Chromatograph I e

ère
Cours d’analyses physico-chimique des denrées alimentaires II, GPEE, 1 année. Préparé par Pr. R. SALGHI, ENSA Agadir.
Introduction
ANALYSES PHYSICOCHIMIQUES II
D finition
Principe g n ral
Ph nom nes physiques
CHROMATOGRAPHIE exploit s en
chromatographie
Modes de
chromatographie
INTRODUCTION
Le nom de chromatographie dérive du mot grec khrôma qui signifie couleur, parce que le premier
scientifique à utiliser cette technique, le botaniste russe Tswett, sépara en 1903 les pigments colorés d’une
plante verte en filtrant un extrait de celle-ci sur une colonne de verre remplie de craie (CaCO3) finement
pulvérisée. Ce fut la première application de la chromatographie d’adsorption sur colonne.
Tandis que l’on perfectionnait la méthode primitive de chromatographie d’adsorption, d’autres chercheurs
s’appliquaient à découvrir de nouveaux procédés chromatographiques basés sur des principes physiques
différents. L’avènement des méthodes modernes de détection a également contribué à l’éclosion de
plusieurs modes de chromatographie différents. Actuellement, certains types de chromatographe
permettent la détection de quantités aussi infimes que des parties par billion (ppb) de composés. La
découverte des principaux modes de chromatographie apparaît dans la liste suivante par ordre
chronologique :
- la chromatographie sur couche mince (CCM) (1938). (TLC : Thin Layer Chromatography)
- la chromatographie sur papier (1944).
- la chromatographie en phase gazeuse (CPG) (1952). (GC : Gas Chromatography)
- la chromatographie sur gel (1959).
- la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) (1967). (HPLC : High Pressure Liquid
Chromatography)
DÉFINITION
La chromatographie est une technique de séparation des constituants d’un mélange, dans le but
d’identifier ou de doser certains constituants du mélange.
PRINCIPE GÉNÉRAL
DE LA CHROMATOGRAPHIE
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ère
Quel que soit le genre de chromatographie effectué, la séparation des composés d’un mélange est basée
sur la distribution différente de ces composés entre une phase stationnaire et une phase mobile. Les
composés seront séparés uniquement si certains d’entre eux sont plus fortement retenus par la phase
stationnaire, pendant que les autres se déplacent plus rapidement au sein de la phase mobile.
Dans une chromatographie, les petites différences dans le comportement de chaque composé d’un
mélange au sein des phases stationnaire et mobile sont multipliées plusieurs milliers de fois, ce qui rend la
séparation possible.
- Tous les composés d’un mélange se déplacent à la même vitesse dans la phase mobile.
- Les temps de rétention des composés sur la phase stationnaire doivent être différents pour que la
séparation se fasse.
PHÉNOMÈNES PHYSIQUES
EXPLOITÉS EN CHROMATOGRAPHIE
Il existe en chromatographie plusieurs phénomènes physiques responsables de la rétention plus ou moins

forte des composés sur la phase stationnaire. Les deux plus exploités sont les phénomènes d’adsorption et
de partition.
Phénomène d’adsorption
Le phénomène d’adsorption est essentiellement un phénomène de surface par lequel les composés sont
attirés sur les sites actifs de la phase stationnaire par des liaisons hydrogènes et électrostatiques. La phase
stationnaire est un matériau solide en forme de petits granules de différentes grosseurs; les plus utilisées
sont le gel de silice, l’alumine et la cellulose en poudre.
Influence de la polarité des composés
En chromatographie d’adsorption, la capacité d’adsorption des composés sur la phase stationnaire est
en relation directe avec leur polarité. Plus un composé est polaire, plus fortement il sera adsorbé
sur les sites actifs de la phase stationnaire et moins vite il se déplacera.
Liste des principaux groupements fonctionnels

par ordre croissant de polarité
fonctions groupements fonctionnels
Alcane R–H
Alcène R – CH = CH – R′
Dérivé halogéné R – X (X = F, Cl, Br, l)
Éther R – O – R′
Ester R–C=O
⏐
O – R′
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ère
Cétone R–C=O
⏐
R′
Aldéhyde R–C=O
⏐
H
Amide R–C=O
⏐
NH2
Amine R – NH2
Alcool R – OH
Acide R–C=O
⏐
OH
Influence de la polarité de la phase mobile
À l’exception de la chromatographie en phase gazeuse, la phase mobile, appelée également éluant,

est un solvant ou un mélange de plusieurs solvants miscibles, dont le rôle est de déplacer les
composés du mélange vers le haut de la plaque en chromatographie sur couche mince ou vers la sortie
de la colonne en chromatographie sur colonne.
Lorsqu’on exploite le phénomène d’adsorption en chromatographie, la polarité de l’éluant a une

influence considérable sur la vitesse de déplacement des composés d’un mélange. Plus l’éluant est
polaire, plus les composés se déplacent rapidement. En effet, l’éluant est également adsorbé sur
les sites actifs de la phase stationnaire et entre en compétition avec les composés du mélange.
Liste des solvants par ordre croissant de leur polarité
Hexane et éther de pétrole

