Diagnostique microbiologique de la tuberculose

Avril 2017

Pr. S. Godreuil
Laboratoire de Bactériologie, CHU de Montpellier
s-godreuil@chu-montpellier.fr
Plan
Généralités
Diagnostic microbiologique
Echantillons biologiques/prélèvements
Examen direct microscopique
Culture
Identification de l’espèce du CMTB
Antibiogramme et détection moléculaire de la
résistance aux antituberculeux à partir des
cultures
Détection moléculaire de CMTB et de la
résistance aux antituberculeux à partir des
échantillons
 Généralités

• Un seul genre : Mycobacterium

• Environ > 150 espèces
• De rares sous-espèces
• Classification :
– Complexe tuberculosis : agents de la tuberculose
– Mycobactéries atypiques : mycobactérioses et infections
opportunistes
– Mycobacterium leprae : agent de la lèpre
 Généralités

Espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis (CMTB)

 M. tuberculosis (Bacille de Kock, BK)

 M. africanum
 M. canettii
 M. bovis (M. bovis BCG)
 M. microti
 M. caprae
 M. pinnipedii
 Généralités

Cycle biologique de la TB humaine

1.Elimination de MTB

2. TB active

3. TB latente : réservoir

4. Réactivation endogène
Réinfection exogène

5. Dissémination et
transmission de MTB.
 Généralités

Epidémiologie de la tuberculose dans le monde

9 millions de cas 1.2 M

VIH+
4 millions de cas bacillifères
1,8 millions de morts

Conditions sociales et
d’hygiène
VIH/SIDA
Efficacité réduite du BCG
Souches multirésistantes
500 000 cas MDR/30 00 UR
 Généralités

Diagnostic de la TB chez l’homme dans Nord vs Sud

Nord Sud
oui Echantillons respiratoires oui
oui Echantillons extra-respiratoires Non/oui

Examen microscopique direct

oui Ziehl-Neelsen = BAAR oui
Stop

oui Mise en culture

oui Identification d’espèce

dans le CMTB Espèce du CMTB
peu documentée
ATB pas documenté

oui Antibiogramme (PIRE)

 Généralités

Contrôle de la TB dans les pays du Sud vs Nord

•Test + Se ED
•Disponible, simple = Graal ???

•½ traité pour TB sans preuve microbio = clinique, radio,

ATB d’épreuve
•Retard diag, tt ATB abusif, non diag forme infra-clinique
(HIV+)

Objectifs OMS
•Améliorer Dépistage des cas suspects de TB
•Améliorer la sensibilité de la microscopie
•Promouvoir la culture de MTB en milieu liquide
•Développer les méthodes moléculaires
•Prévenir les MDR et UR
 Généralités

Améliorer dépistage des cas suspects de TB

•Dépistage passif avec ED des crachats patients

•VIH+ = dépistage actif par ED sans signe clinique
•VIH+ = toux, amaigrissement, sueur nocturne = traitement antiTB (60% Se
et VPN = 90%)
•Dépistage actif dans le communautés = bus/domicile = - 40% de TB
contagieuse
•Radio Thorax = bof !!! = VIH+
Diagnostique microbiologique
 Diagnostic microbiologique
Echantillons biologiques/prélèvements

TB pulmonaire

•3 crachats 2j consécutifs = donc perdu de vue

Crachat +++ = 2 le même jour
•motivation/vérification (qualité et volume ++)

Tubage gastrique
•Hospitalisation
LBA : VIH+
 Diagnostic microbiologique
Echantillons biologiques/prélèvements

TB pulmonaire

Utiliser des techniques alternatives en ambulatoire

-Aspiration nasopharyngée : enfant++
-String test: enfant++
-Lung Flute
-Selles: VIH+ et enfants +++
 Alternative specimen collection
methods

Nasopharyngeal aspirate (NPA)

String test: Entero-test® (HDC
corporation, Milpitas, USA) Less invasive than GA
Gastro-duodenal parasites and H. pilori Associated to induced sputum: Yield
> to GA (Zar, 2005).
Better detection of MTB than induced
sputum in HIV+ adults (Vargas, 2005) Induced sputum (IS): risk of
nosocomial exposure if no TB
Good acceptability in children as young
infection control is in place.
as 4 years (Chow, 2006)
NPA without prior nebulisation:
Reduced intra-gastric downtime from 4
Same yield as IS (Owens, 2007).
to 1-2 hours (Bae, 2009)
 Diagnostic microbiologique
Echantillons biologiques/prélèvements

