L'Analyse HPLC Pour Les Nuls. - Association Française Des Malades de La Thyroide

3/8/2019 L’analyse HPLC pour les nuls.
– Association française des malades de la thyroide
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L’analyse HPLC pour les nuls.

AOÛT 15

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3/8/2019 L’analyse HPLC pour les nuls. – Association française des malades de la thyroide
BESOIN DE DÉVELOPPER UNE

NOUVELLE MÉTHODE
ANALYTIQUE? VOICI LE GUIDE
ULTIME DU DÉVELOPPEMENT DE
MÉTHODES HPLC
(https://hplcfordummies.wordpress.c
om/2013/11/10/need-to-develop-a-
new-analytical-method-heres-the-
ultimate-guide-to-hplc-method-
development/)
Vous devez séparer et identi er les composés dans un nouveau mélange? Il n’y a pas de méthodes
validées publiées précédemment dans la littérature?! Alors c’est pour vous…
Un organigramme présentant toutes les étapes pour développer une nouvelle méthode HPLC
accessible par ce lien:
https://bubbl.us/?h=1b3a2d/364fb7/17rtFv8XG9eT6 (https://bubbl.us/?
h=1b3a2d/364fb7/17rtFv8XG9eT6)
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(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/ owchart_2r2d5l5l.jpg)
Aperçu du diagramme de développement de la méthode
TOUJOURS PERPLEXE PAR

HPLC?! CELA POURRAIT VOUS
AIDER!
om/2013/11/10/still-puzzled-by-
hplc-this-might-help-you-out/)
Personne n’a jamais dit que la HPLC était facile.
Eh bien, c’est en fait … MAIS si vous êtes encore confus au sujet des principaux concepts et de ce qui
in uence quoi (et comment), voici un lien vers une carte conceptuelle qui devrait clari er les choses:
https://bubbl.us/?h=1b3a2d/375bb2/17qY0qI6Jd3QM (https://bubbl.us/?
h=1b3a2d/375bb2/17qY0qI6Jd3QM)
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(https://hplcfordummies.
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Un aperçu de la carte conceptuelle HPLC
DÉGRADÉ OU NE PAS DÉGRADÉ …

om/2013/11/10/to-gradient-or-not-
to-gradient/)
1) À propos de l’isocratique
Lorsque la composition de la phase mobile ne change pas pendant une analyse (composition
constante), la méthode est dite isocratique.
Certains problèmes peuvent être associés à ce choix de méthode, tels que:
Si les composés à séparer ont une large gamme de polarité, la résolution peut être perdue avec
des pics apparaissant à ou proches de t 0 .
Les composés hautement hydrophobes (en RP-HPLC) peuvent être conservés trop longtemps,
ce qui permet d’élargir les pics (élargissement de la bande) avec une faible sensibilité en raison
de la faible hauteur des pics.
Certains composés peuvent être adsorbés de manière irréversible sur la colonne, entraînant
une contamination.
Ces problèmes peuvent être visualisés dans le chromatogramme suivant:
(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/g1.png)
Analyse isocratique
2) À propos du dégradé
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De nombreux
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pour améliorer la HPLC isocratique
expérience peuvent
sur notre être surmontés en utilisant
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savoir
en gradient. Pour
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(normalement en augmentant la quantité de modi cateur organique – ACN ou MeOH dans RP-
HPLC).
Il convient de mentionner que l’élution en gradient est la mieux adaptée aux analyses effectuées à
l’aide de phases stationnaires RP, NP et de chromatographie par échange d’ions. De plus, une pompe
spéciale doit être utilisée pour permettre le mélange en ligne des composants de la phase mobile.
Principaux avantages de l’élution du gradient:
Résolution améliorée
Capacité de détection accrue
Possibilité de séparer des échantillons complexes (large gamme de polarité)
Temps d’analyse plus courts
Diminution de la détérioration de la colonne due à des composants fortement retenus
Comment ça marche?
– la composition initiale est choisie pour que la force du solvant soit appropriée non seulement pour
retenir mais aussi pour résoudre les analytes à élution précoce;
– une fois la composition initiale établie, la concentration en modi cateur organique est augmentée
de manière prédéterminée pour éluer les composés;
– la composition nale de la phase mobile est choisie pour garantir une élution de tous les composés
avec une résolution optimale et dans un délai raisonnable;
– Il est également possible d’augmenter le modi cateur organique pour éliminer les composés
fortement retenus susceptibles de contaminer la colonne.
Inconvénients d’une méthode Gradient:
Instrumentation plus chère

