Fadila Boulahbal, Mohamed Tazir et

Djamel Yala
Leila Slim

Bactériologie de la
tuberculose
 Entête pédagogique du
module

Objectifs pédagogiques
1. Envoyer au laboratoire de microscopie, ou au laboratoire de culture, les
prélèvements d'expectoration d'un malade suspect de tuberculose, en respectant les
règles d'hygiène et de sécurité
2. Décrire l'aspect morphologique du bacille de la tuberculose au microscope, après
coloration(s) appropriée(s), et quantifier les résultats de l'examen microscopique
3. Décrire les caractéristiques macroscopiques des colonies de Mycobacterium
tuberculosis en culture, les différenciant des autres mycobactéries et des
contaminations.
4. Enumérer les indications des tests de sensibilité aux antibiotiques des souches de M.
tuberculosis.
 Table des matières

Préambule. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Chapitre I. Diagnostic bactériologique de la tuberculose -

Théorie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Introduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Partie A. Théorie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1. Caractéristiques des bacilles tuberculeux. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Chapitre II. Diagnostic bactériologique de la tuberculose -

Objectif 1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Partie A. Transmettre au laboratoire les prélèvements d'expectoration d'un
malade suspect. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
8
Préambule. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1. Les crachats. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2. Fiche de renseignements. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3. Conservation des prélèvements. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
4. Transport des prélèvements. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
5. Enregistrement. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
6. Recommandations sur les mesures de sécurité pour éviter les
contaminations du personnel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Chapitre III. Diagnostic bactériologique de la tuberculose -

Objectif 2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Partie A. Décrire l'aspect du bacille de la tuberculose et quantifier les
résultats de l'examen microscopique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1. Confection du frottis à partir du prélèvement. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2. Fixation du frottis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3. Coloration du frottis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4. Lecture au microscope. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
 Table des matières 4

Chapitre IV. Diagnostic bactériologique de la tuberculose -

Objectif 3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Partie A. Décrire les caractéristiques macroscopiques des colonies de
Mycobacterium tuberculosis en culture. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Préambule. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1. Mise en culture des échantillons d’expectoration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2. Méthode de préparation des prélèvements - Introduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3. La décontamination. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4. La centrifugation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
5. Ensemencement. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
6. Incubation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
7. Lecture. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
8. Identification des colonies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
9. Expression des résultats. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
10. Autres méthodes de culture. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
11. Autres techniques de diagnostic. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Chapitre V. Diagnostic bactériologique de la tuberculose -

Objectif 4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Partie A. Donner les indications des tests de sensibilité aux
antituberculeux. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Préambule. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1. Mise en évidence de la résistance aux antituberculeux. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2. Les indications du test de sensibilité. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Exercice récapitulatif I. Cas clinique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

Questionnaire à choix multiples. Contrôlez vous-même vos

connaissances. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

Si vous voulez en savoir plus, vous pouvez lire.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Corrigés des exercices. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Corrigés des QCM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Bibliographie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Documents à consulter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
 Préambule

Préambule
La tuberculose est une maladie infectieuse et transmissible d’homme à homme due à
Mycobacterium tuberculosis. Sa principale localisation est pulmonaire, c’est la seule
forme contagieuse : c’est à partir des lésions pulmonaires que les bacilles sont
disséminés dans l’entourage du malade.
Les localisations extra pulmonaires moins fréquentes, sont des conséquences plus ou
moins lointaines de la primo infection : elles ne sont pas contagieuses.
Le diagnostic bactériologique de la tuberculose repose sur l'examen en microscopie et
la culture des prélèvements pathologiques. La culture des bacilles permet, si
nécessaire, de mesurer leur sensibilité aux antibiotiques.
 Chapitre

I
Diagnostic
bactériologique de
la tuberculose -
Théorie

Introduction
La tuberculose est une maladie infectieuse et contagieuse secondaire à la
multiplication de bactéries appartenant à la famille des mycobactéries. La principale
espèce responsable de tuberculose chez l’homme est Mycobacterium tuberculosis,
isolé par Robert KOCH en 1882 ( d’ou son acronyme de BK). Vous entendrez parler
parfois de deux autres espèces pathogènes pouvant être elles aussi responsables de
tuberculose chez l’homme mais avec une fréquence beaucoup plus faible :
Mycobacterium bovis, agent de la tuberculose chez les bovidés et autres animaux
domestiques ou sauvages, mais qui peut se transmettre à l’homme et Mycobacterium
africanum, isolée de cas de tuberculose en Afrique subsaharienne de l’Ouest et qui a la
particularité de présenter souvent une résistance à la thiacétazone. Avec
Mycobacterium microti, agent de la tuberculose chez le mulot exceptionnellement
rencontré chez l’homme, toutes ces espèces constituent le « Complexe tuberculosis ».
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Théorie 7

A côté des mycobactéries du complexe tuberculosis, toutes considérées comme

pathogènes, la famille des mycobactéries comprend des espèces pathogènes
opportunistes, c’est à dire qu’elles ne manifestent leur capacité de créer des lésions que
si le terrain est favorable à une multiplication intense de la bactérie :
immunodépression (infection par le VIH, traitement immunosuppresseur, dénutrition,
poumon délabré avec lésions multiples favorisant la greffe d’agents microbiens de
l’environnement).
D’autres mycobactéries de l’environnement n’ont jamais encore été décrites comme
responsables d’un tableau clinique est sont considérées pour le moment comme des
mycobactéries atypiques dénuées de tout pouvoir pathogène. Lorsqu’elles sont isolées
sur les milieux de culture de prélèvement pathologiques, elles sont considérées comme
contaminant de laboratoire.

Partie A. Théorie

1. Caractéristiques des bacilles tuberculeux

Les mycobactéries du complexe tuberculosis ont des caractères qui permettent de les
classer dans la famille des mycobactéries : ce sont des bactéries aérobie strict exigeant
une pression partielle d’oxygène proche de celle de l’air. La structure chimique de la
paroi des mycobactéries est très caractéristique du fait de sa forte richesse en lipide ce
qui lui confère de nombreux caractères dont l’acido-alcoolo résistance.
L’acido-alcoolo résistance de la paroi explique pourquoi les mycobactéries sont très
mal colorées par les colorants usuels des bactéries comme dans la coloration de gram,
mais elles fixent fortement les colorants basiques comme la fuchsine de Ziehl (
fuchsine phéniquée) et la décoloration successive par l’acide sulfurique dilué au ¼ et
par l’alcool pendant un temps déterminé n’arrive pas à détacher la fuchsine. La
bactérie reste rouge après l’effet de cette décoloration. L’acido-alcoolo résistance est
un caractère commun à toutes les mycobactéries. On parle alors de Bacilles Acido
Alcoolo Résistants ou BAAR.
Les mycobactéries responsables de tuberculose sont des espèces à multiplication lente
(un doublement de la population par 24 heures), exigeantes quant à leurs conditions de
culture (pH 6,8 à 7, température d’incubation 35-38°C, milieu riche en oxygène).

