Electrophorèse des protéines sériques

sur gels d’agarose

Lionel BEY
Département Diagnostic SEBIA
23 Octobre 2013
 Principe d’électrophorèse des protéines
sur gel

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+-
+
Cathode --
0 Anode
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Point
d’application
 Systèmes semi-automatiques Sebia

Hydrasys 2

Hydrasys
 HYDRASYS 2

Module de coloration Module de lecture

Module d’application et de Choix de programme

migration (migration et coloration)
Electrophorèse des protéines sériques sur gel
• Les protéines sont séparées en 5 ou 6 fractions (en
fonction de type de gel utilisé).

• Après la coloration, les pistes présentent des bandes, dont

l’intensité correspond à la concentration protéique dans
les fractions

• Pour déterminer l’intensité des bandes il est nécessaire

d’utiliser un système de lecture: un densitomètre/un
scanner (Hyrys 2, scanner à plat couplé au logiciel Phoresis,
Hydrasys 2 scan, Gelscan).
Fractions des protéines sériques
Albumine

: Orosomucoïde, 1 Antitrypsine
: Haptoglobine, Macroglobuline, Lipoprotéine,
Céruloplasmine
: Transferrine, Hémopexine, C3 Complément,
Lipoprotéine
: Immunoglobulines
 Albumine Albumine
Orosomucoïde Orosomucoïde
1 Antitrypsine 1 Antitrypsine
Lipoprotéine 1 Antichymotrypsine Lipoprotéine
1 Antichymotrypsine Haptoglobine Haptoglobine
Céruloplasmine Céruloplasmine
Gc globuline Gc globuline
Transferrine 2 Macroglobuline Transferrine 2 Macroglobuline
Hémopexine Hémopexine
Lipoprotéine Lipoprotéine
C 3 Complément C 3 Complément
Globulines
Globulines
G-A-M-D-E
G-A-M-D-E

Positions des différentes fractions Positions des différentes fractions

sur les gels sur les gels
Hydragel 7 Protéine, Hydragel 7 β1-β2,
Hydragel 15/30 Protéine et Hydragel 15/30 β1-β2 et
Hydragel 54 Protéine Hydragel 54 β1-β2
Comment visualiser et quantifier les protéines?

• Une fois les protéines révélées, le gel peut être analysé:

– À l’œil nu - pour les anomalies qualitatives comme la présence

de bandes additionnelles

– En utilisant des instruments de lecture (densitomètre, scanners)

– pour quantifier les fractions et détecter les anomalies
quantitatives (ces instruments mesurent l’absorbance/intensité
de la coloration pour chacune des fractions)
Lecture de gels colorés avec HYDRASYS 2 SCAN pour
quantifier l’intensité de chaque bande du profil et
obtenir les courbes ELP
Présentation des résultats

Alb 1 2
 Valeurs de référence pour Hydrasys
HYDRAGEL 1 2 Sans standardisation* Avec standardisation*
FRACTIONS HYRYS- PHORESIS HYRYS- PHORESIS
Albumine 59.4-73.9 % 53.5-66.5 %
Alpha -1 1.2-3.1 % 1.4-4.0 %
Alpha-2 7.0-12.2 % 8.0-15.7 %
Beta-1 4.9-9.4 % 5.6-12.1 %
Beta-2 1.6-5.6 % 1.8-7.2 %
gamma 6.9-14.7 % 7.9-18.9 %

HYDRAGEL Protéine Sans standardisation* Avec standardisation*

FRACTIONS HYRYS- PHORESIS HYRYS- PHORESIS
Albumine 59.8-72.4 % 53.8-65.2 %
Alpha -1 1.0-3.2 % 1.1-3.7 %
Alpha-2 7.4-12.6 % 8.5-14.5 %
Beta 7.5-12.9 % 8.6-14.8 %
gamma 8.0-15.8 % 9.2-18.2 %

*: Avec ou sans strandardisation avec les techniques Capillaire/Néphélométrique

 Quantification du pic monoclonal
La quantification du pic monoclonal est nécessaire pour:

 La classification d’une gammapathie (MGUS, myélome indolent

ou myélome symptomatique)

 L’évaluation du stade du myélome symptomatique (stage I, II and

III)

 Pour suivre l’évolution d’une gammapathie maligne ou d’une

gammapathie asymptomatique vers une gammapathie maligne

 Pour évaluer la réponse au traitement

 Quantification du pic monoclonal
 La quantification par néphélométrie ou turbidimétrie:
* La mesure inclut la concentration de la classe entière des Igs
(monoclonale et polyclonales) – inutilisable si la concentration de la
protéine monoclonale est faible par rapport au fond polyclonal
* Surestimation possible dans le cas des protéines monoclonales de forte
concentration

 La quantification du pic sur la courbe d’électrophorèse des protéines:

* Recommandé par les experts
* Quantification plus précise que la quantification par immunochimie
* Requiert: une mesure précise de la concentration totale des protéines
sériques: une mesure précise du pic
 Quantification du pic monoclonal

Patient 1

Quantification de l’Ig
monoclonale
Quantification
Mode ‘’du
du pic sommet à la
monoclonal base ’’
sur Phoresis

Mode ‘’de
vallée à
vallée’’
Impératif: toujours
utiliser le même
mode pour le suivi
des patients
Interprétations des résultats
 Sérum normal

Aspect diffus et absence de bande en gamma

&
Aucune bande additionnelle en bêta et alpha 2
ou intensité plus importante de ces bandes de
manière isolée

Alb 1 2
 Dépistage de pathologies TP, β-
multiples
Alb α-1 α-2 β1 β2 bridge
g/dL

Inflammation aigüe   
Inflammation chronique     
Hypergammaglobulinémie 
Maladie hépatique/Cirrhose   + 
Syndrome néphrotique    
Perte de protéines/malnutrition      
Réactions autoimmunes   
Déficit en Alpha-1-antitrypsine 
Hypogammaglobulinémie  
Anémie hémolytique 
protéines totales, Albumine, zones alpha 1 & 2, zone bêta, zone gamma (gammaglobulines )
Syndrome inflammatoire (inflammation aiguë)

N
ALB
P

A1AT
HPT
ORO

Alb 1 2

Immunofixation n’est pas nécessaire

 Syndrome néphrotique

Alb 1 2

Si le taux de protéines totales est diminuée également, une immunofixation

n’est pas nécessaire
Si par contre le taux de protéines totales est normal, une immunofixation est
recommandée
Profil cirrhotique (bloc bêta-gamma)

Augmentation polyclonale des Ig A

et Ig G

Alb 1 2

Immunofixation n’est pas nécessaire.

Consulter le bilan hépatique du patient
Gammapathie
 Recherche des immunoglobulines monoclonales dans le sérum quand une
gammapathie est suspectée:
*Myélome,
*Waldenström,
* Leucémie lymphoïde chronique, lymphome…

Une protéine monoclonale migre en technique d’électrophorèse comme

une bande homogène est étroite. Elles se présentent généralement sous la
présence une bande supplémentaire au niveau des zones gamma ou bêta
mais également de la zone α2. Dans d’autres cas, elles peuvent générer
une augmentation d’intensité de la bande normale observée en bêta ou
alpha 2 de manière isolée.

Si une telle bande est observée, des tests complémentaires doivent être
réalisés pour caractériser cette immunoglobuline monoclonale
Myélome multiple et immunoglobuline monoclonale
Plasmocyte Immunoglobuline

Plasmocytes normaux

Immunoglobulines normales = immunoglobulines Protéinogramme

polyclonales normal

Plasmocytes malins (Myélome)

Immunoglobulines normales
Protéinogramme montrant un
pic monoclonal

Immunoglobuline monoclonale
Faible immunoglobuline monoclonale
en zone gamma

Alb 1 2

La limite de détection d’une Ig monoclonale est 0,25 à 0,5 g/L

sur SEBIA hydragel proteine
 Albumine

 Bisalbuminémie (double bande de l’albumine), présence

d’une bande élargie ou d’un épaulement sur l’albumine :