Précipitation possible aux interfaces solvant (gros non non!)
Le temps de ré-équilibrage ajoute au temps d’analyse
L’étude de cas suivante montre comment l’élution progressive peut être plus avantageuse que les
élutions isocratiques:
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Etude de cas pour Gradient
Comme on peut le voir, une élution Gradient a fourni de meilleurs pics résolus, avec des hauteurs et
une sélectivité acceptables, et un temps d’exécution plus court. L’élution isocratique n’a pas été
achevée avant près de 75 minutes d’exécution, et le dernier pic est large, ce qui n’est pas souhaitable.
Gardez à l’esprit: Les plus grandes molécules sont plus sensibles que les petites molécules aux
modi cations du modi cateur% organique
L’équation ci-dessous explique comment calculer le facteur de rétention k pour une méthode de
gradient en HPLC, où:
Équation
Comment fonctionne l’élution Gradient?

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– Généralement,
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pour sont
améliorer utilisés
votre (réservoirs
expérience A et B). Le
sur notre réservoir A contientOk
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le solvant
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– La force d’élution augmente généralement avec le temps.
– Le mélange de la composition de la phase mobile est réalisé à l’aide de la pompe HPLC et deux
méthodes de mélange sont courantes. Le premier est le mélange à basse pression , dans lequel les
solvants sont proportionnés du côté basse pression de la pompe à l’aide d’ électrovannes . La seconde
approche est connue sous le nom de mélange sous haute pression et se produit lorsque deux pompes
ou plus sont utilisées pour distribuer des solvants à différents débits dans une chambre de mélange.
– Parfois, les solvants peuvent être prémélangés ou « dopés » pour faciliter le mélange des solvants
(le solvant A contient 5% de solvant B et vice-versa).
Quelques principes importants d’élution du gradient:
– L’élution par gradient est particulièrement utile pour la chromatographie HPLC en phase inverse et
la chromatographie par échange d’ions.
– Le gradient réel est formé en augmentant le pourcentage de modi cateur organique (%).
– A cause de cela, au début de l’analyse, lorsque la force de la phase mobile est faible, les composés
seront entièrement répartis dans la phase stationnaire (tête de la colonne).
– Au fur et à mesure que la force de la phase mobile augmente, l’analyte commence à se répartir dans
la phase mobile et se déplace le long de la colonne. Une certaine accélération sera générée lorsque la
concentration en modi cateur organique (%) est augmentée.
– À un moment donné pendant l’élution, les composés seront complètement répartis dans la phase
mobile (en fonction de certaines variables telles que la longueur de la colonne). Au cours de cette
étape, les composés se déplaceront à la même vitesse que la phase mobile, elle-même déterminée par
le débit et la vitesse linéaire.
– Il est important de noter que nous ne pouvons pas affecter une valeur k (facteur de rétention) xe à
un composé lorsque l’élution Gradient est appliquée, car elle change tout au long de l’élution. Il est
faux de calculer k en utilisant l’équation k = (tr-t 0 ) / t 0 , elle ne peut être appliquée qu’à l’élution
isocratique.
La gure suivante montre comment l’élution du gradient fonctionne dans une colonne .
Que se passe-t-il à l’intérieur de la colonne pendant un dégradé?
Région A – Tête de la colonne (où les composés seront retenus au début du cycle, lorsque le
pourcentage de modi cateur organique est faible)
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Région B –
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Région C – Région où les composés se sont entièrement répartis dans la phase mobile et se déplacent
et sa vitesse.
Le graphique ci-dessous montre comment le modi cateur organique et le facteur de rétention