Ce qu’il faut retenir

♦ L’acido-alcoolo-résistance étant un caractère spécifique des mycobactéries,
toutes les techniques de coloration pratiquées pour le diagnostic
microscopique sont basées sur la mise en évidence de ce caractère.
♦ La mise en évidence de bactéries acido-alcoolo résistance ne signifie pas
automatiquement que les bactéries vues au microscope sont des bacilles de la
tuberculose.
♦ Mais, en zone d’endémie de tuberculose et si le tableau clinique est très
évocateur de tuberculose, la découverte de bacilles acido-alcoolo résistants
équivaut à « présence de mycobacterium tuberculosis » et signe le diagnostic
de tuberculose.
 Chapitre

II
Diagnostic
bactériologique de
la tuberculose -
Objectif 1

Partie A. Transmettre au laboratoire les

prélèvements d'expectoration d'un malade suspect
Transmettre au laboratoire de microscopie, ou au laboratoire de culture les plus
proches, les prélèvements d'expectoration d'un malade suspect, en respectant les règles
d'hygiène et de sécurité.
Préambule
Le diagnostic bactériologique de la tuberculose passe par l’exécution des tâches
suivantes:
♦ Recueillir un bon prélèvement
♦ Conserver et transporter correctement les prélèvements
♦ Reconnaître et quantifier les bacilles sur les frottis positifs à l'examen microscopique
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 1 9

La mise en évidence du bacille de la tuberculose sur les étalements sur lame de

prélèvements pathologiques est extrêmement importante pour déterminer s’il s’agit ou
non de cas contagieux de tuberculose. De la qualité du prélèvement et des soins que
l’on apporte dans sa conservation et son transport au laboratoire dépend la qualité du
résultat de l’examen bactériologique. En dehors des prélèvements d’origine
pulmonaire comme les crachats, les liquides de tubage gastrique ou les liquides de
lavage broncho alvéolaire, une variété d’échantillons cliniques peut être envoyée au
laboratoire pour la recherche de bacilles de la tuberculose.
Les prélèvements d'origine pulmonaire
Ils comprennent:
♦ Les crachats
♦ Les tubages gastriques
♦ Les aspirations ou lavages bronchiques

Les prélèvements d’origine extra-pulmonaire

Représentés essentiellement par les liquides pleuraux et autres séreuses, les pus
d’adénopathie superficielle, les urines, des biopsies de lésions osseuses, parfois de
liquide céphalo rachidien et autres prélèvements divers.

1. Les crachats
Sont les prélèvements les plus fréquemment reçus au laboratoire. Chez un malade
suspect de tuberculose pulmonaire il convient, chaque fois que possible, de faire trois
(3) prélèvements.
Après la consultation médicale, le premier échantillon (appelé «échantillon sur place»)
est recueilli sous la supervision de l’infirmier; celui-ci doit expliquer au patient que
l’expectoration doit se faire après un effort de toux profond et vigoureux afin de
ramener des mucosités bronchiques.
L’infirmier doit confier un deuxième crachoir, et demander au malade de recueillir un
deuxième prélèvement le lendemain matin au lever (appelé échantillon matinal). Cet
échantillon doit être ramené le plus rapidement possible au laboratoire. Un troisième
prélèvement est fait sur place de la même manière que le premier prélèvement.
Cas des liquides de tubage gastrique et lavage broncho alvéolaire
♦ Pour certains malades qui ne peuvent pas ou ne savent pas cracher (femmes et
enfants) le tubage gastrique est indiqué et pratiqué en milieu hospitalier. Il permet
de recueillir les mucosités bronchiques dégluties pendant le sommeil, donc il doit
être fait le matin au réveil avant que les contractions de l’estomac n’en aient chassé
le contenu.
♦ Une autre technique l’aspiration ou lavage bronchique consiste à aspirer au cours
d’une bronchoscopie les sécrétions bronchiques. Elle ne peut être pratiquée que sur
des malades hospitalisés et en milieu spécialisé.
Ces deux types de prélèvements seront centrifugés et le culot sera traité comme le
crachat.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 1 10

Ce qu'il faut retenir

La répétition des prélèvements pour l’examen microscopique augmente les chances
d’avoir au moins un résultat positif. Il est recommandé de faire au moins trois
échantillons successifs chez un malade suspect de tuberculose pulmonaire pour
établir le diagnostic de tuberculose. Il est également souhaité d’avoir au moins
deux résultats positifs sur les prélèvements successifs pour commencer le
traitement antituberculeux.

2. Fiche de renseignements
Tout prélèvement doit être accompagné d’une fiche de renseignement indiquant
l’identité du malade, son âge et son adresse, la nature de l’affection, la date de début
de la maladie, et la date des prélèvements, la nature et la durée du traitement
antituberculeux reçu éventuellement avant le prélèvement. Elle doit faire figurer le
nom du médecin traitant et celui du service ou unité clinique de prise en charge.

3. Conservation des prélèvements

Les prélèvements d’origine pulmonaire sont contaminés par les germes qui pullulent
normalement dans le rhino-pharynx et la bouche, et ce, quel que soit les précautions
prises pour les recueillir aseptiquement,. Il faut acheminer autant que faire se peut le
crachat au laboratoire dans les deux heures qui suivent le prélèvement. S’il n’est pas
possible de le faire le jour même, et pour éviter la multiplication de germes de la flore
normale qui risquent de nuire à la qualité du prélèvement, les échantillons doivent être
conservés.
♦ au froid à +4°C (réfrigérateur) sans toutefois dépasser 7 jours en attendant leur
transport.
♦ Ou ajouter au crachat un volume égal de solution de bromure ou chlorure de cétyl
pyridinium à 1%.

4. Transport des prélèvements

Le transport doit être fait dans une boite réservée à cet effet contenant des portoirs
alvéolés dans lesquels s’encastreraient les crachoirs et si nécessaire, un « Ice Box »
pour garder les échantillons au froid. Les crachoirs opaques à la lumière,
hermétiquement fermés et soigneusement étiquetés sont placés dans la boîte.
L’étiquette doit porter le nom et le prénom du malade, le numéro d’enregistrement au
centre de diagnostic et le nom du service demandeur. L’étiquette doit être collée sur le
corps du crachoir et jamais sur le couvercle.
Les fiches de renseignements accompagnant les prélèvements sont mises dans une
enveloppe qui sera confiée au transporteur ou fixée à l’extérieur de la boîte.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 1 11

Les prélèvements sont acheminés vers le laboratoire de microscopie le plus proche

s’ils ne sont destinés qu’à un examen microscopique ou au laboratoire de microscopie
et de culture si l’on souhaite un isolement des mycobactéries sur milieu de culture.
Le réseau de laboratoire pour le soutien au programme de lutte contre la
tuberculose
Le programme national de lutte contre la tuberculose doit, pour le contrôle de la
tuberculose dans le pays, organiser un réseau de laboratoires de diagnostic et de
surveillance de la maladie. Le réseau comprend
♦ des laboratoires de microscopie, situé au niveau du district, dans une polyclinique,
un centre de contrôle des maladies respiratoires ou dans un hôpital de district
couvrant une population d’environ 100 000 habitants ;
♦ des laboratoires capables de faire les deux techniques de diagnostic, microscopie et
culture.