Tétrachlorure de carbone
Benzène
Dichlorométhane
Chloroforme
Éther éthylique
Acétate d’éthyl
Acétone
Propanol
Éthanol
Méthanol
Eau
Acide acétique
Phénomène de partition
Dans une chromatographie de partition, la phase stationnaire est non pas un solide, mais un liquide fixé
physiquement ou greffé chimiquement sur un support solide. Les composés d’un mélange vont donc se
solubiliser dans la phase liquide stationnaire, au lieu de s’y adsorber. C’est la solubilité différente des
22
ère
composés dans la phase stationnaire et dans la phase mobile qui rend la séparation chromatographique
possible.
Influence de la solubilité des composés
- Dans la phase stationnaire :

Plus un composé est soluble dans la phase liquide stationnaire, moins vite il se déplacera.
- Dans la phase mobile :

Plus un composé est soluble dans la phase mobile, plus vite il se déplacera.
MODES DE CHROMATOGRAPHIE
Dépendant du système chromatographique utilisé, on distingue trois modes de chromatographie : la

chromatographie sur papier, la chromatographie sur couche mince et la chromatographie sur colonne. À
cause de l’appareillage spécialisé, la chromatographie sur colonne se subdivise également en quatre
catégories, soit la chromatographie dite traditionnelle sur colonne, la chromatographie en phase gazeuse
(CPG), la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et la chromatographie sur gel.
Chromatographie sur couche mince
Bien que découverte en 1938, ce n’est qu’en 1958 que fut popularisée la chromatographie sur couche
mince, telle que nous la connaissons actuellement. Cette technique a rapidement supplanté la
chromatographie sur papier, car elle est plus rapide et est utilisée autant pour les composés polaires que
non polaires.
Principe de la chromatographie sur couche mince
Dépendant du choix des phases stationnaire et mobile, il est possible de réaliser sur couche mince des
chromatographies en exploitant les phénomènes d’adsorption, de partition ou d’échange d’ions.
Appareillage
L’appareillage utilisé pour la chromatographie sur couche mince est relativement simple, étant
composé d’une plaque et d’une cuve rectangulaire pour l’élution. On peut également utiliser un
simple bocal de verre pour les couches minces plus petites.
Les plaques peuvent être préparées en répandant à l’aide d’un étaleur une mince couche uniforme de
la phase stationnaire sur une plaque de verre, dont les dimensions varient de 2,5 × 7 cm à 20 × 20 cm.
On retrouve cependant dans le commerce des plaques prêtes à l’usage avec la phase stationnaire fixée
sur une feuille en plastique ou en aluminium. Ces dernières ont l’avantage d’être faciles à entreposer
et découpables en bandes selon les besoins de l’expérimentateur. Les phases stationnaires les plus
utilisées en chromatographie sur couche mince sont le gel de silice, l’alumine et la cellulose en
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ère
poudre. La plupart des plaques commerciales contiennent un indicateur de fluorescence qui permet
la visualisation des taches à la lumière ultraviolette.
Technique expérimentale
Les principales étapes d’une chromatographie sur couche mince sont :
a) Préparation de la plaque (activation par chauffage à l’étuve)

b) Déposition des échantillons inconnus et des standards
c) Préparation de l’éluant et de la cuve
d) Élution de la plaque
e) Séchage de la plaque
f) Révélation des taches (lampe U.V., iode ou réactifs chimiques spécifiques)
g) Calcul des Rf et interprétation des résultats.
Résultats et interprétation
Dans une chromatographie sur couche mince, les composés apparaissent sous forme de taches rondes
ou ovales. On peut obtenir parfois des traînées si l’échantillon déposé était trop concentré. Pour une
phase stationnaire et une phase mobile données, chaque composé est caractérisé par son Rf :
Rf = distance parcourue par le composé

distance parcourue par l’éluant
front d’éluant
centre de la tache
niveau de déposition
La distance parcourue par le composé est calculée à partir du niveau de déposition jusqu’au centre de
la tache, tandis que la distance parcourue par l’éluant est calculée à partir du niveau de déposition de
l’échantillon jusqu’au front de l’éluant, marqué à la fin de l’élution. Le Rf est un nombre sans unités
qui varie entre 0 et 1; il est rapporté à deux décimales près (Ex. : Rf = 0,62).
24
ère
Exercice
À l’aide d’une règle, calculez le Rf du mélange suivant de deux composés et des deux standards
déposés sur la même couche mince.
STD 1 : Rf =
STD 2 : Rf =
Mélange :
tache 1 : Rf =
tache 2 : Rf =
STD 1 Mélange STD 2
Le calcul des Rf sert à l’analyse qualitative, c’est-à-dire à l’identification des composés dans un
mélange inconnu, par comparaison avec les Rf de standards soupçonnés dans le mélange inconnu.
On tient compte également de la couleur des taches pour confirmer l’identité des inconnus. De plus,
la grosseur des taches nous donne une bonne idée des proportions relatives des constituants dans le
mélange.
Lorsque les inconnus et les standards ont été déposés sur le support à des concentrations à peu près
identiques, il est relativement facile d’identifier les composantes d’un mélange inconnu. Cependant,
lorsque les échantillons ont été déposés à des concentrations différentes ou à des concentrations trop
élevées (taches accompagnées de traînées), il est possible que l’identification de certains inconnus
devienne problématique.
Lorsqu’il y a un doute raisonnable sur l’identité d’un composé inconnu (Rf légèrement différent), on
utilise la technique de l’enrichissement du mélange inconnu. Pour ce faire, on ajoute au mélange
inconnu une petite quantité du standard soupçonné dans ce mélange et on refait la chromatographie
du mélange enrichi. On obtiendra, comme le montre l’exemple suivant, l’une des deux possibilités
suivantes :
a) Si on obtient une seule tache un peu plus grosse que celle du mélange inconnu original, on peut
conclure que le mélange inconnu contenait effectivement le standard ajouté.
b) Si on obtient deux taches très rapprochées dans le mélange enrichi, il faudra conclure que le
composé dans le mélange inconnu original n’est pas le standard ajouté, mais plutôt un autre
composé qui a un Rf semblable au standard ajouté.
25
ère
STD Mélange STD Mélange STD Mélange

