqu'il ne prend pas en compte la
proportion de bactries ayant acquis une rsistance l'antibiotique aprs son utilisation. Cette
proportion augmente au cours du temps parce que l'emploi de l'antibiotique exerce la pression
de slection ncessaire l'mergence de mutants ou de souches porteuses de facteurs
extrachromosomiques de rsistance. Cette notion doit tre connue du clinicien car elle
explique des situations d'apparence paradoxale : par exemple, le spectre naturel de la
pnicilline G comprend Staphylococcus aureus alors que 90% des souches sont actuellement
rsistantes par production de pnicillinase.

Pour faciliter le choix d'un traitement antibiotique, les espces bactriennes ont t
rparties en 3 classes :

- Espces Habituellement Sensibles ;


- Espces Modrment Sensibles ;
- Espces Rsistantes.

- Les espces habituellement sensibles : il s'agit d'espces rpondant la rpartition


suivante :
90% ou plus des souches sont caractrises par des CMI < c. Moins de 10 % des souches sont
rsistantes ou de sensibilit diminue.
Ex : pnicilline G et streptocoque A

- Les espces modrment sensibles : il s'agit d'espces dont la sensibilit naturelle n'a pas
t modifie par la rsistance mais qui sont habituellement classes I par l'antibiogramme :
90% et plus des souches se situent dans la catgorie I. Le classement ne dpend pas d'un
mcanisme de rsistance acquis (dont la frquence peut voluer), mais d'un caractre propre
l'espce.
Ex : macrolides et Haemophilus influenzae

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- Les espces rsistantes : il s'agit d'espces pour lesquelles plus de 50% des souches sont
rsistantes. Cette rsistance peut tre naturelle ou acquise. L'antibiogramme ne fait que
confirmer la rsistance s'il s'agit d'une rsistance naturelle ; il permet de suivre son volution
s'il s'agit d'un mcanisme acquis.
Ex : pnicilline G et S. aureus / aminosides et streptocoques

NB : la catgorie Espces Inconstamment Sensibles a t supprime fin 1999. La


nomenclature officielle oblige classer les bactries de cette catgorie dans la catgorie
espces sensibles en mentionnant le pourcentage de rsistance acquise.
Ex : penicilline G et pneumocoque.

Le spectre de l'antibiotique pour les diverses classes d'espces bactriennes est publi
rgulirement, en France dans le Dictionnaire Vidal.

V. Mthodes dtude in vitro

V.1 Antibiogramme
V.1.1 Principe

L'antibiogramme a pour but de dterminer la Concentration Minimale Inhibitrice


(CMI) d'une souche bactrienne vis--vis de divers antibiotiques. La dtermination de cette
valeur est peu prcise, mais elle est consacre par l'usage et elle bnficie d'une masse
importante d'informations recueillies son sujet.

V.1.2 Techniques classiques

Mthodes de dilution

Les mthodes de dilution sont effectues en milieu liquide ou en milieu solide. Elles
consistent mettre un inoculum bactrien standardis au contact de concentrations croissantes
d'antibiotiques selon une progression gomtrique de raison 2.
En milieu liquide (figure 1), l'inoculum bactrien est distribu dans une srie de tubes
(mthode de macrodilution) ou de cupules (mthode de microdilution) contenant
l'antibiotique. Aprs incubation, la CMI est indique par le tube ou la cupule qui contient la
plus faible concentration d'antibiotique o aucune croissance n'est visible.

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Figure 1 : Dtermination de la CMI par dilution en milieu liquide.

La CMI de la souche teste est de 2 g/mL (premier tube dans lequel aucune croissance n'est
visible l'il nu).

Technique en milieu liquide couramment utilise :


La dtermination de la sensibilit peut se raliser en milieu liquide en testant la sensibilit de
la souche bactrienne vis--vis des concentrations critiques suprieures et infrieures des
diffrents antibiotiques ou uniquement vis--vis des concentrations critiques infrieures. Ces
mthodes simplifies sont commercialises, ce qui les rend accessibles aux laboratoires de
diagnostic. L'inoculation des galeries et la lecture des rsultats peuvent se raliser
manuellement ou l'aide d'automates : technique en 24h ( 2 dilutions, c et C) ou en 4h (1 ou
2 dilutions possibles).

En milieu solide (figure 1bis), l'antibiotique est incorpor dans un milieu glos coul
en botes de Petri. La surface de la glose est ensemence avec un inoculum des souches
tudier. Aprs incubation, la CMI de chaque souche est dtermine par l'inhibition de la
croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d'antibiotique.
La mthode de dilution en milieu glos, ralise avec une gamme de concentrations en
progression gomtrique de raison 2 est la mthode de rfrence.

Figure 1bis : Dtermination de la CMI par dilution en milieu glos.

Une bote de Petri permet de tester jusqu 30 souches diffrentes. Dans l'exemple prsent
ci-dessus, le nombre de souches est limit quatre.
La CMI de la souche 3 vis--vis de l'antibiotique incorpor la glose est de 1g/mL. La
CMI de la souche 2 est de 2 g/mL. Les dterminations des CMI des souches 1 et 4
ncessiteraient de tester des concentrations plus fortes en antibiotique.

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Les techniques de dilution en milieu glos permettent galement de mesurer la
concentration inhibitrice 99% (concentration qui inhibe la croissance de 99% des cellules
d'une souche bactrienne) ou la concentration inhibitrice 50% (concentration qui inhibe la
croissance de 50% des cellules d'une souche bactrienne). Les dterminations des
concentrations inhibitrices 99% et 50% sont plus prcises que la dtermination des CMI
puisque les carts-types moyens sont respectivement de 0,3 log base 2 et de 0,07 log base 2
contre 0,7 log base 2 pour la CMI.

Dans la pratique courante, les mthodes de dilution sont de mise en uvre dlicate
et/ou onreuses et elles sont rserves des laboratoires spcialiss.