Ce dernier type de laboratoire est généralement situé dans un hôpital ou un laboratoire

polyvalent de chef lieu de province ou de wilaya. Pour répondre correctement à ses
objectifs le laboratoire de culture doit couvrir une population moyenne de 1 million
d’habitants. Les laboratoires de microscopie et les laboratoires de culture doivent être
régulièrement répartis pour être facilement accessibles à la population. Le laboratoire
du plus haut niveau, Laboratoire National de Référence ou laboratoire de région, doit
pratiquer toutes les techniques de diagnostic ainsi que les tests de sensibilité et prendre
en charge la formation, la standardisation et le contrôle de qualité de l’ensemble du
réseau.

5. Enregistrement
Tous les prélèvements qui arrivent au laboratoire sont enregistrés sur le registre du
laboratoire réservé au diagnostic bactériologique de la tuberculose.

6. Recommandations sur les mesures de sécurité pour

éviter les contaminations du personnel
Le laboratoire est reconnu comme un lieu de travail où le personnel est
particulièrement exposé à la contamination par le bacille de la tuberculose. Toutes les
précautions doivent être prises pour éviter cela. Les recommandations essentielles sont
les listées ci-dessous.
♦ Il est Interdit de manger, boire et fumer dans les locaux techniques du laboratoire.
♦ Le lavage des mains doit être fréquent, surtout après chaque manipulation de
produit contaminé.
♦ Le port de gants de protection à usage unique est indispensable en cas d’érosions
ou de blessures cutanées des mains.
♦ Le port de la blouse est obligatoire au laboratoire.
♦ Le nettoyage du laboratoire se fait toujours à l’eau, jamais au balai.
♦ Eviter les courants d’air lors de la manipulation des échantillons au laboratoire.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 1 12

♦ Exécuter les manipulations de produits contaminés sous la protection d’une hotte

aspirante surtout pour la mise en culture des prélèvement ou la préparation des tests
de sensibilité.
♦ Utiliser des poires en caoutchouc ou des « pipetboy » pour l’aspiration de liquide
contenant des bacilles tuberculeux, ne jamais aspirer directement avec la bouche.
♦ Les conteneurs de la centrifugeuse qui reçoivent les flacons à centrifuger pour la
culture doivent être munis d’un couvercle protecteur pour éviter la dissémination
dans l’air des bacilles au cours de la centrifugation.
♦ L’agitateur utilisé pour la décontamination doit être placé sous la hotte pour la
même raison que précédemment.
♦ Si possible, centrifugeuse et agitateur devraient être placés dans un local séparé,
ventilé et éventuellement muni de lampes à U.V.
♦ Evacuer les déchets contaminés seulement après leur décontamination dans un
autoclave. Si cet appareil n’est pas disponible, il faut les incinérer dans un
incinérateur ou les brûler dans un endroit réservé à cet effet.
♦ Désinfecter les surfaces de travail à l’aide d’un produit antiseptique disponible sur
le marché local : l’eau de javel à 6% en respectant un temps de contact d’au moins
10 minutes.
♦ Toute personne fréquentant le laboratoire doit être informée sur les risques de
contamination et sur les mesures de protection de sa propre personne ainsi que de
la collectivité.
 Chapitre

III
Diagnostic
bactériologique de
la tuberculose -
Objectif 2

Partie A. Décrire l'aspect du bacille de la

tuberculose et quantifier les résultats de l'examen
microscopique
Décrire l'aspect morphologique du bacille de la tuberculose au microscope, après
coloration(s) appropriée(s), et quantifier les résultats de l'examen microscopique.
1. Confection du frottis à partir du prélèvement
Utiliser une lame neuve préalablement dégraissée (24 heures dans un mélange
acide-alcool - voir annexe 1) et séchée. Le numéro attribué au malade sur le registre du
laboratoire doit être inscrit, à l’aide d’un graveur sur verre, sur une extrémité de la
lame.
A partir du prélèvement; on choisit une parcelle muco-purulente voire hémorragique à
l’aide d’une anse de platine qu’on étale sur la lame. L’étalement se fait par
mouvements circulaires sur environ 2 cm de long et 1 cm de large. Le frottis doit être
séché à l’air, à l’abri de la poussière et des insectes.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 2 14

2. Fixation du frottis
Il peut se faire de deux façons :
♦ à la chaleur : par 3 passages rapides de la lame au dessus de la flamme d’un bec
bunsen
♦ à l’alcool : recouvrir la lame, rejeter le surplus et flamber.

3. Coloration du frottis
Il existe plusieurs méthodes de coloration du bacille de la tuberculose. Il est important
que la méthode choisie soit standardisée au niveau du pays. Les colorations les plus
couramment utilisées sont la coloration de Ziehl Neelsen pour examen au microscope
à lumière blanche et la coloration à l’auramine pour examen au microscope à
fluorescence.
Coloration de Ziehl-Neelsen pour examen au microscope à lumière blanche
Le frottis fixé est recouvert de fuchsine phéniquée dite de Ziehl, puis chauffée une
première fois jusqu’à émission de vapeur. Laisser agir deux minutes. Répéter le
chauffage encore deux fois toutes les deux minutes. Jeter la fuchsine, laver à l’eau et
passer à la phase de décoloration avec l’acide à 25% , laisser agir 10 minutes, puis à
l’alcool, laisser agir 15 minutes. Laver à l’eau entre chaque décoloration. Le frottis
doit être presque complètement décoloré. Le frottis est recoloré avec la solution de
bleu de méthylène pou pendant 30 secondes. Laver à l’eau, laisser sécher
complètement sans laisser de trace d’eau. Au microscope, les bacilles acido-alcoolo
résistants vont apparaître rouge (couleur de la fuchsine persistante malgré l’action
décolorante de l’acide et de l’alcool) sur le fond bleu donné par le bleu de méthylène,
d’où le nom de bacille acido-alcoolo résistant ou BAAR.
La décoloration successive par l’acide et l’alcool peut être remplacée là où l’alcool
n’est pas disponible facilement, par une seule étape de décoloration par l’acide
sulfurique au ¼ en prolongeant d’une à deux minutes le temps de contact.
Coloration à l’auramine pour examen au microscope à fluorescence
Le principe de la coloration est le même que celui de la coloration par la méthode de
Ziehl Neelsen. La fuchsine est remplacée par la solution d’auramine qui couvre le
frottis durant 10 minutes à froid. Le frottis est décoloré par une solution d’acide-
alcool, on lave , puis le fond est recoloré par un colorant qui peut-être une solution de
rouge thiazine ou une solution de permanganate de potassium.
Le frottis rincé et séché, est examiné au microscope à fluorescence dotée d’une
ampoule à rayonnement riche en lumière bleu capable d’exciter la fluorescence de
l’auramine, avec un objectif de faible grossissement X25 ou X40.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 2 15

Les bacilles acido alcoolo résistants ayant fixé l’auramine vont émettre sous l’effet de
la lumière excitatrice une lumière jaune fluorescente. La sensibilité et la spécificité de
l’examen par fluorescence sont comparables à celles de la coloration de Ziehl Neelsen.
Le principal avantage est la facilité et la rapidité de la lecture : la surface de lame qui
nécessite 10 minutes de lecture au microscope optique est lue en 2 minutes avec le
microscope à fluorescence
Mais cette technique nécessite :
♦ un microscope beaucoup plus coûteux dans son acquisition comme dans son
fonctionnement : les ampoules spéciales sont coûteuses et doivent être renouvelées
toutes les 200 heures d’utilisation.
♦ Un technicien sérieusement formé à l’examen et à l’interprétation des images
observées au microscope (les artéfacts fluorescents qui peuvent prêter à confusion
sont à distinguer des images de BAAR).

