Actions conduites par le laboratoire National de Rfrence sur Rhinotrachite Infectieuse Bovine pour la prophylaxie et la qualification volontaire des

cheptels bovins franais Eric Dubois1, V. Duquesne1, F. Suavet1, C. Gastaldi1, G. Adam1, A. Del Cont1, R. Thiry1, S. Memeteau2 1-Laboratoire National de Rfrence Rhinotrachite Infectieuse Bovine Anses, Laboratoire de Sophia-Antipolis - 105 route des Chappes - B.P. 111 - F-06902 SOPHIA-ANTIPOLIS cedex France ; (eric.dubois@anses.fr - Tl. : +33 492 94 37 00 - Fax : +33 492 94 37 01). 2-Association pour la certification en sant animale (ACERSA) 149 rue de Bercy 75595 Paris cedex 12, France.

Introduction Lherps virus bovin de type 1 (BoHV-1) est responsable de signes cliniques diffrents en fonction de la voie de contamination des animaux (Muylkens et al., 2007). La forme gnitale (vulvo-vaginite de la vache ou balanoposthite du taureau) ne se rencontre que rarement en France, en raison de contrles sanitaires rigoureux sur les animaux reproducteurs. La rhinotrachite infectieuse bovine (IBR) est la forme respiratoire de la maladie qui persiste sur le territoire. Les deux voies de contamination chez des vaches gestantes peuvent aussi conduire des avortements. Toutefois, linfection par le BoHV-1 est le plus souvent asymptomatique et dun impact sanitaire limit. Les pertes conomiques sont essentiellement lies au vice rdhibitoire que constitue lIBR dans la vente ou lchange de bovins au plan national (Dcret n2001-375). Au niveau europen, lIBR donne lieu des demandes de garanties additionnelles pour les changes intracommunautaires de bovins (Dcision du 21 aot 2007) vers des pays qui ont mis en place un programme de lutte approuv (certaines rgions dAllemagne et dItalie) ou indemnes dinfection par le BoHV-1 (une province dItalie, deux rgions dAllemagne, le Danemark, lAutriche, la Finlande et la Sude). En France, dans les annes 90, plus de 40 dpartements avaient mis en uvre des actions en
matire dIBR, mais sans harmonisation. Ce fut lorigine de la mise en place, en 1996, dun dispositif national, volontaire de qualification (dont le gestionnaire est lAssociation pour la certification en sant animale - ACERSA), complt par la suite par des mesures

obligatoires de prophylaxie nationale (Arrt du 27 novembre 2006). Cette prophylaxie concerne annuellement lensemble des cheptels, tandis que la qualification est acquise par environ 58% (donnes 2009-2010) des exploitations (laitires, allaitantes ou mixtes) (Memeteau et al, 2011).

Programme Franais de contrle de lIBR et qualification volontaire des cheptels.

La qualification volontaire des cheptels repose sur le cahier des charges techniques (CC/IBR/01) de lACERSA. Le document dcrit les points de matrise pour lacquisition et le maintien des qualifications. Il dcrit galement la gestion des introductions, du transport, des pturages collectifs, des concours et dfinit les zones situation pidmiologique favorables ( faible prvalence ou faible incidence) permettant lallgement de certaines mesures de contrle (Bronner et al., 2010). Deux niveaux de qualification sont possibles : la qualification A cheptel indemne dIBR et la qualification B cheptel contrl en IBR . En 2010, 122.072 cheptels taient qualifis A contre 1.058 qualifis B (Memeteau et al, 2011). La qualification A est acquise dans un intervalle de temps donn par des sries successives danalyses sur des laits de grand mlange (LGM ; 4 sries ngatives sur 16 24 mois) ou sur des mlanges de srums (mlanges dau plus 10 srums issus des animaux de 24 mois et plus ; 2 sries ngatives sur une priode de 3 15 mois). En cheptel laitier, la qualification est maintenue par deux sries danalyses ngatives sur LGM, ralises sur deux six mois (une seule analyse par an est accepte pour les cheptels en zone situation pidmiologique favorable). En cheptel allaitant, la qualification est maintenue grce une analyse ngative annuelle sur mlange de srums (contrle srologique sur 20% des bovins de plus de 24 mois, avec un minimum de 10 animaux, pour les cheptels en zone situation pidmiologique favorable). La qualification B correspond des cheptels dans lesquels les animaux de moins de 48 mois sont tous ngatifs en analyses srologiques sur mlanges de srums au moment de lacquisition de lappellation. Toutefois ces cheptels peuvent hberger des animaux plus gs connus positifs mais vaccins rgulirement contre lIBR. Dans le cadre des mesures de prophylaxie, le dpistage annuel des bovins de 24 mois et plus, non vaccins, sappuie sur les mmes essais en mlanges que ceux de la qualification volontaire. Dun point de vue rglementaire, les contrles srologiques lintroduction seffectuent, quant eux, sur tous les animaux, quelque soit leur ge, par des analyses individuelles dans les 15 jours maximum avant ou dans les 10 jours suivants leur arrive dans le nouveau cheptel. Seuls les animaux issus de cheptels qualifis A ayant bnfici de conditions de transport matrises peuvent droger ces contrles. Les leveurs engags dans la qualification volontaire sont soumis des rgles particulires. Si les animaux introduits sont indemnes dIBR, le contrle doit tre ralis dans les 30 jours qui suivent larrive des bovins. Il est recommand de prfrer un contrle entre 15 et 30 jours, particulirement si le transport des animaux ntait pas matris. Les animaux issus de cheptels non qualifis seront, quant eux, nouveau contrls (en analyses de mlange dans le cas dintroduction dun lot danimaux) dans les 60 jours suivant leur arrive dans le cheptel introducteur.