inconnu enrichi (a) enrichi (b)
Problème
Prédiction de résultats
Le sucre inverti est un sirop commercial fréquemment utilisé dans l’industrie alimentaire; sa
teneur en sucres est d’environ 80 %. Il est fabriqué par l’hydrolyse acide du sucrose, un
disaccharide qui libère par hydrolyse deux monosaccharides en quantité égale, soit le D-glucose
et le D-fructose.
H+
sucrose + H2O D-glucose + D-fructose
Vous travaillez dans une industrie alimentaire qui utilise régulièrement du sucre inverti comme
matière première. Selon l’étiquette, la compagnie qui vous vend ce sirop garantit que le sirop est
de première qualité, c’est-à-dire qu’il contient, sur une base sèche, au moins 95 % de sucre inverti
et au plus 5 % de sucrose non hydrolysé.
Pour vérifier l’authenticité de cette matière première, vous choisissez la technique de

chromatographie sur couche mince. Vous avez trouvé dans la littérature un éluant qui sépare
convenablement les trois sucres, lorsqu’on utilise le gel de silice comme phase stationnaire. On
rapporte des Rf de 0,30 pour le D-fructose, 0,45 pour le D-glucose et 0,65 pour le sucrose. De
plus, vous possédez dans le laboratoire des échantillons purs de ces trois sucres.
a) Montrez, en dessinant un chromatogramme, les résultats normalement attendus, en supposant

que le sirop que vous avez acheté est conforme aux spécifications inscrites sur l’étiquette.
b) Montrez, en dessinant un chromatogramme, les résultats normalement attendus, en supposant

que le sirop que vous avez acheté est un autre sirop de sucrose, c’est-à-dire qu’il contient, sur
une base sèche, 70 % de sucre inverti et 30 % de sucrose non hydrolysé.
Seuil de détection
Le seuil de détection d’un composé est la plus petite quantité de composé détectable dans un système
chromatographique donné. Le seuil de détection est influencé principalement par le type de
révélation des taches utilisé (lampe ultraviolette, iode, réactifs chimiques spécifiques) et est important
à connaître, lorsqu’on recherche la présence d’un composé dans un aliment présent à l’état de trace.
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ère
Chromatographie sur colonne
Alors que la chromatographie sur couche mince sert essentiellement à l’analyse qualitative, la
chromatographie sur colonne est utilisée non seulement pour identifier les composantes de mélanges
inconnus, mais également pour les doser, c’est-à-dire pour l’analyse quantitative.
Les genres de chromatographie sur colonne sont variés et dépendent de l’appareillage utilisé. Les deux
principaux sont :
- la chromatographie en phase gazeuse (CPG)

- la chromatographie liquide à haute pression (HPLC)
Chromatographie en phase gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse est rapidement devenue l’une des meilleures méthodes analytiques
dans le domaine scientifique, autant en recherche que dans le domaine industriel (industrie
pharmaceutique, agriculture, environnement, etc.) Cette technique fut découverte en 1952 par James et
Martin et a fait des progrès vertigineux, particulièrement grâce à la découverte des détecteurs
ultrasensibles. Le seuil de détection de la chromatographie en phase gazeuse, de l’ordre des parties par
billions, n’a pas encore été égalé. C’est également le seul type de chromatographie qui utilise un gaz
comme phase mobile, ce qui nécessite un appareil spécial, appelé communément le chromatographe à
gaz.
Dépendant de la phase stationnaire, il est possible d’exploiter les phénomènes d’adsorption ou de partition
en chromatographie en phase gazeuse.
Principe de la chromatographie en phase gazeuse
Le principe de la séparation chromatographique est illustré sur le schéma suivant. Le mélange de

composés est introduit à l’aide d’une seringue de façon à ce qu’il entre dans la colonne sous forme
vapeur. La phase mobile est un gaz chimiquement inerte, appelé gaz vecteur. Celui-ci entraîne avec
lui le mélange de composés à travers la colonne qui contient une phase stationnaire. Les composés du
mélange traversent la colonne à des vitesses différentes. Lorsqu’ils arrivent à la sortie de la colonne,
ils sont détectés par un détecteur qui transmet un signal électrique à un enregistreur. Les résultats
apparaissent sur le chromatogramme sous forme de pics.
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ère
Échantillon Colonne Détecteur

