Methodes Spectrales 2 D Fevrier 2012

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CHROMATOGRAPHIE
I. GENERALITES CHROMATOGRAPHIQUES
Le chimiste est souvent appelé à analyser les mélanges des substances pour en
connaître la nature, les propriétés spectroscopiques et les teneurs respectives. Il faudra
donc qu’il puisse posséder suffisamment des connaissances théoriques et l’art pour les
pratiquer.
Il s’agit en définitive de donner la réponse aux problèmes de :
 purification,
 identification,
 dosage.
Quelles sont les méthodes de purifications des substances ? Quelles sont les
méthodes d’identification ? Comment peut-on faire le dosage des constituants
organiques d’un mélange des substances ?
I.1. ETAPES DE PROCESSUS D’ANALYSE
a) Les méthodes de purification sont ;
 Filtration ;
 Recristallisation,
 Sublimation,
 Extraction
 Evaporation et séchage,
 Distillation fractionnée et distillation moléculaire, distillation sous-vide
 Chromatographie
b) Méthodes d’identification
 Détermination des constantes physiques.

 Point de fusion et point de fusion mixte,
 Détermination de point d’ébullition,
 Détermination de pouvoir rotatoire,
 Détermination de la densité et de l’indice de réfraction,
c) Détermination des données spectroscopiques
d) Détermination des propriétés chimiques
 réactions caractéristiques des fonctions
 réactions des préparations des dérivés et de leurs constantes physiques.

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I.2. SEPARATION D’UN MELANGE LIQUIDE EN SES CONSTITUANTS.
2.a. RUPTURE DE PHASE
Pour séparer des mélanges constitués par des liquides miscibles, on procède à la
rupture de l’homogénéité (rupture de phase): soit en diminuant le volume du solvant,
soit en augmentant la concentration du soluté.
 Elimination du solvant se fait soit partiellement soit totalement sous-vide, à

l’abri de l’air.
 Diminution du pouvoir dissolvant qui se fait ;
 en variant la température,
 en additionnant un non solvant,
 en relarguant, on ajoute un nouveau soluté entraînant la séparation d’un
soluté ou d’un liquide. C’est généralement les sels minéraux.
2.b. CAS D’EXTRACTION.
a) Extraction par un solvant : on se sert d’une pression osmotique à travers les

pores de la membrane.
b) Extraction par un solvant non miscible. L’extraction dépendra de la solubilité

de cette substance dans les deux phases.
Pour le cas des acides gras par chromatographie en phase gazeuse (CPG).
Fig. d’un chromatographe et d’un spectre des substances A, B et C.
Séparation par contre –courant, soit un soluté A en solution dans 2 solvants S et

S’ non miscibles solvants par le coefficient de partage de A entre S’ et S. C’est
le rapport de deux concentration de A, à l’équilibre, entre S et S’ prises dans
un ordre tel que ce rapport soit supérieur à 1.
Si A est plus soluble dans S’ que dans S alors a = [A]s’/[A]s >1
Chromatographie sur papier.
Chromatographie descendante, de partage
Chromatographie sur couche mince,
 chromatographie ascendante,
 chromatographie de partage,
 chromatographie à une dimension et deux dimensions.
Chromatographie par échange d’ions.

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Fixation des acides aminés par liaisons ioniques selon leur charge sur un rapport solide
synthétique chargé. C’est une méthode fondée sur la fixation des substances sur un
rapport porteur de charges électriques de signe opposés.
Résines cationiques
R-X(-)Y(+) + AA(+) R-X(-)AA(+) + Y(+) Réaction d’échange

cationique
Résine cationique R-X
Y(+) : contre ion et AA(+) : cation à échanger.
Résines anionique
R-X(+)Y(-) + AA(-) R-X(+)AA(-) + Y(-)
Résine anionique R-X(+)Y(-)
Y(-) : contre ion et AA(-) : anion à échanger.
Elution des acides aminés par changement pH ou de force ionique (Electrophère)
Chromatographie d’adsorption sur gel de phosphate tricalcique sur gel d’hydroxyapatite

d’interactions hydrophobes.
I.3. CHROMATOGRAPHIE PAR GEL-FILTRATION.
 Méthode de séparation fondée sur la taille des molécules.
 Méthode de séparation sur gel de dextrane
Ce type des grains de dextrane : séphadex G100 polyosids (comportement un

nombre variables de liaisons croisées lesquelles déterminent le degré de porosité ; Les
petites molécules pénètrent dans les grains de séphadex, y sont retenus et s’écoulent
lentement. Les grosses molécules exclues des grains de séphadex ne sont pas retenues
et s’écoulent rapidement.
Marquage de chromatogramme par BD : bleu dextrane de masse moléculaire > 106

dalton et la sortie de BU ; acide urique de M : 168 dalton. Cette référence définit le
volume mort.
Ve : volume d’élution et Vt Volume total d’élution. Le nature des pores de séphadex