Mthodes de diffusion : antibiogramme standard

Les mthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont les plus utilises par les
laboratoires de diagnostic.
Des disques de papier buvard, imprgns des antibiotiques tester, sont dposs la
surface d'un milieu glos, pralablement ensemenc avec une culture pure de la souche
tudier. Ds l'application des disques, les antibiotiques diffusent de manire uniforme si bien
que leurs concentrations sont inversement proportionnelles la distance du disque. Aprs
incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant une
absence de culture. Lorsque la technique est parfaitement standardise, les diamtres des
zones d'inhibition dpendent uniquement de la sensibilit du germe.
la limite des zones d'inhibition, il existe dans la glose des concentrations
d'antibiotiques gales aux CMI. Les mthodes de diffusion ne permettent pas de chiffrer
directement ces valeurs. Toutefois, il existe une relation simple entre les diamtres des zones
d'inhibition et les log base 2 des CMI mesures par les techniques de dilution. Ces relations,
appeles droites de concordance ou droites de rgression (figure 2), ont t tablies par des
laboratoires spcialiss travaillant dans des conditions standardises. condition de respecter
un protocole identique, ces courbes sont utilisables par un laboratoire de diagnostic. En
thorie, les mesures des diamtres des zones d'inhibition et leurs reports sur les courbes de
concordance donnent les valeurs des CMI en g/mL. Dans la pratique, les rsultats de la
technique des disques doivent tre considrs comme uniquement qualitatifs en raison de la
variabilit exprimentale des diamtres et de l'erreur sur les valeurs de la pente et de
l'ordonne l'origine des droites de rgression.
Ces droites de concordance sont traces exprimentalement l'aide de nombreuses
souches. En gnral, on utilise un minimum de 100 souches appartenant au moins quatre
genres bactriens diffrents.
Une droite de concordance n'est valable que pour un disque contenant une quantit
dtermine d'un antibiotique donn.

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Figure 2 : Droite de concordance tablie pour l'amoxicilline avec un disque charg 25 g.

V.1.3 Standardisation

La fiabilit des rsultats d'un antibiogramme est influence par de nombreux


paramtres qui doivent tre rigoureusement contrls. La standardisation est rgie par des
documents manant de l'O.M.S. et des divers comits nationaux (pour la France, le Comit de
l'Antibiogramme de la Socit Franaise de Microbiologie). Selon les pays, il peut exister des
variations techniques et il est important de respecter une technique identique celle utilise
pour l'tablissement des courbes de concordance.
Parmi les principales recommandations, on peut citer les points suivants :
Le milieu de culture doit permettre la croissance de nombreuses bactries et il
ne doit pas contenir d'inhibiteurs des antibiotiques. Le milieu retenu pour la
majorit des espces bactriennes est celui de Mueller-Hinton.
La glose de Mueller-Hinton est enrichie de 5% de sang de mouton pour les streptocoques et
les campylobactries, de 10% de sang de cheval pour Helicobacter pylori ou de 5 % de sang
de cheval hmolys pour l'tude de la sensibilit des streptocoques vis--vis du
cotrimoxazole.
Pour Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae, le milieu de Mueller-Hinton est
remplac par une glose chocolat PolyVitex et pour les bactries anarobies par une glose
Wilkins Chalgren additionne de 5% de sang de mouton (ou une glose Brucella contenant 1
mg/L de vitamine K1 et 5% de sang).
Dans le cas particulier de la recherche de la rsistance la mticilline de Staphylococcus
aureus subspecies aureus, il est possible d'utiliser un milieu de Mueller-Hinton hypersal.
Les teneurs en calcium et en magnsium doivent tre contrles, car des
concentrations trop leves inhibent l'action des aminosides (rduction de la fixation sur la
membrane externe de certaines bactries Gram ngatif), des ttracyclines (chlation) et des
polymyxines.

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La teneur en thymidine doit tre fixe, car elle nuit l'activit des sulfamides.
Le pH influence l'activit de plusieurs antibiotiques (les aminosides et les
macrolides sont plus actifs en milieu alcalin, alors que les ttracyclines sont plus actives en
milieu acide) et il doit tre compris entre 7,2 et 7,4 (valeur qui permet une bonne croissance
bactrienne et qui ralise un compromis pour l'activit des antibiotiques).
Pour les mthodes de diffusion, la source d'antibiotique est en fait constitue
par le disque et le cylindre de glose sous-jacente. L'paisseur de la glose va donc
conditionner la concentration de la source d'antibiotique et elle doit tre de 4 mm.
Les antibiotiques, ainsi que les disques doivent tre standardiss. Cette
standardisation est effectue par les fabricants et le laboratoire a pour unique responsabilit de
stocker les disques dans des conditions optimales et de ne pas utiliser des disques prims.
Avant utilisation, les disques doivent tre amens temprature ambiante. Toute cartouche
ouverte doit tre utilise dans les cinq jours.
La densit de l'inoculum bactrien est un lment primordial et elle doit tre
ajuste l'aide d'un photomtre ou par comparaison avec un talon d'opacit (chelle de
McFarland).
En France, l'antibiogramme par diffusion est ralis avec une suspension contenant environ
106 bactries par mL. Pour certaines bactries, l'inoculum doit tre plus important : 107
bactries par mL pour les streptocoques, 108 pour Neisseria gonorrhoeae et 109 pour
Helicobacter pylori.
Pour les mthodes de dilution en milieu glos, les spots doivent renfermer environ 104
bactries et ce nombre est port 105 pour les Campylobacter ou pour les bactries anarobies
et 106 pour Neisseria gonorrhoeae.
Une phase de pr-diffusion des antibiotiques peut conduire l'obtention de
zones d'inhibition plus importantes. Selon les pays, une pr-diffusion est ou non prconise.
En France, la technique du "Comit de l'Antibiogramme de la SFM" ne prvoit pas de pr-
diffusion.
La temprature et la dure d'incubation doivent tre fixes. Pour la majorit des
bactries l'incubation est effectue 35-37 C durant 18-24 heures dans une
atmosphre normale.
Pour les streptocoques, Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae, l'incubation est
ralise dans une atmosphre contenant 5% de dioxyde de carbone.
Pour les Campylobacter l'incubation est effectue en micro-arophilie ou en anarobiose.
La dure de l'incubation, effectue dans une atmosphre dpourvue d'oxygne, est porte 48
heures pour les bactries anarobies et 72 heures (dans une atmosphre micro-arophile)
pour Helicobacter pylori.
Dans le cas particulier de la recherche de la rsistance la mticilline de Staphylococcus
aureus subspecies aureus, il est possible d'utiliser soit une glose de Mueller-Hinton
hypersale incube 37 C, soit une glose de Mueller-Hinton incube 30 C. Dans ce
dernier cas, la dure de l'incubation peut tre de 48 heures.
La technique doit tre rgulirement contrle avec des souches de rfrence.
Les souches les plus couramment utilises sont la souche ATCC 25922 (= CIP 76.24 = DSM
1103 = NCIB 12210 = JCM 5491) de Escherichia coli, la souche ATCC 27853 ( = CIP
76.110 = DSM 1117 = LMG 6395) de Pseudomonas aeruginosa et la souche ATCC 25923 (=
CIP 76.25 = DSM 1104 = JCM 2413 = NCTC 12981) de Staphylococcus aureus subspecies
aureus.