– Bisalbuminémie congénitale (héréditaire)

– Bisalbuminémie transitoire (due à une interaction des
molécules de médicament avec l’albumine)
– Bisalbuminémie due à une pancréatite aiguë:
(dégradation de l’albumine par des enzymes
pancréatiques libérés dans le sérum)
Bisalbuminémie
 Bisalbuminémie

Alb 1 2

Immunofixation n’est pas nécessaire

Phénotype Hétérozygote d’A1AT

Mutation du gène alpha 1 anti-trypsine

Alb 1 2

Immunofixation n’est pas nécessaire

 Alpha-2 globulines

 Double bande dans le cas de :

– Echantillon hémolysé (complexes haptoglobine-hémoglobine)
– Phénotypes particuliers d’haptoglobine
– Mobilité atypique des alpha-lipoprotéines
– Présence d’une immunoglobuline monoclonale de mobilité
anodique
 Augmentation dans le cas de :
– Syndrome inflammatoire
– Syndrome néphrotique
– Présence d’un composant monoclonal de mobilité anodique
(chaînes légères libres)
Echantillon hémolysé

Complexe Haptoglobine-Hémoglobine

Alb 1 2

Nouveau prélèvement nécessaire

Immunoglobuline monoclonale en alpha-2

Alb 1 2

Elévation isolée hors contexte inflammatoire

Immunofixation est nécessaire
 Bêta-globulines
 Double bande dans le cas de :
– Echantillon vieilli ou un sérum avec concentration élevée de cholestérol
(LDL a une mobilité modifiée, ce qui provoque le dédoublement de la
fraction bêta)
– Présence d’un composant monoclonal

 Augmentation dans le cas de :

– Obstruction biliaire
– Syndrome néphrotique
– Cirrhose
– Anémie ferriprive
– Présence d’un composant monoclonal
– Hyperlipoproteinémie
– Hémolyse important (présence d’hémoglobine libre)
Bêta lipoprotéines
Immunoglobuline monoclonale en bêta

Alb 1 2

Elévation isolée hors anémie ferriprive

Immunofixation est nécessaire
 Gamma-globulines
Hypogammaglobulinémie
 Diminution dans le cas de :
– Immunodéficience primaire ou secondaire (traitement
immunosuppresseur, corticoïdes, chimio/radiotherapie )
– Myélome à chaînes légères ou myélome non sécrétant
– Physiologique chez le nouveau-né

Hypergammaglobulinémie
 Augmentation polyclonale des immunoglobulines en zone
gamma
- Inflammation
- Cirrhose
- Infections aiguës et chroniques
 Gamma-globulines

Bande(s) surnuméraire(s) :
– Immunoglobuline monoclonale
– Profil oligoclonal
– Présence du fibrinogène (échantillon de plasma)
Hypergammaglobulinémie

Augmentation du fond polyclonal en

gamma

Alb 1 2

Immunofixation n’est pas nécessaire

Immunoglobuline monoclonale importante
en gamma

Alb 1 2

Immunofixation est nécessaire

Faible immunoglobuline monoclonale
en gamma

Alb 1 2

Immunofixation est nécessaire

Gammapathie biclonale (deux pics monoclonaux)

Alb 1 2

Immunofixation est nécessaire

Présence de fibrinogène (plasma ou un sérum
d’un patient sous anti-coagulants)

Fibrinogène

Fibrinogène

Alb 1 2
Immunofixation est nécessaire ou
traitement à l’éthanol 10%
 Hypogammaglobulinémie sans autre
anomalie monoclonale visible

Pas d’anomalie visible en alpha 2 ou

bêta

Alb 1 2

Si les causes de cette hypogammaglobulinémie ne sont pas connues,

faire la recherche de protéine de Bence Jones dans les urines
 Profil oligoclonal en gamma
Le Profil oligoclonal : Présence de plusieures bandes étroites
homogènes (d’habitude de faible intensité) en gamma.
Il est dû à l’augmentation de plusieurs sous classes d’immunoglobulines,
donnant un aspect de bandes monoclonales multiples appelé “ profil
oligoclonal” ou “bandes oligoclonales”.