définit la nature de séparation (par exclusion ou par adsorption). Les pores sont de
dimensions bien définies et agissent comme écran ou comme filtre suivant les
dimensions de molécules de l’échantillon.
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I.4. SELON LE PROCESSUS UTILISE.
En se basant sur le type d’immobilisation de l’une des phases, on distingue :
1. chromatographie sur colonne remplie.
2. chromatographie sur couche mince,
3. chromatographie en phase gazeuse,
4. chromatographie du type électrophorétique.
I.5. SÉPARATION CHROMATOGRAPHIQUE
Le mécanisme de la séparation chromatographique s’explique par les

différences de répartition des molécules des composés d’un mélange entre deux phases
non-miscibles: l’une mobile et l’autre stationnaire. En chromatographie, les constituants
d'un mélange se partagent entre les deux phases: l’une phase mobile et l’autre
stationnaire (figure 1.1 mais où la répartition entre les deux phases peut être
différente). Ce phénomène est dynamique, les molécules passant continuellement d'une
phase à l'autre; ce qui crée un état d'équilibre entre la phase mobile et la phase
stationnaire pour un constituant en particulier. À ce moment le rapport des
concentrations est égal au rapport des répartitions dans les deux phases ou coefficient
de partage K.
Plus K est grand, plus le composé est absorbé fortement dans la phase
stationnaire et plus la rétention est grande et inversement.
La valeur de K dépend de :
 la structure du composé qui détermine son affinité pour chacune des phases
 la nature de la phase stationnaire qui est un adsorbant ou un solvant pour
chacun des composés
 la phase mobile, seulement si elle est un liquide, et donc un solvant pour chacun
des composés
 la température qui affecte les pressions de vapeur et les solubilités.
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En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT

(1872- 1920) décrit la purification des pigments végétaux sur
une colonne de verre remplie de craie (M. Tswett, Ber. Deutsh.
Bot. 24 (1906) 384) Il donne alors à ce phénomène de
séparation le nom de chromatographie (du grec khrôma,
couleur et graphein, écrire) qu'il définit comme
l'enregistrement graphique des couleurs. On assiste alors à la
naissance de la chromatographie, dont la définition a depuis
fortement évolué.
La chromatographie est une technique de séparation des constituants d'un mélange

basée sur les interactions entre trois produits lors d'un processus dynamique : le
composant (produit contenu dans le mélange), la phase mobile (le solvant) et la phase
stationnaire (cellulose, silice, alumine, etc...).
Ne pas confondre: adsorber (déposer à la

surface) avec absorber (faire entrer en
soi).
En effet, le composant, en présence d'une

phase liquide, va avoir tendance à se
dissoudre partiellement ou totalement
(dissolution) et en présence d'une phase
solide à s'adsorber.
Le composant est donc réparti entre la phase stationnaire et la phase mobile selon
l'équilibre suivant:
La constante de cet équilibre définit le coefficient de partage entre les deux phases
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Cette constante d'équilibre n'est fonction que de:

 la structure du composant qui détermine son affinité pour chacune des phases,
 la nature de la phase stationnaire qui est un adsorbant ou un solvant pour
chacun des composés,
 la nature de la phase mobile, seulement si elle est un liquide, et donc un solvant
pour chacun des composés,
 la température qui affecte les pressions de vapeur et les solubilités.
On peut définir deux grands types de techniques chromatographiques selon la nature

de leur phase mobile:
 La chromatographie en phase gazeuse (CPG) utilisant un gaz comme phase
mobile ;
 La chromatographie en phase liquide (CPL) où c'est un liquide qui remplit le rôle
de phase mobile.
Selon la mise en oeuvre pratique de la méthode, on distinguera dans cette dernière:

 La chromatographie de surface sur papier ou sur couche mince (ccm);
 La chromatographie sur colonne basse pression ou haute pression encore
appelée Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP).
I.6. CLASSIFICATION DES TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES SELON LES

PHASES MOBILES ET SELON LES MÉCANISMES DE SÉPARATION.
Tableau 1
type phase stationnaire
Chromatographie en phase gazeuse
gaz/solide</B< font> adsorption solide poreux
gaz/liquide partage dans les colonnes remplies, solide poreux

(partition) inerte enrobé de liquide
dans les colonnes capillaires, paroi

interne
de la colonne qui sert de support
Chromatographie en phase liquide
liquide/solide adsorption solide poreux

solide à la surface duquel se trouvent des
sites ioniques qui permettent à l'aide d'un
échange d'ions
solvant approprié l'échange d'ions
présents dans la phase mobile
exclusion solide dont la dimension des pores
(filtration sur gel, permet la séparation des espèces selon
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perméation de leur taille

gel)
liquide/liquide partage solide poreux inerte enrobé de liquide
phase normale(de moins en moins utilisée).
solide poreux sur lequel sont greffées
partage
des chaînes hydrocarbonées non-
phase inversée
polaires.
Chromatographie en phase supercritique
Gaz
supercritique/solide
Gaz
supercritique/liquide
Selon les phénomènes mis en jeu pour réaliser la séparation, on distinguera au sein
des deux techniques :
 La chromatographie de partage (C.P.G. et C.L.) lorsque la séparation est basée