changent avec le temps pendant une élution du gradient:
Comment le facteur de rétention change en fonction de% B au cours d’un dégradé
Le graphique du haut détaille le pro l du gradient et, au l du temps, plus de modi cateur organique
est présent dans la phase mobile, ce qui nous amène au graphique inférieur, où nous pouvons voir
comment les composés commencent à être presque entièrement conservés dans la colonne
commence à diminuer au fur et à mesure que le temps (et le modi cateur organique) augmente.
Forme de pointe en HPLC dégradée
Dans des conditions isocratiques, il n’est pas rare de voir l’élargissement de la bande et les pics avec
une plus grande largeur avec un temps de rétention accru. Ce n’est pas un problème pour l’élution du
gradient due à la vitesse des composés pendant l’élution. À un moment donné, les analytes vont
accélérer à travers la colonne (avec un% de modi cateur organique) et générer des pics plus étroits,
qui sont souhaités. La différence de temps de rétention entre les composés est naturellement une
conséquence de la quantité de modi cateur organique dont ils ont besoin pour commencer à
accélérer. Cela change en fonction de chaque composé et dépend de leurs propriétés physico-
chimiques.
Le terme de focalisation du pic peut être appliqué à l’élution du gradient.
La focalisation du pic peut également être attribuée à l’arrière et à la queue du pic à des compositions
de phase mobile légèrement différentes tout au long du cycle.
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Mise au point maximale
Mise au point maximale
Qu’est-ce qu’un dégradé de scoutisme?
Le gradient de dépistage est un gradient linéaire de 5 à 10% de B à 100% de B, généralement pendant

20 minutes. Pour RP-HPLC, l’eau et l’ACN sont généralement les éluants de choix. C’est un bon outil à
utiliser pour développer une méthode isocratique ou en gradient.
Si les composés éluent pour plus de 25% du temps après la n du gradient, puis un solvant plus fort B

est requise, ou d’ une colonne inférieure de rétention, de sorte que les composés peuvent partitionner
plus dans la phase mobile et éluer rapidement.
L’utilisation d’un gradient de reconnaissance peut être utile et révèle beaucoup sur la composition de
phase mobile requise pour la séparation.
Pente raide
La pente du gradient peut être vue dans la gure ci-dessous:
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raide
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La pente du gradient est naturellement contrôlée par la composition de début et de n de la phase
mobile, ainsi que par le temps de gradient.
La pente du gradient peut également être déterminée par 1 / k
Comment manipuler l’équation du gradient pour optimiser la séparation?
L’équation du facteur de rétention du gradient peut être examinée plus avant a n d’améliorer la
séparation des gradients. Si l’on cherche à augmenter le facteur de rétention du gradient, ils peuvent:
Utilisez un temps de dégradé plus long

Utiliser une colonne plus courte
Utiliser un débit plus élevé
Utiliser une gamme de solvants organiques plus courts
Cela ne garantit toutefois pas que la résolution sera améliorée à 100%.
Quelques considérations pratiques concernant le dégradé:
En raison des longues durées d’équilibrage de la colonne, les applications utilisant

des composants fortement retenus tels que la triéthylamine ne conviennent pas. Pour les
mêmes raisons, les applications de paires d’ions ne sont pas adaptées à l’élution par gradient.
Les applications HPLC en phase normale utilisant des colonnes de silice nues ne conviennent
pas non plus. Les temps d’équilibrage longs entraînent une imprécision du temps de
rétention .
Les solvants utilisés dans l’élution par gradient doivent être purs. La qualité de l’eau est
particulièrement importante. Les impuretés sont retenues sur la colonne alors que la
composition de la phase mobile est faible. Lorsque la force d’élution augmente, les impuretés
apparaissent sous forme de pics dans le chromatogramme. Le chromatogramme présenté est
un exemple concret de ces pics fantômes – les impuretés proviennent de l’eau, qui a été stockée
de manière inappropriée.
Pour éviter les problèmes de précipitation dans l’instrument, testez le tampon pour vous
assurer qu’il est soluble dans la composition nale de la phase mobile.
En n, pour augmenter la précision du temps de rétention, assurez-vous que le temps de ré-
équilibrageadéquat est autorisé entre chaque série chromatographique.
10 NOVEMBRE 2013 (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/to-gradient-or-not-to-gradient/)
LAISSER UN COMMENTAIRE (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/to-gradient-or-not-to-

