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Les Outils et techniques immunologiques

-En biochimie, on utilise surtout des IgG (+ affinit) -On peut prparer des Ac polyclonaux (srum dun animal immunis) ou des Ac monoclonaux (technique des hybridomes). -on peut tre amen devoir purifier ces prparations (Protine G ou Protine A).

La spcificit (pas de reconnaissance croise avec dautres protines)

Rappels sur la raction antigne-anticorps et ses applications


La raction antigne - anticorps (Ag-Ac) est due l'interaction entre les pitopes de l' antigne et les paratopes de l'anticorps. Elle fait intervenir quatre types de liaisons non covalentes (des liaisons hydrognes, des liaisons lectrostatiques, des liaisons hydrophobes et les forces de Van der Waals). Les Ac constituent des sondes molculaires spcifiques vis vis de n'importe quelle substance antignique.

La raction Ag-Ac a deux grands types d'applications :

La dtection et le dosage des antignes (par des mthodes dont il faut vrifier la spcificit, la reproductibilit et la sensibilit).
La dtection et le titrage des anticorps (vis--vis d'un Ag ou d'un mlange d'Ag).

Interaction Antigne-Anticorps
Ac + Ag k1=constante de vitesse d'association k1 k2=constante de vitesse de dissociation ka= k1/k2 = constante d'association ou d'affinit (l/mol) Affinit: force par laquelle un ligand (pitope) entre en interaction avec un site de liaison (paratope). Ex : forte affinit : 1011 l.mol-1 faible affinit : 104 l.mol-1 Valence Ac: nombre de site de fixation de l'Ag, 1 IgG (bivalent), 1IgM (decavalent). Valence Ag: nombre de molcule Ac qui se fixe sur Ag saturation.
Avidit: force de liaison entre lAg (multivalent) et lAc (multivalent) plus proche de la ralit. (affinit, conformation Ag, valence) 3
k2

Ac-Ag

Mesure de l affinit: dtermination de Ka Dialyse lquilibre


Ka Ac + Ag Ac-Ag

[Ac-Ag]
Ka =

[Ac]x[Ag]

Ag marqu Membrane semi-permable radioactivement


Courbes de Scatchard
1a

Ac monoclonal Ac 1a plus forte affinit que 1b

srumpolyclonal #3 plus forte affinit que #1b

1b -Ka

Valence (site de fixation)


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Raction de prcipitation (pour les molcules)


Il faut que: -Ac soit bivalent

-Ag soit au moins bivalent ou multivalent

zone d'quivalence Prcipitation

2 types de prcipitation: *En milieu liquide (qualitatif)

*En milieu semi-solide (glos) (quantitatif et qualitatif):


a) Immunodiffusion radiale (Mthode de Mancini) *Mthode quantitative :mesure des diamtre

b) Immunodiffusion double (Mthode d'Ouchterlony) *Mthode qualitative

b) Immunodiffusion double (Mthode d'Ouchterlony)

Comparaison des pitopes d'Ag diffrents

c) Immuno-electrophorse

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Raction d'Agglutination (pour des cellules) Ac peuvent agglutiner des bactries, cellules (hmaties).
Ex: l'Hmagglutination : Globules rouges (GR) + Ac anti GR

Hmagglutination (rseau)

Dilution croissante des Ac anti Globules Rouges

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)


*Mthode trs sensible pour doser (Ag ou Ac) et titrer des Ac.

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ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

anti-espce du primaire

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LELISpot
But quantifier les cellules produisant la molcule recherche

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Le Western Blot (Immuno Blot)


Conditions dnaturantes et reductrices
SDS + agent rducteur de ponts dissulfures

HRP: Horseradish peroxidase

rvlation
Ac I+ AcII-Enz
HRP Ac II coupl une enzyme anti-Ac I (anti espce)

Ac I anti-Protine dintrt

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Peroxydase

Phosphatase

Peroxydase

Phosphatase

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Limmunoprcipitation (IP)

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Limmunoprcipitation dune ou plusieurs protines dintrt recherche de partenaires de la protine dintert

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Cytofluoromtrie en flux
(FACS :Fluorescence-activated cell sorting)

gate

Immuno-Histochimie Immuno-Fluorescence Immuno-Electromicroscopie

Les mthodes de fixation des tissus ou des cellules vont influer sur la structure des pitopes de lantigne, donc jouer sur la reconnaissance des anticorps.

Plusieurs mthodes de fixation et de dure devront tre tests pour que lanticorps puisse reconnatre lpitope.

Fixations de dure variable : Glutaraldhyde Formaldhyde Mthanol -20C Actone


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Immunohistochimie

Microscopie optique

Mouse monoclonal [H10E4C9F] to Mineralocorticoid Receptor

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Immunofluorescence

Microscopie fluorescence

Ac anti pericentrine

Ac anti tubuline

DAPI (marqueur ADN)

Immuno-Electroscopie

Microscopie lectronique (Or collodale ou Frritine)


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Microscopie lectronique transmission

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1-10-Fonctions antimicrobiennes des Ig


1) Neutralisation

Pathogne

anticorps

Agglutination: De multiples pathognes sont aggrgs par les molcules dAc

2) Activation de la voie classique du complment

1er composant du

-LAc se fixe sur le pathogne -Fixation du 1er lment dun rseau complexe de protines sriques (le complment) -Activation de la cascade du complment

complment

Pathogne quelconque

Pore

-Formation dun pore et lyse du pathogne

Lyse mdie par le complment de la bactrie E. coli.

3) Opsonisation

=aide la phagocytose

-Macrophage reconnait les parties Fc des Ac par rcepteurs Fc (RFc), activation de la phagocytose.

Fc

Rcepteurs au Fc

Opsonisation

Macrophage
Principalement IgG et rcepteur RFc.
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3) Lyse ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)