sur les différences de solubilité des molécules à séparer dans la phase liquide
stationnaire qui imprègne un support solide.
 La chromatographie d'adsorption (C.P.G. et C.L.) lorsque la phase stationnaire
est un solide adsorbant, la séparation étant fondée sur les différences
d'adsorption des composants du mélange par la phase stationnaire.
 La chromatographie d'échanges d'ions (C.L.) où la phase stationnaire est un
échangeur d'ions, c'est à dire un solide contenant des ions et susceptible de les
échanger avec ceux de la solution avec laquelle il est en contact.
 La chromatographie d'exclusion (C.L.) dite également chromatographie de
perméation (ou filtration) sur gel. La phase fixe est un solide poreux dont la
dimension des pores est proche de celle de certaines molécules du mélange à
séparer. Les molécules du mélange dont la dimension est supérieure à celle des
pores sont exclues de la phase fixe et sont d'abord éluées, celles qui peuvent y
pénétrer sont entraînées avec un certain retard. Ce retard est d'autant plus
grand qu'elles pénètrent facilement dans les pores.
Notions fondamentales en chromatographie Notions de temps.

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Temps mort Tm : Temps passé dans

la phase mobile.
Temps mis par un composé non
retenu par la phase stationnaire de
la colonne, pour parcourir le trajet
entre l'entrée et la sortie de la
colonne.
Temps de rétention Tr : Temps total

passé dans la colonne mesuré entre
l’entrée et la sortie du système
chromatographique, caractéristique
du constituant.
Temps de rétention réduit Tr' :

Temps passé dans la phase
stationnaire.
Tr' = Tr - Tm
Largeur de pic ω, ω1/2 :

Temps que met le produit pour sortir de la colonne défini par la largeur du pic à mi-
hauteur ω1/2 exprimée en secondes; la mesure de cette dernière étant plus facile et plus
précise que celle de la largeur du pic à la base ω.
Notions de concentration
Le coefficient de partage K : Il traduit l’affinité d’un composé pour la phase stationnaire

représentant le passage de la phase mobile à la phase stationnaire et inversement.
K = [ Cstat ] / [ Cmob ]
Le facteur de capacité k' : c’est la vitesse de déplacement du soluté. C'est le rapport de
la quantité d'un même soluté, dans la phase stationnaire et dans la phase mobile.
Cstat : concentration dans la phase stationnaire

Vstat : volume de la phase stationnaire
Cmob : concentration dans la phase mobile
Vstat : volume de la phase mobile
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C'est aussi le rapport du temps passé par une espèce dans la phase stationnaire par
rapport au temps passé par cette même espèce dans la phase mobile. Il peut être
déterminé expérimentalement par: k' =( Tr-Tm ) / Tm.
Notions de qualité de séparation :
La sélectivité α : C'est le rapport des temps de rétention réduits,

α = Tr'B / Tr'A. α est toujours ≥ 1 car Tr'B est > à Tr'A.
L'efficacité Elle est caractérisée par la largeur d'un pic et est exprimée par le nombre de
plateaux théoriques Nth : Nth = 5,54 ( Tr/ω1/2 )2.
on peut aussi utiliser le nombre de plateaux effectifs Neff : Neff : 5,54 (Tr-Tm/ω1/2)2.
La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) est définie à partir de la longueur

L de la colonne : HEPT = L / Nth.
La résolution R : La résolution entre deux pics est définie par la relation suivante:
R = 2 ( TrB-TrA ) / ( ωB + ωA )
= 1,18 ( TrB-TrA ) / ( ω1/2B + ω1/2A ).
 si R < 1 : Mauvaise résolution

 si 1 <R < 1,4 : Résolution acceptable
 si 1,4 < R < 1,6 : Résolution optimale
 si R > 1,6 Trop bonne résolution (car le temps d'analyse est rallongé).
La résolution peut aussi s'exprimer avec la sélectivité et l'efficacité :

R = √Nth /4 .( α-1/α ).( k'/1+k')
= 1/4 ( α-1/α )√Neff
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II. CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
1.Définition et appareillage.
La CCM repose principalement sur des phénomènes d’adsorption : la phase mobile est
un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire
fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou
d’aluminium.
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une méthode simple et rapide qui
permet de suivre l'évolution d'une réaction ou de tester la pureté de composés
organiques
Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent
à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.
Les principaux éléments d’une séparation chromatographique sur couche mince sont :
 la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme

variable, fermé par un couvercle étanche.
 la phase stationnaire : une couche d’environ 0,25 µm de gel de silice ou d’un
autre adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l’aide d’un liant comme le
sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris) l’amidon ou un polymère organique.
 l’échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée (2 à 5 %) du mélange
à analyser, déposer en un point repère situé au-dessus de la surface de l’éluant.
 l’éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque
en entraînant les composants de l’échantillon.
2. Principe de la technique.
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l’échantillon est placée dans la cuve, l’éluant
monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque
composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant.
Cette vitesse dépend d’une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur
la plaque stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les
composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase
mobile, l’action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par
des phénomènes d’adsorption. Généralement, en chromatographie sur couche mince,
les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.
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Schéma : Développement de la plaque.
3. Applications de la CCM.
Lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide
de la pureté d’un composé organique. Si l’analyse, réalisée avec divers solvants et
différents adsorbants, révèle la présence d’une seule substance, on peut alors
considérer que cet échantillon est probablement pur.
De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de
composants d’un mélange, on peut l’employer pour suivre la progression d’une réaction.
4. Adsorbants et plaques chromatographiques.
Par ordre d’importance décroissante, les adsorbants employés en CCM sont : le gel de
silice, l’alumine, le kieselguhr et la cellulose.
Les plaques vous seront fournies prêtes à l’emploi.
5. Choix de l’éluant.
L’éluant est formé d’un solvant unique ou d’un mélange de solvants. Choix de l’éluant
dans le cas d’analyses:
 d’hydrocarbures: hexane, éther de pétrole ou benzène.