(A + B)
t0 injection
Chromatogramme
t1 B+A
t2 B A
Gaz vecteur
t3
A
B A
t4
B
t5
B
B
Séparation d’un mélange de deux composés en CPG
Appareillage et matériaux
Quel que soit le chromatographe à gaz, on retrouve toujours les principales composantes suivantes :
sortie
chambre four à colonne détecteur

d’injection
gaz vecteur
enregistreur
Chromatographe à gaz
Phase mobile
La phase mobile entraînant les composés dans la colonne est un gaz de préférence chimiquement
inerte. Les principaux sont l’hélium, l’argon, l’azote et le dioxyde de carbone. Ils sont livrés dans
28
ère
des bonbonnes surmontées d’un régulateur de pression. Ces gaz doivent être de pureté analytique, car
les impuretés sont responsables des bruits de fond sur le chromatogramme. Le choix du gaz vecteur
dépend principalement du type de détecteur de l’appareil.
Chambre d’injection
La chambre d’injection est un compartiment placé entre la bonbonne du gaz vecteur et le four
principal contenant la colonne. Elle est munie d’éléments pouvant chauffer le compartiment à des
températures très élevées.
L’injection des échantillons se fait à l’aide d’une seringue graduée en microlitres qui est introduite
dans la chambre à travers une rondelle en caoutchouc. À cause de la température élevée dans le
compartiment, les composés passent instantanément à l’état vapeur et sont poussés par le gaz vecteur
vers la colonne chromatographique.
Four principal
Le four principal est un compartiment, placé entre la chambre d’injection et le détecteur, qui contient
la colonne chromatographique. Il est muni d’éléments chauffants pouvant contrôler la température du
four avec une très grande précision. Des contrôles permettent également de travailler à température
programmée pour la séparation de mélanges de composés ayant des capacités de rétention très
différentes sur la phase stationnaire.
Exemples de graphique :
T (°C) T (°C)
120 120
80
t (min) t (min)
12 2 10 14
Température isotherme Température programmée
Colonnes
Les colonnes sont des tubes de 4 à 6 mm de diamètre, en acier inoxydable, en cuivre ou en verre.
Leur longueur varie habituellement de 1 à 4 mètres. Elles sont repliées en U ou en hélice pour en
diminuer l’encombrement dans la four.
29
ère
Le remplissage de la colonne est fait d’un matériau solide pour la chromatographie par adsorption ou
d’un liquide fixé sur un support solide pour la chromatographie par partition. Des compagnies se
spécialisent dans la vente de colonnes déjà remplies de la phase stationnaire et il suffit de consulter
les catalogues de compagnies pour commander la colonne appropriée à nos besoins. On retrouve
dans ces catalogues la température maximale d’utilisation de la phase stationnaire, ainsi que ses
principaux champs d’application.
Détecteurs
Le détecteur du chromatographe à gaz est situé dans un compartiment immédiatement à la sortie de la

colonne. Comme la chambre d’injection, la chambre à détection peut être chauffée à des
températures très élevées. Son rôle est de détecter les composés à la sortie de la colonne et de
transmettre l’information sous forme d’un signal électrique à l’enregistreur. Comme les pulsions
électriques sont très faibles, un amplificateur est branché au détecteur pour multiplier ou diviser
l’intensité des signaux d’un certain facteur, généralement des multiples de 10 (bouton RANGE ou
ATTENUATOR sur le chromatographe).
Un détecteur est caractérisé principalement par sa sensibilité et sa capacité de donner une réponse
proportionnelle à la concentration du composé détecté :
SENSIBILITÉ – La sensibilité d’un détecteur est sa capacité de réagir à la présence d’un composé.
Plus un détecteur détecte de petites quantités de substance, plus il est sensible. La plus petite quantité
de substance qu’un détecteur peut détecter se nomme le seuil de détection.
LINÉARITÉ DE LA RÉPONSE – Un détecteur doit émettre un signal proportionnel à la concentration

de la substance détectée, et cela sur une gamme de concentration la plus élevée possible. La courbe
d’étalonnage d’un composé sert à déterminer une zone de concentration où la réponse est linéaire.
Les principaux détecteurs de chromatographe à gaz sont le détecteur à ionisation de flamme et le

détecteur à conductivité thermique.
• Détecteur à ionisation de flamme (FID)

C’est un détecteur universel, parce qu’il est sensible à tous les composés combustibles, donc
à presque tous les composés organiques. Il émet également une réponse linéaire sur une
gamme de concentration très élevée. Il nécessite cependant l’emploi, en plus du gaz vecteur,
de deux autres gaz dont l’hydrogène, avec lequel il faut prendre des précautions particulières.
Le gaz carburant (O2) est une bonbonne d’air comprimé.
Le principe de la détection est le suivant : lorsque le gaz vecteur circule dans le détecteur,
l’hydrogène brûlé produit un courant ionique constant (ligne de base sur l’enregistreur).
Lorsqu’un composé se présente au détecteur, il est brûlé mais le courant ionique produit est
supérieur à celui de l’hydrogène pur. Cette différence de courant, normalement
proportionnelle à la quantité de composé, est transmise à l’enregistreur sous forme de pic.
30
ère
• Détecteur à conductivité thermique

