SAMBANY RASOANARIVAO Heryliva

EVALUATION DE LA CHIMILUMINESCENCE ET DE L’IMMUNODOT

POUR LE DIAGNOSTIC DES VASCULARITES A ANTICORPS ANTI-
CYTOPLASME DES POLYNUCLEAIRES NEUTROPHILES AU NIVEAU
DU CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE DE MONTPELLIER EN 2022

Mémoire pour l’obtention de Diplôme d’Etudes et de Formation Spécialisées

(DEFS) en Biologie Médicale
 UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DE MEDECINE

Année : 2023 N° : 594

EVALUATION DE LA CHIMILUMINESCENCE ET DE L’IMMUNODOT

POUR LE DIAGNOSTIC DES VASCULARITES A ANTICORPS ANTI-
CYTOPLASME DES POLYNUCLEAIRES NEUTROPHILES AU NIVEAU
DU CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE DE MONTPELLIER EN 2022

Mémoire

Présenté le 02 juin 2023

A
Antananarivo

Par

Le Docteur SAMBANY RASOANARIVAO Heryliva

Née le 25 Février 1993 à Befelatanana

Pour l’obtention de Diplôme d’Etudes et de Formation Spécialisées (DEFS)

en Biologie Médicale – Immuno-allergologie

MEMBRES DU JURY
Président et Directeur : Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andriamiliharison Jean
Juges : Professeur RANDRIAMAHAZO Rakotomalala Toky
Professeur RAKOTO ALSON Aimée Olivat
 DEDICACES

Je dédie ce mémoire :

A mon Seigneur Jésus Christ

Gloire à Toi seul Seigneur, par ta grâce je suis ce que je suis

A Neny et Tatie Fara

Merci pour tous les sacrifices et les efforts afin de me donner un avenir brillant.

A Mevantsoa, mon mari

Pour tout ton amour et ton soutien, je te remercie.

A mes deux garçons Riana et Andrianina

A vous qui me comblent d’amour, de joie et de tendresse.

A Dada et Neny, Jajah et Zoely

Merci pour votre encouragement et vos précieux conseils.

A toute ma famille

Je vous dédie ce mémoire, en témoignage de ma reconnaissance.

Au Professeur Thierry VINCENT

Je vous remercie de m’avoir donné une chance de vivre une si belle expérience au sein
de votre secteur.

Au Docteur Alexandre JENTZER

Je te remercie pour ton soutien, ton aide et tes conseils dans la réalisation de ce
mémoire.

Au Docteur Chantal COGNOT-PONS

Je suis très reconnaissante pour tout le soutien et les conseils que j'ai reçu de ta part.
A NOTRE MAITRE PRESIDENT ET DIRECTEUR DE MEMOIRE

Monsieur le Docteur RASAMINDRAKOTROKA Andriamiliharison Jean

Professeur Titulaire d’Enseignement Supérieur et de Recherche en Immunologie

à la Faculté de Médecine d’Antananarivo

Ancien Ministre de la Santé Publique

Pour l’immense honneur que vous nous aviez fait en acceptant de présider notre
mémoire.

Veuillez recevoir, l’expression de notre plus grande estime et notre profonde gratitude.
A NOS MAITRES ET HONORABLES JUGES DE MEMOIRE

Monsieur le Docteur RANDRIAMAHAZO Rakotomalala Toky

Professeur d’Enseignement Supérieur et de Recherche en Immunologie à la

Faculté de Médecine d’Antananarivo

Chef de Service de l’UPFR Immunologie au Centre Hospitalier Joseph

Ravoahangy Andrianavalona

Madame le Docteur RAKOTO ALSON Aimée Olivat

Professeur Titulaire d’Enseignement Supérieur et de Recherche en Hématologie

à la Faculté de Médecine d’Antananarivo

Ancien Directeur de l’Etablissement du Centre Hospitalier Universitaire Joseph

Ravoahangy Andrianavalona

Chef de service de l’ UPFR Hématologie au Centre Hospitalier Joseph

Ravoahangy Andrianavalona

Qui ont accepté très spontanément de siéger dans ce jury.

Nous leur sommes très reconnaissants de vouloir porter intérêt à ce travail. Qu’ils en
soient vivement remerciés.
A NOTRE MAITRE ET DOYEN DE LA FACULTE DE MEDECINE
D’ANTANANARIVO

Monsieur le Professeur RANDRIAMAROTIA Harilalaina Willy Franck

Nos hommages les plus respectueux.

A TOUS NOS MAITRES DE LA FACULTE DE MEDECINE

D’ANTANANARIVO

En reconnaissance de leurs précieux enseignements.

A TOUS LES MEDECINS ET ENCADREURS DE STAGES QUI M’ONT

ACCUEILLIS DURANT NOS STAGES HOSPITALIERS

A TOUT LE PERSONNEL DU DEPARTEMENT D’IMMUNOLOGIE DU CHU

DE MONTPELLIER

A TOUT LE PERSONNEL ADMINISTRATIF ET TECHNIQUE DE LA

FACULTE DE MEDECINE D’ANTANANARIVO

A TOUS CEUX QUI ONT APPORTE LEUR PIERRE A L’EDIFICATION DE

CE MEMOIRE

Trouvez ici l’expression de notre grande reconnaissance et nos très vifs remerciements.
 SOMMAIRE
Pages
INTRODUCTION ............................................................................................................ 1
PREMIERE PARTIE : METHODES ET RESULTATS ................................................. 3
I. METHODES ................................................................................................................. 3

I.1. Objectifs............................................................................................................... 3

I.2. Cadre de l’étude .................................................................................................. 3

I.3. Type d’étude........................................................................................................ 4

I.4. Période d’étude ................................................................................................... 4

I.5. Durée de l’étude .................................................................................................. 4

I.6. Population d’étude.............................................................................................. 4

I.7. Critères d’inclusion ............................................................................................ 5

I.8. Critères de non-inclusion ................................................................................... 5

I.9. Critères d’exclusion ............................................................................................ 5

I.10. Taille de la population ...................................................................................... 5

I.11. Variables d’étude .............................................................................................. 5

I.12. Matériels ............................................................................................................ 6

I.13. Méthodologie ................................................................................................... 10

I.14. Analyse de données ......................................................................................... 13

I.15. Considération éthique .................................................................................... 13

II. RESULTATS ............................................................................................................. 13

II.1. Caractéristiques démographiques des patients ............................................ 14

II.2. Distribution des patients selon le type de pathologie ................................... 15

 II.3. Résultats des différentes techniques utilisées ............................................... 16

II.4. Performance des tests ..................................................................................... 25

DEUXIEME PARTIE : DISCUSSION ....................................................................... 27

I. SUR LA METHODOLOGIE ........................................................................... 27

II. CARACTERISTIQUES DE LA POPULATION D’ETUDE ....................... 27

III. PERFORMANCE DIAGNOSTIQUE DES

TESTS……………………………31

IV. CORRELATION ENTRE LES TESTS .......................................................... 38

V. RECOMMANDATIONS ET PERSPECTIVES ............................................ 42

CONCLUSION ............................................................................................................... 45

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ANNEXES
 LISTE DES FIGURES

Pages

Figure 1 : Hôpital Saint Eloi- CHU de Montpellier ........................................................ 4

Figure 2 : Préparateur de lames QUANTA-Lyser® ...................................................... 7

Figure 3 : Automate BIO-FLASH® ................................................................................ 7

Figure 4 : Automate Blue Diver® ................................................................................... 8

Figure 5 : Image représentant la bandelette et la cartouche pour l’immunodot ............. 9

Figure 6 : Aspect périnucléaire et cytoplasmique des ANCA à l’IFI ; PNN fixés

à l’éthanol ...................................................................................................... 11
Figure 7 : Répartition des patients selon l’âge ............................................................. 14

Figure 8 : Répartition des patients présentant une vascularite selon l’âge .................. 15

Figure 9 : Répartition des diagnostics des patients présentant une vascularite ........... 16

Figure 10: Répartition du résultat de l’IFI chez les patients ayant une vascularite ...... 17

Figure 11: Répartition du résultat de l’IFI chez les patients sans vascularite ............... 17

Figure 12: Répartition du résultat de la CIA chez les patients ayant une vascularite .... 18
Figure 13: Répartition du résultat de la CIA chez les patients sans vascularite ............ 18
Figure 14: Répartition du résultat de l’immunodot chez les patients ayant
une vascularite ............................................................................................. 20
Figure 15: Répartition du résultat de l’immunodot chez les patients sans
vascularite ................................................................................................... 20
 LISTE DES TABLEAUX

Pages

Tableau I : Calcul de la sensibilité, spécificité, VPP, VPN et VGT ......................... 13

Tableau II : Concordance entre l’immunofluorescence indirecte et

la chimiluminescence ......................................................................... 19
Tableau III : Concordance entre les résultats de l’immunofluorescence et
l’immunodot ....................................................................................... 21
Tableau IV : Concordance entre les résultats de la CIA et l’immunodot .................... 21

Tableau V : Caractéristiques des résultats de la cohorte obtenus avec l’IFI,

la CIA et l’immunodot ........................................................................ 23
Tableau VI : Profil diagnostique des patients atteints de vascularite dans la
cohorte ................................................................................................. 24
Tableau VII : Résultats de la chimiluminescence et l’immunodot .............................. 25

Tableau VIII: Performance diagnostique de la chimiluminescence et de

l’immunodot ........................................................................................ 25
Tableau IX : Performance de la CIA et l’immunodot selon l’antigène MPO
ou PR3 .................................................................................................. 26
Tableau X : Performance diagnostique de la CIA et de l’immunodot
selon la pathologie ............................................................................... 26
 LISTE DES ANNEXES

Annexe 1 : Classification de Chapel Hill actualisée en 2012

Annexe 2 : Algorithme décisionnel pour la recherche d’ANCA dans le cadre

du diagnostic de vascularite autoimmune
Annexe 3 : Identification des ANCA par immunofluorescence indirecte
Annexe 4 : Positivité des ANCA au cours des vascularites à ANCA
 LISTE DES ABREVIATIONS

AAV : vascularites associées aux ANCA

Ac : Anticorps
ANCA : Antineutrophil Cytoplasmic Autoantibodies
c-ANCA : fluorescence cytoplasmique des ANCA
CHU : Centre Hospitalier Universitaire
CIA : Chimiluminescence
EGPA : Granulomatose éosinophilique avec polyangéite
ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
FEIA : Fluorimetric Enzyme-linked ImmunoAssay
FFS : Five Factor Score
GFEV : Groupe Français d’Etudes des Vascularites
GPA : Granulomatose avec polyangéite
IFI : Immunofluorescence indirecte
MBG : Membrane Basale Glomérulaire
MPA : Micropolyangéite
MPO : Myéloperoxydase
ORL : Oto-rhino-laryngologie
p-ANCA : fluorescence périnucléaire des ANCA
PR3 : Protéinase 3
SGP : Syndrome de Goodpasture
VGT : Valeur Globale du Test
VPN : Valeur Prédictive négative
VPP : Valeur Prédictive Positive
 1

INTRODUCTION
Les vascularites systémiques constituent un groupe hétérogène de maladies,
caractérisées par l’existence d’une inflammation de la paroi vasculaire. Elles peuvent
être soit primitives survenant isolément, soit secondaires pouvant être révélatrices ou
compliquant l’évolution d’une maladie infectieuse, d’une connectivite, d’un cancer ou
être secondaire à une prise médicamenteuse [1]. Les lésions vasculaires peuvent toucher
les vaisseaux de tous calibres, et compromettre ainsi la perfusion des organes en aval.
Les vascularites systémiques primitives sont individualisées selon la classification de
Chapel Hill qui a été actualisée en 2012 et classe les vascularites selon le calibre des
vaisseaux touchés. Les vascularites associées aux anticorps anti-cytoplasme de
polynucléaires neutrophiles (AAV) font partie des vascularites intéressant
préférentiellement les vaisseaux de petit calibre (petites artères, artérioles, capillaires et
veinules) [2].