gradient/#respond)
COMPRENDRE LES POINTS CLÉS DE

LA CHIMIE DE LA COLONNE Privacy - Termini
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En savoir
om/2013/11/10/understanding-key-
points-about-column-chemistry/)
Notes sur la silice en phase stationnaire :
La silice est souvent utilisée comme matériau de support pour l’adsorption en HPLC en phase normale
et avec une modi cation chimique pour HPLC en phase inverse (partition) et d’autres types de
chromatographie.
La silice poreuse a une surface spéci que élevée qui conduit à un rendement élevé grâce à un nombre
plus élevé de plateaux théoriques.
Certains facteurs à prendre en compte pour la fabrication des colonnes à base de silice sont la pureté,
la forme, la taille des particules et la distribution granulométrique.
Pourquoi ces facteurs sont-ils importants? La présence d’ions métalliques dans la silice peut
entraîner un pic de fuite. Donc, ce qui se passe est une « rétention secondaire indésirable » qui
provient des molécules d’analyte interagissant avec les groupes de métal ou de silanol sur la surface
de la silice, conduisant à une rétention plus longue. De plus, les ions métalliques de surface agissent
comme agents chélatants pour retenir les molécules d’analyte. Le fer et l’aluminium sont
particulièrement gênants. Une façon de minimiser cela est de « laver à l’acide » la silice.
Pourquoi ces facteurs sont-ils importants? Bien que les particules irrégulières soient moins
coûteuses, elles sont moins ef caces que les particules sphériques. Cela est dû à la manière dont les
particules se rangent dans la colonne HPLC. Cela conduit à une perte d’ef cacité (élargissement de la
bande) principalement en raison de plus d’effets de diffusion de Foucault et de transfert de masse.
À pH élevé, le substrat de silice est susceptible de subir une hydrolyse, ce qui entraîne une
dégradation. Les symptômes typiques de ceci sont une perte d’ef cacité et une augmentation de la
contre-pression.
Une réponse à cela: les matériaux hybrides. Ils sont formés à partir d’un mélange d’alkylsiloxane
(organique) et de silane (inorganique). Ces matériaux présentent une bonne stabilité à pH élevé en
diminuant la sensibilité à l’hydrolyse.
L’image ci-dessous résume tous les facteurs les plus importants à prendre en compte pour les
colonnes HPLC à base de silice:
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(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/hplcc.png)
Notes sur les phases chimiquement liées
La composition fondamentale de la silice utilisée pour HPLC est SiO 2 .xH 2 0 . Le groupe silanol est
celui dans lequel les phases liées chimiquement sont attachées.
Un moyen de modi er la sélectivité consiste à modi er la chimie de la phase stationnaire. L’une des

façons les plus courantes de le faire consiste à faire réagir un chlorosilane avec les groupes silanols de
surface, en produisant un certain nombre de phases stationnaires différentes selon qu’il s’agit d’un
mono, d’un di ou d’un trichlorosilane.
Les mono produisent des matériaux d’emballage monomères , se xant à la surface de la silice par une

simple liaison.
Bien qu’ils soient très ef caces, ils ne sont pas aussi robustes que ceux produits par le di et tri-
chlorosilane. Ces phases liées sont appelées « phases polymères liées ». Ils sont utiles car en modi ant
la chimie de surface, ils modi ent la sélectivité de la colonne.
La gure ci-dessous montre les voies de synthèse pour synthétiser des phases polymères liées:
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(https://hplcfordummies.
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Notes sur le traitement de surface et le recouvrement
Même si la plupart des fabricants font du bon travail en fournissant de bonnes phases liées (matériaux
hybrides), il y a toujours quelques groupes silanol qui n’ont pas réagi en raison d’effets stériques.
Ces groupes silanols restants (en fonction de leur conformation) réagiront avec des molécules
contenant des groupes fonctionnels ioniques ou polaires et conduiront à un pic de rétention
(rétention / interaction secondaire indésirable)
Comment se débarrasser de ce problème? En recouvrant la surface de la colonne, on fait réagir les