Ce profil est observé au cours des :

- maladies auto-immunes (arthrite rhumatoïde, syndrome de Gougerot-
Sjögren, lupus érythémateux)
- maladies infectieuses (virales, bactériennes et parasitaires)
- H.I.V.
- hépatites virales
- infection à cytomégalovirus
- réactions auto-immunes chez les transplantés et les patients sous
traitement immunosuppresseur.
Profil oligoclonal en gamma

Alb 1 2

Immunofixation est nécessaire

 En résumé
 Le tracé électrophorétique doit être analysé en termes des anomalies
qualitatives et/ou quantitatives :
* Zones augmentées
* Zones diminuées
* Présence des bandes surnuméraires, bandes trop larges / d’un aspect
inhabituel

 L’analyse qualitative est réalisée visuellement, en inspectant attentivement le

gel (la vision humaine est plus résolutive qu’un système de lecture → il est
plus facile de trouver une discrète condensation en gamma ou un aspect un
peu inhabituel d’une bande en bêta à l’œil qu’en regardant la courbe
densitométrique)

 L’analyse quantitative (augmentation ou diminution des zones) est réalisée à

partir de la courbe densitométrique
 En résumé
Informations à considérer pour interprétation:
* Vue globale du tracé électrophorétique

* Couleur et aspect du sérum

* Concentration des protides totaux

* Age du patient. Un patient de plus de 45 ans a plus de probabilité

d’avoir une bande monoclonale qu’un patient plus jeune

* Informations cliniques, si disponibles: douleurs osseuses, perte du

poids, anémie, VS augmentée, hypercalcémie….
Les tracés ne nécessitant pas
d’immunofixation
• Profil normal
• Profil inflammatoire
• Profil néphrotique
• Dédoublement des alpha-1
• Dédoublement des alpha-2
• Dédoublement et/ou augmentation
des alpha-2 dans le cadre d’hémolyse
• Bisalbuminémie
• Bloc bêta-gamma
• Une bande surnuméraire en bêta-1 si
elle a un aspect typique de
bêta-lipoprotéines (bande très
focalisée, en « moustache »)
• Patient connu (si la position de la
migration de la bande ne change pas et
s’il n y a pas d’apparitions de bandes
supplémentaires)
Les tracés nécessitant une analyse
complémentaire par immunofixation
• Bande ou condensation en zone gamma
• Aspect inhabituel des fractions bêta
(bêta-1 ou bêta-2): dédoublement; bande
plus large que d’habitude; bande « floue »
• Augmentation isolée des bêta-1 (hors
contexte d’anémie ferriprive)
• Augmentation isolée des bêta-2 (bêta2 >
bêta1)
• Hypogamma avec/sans bande visible
• Patient avec une antériorité de pic
monoclonal + absence d’anomalie sur le
tracé du jour
• Protéine de Bence Jones dans les urines +
pas d’évidence de protéine monoclonale
dans le sérum
• Augmentation isolée des alpha-2 (hors
contexte inflammatoire et néphrotique),
surtout si associée à une hypogamma
Causes d’erreurs
Echantillons en surcharge (la chambre humide n’a pas été
utilisée) ou
Echantillons vieillis (conservés plus d’une semaine à 4 C)

Bêta-lipoprotéines
Position 1: la membrane a été endommagée

Ne pas toucher la membrane des puits au moment de

dépôt des échantillons sur l’applicateur, pour ne pas la
trouer.
 Goutte de sérum est tombé sur gel

Placer l’applicateur sur le chariot

avec précaution, éviter les
mouvements brusques
 Mauvaise reconstitution du colorant