 de groupements fonctionnels courants : hexane ou éther de pétrole mélangés en
proportions variables avec du benzène ou de l’éther diéthylique forment un
éluant de polarité moyenne.
 de composés polaires : éthanoate d’éthyle, propanone ou méthanol.
6. Dépôt de l’échantillon.
L’échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatile, qui n’est pas
forcément le même que l’éluant : on emploie fréquemment le trichlorométhane
(chloroforme), la propanone ou le dichlorométhane. La solution est déposée en un point
de la plaque situé à environ 1 cm de la partie inférieure.
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Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible ;
idéalement, il ne devrait pas dépasser 3 mm. Ce sont généralement les dépôts les
moins étalés qui permettent les meilleures séparations. Pour augmenter la quantité
déposée, il est toujours préférable d’effectuer plusieurs dépôts au même point, en
séchant rapidement entre chaque application plutôt que de déposer en une seule fois
un grand volume d’échantillon qui produirait une tache plus large.
L’échantillon est déposé à l’aide d’une micropipette ou d’un tube capillaire en appuyant
légèrement et brièvement l’extrémité de la pipette sur la couche d’adsorbant en prenant
soin de ne pas le détériorer.
Dépôt de l’échantillon
On vérifie l’identité des composants présumés d’un échantillon, en procédant à un

dépôt séparé d’une solution de chacun d’eux puis à celui de leur mélange. Ces solutions
témoins permettent de comparer la migration de chaque composé avec celle de
l’échantillon à analyser.
7. Développement de la plaque.
Le développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque. Dans les analyses
usuelles de laboratoire, le principal type de développement est la chromatographie
ascendante : la plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant qui
en recouvre le fond monte par capillarité.
Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve puis on introduit la
plaque. Pendant le développement du chromatogramme, la cuve doit demeurer fermée
et ne pas être déplacée.
Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1 cm de l’extrémité supérieure,

la plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est marqué par un trait
fin, puis la plaque est séchée à l’air libre ou à l’aide d’un séchoir.
8. Révélation.
Lorsque les composants de l’échantillon analysé sont colorés, leur séparation est
facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire, on doit rendre les taches
visibles par un procédé de révélation. Les taches sont ensuite cerclées au crayon.
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Utilisation de plaque contenant un matériau fluorescent et visualisation à l'aide d'un

éclairage ultraviolet. Les constituants de l'échantillon désactivent la fluorescence du
matériau de sorte que la plaque est fluorescente partout sauf aux endroits où se
trouvent les constituants.
Certaines plaques de CCM contiennent un indicateur fluorescent permettant une

résolution dans l'UV proche (366nm) ou lointain (254nm). L'indicateur UV 254 est un
silicate de zinc activé au manganèse, dont le maximum d'absorption est à 254nm. Il
présente une fluorescence verte. Il est sensible aux acides et sa fluorescence peut être
éteinte par des solvants acides. L'indicateur UV366 est également un pigment minéral
avec un le maximum d'absorption est à 366nm. Il présente une fluorescence bleue.
Interprétation
La Figure montre le front de migration par capillarité du solvant à partir de la ligne de

dépôt des échantillons. La tache correspond à un produit qui a migré sur une distance B
alors que le solvant a migré sur une distance A
9. Calcul de Rf (retarding factor ou rapport frontal).
di : distance parcourue par le composé (mesuré au centre de la tache)

ds : distance parcourue par le front du solvant.
La valeur de Rf est donc comprise entre 0 et 1. Pour obtenir des Rf reproductibles, il est
nécessaire d'opérer dans des conditions identiques : composition identique d'éluant,
température constante, cuve saturée ...
10. Description d’une analyse par CCM selon l’ordre chronologique.
a. Préparation de la cuve chromatographique.
– Introduire l’éluant ou le mélange de solvants.

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– Ajuster le niveau à environ 0,5 cm du fond de la cuve.

– Garnir l’intérieur de la cuve d’un papier filtre imprégné d’éluant et plaqué contre
les parois ; une ouverture est ménagée dans le filtre pour observer le
développement du chromatogramme.
– Fermer le récipient (la cuve doit être saturée de vapeur de solvant)
b. Dépôt de l’échantillon sur la plaque.
– Procéder au nettoyage de la plaque si nécessaire.