Ainsi, ce sont les mmes essais de diagnostic de lIBR qui servent la qualification comme aux contrles rglementaires, quil sagisse danalyses individuelles pour les contrles dintroduction ou danalyses de mlange pour les dpistages de troupeaux

Essais srologiques et gestion des animaux positifs au diagnostic de lIBR Quatre tests srologiques peuvent tre utiliss pour tablir le statut sanitaire dun bovin vis--vis de lIBR : la neutralisation virale, lELISA indirect et deux ELISA par comptition ciblant les anticorps dirigs contre soit la glycoprotine virale B (gB) soit la glycoprotine virale E (gE). Seuls les ELISA indirects sont agrs pour les essais en mlange (mlange de srums ou LGM). Les ELISA indirects et ELISA gB servent tous deux aux tests individuels. En France, les ELISA comptition gE, dont les performances sont moindres (confer ci-dessous), ne sont pas mis en uvre pour dfinir le statut dun animal. Bien que normaliss (AFNOR, 2010), les essais de neutralisation sont gnralement mis en uvre dans le cadre dexpertises complmentaires. Selon la rglementation (Arrt du 25 avril 2001), la seule ractivit en neutralisation virale suffit considrer un bovin comme atteint de lIBR. Toutefois, elle seule, la ngativit dun srum par ce test na pas suffisamment de valeur (valeur prdictive ngative) pour permettre de statuer sur lanimal. En prophylaxie, la positivit dun mlange de srum est vrifie par une analyse sur chaque srum ayant constitu le mlange (Figure 1). Les cheptels non ngatifs par des analyses sur LGM sont recontrls sur LGM ; si le rsultat est confirm, ils sont vrifis par des analyses sur srums (mlanges de srums suivis ventuellement danalyses individuelles). Les animaux non ngatifs doivent tre vaccins dans les deux mois qui suivent la notification du rsultat et cette vaccination doit tre entretenue par des rappels vaccinaux. En cheptel qualifi (Figure 1), la positivit dun LGM suspend la qualification dans lattente des rsultats dune seconde analyse sur LGM (dans les 3 mois maximum). Si le second rsultat sur LGM est ngatif, le cheptel est requalifi mais reste suivi pendant deux mois avec la ralisation de deux nouvelles analyses sur LGM. Si par contre, le second rsultat est de nouveau positif, une analyse srologique sur mlanges de srums est ralise dans un dlai maximum de trois mois. Les srums des mlanges positifs seront repris en analyses individuelles (ELISA indirect). Un srum individuel positif, issu dun animal qualifi (ou ayant dj t test ngatif dans le cadre dune dmarche de qualification), dans un contexte pidmiologique favorable, sera vrifi par un second test ELISA comptition gB afin damliorer la spcificit du diagnostic srologique (ACERSA, PR/IBR/03 et ACERSA, 2011). Trois interprtations diffrentes sont alors possibles : srum positif, srum ngatif ou srum divergent (Tableau 1).