Les anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles (« antineutrophil

cytoplasmic autoantibodies » [ANCA]) sont des auto-anticorps dirigés contre des
antigènes présents dans les granules azurophiles des polynucléaires neutrophiles [3].
Les vascularites associées aux ANCA (AAV) sont un groupe de pathologies auto-
immunes systémiques, résultant en une destruction inflammatoire et nécrosante des
vaisseaux de faible diamètre [4]. Les AAV affectent des organes et tissus variés (reins,
poumons et voies aériennes, peau, articulations, muscles, cœur, système nerveux…), en
y causant des lésions et déficiences. Elles peuvent donc rapidement engager le pronostic
vital des patients, en particulier dans les formes rénales (glomérulonéphrite) et
pulmonaire. Plusieurs enzymes existent dans le cytoplasme des polynucléaires
neutrophiles mais la protéinase 3 (PR3) et la myélopéroxydase (MPO) ont été
identifiées comme étant les cibles préférentielles des ANCA. Les ANCA sont associés
aux vascularites systémiques, mais particulièrement à trois entités cliniques : la
granulomatose avec polyangéite (GPA), la micropolyangéite (MPA) et la
granulomatose éosinophilique avec polyangéite (EGPA) qui vont être regroupés dans le
groupe des vascularites à ANCA. Cependant, les ANCA ont également été décrits dans
les vascularites à complexes immuns comme le syndrome pneumo-rénal avec anticorps
anti-membrane basale glomérulaire (anti-MBG) ou syndrome de Goodpasture (SGP),
dans les vascularites iatrogènes, au cours des maladies inflammatoires chroniques
 2

intestinales comme la rectocolite hémorragique, les hépatites auto-immunes, au cours

d’infections bactériennes ou virales voire dans d’autres situations cliniques [5-6].

Selon la déclaration de consensus international publiée en 1999, l’immunofluorescence

indirecte (IFI) devrait être utilisée comme méthode de dépistage pour détecter la
présence d’ANCA. Lorsque les ANCA sont positifs à l’immunofluorescence, les
échantillons doivent ensuite être testés par d’autres techniques pour identifier les
antigènes cibles MPO ou PR3 [7]. Actuellement, différents tests existent pour identifier
spécifiquement ces antigènes cibles : ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay),
CIA (Chemiluminescence), FEIA (Fluorimetric Enzyme-linked ImmunoAssay),
Immunodot blot ; sauf qu’aucune recommandation sur la meilleure technique à utiliser
n’existe. La présente étude a été faite au niveau du Centre Hospitalier Universitaire
(CHU) de Montpellier, au cours de laquelle les antigènes MPO ou PR3 ont été identifiés
par CIA et immunodot blot. Les 2 techniques existent au niveau du laboratoire
d’immunologie et l’équipe d’auto-immunité a voulu connaître leurs performances pour
permettre une bonne stratégie diagnostique des patients. Alors comme hypothèse de
travail, la CIA et l’immunodot ont la même performance dans le diagnostic des AAV.
Cette étude a ainsi pour objectif d’évaluer ces deux méthodes différentes dans le
diagnostic des AAV sur sérum de patients issus du CHU de Montpellier :

- CHIMILUMINESCENCE (BIO-FLASH®, WERFEN)

- IMMUNODOT BLOT (BlueDiver Dot®, D-TEK).

Nous évaluerons pour chaque test la sensibilité, la spécificité, les valeurs prédictives
positive et négative de chacun d’eux principalement dans le diagnostic de la GPA, de la
MPA et de l’EGPA.

Ce travail est subdivisé en deux parties. La première partie sera consacrée à la

méthodologie et les résultats de cette étude. Dans la deuxième partie seront exposées la
discussion, les recommandations et perspectives.
 3

PREMIERE PARTIE : METHODES ET RESULTATS

I. METHODES
I.1. Objectifs
Cette étude a pour objectif d’évaluer les deux tests suivants pour la détection des ANCA
dirigés contre la MPO et la PR3 dans le diagnostic des vascularites à ANCA (GPA,
MPA et EGPA) :

- CHIMILUMINESCENCE : BIO-FLASH®, WERFEN

- IMMUNODOT BLOT : BlueDiver Dot®, D-TEK
I.2. Cadre de l’étude
Cette étude a été réalisée au sein du Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier, au
niveau du département d’immunologie du CHU de Montpellier. Le CHU est situé à
Montpellier dans l’Hérault et exerce des missions fondamentales telles que le soin,
l’enseignement, la recherche. Le CHU de Montpellier est composé de huit
établissements qui sont répartis sur deux sites principaux : l’hôpital Arnaud de
Villeneuve, l’hôpital Lapeyronie, le centre Antonin Balmès, l’hôpital La Colombière,
l’hôpital Gui de Chauliac et l’hôpital Saint-Eloi, le centre de soins pour personnes âgées
Bellevue et le centre de soins dentaires.

Le laboratoire d’immunologie se situe au niveau de l’hôpital Saint-Eloi. Il est divisé en

quatre secteurs dont l’immunochimie, l’immunocellulaire, l’immunogénétique et l’auto-
immunité dans lequel s’est déroulé principalement cette étude. Le secteur d’auto-
immunité compte deux biologistes et trois techniciens. Les prélèvements sanguins
provenaient de différents services cliniques au niveau du CHU et les analyses ont été
effectués au niveau du secteur « auto-immunité » du laboratoire d’immunologie du
CHU. Les patients étaient des patients en cours de diagnostic ou des patients déjà
diagnostiqués et en cours de suivi pour une vascularite à ANCA.
 4

Figure 1 : Hôpital Saint Eloi -CHU de Montpellier

I.3. Type d’étude

Il s’agit d’une étude de cohorte prospective.

I.4. Période d’étude

L’étude a été réalisée sur une période de quatre mois allant du mois de mai au mois
d’août 2022.

I.5. Durée de l’étude

L’étude a duré treize mois, allant du mois d’avril 2022 par l’élaboration du protocole de
recherche jusqu’au mois de mai 2023 pour la présentation du mémoire

I.6. Population d’étude

Tous les échantillons des patients, quel que soit l’âge, parvenus au laboratoire
d’immunologie du CHU de Montpellier pour une recherche d’ANCA durant la période
d’étude figurent parmi la population d’étude.
 5

I.7. Critères d’inclusion

Ont été inclus des patients adultes et enfants dont les prélèvements sanguins ont été
acheminés au laboratoire d’immunologie :

- pour le dépistage et la quantification des ANCA dans le cadre d’un diagnostic de

vascularite systémique ;
- pour un suivi immunologique à la recherche d’ANCA chez les patients dont le
diagnostic de vascularite systémique à petits vaisseaux a été confirmé sur la base
de critères clinico-biologiques et histologiques ;
- pour le dépistage, la quantification ou le suivi des titres des ANCA dans le cadre
de pathologies au cours desquelles la présence d’ANCA a été citée.

I.8. Critères de non-inclusion

N’ont pas été inclus tous les patients chez qui une recherche d’ANCA n’a pas été
demandée.

I.9. Critères d’exclusion

Ont été exclus tous les patients qui possèdent les critères d’inclusion mais dont
l’échantillon de sérum n’a pas été exploitable (quantité insuffisante).

I.10. Taille de la population

Il s’agit d’une étude exhaustive (tous les échantillons testés au laboratoire durant cette
période).

I.11. Variables d’étude

L’étude concernait les caractéristiques démographiques, cliniques et biologiques des
patients. Ont été étudiées des variables dépendantes et indépendantes.

Les variables dépendantes sont caractérisées par :

- les paramètres cliniques englobés dans le diagnostic établi par les experts : la
GPA, la MPA, l’EGPA, le SGP et autres diagnostics ;
- les paramètres biologiques représentés par les résultats de chaque technique : le
résultat de l’IFI, la chimiluminescence et l’immunodot.
 6

Concernant les paramètres cliniques, il a été recherché sur le dossier médical de chaque
patient recruté, le diagnostic établi qui a été subdivisé en GPA, MPA, EGPA, SGP et
autres diagnostics.

Pour les paramètres biologiques :

▪ L’IFI est considérée comme positive si la fluorescence est présente à partir d’une
dilution à 1/50è et l’aspect de la fluorescence doit être caractérisée
(cytoplasmique ou périnucléaire) si elle est identifiable
▪ Pour la CIA, positifs sont les échantillons avec un titre d’anticorps anti-MPO ou
anti-PR3 supérieur à 20 UI/ml
▪ L’immunodot est rendu positif lorsqu’un trait de couleur violet devient visible
sur le site de la réaction enzymatique (MPO, PR3 ou MBG)

Les variables indépendantes sont constituées par l’âge et le genre.

Selon l’âge, les patients ont été répartis par tranche d’âge :

▪ Ceux de moins de 50 ans

▪ Ceux âgés de 50 ans et plus

I.12. Matériels
Pour la réalisation de cette étude, les matériels suivants ont été utilisés :

I.12.1. Matériels utilisés pour l’analyse

Pour l’IFI :

• Lames NOVA-lite® ANCA : Lame avec polynucléaires neutrophiles fixés à

l'éthanol
• Préparateur de lames QUANTA-Lyser®
• Microscope à fluorescence
 7

Figure 2 : Préparateur de lames QUANTA-Lyser®

Pour la chimiluminescence :

• Automate BIO-FLASH® avec ordinateur

• Cartouche de réactifs QUANTA Flash MPO/ PR3/ MBG

Figure 3 : Automate BIO-FLASH®

 8

Pour l’immunodot :

• Automate Blue Diver®

• Immunodot kit : BlueDiver Dot ANCA+GBM IgG (ANCAGDIV-24) de D-tek

Figure 4 : Automate Blue Diver®

I.12.2. Consommables

Les consommables ont été constitués par

• les tubes secs,

• les embouts,
• les cuvettes BIO-FLASH.