C’est un détecteur très répandu, mais qui est moins sensible que le détecteur à ionisation de
flamme. On l’utilise surtout en analyse qualitative pour l’identification des composés. Pour
certains composés qui ont une conductivité thermique semblable à celle du gaz vecteur, la
réponse cesse d’être linéaire.
Le détecteur mesure la conductivité thermique des composés qui sortent de la colonne et la
convertit en signal électrique. Comme la conductivité thermique est sensible aux variations
de température et de débit de gaz vecteur, on utilise toujours deux colonnes, dont l’une sert à
la séparation du mélange inconnu et l’autre, dans laquelle on fait passer uniquement le gaz
vecteur, sert à compenser les variations de débit et de température, particulièrement lorsqu’on
travaille à température programmée.
Enregistreurs
Relié au chromatographe, l’enregistreur reçoit les impulsions électriques venant du détecteur et les
transmet sur un papier déroulant à une vitesse donnée sous forme de pics. On obtient un
chromatogramme et c’est sur celui-ci que sont données toutes les informations nécessaires à
l’analyse qualitative et quantitative. Actuellement, l’informatique tend à supplanter l’enregistreur,
grâce aux logiciels d’applications (ex. : Millenium). Ces logiciels sont capables, non seulement de
conserver les signaux du détecteur dans un fichier de données, mais également d’en faire l’analyse
qualitative (temps de rétention) et quantitative (calcul de surface de pic, courbe d’étalonnage, etc.).
Les principales étapes d’une analyse en chromatographie en phase gazeuse sont :
a) Préparation des échantillons
Comme les composés injectés dans un chromatographe à gaz doivent être volatils dans les
conditions expérimentales choisies, très peu d’aliments peuvent être injectés directement dans
l’appareil. Les composés qu’on veut analyser doivent la plupart du temps être soumis à une
purification, afin d’éliminer de l’échantillon les composés non volatils (minéraux, protéines, etc.)
qui détérioreraient rapidement la colonne chromatographique, si injectés. La technique
privilégiée pour une purification préliminaire est l’extraction avec un solvant organique, comme
le dichlorométhane.
Les composés liquides ou solides à bas point de fusion sont habituellement injectés en solution
dans un solvant qui ne posera pas d’interférence avec les composés sur le chromatogramme (le
pic du solvant sort habituellement le premier). Quant aux solides à très faible volatilité, on utilise
la technique de formation de dérivés, qui consiste à transformer le composé en un dérivé
chimique dont la volatilité est plus grande. La transformation des acides gras en leurs esters
méthylés en est un exemple classique :
cat
R – COOH + CH3 – OH R – COO – CH3
Acides gras Esters méthylés
(peu volatils) (très volatils)
31
ère
b) Ajustement des paramètres (débit de gaz, températures, etc.) pour la séparation optimale des
composés du mélange inconnu.
c) Injection des échantillons inconnus et des standards.
d) Calculs pour l’analyse qualitative.
e) Calculs pour l’analyse quantitative.
f) Interprétation des résultats.
En chromatographie en phase gazeuse, les résultats apparaissent sur le chromatogramme sous forme
de pics, dont l’allure générale peut être représentée par l’exemple suivant :
C16
solvant
C14
C6
∆C18
C10
C12
C8
C18
Analyse des esters méthyliques du beurre (DEGS à 180 °C)
Observations importantes :
32
ère
Analyse qualitative
L’analyse qualitative consiste à identifier un ou plusieurs composés du mélange inconnu injecté.

Pour ce faire, il faut posséder des échantillons standards des composés soupçonnés dans le mélange.
Pour un ensemble de paramètres donné (débit de gaz vecteur, température du four, etc.), chaque
composé est caractérisé par son temps de rétention tr :
tr = distance parcourue par le composé

vitesse de déroulement du papier
Le temps de rétention d’un composé représente le temps que prend le composé pour traverser la
colonne chromatographique. La distance parcourue par le composé se calcule à partir du moment de
l’injection jusqu’à son apparition au détecteur, mesurée au sommet du pic sur le chromatogramme.
Exercice
À l’aide d’une règle, calculez le temps de rétention, en minutes-secondes, des deux pics sur le
chromatogramme suivant, sachant que la vitesse de déroulement du papier était de 2 cm/min.
injection
Lorsqu’on veut identifier un pic sur le chromatogramme, on injecte le standard soupçonné dans les
mêmes conditions expérimentales que le mélange inconnu. Si le temps de rétention du standard
correspond à ± 5 % au temps de rétention d’un pic du mélange, on peut conclure que c’est le même
composé.
En cas de doute, on utilise la technique de l’enrichissement du mélange inconnu. Pour ce faire, on

ajoute au mélange inconnu une petite quantité du standard soupçonné et on injecte le mélange enrichi.
Le chromatogramme du mélange enrichi, comme le montre l’exemple suivant, peut se présenter selon
l’une des deux possibilités suivantes :
a) Si on obtient un seul pic un peu plus haut que le pic dans le mélange inconnu original, on peut
conclure que le composé dans le mélange inconnu correspond au standard ajouté au mélange
enrichi.
b) Si on obtient deux pics très rapprochés dans le mélange enrichi, on doit conclure que le
composé dans le mélange inconnu n’est pas le standard ajouté au mélange enrichi, mais un autre
composé qui a un temps de rétention semblable au standard utilisé.
33
ère
Mélange inconnu
injection
Standard
injection
Mélange inconnu
(possibilité a)
injection
Mélange inconnu
(possibilité b)
injection
Problème
On injecte un mélange de composés inconnus et on obtient le chromatogramme A. On injecte

ensuite dans les mêmes conditions expérimentales un standard qu’on soupçonne dans le mélange
inconnu et on obtient le chromatogramme B.
34
ère
A. Mélange inconnu
injection
B. Standard
injection
On prépare un mélange en ajoutant un peu du standard au mélange inconnu et on injecte le

mélange enrichi dans les mêmes conditions. Quelle conclusion faudrait-il tirer, selon que le
chromatogramme du mélange enrichi obtenu est C, D ou E?
C. Mélange enrichi
injection
D. Mélange enrichi
injection
E. Mélange enrichi
injection
35
ère
Analyse quantitative
L’analyse quantitative consiste à doser, c’est-à-dire déterminer la concentration d’un ou de plusieurs

composés du mélange inconnu, une fois que ces composés ont été identifiés. La méthode repose
essentiellement sur la détermination de la surface (parfois la hauteur) des pics. Ensuite, selon les
besoins de l’expérimentateur, on pourra soit déterminer les pourcentages relatifs des constituants du
mélange, soit déterminer la concentration d’un composé du mélange par la méthode de la courbe
d’étalonnage ou par la méthode du standard interne.
• Détermination de la surface des pics