Tableau 1 : Interprtation des analyses de srums individuels selon la procdure ACERSA PR/IBR/03. Rsultat ELISA indirect Rsultats ELISA comptition gB Positif Ngatif Douteux Positif srum positif srum divergent srum positif Ngatif srum divergent srum ngatif srum ngatif

Si plus de 1% de leffectif des bovins qualifis est positif, le cheptel est dqualifi. Si un seul animal ou moins de 1% de leffectif est positif, la qualification du cheptel est suspendue ; une seconde prise de sang est ralise sur les animaux positifs et les deux tests ELISA, indirect et gB, sont utiliss. Les animaux non ngatifs aux deux kits seront limins et le cheptel entier sera recontrl (au moins 3 mois aprs limination du dernier bovin positif si cest en analyses de mlange et au moins 1 mois si cest en analyses individuelles) pour recouvrir sa qualification.

Figure 1 : Synoptique des analyses conduites en prophylaxie et qualification, en cas de positivit danimaux.

Les animaux divergents ne peuvent entrainer eux seuls la dqualification dun cheptel. Toutefois, il est conseill de refaire des analyses dans un dlai dun mois au cas o il sagirait dun animal en cours de sroconversion.

Dans ce contexte des mesures de contrle de lIBR, le Laboratoire National de Rfrence (LNR-IBR) conduit des actions dappui scientifique et technique, dexpertise et de recherche.

Contrle des outils srologiques de diagnostic et des conditions de leur mise en application Officialis en 2009 par arrt ministriel (Arrt du 29 dcembre 2009), le LNRIBR sappuie sur une exprience de plus de 15 ans de travaux scientifiques sur cette maladie. LAnses (laboratoire de Lyon) a soutenu ds 1996 le diagnostic srologique de lIBR en mettant en place une procdure volontaire de contrle des trousses ELISA indirect (recherche des anticorps totaux dirigs contre le BoHV-1) et comptition (anticorps dirigs contres la protine virale gB). Le contrle des kits reposait galement sur llaboration dune collection de srums nationaux (srums de rfrence Ref46 pour les analyses individuelles, Ref46/10 pour les essais sur mlanges de srums, et lait franais de rfrence LFI/10) et internationaux (srums OIE EU1 [positif fort], EU2 [positif faible] et EU3 [ngatif en anticorps]). Le laboratoire de Sophia-Antipolis a repris ces travaux en 2007 avec la mise en place de la prophylaxie nationale. Le contrle des kits de diagnostic est rendu obligatoire afin de garantir leurs performances en dtectabilit, sensibilit, spcificit et rptabilit (Tableau 2). Chaque anne des kits ne satisfont pas ces exigences (Figure 2) et ils ne sont donc pas autoriss pour le diagnostic de lIBR en France. Particulirement, aucun kit gE actuellement disponible sur le march ne satisfait ces exigences notamment en terme de dtectabilit. Tableau 2 : Critres dagrment du LNR-IBR, en fonction des matrices, des kits ELISA indirect et ELISA par comptition Critres Dtectabilit1 Dtectabilit2 Relation dose/rponse Sensibilit Rptabilit Spcificit1 Spcificit Spcificit Mlange de srum Srum individuel EU1 et EU2 positifs Ref46/dilu au LFI dilu au 10me Ref46 positif 5 fois 10me positif 5 fois positif 8 fois sur sur 10 sur 10 10 Evolution de la positivit la ngativit et de faon cohrente des rsultats obtenus partir dune dilution de raison deux dun chantillon positif 5 chantillons positifs de rfrence trouvs positifs Coefficient de variation obtenu partir de 56 rptitions infrieur ou gale 12% EU3 ngatif 10 chantillons ngatifs de rfrence trouvs ngatifs 97 % partir de 99,3 % partir de 99% partir de 100 mlanges 1000 srums 100 laits de grand ngatifs ngatifs mlange ngatifs Lait de grand mlange

: essais sur srums de rfrence internationaux (OIE) : EU1 est un srum fort positifs, EU2 est faiblement positifs et EU3 est ngatifs. 2 : essais sur chantillons de rfrence franais : Ref46 est le srum national de rfrence faiblement positif ; LFI est le lait de rfrence franais positif.

Figure 2 : Rsultats des contrles de kits de diagnostic de lIBR, raliss par le LNR Le LNR vrifie aussi les conditions dusage de ces kits en organisant priodiquement des essais interlaboratoires daptitudes auprs du rseau de 85 laboratoires agrs pour le diagnostic sur srum et 25 sur le lait. Il est galement ouvert dautres participants sur le plan national et international. Les donnes de ces essais permettent aussi dapprcier la justesse et la fidlit des mthodes. Le LNR (accrdit pour les essais en immunosrologie selon la norme NF/EN/ISO 17025) ralise galement des contre-expertises la demande des laboratoires ou des gestionnaires de la prophylaxie comme de la qualification. Il complte les essais de recherche danticorps en ELISA par des essais de neutralisation virale et dveloppe de nouveaux outils pour renforcer encore son expertise (western blot, neutralisation virale croise, PCR).