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La mise en place d'un contrle de qualit interne a fait l'objet de recommandations de
la part du Comit de l'Antibiogramme de la Socit Franaise de Microbiologie.
Lors de sa premire mise en uvre par un laboratoire, la technique de diffusion doit tre
ralise quotidiennement 8 10 jours de suite afin de la matriser, avec les souches de
rfrence et les antibiotiques suivants : pnicilline G, oxacilline, amoxicilline,
amoxicilline/acide clavulanique, ticarcilline, pipracilline, cfalotine, cfotaxime,
ceftazidime, imipnme, gentamicine, tobramycine, amikacine, acide nalidixique,
pfloxacine, ciprofloxacine, trimthoprime/sulfamthoxazole, rythromycine, lincomycine,
pristinamycine, rifampicine, acide fusidique, fosfomycine, colistine, vancomycine et
teicoplanine.
Le maintien de la qualit est ensuite vrifi au minimum une fois par mois. Si des
rsultats corrects ne sont pas obtenus, des mesures correctives sont mises en place, impliquant
alors de revenir la premire tape du contrle de qualit.

V.1.4 Rsultats

Expression des rsultats (figure 3)

En pratique, les laboratoires ne disposent pas des courbes de concordance, mais de


bandelettes de lecture sur lesquelles sont reports les diamtres correspondant aux
concentrations critiques. Si le diamtre mesur est infrieur au diamtre correspondant la
concentration critique suprieure, la souche est rsistante. Si le diamtre mesur est suprieur
au diamtre correspondant la concentration critique infrieure, la souche est sensible. Si le
diamtre mesur est compris entre les diamtres correspondant aux deux concentrations
critiques, la souche est de sensibilit intermdiaire.

Figure 3 : Bandelettes de lecture.

Les rsultats quantitatifs (CMI en mg/L) sont le plus souvent interprts par les
laboratoires en terme de possibilit thrapeutique. Cette interprtation consiste comparer les
valeurs des CMI avec les concentrations critiques tablies pour chaque antibiotique.

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Lecture interprtative de l'antibiogramme

La lecture interprtative de l'antibiogramme est fonde sur la connaissance des


phnotypes de rsistance. Elle a pour principal but de transformer un rsultat catgoris
"sensible" en un rsultat "intermdiaire" ou "rsistant" en raison d'un risque d'chec
thrapeutique. La lecture interprtative ncessite une identification correcte de la souche et
une mthode d'antibiogramme parfaitement standardise. La mise en vidence de phnoypes
de rsistance hautement improbables compte tenu de l'identification de la souche doit
conduire vrifier l'identification bactrienne, contrler la puret de l'inoculum et
contrler la technique de l'antibiogramme.
Actuellement, il existe des systmes informatiss daide la validation des rsultats :
les systmes experts qui permettent la recherche de rsultats anormaux. Ce contrle de
validation vise :
- Vrifier la cohrence germe/antibiogramme
- Dtecter les phnotypes de rsistance impossibles
- Dtecter labsence dune rsistance associe
- A reconnatre des phnotypes anormaux pouvant correspondre de nouvelles
modalits de rsistance.
Rq : Gnralisation des rsultats des antibiotiques non tests :
Le choix des antibiotiques tests repose avant tout sur l'identification du germe et sur la
connaissance de sa rsistance naturelle. Ce choix dpend galement du site de l'infection.
Parmi les antibiotiques susceptibles d'tre utiliss en thrapeutique, toutes les molcules ne
sont pas prises en compte. En effet, la connaissance des familles d'antibiotiques et des
mcanismes de rsistance croise permet de ne faire figurer dans l'antibiogramme qu'un
nombre restreint de molcules reprsentatives.

V.1.5 Autres techniques

Technique en milieu glos : le Etest


La dtermination prcise de la CMI par la mthode de rfrence est difficilement
utilisable en pratique quotidienne. La commercialisation d'une technique rapide et simple, le
Etest (AB Biodisk) permet un laboratoire une estimation indirecte de la CMI, tire de la
CID (figure 4).

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Figure 4 : Le Etest.

Le Etest permet de dterminer la CMI grce l'utilisation de bandelettes imprgnes d'un


gradient exponentiel continu de l'antibiotique tester. Ce gradient couvre une zone qui, en
fonction des molcules, va de 0,016 256 mg/L ou de 0,002 32 mg/L. Le Etest associe les
caractristiques des mthodes de diffusion et de dilution en milieu solide. Les bandelettes
(supports inertes, hydrophobes, de 5 mm de largeur et de 50 mm de longueur) sont appliques
sur la surface d'un milieu glos pralablement ensemenc avec un inoculum de la souche
tudier. Aprs incubation, l'inhibition de la croissance se traduit par une ellipse d'inhibition
dont les points d'intersection avec la bandelette dfinissent la CMI. Une chelle de lecture,
imprim sur la bandelette, permet une interprtation rapide.
Le milieu de culture (Mueller-Hinton ou milieux plus adapts pour les bactries croissance
lente et pour les anarobies) est ensemenc par la technique de Kirby-Bauer, soit par
inondation, soit par couvillonnage (lcouvillonnage permet de mieux fixer les bactries la
glose). La technique de Kirby-Bauer est conseille pour les bactries croissance lente et
pour les anarobies. L'inoculum doit tre standardis et les botes doivent tre parfaitement
sches avant le dpt des bandelettes. Ce dpt est un temps dlicat, il est impratif de ne pas
dplacer les bandelettes sur la surface de la glose, car l'antibiotique diffuse dans le milieu en
quelques secondes.
Lorsque la zone d'inhibition est nette et parfaitement symtrique, la lecture ne pose
aucun problme. Dans tous les autres cas, une interprtation est ncessaire :
- Une zone de dcrochage (dip) dans la zone de lecture impose de lire la CMI en
extrapolant la courbe de l'ellipse ;
- La prsence de colonies "squatter" doit tre analyse (rsistance htrogne,
mergence de mutants rsistants, mlange bactrien) ;
- La prsence d'une croissance en ligne le long de la bandelette n'est pas prise en compte
et rsulte certainement d'un schage insuffisant de la surface du milieu ;

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DES bactrio / t 2003
- Une asymtrie des points d'intersection de l'ellipse avec la bandelette conduit lire la
CMI au niveau le plus lev.