La surface des pics d’un chromatogramme peut être déterminée selon l’une des méthodes
suivantes :
A. Méthode par triangulation
La méthode par triangulation est utilisée lorsqu’on utilise un enregistreur à plume qui ne
possède pas d’intégrateur électronique. C’est une méthode qui donne des résultats exacts si
les pics sont symétriques. On trace sur le pic deux tangentes qui croisent la ligne de base, de
façon à former dans le pic un triangle isocèle. On calcule ensuite la surface du pic par la
formule suivante :
SA = B × H =
2
H
où : SA = surface du pic A
B = base du triangle B
H = hauteur du triangle
Exercice
À l’aide d’une règle, calculez la surface réelle du pic précédent en cm2.
B. Méthode par intégration électronique
La méthode par intégration électronique est utilisée lorsqu’on possède un enregistreur (ou un
logiciel d’application) muni d’un intégrateur électronique. Le chromatogramme est subdivisé
en un nombre de points équidistants sur l’axe des X et sur l’axe des Y et l’intégrateur
additionne le nombre de points situés à l’intérieur de la surface du pic à partir de la ligne de
base. La somme des points du pic, qui est proportionnelle à sa grosseur, est gardée en
mémoire pour les calculs ultérieurs de concentration.
Exemple : le pic A contient 2854 points, le pic B contient 677 points, etc.
36
ère
• Détermination des pourcentages relatifs des constituants d’un mélange

La détermination des pourcentages relatifs des constituants d’un mélange peut être utilisée à
certaines fins, par exemple :
- confirmer l’identité d’un aliment par sa composition en certains constituants.
- déterminer la pureté d’un aliment, d’un constituant alimentaire isolé ou d’un produit
chimique en général.
- déterminer la teneur d’un constituant particulier dans un aliment.
La méthode consiste à déterminer la surface de tous les pics du mélanges (sauf le pic du
solvant si le mélange a été mis en solution), puis on utilise l’une des deux formules suivantes,
selon qu’on a utilisé la méthode par triangulation ou la méthode par intégration électronique :
%A = SA × 100 %B = SB × 100 etc. S = Surface

Stotal Stotal
%A = NA × 100 %B = NB × 100 etc. N = Nombre de points électroniques

Ntotal Ntotal
Exercice
On injecte un mélange inconnu de 2 composés dissous dans un solvant. La surface des

pics, déterminée par la méthode par triangulation est la suivante :
pic A : 102,54 cm2 pic B : 4,68 cm2 pic C : 3,45 cm2
Calculez, à une décimale près, les pourcentages relatifs des composés dans le mélange
inconnu.
• Détermination de la concentration d’un composé dans le mélange

Il arrive fréquemment que l’expérimentateur soit intéressé à connaître uniquement la
concentration d’un seul composé du mélange inconnu, même si celui-ci en contient
plusieurs. La concentration d’un composé dans un mélange inconnu peut être déterminée de
deux façons différentes, soit par la méthode de la courbe d’étalonnage ou par la méthode du
standard interne.
A. Méthode de la courbe d’étalonnage
37
ère
Un bon détecteur donne une réponse proportionnelle à la concentration du composé détecté,

et ce sur une gamme de concentration la plus élevée possible. La méthode de la courbe
d’étalonnage est utilisée pour déterminer la concentration d’un composé dans une zone de
concentration où la relation entre la concentration et le signal du détecteur est linéaire.
Pour utiliser la méthode de la courbe d’étalonnage, on prépare une série de solutions

standards du composé et on injecte dans le chromatographe des volumes identiques de ces
solutions. On trace ensuite le graphique de la surface (parfois la hauteur) des pics des
standards en fonction de la concentration des standards. On obtient une courbe d’étalonnage
du composé en traçant la droite la plus probable.
Surface des pics (ou hauteur)
[STD]
On injecte ensuite le même volume du mélange inconnu, puis on détermine la surface du pic
du composé; la concentration du composé dans le mélange inconnu est déterminée sur la
partie droite de la courbe d’étalonnage, soit par la méthode graphique, soit en utilisant
l’équation de droite.
Problème
On injecte dans un chromatographe à gaz 10 µl d’un extrait d’un aliment, dans le but de
détecter la présence d’un pesticide et de le doser, si présent. L’analyse qualitative du
chromatogramme confirme la présence du pesticide (pic B) et l’intégrateur électronique
donne une surface correspondant à 1833 points pour ce pic.
On prépare une série de solutions standards du pesticide contenant 2, 4, 6, 8 et 10 µg/ml

du pesticide. On injecte 10 µl de chacune de ces solutions standards dans les mêmes
conditions expérimentales. L’intégrateur fournit les résultats suivants :
STD 2 µg/ml : 508 points
38
ère