TB extra-pulmonaire

liquides de ponction (pleural, ascite, LCR, articulaire) :tube sur héparine

(exclure l’EDTA), volume max1-2 ml (sinon centrifuger)
urines: recueil 3 /j consécutif
tissus (ganglion, biopsie, peau et os) : flacon stérile
Abcès, lésions, et plaies: ponctions/biopsies, pas écouvillons ++
Hémocultures: 2 ou 3, 10 ml/flacon, flacons dédiés
(Becton Dickinson; bioMérieux; TREK Diagnostics Systems), 45 jours
à 37° C
moelle osseuse: tubes héparinés = flacons d’hémoculture
 Diagnostique microbiologique

Précautions de manipulation et traitement des échantillons

Echantillons contaminées Echantillons non contaminées

•Respiratoires •Liquide LCR, pleural (héparine pas
•Tous prélèvements avec flore EDTA++)
•Biopsie

•< 2h T°C ambiante

•24 à 48h à T°= 4°C

Fluidification et décontamination
Ex: Prélèvements respiratoires
• L-Cystéine
• Soude
• Centrifugation
• Culot : Frottis/ cultures
 Diagnostic microbiologique

Examen direct microscopique

Technique du concentration du crachat

• Liquéfaction + concentration
– Pdt chimique: Javel à 3-5%
– Centrifugation ou sédimentation par gravité
Steingart et al, Lancet Infect Dis 2006
• Performances
• Entre 13 et 33% d’augmentation de Se
• Pas de réduction de Sp
• Meilleures chez les patients VIH?
• Meilleures si faible performance de la microscopie de base
• Faisabilité
– Facile, peu chère, bien acceptée (NaCl tue le BK et le VIH)
– Contraintes opérationnelles
• Qualité de la javel et stabilité
• Fragilité des frottis: QC
• Délais
 Diagnostique microbiologique

L’examen direct des prélèvements

• Coloration à l’auramine
– Lecture en fluorescence
– Sensibilité +++
– Spécificité +
– Rapide ¾ fois + ZN

• Coloration de Ziehl-Neelsen (référence, 5000/10 000 bacilles/ml)

– Fuschine phéniquée
– lecture microscope optique
– Sensibilité +
– Spécificité +++

• Dans les deux cas acido-alcoolo-résistance

• Microscope à lampe Light-Emitting Diodes (LED)

-pas chambre noir, coût (lampe)
-Labo périphérique+++
-adaptation au micro classique, peu électricité
 Diagnostic microbiologique

Examen direct microscopique

Modification des critères frottis + (OMS pour PDS)

•Frottis + = seuil 1BAAR/100 champs et sur 1 crachat

(ED du 2ème si first -)
-Charge de travail -, qualité de lecture +, coût -
•2 crachats
-3ème sert à rien
-Limite les perdus de vue = stratégie de réduction du temps
entre les prélèvements
 Diagnostique microbiologique

Examen direct microscopique

• Résultats
– Négatif
– Positif + ; ++ ; +++ et ++++

• Intérêt fondamental
• Diagnostic
• Surveillance : patient « cracheurs de BK »
• « Levée » des mesures d’isolement
• Souvent le seul moyen diagnostic dans les pays en voie de
développement
 Diagnostic microbiologique
Culture

•Se +++ 10/100 bacilles/ml culture vs 5000/10 000 bacilles/ml ED

microscopique
•Dépiste > 30/50% vs ED microscopique
•Diagnostic précoce +++ moins risque de transmission
 Diagnostique microbiologique
Culture

Milieux solides
Löwenstein-Jensen
 Méthode de ref bien rodée
 Contamination (1-10%)
 Délais: 20-26j
 Peu chère
 Milieux faits maison
 Diagnostique microbiologique
Culture
Liquide : OMS ++ Automates
• Meilleure Se • Bactec™ MGIT™ 960 (BD)
• Délais: 8-16j • BacT/ALERT 3D (bioMérieux)
• Contamination (4-15%) • VersaTREK culture system (TREK
Diagnostics )
• Automatisée (MGIT 960)
• Bactéries atypiques fréquentes
• Recommandation OMS (PDS)
 Diagnostique microbiologique
Culture

Méthodes alternatives: MODS

 Diagnostique microbiologique
Culture
prlt 1 T- T+ C A1 A2 A3
milieu liquide (7H9): C
prlt 2 T- T+ C A1 A2 A3 +/- antibiotique: A

J4 -J25

prlt 1 T- T+ C A1 A2 A3

prlt 2 T- T+ C A1 A2 A3
 Diagnostic microbiologique
Identification du complexe Mycobacterium tuberculosis à partir des cultures

Culture +

Liquide
Solide
ED avec coloration ZN = BAAR
ED avec coloration ZN = BAAR
Subculture élimine contamination

BAAR + : MTBC ou MNT ?