Cas particulier des mycobactries

Une fois la mycobactrie isole, il faut compter 3 4 semaines pour obtenir la rponse
de lantibiogramme. Les techniques utilises sont particulires ce type de bactries.

- Mthode des proportions


La dtermination de la sensibilit nest pas fonde sur la dtermination des CMI. On
considre les souches sensibles si, pour une concentration donne dantibiotique, la
population ne comporte une proportion trop importante de mutants rsistants, dfinie pour
chaque antibiotique et chaque concentration (proportion critique).
Elle consiste rpartir des quantits gales dinoculum bactrien sur des milieux contenant les
antibiotiques tester (Milieux Lowenstein-Jensen, Middlebrook 7H10 ou 7H11). On
ensemence 0,1 mL des dilutions 10-2 10 -5 sur des milieux de contrle tandis que 0,1 mL des
dilutions 10-2 et 10-4 est rparti en parallle sur des milieux contenant des concentrations
critiques des antibiotiques tester. La proportion de bactries rsistantes une concentration
donne est dtermine par comparaison du nombre de bactries viables qui se sont
dveloppes celui obtenu sur les boites contrle aprs 4 semaines. Pour chaque antibiotique,
un pourcentage de rsistance est tolr pour dterminer si la souche est S ou R. Ce
pourcentage est appel proportion critique et varie selon le milieu utilis et lantibiotique.
- Mthode radiomtrique
Dans cette mthode les bactries mtabolisent lacide palmitique marqu au carbone
14 en bouillon Middlebrook 7H12. La croissance bactrienne est value chaque jour par la
mesure du 14C-CO2 libr dans le milieu et captur par un dtecteur qui exprime ensuite un
indice de croissance variant de 1 999.

V.1.6 Limites de l'antibiogramme

Limites techniques

La ralisation d'un antibiogramme est soumise au respect de conditions techniques qui


sont parfois incompltement et insuffisamment respectes.
Un antibiogramme doit obligatoirement tre effectu sur une culture pure et identifie.
Cette dernire condition permet d'ajuster la densit de l'inoculum, de choisir judicieusement
les antibiotiques tester et de pratiquer une lecture interprtative.
Un antibiogramme ralis de manire non standardise et sur un mlange de germes non
identifis est dpourvu de sens.
Tout laboratoire devrait vrifier la validit de sa technique en testant, au moins une
fois par mois, la sensibilit des souches de rfrence et vrifier que les diamtres des zones
d'inhibition obtenues vis--vis des divers antibiotiques sont conformes aux valeurs publies
par le Comit de l'Antibiogramme.
Les techniques de l'antibiogramme ont t standardises uniquement pour les bactries
cultivant rapidement sur milieux usuels. Lorsque la souche isole ne rentre pas dans ce cadre,
l'interprtation est parfois dlicate :

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DES bactrio / t 2003
Les bactries appartenant aux genres Haemophilus, Brucella, Pasteurella,
Campylobacter, Nocardia... requirent l'emploi de milieux et de conditions de
culture adapts leurs exigences de croissance. D'une manire gnrale, on
considre que la rsistance est sans ambigut, mais que la sensibilit n'est
qu'apparente et devrait tre confirme par des techniques de dilution ;
En raison de la petite taille des colonies et de la dure d'incubation souvent longue,
la mthode de diffusion en milieu glos est inadapte pour les mycoplasmes.
Les espces des genres Chlamydia, Rickettsia... sont des parasites intracellulaires
obligatoires et l'tude de leur sensibilit aux antibiotiques ncessite le recours des
techniques particulires rarement effectues en routine.
L'antibiogramme ne permet pas de dterminer la sensibilit des mycobactries
croissance lente et pour les espces croissance rapide, on doit avoir recours des
mthodes de dilution (E-Test possible aussi).
Les techniques de diffusion appliques aux anarobies ont t critiques, car elles
ne peuvent tre appliques ni toutes les espces ni tous les antibiotiques. Elles
sont peu reproductibles et les rsultats diffrent souvent de ceux obtenus par
dilution. Ces techniques sont cependant utilises pour dtecter des rsistances
inhabituelles : rsistance au mtronidazole ou aux associations bta-lactamines -
inhibiteurs des bta-lactamases chez Bacteroides fragilis ; rsistance la
pnicilline chez les clostridies.
La technique des disques s'applique mal l'valuation de la sensibilit des molcules
qui diffusent peu dans la glose, ce qui est le cas des polymyxines ou des glycopeptides et
toute rsistance devrait tre confirme par la mesure de la CMI.

Limites dans l'interprtation des rsultats

Incertitude sur l'tiologie de l'infection


L'antibiogramme ne peut apporter une aide que dans la mesure o il est effectu sur la
bactrie vritablement responsable de l'infection. Parmi les bactries isoles d'un prlvement,
le laboratoire doit faire un choix et n'effectuer l'antibiogramme que sur l'espce ou les espces
susceptibles de jouer un rle tiologique. Ce choix n'est possible que dans la mesure o le
bactriologiste possde des connaissances en pathologie infectieuse.
valuation de l'intensit d'action d'un antibiotique
L'antibiogramme ne renseigne que sur l'activit bactriostatique. L'tude du pouvoir
bactricide d'un antibiotique sur la souche isole ncessite d'autres tests.
Association d'antibiotiques
D'une manire gnrale, l'antibiogramme ne permet pas la mise en vidence des
interactions ventuelles entre deux agents antimicrobiens et l'tude des synergies ou
antagonismes ncessite des tests complmentaires.

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Aminosides (entrobactries)
L'observation des phnotypes gentamicine "rsistant", tobramycine "sensible", ntilmicine
"rsistant" et amikacine "sensible" ou gentamicine "sensible", tobramycine "rsistant", ntilmicine
"rsistant" et amikacine "sensible" ou gentamicine "sensible", tobramycine "sensible", ntilmicine
"rsistant" et amikacine "rsistant" ou gentamicine "sensible", tobramycine "rsistant",
ntilmicine "sensible" et amikacine "rsistant" doivent conduire vrifier l'identification et
l'antibiogramme car de tels phnotypes sont improbables.