Tracez sur le papier graphique la courbe d’étalonnage du pesticide et déterminez la

concentration du pesticide dans l’extrait de l’aliment en utilisant l’équation de la droite.
Courbe d’étalonnage du pesticide
B. Méthode du standard interne
Un standard interne est un composé organique ajouté à un mélange inconnu, à une

concentration connue. On l’utilise comme alternative à la méthode de la courbe d’étalonnage
pour déterminer la concentration d’un ou de plusieurs composés dans un mélange inconnu.
Elle est particulièrement avantageuse lorsqu’on veut doser plus d’un composé dans le
mélange, puisque c’est le même standard interne qui sert au dosage de tous les composés du
mélange. Un autre avantage est que le volume d’échantillon injecté n’a pas d’importance,
contrairement à la méthode de la courbe d’étalonnage. Cependant, deux conditions doivent
être respectées pour pouvoir l’utiliser :
- Le composé choisi comme standard interne doit être absent du mélange inconnu, car s’il
y est, sa concentration deviendra inconnue.
39
ère
- Le pic du standard interne doit être bien séparé des autres pics du mélange inconnu, sinon
le calcul de sa surface sera inexact.
Il faut en premier lieu injecter un mélange du standard interne et du composé analysé à

concentration connue pour déterminer le facteur de réponse F du standard interne. le facteur
de réponse est le rapport de la surface S du pic du standard interne sur celle du pic du
composé analysé, à concentration égale. Cette injection est importante, car le détecteur n’a
pas la même sensibilité pour tous les composés détectés.
F = S (std interne)/concentration
S (composé)/concentration
N.B. Le facteur de réponse F varie habituellement entre 0,8 et 1,2.
On injecte ensuite le mélange inconnu enrichi d’une quantité connue du standard interne, puis
on calcule la concentration C du composé de la façon suivante :
C (composé) = C (std interne)

S (composé) = S (std interne)
C (composé) = C (std interne) × S (composé) ×F

S (std interne)
40
ère
Problème
Le dosage d’un composé X dans un mélange inconnu par chromatographie en phase

gazeuse a été effectué par la méthode du standard interne. Le chromatogramme du
mélange inconnu apparaît ci-dessous :
Mélange inconnu x
↓
On injecte un mélange constitué du standard interne à une concentration de 5 µg/100 ml

et du composé X à une concentration de 4 µg/100 ml. La valeur des surfaces apparaît sur
le chromatogramme :
Composé X + Std interne Std interne x

S = 750 pts S= 560 pts
On injecte ensuite le mélange inconnu enrichi avec le standard interne à une concentration
de 5 µg/100 ml. La valeur des surfaces apparaît sur le chromatogramme :
Mélange inconnu Std interne x

S = 752 pts S= 295 pts
+ Std interne
Calculez la concentration du composé X dans le mélange inconnu.
41
ère
Chromatographie liquide à haute pression (HPLC)
Mise au point vers 1967 par Huker et Hulsman, la chromatographie liquide à haute pression a rapidement
fait une concurrence presque déloyale à la chromatographie en phase gazeuse. En effet, alors que la
chromatographie en phase gazeuse ne s’applique qu’aux composés volatils, la chromatographie liquide à
haute pression n’est pas limitée par cette contrainte et peut séparer pratiquement tous les mélanges, peu
importe la volatilité des composés. Si la chromatographie en phase gazeuse existe encore aujourd’hui,
c’est à cause de son seuil de détection extrêmement bas que la chromatographie liquide à haute pression
n’arrive pas à rattraper.
Appareillage et matériaux
Comme pour la chromatographie en phase gazeuse, la chromatographie liquide à haute pression

s’effectue avec un appareil commercial, dont les principales composantes sont vendues en modules
séparés, ou incorporées dans le chromatographie, tel qu’illustré dans le schéma suivant :
pompe colonne détecteur
sortie
injecteur
solvant
enregistreur
Chromatographe HPLC
Phase mobile
La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants qui doit être de pureté analytique et filtré
pour éliminer les particules solides qui risqueraient d’endommager la pompe ou de bloquer la
colonne. Le filtre, en acier inoxydable d’une porosité de 2 µm, est placé à l’extrémité dans le
réservoir à solvant.
Principaux solvants en HPLC
phénomène solvants
Adsorption Hexane, méthanol, acétonitrile,
dichlorométhane, chloroforme
Partition Méthanol-eau, acétonitrile-eau
Échange d’ions Solution tampon (pH contrôlé)
Exclusion Tétrahydrofurane, toluène
42
ère
Pompe
Le rôle de la pompe en HPLC est de pousser l’éluant à travers la colonne à une pression élevée et à un
débit constant. Elle doit être inerte à la corrosion des solvants utilisés, offrir un bon choix de débits et
être conçue pour réduire les pulsations au minimum. Les pompes utilisées en HPLC sont des pompes
à piston, tel qu’illustré dans le schéma suivant :
Mobile phase
outlet
Seals
Motor
and
gearbox
Screw Solvent
driven chamber
piston
Mobile phase
inlet
Schéma d’une pompe en HPLC
Injecteur
Comme la pression dans le circuit