groupes silanol avec un agent qui recouvre la surface polaire. Cela se fait à l’aide d’un groupe non
polaire, tel que le triméthylsilyle (TMS).
Considérations importantes sur la conformation du silanol: toutes les différentes conformations

interagissent avec des groupes fonctionnels ioniques et polaires de molécules à différents degrés. Par
exemple, les groupes acidi (ou solitaires) silanol offrent la plus forte interaction et conduisent donc à la
pire pointe de résidus. Ainsi, la conformation du groupe silanol peut être un facteur de changement
de la sélectivité de la colonne.
Comme on pouvait s’y attendre, le maximum de résidus sera pire quand une interaction entièrement
ionique se produira entre ces groupes, et cela dépend naturellement du pH (car cela affecte le degré
d’ionisation des deux espèces).
Comme nous pouvons le constater, le fait de lier chimiquement la phase stationnaire et le

recouvrement nal sont des moyens de réduire la rétention indésirable et de modi er la sélectivité.
L’image ci-dessous détaille le fonctionnement du recouvrement:
(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/endcapping.png)
Notes sur le silanol et la séparation
Des groupes de silanols isolés (acides) peuvent conduire à un pic de rétention et à une rétention
irréversible. Cependant, il est également possible d’utiliser la surface de silanol pour conférer des
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attributs de sélectivité spéci ques à une séparation.
En contrôlant
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des cookies des ligands
pour améliorer de la phasesur
votre expérience liée, le degré
notre d’in uence que les espèces
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En
silanol
naviguant exercent
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contrôlé. plus
Notes sur les phases mouillables à l’eau
Les colonnes à inversion de phase traditionnelles ne conviennent pas aux phases mobiles hautement
aqueuses (> 95% H 2 0), en raison d’un phénomène connu sous le nom de « collapsus de phase » ou
« auto-association ».
Comment se passe l’effondrement de phase? En modi ant l’hydrophilie de la phase mobile, les ligands
C8 et C18 s’auto-associent pour minimiser l’énergie d’interaction avec la phase mobile, entraînant de
grandes pertes d’ef cacité.
Il existe différentes méthodes pour produire une phase stationnaire mouillable à l’eau (pour HPLC
RP). L’une d’elles implique un contrôle étroit de l’espacement entre les ligands de la phase liée sur la
surface de la silice. Si nous connaissons la surface de la silice et ajustons la charge de carbone, nous
pouvons modi er la sélectivité de la séparation.
Comment la stabilité est-elle atteinte dans ce cas? – Adsorption d’une couche d’eau sur la surface de
silice. Les groupes silanols à basse énergie (conformation vicinale) s’hydratent et la force motrice de
l’auto-association est perdue car les chaînes vont se repousser à cause de la couche d’eau qui est
ef cacement adsorbée.
Un autre moyen d’obtenir une stabilité dans une phase mobile aqueuse à 100% consiste à utiliser des
réactifs de coiffage d’extrémité polaire. Le mécanisme est similaire au précédent, où la couche d’eau
empêche l’effondrement de la phase et modi e de manière signi cative la sélectivité de la colonne.
La gure ci-dessous est une représentation de ce mécanisme:
(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/waterwettablephases.png)
Mécanisme pour les phases mouillables de l’eau
Phases incorporées polaires : ces phases contiennent une modi cation de la chaîne alkyle, qui est
habituellement un amide, un carbamate ou un autre groupe polaire approprié. Certains des avantages
sont les suivants: utilisation avec des phases mobiles aqueuses à 100%; aptitude à séparer les
composés polaires, ionisables et particulièrement basiques avec une ef cacité et une forme de pic
excellentes; robustesse accrue.
Travailler à faible pH Privacy - Termini
A faible des
Nous utilisons pH, le risquepour
cookies est dû à l’hydrolyse
améliorer de la liaison
votre expérience suréther
notreentre la phase liée et la surface
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silice. Cela
naviguant sevous
sur ce site, voitacceptez
à travers la détérioration
notre de la forme de pointe et la perte d’ef cacité.
utilisation des cookies. plus
Les fabricants offrent maintenant des choix de phase stationnaires pouvant fonctionner à un pH
faible. Ils le font en ajoutant des groupes latéraux volumineux sur le ligand pour offrir une protection
stérique de la liaison éther.
(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/lowph.png)
Travailler à faible pH
Travailler à pH élevé
A pH élevé, la surface de silice présente un risque, une fois susceptible de s’hydrolyser des groupes
silanols de surface.
Cette hydrolyse potentielle peut éventuellement conduire à la formation de très petites particules
( nes) qui migrent vers et bloquent la fritte de sortie, conduisant à une contre-pression accrue. Cela
peut également être vu par la perte de forme de crête et l’élargissement de la bande.
Certaines approches pour surmonter ce problème comprennent: l’utilisation de la silice hybride qui
contient moins de groupes silanols de surface; en utilisant un matériau à base de polymère et de non-
silice.
Certains avantages du travail à pH élevé sont les suivants: élimination du degré d’ionisation de
l’analyte (ce qui signi e qu’il ne sera pas nécessaire d’ajuster le pH de la phase mobile); augmente la
robustesse et la rétention de la méthode pour les analytes basiques élevés.
La gure ci-dessous illustre les moyens de surmonter l’hydrolyse de la silice due à un pH très élevé:
Privacy - Termini
(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/highph.png)
Travailler à pH élevé
LA BOITE ~ MYSTIEUSE ~ USLC
Chromatographie liquide ultra sélective (USLC)
Cette boîte contient la plus large gamme de sélectivité de phase inversée disponible, avec quatre
phases stationnaires différentes:
– C18 aqueux
– IBD (à base intrinsèque désactivée)
– biphényle
– PFP Propyl
Les détails de chacune de ces colonnes en ce qui concerne les dimensions et la taille des particules
peuvent être trouvés ici: http://www.restek.com/Landing-Pages/USLC-sup-reg-sup-Columns-Ultra-
Selective-Liquid-Chromatography (http://www.restek.com/Landing-Pages/USLC-sup-reg-sup-
Columns-Ultra-Selective-Liquid-Chromatography)
10 NOVEMBRE 2013 (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/understanding-key-points-about-