Pour toutes ces raisons, l’utilisation de la microscopie en fluorescence ne devient utile

et rentable que si l’on dispose d’un technicien bien formé et si le nombre de lames à
lire dans une journée de travail dépasse les 30 lames pour un technicien.

4. Lecture au microscope
A l’examen au microscope à lumière blanche, avec l’objectif X100 et après avoir
déposé une goutte d’huile à immersion sur le frottis, les bacilles apparaissent comme
des bâtonnets rouges droits ou légèrement incurvés, plus ou moins granuleux, isolés ou
en petits amas se détachant nettement sur le fond bleu de la préparation.
La lecture doit se faire méthodiquement en commençant par le point où la goutte
d’huile a été déposée. Dès que les détails du frottis apparaissent clairement, la mise au
point est obtenue, on commence alors à examiner la surface du champ en allant de la
périphérie vers le centre puis on passe à un second champs en faisant tourner la vis qui
mobilise le chariot. La vis micrométrique sert à maintenir la mise au point au cours de
l’examen des champs.
Expression des résultats
Les bacilles acido alcoolo résistants découverts en cours d’examen sont décomptés sur
100 champs observés (environ une longueur d’un frottis de 2cm sur 1cm). Le nombre
de bacilles présents dans l’expectoration d’un malade est en relation directe avec son
degré de contagiosité, le résultat doit être rendu en nombre de bacilles vus sur 100
champs microscopiques observés. Le code suivant, proposé par l’ UICTMR est
généralement utilisé.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 2 16

Code de lecture de frottis colorés par la méthode de Ziehl-Neelsen

Richesse du frottis en nombre de BAAR Code
Pas de BAAR sur 100 champs 0
1à 9 BAAR sur 100 champs Nombre exact de BAAR
10 à 99 sur 100 champs +
1 à 10 par champ ++
Plus de 10 BAAR par champ +++
TAB. 1

Code de lecture de frottis examinés en fluorescence

La surface du champ examinée au microscope à fluorescence est 16 fois plus grande
que celle examinée au Ziehl. Il est alors possible d’examiner pendant la même durée
de lecture une surface beaucoup plus étendue en fluorescence. Les résultats sont alors
exprimés différemment. Le code suivant est généralement utilisé:
Richesse du frottis en nombre de BAAR Code
Pas de BAAR sur 100 champs 0
1à 10 BAAR sur toute la lame Résultat douteux, faire un Ziehl
Moins de 1 BAAR par champ, mais plus de 10
+
sur la lame.
1 à 9 par champ ++
Plus de 10 BAAR par champ +++
TAB. 2

Ce qu'il faut retenir

L’examen microscopique d’un prélèvement n’est positif que s’il contient un
nombre suffisant de bacilles. On estime que le produit pathologique doit contenir
au moins 10 000 bacilles par ml pour être positif à l’examen microscopique. Une
telle richesse bacillaire n’est atteinte que dans les lésions pulmonaires cavitaires.
C’est cela qui explique d’une part, qu’un examen microscopique positif signe la
haute contagiosité du cas diagnostiqué et d’autre part, que l’examen microscopique
fait régulièrement au cours du traitement permet de suivre l’évolution de la
tuberculose : une diminution de la richesse des frottis et leur négativation est un
signe de bonne évolution.

Attention
Le microscope est l’outil principal de travail pour le diagnostic de la tuberculose
dans les pays à haute prévalence. Il coûte relativement cher, et il est de
maintenance difficile. Pour ces raisons, son entretien en bon état de marche est
primordial. Il doit être préservé de la poussière en restant couvert d’un cache
tout le temps où il n’est pas en marche, toute trace d’huile à immersion déposée
sur le chariot et sur la lentille de l’objectif doit éliminée à la fin de chaque
séance de lecture à l’aide d’un chiffon propre.
 Chapitre

IV
Diagnostic
bactériologique de
la tuberculose -
Objectif 3

Partie A. Décrire les caractéristiques

macroscopiques des colonies de Mycobacterium
tuberculosis en culture
Décrire les caractéristiques macroscopiques des colonies de Mycobacterium
tuberculosis en culture, les différenciant des autres mycobactéries et des
contaminations
Préambule
La mise en culture des prélèvements pathologiques est la deuxième méthode de
diagnostic de la tuberculose. Elle permet l’isolement des bacilles, leur identification et
éventuellement l’étude de leur sensibilité aux antituberculeux. C’est une méthode de
très haute spécificité qui fait qu’elle reste encore la méthode de référence ou « Gold
Standard » face aux techniques plus modernes et plus sophistiquées comme les
techniques de diagnostic par la biologie moléculaire.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 3 18

La technique demande, comparativement à la microscopie,

♦ plus de matériel coûteux et lourd comme la centrifugeuse, l’incubateur et la hotte de
protection du personnel au cours de la manipulation
♦ une plus grande compétence du technicien pour la préparation des échantillons à
mettre en culture, pour la lecture et l’interprétation des résultats

1. Mise en culture des échantillons d’expectoration

L’expectoration est un prélèvement contaminé naturellement par les germes de la flore
normale du pharynx et de la bouche. L’isolement des bacilles tuberculeux en culture
nécessite une décontamination obligatoire de l’expectoration, c’est à dire l’élimination
des germes de la flore qui, se multipliant très rapidement, vont consommer le milieu de
culture et modifier le pH, inhibant ainsi la croissance de M. tuberculosis.

2. Méthode de préparation des prélèvements - Introduction

La méthode de préparation des prélèvements se constitue des phases suivantes:
♦ la décontamination
♦ la centrifugation
♦ l' ensemencement
♦ l' incubation
♦ la lecture
♦ l' identification des colonies
♦ l' expression des résultats

3. La décontamination
La plupart des produits pathologiques, à l’exception des échantillons qui viennent de
lésions fermées (séreuses, articulation, prélèvements de biopsie faites en milieu
chirurgical) doivent être décontaminés avant ensemencement. Les antiseptiques
comme la soude diluée permet de détruire les contaminants et préserver le bacille
tuberculeux relativement plus résistant. La solution de soude (NaOH à 4%) est
rajoutée en volume égal à celui du prélèvement. Le mélange est agité pendant une
durée bien déterminée pour permettre à la soude d’entrer en contact avec les germes et
les neutraliser.