I.12.3. Réactifs

Pour l’IFI :

• Diluant
• Tampon de lavage
• Calibrateurs et contrôles
• Conjugué constitué par anticorps anti-IgG couplé à la fluorescéine
 9

Pour la chimiluminescence :

▪ Cartouche de réactifs QUANTA Flash MPO/ PR3/ MBG :

- Billes paramagnétiques revêtues de l’antigène à rechercher
- Tampon de dosage
- Anticorps IgG antihumain marqué à l’isoluminol
- Tampon de dilution d'échantillon
▪ Réactifs pour contrôles dont pour chaque antigène :
- Un contrôle négatif (QUANTA Flash MPO/PR3/MBG Negative Controls)
- Un contrôle positif (QUANTA Flash MPO Positive Controls)
▪ Etalons :
- QUANTA Flash MPO/PR3/MBG Calibrators
▪ Eau de rinçage

Pour l’immunodot, le kit inclue :

▪ les cartouches dans lesquels sont intégrés les réactifs dont un diluant, une eau de
rinçage, un conjugué et un substrat
▪ la bandelette sur laquelle sont préalablement fixés les trois antigènes, un
contrôle positif et un contrôle négatif

Figure 5 : Image représentant la bandelette (à gauche) et la cartouche (à droite)

pour l’immunodot
 10

I.12.4. Autres

A part tout ce qui a été cité, il y a la centrifugeuse, la micropipette et le portoir.

I.13. Méthodologie
I.13.1. Etape pré-analytique
Pour un dépistage des auto-anticorps, être à jeun n’est pas nécessaire. Un prélèvement
sanguin a été réalisé sur tube sec par les services traitants. Le(s) tube(s) a/ont été
acheminé(s) au niveau du laboratoire. Le tube sec a été ensuite centrifugé à 4000 g
pendant dix minutes pour obtenir du sérum qui a été par la suite utilisé pour la détection
des auto-anticorps par IFI, puis par chimiluminescence et immunodot.

I.13.2. Etape analytique

Tous les échantillons ont été testés par IFI pour dépister la présence ou non d’ANCA et
identifier l’aspect de la fluorescence, puis par chimiluminescence sur le BIO-FLASH®
et immunodot sur le Blue Diver® pour identifier la spécificité anti-MPO, anti-PR3 ou
anti-MBG.

I.13.2.1. L’immunofluorescence indirecte

Il s'agit d'un test d’IFI pour la détection semi-quantitative des auto-anticorps ANCA
dans le sérum humain. La détection des ANCA par IFI a été réalisée sur des leucocytes
fixés à l’éthanol. Le test se déroule comme suit :

- Des lames NOVA-lite® contenant des PNN fixés à l’éthanol sont incubées avec
le sérum du patient dilué à 1/50è pendant 30 minutes à température ambiante.
- Après lavage, un anticorps anti-IgG couplé à la fluorescéine est ajouté, suivi
d’une période d’incubation de 30 minutes à température ambiante.
- Après une autre étape de lavage, une lamelle est entreposée sur la lame.

Une double lecture de la lame est faite par un technicien et un biologiste sur microscope
à fluorescence après excitation par un laser bleu (488nm) afin d’observer la présence ou
non d’ANCA et de déterminer l’aspect et le titre des anticorps.

La fluorescence se répartit de deux façons différentes : elle est localisée soit au niveau
cytoplasmique, ce qui correspond aux c-ANCA, soit autour du noyau de façon
 11

périnucléaire correspondant aux p-ANCA. L’IFI est considérée positive à partir d’un
titre d’anticorps supérieur à 1/50ème. Le test est négatif quand il y a très peu ou pas de
fluorescence.

Aspect cytoplasmique Aspect périnucléaire

Figure 6 : Aspect cytoplasmique et périnucléaire des ANCA à l’IFI ; PNN fixés à

l’éthanol

I.13.2.2. La chimiluminescence
L’automate qui a été utilisé est le BIO-FLASH® (INOVA Diagnostics Inc., San Diego,
États-Unis). Il s’agit d’un automate utilisé pour des analyses de routine en auto-
immunité, destiné à la détection quantitative des auto-anticorps dans le sérum humain.
Dans le système BIO-FLASH la conformation de l'épitope des antigènes natifs PR3 et
MPO et, par conséquent, une représentation fiable des épitopes, a été rapportée [8]. Le
test est totalement automatisé :

- L’appareil prédilue dans une cuvette en plastique jetable un échantillon de sérum

du patient à l’aide d’un tampon échantillon.
- Des billes de latex paramagnétiques sont recouvertes d’un antigène natif (MPO
ou PR3 ou MBG) et sont stockées dans une cartouche de réactifs.
- L’anticorps d’intérêt dans l’échantillon est capturé par l’antigène.
- De petites quantités de sérum dilué, des billes propres à l’analyse souhaitée et le
tampon de dosage sont mélangés dans une seconde cuvette et sont incubés à
37°C.
 12

- Un anticorps IgG antihumaine conjugué à l’isoluminol est ajouté et va

reconnaître l’antigène couplé aux billes.
- Le conjugué isoluminol est oxydé lorsque des solutions d’hydroxyde de sodium
et de peroxyde est ajoutée à la cuvette produisant une réaction luminescente.

Le système optique BIO-FLASH mesure la lumière produite par cette réaction en unités
de luminescence relatives (RLU). Les RLU sont proportionnelles à la quantité de
conjugué d’isoluminol lié, elle-même proportionnelle à la quantité d’autoanticorps lié à
l’antigène présent sur les billes.

I.13.2.3. L’immunodot blot

L’immunodot est réalisé à l’aide du Blue Diver®. Les tests utilisés sont basés sur une
méthode immuno-enzymatique. Les bandelettes sont composées d’une membrane fixée
sur un support plastique spécifique. Les antigènes MPO, PR3 et MBG purifiés sont
fixés sur des bandelettes de nitrocellulose. Les réactifs sont prêts à l’emploi et les tests
sont automatisés. Seule une étape initiale de dépôt de sérum sur la bandelette est faite à
la main.

Le test se déroule comme suit :

- Le Blue Diver® instrument incube les bandelettes successivement dans les puits
des cartouches.
- Les bandelettes sont incubées avec le sérum du patient.
- Les anticorps, s’ils sont présents dans l’échantillon, se lient à l’antigène
spécifique sur la membrane ; la fraction non liée est éliminée par lavage.
- Les bandelettes sont ensuite incubées dans le conjugué, qui se lie aux complexes
antigènes-anticorps à la surface de la membrane.
- Une incubation dans le substrat après une étape de lavage va permettre
l’apparition d’un produit insoluble violet qui précipite sur le site de la réaction
enzymatique si des anticorps sont présents dans l’échantillon.

L’intensité de la coloration est directement liée à la quantité d’anticorps présents dans

l’échantillon testé. Les résultats sont interprétés avec le logiciel Dr.DOT puis confirmés
par le biologiste. Les résultats obtenus sont de nature qualitative, positif ou négatif selon
l’intensité de la coloration. Selon la fiche technique, un échantillon est positif pour un
 13

anticorps spécifique si l’intensité de la couleur du dot antigène correspondant est

supérieure à l’intensité de la couleur du contrôle négatif. Inversement, un échantillon est
négatif pour un anticorps spécifique si l’intensité de la couleur du dot antigène
correspondant est inférieure ou égale à l’intensité de la couleur du contrôle négatif.

I.14. Analyse de données

Les données ont été saisies et analysées sur Microsoft Excel® 2010 puis traitées avec le
logiciel Epi Info® 7.2.2.6. La sensibilité, la spécificité, la VPP, la VPN sont calculées
selon leur formule (Tableau I).

Tableau I : Calcul de la sensibilité, spécificité, VPP, VPN et VGT

Malade Non malade

Test positif Vrais positifs Faux positifs
(VP) (FP)
Test négatif Faux négatifs Vrais négatifs
(FN) (VN)

❖ Sensibilité = VP / (VP+FN)
❖ Spécificité = VN / (VN+FP)
❖ VPP = VP/ (VP+FP)
❖ VPN = VN/ (VN+FN)
❖ VGT = (Se+Sp+VPP+VPN)/4

En vue de rechercher la liaison entre les variables dépendantes, entre les résultats
donnés par les trois techniques, le test de χ2 a été utilisé (p significatif si < 0,05).

I.15. Considération éthique

Le recueil des données sociodémographiques, cliniques et biologiques a été fait en
prenant en considération les règles globales d’éthique relatives au respect de la
confidentialité et la protection des données propres aux patients.

II. RESULTATS
Les résultats ont concerné les caractéristiques démographiques des patients, la
répartition des patients selon les pathologies, les résultats des trois techniques et
l’évaluation des tests.
 14

II.1. Caractéristiques démographiques des patients

Durant la période d’étude, 168 échantillons de patients chez qui une prescription
d’identification d’ANCA a été faite, ont été inclus. Parmi eux, il y eu 86 hommes et 82
femmes correspondant à un sex ratio de 1,04.

L’âge des patients testés variait de 2 ans à 90 ans. La figure 5 ci-dessous montre la
répartition des patients selon les tranches d’âge.

120

98
100

80
0-14 ans
60
15-24 ans
43
25-50 ans
40
> 50 ans
20 15
12

Figure 7 : Répartition des patients selon l’âge

L’âge des patients atteints de vascularite systémique variait de 12 à 89 ans. La moyenne

d’âge était de 52 ans ± 25. Vingt-deux d’entre eux ont eu moins de 50 ans. Presque trois
quarts de ces patients ont plus de 50 ans comme le montre la figure 6 et seulement 3 de
ces patients avaient moins de 25 ans, respectivement 12, 13 et 21 ans.
 15

22; 26%

62; 74%

< 50 ans > 50 ans

Figure 8 : Répartition des patients présentant une vascularite selon l’âge

II.2. Distribution des patients selon le type de pathologie

La moitié des patients ont présenté une vascularite (84) dont :

▪ 57,1 % de GPA
▪ 5,9 % d’EGPA
▪ 27,4 % de MPA
▪ 4,8 % de SGP
▪ 4,8 % avec autres diagnostics : vascularite à cellules géantes, vascularite à
l’Elmisol®, vascularite des gros vaisseaux, vascularite cryoglobulinémique
 16

60

50 48

40

30

23

20

10
5 4 4

0
GPA EGPA MPA SGP AUTRES

Figure 9 : Répartition des diagnostics des patients présentant une vascularite

II.3. Résultats des différentes techniques utilisées

II.3.1. Résultats de l’IFI

L’IFI a été positive chez 73,2 % (123) des patients recrutés et 65% (80) d’eux
présentent une vascularite. Si on ne considère que les patients atteints de vascularite,
l’IFI était positive chez 95,2% de ces patients. Chez ces patients, l’IFI a montré dans
35,7% une fluorescence périnucléaire, une fluorescence cytoplasmique chez 50%, 9,5%
regroupés dans les autres aspects de fluorescence (aspect à la fois périnucléaire et
cytoplasmique ; interprétable dû à la présence d’anticorps antinucléaire rendant
l’interprétation des ANCA difficile et d’autres échantillons chez qui l’aspect n’a pas pu
être déterminé), et 4,8% avec un résultat négatif (figure 10) .
 17

4; 5%

8; 9%

42; 50%

30; 36%

NEGATIF AUTRES ASPECTS c-ANCA p-ANCA

Figure 10 : Répartition du résultat de l’IFI chez les patients ayant une vascularite

Chez les patients sans vascularite, l’IFI a été positive chez 51% (43) avec une
fluorescence cytoplasmique chez 13%, périnucléaire chez 17% et les autres aspects ont
représenté 21%.