column-chemistry/)
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points-about-column-chemistry/#respond)
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LE NOMOGRAM
om/2013/11/10/the-nomogram/)
(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/nomogram.png)
Le NOMOGRAM
10 NOVEMBRE 2013 (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/the-nomogram/)
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[CONCEPTS CLÉS] ÉLABORATION

DES BANDES
om/2013/11/10/key-concepts-band-
broadening/)
Aussi appelée « perte d’ef cacité », elle réduit l’ef cacité de la séparation et donc la
résolution;
Le vieillissement de la colonne est un phénomène courant.
L’ équation de Van Deemter comprend les trois facteurs les plus importants pouvant
entraîner l’élargissement de la bande: HETP = A + B / u + Cu
Où: HETP = Hauteur de la plaque / A = Diffusion Eddy / B / u = Diffusion longitudinale / Cu =
Transfert de masse
Diffusion Eddy (Effet Multi-Path): également connu sous le nom d’effets de variation de ux,
il est lié au fait que l’analyte peut prendre de nombreux chemins différents dans une colonne,
en raison de nombreux facteurs tels que l’inhomogénéité du matériel d’emballage. Il peut
Privacy - Termini
être minimisé en: sélectionnant des colonnes bien emballées, en utilisant un matériau de
Nous utilisonsgarnissage
des cookiesde colonne
pour (phase
améliorer stationnaire)
votre avec
expérience sur un faible
notre PSD (distribution Ok
site. En En savoir
granulométrique).
Diffusion longitudinale: diffusion moléculaire aléatoire. En raison des différents gradients de
concentration, les analytes ont tendance à se disperser dans toutes les directions. Cela se
produit lorsque le système HPLC a des volumes internes plus importants que nécessaire, tels
que la longueur et la largeur du tube. Peut être minimisé en: utilisant des débits de phase
mobiles plus élevés, gardez le système de tubulure court et aussi étroit que possible.
Transfert de masse: Le matériau en phase stationnaire (généralement la silice-C18) est
poreux et provoque la stagnation (stationnaire) de la phase mobile qui pénètre dans un
pore. Les analytes à l’intérieur des pores se déplacent uniquement par diffusion, ce qui
conduit à un élargissement de la bande. Peut être minimisé en: réduisant le débit, en
chauffant la colonne (accélérant le processus de diffusion).
L’optimisation de la taille des particules (en la réduisant) conduit à une meilleure ef cacité
(hauteur de la plaque) et donc à la résolution. Cependant, il convient de noter que la pression
du système (pompe) doit être surveillée.
(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/bb.png)
L’équation de Van Deemter
10 NOVEMBRE 2013 (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/key-concepts-band-broadening/)
LAISSER UN COMMENTAIRE (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/key-concepts-band-

