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Chapitre 3 : les techniques physico-chimiques danalyse et de

caractrisation
Le choix : - des caractristiques de lanalyte
Pure ?
A sparer des autres composs ?
En concentration suffisante ?
A rcuprer aprs dosage ?
Quel volume disponible ?
- des caractristiques de la mthode :
Prcision, sensibilit, cot, rapidit

1. La pH metrie
1.1.

Dfinition

Le pH est la mesure de lacidit ou la basicit dune solution.


pH : potentiel hydrogne = -log [H3O+]
En ralit, seul les ions participent la raction :
pH = -log aH3O+
a : activit = [H30+]
: coefficient dactivit (compris entre 0 et 1)
Produit ionique de leau [H3O+]*[OH-] = 1,008.10-4 25C.
la concentration de H3O+ varie de 1 10-14 mol/L
chelle de pH, de 0 14
Influence de la temprature : dplace lquilibre ionique
Ex. : 60C, le pH de leau est de 6,51.

1.2.

Les diffrentes mthodes de mesure du pH

Les indicateurs colors : ce sont des substances organiques qui prsentent une couleur
diffrentes sous forme basique ou acide. Utiliss en solution ou en mlange sur des
bandelettes.
Les mthodes potentiometrique : cest une mesure de diffrence de potentiel entre 2
lectrodes plonges dans la solution.
Electrode hydrogne : cest la mthode absolue. Son potentiel vaut 0.
Electrode de verre.

1.3.

La chane de mesure en pH metrie

Elle est compose de :


Un millivoltmtre
Une lectrode de verre
Une lectrode de rfrence
Une sonde de temprature
Solutions talons de pH connus

Electrode de verre : une membrane de verre mise au contact de 2 solutions de valeurs


de pH diffrents, dveloppant entre ses parois une diffrence de potentiel lectrique
proportionnel la diffrence de la valeur du pH.
Electrode de rfrence : son potentiel reste constant une temprature donn quel que
soit le milieu dans lequel elle est plonge
Electrode combine : elle combine en une seul entit une lectrode de verre et une
lectrode de rfrence (2 fils dans un cble).

1.4.

Etalonnage de la chane de mesure

Il doit tre raliser avec des solutions talons pH connu et dans les mmes conditions que les
mesures sur les solutions inconnus : mme temprature, agitation, mme critre de stabilit
(dure au bout de laquelle lappareil donne une valeur stable).
Rsultat : droite dtalonnage (rponse linaire en fonction du pH) voir doc 2
Pente : sensibilit de la membrane de verre
pH0 : pH pour lequel le pH-mtre mesure 0 mV.
Ses deux paramtres dtalonnage sont calculs et mmoriss par le pH-mtre. Les tensions
mesures par le pH-mtre sont dfinit par la loi de Nernst (voir cour de chimie).

1.5.

Exemple dapplication (doc 3)

Mesure pH dune solution


Titrage acide/base
Dtermination pHi et pKA

2. Conductimtre
Cest la mesure de la capacit, pour une solution, conduire llectricit.

2.1.

Principe et dfinition

Electrolyte : cest une solution dans leau. Un sel est un compos ionique composs de
cations et danions, formant un produit neutre sans charge net. Cest un milieu conducteur
dans lequel les ions se dplacent sous leffet dun champ lectrique (Fig. 1).
Conductance : inverse de R
Loi dOhm : U = R*I
R = (1/G)*I
Mesure : cellule conductimtrique (fig. 1 et T.D.).
Facteur dinfluence :
- caractristique de la cellule
- la nature et la concentration des ions
G = *(S/l)
: conductivit
S : surface des lectrode
l : largeur entre les lectrodes
G : conductance S/m
G : *constante de la cellule
- conductivit : = (zi*Ci*i)
zi : charge de lion
Ci : concentration ion
i : conductivit molaire ionique
La conductivit molaire ionique dpend de la nature de lion, du solvant, de la temprature et
de la concentration. La valeur est donne dans les tables dilutions infinies.

2.2.

Utilisation du conductimtre (voir T.P.)

Ltalonnage se fait une temprature donne et une concentration de KCl connu.

2.3.

Exemple dapplication

dosage par dtermination dun volume quivalent


dosage par mesure de la conductivit dune solution talon, puis tracer la droite
constante de solubilit
conductimtre en sortie de colonne HPLC comme dtecteur

3. La spectroscopie dabsorption molculaire dans lUV et le visible


3.1.

Dfinition

Mthode couramment employe pour dterminer la concentration en substance en solution


dans un mlange complexe. Cette mthode utilise la proprit de certains composs
dabsorbs davantage la lumire certaines longueurs donde.
Chromophores : groupement datomes au sein dune molcule prsentant une absorption dans
lUV ou le visible. (doc 2)

3.2.

Spectres dabsorption

Les molcules incolores peuvent tre colors par des ractifs => dosage colorimtrique

Choix de la cuve :
Il y a les cuves plastiques visibles
cuves plastique UV
cuves en quartz

3.3.

mesure 340nm
mesure 280nm
mesure <280nm

Loi de Beer-Lambert

Enonc : quand un faisceau de lumire monochromatique dintensit I0 traverse une solution


contenant des molcules absorbantes, une partie de la lumire est absorbe. Labsorbance est
proportionnel la concentration de la molcule qui absorbe dans le milieu de culture.
A=*l*C
varie en fonction de la longueur donde.
Condition de validit :
Lumire monochromatique
Solution dilue
Milieu homogne non fluorescent
Loi dadditivit des absorbance dans un mlange

AMlange = A1+A2= 1lC1+ 2lC2


Consquence : il faut tenir compte de labsorbance du ractif, de la cuve, donc, soit on les
mesure sparment, et on les soustrait, soit on lit directement un blanc ractif (spectro. bi
faisceau, soit on fait un zro sur le blanc ractif si spectro. mono faisceau).
Limite de linarit, limite de dtection, sensibilit (voir cour et T.P.)

3.4.

Schma de principe dun spectro.

Spectro. mono faisceau


Choix de la longueur donde, slection grce un filtre ou un monochromateur.
Rglage du zro, sur un blanc ractif, puis lecture de lchantillon
Spectro. bi faisceau
Slection de la longueur donde par un monochromateur. 2 emplacements, un pour le blanc
ractif, lautre pour lchantillon.
Laffichage se fait directement, Aech. - Ablanc
Vrifier le zro lectrique lorsque le spectro est vide, positionner les cuves, et lire
directement.
Lavantage de ce systme est que lorsque lon a une rfrence qui volue dans le temps ou
avec la longueur donde.
Contrle de lappareil : la longueur donde affiche est elle exact? Contrle avec une solution
dholmium.
A affich est elle exact ? (Bichromate de potassium)

3.5.

Exemple dapplication et mthode de dosage

Dosage des protines :


- Biuret
- Bradford
- Folin-Lowry
- Absorbance 280 nm : spectrophotomtrie UV
Dosage des acides nucliques : Absorbance 260 nm, spectroscopie UV.
Diffrentes mthodes de concentration dchantillon :
Premier cas : on connat .
Problme : varie selon les conditions opratoires (pH, solvant) Cest cependant trs utilis
en enzymologie.

Deuxime cas : inconnu 1 ou plusieurs talons de concentration connues

Impose de connatre la limite de linarit.


plusieurs talons : gamme dtalonnage A=f(C)
Avantage :
On vrifie le domaine de linarit
On minimise les erreurs en traant une droite moyenne