– Dissoudre l’échantillon dans un solvant approprié en solution de 2 à 5 % .
– Déposer environ 0,5 ml de la solution en un point situé à 1 cm de l’extrémité
inférieure de la plaque; le diamètre de la tache doit être d’environ 2 mm pour la
disposition de plusieurs produits.
– Sécher à l’aide d’un séchoir ; éventuellement faire de nouvelles applications.
c. Développement du chromatogramme.
– Placer la plaque dans la cuve en position verticale.

– Refermer le récipient qui ne doit plus être déplacé.
– Lorsque le front du solvant se trouve à environ 1 cm de l’extrémité supérieure de
la plaque, la retirer et marquer cette position. (le trait peut être tracé à l’avance et
servir de repère pour arrêter l’élution).
d. Révélation et calcul de Rf.
– Sécher la plaque à l’aide d’un séchoir

– Révéler les taches sous une lampe U V
– Cercler les taches et pointer leur centre.
– Calculer les Rf
11. APPLICATION
a. Analyse qualitative.
Si les témoins placés à coté de l'échantillon ont été bien choisis, les taches ayant
parcouru la même distance ont de grandes chances d'être de même nature que les
constituants de l'échantillon.
Lorsqu'une substance a été localisée sur la plaque mais non identifiée, on peut gratter
la tache et l'étudier après dissolution dans un solvant à l'aide des méthodes
d'identification (spectroscopie infrarouge, UV, spectrométrie de masse...).
c. Analyse quantitative.
On peut à l'aide d'un spectromètre (scanner), après étalonnage, obtenir des résultats
tout à fait précis. Les procédés indirects (grattage et élution) ne permettent pas une
détermination quantitative aussi précise.
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III. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
SCHEMA : CPG Configuration la plus classique.
Le principe de la séparation repose sur la différence d’affinité entre les composés pour
la phase mobile et la phase stationnaire.
Un composé qui aura plus d’affinité pour la phase mobile, aura peu d’interaction avec la
phase stationnaire et sera donc moins ralenti par celle-ci et sera donc élué plus
rapidement qu’un composé qui aura plus d’affinité avec la phase stationnaire et sera
plus souvent en interaction avec la phase stationnaire qu’avec la phase mobile.
INJECTEUR
L’injecteur permet à la fois de vaporiser les échantillons et de les entraîner par la phase
mobile. Parmi les nombreux types d’injecteurs utilisables, l’injecteur Split/Splitless est le
plus souvent utilisé pour des échantillons en solutions.
Le terme Split se rapporte à une fuite qui est contrôlée et qui permet d’éliminer une
partie de l’échantillon lors de l’injection et ceci est utilisé pour des échantillons
concentrés. Les échantillons qui seront les plus volatils seront en plus grande
concentration au début de la Colonne.
Colonne
La colonne est constituée d’une phase stationnaire greffé à la paroi de la colonne est qui
est constituée de Plusieurs types de composés. Elle permet la séparation des composés
comme les hydrocarbures légers en fonctions de la température.
Four
Le four permet de maintenir la colonne à une température constante ou de travailler avec

un gradient de température. On peut ainsi travailler de -99°C à 250°C.
Détecteur
Le détecteur est donc un détecteur à ionisation de flamme. L'éluat pénètre dans une
flamme obtenue par combustion d'hydrogène et d'air. Les composés organiques forment
alors des ions collectés par deux électrodes, entre lesquelles on applique une différence
de potentiel. Il en résulte un courant électrique recueilli par un électromètre qui le
transforme en courant que l'on peut enregistrer.
IV. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE
APPAREILLAGE
Un appareil de chromatographie en phase liquide comporte quatre parties : système de

pompage, injecteur, colonne et détecteur à travers lesquelles un liquide entraîne les
substances d’un mélange à séparer.
Pr Lumbu Simbi Jean – Baptiste, Méthodes Instrumentales, 2012

Schéma : Chromatographie en phase liquide.
POMPE
INJECTEUR
L’injecteur à boucle est le seul dont le fonctionnement sera décrit ici.

Avantages: - permet des injections répétées qui donnent des résultats très reproductibles
et donc adaptés aux analyses;

 ne comporte pas de septum;
 peut supporter des pressions qui dépassent 5000 psi.
Désavantages: - la boucle est difficile à remplir ; - la boucle doit être changée si le

volume injecté doit être modifié car la boucle possède un volume fixe.
HPLC
Principe
L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelée phase mobile) dans une
colonne remplie d'une phase stationnaire de fine granulométrie (les "grains" sont de très
petite taille)
Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de
la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les
composants le long de la phase stationnaire.
La fine granulométrie de la phase stationnaire permet une meilleure séparation des

composants. En effet, pour un même volume de phase stationnaire la surface d'échange
augmente si les "grains" qui la composent sont de diamètre plus petit.
Les pics obtenus sont plus étroits donc la résolution est améliorée (les pics sont bien
séparés, on peut donc bien les différencier), le seuil de détection est également plus bas
(des pics étroits et hauts sont plus faciles à isoler du bruit de fond que des pics larges et
bas).
La combinaison de ces attributs - rapidité et résolution élevées - conduit à l'appellation

« haute performance ».
Les solvants utilisés sont des combinaisons miscibles d'eau et de divers liquides
organiques (alcools, acétonitrile, dichlorométhane, ...).
Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse, c'est le

mode dit "gradient" ou "élution graduée" (en opposition au mode "isocratique", pour
lequel la composition de la phase mobile reste la même tout au long de l'analyse).
Les phases stationnaires.
Phase normale : Les colonnes en phase normale sont des colonnes dont la phase
stationnaire est polaire et acide.
La phase normale la plus utilisée est à base de gel de silice : à sa surface se trouvent des
groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-). Ces groupes permettent à la silice
de retenir les composés à analyser par des liaisons hydrogènes.
Cette phase sert ainsi principalement à séparer des composés polaires.