broadening/#respond)
COMPRENDRE L’EFFET DU PH ET DE
LA TEMPÉRATURE
om/2013/11/10/understanding-the-
effect-of-ph-and-temperature/)
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Effet dudes
Nous utilisons pH:cookies pour améliorer votre expérience sur notre site. En Ok En savoir
Dans un environnement acide (phase mobile), les médicaments / composés acides seront
principalement syndiqués (forme moléculaire), tandis que les médicaments / composés de base seront
ionisés. En revanche, dans les environnements basiques, les composés acides seront principalement
des composés ionisés et basiques sous forme moléculaire. Il convient de noter que cela dépend
également du pkA / pkB.
Effet de la température:
(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/temperature.png)
Effet de la température
Selon l’image ci-dessus, une augmentation de la température réduira généralement la valeur de k,

donc le temps de rétention réel diminuera et la séparation ne sera pas aussi ef cace.
Il y a deux autres effets signi catifs de la séparation sous la température élevée:
La stabilisation de la colonne sous la température élevée conduit généralement à la

stabilisation des temps de rétention.
Augmentation de l’ef cacité de la colonne. À la température élevée, la viscosité des liquides
diminue et le coef cient de diffusion augmente. À partir de l’ équation de Van Deemter,
(http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Theory/th_vandm.html#Band%20broadening%2
0theory) le deuxième terme augmentera, ce qui entraînera une diminution de l’ef cacité aux
très faibles débits. Le dernier terme diminuera, ce qui entraînera une augmentation de
l’ef cacité aux débits courants. Il élargit également la gamme de débit avec une ef cacité
optimale.
10 NOVEMBRE 2013 (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/understanding-the-effect-of-ph-

and-temperature/)
PH (https://hplcfordummies.wordpress.com/tag/ph/) , TEMPÉRATURE
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Nous estimons être victimes d’un mensonge d’Etat : Motion déposée dans toutes les ARS de
France le 2 juillet 2019 (https://www.asso-malades-
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la-reunion-publique-du-28-05-2019-a-pace-35-740/)
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soutien-du-show-mode-a-lafmt/)
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cause/)
(https://www.asso-malades-thyroide.fr/wordpress/index.php/2019/04/05/nouvelle-
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critique/)
Nouvelle formule du Levothyrox : « Il n’y a pas de roue de secours », déplore le co-auteur d’une
étude critique (https://www.asso-malades-
thyroide.fr/wordpress/index.php/2019/04/05/nouvelle-formule-du-levothyrox-il-ny-a-pas-
de-roue-de-secours-deplore-le-co-auteur-dune-etude-critique/)
(https://www.asso-malades-thyroide.fr/wordpress/index.php/2019/04/03/le-
glyphosate-serait-il-aussi-un-perturbateur-endocrinien/)
Le glyphosate serait-il aussi un perturbateur endocrinien ? (https://www.asso-malades-
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endocrinien/)
Enquête sur les escrocs de l’autisme (https://www.asso-malades- Privacy - Termini
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L'Analyse HPLC Pour Les Nuls. - Association Française Des Malades de La Thyroide

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3/8/2019 L’analyse HPLC pour les nuls.