11; 13%

14; 17%
41; 49%

18; 21%

c-ANCA p-ANCA AUTRES ASPECTS NEGATIF

Figure 11 : Répartition du résultat de l’IFI chez les patients sans vascularite

 18

II.3.2. Résultats de la CIA

Le BIO-FLASH® qui représente la CIA a donné un résultat positif chez 73,8% (124)
des échantillons. Chez les patients atteints de vascularite, 96,4% (81) ont eu un résultat
positif. La spécificité antigénique retrouvée par cette méthode est représentée par la
figure ci-dessous et la MPO a été retrouvée dans la moitié des cas.

45 42
40
36
35
30
25
20
15
10
5 2 3
1
0

MPO PR3 MPOPR3 MBG NEGATIF

Figure 12 : Répartition du résultat de la CIA chez les patients ayant une vascularite

Chez les non-vascularites, la CIA était positive chez 51% et les anti- PR3 étaient les
plus retrouvés.

45
41
40

35

30
25
25

20

15 13

10
4
5
1
0
MPO PR3 MPOPR3 MBG NEGATIF

Figure 13 : Répartition du résultat de la CIA chez les patients sans vascularite

 19

Comme le montre le tableau suivant, dans 93,5% les résultats donnés par l’IFI et le
BIO-FLASH® concordent.

Tableau II : Concordance entre l’immunofluorescence et la chimiluminescence

IFI

Test positif Test négatif

χ2
n = 123 n = 45
Test positif 118 6

CIA 0,091
Test négatif 5 39

La valeur critique pour un niveau de signification de α = 0,05 et de 1 degré de liberté est

χ2c = 3,841 et depuis χ2 =0,091 < χ2c = 3,841 ; cela montre que l’hypothèse selon laquelle
l’IFI et la CIA ont la même performance n’est pas rejetée.

Maintenant, en utilisant l’approche de la valeur p, on constate que la valeur p associée à

cette statistique de test est p = 0,763. Depuis p = 0,763 > α = 0,05, nous concluons que
l’hypothèse de départ a été acceptée.

II.3.3. Résultats de l’immunodot

L’immunodot a rendu un résultat positif chez 43,4% (73) des échantillons. Pour les
patients présentant une vascularite, l’immunodot a été positif dans 78,6% (66). Chez ces
patients, l’immunodot a retrouvé une spécificité pour MPO chez 47,6% des
échantillons, pour PR3 chez 28,6% ; 1,2% des patients ont eu une spécificité pour les 2
antigènes, 1,2% une spécificité pour MBG et 21,4% ont eu un résultat négatif.

Au sujet des patients sans vascularite, l’immunodot n’a été positif que chez 8,3% (7)
des patients. La MPO était retrouvée chez 5,9%. Le résultat du dot a été alors négatif
chez 91,7% des patients sans diagnostic de vascularite.
 20

NEGATIF 18

MBG 1

MPOPR3 1

PR3 24

MPO 40

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Figure 14 : Répartition du résultat de l’immunodot chez les patients avec vascularite

NEGATIF 77

PR3 2

MPO 5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Figure 15 : Répartition du résultat de l’immunodot chez les patients sans vascularite

 21

Dans 67,9% les résultats donnés par l’IFI et l’immunodot ont été concordants (Tableau
III) ; un pourcentage qui n’est pas très loin de la concordance entre la CIA et
l’immunodot et qui a été de 68,5% (Tableau IV).

Tableau III : Concordance entre les résultats de l’immunofluorescence et l’immunodot

IFI

Test positif Test négatif

χ2
n= 123 n = 45
71 2
Test positif
Immunodot 46,296
52 43
Test négatif

La valeur critique pour un niveau de signification de α = 0,05 et de 1 degré de liberté est

χ2c = 3,841 et depuis χ2 = 46,296 > χ2c = 3,841, alors l’hypothèse selon laquelle l’IFI et
l’immunodot ont la même performance est rejetée.

En utilisant l’approche de la valeur p, on constate que la valeur p associée à cette

statistique de test est p = 0. Depuis p = 0 < α = 0,05, nous concluons que l’hypothèse de
départ est rejetée.

Tableau IV : Concordance entre les résultats de la CIA et l’immunodot

Immunodot

Test positif Test négatif

χ2
n = 73 n = 95

Test positif 72 52
CIA 49,075
Test négatif 1 43
 22

La valeur critique pour un niveau de signification de α = 0,05 et de 1 degré de liberté est

χ2c = 3,841 et depuis χ2 = 49,075 > χ2c = 3,841 ; cela révèle alors que l’hypothèse selon
laquelle la CIA et l’immunodot ont la même performance est rejetée.

Puis, en utilisant l’approche de la valeur p, on constate que la valeur p associée à cette

statistique de test est p = 0. Depuis p = 0 < α = 0,05, nous concluons que l’hypothèse
nulle est rejetée.

II.3.4. Résultats observés par les trois tests

Les résultats donnés par chaque test (IFI, CIA, DOT) sont représentés sous forme de
tableau avec le nombre correspondant chez les patients atteints de vascularite ou non.
Dans l’ensemble, les trois tests ont été négatifs chez 39 patients, et positifs chez 70
patients. Chez les 59 patients restants existe une discordance entre les trois tests. Les
résultats observés sont présentés sur le tableau V. Seuls les résultats positifs (« Pos ») y
sont mentionnés.
 23

Tableau V : Caractéristiques des résultats de la cohorte obtenus avec l’IFI, la CIA et

l’immunodot

IFI CIA Dot Vascularite

Cyto Péri C/P Autres MPO PR3 Autres MPO PR3 Autres OUI NON
Négatif Négatif Négatif 1 38
Pos Pos Pos 1 0
Pos Pos Pos 21 1
Pos 0 1
Pos Pos 0 1
Pos Pos 8 8
Pos Pos Pos 36 1
Pos Pos 2 3
Pos Pos Pos 0 1
Pos Pos 2 7
Pos Pos 1 0
Pos MPOPR3 MPOPR3 1 0
Pos MPOPR3 Pos 0 2
Pos Pos Pos 1 0
Pos Pos 0 1
Pos Pos Pos 1 2
Pos Pos 1 6
Pos Pos Pos 2 0
Pos Pos 2 5
Pos MPOPR3 0 2
Pos 1 2
MBG MBG 1 0
MBG Pos 1 0
MBG 0 1
Pos 1 2
IFI : immunofluorescence indirecte ; CIA : Chimiluminescence ; Cyto : aspect cytoplasmique ; Péri :
aspect périnucléaire; C/P : aspect à la fois cytoplasmique et périnucléaire ; MPO : myéloperoxydase ;
PR3 : protéinase 3 ; MBG : anti-membrane basale glomérulaire ; Pos : Positif
 24

Le tableau qui suit (Tableau VI) résume le profil diagnostique des patients atteints de
vascularite systémique dont la GPA, l’EGPA, la MPA et le SGP. Les quatre patients
avec autres diagnostics de vascularite ne sont pas représentés, dont un patient avec
vascularite à cellules géantes, une fille de 12 ans atteinte de vascularite iatrogène
secondaire à l’Elmisol®, une femme suspecte de vascularite des gros vaisseaux et le
dernier atteint de vascularite cryoglobulinémique.

Tableau VI : Profil diagnostique des patients atteints de vascularite dans la cohorte

GPA EGPA MPA SGP

NOMBRE 48 5 23 4

AGE MOYEN 55,2 69 61 58

GENRE Masculin 29 3 8 1

Féminin 19 2 15 3
IFI CYTO 28 2 - -

PERI 11 3 22 3

AUTRES 7 - 1 -

NEGATIF 2 - - 1
CIA MPO 12 4 23 3

PR3 33 1 - -

MBG 1 - - 1

NEGATIF 2 - - -
IMMUNODOT MPO 10 4 23 3

PR3 24 - - -

MBG - - - 1

NEGATIF 14 1 - -
GPA : granulomateuse avec polyangéite ; EGPA : Granulomateuse éosinophilique avec polyangéite ;
MPA : polyangéite microscopique ; IFI : immunofluorescence indirecte ; MPO : myélopéroxydase ;
PR3 : Protéinase 3
 25

II.4. Performance des tests

Pour le diagnostic des vascularites associées aux ANCA, la chimiluminescence présente

une sensibilité de 96,43% et une spécificité de 48,81%, quel que soit la pathologie en
cause. L’immunodot donne une sensibilité de 78,57% et une spécificité de 91,67%. Ces
résultats ont été obtenus en utilisant les formules Se = VP/(VP+FN) et
Sp = VN/(VN+FP) dont les nombres correspondants sont représentés sur les tableaux
suivants [VP = vrais positifs, FN = faux négatifs, VN = vrais négatifs et FP = faux
positifs]. Le tableau VIII résume les performances diagnostiques obtenues par les deux
tests.

Tableau VII : Résultats de la chimiluminescence et l’immunodot

Vascularites Non-vascularites

Test positif 81 43
Chimiluminescence
Test négatif 3 41

Test positif 66 7
Immunodot
Test négatif 18 77

Tableau VIII : Performance diagnostique de la chimiluminescence et de l’immunodot

Chimiluminescence Immunodot

Sensibilité 96,43 78,57

Spécificité 48,81 91,67

VPP 65,32 90
VPN 93,18 81

VGT 75,93 85,31

Selon l’antigène identifié, la CIA montre une meilleure sensibilité que l’immunodot tant
pour l’identification de la MPO que pour celle de la PR3 mais avec une VPP basse par
rapport au dot. La CIA offre une meilleure VPN avec 93,18%. Le dot offre cependant
une meilleure spécificité que la CIA avec 97,5% pour la PR3 et 93,9% pour MPO.
 26

Tableau IX : Performance de la CIA et l’immunodot selon l’antigène MPO ou PR3

MPO PR3
CIA Immunodot CIA Immunodot
Sensibilité 93,62 69,49 92,31 57,14
Spécificité 73,21 93,90 60,29 97,47
VPP 74,58 89,13 57,14 92,31
VPN 93,18 81,05 93,18 81,05
VGT 83,65 83,39 75,73 81,99

En isolant les patients selon la pathologie et l’antigène incriminé, c’est-à-dire les

patients atteints de GPA associée à la PR3, et les patients atteints de MPA et EGPA
associées à la MPO, la CIA et le dot offrent une bonne sensibilité dans le diagnostic de
MPA et EGPA. La bonne spécificité n’est observée que par l’immunodot dans le
diagnostic de GPA.