Phase inverse : Phase normale - chaînes alkyles (ou autres selon la polarité
recherchée) greffées au niveau des groupes silanols (end-capping).
En général, la phase stationnaire est majoritairement composée de petites particules de

silice sur lesquels on a greffé des fonctions chimiques, le plus souvent de chaines alkyles
à 8 ou 18 atomes de carbones.
Les fonctions silanols (Si-OH) qui subsistent engendrent des interactions hydrophiles
parasites, qui rendent les résultats non reproductibles surtout pour les molécules
basiques.
Alors, les fonctions silanols deviennent sous la forme (Si-O-CH3), c'est cette étape que
l'on appelle "end-capping". Les fonctions chimiques utilisées pour le "end-capping"
peuvent toutefois être de nature très diverses et les colonnes de dernières générations
résistant à des pH extrêmes sont généralement "end-capped" .
Selon le taux de greffage, on obtient une plus ou moins grande résolution.
Cette phase est dite "inverse" car de polaire et hydrophile (sans les "greffes"), la phase
devient apolaire et hydrophobe.
V. ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
ELECTROPHORESE DE ZONE
Schéma
Application
En biologie:
- séparation des peptides
- dosage des différentes fractions des protéines du sérum sanguin
(Protéinogramme des albumines et de globulines)
En biochimie :
- séparation des polysaccharides, des acides nucléiques, des protéines et
autres espèces colloïdales
ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
Schéma : Installation d’électrophorèse capillaire en configuration standard.
L’électrolyte est une solution aqueuse ionique, filtrée, dégazée contenant divers additifs.
Influence des paramètres de charge nette, du champ, de viscosité et de taille d’une

espèce sur le vecteur de migration dans un électrolyte supposé immobile.

Effet de la nature de la paroi interne d’un capillaire sur les vitesses de migration. Si la
paroi n’a pas subi de traitement, il apparaît un effet de pompage qui aspire le liquide de
l’anode vers la cathode – c’est le flux électro-osmotique. Si la paroi est traitée (recouverte
d’un film apolaire, ce flux n’existe pas.
VI. SÉPARATION EN CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTION
En chromatographie d’adsorption, la répartition des molécules se fait entre la

phase mobile et la surface de la phase stationnaire qui n’est pas liquide, donc qui ne joue

pas le rôle de solvant. La figure 1 représente le mécanisme de l’adsorption et de la
désorption.
Figure 1.1. Répartition des molécules entre les deux phases dont l’une est solide. Ici les
molécules sont adsorbées à la surface du solide.
Les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène,… jouent aussi un rôle dans
l’affinité qu’ont les molécules pour l’une ou l’autre phase.
La phase mobile
La phase mobile peut être un gaz (gaz vecteur) ou un liquide (ou solvant).
Si la phase mobile est un gaz, elle ne sert qu’à entraîner les constituants à travers
la colonne. Le passage des constituants vers la phase mobile ne dépend pas de leur
solubilité mais de leur pression de vapeur.
Si la phase mobile est un liquide elle a un double rôle :
 celui d’entraîner les composés à travers la colonne et

 celui de solubiliser les constituants du mélange.
VII. SÉPARATION EN CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
La différence de répartition des molécules des composés d’un mélange entre deux
phases non-miscibles; l’une mobile et l’autre stationnaire constituée d’un liquide. Les
différents composés d'un mélange sont entraînés par une phase mobile à travers une
couche d'absorbant qui est fixe. Ils se déplacent plus ou moins rapidement selon leur
répartition entre les deux phases décrites plus haut. Plus leur répartition dans la phase
stationnaire est grande plus leur rétention est grande et inversement. L'affinité de chaque
constituant pour la phase stationnaire dépend de sa solubilité dans cette phase et de sa
polarité. Les forces qui entrent en jeu sont donc les forces de Van der Waals, les ponts
hydrogène, etc.

Figure 1.2. Répartition (elle peut être différente) des molécules d’un composé entre les
deux phases. L’absorption se produit devant le pic et la désorption derrière.
La phase stationnaire en chromatographie de partage doit être chimiquement

inerte, c'est-à-dire qu'elle ne doit réagir avec aucun des constituants du mélange au
cours de la séparation.
Figure 1.3. Migration de trois composés en fonction de leur répartition entre les deux
phases. Plus l'affinité des différents constituants pour la phase stationnaire est grande,
plus leur rétention est grande et inversement. Un constituant plus soluble qu'un autre
dans la phase stationnaire est retenu davantage et migre plus lentement.