15 mL du diluant au lieu de 60 mL Diluant oublié

Reconstitution et utilisation du colorant
Solution de lavage a été utilisée au lieu du
décolorant
 Gels gelés

Respecter les conditions de stockage

 Migrations courtes:
déshydratation des mèches / du gel ou problème
de réglage du chariot

Vérifier systématiquement l’absence d’un excès de liquide dans les sachets des
mèches et du gel;
Respecter les conditions du stockage (à plat, à l’abri de toute source de chaleur);
Si le problème persiste – contacter le service SAV
Encore quelques cas pour
s’entraîner
 Profil normal

Hydragel Protein(e)

Alb 1 2

Immunofixation n’est pas nécessaire

Bande monoclonale en gamma

Hydragel Protein(e)

Alb 1 2

IF est nécessaire
 Inflammation chronique;
Hypergammaglobuminémie

Hydragel β1- β2

Alb 1 2 1 2

Immunofixation n’est pas nécessaire

 Hypergammaglobulinémie avec discrètes
bandes sous-jacentes

Hydragel β1- β2

Alb 1 2 1 2
Si les discrètes bandes sont visibles sur le fond polyclonal, une IF pourra
être réalisée. Une fois les anomalies caractérisées, refaire l’électrophorèse à
distance dans 3 à 6 mois pour voir la persistance en l’absence
d’hypergammaglobulinémie
 1. Inflammation chronique
2. Profil oligoclonal/gammapathie biclonale/
immunoglobuline monoclonale polymérisée?

Hydragel β1- β2

Alb 1 2 1 2

- IF est nécessaire afin de distinguer la situation si contexte de gammapathie

possible
- Alternative: refaire l’électrophorèse à distance (3 à 6 mois) de
l’épisode inflammatoire
Bloc bêta2-gamma + discrète déformation en gamma

Hydragel β1- β2

Alb 1 2 1 2

- Si une discrète bande focalisée est visible, réaliser une IF.

- Dans d’autres cas, vérifier le bilan hépatique et refaire l’électrophorèse à
distance, dans 3 à 6 mois pour suivi de l’évolution
1. Profil inflammatoire +hypogammaglobulinémie
2. Discrète bande monoclonale en gamma plus
visible sur le gel directement

Hydragel
Protein(e)

Alb 1 2
IF est nécessaire
1. Hypogammaglobulinémie
2. Recherche une éventuelle anomalie sur les autres
fractions: on note une élévation quantitative dans les
fractions bêta et alpha 2

Hydragel Protein(e)

Alb 1 2
IF est nécessaire pour investiger une éventuelle anomalie monoclonale en
bêta ou alpha 2 . En cas d’absence d’anomalie monoclonale, voir un
possible contexte d’élévation des lipoprotéines sur ces fractions
 Augmentation isolée des alpha-2 +
élargissement de la fraction bêta 1

Hydragel β1- β2

Alb 1 2 1 2
La forme particulière en bêta 1 indique la présence de bêta-lipoprotéines.
Pour statuer sur les alpha 2, un dosage des alpha-lipoprotéines est à
recommander. Si les alpha-lipoprotéines ne sont pas en cause, réaliser
une immunofixation
1. Bande surnuméraire en bêta1 avec un aspect typique
des lipoprotéines (très focalisée, en « moustache »

Hydragel β1- β2

Alb 1 2 1 2

Echantillon vieilli / lipémique?

Immunofixation n’est pas nécessaire
1. Protéine monoclonale en bêta
2. Hypogammaglobulinémie et une discrète bande
monoclonale en gamma

Hydragel Protein(e)

Alb 1 2

IF est nécessaire
Bande monoclonale en bêta-2 dans un
contexte hypogammaglobulinémie

Hydragel β1- β2

Alb 1 2

IF est nécessaire
1. Profil inflammatoire
2. Bande monoclonale supplémentaire en bêta-2
associée à une hypogammaglobulinémie

Hydragel β1- β2

Alb 1 2

IF est nécessaire
Merci de votre attention!