Aminosides (entrocoques, Streptococcus sp. l'exception de Streptococcus pneumoniae)


Seuls des disques fortement chargs en streptomycine, kanamycine et gentamicine doivent tre
utiliss pour les entrocoques et pour les streptocoques, car ces bactries sont naturellement
rsistantes bas niveau vis--vis des aminosides. Ils permettent de dtecter une rsistance acquise
de haut niveau qui abolit l'effet synergique bactricide de l'association des aminosides concerns
avec les pnicillines. Les autres aminosides restent utilisables en association.
Diamtre suprieur ou gal 14 mm pour la streptomycine ou la kanamycine, diamtre suprieur
ou gal 17 mm pour la gentamicine : synergie possible avec les pnicillines en cas de sensibilit
ces antibiotiques.
Diamtre infrieur 12 mm pour la streptomycine : la streptomycine ne peut tre utilise.
Diamtre infrieur 10 mm pour la kanamycine : la kanamycine, l'amikacine et l'ispamycine ne
peuvent tre utiliss.
Diamtre infrieur 11 mm pour la gentamicine : la gentamicine, la kanamycine, la tobramycine,
la dibkacine, l'amikacine, la sisomycine, la ntilmicine et l'ispamicine ne peuvent tre utiliss.

Aminosides (Providencia sp.)


Les rsultats gentamicine "sensible", tobramycine "sensible" et ntilmicine "sensible" doivent tre
interprts comme "intermdiaires" (rsistance naturelle).

Ampicilline (entrobactries)
Interprtation valable pour la bacampicilline, la mtampicilline et la pivampicilline.

Ampicilline (entrocoques)
La sensibilit des entrocoques aux pnicillines est apprcie l'aide d'un disque d'ampicilline
charg 10 g. Pour Enterococcus faecalis, l'interprtation est valable pour la pnicilline G,
l'amoxicilline, la pipracilline et l'imipnme.
Le traitement des infections svres dues des souches de Enterococcus sp. ampicilline S/I
ncessite des doses leves d'une pnicilline associe un aminoglycoside pour obtenir une
activit bactricide.

Amoxycilline + acide clavulanique


L'observation d'un phnotype amoxicilline "sensible" et amoxicilline + acide clavulanique
"rsistant" rvle une mauvaise conservation des disques d'antibiotique.

Cfalotine (entrobactries)
Rponse valable pour toutes les cphalosporines de premire gnration.

Chloramphnicol (Acinetobacter sp., entrobactries, entrocoques, Pseudomonas


aeruginosa, staphylocoques, Stenotrophomonas maltophilia, streptocoques)
Rponse valable pour le thiamphnicol.

Clindamycine (anarobies)

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La lecture doit tre effectue aprs 48 heures d'incubation car aprs 24 heures d'incubation les
souches peuvent apparatre faussement sensibles.

Colistine
Rponse valable pour les autres polymyxines.

Colistine (Proteus sp., Providencia sp., Serratia sp.)


L'observation d'un phnotype colistine "sensible" doit conduire vrifier l'identification et
l'antibiogramme, car un tel phnotype est improbable.

rythromycine (entrocoques, staphylocoques, streptocoques)


Rponse valable pour l'azithromycine, la clarithromycine, la dirithromycine et la roxithromycine.

Gentamicine (staphylocoques)
Interprtation valable pour la ntilimicine. Les souches rsistantes la gentamicine sont
rsistantes l'ensemble des aminoglycosides (sauf streptomycine).

Kanamycine (entrobactries)
Rponse valable pour la nomycine, la framyctine et la paromomycine.

Kanamycine (staphylocoques)
Interprtation valable pour la nomycine, la framyctine, la paromomycine, l'amikacine et
l'ispamycine.

Mtronidazole (anarobies)
Rponse valable pour lornidazole. Certaines souches apparaissent faussement rsistantes si
l'anarobiose n'est pas correcte.

Oxacilline (staphylocoques)
Les souches rsistantes loxacilline (rsistance homogne ou rsistance htrogne) doivent tre
considres comme rsistantes toutes les pnicillines (associes ou non un inhibiteur des bta-
lactamases), aux cphalosporines et aux carbapnmes, mme sil existe une sensibilit apparente
in vitro.
Les souches pnicillines rsistantes - oxacilline sensibles sont sensibles aux associations
pnicilline - inhibiteur de bta-lactamase, aux cphalosporines et aux carbapnmes. Il n'est pas
utile de tester ces molcules en routine.
Le test doit tre effectu dans des conditions permettant la dtection de la rsistance htrogne :
milieu de Mueller-Hinton hypersal incub 37 C ou milieu de Mueller-Hinton incub 30 C.
La rsistance htrogne se traduit par la prsence de microcolonies dans la zone d'inhibition.

Pnicilline G (staphylocoques)
La rsistance la pnicilline G par production de pnicillinase se traduit par la prsence de
grosses colonies en bordure de la zone d'inhibition ainsi que par l'ventuelle prsence de colonies
"squatters" dans la zone d'inhibition. La rponse "rsistant" est valable pour la pnicilline G et
pour les autres pnicillines sensibles aux pnicillinases (pnicilline V, aminopnicillines,
carboxypnicillines, uridopnicillines). Seule la pnicilline G doit tre teste et lorsque le
diamtre correspond une souche sensible, l'absence de production de pnicillinase devrait tre
recherche.

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Pnicilline G (streptocoques sauf Streptococcus pneumoniae)
La sensibilit des streptocoques la pnicilline G est apprcie avec un disque d'oxacilline charg
5 g. Si le diamtre est suprieur ou gal 21 mm la souche est sensible la pnicilline G et
cette interprtation est valable pour les autres bta-lactamines incluant les streptocoques dans leur
spectre. Si le diamtre est infrieur 21 mm la souches est rsistante ou de sensibilit
intermdiaire la pnicilline G. Devant toute souche dont le diamtre est infrieur 21 mm, il y a
lieu de dterminer la CMI de l'ampicilline, de l'amoxicilline ou du cfotaxime.

Quinolone de premire gnration (entrobactries)


Rponse valable pour toutes les quinolones de premire gnration.

Spiramycine (staphylocoques)
Interprtation valable pour la josamycine et la midcamycine.