Séparation d'isomères de molécules de phénol très semblables de façon
surprenante par Véronique Dion et Véronique Payant
VIII. ÉQUILIBRE EN CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE-

ISOTHERMES
Si un composé se partage également entre la phase mobile et la phase

stationnaire, comme le montre la figure 1.4a, il apparaît sous la forme d’un pic
parfaitement symétrique. Ce qui signifie que le partage (absorption dans la phase
stationnaire ou adsorption) se réalise dans des conditions idéales. En réalité, la plupart du
temps, les pics en chromatographie se présentent sous des allures bien différentes en
figures 1.4 b et c.
Figure 1.4. a) le composé se partage également entre les deux phases;
b) le composé est absorbé trop rapidement dans la phase stationnaire, il migre
trop vite et laisse un effet de queue;
c) le composé est absorbé trop lentement dans la phase stationnaire, sa
migration est trop lente.
IX. GRANDEUR DE RÉTENTION ET RÉSOLUTION
1. LE VOLUME OU LE TEMPS DE RETENTION
Soit la séparation de deux composés par chromatographie de partage (figure

1.5). Un des paramètres les plus importants en chromatographie sur colonne est le
volume de rétention qui s’exprime comme
et pour un soluté non retenu, ce volume devient:

Le temps de rétention est habituellement utilisé à la place du volume de
rétention et sa grandeur dépend:
 de la nature de la phase stationnaire

 de la nature de la phase mobile
 du débit de la phase mobile
 de la longueur de la colonne
Figure 1.5. Chromatogramme typique montrant la séparation de deux constituants d’un

mélange et les différents paramètres mesurables.
où tm= temps de rétention d’une substance non retenue sur la colonne

tr= temps de rétention h= hauteur du pic
t’r= temps de rétention corrigé par rapport à tm h’= hauteur corrigée
du pic

l= largeur du pic à la base
2. LE FACTEUR DE CAPACITE K’
Ce facteur s’apparente au coefficient de partage puisqu’il exprime le rapport de la

quantité de soluté dans la phase stationnaire à la quantité de soluté dans la
phase mobile. Ce facteur, sans dimension, peut être relié au temps de rétention. Il a
l’avantage de ne dépendre ni du débit ni de la longueur de la colonne. Il est facilement
calculé pour une substance dont le temps de rétention est tr par l’expression:
3. LE FACTEUR DE SELECTIVITE
Ce facteur de sélectivité ou de séparation, sans dimension, est égal au rapport des

facteurs de capacité de deux solutés dont on veut réaliser la séparation. Il s’exprime
comme ceci :
4. LA RESOLUTION R
La résolution est une mesure de la qualité d’une séparation. Deux

caractéristiques déterminent le degré de recouvrement des pics:
 la distance séparant les sommets de deux pics mesurée par tr2

- tr1;
 la largeur des pics à la base l.

Figure 1.6. a) les pics se recouvrent;
b) la distance séparant les sommets des pics est plus grande mais les
largeurs à la base sont les mêmes qu’en a);
c) la distance séparant les sommets des pics est égale à celle trouvée en a)
mais les largeurs à la base sont plus petites qu’en b).
Comme le montre la figure 1.6, la séparation idéale est réalisée en c) où la valeur

de R est un peu plus grande que 1. Pour des valeurs de R beaucoup plus grande que 1,
la séparation des pics n’est pas meilleure mais le temps de la séparation devient
inutilement long.
Exprimée en termes de volume de rétention, la résolution est égale à
Exprimée en termes de temps de rétention, la résolution est égale à

5. LE NOMBRE DE PLATEAUX THEORIQUES N
C’est un paramètre qui sert à mesurer la performance d’une colonne à distillation

fractionnée. Autant il est souhaitable dans une distillation fractionnée d’avoir le plus de
distillations simples possibles pour obtenir la meilleure séparation des constituants d’un
mélange, autant il souhaitable que le passage d’une substance de la phase mobile à la
phase stationnaire et inversement se fasse sur la distance la plus courte possible. Le
nombre de fois que ce phénomène se passe correspond à un plateau théorique.
Tableau :
où l = largeur du pic à la base
où w = largeur du pic à mi-hauteur
La hauteur équivalente à un plateau théorique h est

où LC = longueur de la colonne
et N = nombre de plateaux
théoriques
L’équation de la résolution R vue plus haut est très utile pour mesurer le degré de
séparation mais ne relie pas les paramètres fondamentaux de la chromatographie,
sélectivité, facteur de capacité et nombre de plateaux théoriques à la résolution.
C’est pourquoi on utilise:
6. VARIATION DE R AVEC
Si = 1, il n’y a pas de séparation quelle que soit la valeur de N.

Si passe de 1,1 à 1,2, la valeur de R double.
Si > 2, la valeur de R ne change presque pas comme le montre la figure 1.7.

Figure 1.7. Variation de R avec .
7. VARIATION DE R AVEC K’
A ce moment, le temps de rétention devient très long et le pic de plus en plus large
(figure ).
Figure 1.8. Variation de R avec k’.
8. VARIATION DE R AVEC N
La valeur de R est proportionnelle à la racine carrée du nombre de plateaux

théoriques. Si la longueur de la colonne est multipliée par 2, R est multiplié par 1,4.
Cependant, N demeure un facteur important dans le processus de séparation des pics en
chromatographie.