Tableau X : Performance diagnostique de la CIA et de l’immunodot selon la pathologie

GPA-PR3 MPA et EGPA-MPO

CIA Immunodot CIA Immunodot

Sensibilité 68,75 50,00 96,43 96,43

Spécificité 75,00 98,33 77,86 86,43

VPP 52,38 92,31 46,55 58,70

VPN 85,71 83,10 99,09 99,18

VGT 70,46 80,93 79,98 85,18

En résumé, par ces résultats nous pouvons conclure que la chimiluminescence et

l’immunodot n’ont pas les mêmes performances : la première est plus sensible et la
deuxième plus spécifique. On a observé plus de concordance entre les résultats donnés
par la CIA et l’IFI.
 27

DEUXIEME PARTIE : DISCUSSION

I. SUR LA METHODOLOGIE

Plusieurs études sur la comparaison de méthodes dans les vascularites à ANCA existent.
Sont rapportés les comparaisons entre IFI et ELISA, entre des différents kits d’ELISA,
la comparaison entre la méthode ELISA et la chimiluminescence. Cependant, les études
portant sur la comparaison entre chimiluminescence et immunodot ne sont pas
nombreuses. Cette étude permet de comparer ces deux techniques afin de connaître la
performance de chacune d’elles dans le diagnostic des AAV, permettant ainsi d’établir
une démarche diagnostique appropriée, surtout pour les patients nécessitant un
diagnostic urgent.

II. CARACTERISTIQUES DE LA POPULATION D’ETUDE

II.1. Caractéristiques démographiques de la population d’étude

Au bout de quatre mois de recueil des échantillons, la population d’étude a été

constituée de 168 échantillons de patients. Cette population a été sélectionnée à partir de
tous les échantillons acheminés au niveau du laboratoire d’immunologie du CHU de
Montpellier. Diverses analyses biologiques peuvent être faites au niveau du laboratoire
mais cette étude s’est concentrée sur la prescription d’ANCA durant la période d’étude.
L’âge des patients chez qui une demande d’identification des ANCA a été prescrite,
variait de 2 à 90 ans. Plus de 50% des patients avaient plus de 50 ans. Les AAV
surviennent préférentiellement entre 40 et 60 ans, c’est pour cela que plus de demandes
ont été observées chez les adultes. En effet, l’âge médian des patients au diagnostic de
la MPA et la GPA se situe dans la cinquième décennie. L’EGPA peut affecter des sujets
de tout âge, avec une fréquence maximale entre 30 et 50 ans. Des formes ont toutefois
été décrites chez l'enfant et le sujet âgé. En effet, la pathologie peut également survenir
chez les enfants. Cette étude a observé un taux de prescription à 7,1% chez les
personnes de moins de 14 ans. L'incidence annuelle de l'AAV rapportée dans une étude
rétrospective multicentrique française incluant 66 enfants, qui a été la plus grande
cohorte en Europe, est d’environ 0,5 par million d'enfants [9]. Des taux d'incidence plus
élevés, allant jusqu'à 6,39 cas/million d'enfants/an ont été rapportés dans une étude
canadienne [10].
 28

En ce qui concerne les patients qui sont atteints d’une vascularite dans la présente
cohorte, quel que soit son étiologie, ils ont représenté la moitié des échantillons
recrutés. L’âge de ces patients variait entre 12 et 89 ans. Les patients âgés de plus de 50
ans représentent 73 ,8%. Trois patients avaient moins de 25 ans, 2 adolescents de 12 et
13 ans et un jeune homme de 21 ans. Chez les enfants, l’apparition des AAV est
maximale au début de la deuxième décennie, l’âge médian au diagnostic étant d’environ
11-14 ans [9]. Une étude comparant la chimiluminescence contre l’ELISA, faite à Pékin
en 2017 a collecté des patients atteints d’AAV avec une tranche d’âge de 20 et 89 ans et
des patients avec MPO et PR3 positifs sans être atteints d’AAV âgés entre 17 et 91 ans
[11]. La limite supérieure de l’âge correspond à peu près dans cette étude de
Montpellier mais la population de Montpellier est plus jeune comparée à celle de cette
étude. Comparer l’âge de la population observée à Montpellier avec celle d’autres
études est difficile puisque la plupart des études faites sur les AAV souvent ne citent pas
l’âge des patients recrutés dans l’étude et le genre également n’est pas précisé.

II.2. Caractéristiques selon la pathologie diagnostiquée

Dans la présente étude, les patients peuvent être divisés en deux selon le diagnostic
final : les patients atteints de vascularite qui représentent la moitié (84/50%) et l’autre
moitié constituée par les patients qui n’ont pas de vascularite. Concernant les patients
atteints de vascularite, 48 d’entre eux sont atteints de GPA, 23 patients atteints de MPA,
5 malades d’EGPA, 4 malades de SGP et 4 atteints d’autres causes de vascularite dont
un avec une vascularite iatrogène secondaire à l’Elmisol®, une vascularite à cellules
géantes, une vascularite cryoglobulinémique et une vascularite des gros vaisseaux. Nous
pouvons dire que cette étude regroupe diverses formes de vascularite puisqu’elle permet
d’étudier les trois étiologies d’AAV, même si le nombre des patients n’est pas
équivalent. Les chiffres cités précédemment révèlent que la GPA représente la
pathologie la plus rencontrée. En effet, les études épidémiologiques faites jusqu’à
présent ont montré également une différence dans la fréquence de ces trois sous-types
ainsi que des variations dans différentes zones géographiques. Les données des années
1990 suggèrent que la GPA est plus fréquente que la MPA dans les populations
d'Europe du Nord, alors que dans les populations d'Europe du Sud, l'inverse était
observé [12]. Cependant, des études récentes ont suggéré que ce n'était pas aussi clair
que cela. Des données récentes provenant du Royaume-Uni suggèrent que la MPA est
 29

plus fréquente que la GPA dans la zone urbaine (13,3 par million et 8,2 par million,
respectivement) [13]. Dans le comté d'Olmsted, aux Etats-Unis, dans une population
d'origine nord-européenne, la fréquence de la GPA et de la MPA était à peu près
similaire (13 et 16 par million, respectivement) [14]. Les taux d'incidence de l'AAV
sont similaires dans la plupart des populations caucasiennes ; les populations étudiées
dans l'ouest des États-Unis, en Australie et en Nouvelle-Zélande sont principalement
des populations blanches d'origine nord-européenne. Des études menées dans des
populations d'origine non-européenne suggèrent une incidence plus faible. Une étude de
prévalence réalisée dans une zone urbaine de France a rapporté que la prévalence
globale de périartérite noueuse, GPA, EGPA et MPA dans la population d'ascendance
européenne était deux fois plus élevée à celle de la population d'ascendance non
européenne [15]. En Nouvelle-Zélande, la GPA est deux fois plus fréquente chez les
européens que chez les maoris ou les asiatiques [16]. En Chine, de grandes séries de cas
suggèrent que la MPA est plus fréquente que le GPA [17]. Dans une série multiethnique
de Chapel Hill aux Etats-Unis, la GPA est relativement rare chez les afro-américains par
rapport aux blancs de type caucasien [18]. Une étude comparative entre les régions du
Royaume-Uni et le Japon a observé que l'incidence globale de l'AAV était similaire
(22,6 par millions et 21,8 par million, respectivement). Au Japon, la GPA était
beaucoup moins fréquente (2,1 par million) que la MPA (18,2 par million) [19].

Dans tous les cas, l'EGPA est la moins fréquente des trois sous-types. C'est une des
vascularites systémiques les plus rares. Sa prévalence en France [15] a été estimée à
10,7 par million d'adultes dans la population générale. Son incidence est estimée entre
1,3 et 6,8 nouveaux cas par million d'habitants [20]. Elle est nettement plus élevée, de
l'ordre de 64,4 par million, dans des populations de patients asthmatiques traités, quelles
que soient les médications utilisées [21], témoignant du terrain particulier sur lequel
cette affection se développe. Notamment, l’incidence de l'EGPA chez les asthmatiques
ne varie pas, quels que soient les traitements antérieurs pris, notamment en ce qui
concerne l'utilisation d’antagonistes des récepteurs des leucotriènes.

Dans la plupart des études faites sur les comparaisons de méthode de diagnostic des
AAV, on observe rarement le recrutement des patients atteints de GPA, de MPA et
d’EGPA dans une même étude. On observe surtout des études centrées uniquement sur
des patients atteints de GPA, comme l’étude de N.Noel et al. à Paris [22] et de A.Radice
 30

et al. à Milan [23]. Il y a également les études qui recrutent des patients atteints de GPA
et de MPA. L’équipe de E. Csernok et al. en Allemagne a évalué des kits commerciaux
d’ELISA pour la détection d’ANCA anti-PR3 et anti-MPO dans le diagnostic de GPA et
MPA [24]. Dans cette étude figurent 50 patients atteints de GPA et 42 patients avec
MPA et les ANCA anti-PR3 ont été recherchés pour diagnostiquer la GPA tandis que
les anti-MPO ont été utilisés pour le diagnostic de la MPA. Une étude faite en Belgique
rassemblant les trois pathologies, a recruté 23 patients atteints de GPA, 12 patients avec
MPA et 3 patients atteints d’EGPA [25]. Il existe également des études dans lesquelles
des patients atteints d’AAV et de SGP sont rassemblés. Une étude réalisée par
M.Mahler et al. a recruté 81 patients atteints de GPA, 70 patients atteints de MPA et 90
patients présentant un SGP dans le but d’évaluer la performance de la
chimiluminescence dans les AAV et le SGP [26]. En effet, dans le cas de la CIA comme
dans le cas de l’immunodot, les anticorps anti-PR3, anti-MPO et anti-MBG peuvent être
simultanément recherchés par les kits commerciaux. De plus, les AAV et le SGP
figurent parmi les étiologies du syndrome pneumo-rénal. Il s'agit d'un syndrome aigu
associant une glomérulonéphrite rapidement progressive à une vascularite pulmonaire
responsable d'hémoptysie par capillarite alvéolaire. L'évolution peut être fatale par
hémorragie intrapulmonaire massive [27], ce qui justifie la recherche en urgence des
ANCA et des anticorps anti-MBG. D’où l’existence de kits commerciaux qui peuvent
rechercher simultanément les ANCA et les anticorps anti-MBG, aide relativement les
cliniciens avec la collaboration des biologistes à faire un diagnostic étiologique qui doit
être entrepris en urgence. Le syndrome pneumorénal représente quand même un motif
d’admission fréquent en unité de réanimation médicale, avec une mortalité estimée de
25 à 50% [27].