Ttracycline (entrobactries, entrocoques, Pseudomonas aeruginosa, staphylocoques,


streptocoques)
Rponse valable pour l'oxyttracycline et la doxycycline.
Ttracyclines (coques Gram positif)
L'observation d'un phnotype ttracycline "sensible" et minocycline "rsistant" doit conduire
vrifier l'identification et l'antibiogramme car un tel phnotype est improbable.

Trimthoprime-sulfamthoxazole
Rponse valable pour les autres associations trimthoprime-sulfamide.

Il existe toutefois deux cas particuliers o l'antibiogramme est apte donner des
indications sur les associations :
o La rsistance aux macrolides, lincosamides et streptogramines (rsistance MLS),
par synthse d'une mthylase inductible, peut tre dtecte en plaant un disque
d'rythromycine en regard d'un disque de lincomycine. L'rythromycine dclenche
la synthse de la mthylase inductible et une image d'antagonisme est visible en
face du disque de lincomycine.
o Un disque unique est utilis pour les associations bta-lactamine-inhibiteurs des
bta-lactamases ou pour les associations trimthoprime-sulfamides.

Cas particulier des streptocoques et des entrocoques

La dtermination de la sensibilit des streptocoques et des entrocoques aux


aminosides permet au clinicien de prdire l'effet d'une association aminoside-bta-lactamine.
Les streptocoques et les entrocoques sont naturellement rsistants de faibles concentrations
d'aminosides, car ces antibiotiques pntrent difficilement dans le cytoplasme. L'association
avec une bta-lactamine qui altre la biosynthse de la paroi facilite la pntration. Cette
association est cependant inefficace si la souche de streptocoques ou d'entrocoques a acquis
une rsistance aux aminosides par mutation ou par synthse d'enzymes altrant l'antibiotique.
Ce haut niveau de rsistance est dtect en utilisant des disques fortement chargs en
streptomycine, en gentamicine ou en kanamycine.
En pratique, la rponse streptocoque ou entrocoque rsistant un aminoside signifie
que son association avec une bta-lactamine n'est pas souhaitable. Inversement, la rponse

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sensible signifie que l'aminoside pourra tre utilis, mais uniquement en association avec une
bta-lactamine et condition que la souche soit sensible aux bta-lactamines.

Absence de paralllisme entre les situations in vitro et in vivo.

L'antibiogramme ne peut prdire le comportement d'un antibiotique in vivo. Celui-ci


est fonction de multiples facteurs :
o Choix d'un schma posologique ;
o Diffusion au site de l'infection ;
o Pntration dans les cellules ce qui est important considrer pour les infections
dues aux bactries intracellulaires (les antibiotiques pntrant bien dans les cellules
sont les ttracyclines, le chloramphnicol, la rifampicine) ;
o Influence des facteurs physiologiques ou pathologiques sur la pharmacocintique
de l'antibiotique ;
o Transformation de la molcule in vivo ;
o Inactivation de l'antibiotique par chlation (ttracyclines) ou par fixation sur des
dbris cellulaires (polymyxines) ;
o Effets du pH (les aminosides sont inactifs pH acide) ;
o Etat physiologique de la bactrie au sein du foyer infectieux (les bactries au
repos sont insensibles aux antibiotiques qui interfrent avec la biosynthse du
peptidoglycane et il en va de mme pour les formes L qui sont des mutants
dpourvus de paroi) ;
o mergence d'une rsistance au cours du traitement ;
o Effets de l'antibiotique concentration sub-inhibitrice sur le pouvoir pathogne
(les quinolones et les ttracyclines inhibent, au moins partiellement, la synthse
des facteurs d'adhsion et une concentration insuffisante pour inhiber la croissance
peut avoir une certaine efficacit in vivo).

V.2 Autres mthodes


V.2.1 Recherche des bta-lactamases

Les enzymes inactivant les bta-lactamines peuvent tre dtectes par une mthode
chromognique :
Le principe repose sur l'utilisation d'une cphalosporine changeant de coloration aprs
hydrolyse. La molcule la plus utilise est la nitrocfine qui, aprs action d'une bta-
lactamase, vire du jaune au rouge. Des disques de papier imprgns de nitrocfine sont
commercialiss : Test Cfinase.

V.2.2 Recherche de la mticilino-rsistance chez les staphylocoques

Dans les conditions standard de lantibiogramme, seule une fraction de la population


exprime la rsistance aux pnicillines M. seules des conditions plus drastiques (incubation
30C ; milieu MH hyper sal) permettent une meilleure expression de la rsistance. On
dpose un disque doxacilline la surface du milieu. La lecture se fait 24 puis 48H. Une
rsistance htrogne se manifeste par la prsence de colonies de taille variable autour du
disque. La forte prsence de SARM en milieu hospitalier rend leur recherche indispensable.

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DES bactrio / t 2003
V.2.3 Recherche des bta-lactamases spectre tendu (BLSE)

La technique par diffusion est galement utilise dans le cadre de la recherche de


Btalactamase Spectre Etendu (BLSE). Pour cela on dispose sur la surface d'une glose des
disques de ceftazidime (et/ou de cefotaxime, et/ou de cfpime, et/ou de cefpodoxime, et/ou
d'aztronam) et d'amoxicilline-acide clavulanique 3cm l'un de l'autre.Les BLSE sont des
Btalactamases et sont donc inhibes par l'acide clavulanique. On observe alors une synergie
d'action entre les deux antibiotiques, appele "bouchon de champagne". En cas de prsence de
BLSE, on rendra sur l'antibiogramme sensibilit intermdiaire aux C3G et l'aztronam.
Cette technique permet de diffrencier une bactrie hyper productrice de cphalosporinase
d'une bactrie produisant une BLSE dans la famille des Entrobactries par exemple.