4. La centrifugation
Le produit pathologique est ensuite ramené à pH neutre par adjonction d’acide puis
centrifugé pour concentrer les bacilles tuberculeux.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 3 19

5. Ensemencement
Eliminer le surnageant, le culot de centrifugation est ensemencé sur au moins deux
tubes de milieu de Löwenstein Jensen. Le milieu de L.J et ses variantes (milieu de
Coletsos, milieu au pyruvate de sodium) est le plus couramment utilisé pour la culture
des mycobactéries. C’est un milieu solide à base d’œufs, coagulé à l’autoclave. Il est
de couleur vert pomme fortement tamponné pour permettre la stabilité du pH.

6. Incubation
Les tubes ensemencés sont mis à l’étuve à 37°C pendant 4 à 12 semaines. Les
mycobactéries tuberculeuses se multipliant lentement, les colonies caractéristiques
commencent à apparaître vers le 21ème jour d’incubation.

7. Lecture
La lecture des tubes est faites une fois par semaine.
Lorsque la culture est positive, les colonies sont visibles à la surface du milieu sous
forme de petites formations sèches et rugueuses, de coloration blanc crème, en forme
de « choux fleur », bien individualisées ou en nappe en fonction de la richesse du
prélèvement en bacilles. Si à la lecture du 28ème jour, aucune colonie n’est visible, le
résultat est temporairement négatif. Les tubes sont gardés à l’étuve et revus toutes les
semaines jusqu’à la 8ème semaine. Des colonies peuvent parfois apparaître entre le 28ème
et le 72ème jour.

8. Identification des colonies

Les colonies apparues dans les tubes doivent être identifiées sur des caractères
culturaux morphologiques et biochimiques. Les caractères culturaux et
morphologiques des colonies permettent de faire une identification de premier niveau
suffisante pour suspecter ou écarter les mycobactéries pathogènes (mycobacterium
tuberculosis complexe comprenant dans nos régions, essentiellement, M. tuberculosis
et M. bovis )
Les colonies de M. tuberculosis sont visibles à l’œil nu entre le 21ème et le 28ème jour
d’incubation, elles sont grosses, 1à 2 mm de diamètre ( grain de couscous), rugueuses,
de couleur crème beige. Par contre celles de M. bovis, sont visibles plus tard, après le
28ème jour, très petites, translucides à blanchâtres, brillantes, très différentes de celles de
M. tuberculosis. leur taille peut augmenter avec l’age mais reste néanmoins très petite,
ne dépassant pas le grain de semoule.
Les mycobactéries atypiques sont suspectées sur la base des caractères culturaux
différents de ceux décrits plus haut : vitesse de croissance : apparition des colonies dès
le 5ème jour, ou entre le 5 et le 15ème jour, colonies brillantes, lisses, pigmentées en
jaune, orange ou ocre spontanément ou après exposition pendant quelques heures à la
lumière.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 3 20

Les tests biochimiques sont praticables dans les laboratoires spécialisés. Certains sont
à la portée des laboratoires de cultures comme le test de la catalase, le test de la niacine
et la recherche de la nitrate réductase.
On suspectera une contamination du milieu par d’autres germes que les mycobactéries
si le milieu change de couleur passant du vert pomme au jaune (pH basique) ou au
bleu (pH acide) devenant ainsi impropre à la croissance mycobactérienne. La
contamination est parfois si intense que le milieu est liquéfié donnant l ‘aspect de flan
mou et dégageant une odeur d’œuf pourri.

Ce qu'il faut retenir

L’isolement de colonies de M. tuberculosis est toujours significatif d’une
tuberculose en évolution. Par contre, l’incrimination d’une mycobactérie autre que
celle appartenant au complexe tuberculosis, comme agent responsable du tableau
clinique doit obéir à un certain nombre de critères: examen microscopique positif
avec grand nombre de BAAR, isolement en culture d’un nombre de colonies
supérieur à 20, isolement des mêmes colonies sur plusieurs prélèvements
successifs, absence de colonie de Mycobacterium tuberculosis dans le prélèvement.

9. Expression des résultats

Le nombre de colonies présentes dans les tubes de culture est en relation directe avec
la richesse en bacilles des lésions. C’est pourquoi les colonies sont comptées et les
résultats données en nombre de colonies par tube. Le nombre de colonies est parfois
très élevé, incomptable, donnant une culture confluente en tapis. Comme pour la
microscopie, un code de lecture est adopté pour rendre les résultats au clinicien.
Code de lecture des cultures
Nombre de colonies par tube Code de lecture
Moins de 10 colonies +
10 à 100 colonies ++
Plus de 100 mais non confluentes +++
Confluentes incomptable
TAB. 3

Ce qu'il faut retenir

La culture n’est pas la technique idéale pour diagnostiquer rapidement les cas les
plus contagieux, source de la transmission de la tuberculose dans la population.
C’est une technique délicate, de coût relativement élevé et de réponse tardive (entre
1 et 2 mois après le prélèvement)
Par contre elle reste la meilleure méthode de confirmation des tuberculoses
pulmonaires à microscopie négative et des tuberculoses extra pulmonaires à cause
de leur pauvreté en bacilles.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 3 21

10. Autres méthodes de culture

D’autres méthodes de cultures sont disponibles pour le diagnostic de la tuberculose.
Elles ont pour but d’augmenter le rendement de la culture par rapport à celle obtenue
sur milieu de Löwenstein Jensen et/ ou de raccourcir le temps de la croissance. Les
deux techniques les plus utilisées sont :
♦ la culture sur milieu liquide en système radioactif sur appareil Bactec (en voie de
suppression à cause des déchets radioactifs difficiles à éliminer) soit en système non
radioactif MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube), Quand le prélèvement est
riche en bacilles, la détection de la croissance bacillaire se fait entre 12 et 18 jours
♦ la culture sur milieu solide gélosé (milieu de Middlebrook) Beaucoup plus cher que
le milieu de L.J, le milieu de Middlebrouk , 7H10 ou 7H11 permet de voir les
colonies plus tôt grâce à la transparence du milieu. Sur ce milieu, les colonies
apparaissent entre 18 et 25 jours d’incubation. Mais il a un deuxième inconvénient à
côté de son coût, c’est sa susceptibilité à la contamination par les germes autres que
les mycobactéries.

11. Autres techniques de diagnostic

Des techniques de biologie moléculaire, mises au point depuis quelques années
permettent de faire le diagnostic bactériologique en quelques heures. Un produit
pathologique susceptible de contenir des bacilles de la tuberculose est préparé selon
une technique qui aboutit à la réplication en de milliers d’exemplaires d’une séquence
nucléotidique par une technique d’amplification génomique. C’est la PCR :
Polymerase Chain Reaction. La présence de ces fragments d’ADN générés par
amplification sont ensuite identifiés par l’utilisation d’une sonde nucléotidique
spécifique qui permet de reconnaître que les fragments amplifiés appartiennent bien à
M.tuberculosis. La technique de diagnostic par PCR a un grand avantage qui est la
rapidité (le diagnostic est établi dans les 24 heures après le prélèvement). Cependant,
elle est encore de faible sensibilité, sa positivité est en directe relation avec la richesse
du prélèvement en bacilles. De plus, elle exige une bonne technicité et du matériel et
des réactifs coûteux. Les réactifs, en particulier les enzymes qui sont très fragiles,
nécessitent un transport rapide et une conservation permanente au congélateur à
–20°C.