Dans la majorité de ces études comme dans d’autres études encore, la GPA reste la
pathologie le plus souvent rencontrée contrairement aux études portant sur le diagnostic
d’EGPA. Ces dernières sont moins fréquentes, du fait de la faible prévalence de la
pathologie mais également parce que l’identification d’ANCA au cours d’EGPA n’est
pas constante. Les résultats basés sur deux cohortes, décrits par Sinico [28] ont montré
que la fréquence des ANCA dans les EGPA était légèrement inférieure à 40 % et 37,6%
respectivement.
 31

Cette présente étude permet d’observer les trois formes de vascularites à ANCA et
également le SGP mais quatre des patients présents dans l’étude sont atteints d’autres
causes de vascularites systémiques dont vascularite iatrogène secondaire à l’Elmisol®,
une vascularite à cellules géantes, une vascularite cryoglobulinémique et une vascularite
des gros vaisseaux. De nombreux médicaments, appartenant à presque toutes les classes
pharmacologiques, ont été incriminés dans l’apparition d’ANCA, eux-mêmes souvent
associés à des vascularites. Les plus fréquemment cités sont des molécules utilisées
dans les traitements antithyroïdiens, en particulier le propylthiouracile (PTU) avec plus
d’une centaine de cas décrits [29]. Mais des antibiotiques comme la minocycline, des
psychotropes comme la clozapine, des anti-inflammatoires comme la sulfasalazine, la
D-Pénicillamine ou des anti-TNFα peuvent également induire des vascularites et des
ANCA. Ici dans cette cohorte, le médicament incriminé est le Levamisole (Elmisol®).

III. PERFORMANCE DIAGNOSTIQUE DES TESTS

III.1. L’immunofluorescence indirecte

Dans une déclaration de consensus internationale [7], il a été convenu que l’IFI faite à
l'aide de neutrophiles fixés à l'éthanol devrait être la base de la détection des ANCA.
L'IFI montre deux principaux motifs de coloration : un motif cytoplasmique (c-ANCA)
et un motif périnucléaire (p-ANCA). Le schéma c-ANCA qui montre une fluorescence
cytoplasmique granulaire avec une accentuation interlobulaire centrale est généralement
lié à la présence des PR3-ANCA et est associé à la GPA. L'image p-ANCA présente
une coloration périnucléaire ou nucléaire. Ce modèle est associé à la MPO-ANCA, mais
on l'observe également avec des anticorps dirigés contre d'autres enzymes neutrophiles.
La MPO-ANCA est principalement observée chez les patients atteints de MPA. La
coloration p-ANCA sans spécificité pour la MPO est associée à des maladies telles que
la colite ulcéreuse, la cholangite sclérosante, l'hépatite auto-immune et la polyarthrite
rhumatoïde.

Dans cette cohorte, l’IFI a montré une positivité chez 73,2% des patients recrutés. Les
65% de ces patients sont représentés par les patients atteints de vascularite. Une
fluorescence périnucléaire était retrouvée chez 35,7% de ces patients ayant une
vascularite. L’aspect c-ANCA était présente chez 50% de ces patients. Dans 4,8% des
cas, l’IFI s’est révélée négatif. Chez certains patients, un aspect à la fois périnucléaire et
 32

cytoplasmique était retrouvé ; un aspect doutant avec la positivité d’anticorps

antinucléaire a également été observé et chez certains échantillons chez qui le titre
d’anticorps était faiblement positif à 1/50è, l’aspect n’a pas pu être déterminé. Ces
patients représentent 9,5% des patients présentant une vascularite. Au CHU de
Montpellier, l’IFI est positive à partir d’une dilution de 1/50è. Une double lecture a été
faite chez tous les patients. L’utilisation de lames fixées au formol n’est pas
systématique dans le laboratoire et n’a pas du tout été faite au cours de cette étude. En
effet, en France, l’IFI est en grande majorité effectuée sur des lames commerciales, de
PNN fixés à l’éthanol [30]. En Europe, l’utilisation de lames fixées au formol est
également très variable en fonction des pays, allant de 0 % à 60% d’utilisation
systématique [31]. Le recours à des lames fixées au formol ne fait pas partie à l’heure
actuelle des recommandations internationales [32], mais relève davantage d’une
pratique organisationnelle. Elle est tout de même recommandée pour différencier une
fluorescence de type périnucléaire d’une fluorescence liée à la présence d’anticorps
antinucléaires [33], si aucune recherche d’anticorps antinucléaires n’est effectuée en
parallèle sur cellules HEp2. L’interférence des anticorps antinucléaires sur lames HEp2
n’a pas été étudiée dans la présente étude sauf chez certains patients chez qui une
prescription d’anticorps antinucléaires a été faite concomitamment. Les résultats de nos
patients nous montrent que l’IFI peut donner un résultat très hétérogène et la
confirmation par un test en phase solide est une étape indispensable.

Par ailleurs, dans cette cohorte, 95,2% des patients atteints de vascularite avaient alors
un test d’IFI positif pour la recherche d’ANCA. Pour cela, l’IFI reste tout de même la
méthode de référence pour la mise en évidence des ANCA. Dans cette cohorte, 35% de
nos échantillons avec IFI positive provenaient de patients qui n’avaient pas de
vascularite. Les ANCA ont été décrits non seulement dans la GPA, la MPA et l’EGPA,
les trois pathologies qui constituent essentiellement les AAV, mais aussi dans d’autres
pathologies dont les vascularites à complexes immuns comme le syndrome de
Goodpasture avec anticorps anti-MBG, dans les vascularites iatrogènes, ces 2
pathologies qui font partie de la classe des patients avec vascularite dans cette présente
étude ; au cours des maladies inflammatoires chroniques intestinales comme la
rectocolite hémorragique, les hépatites auto-immunes, au cours d’infections
bactériennes ou virales voire dans d’autres situations cliniques. La recherche des ANCA
 33

ne se limite pas aux vascularites des petits vaisseaux, en conséquence, l’interprétation

de l’IFI et le choix des examens complémentaires doit s’adapter au contexte clinique.
Chez les patients sans vascularite et dont le titre d’ANCA est supérieur à une dilution
1/50è, les étiologies retrouvées au cours de cette cohorte, sont les MICI, l’HAI, la
polyarthrite rhumatoïde, un cas de syndrome lympho-prolifératif auto-immun ou ALPS,
une infection bactérienne et la sarcoïdose. Dans ces situations cliniques, les ANCA
pourraient n'être que les marqueurs d'une activation de longue durée des PNN avec une
libération chronique de molécules granuleuses capables de briser la tolérance dans
certains contextes inflammatoires. L’IFI a été l'étalon-or pour la phase aiguë du
diagnostic comme pour la recherche d’ANCA mais aussi les anticorps anti-MBG, mais
elle nécessite un personnel qualifié et expérimenté. C'est pourquoi nous faisons appel à
un personnel qualifié et expérimenté. Dans le laboratoire d’immunologie du CHU de
Montpellier, une double lecture doit être faite et par des personnels qualifiés et habilités.
L'avantage de l'IFI est qu'elle permet de détecter les patients atteints du syndrome
pneumo-rénal mais la technique prend du temps, c’est pour cela qu’un test de dépistage
rapide est un outil très utile. L’IFI est également compliquée par la difficulté de
déterminer les véritables titres d'anticorps. L’étude faite par Russel et al. a observé une
sensibilité/spécificité de l’IFI à 64%/91,5% respectivement [34]. Tandis que Sayegh et
al. a trouvé une sensibilité/spécificité de l’IFI de 83,3% /83,3% respectivement [35]. Le
taux de positivité des ANCA par l’IFI est de 27,2% dans l’étude de Sayegh et al.
Sinclair et al. avaient trouvé un taux de positivité de 26,9% [36] et Arnold et al. de
30,3% [37]. Dans l’étude de Robinson et al. l’IFI était positive chez 9,8% des patients
[38] et celle de Tsiveriotis et al. a montré un taux de 6% [39].

La présence des cas de faibles fluorescences mais aussi dans les cas où l’IFI avait été
peu informative nous obligent à ne pas minimiser la deuxième étape obligatoire qui est
la caractérisation de l’antigène cible par un test en phase solide qui dans cette étude est
un test par chimiluminescence et par immunodot. L’étape suivante permet d’éliminer les
cas de « faux positifs » en IFI. Par ailleurs, cette caractérisation de la spécificité des
ANCA doit suivre car les corrélations cliniques sont plus informatives avec une
spécificité définie qu'avec les profils de fluorescence seuls [40]. Pourtant des
discordances peuvent survenir entre les résultats et dans la majorité des cas, les
discordances sont dues à des AAN qui interfèrent ou à des ANCA dirigés contre des
 34

antigènes cibles autres que MPO et PR3 (cathepsine, BPI, élastase, lactoferrine…) dont
les spécificités ne sont pas recherchées car jusque-là aucune association clinique
spécifique n’a été identifiée.

III.2. La chimiluminescence

Historiquement, l’identification des PR3- et MPO-ANCA après le dépistage des ANCA

par IFI est suivi d’un test ELISA qui est basé sur une technique immunoenzymatique
utilisant des antigènes PR3 et MPO directement immobilisés [41]. En effet, le test
ELISA est la méthode traditionnelle de détection des anticorps MPO et PR3, mais il
présente certains défauts, puisqu’il est long et laborieux et il ne permet pas d'effectuer
des tests à grande échelle [33]. C’est en 1983 qu’Anthony Campbell et Ashok Patel [42]
ont mis au point les premiers prototypes d'un immunodosage par chimiluminescence.
Par la suite, l'utilité de la CIA s'est rapidement développée, d'abord dans le domaine de
la chimie, puis dans celui de la médecine pour le diagnostic des maladies infectieuses
[43-44]. Inova Diagnostics a été l'une des premières sociétés de diagnostic à
commercialiser la CIA dans le domaine de l’immunologie notamment dans le domaine
de l'auto-immunité : dans le domaine de la maladie cœliaque, du syndrome des
antiphospholipides, de la polyarthrite rhumatoïde, de la vascularite des petits vaisseaux
et des maladies du tissu conjonctif. Les tests de CIA sont réalisés à l'aide de la
plateforme technologique BIO-FLASH®. Comme il a été dit, les échantillons dans cette
cohorte ont été testés sur BIO-FLASH®. Avec de nombreux avantages qui sont
l’automatisation, une reproductibilité élevée, des résultats séquentiels après 30 min et un
débit de test élevé, la CIA pourrait être un outil prometteur pour la détection de routine
des anticorps MPO et PR3 [45-46] ce qui répond au besoin impérieux d'une détection
rapide des ANCA. A part le système BIO-FLASH, il existe d'autres plateformes de CIA
disponibles pour la détection d'auto-anticorps notamment le Zenit RA (Menarini
Diagnostics, Florence, Italie) ou le LIAISON (Diasorin, Saluggia, Italie). Cependant, le
système BIO-FLASH® est le CIA le plus utilisé dans le domaine de l'auto-immunité
[47].