V.2.4 Apport de la biologie molculaire

Se rfrer pour ce chapitre lexpos


BIOLOGIE MOLECULAIRE EN ROUTINE AU LABORATOIRE DE
BACTERIOLOGIE DES BACTERIOLOGIE semestre hiver 2002/2003
disponible sur le site.
VI. Cas particulier de lantibiogramme automatis
Lautomatisation de lantibiogramme sest dveloppe pour pallier aux inconvnients
de cette technique manuelle, manquant de standardisation et dont la ralisation est lente.
Actuellement, ce terme est utilis pour dsigner des appareils effectuant la lecture et
linterprtation de tests faits manuellement. Ces appareils fonctionnent selon 2 grands
principes :
- Ils miment les tests conventionnels dtude de la sensibilit des bactries aux
antibiotiques (technique la plus courante : dilution en milieu liquide en plaque de
microtitration avec lecture en point fixe par un photomtre)
- Ou bien ils comparent la croissance dun tmoin celle observe en prsence
dune ou plusieurs concentrations dantibiotiques.
Les systmes tudient la croissance bactrienne soit en prsence dune seule
concentration dantibiotique (concentration permettant de discriminer les bactries
sensibles des bactries rsistantes) soit en effectuant une analyse cintique de la
croissance.

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DES bactrio / t 2003
Les mthodes dtude de la croissance des bactries font appel des mthodes optiques
directes :
- Analyse de limage recueillie par une camra ;
- Turbidimtrie (D.O. dune suspension proportionnelle la masse des particules en
suspension) ;
- Nphlmtrie (mesure de la lumire diffracte). En rgle gnrale, la
nphlmtrie a une sensibilit suprieure mais un domaine de linarit plus troit
que la turbidimtrie.
La plupart des instruments utiliss ne dtectent un trouble que si la densit
bactrienne atteint au mieux 107 bactries/mL (la turbidimtrie ncessite elle 108
109 bactries/mL).
Lquipement maximum et reprsent par :
- Un dispositif optique permettant la standardisation de linoculum ;
- Un systme de rpartition de linoculum
- Un incubateur
- Un dispositif de lecture des tests
- Un systme informatique qui effectue linterprtation des rsultats
- Des extensions ventuelles : identification, systme expert.

Exemples dautomates utiliss dans les laboratoires de bactriologie locaux :

Nom Principe Dlai Extension Utilisateurs


Systme ATB 1 ou 2 concentrations 24 ou 4h Identification HEH
Expression - dATB Systme expert X ROUSSE
Biomrieux Lecture en point fixe CARDIO
Turbidimtrie CHLS
CLB
BELLEVUE
Vitek I- Analyse cintique 4h-18h Identification CHLS
Biomrieux Photomtrie CLB
Antibiogramme pour
Entrobactries, non-
fermentants,
staphylocoques,
entrocoques, strepto B,
pneumocoques
Phoenix Lecture en point fixe sur 6h-11h Identification HEH
Becton 5 points de gamme en Systme expert X ROUSSE
Dickinson moyenne CARDIO
Colorimtrie

Lecteur automatis : Sirscan i2a


Automatisation de la lecture des antibiogrammes raliss en glose.
Lecture en 18 24h.

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DES bactrio / t 2003
VII. Conclusion
Lantibiogramme a pour but de prdire la sensibilit dun germe un ou plusieurs
antibiotiques dans le but dadapter au mieux lantibiothrapie dans un contexte infectieux.
Cette tude a lieu in vitro et il convient de considrer dautres caractristiques des
antibiotiques, pharmacocintiques par exemple, afin de davoir le maximum de chances de
gurison pour le malade.
Les techniques de ralisation des antibiogrammes nont cess dvoluer depuis une
vingtaine dannes avec les progrs de lautomatisation. Ceci a permis de diminuer les temps
dattente dans une optique doptimisation de la qualit des soins, mais galement de
standardiser au mieux les antibiogrammes. Toutefois, les anciennes techniques nont pas
disparu, car les techniques automatises ne sont pas parfaites : les bactries anarobies et
croissance lente poussent mal dans le cadre de techniques en milieux liquides. Ceci tend
prouver quun laboratoire de bactriologie devrait possder deux techniques pour raliser les
antibiogrammes : une automatique (choix dun automate parmi ceux sur le march) et une
manuelle, afin dobtenir une complmentarit maximale entre ces techniques.

Bibliographie

Manuel de bactriologie clinique 2e dition volume 1 FRENEY J. RENAUD F.


HANSEN W. Editions Elsevier p. 413-464.

Prcis de bactriologie clinique FRENEY J. RENAUD F. HANSEN W. BOLLET C.


Editions ESKA Fvrier 2000 - p.709-714 ; p.1071-1095.

De lantibiogramme la prescription JEHL F. CHOMARAT M. GERARD A. Editions


Biomrieux Fvrier 2000.

Site internet : http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/atbq.sensibilite.htlm.

Comit de lAntibiogramme de la Socit Franaise de Microbiologie - Communiqu


2003 Edition de janvier 2003 http://www.sfm.asso.fr

Bactriologie mdicale - Sous la direction de Jean-Pierre FLANDROIS - Collection Azay


p.73-100.

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DES bactrio / t 2003
ANNEXE : preuves de synergie
Introduction.

L'utilisation d'une association d'antibiotiques est justifie dans quatre cas :


largir le spectre d'activit dans les cas d'infections germes multiples ;
Traiter en urgence une infection grave non diagnostique ;
Prvenir la slection de mutants rsistants lors des traitements de longue
dure ;
Obtention d'un effet synergique.
La prvention de la slection de mutants rsistants (par exemple, lors d'infections
mycobactries ou brucelles) et l'obtention d'un effet synergique avec, si possible, une action
bactricide rapide constituent les raisons essentielles de l'utilisation d'une association. La plus
grande efficacit thrapeutique de certaines associations a t dmontre exprimentalement
et/ou confirme par l'exprience clinique.
L'interaction de deux antibiotiques peut produire quatre effets principaux :
Indiffrence : l'activit d'un antibiotique n'a aucune influence sur l'activit de
l'autre ;
Addition : l'effet de l'association est gal la somme des effets produits par
chacun des antibiotiques pris isolment ;
Synergie : l'effet de l'association est suprieur la somme des effets produits
par chacun des antibiotiques pris isolment ;
Antagonisme : l'effet de l'association est infrieur la somme des effets
produits par chacun des antibiotiques pris isolment.