Ce qu'il faut retenir

L’examen microscopique et la culture sur milieu solide de Löwenstein Jensen sont
encore les méthodes les plus efficientes et les moins coûteuses pour le diagnostic
de la tuberculose dans les pays à haute et moyenne prévalence.
 Chapitre

V
Diagnostic
bactériologique de
la tuberculose -
Objectif 4

Partie A. Donner les indications des tests de

sensibilité aux antituberculeux

Préambule
Pour éviter de créer la résistance bactérienne chez un tuberculeux admis au traitement,
il est utile de comprendre comment la résistance s’installe.
Les bacilles résistants apparaissent spontanément par un phénomène naturel appelé
mutation dans une population de bacilles tuberculeux et ce, en dehors de tout contact
avec les antibiotiques. Mais le nombre de ces mutants est naturellement très faible (1
bacille mutant résistant pour l’INH dans une population de 106 bacilles, pour la
rifampicine, la probabilité est encore plus faible : 1 bacille mutant résistant à la
rifampicine dans une population de 108). Ce faible taux n’affecte pas l’efficacité des
médicaments si le traitement est bien conduit.
Les grandes populations de bacilles tuberculeux renferment toujours et naturellement
des mutants qui résistent aux médicaments. Le phénomène de sélection se voit plus
particulièrement dans les tuberculoses pulmonaires cavitaires riches en bacilles ( une
caverne tuberculeuse de 2cm de diamètre renferme 107 à 109 bacilles en moyenne).
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 4 23

L’apparition d’une résistance aux médicaments est un problème créé par l’homme
L’utilisation d’un seul médicament pour traiter un patient (mono thérapie) conduit
invariablement à l’émergence d’une souche résistante à ce médicament. Ceci survient
parce que seuls les bacilles sensibles sont détruits par la drogue administrée alors que
les mutants résistants présents échappent à son action et vont se multiplier et remplacer
progressivement la population bacillaire contenue dans les lésions. Lorsque les bacilles
d’un patient sont résistants à deux médicaments (Isoniazide et streptomycine par
exemple) et qu’il est traité par une association comprenant ces deux drogues et la
rifampicine, le traitement a le même mauvais résultat que si la rifampicine était donnée
seule. Le résultat est l’aggravation de la résistance par l’apparition après quelques
semaines de traitement d’une souche de bacilles tuberculeux résistante aux trois
drogues à la fois. Très grave est l’apparition de résistance touchant au moins les deux
drogues majeures de l’arsenal thérapeutique antituberculeux qui sont l’isoniazide et la
rifampicine. Ce type de résistance porte le nom de « multirésistance ou MDR » et
explique la gravité de la situation d’un tuberculeux ayant perdu le bénéfice d’un
traitement basé sur les antibiotiques les plus efficaces et les mieux tolérés.
Il faut de plus distinguer les deux formes importantes de résistance aux médicaments
chez les tuberculeux :
♦ La résistance acquise ou secondaire observée chez un cas ayant reçu un traitement
inadéquat: le malade est porteur d’une souche initialement sensible, mais suite à un
traitement mal conduit, il développe au cours du traitement une résistance à un ou
plusieurs antibiotiques reçus
♦ La résistance primaire observée chez un nouveau cas, n’ayant jamais reçu
d’antibiotiques antituberculeux avant sa maladie. Le malade a été contaminé par une
souche de bacilles tuberculeux résistante à un ou plusieurs antibiotiques.

1. Mise en évidence de la résistance aux antituberculeux

Pour détecter la résistance de M. tuberculosis aux antituberculeux il faut cultiver les
bacilles, puis réaliser les tests de sensibilité aux différentes drogues entrant dans les
schémas thérapeutiques standards. Ces techniques sont complexes et coûtent cher,
elles ne sont pas accessibles en routine dans la plupart des pays à faibles revenus. Le
traitement est donné sans connaissance préalable de la sensibilité du bacilles aux
médicaments prescrits.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 4 24

La technique le plus couramment utilisée pour évaluer la résistance de M. tuberculosis

aux drogues antituberculeuses est la méthode des proportions. Le test est appelé à
mesurer la proportion de bacilles résistants présents dans une souche de bacilles
tuberculeux. Pour y parvenir, le test doit indiquer le nombre total de bacilles
ensemencés sur le milieu de culture et le nombre de bacilles résistants présents dans la
population bacillaire totale. Le milieu utilisé est le milieu de Löwenstein- Jensen
simple pour la culture de la population bacillaire totale (Tube témoin) et le même
milieu mais auquel a été ajouté à une concentration bien connue, un antibiotique
antituberculeux vis à vis duquel la souche va être éprouvée. La suspension bacillaire
est ensemencée à la surface du milieu de chaque tube et incubée à 37° pendant 28
jours. La lecture se fait au 28ème jour et comporte le dénombrement des colonies
apparues dans les tubes témoins et dans les tubes avec antibiotique. Il sera alors facile
de déduire par un simple calcul, la proportion de bacilles existants dans la population
totale.
Exemple
% de bacilles résistants à l’INH = Nombre de colonies apparues sur le tube
contenant le milieu avec INH / Le nombre de colonies apparues sur le tube
témoin sans antibiotique X par 100

La proportion trouvée est comparée à la proportion critique adoptée pour chaque

antibiotique. Si la proportion de mutants résistants trouvée est inférieure à la
proportion critique, la souche peut être considérée comme sensible. Pour les
antituberculeux majeurs (INH, Streptomycine, Rifampicine et Ethambutol) la
proportion critique est de 1% de la population bacillaire totale.
L’antibiogramme est fait généralement à partir des colonies obtenues après culture du
prélèvement. C’est l’antibiogramme indirect. Les résultats sont disponibles après au
moins deux mois après le prélèvement : un mois pour la culture du prélèvement et un
mois supplémentaire pour l’antibiogramme.
Dans les cas où l’examen microscopique du prélèvement révèle un nombre élevé de
bacilles (+++), un antibiogramme direct peut être pratiqué à partir du prélèvement
après décontamination et centrifugation. Le culot de centrifugation est utilisé pour
faire la à la fois la culture et l’antibiogramme en ensemençant les tubes de milieu avec
antibiotiques. Quand la richesse bacillaire des crachats le permet, cette procédure
permet de gagner un mois pour avoir la réponse de l’antibiogramme.
Apports de la biologie moléculaire dans l’étude de la sensibilité aux
antituberculeux
Comme pour le diagnostic, les laboratoire de mycobactériologie de haut niveau
peuvent pratiquer des tests de sensibilité de M. tuberculosis aux antituberculeux
majeurs en utilisant des méthodes basées sur la PCR. Cependant, ces techniques sont
encore très coûteuses, pas encore très bien standardisées pour être utilisées comme
méthode de routine. Elles ne sont pas encore validées, exception faite pour la
recherche de la résistance à la rifampicine. De plus, du fait que la résistance à la
rifampicine est dans la grande majorité des cas accompagnée d’une résistance à l’INH,
la détection de la résistance à la rifampicine permet de diagnostiquer avec très peu de
risque d’erreur, les cas multirésistants (cas MDR).
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 4 25