– Association française des malades de la thyroide

ADHÉSION & DONS (HTTPS://WWW.ASSO-MALADES-THYROIDE.FR/WORDPRESS/INDEX.PHP/ADHEREZ/)

L’analyse HPLC pour les nuls.

BESOIN DE DÉVELOPPER UNE

(https://hplcfordummies. les.wordpress.com/2013/11/ owchart_2r2d5l5l.jpg)

Aperçu du diagramme de développement de la méthode

TOUJOURS PERPLEXE PAR

DÉGRADÉ OU NE PAS DÉGRADÉ …

Certains problèmes peuvent être associés à ce choix de méthode, tels que:

Ces problèmes peuvent être visualisés dans le chromatogramme suivant:

Principaux avantages de l’élution du gradient:

Inconvénients d’une méthode Gradient:

Instrumentation plus chère

Etude de cas pour Gradient

Comment fonctionne l’élution Gradient?

– La force d’élution augmente généralement avec le temps.

Quelques principes importants d’élution du gradient:

La gure suivante montre comment l’élution du gradient fonctionne dans une colonne .

Que se passe-t-il à l’intérieur de la colonne pendant un dégradé?

Le graphique ci-dessous montre comment le modi cateur organique et le facteur de rétention

Comment le facteur de rétention change en fonction de% B au cours d’un dégradé

Forme de pointe en HPLC dégradée

Le terme de focalisation du pic peut être appliqué à l’élution du gradient.

Mise au point maximale

Mise au point maximale

Qu’est-ce qu’un dégradé de scoutisme?

Le gradient de dépistage est un gradient linéaire de 5 à 10% de B à 100% de B, généralement pendant

Si les composés éluent pour plus de 25% du temps après la n du gradient, puis un solvant plus fort B

La pente du gradient peut être vue dans la gure ci-dessous:

Nous utilisons des cookies pour améliorer votre expérience Pentesur

La pente du gradient peut également être déterminée par 1 / k

Comment manipuler l’équation du gradient pour optimiser la séparation?

Utilisez un temps de dégradé plus long

Cela ne garantit toutefois pas que la résolution sera améliorée à 100%.

Quelques considérations pratiques concernant le dégradé:

En raison des longues durées d’équilibrage de la colonne, les applications utilisant

10 NOVEMBRE 2013 (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/to-gradient-or-not-to-gradient/)

LAISSER UN COMMENTAIRE (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/to-gradient-or-not-to-

COMPRENDRE LES POINTS CLÉS DE

Notes sur les phases chimiquement liées

Un moyen de modi er la sélectivité consiste à modi er la chimie de la phase stationnaire. L’une des

Les mono produisent des matériaux d’emballage monomères , se xant à la surface de la silice par une

Comment se débarrasser de ce problème? En recouvrant la surface de la colonne, on fait réagir les

Considérations importantes sur la conformation du silanol: toutes les différentes conformations

Comme nous pouvons le constater, le fait de lier chimiquement la phase stationnaire et le

L’image ci-dessous détaille le fonctionnement du recouvrement:

Notes sur le silanol et la séparation

Notes sur les phases mouillables à l’eau

La gure ci-dessous est une représentation de ce mécanisme:

Mécanisme pour les phases mouillables de l’eau

Travailler à faible pH Privacy - Termini

LA BOITE ~ MYSTIEUSE ~ USLC

Chromatographie liquide ultra sélective (USLC)

– IBD (à base intrinsèque désactivée)

10 NOVEMBRE 2013 (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/understanding-key-points-about-

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10 NOVEMBRE 2013 (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/the-nomogram/)

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[CONCEPTS CLÉS] ÉLABORATION

L’équation de Van Deemter

10 NOVEMBRE 2013 (https://hplcfordummies.wordpress.com/2013/11/10/key-concepts-band-broadening/)

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