Mahler et al. en étudiant la performance de la CIA à travers BIO-FLASH®, a comparé

la CIA avec l’ELISA et a trouvé une concordance positive de la CIA PR3 par rapport à
l'ELISA de 100%, une concordance négative à 92,5% et une concordance globale de
 35

95,8%. Pour la MPO, le pourcentage de concordance positive de la CIA par rapport à

l'ELISA était de 100%, celui de la concordance négative à 85,7% et la concordance
générale à 91,5%. Les titres de PR3 et de MPO-ANCA mesurés par ELISA et par CIA
étaient fortement corrélés [48]. Mahler et al, avaient aussi comparé le QUANTA Flash
nGBM® avec l'EliA GBM® et avait trouvé une concordance globale de 95,8% [49].
Dans l'étude de Kaul et al. les résultats des tests PR3 et MPO-ANCA du panel BIO-Plex
2200 Vasculitis ont été comparés aux tests Varelisa® PR3 et MPO (Phadia, Freiburg,
Allemagne) et les accords positifs étaient de 93,1%, 95,4% de concordance entre les
résultats négatifs, et 94,4% de concordance globale pour la PR3. Pour la MPO-ANCA,
les accords étaient de 93,4% pour les résultats positifs, 99,2% de concordance négative
et 97,7% de concordance globale [50]. Ces études permettent de conclure que la CIA et
l’ELISA donne dans la majorité les mêmes résultats mais la CIA est-elle tout aussi
performante que l’ELISA ?

Dans une autre étude faite sur une analyse de la performance de BIO-FLASH sur les
anticorps anti-PR3, anti-MPO et anti-MBG par Mahler et al., les sensibilités/spécificités
étaient de 70,4%/98,2% pour la PR3, 79,5%/98,7% pour la MPO et 95,6%/99,6% pour
les anticorps anti-MBG [26]. Au cours de cette étude, de bonnes concordances ont été
observées entre l’ELISA et CIA. Les accords positifs étaient de 98,2%, les accords
négatifs de 96%, et une concordance globale à 96,7% pour les anti-PR3. Pour les anti-
MPO, les accords positifs, négatifs et totaux sont respectivement de 100%, 87% et 91%
et respectivement de 98,8%, 97,1% et 98,3% pour les anticorps anti-MBG. Par toutes
ces études et bien d’autres encore on pourrait alors conclure que la CIA peut très bien
substituer l’ELISA dans le diagnostic des AAV mais aussi dans le syndrome de
Goodpasture [26]. Dans cette cohorte de Montpellier, la CIA par le système BIO-
FLASH® offre une sensibilité de 96,4% et une spécificité de 48,8% dans le diagnostic
d’AAV. Selon les anticorps, les sensibilités/spécificités étaient de 92,3%/60,3% pour la
PR3, 93,6%/73,2% pour la MPO et 100%/97,6% pour la MBG. Ce qui fait que la CIA
est une technique sensible mais peu spécifique dans cette étude, ce qui ne concorde pas
avec l’étude faite par Mahler et al qui trouve que le BIO-FLASH® procure une bonne
spécificité mais pas une meilleure sensibilité dans le dosage des anti-PR3 et des anti-
MPO. Cependant les populations dans l’étude de Mahler et al et la population d’étude
de Montpellier diffèrent. Mahler et al ont recrutés des patients dont le diagnostic de
 36

vascularite était déjà bien défini. Pour les anticorps anti-MBG, la sensibilité et la
spécificité dans cette étude comme dans l’étude de Mahler et al. sont bonnes. On
rappelle cependant que dans cette cohorte faite à Montpellier, le nombre de patients
avec SGP n'était que quatre ; contrairement dans l’étude de Mahler et al où il y avait 90
patients atteints de SGP. Dans 93,45%, les résultats obtenus par l’IFI et le BIO-
FLASH® concordaient. L’étude faite par Damoiseaux et col. ne montre aucune de
différence ni de sensibilité ni de spécificité entre l'ELISA (Inova QuantaLite, Euro-
Diagnostica, Euroimmun, Orgentec), la FEIA (Thermo-Fisher), le dosage par CIA
(Inova QuantaFlash), le multiplex (BioRad) pour la détection des anticorps anti-MPO et
anti-PR3. Pour tous ces tests immunologiques, la spécificité du PR3-ANCA (98-99%)
était supérieure à celle de la MPO-ANCA (96-99 %) [51].

Ces quelques lignes montrent la performance de la CIA, mais voyons ci-dessous

comment est celle de l’immunodot.

III.3. L’immunodot

La technique de l’immunodot pour la recherche des anticorps a été introduite par Paul
Herbrinck et col. sous l’appellation de « Antigen Spot Test » ou AST en 1982 [52]. Les
auteurs se sont inspirés de la technique du Western blot, ou immunotransfert ou
immunoempreinte, développée quelques années auparavant. Mais, contrairement à cette
dernière, les protéines ne sont pas transférées d’un gel d’acrylamide sur une membrane
de nitrocellulose, mais sont directement appliquées sur des bandelettes sous forme de
spots pour former des « dots ». Quelques variantes techniques ont été apportées : les
dépôts de protéines peuvent avoir une forme ronde (dot-spot) ou linéaire (dot-line), et
d’autres supports que la nitrocellulose ont été proposés (dérivés de la cellulose ou du
nylon). Plusieurs antigènes différents peuvent être déposés sur la même membrane
permettant ainsi la détection simultanée de nombreux anticorps différents. La lecture
des résultats par simple appréciation visuelle de la coloration fournit des résultats
qualitatifs, à la limite semi-quantitatifs si l’on tient compte de l’intensité de la
coloration. Il est parfois possible de faire une interprétation semi-quantitative en
utilisant un scanner qui mesure l’intensité de la coloration des bandes ou des spots. Au
CHU de Montpellier, c’est le dot fabriqué par D-Tek qui a été utilisé et la lecture par le
scanner donne un résultat qualitatif : positif ou négatif. Le premier immunodot pour la
 37

détection d’autoanticorps a été présenté en 1990 par la firme LipoGen (USA), le

RheumaStrip ANA, utilisant des protéines recombinées RNP, Sm, SS-A et SS-B, ainsi
que de l’ADN de thymus de veau. Depuis, de nombreux immunodots ont été
commercialisés et ils sont de plus en plus utilisés dans les laboratoires. Ils prennent tout
leur intérêt pour les analyses au coup par coup : soit pour confirmer un aspect de
fluorescence (exemple : anticorps anti-PR3 dans le cas d’une fluorescence
cytoplasmique typique), soit pour répondre à une demande urgente (exemple : anticorps
anti-MBG), soit, plus généralement, pour répondre à des demandes de recherches
d’autoanticorps trop peu nombreuses pour justifier l’utilisation de techniques comme
l’ELISA ou la CIA qui sont mieux adaptées aux analyses en série. Leur premier
avantage est la simplicité : réalisés en général manuellement, ils ne nécessitent aucun
appareillage particulier et sont peu onéreux [53]. Leur deuxième avantage réside
précisément dans la possibilité de rechercher simultanément plusieurs anticorps. Leurs
limites tiennent d’abord aux quantités d’échantillons à analyser. Les kits BlueDiver Dot
de D-Tek sont composés de 24 bandelettes et la capacité maximale de test est de 24
bandelettes qui sont incubées simultanément. Ces tests sont bien adaptés à des
recherches ponctuelles, soit pour répondre à une demande rare, soit pour contrôler ou
préciser un résultat obtenu par une autre technique, en particulier après l’analyse d’un
sérum par IFI. Cependant, il existe sur le marché des appareils qui permettent de traiter
simultanément jusqu’à 48 bandelettes pour répondre à des demandes plus importantes
(ProfiBlot™ de Tecan, Autoblot de Genelabs®Diagnostics).

Dans une étude effectuée par Savegh et al., la sensibilité et la spécificité obtenues avec
la combinaison entre IFI et immunodot pour le diagnostic d’AAV (GPA, MPA et
EGPA) étaient respectivement de 83,3% et 83,5 %. Lorsque l'analyse a été limitée aux
patients présentant c-ANCA anti-PR3 ou p-ANCA anti-MPO typiques, la sensibilité et
la spécificité du diagnostic d’AAV étaient de 82,3% et 100 % [35]. Ils ont conclu que la
combinaison IFI/Immunodot confère une bonne sensibilité/spécificité pour les AAV
nouvellement diagnostiquées. Dans la présente cohorte, l’immunodot de D-tek offre une
sensibilité de 78,6% et une spécificité de 91,7%. Il a une meilleure sensibilité de 69,5%
pour rechercher les anti-MPO par rapport aux anti-PR3 à 57,1% mais une meilleure
spécificité pour les anti-PR3 à 97,5% par rapport aux anti-MPO à 93,9%. Pour le
diagnostic des GPA-PR3, ce dot offre une faible sensibilité de 50% mais une bonne
 38

spécificité de 98,3%. Cependant, pour le diagnostic de MPA et d’EGPA-MPO, il a une

bonne sensibilité de 96,4% mais une spécificité à 86,4%. Les chiffres donnés par la
fiche technique BlueDiver D-tek montrent une bonne sensibilité ainsi qu’une bonne
spécificité de 93%/>99% respectivement pour les anti-MPO et 97%/99% pour les anti-
PR3 et > 99%/97% pour les anti-MBG. Pour détecter les anticorps anti-MBG, ce dot a
effectivement une bonne sensibilité et une bonne spécificité correspondant à 100%.

Actuellement peu de données sur les performances diagnostiques des immunodots en

auto-immunité sont disponibles et surtout dans les AAV. Mais ils sont de plus en plus
utilisés par les laboratoires. Dans le domaine de l’auto-immunité les immunodots sont
bien adaptés aux recherches ponctuelles d’autoanticorps puisqu’ils sont simples à
réaliser, ils ne nécessitent pas d’appareillage particulier, et ils sont peu onéreux. Une
faible sensibilité mais bonne spécificité est également retrouvée dans une étude
comparant cinq kits de détection des anticorps anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA)
dans le sérum pour le diagnostic de la maladie de Cröhn. Dans cette étude, l’immunodot
avait été comparé avec l’ELISA et l’IFI et avait montré une sensibilité de 33% et une
spécificité de 100%. Une évaluation de l’immunodot dans le diagnostic d’hépatite auto-
immune de type 1 a révélé une sensibilité de 70% et une spécificité de 76% excluant
ainsi dans cette étude l’utilisation de l’immunodot comme outil de dépistage mais aussi
comme test de confirmation. Bien évidemment, l’immunodot, tout comme les autres
méthodes immunologiques voisines, est grandement dépendant de la nature et de la
qualité de l’antigène immobilisé sur la membrane. On fait appel à des antigènes natifs,
extraits de tissus par des méthodes physicochimiques ou par immunoaffinité, à des
protéines recombinées ou encore des antigènes synthétiques. Dans le cas des
immunodots sur les ANCA, des antigènes purifiés sont utilisés.