De nombreuses méthodes PCR permettent actuellement de détecter avec au moins

90% de sensibilité et près de 100% de spécificité, les mutations sur le gène de
résistance à la rifampicine. Comme toutes les techniques PCR, le résultat est rapide, et
fiable, mais elle reste coûteuse et de technicité relativement compliquée pour des
techniciens non expérimentés. De ce fait, dans nos pays, elle reste à la portée
seulement des laboratoires de référence qui seraient susceptibles de la pratiquer sur des
indications précises dont la détection de la résistance à la rifampicine chez tuberculeux
chroniques ou chez les nouveaux cas apparus autour d’un cas de tuberculose à bacilles
multirésistants dans le but d’adapter rapidement le régime thérapeutique.

2. Les indications du test de sensibilité

♦ Il est inutile de demander un antibiogramme pour adapter le traitement chez les
malades nouveaux cas. La grande majorité des tuberculeux traités pour la première
fois ont une souche sensible aux antituberculeux. De plus, compte tenu de la
complexité du test tant dans sa technique que dans son interprétation, et du coût, il
est matériellement et financièrement impossible de le faire pour tous les nouveaux
cas.
♦ Pour les cas déjà traités qui présentent une rechute après une cure correctement
suivie et contrôlée, la majorité d’entre-eux rechutent avec une souche sensible car
l’opportunité de sélection de mutants résistants au cours d’un primo-traitement bien
conduit est très faible. L’antibiogramme n’est pas nécessaire pour la prescriptin du
régime adéquat si les directives du programme suivent ceux de l’OMS (prescription
pour ces cas d’u régime standard de retraitement)
♦ Le test de sensibilité devrait être disponible pour les tuberculeux chroniques en
évolution car ils sont fortement susceptibles d’avoir une souche multirésistante créée
lors des chimiothérapies itératives. L’antibiogramme permet de guider le clinicien
dans le choix des antibiotiques à administrer.
♦ Les tests de sensibilité doivent être pratiqués sur un échantillon représentatif de
souches isolées de nouveaux cas de tuberculose pour maintenir une surveillance
épidémiologique de la résistance aux antituberculeux. Le taux de la résistance
acquise reflète les mauvaises pratiques de traitement (traitement inappropriés, mono
thérapie, interruptions répétées et insuffisance de la prise en charge des tuberculeux
admis au traitement. Plus le taux de la résistance secondaire est élevé plus le risque
de dissémination des souches résistantes dans la communauté est élevé.
♦ Le taux de la résistance primaire observée chez les tuberculeux jamais traités est
justement le reflet de l’importance du réservoir de bacilles résistants constitué par
les malades déjà traités et l’importance de la dissémination de ces bacilles. Ce taux
de prévalence de la résistance primaire doit être régulièrement évalué pour juger des
mesures à prendre dans le cadre du programme pour réduire le risque d’aggravation
de la résistance.
 Diagnostic bactériologique de la tuberculose - Objectif 4 26

Ce qu'il faut retenir

Les tests de sensibilité sont de pratique délicate, de coût élevé, de résultats tardifs (
8 à 12 semaines après le prélèvement et le début du traitement ( fin de la phase
initiale du traitement).
Ils ne sont pas utiles pour l’initiation du traitement chez les nouveaux cas, pas très
utiles pour conduire le traitement des échecs et rechutes après une première cure,
utiles pour le traitement des cas chroniques, très utiles pour la surveillance
épidémiologique de la résistance dans le cadre de l’évaluation du programme.
 Exercice
récapitulatif

I
Cas clinique
Mohamed est un agent de santé de l'hôpital de Ain El Benian. Nous sommes
aujourd'hui le samedi matin. Il suspecte que sa malade Ghania a une tuberculose
pulmonaire. Mohamed parle à Ghania des examens d'expectoration. Il remplit ensuite
un formulaire de demande d'examen d'expectoration. Puis Mohamed note le numéro
d'identification de l'échantillon du formulaire sur le coté du pot de prélèvement.
Mohamed montre à Ghania comment produire une expectoration. Mohamed se tient
debout à coté d'elle et lui dit d'essayer de produire une expectoration. Ghania est
embarrassée de faire autant de bruit à coté des autres malades. Mohamed l'installe dans
une pièce à part sans fenêtre et réussit à recueillir un échantillon d'expectoration sur
place.
Ghania revient le dimanche pour un second entretien. Mohamed prépare ce qui est
nécessaire pour recueillir un second prélèvement. Il écrit ensuite le numéro
d'identification de l'échantillon du formulaire d'examen d'expectoration sur le coté du
second pot. Ensuite, Mohamed rappelle à Ghania comment produire une
expectoration. Mohamed se tient à coté de Ghania pendant que celle-ci essaie de
produire une expectoration.
Une fois qu'elle a recueilli chaque échantillon d'expectoration, Mohamed place le
couvercle sur le récipient et le ferme solidement. Il se lave soigneusement les mains
avec du savon. Il place ensuite chaque récipient dans un placard au dessus de la
cuisinière et ferme à clé le placard.
Le Lundi, il emballe soigneusement pour le transport ces récipients d'expectoration.
Les récipients sont reçus le mercredi par le laboratoire de microscopie.
Question1
Mohamed a-t-il recueilli le nombre correct d'échantillons d'expectoration de
Ghania ? Expliquez votre réponse.

Question2
Mohamed a-t-il recueilli l'expectoration de Ghania en procédant à cette
opération dans un endroit qui convenait ? Expliquez votre réponse ?
 Cas clinique 28

Question3
Le placard au dessus de la cuisinière était-il un bon endroit pour ranger les
échantillons ? Expliquez votre réponse.