pompe-colonne est très élevée, on utilise LOAD INJECT
un moyen indirect pour introduire Sample Sample
l’échantillon à l’entrée de la colonne.
Celui-ci est d’abord introduit à l’aide
Loop Loop
d’une seringue dans un injecteur à
boucle externe, en position LOAD. On
injecte toujours un volume supérieur à
celui de la boucle, en prenant soin de ne
pas introduire de bulles d’air dans la
boucle. En tournant la valve en position
INJECT, seul le contenu de la boucle
est dirigé en tête de colonne. Cette Pump Column Pump Column
méthode d’injection a l’avantage de Schéma d’un injecteur à boucle externe
donner des résultats très reproductibles,
d’une injection à l’autre.
43
ère
Colonnes
La colonne est la partie la plus importante du système, puisque c’est à cet endroit que se fait la
séparation des composés. Les colonnes sont en acier inoxydable, de longueur variant de 5 à 25 cm
avec un diamètre interne de 4 à 4,6 mm. Ces colonnes sont remplies de la phase stationnaire, dont le
diamètre des particules varie de 3 à 10 µm. Des compagnies se spécialisent dans la vente de colonnes
pour HPLC.
Pour éviter l’obstruction et la détérioration des colonnes par les contaminants, on place
habituellement une colonne de garde plus petite et moins dispendieuse au sommet de la colonne
principale. Les colonnes de garde doivent être changées régulièrement.
Détecteurs
La détecteur est placé à la sortie de la colonne chromatographique et doit être capable de détecter les
composés qui sortent de la colonne. Le signal est converti en impulsion électrique qui est transmise à
l’enregistreur. Comme en chromatographie en phase gazeuse, les détecteurs utilisés en
chromatographie liquide à haute pression doivent posséder certaines qualités, dont les principales
sont :
- une grande sensibilité

- une réponse linéaire sur une gamme de concentration élevée
- une capacité à détecter le plus de produits possible.
Les principaux détecteurs utilisés en HPLC sont :
a) Détecteur à absorbance dans l’U.V. et le visible

Le détecteur mesure l’absorbance du liquide qui sort de la colonne, à une longueur d’onde
déterminée par le filtre utilisé. Son principal inconvénient est qu’il ne détecte que les composés
qui ont une absorbance appréciable à la longueur utilisée.
b) Détecteur à indice de réfraction

Le détecteur mesure l’indice de réfraction du liquide sortant de la colonne. C’est un détecteur
universel puisque l’indice de réfraction de l’éluant est modifié lorsqu’un composé, quel qu’il soit,
sort de la colonne. Il donne une réponse similaire pour les composés de la même famille (ex. :
sucres), mais son principal inconvénient est sa faible sensibilité.
Enregistreurs
Les enregistreurs sont les mêmes que ceux utilisés en chromatographie en phase gazeuse. Les
logiciels d’application, comme le Millenium, sont également utilisés en HPLC.
44
ère
Les principales étapes d’une analyse en chromatographie liquide à haute pression sont similaires à
celles de la chromatographie en phase gazeuse :
a) Préparation des échantillons

Les produits doivent habituellement être soumis à une purification préliminaire pour éliminer du
mélange les produits indésirables. Les extraits obtenus sont filtrés sur une membrane jetable de
type Luer de 0,5 µm ou moins, avant d’être injectés.
b) Ajustement des paramètres (débit d’éluant et pression, nature de l’éluant, etc.) pour la séparation
optimale des composés du mélange inconnu.
c) Injection des échantillons inconnus et des standards.
d) Calculs pour l’analyse qualitative et quantitative.
e) Interprétation des résultats.
Comme en chromatographie en phase gazeuse, les résultats apparaissent sous forme de pics sur le
chromatogramme. On utilise donc les mêmes méthodes pour effectuer l’analyse qualitative et
quantitative des composés.
45

Chromatograph I e

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ère

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b) Montrez, en dessinant un chromatogramme, les résultats normalement attendus, en supposant

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Température isotherme Température programmée

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a) Préparation des échantillons

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e) Calculs pour l’analyse quantitative.

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Analyse des esters méthyliques du beurre (DEGS à 180 °C)

L’analyse qualitative consiste à identifier un ou plusieurs composés du mélange inconnu injecté.

tr = distance parcourue par le composé

En cas de doute, on utilise la technique de l’enrichissement du mélange inconnu. Pour ce faire, on

On injecte un mélange de composés inconnus et on obtient le chromatogramme A. On injecte

On prépare un mélange en ajoutant un peu du standard au mélange inconnu et on injecte le

L’analyse quantitative consiste à doser, c’est-à-dire déterminer la concentration d’un ou de plusieurs

• Détermination de la surface des pics

A. Méthode par triangulation

À l’aide d’une règle, calculez la surface réelle du pic précédent en cm2.

B. Méthode par intégration électronique

• Détermination des pourcentages relatifs des constituants d’un mélange

%A = SA × 100 %B = SB × 100 etc. S = Surface

%A = NA × 100 %B = NB × 100 etc. N = Nombre de points électroniques

On injecte un mélange inconnu de 2 composés dissous dans un solvant. La surface des

pic A : 102,54 cm2 pic B : 4,68 cm2 pic C : 3,45 cm2

• Détermination de la concentration d’un composé dans le mélange

A. Méthode de la courbe d’étalonnage

Un bon détecteur donne une réponse proportionnelle à la concentration du composé détecté,

Pour utiliser la méthode de la courbe d’étalonnage, on prépare une série de solutions

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