Test identification d’espèce

 Diagnostique microbiologique
Identification du complexe Mycobacterium tuberculosis à partir des cultures

• Immunochromatographie
– Test TB Ag MPT64 : Capilia TB SD, BIOLINE TB Ag MPT64,
rapid BD MGIT™ TBc Identification Test
 MPT64 est retrouvé dans le milieu de culture
 Ag est spécifique des souches MTBC
 Test immunochromatographique
 en 15 minutes
 Se 97%, Sp 98%.
 OMS ++
 Diagnostic microbiologique
Identification de l’espèce du CMTB
Culture +

Liquide
Solide
ED avec coloration ZN = BAAR
ED avec coloration ZN = BAAR
Subculture élimine contamination

BAAR + : MTBC ou MNT ?

Test identification d’espèce

MPT64 = pos = Tuberculose à MTBC

MPT64 = neg = élimine TB = MNT
 Diagnostique microbiologique
Identification de l’espèce dans CMTB à partir des cultures

• Biologie Moléculaire
GenoType MTBC® (Hain®)
•Identification dans le CMTB
•Culture
•PCR = gène gyrA
•Hybridation inverse spécifique
 Diagnostique microbiologique

Antibiogramme et détection moléculaire de la résistance aux antituberculeux

à partir des cultures
• Relativement rapide en milieu liquide
• Peut se faire en milieu solide : lourd et long
• Comparaison de croissance entre flacons sans antibiotiques (témoins) et flacons
avec antibiotiques
• La mesure se fait par fluorescence ou colorimétrie
• Délai de réponse de 5 à 14 jours

INH = isoniazide
RIF= rifampicine
EMB = éthambutol
SM = streptomycine
PRZ = pyrazinamide
 Diagnostique microbiologique
Antibiogramme et détection moléculaire de la résistance aux antituberculeux
à partir des cultures
Antibiogramme : ensemencement des flacons

Flacon Positif
ou milieu solide +

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Contrôle
positif RIF INH SM EMB
 Diagnostique microbiologique
Antibiogramme et détection moléculaire de la résistance aux antituberculeux
à partir des cultures
Interprétation des résultats : Analyse des courbes

4000

3500

3000

2500
R.U.

2000 Contrôle positif

Résistant
1500

1000
Sensible
500
Limite d’interprétation 3 jours
0
Jours
 Diagnostique microbiologique
Antibiogramme et détection moléculaire de la résistance aux antituberculeux
à partir des cultures

• Nature exclusivement chromosomique

• Mutation – sélection
• Apparaît facilement car:
– taux de mutation élevé (1 pour 105)
– cavernes très riches en bacilles (jusqu’à 10 8)
• Nécessité d’associer les anti-tuberculeux :
• 3 à 4 produits pendant les premiers mois
• Souche résistante :

• Multirésistance (MDR): résistance à la rifampicine et à l’isoniazide

• Ultrarésistance (XDR): MDR + résistance aux fluoroquinolones et aux
médicaments injectables de 2ème ligne (amikacine, kanamycine, capréomycine)
• Pré-XDR: MDR + résistance aux fluoroquinolones ou aux médicaments
injectables de 2ème ligne (amikacine, kanamycine, capréomycine)
 Diagnostique microbiologique
Antibiogramme et détection moléculaire de la résistance aux antituberculeux
à partir des cultures
GenoType MTBDRplus (Hain)
 Diagnostique microbiologique
Antibiogramme et détection moléculaire de la résistance aux antituberculeux
à partir des cultures

GenoType MTBDRsl
 Diagnostique microbiologique
Détection moléculaire de CMTB et de la résistance aux antituberculeux à
partir des échantillons
Performance of Xpert MTB/RIF
Boehme et al., NEJM, 2010
• 561 culture-positive TB patients
• Detection of Mycobacterium Tuberculosis Complex
– Sensitivity: peu de faux nég +++
• Smear-positive patients: 98.2%
• Smear-negative patients: 72.5%
– (3 times) increased up to 90.2% w/ repeated tests (x3)
– Specificity 99.2% : peu de faux pos ++
• Identification of RIF-resistant:
– Sensitivity of 97.6%
– Specificity of 98.1%
• Endorsed by WHO in December 2010
 Diagnostique microbiologique
Détection moléculaire de CMTB et de la résistance aux antituberculeux à
partir des échantillons
Performance des méthodes moléculaires