Question4
Mohamed devait-il se laver les mains après avoir recueilli les échantillons
d'expectoration ? Expliquez votre réponse.
 Questionnaire à
choix multiples

Contrôlez
vous-même vos
connaissances
QUESTION N°1
Un frottis de crachat coloré par la méthode de Ziehl Neelsen montre 4 bacilles acido-alcoolo
résistants sur 300 champs microscopiques. Ce résultat doit être considéré comme
A négatif, on renvoie le malade et on n'entreprend pas le traitement
B positif et on commence le traitement
C douteux, mais on commence le traitement
D on refait d'autres prélèvements avant de commencer le traitement
E une erreur de lecture

QUESTION N°2
Les prélèvements de crachats destinés à la recherche de BAAR
A doivent être examinés immédiatement, sinon le résultat sera faux
B peuvent être conservés au froid pendant moins de 5 jours
C peuvent être conservés au froid au moins 30 jours
D peuvent être conservés à température ambiante pendant plus de 10 jours
E peuvent être conservés au froid pendant 15 jours
 Contrôlez vous-même vos connaissances 30

QUESTION N°3
Quelle substance n'est pas indispensable pour faire une coloration de Ziehl-Neelsen pour la
recherche de bacilles acido alcoolo résistants au microscope
A l'eau courante
B L'alcool à 95°
C l'acide sulfurique à 25%
D le bleu de méthylène à 0,3%
E la fuchsine phéniquée

QUESTION N°4
La mise en culture d'un crachat chez un malade suspect de tuberculose pulmonaire nécessite
A un ensemencement direct sur milieu de culture spécifique
B un passage préalable du prélèvement contaminé à l'autoclave
C une décontamination préalable du crachat
D l'addition préalable d'un volume équivalent d'eau de javel au prélèvement
E Un ensemencement direct après centrifugation

QUESTION N°5
La mise en évidence de BAAR dans les crachats signe
A dans tous les cas une tuberculose évolutive
une tuberculose évolutive chez les patients présentant des symptômes radio cliniques
B
évocateurs
C signe toujours la présence de M. tuberculosis
D la présence possible de M. leprae
E la présence possible de bacilles anaérobies.

QUESTION N°6
Les tests de sensibilité sont indiqués en priorité dans les cas suivants :
A Pour tous les nouveaux cas avant la mise au traitement
Pour tous les tuberculeux déjà traités par une première cure de chimiothérapie et présentant
B
un échec à bactériologie positive
Pour les tuberculeux chroniques à bactériologie positive après retraitement complet en
C
évolution après plusieurs cures
pour tous les tuberculeux déjà traités par une première de chimiothérapie et présentant une
D
rechute à bactériologie positive
Pour tous les tuberculeux déjà traités de façon incomplete et présentant de nouveau une
E
bactériologie positive
 Contrôlez vous-même vos connaissances 31

QUESTION N°7
Au cours de la chimiothérapie curative de la tuberculose, on ne peut pas utiliser un seul
antituberculeux essentiel pour la raison suivante :
A il n'est pas toujours bien absorbé
B il sélectionne les mutants résistants à cet antibiotique
C il n'est actif que sur 80% des malades
D il oblige à prendre le traitement 2 fois par jour
E il oblige à prolonger le traitement de 2 mois supplémentaires
 Bibliographie

Si vous voulez en
savoir plus, vous
pouvez lire...
Séries de diapositives fixes
Séries de diapositives fixes démontrant la réalisation d'un frottis, les étapes de la
coloration de Ziehl-Neelsen, les aspects en microscopie, les colonies de M.
tuberculosis, de M. atypiques et de contaminants autres que mycobactériens.
Vidéo cassette
Vidéo cassette (OMS, CDC, UICTMR)
AIT-KHALED N, ENARSON D, "Tuberculose, manuel pour les étudiants en
médecine", Chapitre 1, pages 21-34 pages, WHO/CDS/TB/99.272, ..
GROSSET J, "Examens microbiologiques et anatomopathologiques dans la décision
diagnostique et thérapeutique" in "Med Mal Infect", 1995, pp.25 : 327-3.
UNION INTERNATIONALE CONTRE LA TUBERCULOSE ET LES MALADIES
RESPIRATOIRES , "Guide pour les pays à faible revenus.", Prise en charge de la
tuberculose, Paragraphe B page 6 à 8 ; paragraphe C, page 34 à 37 et Annexe 1 : Guide
Technique. Diagnostic de la tuberculose par examen microscopique direct des
expectorations. pages, ., ., ..
 Conclusion

Le diagnostic de la tuberculose est basé sur la mise en évidence de la présence de M.

tuberculosis dans les prélèvements pathologiques d’un malade suspect de tuberculose.
Les techniques mises en œuvre au laboratoire sont d’abord l’examen microscopique du
frottis de crachats après coloration de Ziehl-Neelsen. C’est la technique la plus simple,
la moins chère et la plus rapide. Elle permet d’identifier les cas les plus contagieux
responsables de la transmission de la tuberculose dans la communauté. La culture reste
la méthode de référence car elle seule permet de voir les bacilles capables de
multiplication, elle permet de les identifier et de faire l’antibiogramme pour la
conduite du traitement des cas difficiles ou pour la surveillance épidémiologique.
De ce fait, chaque pays doit disposer d’un réseau de laboratoire de microscopie
efficient et contrôlé, de laboratoires de culture pour diagnostiquer les cas difficiles et
d’un laboratoire de référence capable d’apporter le soutien technique, la formation
nécessaire et le contrôle de l’ensemble des laboratoires composant le réseau.
 Corrigés des exercices

Corrigé de l'exercice récapitulatifI : Cas clinique

Question n°1
Non, Mohamed aurait dû recueillir 3 échantillons de Ghania . Il a oublié de donner à
Ghania un pot d'expectoration pour recueilli la première expectoration que dernière a
produite le dimanche matin (échantillon matinal)

Question n°2
Non ; Mohamed aurait dû recueillir l'expectoration de Ghania à l'air libre loin des
autres malades. Si ceci n'était pas possible, il aurait dû trouver une pièce vide avec une
(ou des) fenêtre (s) ouverte (s).

Question n°3
Non ; les échantillons d'expectoration doivent être rangés dans un endroit frais.
Lorsque la cuisinière est utilisée, l'air dans le placard devient chaud ou même très
chaud.

Question n°4
Oui, ceci l'empêchera de contaminer l'échantillon d'expectoration d'un autre malade
 Corrigés des QCM

Questionnaire n°1, Question n°1

Proposition correcte : D

Questionnaire n°1, Question n°2

Proposition correcte : B

Questionnaire n°1, Question n°3

Proposition correcte : B

Questionnaire n°1, Question n°4

Proposition correcte : C

Questionnaire n°1, Question n°5

Proposition correcte : B

Questionnaire n°1, Question n°6

Propositions correctes : B, C

Questionnaire n°1, Question n°7

Proposition correcte : B
 Bibliographie

AIT-KHALED N, ENARSON D, "Tuberculose, manuel pour les étudiants en

médecine", Chapitre 1, pages 21-34 pages, WHO/CDS/TB/99.272, ..
GROSSET J, "Examens microbiologiques et anatomopathologiques dans la décision
diagnostique et thérapeutique" in "Med Mal Infect", 1995, pp.25 : 327-3.
UNION INTERNATIONALE CONTRE LA TUBERCULOSE ET LES MALADIES
RESPIRATOIRES , "Guide pour les pays à faible revenus.", Prise en charge de la
tuberculose, Paragraphe B page 6 à 8 ; paragraphe C, page 34 à 37 et Annexe 1 : Guide
Technique. Diagnostic de la tuberculose par examen microscopique direct des
expectorations. pages, ., ., ..
 Documents à consulter

Séries de diapositives fixes

Séries de diapositives fixes démontrant la réalisation d'un frottis, les étapes de la

coloration de Ziehl-Neelsen, les aspects en microscopie, les colonies de M.
tuberculosis, de M. atypiques et de contaminants autres que mycobactériens.

Vidéo cassette

Vidéo cassette (OMS, CDC, UICTMR)