Mcanismes des associations synergiques

Facilitation de la pntration
La pntration d'un antibiotique dans la bactrie peut tre facilite par une autre
molcule. Ce mcanisme est observ lors de l'association d'un antibiotique inhibant la
synthse de la paroi avec un aminoside. Ainsi, les bta-lactamines ou la vancomycine
facilitent la pntration des aminosides en augmentant la permabilit de la paroi. Cet effet
synergique a t dmontr pour les entrocoques, les streptocoques, Staphylococcus aureus
subsp. aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, mais il
n'est pas constat pour toutes les souches de ces espces.
Inhibition squentielle d'une mme voie mtabolique
Les associations trimthoprime-sulfamides sont synergiques, car il y a inhibition
squentielle de la dihydroptroate synthtase et de la dihydrofolate rductase qui sont deux
enzymes impliques dans la synthse des folates.
Inhibition de la synthse de la paroi
Un effet synergique squentiel se produit lors de l'association de la vancomycine avec
une bta-lactamine. L'association de deux bta-lactamines se fixant sur des PLP diffrentes
peut galement avoir un effet synergique. Les PLP ou Protines Liant les Pnicillines
constituent les cibles d'action des bta-lactamines.

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DES bactrio / t 2003
Inhibition des bta-lactamases
Une synergie par comptition d'affinit pour une bta-lactamase peut tre observe
lors de l'association pnicilline G (ou ampicilline) avec la cloxacilline.
L'association d'un inhibiteur des bta-lactamases, tel que l'acide clavulanique, avec
l'amoxicilline permet ce dernier antibiotique de conserver une efficacit sur des souches
productrices de certaines bta-lactamases.

Mcanismes des associations antagonistes

Association d'un antibiotique bactriostatique et d'une bta-lactamine


Les antibiotiques bactriostatiques comme les ttracyclines, les macrolides ou les
phnicols diminuent l'activit bactricide des bta-lactamines, car celles-ci ne sont actives
que sur les bactries en phase de multiplication. Cet antagonisme a t dmontr in vitro et in
vivo.
Associations d'antibiotiques actifs sur la sous-unit 50 S des ribosomes
Les associations macrolides-chloramphnicol ou macrolides-lincosamides ou
macrolides-macrolides conduisent une comptition pour la fixation sur la sous-unit 50 S
des ribosomes ce qui produit un effet antagoniste.
Inhibition du transfert actif des aminosides
In vitro, l'association d'un aminoside avec un phnicol ou une ttracycline inhibe le
mcanisme de transfert actif ncessaire la pntration de l'aminoside dans la cellule
bactrienne.

Induction de bta-lactamases
L'association de deux bta-lactamines peut tre antagoniste si l'une d'elles est
inductrice de bta-lactamases. Exemples : associations pipracilline-cfotaxime (ou
ceftazidime ou imipnme) ; associations cfoxitine-cfamandole (ou ceftazidime ou
carbnicilline).

Ralisation des preuves de synergie

L'activit d'une association d'antibiotiques est variable en fonction des espces


bactriennes et pour une mme espce selon les souches. En thorie, il est donc ncessaire de
vrifier l'activit de l'association envisage sur chaque souche isole. Il existe de nombreuses
mthodes pour tudier les effets d'une association, mais aucune d'elles n'est standardise et
elles sont gnralement de mise en uvre complexe. Le choix d'une mthode dpend donc
des possibilits du laboratoire.

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Technique simplifie utilisant une mthode de dilution en milieu liquide
(figure 5)

Figure5 : Schma
triangulaire de
rpartition (pour
quatre
antibiotiques)

C : Antibiotiques associs (de haut en


bas)
. A + B : 0,01 % de survivants, synergie
A : Tmoin inoculum . A + C : 0,01 % de survivants, synergie
B : Antibiotiques isols (de haut en bas)
(de haut en bas) : . A + D : 0,01 % de survivants, synergie
:
Inoculum pur . B + C : 100 % de survivants,
. Antibiotique A : 0,1 % de survivants
Dilu 10-1 antagonisme
. Antibiotique B : 1 % de survivants
Dilu 10-2 . B + D : 0,1 % de survivants, synergie
. Antibiotique C : 1 % de survivants
Dilu 10-3 (mais l'association est insuffisamment
. Antibiotique D : 10 % de survivants
Dilu 10-4 bactricide)
. C + D : 0,1 % de survivants, synergie
(mais l'association est insuffisamment
bactricide)

Une mme quantit de bouillon, ensemenc avec la souche bactrienne tudier (106
bactries / mL), est rpartie dans une srie de tubes disposs selon un "schma triangulaire".
Dans chaque tube, l'adjonction de disques pour antibiogramme permet de raliser les
concentrations dsires des antibiotiques tudier, soit seuls, soit en associations. Ces
concentrations sont comprises dans les limites des concentrations sriques efficaces tablis
pour chaque antibiotique. Aprs 24 heures d'incubation, chaque tube ne prsentant pas de
culture visible sert effectuer la numration des survivants ralise en milieu glos. Le
pourcentage de germes survivants est dtermin par comparaison de la densit des colonies
avec un tmoin inoculum.

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Technique par diffusion
Deux techniques qualitatives permettent une valuation, thoriquement simple, des
effets bactriostatiques des associations :
o Le placement rapproch de deux disques, la surface d'un milieu glos,
permet de dtecter les synergies ou les antagonismes les plus nets (figure 6).

Figure 5 Epreuve de
synergie

Avant d'effectuer le test d'association, on mesure le rayon de chacune des zones d'inhibition.
Dans le test proprement dit, la distance entre les disques sera gale ou lgrement suprieure
la somme de ces rayons.

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o La disposition angle droit de deux bandes de papier filtre imprgnes des
solutions d'antibiotique permet, aprs observation de l'angle form par la
rencontre des deux zones d'inhibition, de dterminer l'effet de l'association
(figure 7).

Figure 7 : Disposition
angle droit.

Technique par diffusion avec transfert sur cellophane.


Deux bandes de papier filtre imprgnes d'une solution d'antibiotique sont disposes
angle droit sur un milieu glos non ensemenc. Aprs diffusion des antibiotiques, les bandes
sont enleves et on dispose sur la glose une cellophane pralablement ensemence avec la
souche bactrienne. Au cours de l'incubation, les bactries se multiplient directement sur la
cellophane, sauf dans les endroits o les concentrations en antibiotiques inhibent la
croissance. Il est ainsi possible d'observer l'effet bactriostatique de l'association sur la souche
bactrienne. La cellophane est ensuite transfre sur une glose dpourvue d'antibiotique et
aprs une nouvelle priode d'incubation, on note la croissance des bactries survivantes. La
croissance ou l'absence de croissance dans les zones de diffusion et d'intersection aprs
transfert permet d'valuer l'activit bactricide de chaque antibiotique et de leur association.

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