Diagnostic PCR
•Rapide, coût++, infrastructure
•Spécificité ++,
•Se direct échantillon > ED (pos entre 5000 et 10 000 b/ml) < culture
(10 et 100) = (ED-, paucibacillaire), faible volume, inhibiteur
•TB pulmonaire Se 85% TBP, 60% méningés et pleurale.
 Diagnostique microbiologique
Détection moléculaire de CMTB et de la résistance aux antituberculeux à
partir des échantillons
Performance of Xpert MTB/RIF
 Diagnostique microbiologique
Détection moléculaire de CMTB et de la résistance aux antituberculeux à
partir des échantillons
Performance of Xpert MTB/RIF

Recommandation OMS
TBP
Xpert MTB/RIF vs ED/Culture/DST = MDR-TB /VIH = +++
Xpert MTB/RIF vs ED/Culture/DST = enfant = +++
Plus fréquemment possible en fonction structure/ressource PNLT

TBEP
 Xpert MTB/RIF vs ED/Culture/DST = LCR et GG
 Diagnostique microbiologique
Détection moléculaire de CMTB et de la résistance aux antituberculeux à
partir des échantillons
Performance of Xpert MTB/RIF ultra

Xpert MTB/RIF Ultra: A New Near-Patient TB Test With Sensitivity Equal to Culture
Author(s): David Alland1, Mazhgan Rowneki1, Laura Smith1, Jamie Ryan2, Mitchell Chancellor2, Ann Marie Simmons2, David Persing2,
Robert Kwiatkowski2, Martin Jones2, Soumitesh Chakravorty1
1 Medicine, Rutgers New Jersey Medical School, Newark, NJ, United States. 2 Cepheid, Sunnyvale, CA, United States.
 Diagnostique microbiologique
Détection moléculaire de CMTB et de la résistance aux antituberculeux à
partir des échantillons

GenoType MTBDRplus
GenoType MTBDRsl

Indications:
•Echantillon pulmonaire
ED+
ED- (seul MTBDRplus++
V2)
 Diagnostique microbiologique
Détection moléculaire de CMTB et de la résistance aux antituberculeux à
partir des échantillons
Interprétation des résultats PCR dans les échantillons: REMIC
(France)

•Kits CE-IVD = pulmonaire (extra-pulmonaire peu documenté)

•Suspicion TB++: PCR sur ED+

PCR+ et ED+ PCR- ED+ PCR+ et ED- PCR- et ED-

•Contagieux isoler •NTM •2ème PCR sur
•Traitement ++ •2ème PCR autre échantillons
sur autre échantillons

2ème PCR+ et ED- N’exclue pas le diag de

•Traitement TB
 Diagnostique microbiologique

Diagnostique indirecte de la TB

Réponse immunologique de type cellulaire essentiellement

M. tuberculosis

lymphocyt
e mature

Mφ CD mature
lymphocyte
immature LT CD8+
Alvéole Poumon
LT CD4+

IFNγ Ganglion lymphoïde

Lyse cellulaire
Effet bactéricide LT - CD1 restreint

Granulome
 Diagnostique microbiologique

Diagnostique indirecte de la TB

Le test QuantiFERON®-TB

 Mesure la production d’INF g

– Stimulation in vitro des cellules (sang total)
– Par des antigènes spécifiques de M. tb
• ESAT-6, CFP-10 et TB 7.7
– Mesure par ELISA
 Diagnostique microbiologique

Diagnostique indirecte de la TB

Le test QuantiFERON®-TB
– Enquête autour d’un cas
– A l’embauche des personnels soignants
– Avant mise sous traitement anti-TNF a
– Dans l’aide au diagnostic des tuberculoses extra-pulmonaires
 Temps moyen des différentes étapes du diagnostic bactériologique

Prélèvement
Identification et
Culture positive antibiogramme
Examen direct
(milieu solide) (milieu solide)
(BAAR + ou -)
Milieux
solide
24h 3 à 4 semaines 3 à 4 semaines

Prélèvement

Culture positive
Examen direct
(milieu liquide)
(BAAR + ou -) Antibiogramme
(milieu liquide)
Milieux
liquide 24h 1 à 2 semaines 1 semaine

Identification moléculaire/R Rif à partir des échantillons

Identification moléculaire à partir des cultures

 Conclusion/Perspective

•Pas de test sensible, rapide, simple = Diag TB maladie = centre santé primaire
•Xpert MTB/RIF Ultra : espoir +++
•Culture = indispensable = ATB échec ou forte prévalence de R (coûteux,
technique)
•Test immunologique = PED = espoir de nv tests
•Limite test dépendant des expectorations = rendement bof HIV+/enfant
•Pistes = test sérologique, combinaison Ag, moléculaire …

•Modèle mathématique = test rapide, Se > 85%, Sp> 97% = sauver 400 000
vie/ans PED
•Test diag de la TB + R ATB = impact que si traitement sans délais =
amélioration du systéme de soins dans nb PED