Perspectives du diagnostic de lIBR Le diagnostic srologique de lIBR profite rgulirement de lavance des connaissances scientifiques et des dveloppements mthodologiques. Lobjectif vis est chaque fois damliorer la sensibilit tout en maintenant une spcificit leve des essais. Toutefois, lenjeu des prochaines volutions sera aussi de contribuer la reconnaissance, au plan europen, des mthodes de diagnostic mise en uvre dans le cadre du programme franais dradication.

Dans un contexte dradication de lIBR o la proportion et le nombre danimaux indemnes augmente chaque anne, les animaux nouvellement positifs devront faire lobjet dtudes plus approfondies afin dapporter des lments scientifiques et pidmiologiques pour statuer sur une exposition au BoHV-1 ou sur un manque de spcificit du diagnostic. Le LNR sintresse notamment aux interfrences des alpha-herpes virus (diffrents du BoHV-1) sur le diagnostic de lIBR. Ces recherches ont permis didentifier, pour la premire fois, lherpesvirus caprin de type 1 (CpHV-1) dans des cheptels caprins de France continentale. Les travaux se poursuivent afin dvaluer la prvalence de ce virus et les possibilits dchanges entre cheptels caprins et bovins. Les futurs axes de recherche devront aussi contribuer dvelopper des mthodes complmentaires aux diagnostics de routine : neutralisation virale croise, western blot, voire pour permettre plus aisment le diagnostic direct de linfection par PCR.

Rfrences 1- ACERSA, 2011. Evolution de la PR/IBR/03 prvoir pour 2011-2012. Brves n44. 2- ACERSA, CC/IBR/01. Cahier des charges techniques du systme national de qualification de cheptel en matire de rinotrachite infectieuse bovine. Version M du 29/01/2010. 3- ACERSA, PR/IBR/03. Analyses. Rv C du 16/04/07. 4- AFNOR, 2010. Recherche danticorps contre la rhinotrachite infectieuse bovine par la technique de neutralisation virale. NF U47-030. 5- Arrt du 29 dcembre 2009 dsignant les laboratoires nationaux de rfrence dans le domaine de la sant publique vtrinaire et phytosanitaire. AGRG0930196A. 6- Arrt du 27 novembre 2006 fixant des mesures de prophylaxie collective de la rhinotrachite infectieuse bovine (IBR). AGRG0602473A. 7- Arrt du 25 avril 2001 fixant les procds et critres dtablissement dun diagnostic pour la rhinotrachite infectieuse bovine vise larticle 285 du code rural. Journal officiel de la Rpublique franaise du 2 mai 2001. AGRG0001294A. 8- Dcision de la commission du 21 aot 2007 modifiant la dcision 2005/558/CE mettant en uvre la directive 64/432/CEE du Conseil en ce qui concerne des garanties additionnelles pour les changes intracommunautaires de bovins en rapport avec la rhinotrachite infectieuse bovine et lapprobation des programmes dradication prsents par certains Etats membres. 2007/584/CE.

9- Dcret n2001-375 du 25 avril 2001 modifiant le dcret n90-572 du 28 juin 1990 pris pour application du titre VI du livre III du code rural et reklatif aux vices rdhibitoires dans les ventes et changes danimaux domestiques. AGRG0001293D. 10-Memeteau S, Msi F, Dubois E, Bronner A. 2011. Bilan de la surveillance rglemente et facultative de la rhinotrachite infectieuse bovine (IBR) en 2010. Bulletin pidmiologique, sant animale et alimentation, sous presse. 11-Muylkens B., Thiry J., Kirten P., Schynts F., Thiry E. (2007) Bovine herpesvirus 1 infection and infectious bovine rhinotracheitis. Vet. Res. 38:181-209. 12-Norme internationale (2005). Exigence gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnages et dessai. NF EN ISO/CEI 17025. 13-Bronner A, Guerrier-Chatellet M-C. Languille J., Petit E., Duquesne V., Dubois E. (2010) La lutte contre la rhinotrachite infectieuse bovine (IBR) en France : un dispositif original. Prsentation, bilan et perspectives. Bulletin pidmiologique, sant animale et alimentation, n41.