9. FACTEURS DEPENDANT DES CONDITIONS D'OPERATION.
a) Le débit du gaz vecteur (phase gazeuse) ou du solvant (phase liquide).
La hauteur d’un plateau théorique h peut être affectée par la vitesse du gaz vecteur ou
son débit. En effet plus le débit du gaz vecteur est grand, plus le soluté migre rapidement
et inversement car le débit modifie le coefficient de partage. Cette relation entre débit ou
vitesse moyenne du gaz vecteur et la hauteur d’un plateau théorique h a été mise en
évidence par Van Deemter (fig 1.9).
 A dépend de la diffusion tourbillonnaire dans les canaux formés par les

grains du support (colonnes remplies). A est inexistant dans une
colonne capillaire.
 B est facteur de la diffusion moléculaire dans la phase gazeuse.
 C dépend de la résistance au transfert de masse en phase liquide.
Figure 1.9. Courbe de Van Deemter. Variation de la hauteur d’un plateau théorique en
fonction du débit du gaz vecteur.
b) La température de la colonne.
Vous pouvez télécharger ce programme modifié par l'enseignant de

mathématiques, Charles Foucault, et remplacer les données comme exemples obtenues
expérimentalement au laboratoire de chromatographie en phase gazeuse. Ce programme
qui s'appelle "Deemter_dvT.mws" pourra fonctionner dans MAPLE.

Methodes Spectrales 2 D Fevrier 2012

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1

Il s’agit en définitive de donner la réponse aux problèmes de :

I.1. ETAPES DE PROCESSUS D’ANALYSE

a) Les méthodes de purification sont ;

 Détermination des constantes physiques.

c) Détermination des données spectroscopiques

d) Détermination des propriétés chimiques

 réactions caractéristiques des fonctions

 réactions des préparations des dérivés et de leurs constantes physiques.

I.2. SEPARATION D’UN MELANGE LIQUIDE EN SES CONSTITUANTS.

2.a. RUPTURE DE PHASE

 Elimination du solvant se fait soit partiellement soit totalement sous-vide, à

 Diminution du pouvoir dissolvant qui se fait ;

2.b. CAS D’EXTRACTION.

a) Extraction par un solvant : on se sert d’une pression osmotique à travers les

b) Extraction par un solvant non miscible. L’extraction dépendra de la solubilité

Fig. d’un chromatographe et d’un spectre des substances A, B et C.

Séparation par contre –courant, soit un soluté A en solution dans 2 solvants S et

Si A est plus soluble dans S’ que dans S alors a = [A]s’/[A]s >1

Chromatographie sur papier.

Chromatographie descendante, de partage

Chromatographie sur couche mince,

Chromatographie par échange d’ions.

R-X(-)Y(+) + AA(+) R-X(-)AA(+) + Y(+) Réaction d’échange

Résine cationique R-X

Y(+) : contre ion et AA(+) : cation à échanger.

R-X(+)Y(-) + AA(-) R-X(+)AA(-) + Y(-)

Résine anionique R-X(+)Y(-)

Y(-) : contre ion et AA(-) : anion à échanger.

Elution des acides aminés par changement pH ou de force ionique (Electrophère)

Chromatographie d’adsorption sur gel de phosphate tricalcique sur gel d’hydroxyapatite

I.3. CHROMATOGRAPHIE PAR GEL-FILTRATION.

 Méthode de séparation fondée sur la taille des molécules.

 Méthode de séparation sur gel de dextrane

Ce type des grains de dextrane : séphadex G100 polyosids (comportement un

Marquage de chromatogramme par BD : bleu dextrane de masse moléculaire > 106

Ve : volume d’élution et Vt Volume total d’élution. Le nature des pores de séphadex

I.4. SELON LE PROCESSUS UTILISE.

En se basant sur le type d’immobilisation de l’une des phases, on distingue :

1. chromatographie sur colonne remplie.

2. chromatographie sur couche mince,

3. chromatographie en phase gazeuse,

4. chromatographie du type électrophorétique.

I.5. SÉPARATION CHROMATOGRAPHIQUE

Le mécanisme de la séparation chromatographique s’explique par les

En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT

La chromatographie est une technique de séparation des constituants d'un mélange

Ne pas confondre: adsorber (déposer à la

En effet, le composant, en présence d'une

Cette constante d'équilibre n'est fonction que de:

On peut définir deux grands types de techniques chromatographiques selon la nature

Selon la mise en oeuvre pratique de la méthode, on distinguera dans cette dernière:

I.6. CLASSIFICATION DES TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES SELON LES

type phase stationnaire

Chromatographie en phase gazeuse

gaz/solide</B< font> adsorption solide poreux

gaz/liquide partage dans les colonnes remplies, solide poreux

dans les colonnes capillaires, paroi

Chromatographie en phase liquide

liquide/solide adsorption solide poreux

perméation de leur taille

 La chromatographie de partage (C.P.G. et C.L.) lorsque la séparation est basée

Notions fondamentales en chromatographie Notions de temps.