IV. CORRELATION ENTRE LES TESTS

Les ANCA sont utiles pour le diagnostic de l'AAV, mais leur utilisation comme
biomarqueur diagnostique est insuffisante. Leur diagnostic repose sur la présentation
clinique, la positivité des ANCA qui ne sont pas toujours présents, et dans la mesure du
possible sur une preuve histologique de vascularite. Une étude de Damoiseau et al.
confirme qu'une fraction de patients atteints d’AAV peut être négative pour les ANCA.
En fonction du test, 11-17% des patients atteints d’AAV étaient négatifs par IFI dans
 39

cette étude et 9-16% par dosage immunologique [51]. Par conséquent, un diagnostic
d’AAV ne peut être exclu chez les patients ANCA négatifs. Des biopsies rénales et/ou
autres doivent être réalisées chez ces patients. Mais il existe des cas d’AAV
séronégatives, des patients qui remplissent les critères d’AAV sans retrouver d’ANCA.
Dans cette cohorte, il y avait un cas de GPA séronégatif qui avait déjà été diagnostiqué
en 2009. Il a été négatif tant en IFI mais également sur dosage par CIA et immunodot.
Dans une cohorte tunisienne, sur 32 patients inclus, 33,33% soit patients étaient
séronégatives dont des patients atteints de GPA et d’EGPA [54]. Peu de données parlent
des AAV séronégatives. Dans les études menées par l'European Vasculitis Study Group,
10 à 20 % des patients atteints de GPA, de MPA et d’EGPA ou une glomérulonéphrite
idiopathique rapidement progressive étaient ANCA négatifs [55]. Dans une grande
cohorte de 213 patients atteints de glomérulonéphrite rapidement progressive, étudiés
par le groupe de Chapel Hill aux Etats-Unis, la probabilité d'une négativité des ANCA
était d'environ 10 à 20 % [56]. Lorsque patient est négatif pour les ANCA, le résultat
peut être un faux négatif en raison d'une réactivité à des épitopes qui ne sont pas encore
reconnus dans la plupart des tests qui existent pour identifier les ANCA [57].

Concernant les AAV, chez 75% (soit 63 sur 84) de nos patients atteints d’AAV, les 3
techniques utilisées pour détectées les ANCA avaient donné un résultat positif. En
général, PR3-ANCA est associé à la GPA et MPO-ANCA à la MPA et l’EGPA. Si on
ne considère que les GPA liées à la présence de PR3-ANCA, la CIA n’a ni une bonne
sensibilité ni une bonne spécificité avec 68,75% et 75% respectivement tandis que
l’immunodot est moins sensible mais spécifique avec 50% de sensibilité et 98,3% de
spécificité. Pourtant plusieurs cas de patients atteints de GPA positifs pour la MPO-
ANCA et négatifs pour la PR3-ANCA ont été signalés et dans le cas des patients vus
dans cette cohorte 25% (soit 12 sur 48) des patients atteints de GPA sont positifs pour la
MPO-ANCA. Trois d’entre eux n’ont pas été identifiés par le dot. Cependant dans le
diagnostic des MPO-ANCA associés à la MPA et l’EGPA, la CIA ainsi que
l’immunodot ont une sensibilité similaire à 96,4% ; l’immunodot a une meilleure
spécificité à 86,4% par rapport à la CIA avec 77,9%. Dans cette cohorte, la spécificité
antigénique retrouvée chez tous les MPA était la MPO et elle était identifiée avec les 2
techniques. Chez les patients atteints d’EGPA, 4 sur 5 étaient MPO-ANCA positifs, un
était PR3 positif sur QUANTA-FLASH mais négatif sur le dot. En comparant les
 40

résultats obtenus par CIA et le dot, une concordance entre les résultats n’est observée
que chez 68,5%. Dans 31,5%, les résultats ne concordent pas avec un résultat positif
donné par le QUANTA-FLASH mais qui n’est pas détecté par le Blue Diver Dot. Près
d’un tiers de ces échantillons proviennent de patients atteints de vascularite et les deux
tiers restants étaient des patients indemnes de vascularite. Quant à la spécificité
antigénique identifiée, dans plus des deux tiers des échantillons, des anticorps dirigés
contre PR3 ont été identifiés. Ces constatations confirment nos résultats : le QUANTA-
FLASH est plus sensible mais le Blue Diver Dot est plus spécifique et l’étude de
corrélation faite entre ces 2 techniques montre d’ailleurs qu’elles n’ont pas la même
performance diagnostique. Pourtant, on observe plus une concordance les résultats entre
CIA et IFI, chez 93,5% des résultats et le test de Mac Nemar fait entre l’IFI et la CIA
confirme que ces 2 techniques ont les mêmes performances.

Par ailleurs, tous les patients atteints de vascularite systémique ne sont pas ANCA IFI
positifs, de sorte que l’IFI peut ne pas être suffisamment sensible [58]. Dans la présente
cohorte, les échantillons de patients atteints de vascularite mais dont l’IFI était négatif
mais avec dosage immunologique positif étaient issus d’un patient de 21 ans atteint de
SGP et d’un patient de 30 ans atteint de GPA mais qui avait une double positivité en
PR3 et MBG. En effet, des anticorps anti-MBG sont présents dans la maladie de
Goodpasture dans laquelle on ne retrouve pas d’ANCA et qui constitue un diagnostic
différentiel des vascularites à ANCA. Depuis la fin des années 90, des cas de
vascularites primitives des petits vaisseaux dites double-positives, caractérisées par la
coexistence d’ANCA associés à des anti-MBG, sont progressivement rapportés [59].
L’incidence des vascularites double-positives ANCA/anti-MBG est estimée à 0,6 cas
par million d’habitants [60]. Selon les séries, cette entité représente 30 à 50 % des
vascularites à anti-MBG et 5 à 10% des vascularites à ANCA. L’étude de Jayne et al. a
montré en 1990 que, parmi les 889 patients présentant un tableau de glomérulonéphrite
rapidement progressive, 2 % présentaient une double positivité ANCA et anti-MBG
[61]. Chez la plupart des patients double-positifs présentant un tableau de
glomérulonéphrite rapidement progressive ou d’hémorragie intra-alvéolaire, les deux
anticorps ont été concomitamment recherchés et donc conjointement retrouvés au
moment du diagnostic. De nombreux articles rapportent des patients avec une
vascularite à ANCA présentant secondairement l’apparition d’une vascularite à
 41

anticorps anti-MBG [62-65]. L’apparition secondaire d’anticorps anti-MBG serait liée à

un phénomène d’extension d’épitopes (epitope spreading). L’activation des
polynucléaires neutrophiles par les ANCA entraîne leur dégranulation et la libération
conséquente de radicaux libres oxydants notamment au niveau du tissu rénal, ce qui
serait responsable de la destruction de la membrane basale glomérulaire [66]. Cette
destruction exposerait ainsi l’épitope alpha 3(IV)NC1 du collagène de type IV, pouvant
aboutir à une rupture de la tolérance et à la production des anticorps anti-MBG [67-68].
Cependant, les cas de patients présentant une vascularite à anti-MBG avec apparition
secondaire d’ANCA sont beaucoup plus rarement décrits [69-70].

En outre, les ANCA ne sont pas spécifiques de la vascularite, car des ANCA peuvent
également être détectés dans d’autres pathologies telles que les MICI avec 6 à 20 % des
cas dans la maladie de Crohn et 50 à 70 % des cas dans les rectocolites hémorragiques,
les hépatites auto-immunes (90 %), les arthrites rhumatoïdes (30 à 40 %), les cancers,
les infections (HIV, hépatites virales, paludisme…), au cours de la prise de certains
médicaments (hydralazine, thiouracile, levamisole…), etc. On retrouve également des
ANCA dont la caractéristique est de ne reconnaître ni la PR3, ni la MPO [55]. Les
étiologies retrouvées chez les 7 patients dont les 3 tests étaient positifs mais qui n’ont
pas de vascularite sont : les MICI, l’infection, la connectivite et un cas de fibrose
pulmonaire idiopathique. Il y avait un garçon de 13 ans présentant un syndrome
néphrotique et qui était traité par Levamisole, chez qui le diagnostic de vascularite n’a
pas encore établi mais dont les 3 tests étaient positifs avec une double positivité MPO
PR3 sur BIO-FLASH® mais le dot révélait une positivité de MPO uniquement. Ensuite,
l’IFI peut être positive mais les dosages immunologiques négatives. Dans 39,3% (33
patients) des patients non-vascularites, l’IFI et le BIO-FLASH étaient positifs mais le
dot négatif avec une spécificité pour la PR3 dans 63,6%, pour MPO dans 30,3% et une
double positivité MPO PR3 dans 6,1% (2 patients). Les étiologies reconnues les plus
fréquentes sont les MICI et les connectivites dont le lupus, la sclérodermie et la
polyarthrite rhumatoïde. Les 2 patients ayant une double positivité MPO PR3 étaient
atteint de syndrome de Marfan avec un taux de MPO plus important.

Les vascularites touchant les gros ou les moyens vaisseaux telles que la maladie de
Horton ou la maladie de Takayasu ne comportent qu’exceptionnellement des ANCA.
 42

En conséquence, les ANCA constituent un marqueur prédictif négatif pour ces

pathologies [71]. Dans cette cohorte, il y avait une femme chez qui on suspectait une
vascularite des gros vaisseaux et seule l’IFI était positive à 1/50è.

V. RECOMMANDATIONS ET PERSPECTIVES

La recherche d’un auto-anticorps a d’abord un but diagnostique. La valeur diagnostique

d’un auto-anticorps est très liée à sa spécificité. Toutefois, un test très spécifique, quasi
pathognomonique d’une maladie, a généralement une faible sensibilité (cas des anti-Sm,
anti- PCNA dans le lupus). Habituellement, les auto-anticorps dits de débrouillage
(facteur rhumatoïde, anticorps antiphospholipides, AAN, ANCA détectés en
immunofluorescence) ont une faible valeur diagnostique. En outre, la positivité de ces
autoanticorps conduit à la recherche de spécificités antigéniques qui ont une valeur
d’orientation diagnostique et tout résultat d’auto-anticorps doit être confronté au tableau
clinique, sa valeur clinique étant variable selon le contexte clinique. En guise
d’exemple, la positivité des ANCA au cours d’une glomérulonéphrite rapidement
progressive (insuffisance rénale en quelques semaines) va permettre d’orienter le
diagnostic vers une glomérulonéphrite nécrosante pauci-immune à ANCA (GPA, MPA
et EGPA). En effet, dans ce contexte, la valeur prédictive positive (VPP) des
ANCA/PR3+ est de 100 % avec une valeur prédictive négative (VPN) de 82 % [72],
alors que ces valeurs sont respectivement de 90% et 71 % pour l’IFI seule. Les formes
les plus sévères associent un taux d’anti-PR3 élevé, une créatinémie élevée et une
réduction des plaquettes. En situation d’urgence, la thérapeutique pourra être initiée
devant la seule positivité des ANCA (IFI et dosage immunologique) mais la preuve
histologique devra être rapidement apportée. Dans les AAV, la détection et la mise en
route du traitement sont particulièrement critiques pour assurer la réparation ad
integrum des organes atteints, notamment le rein. La biopsie rénale demeure
indispensable pour confirmer le diagnostic, adapter le traitement et pour des raisons
pronostiques. Par ailleurs, les auto-anticorps ont une place importante en termes de
pronostic. En effet, alors que leur association à une pathologie est rarement spécifique,
leur lien avec l’atteinte d’un ou plusieurs organes susceptibles, dans certains cas,
d’engager le pronostic vital ou fonctionnel, semble plus étroit. Ainsi, la positivité de
certains auto-anticorps peut être prédictive de l’apparition de manifestations cliniques
potentiellement graves : anti-MPO et glomérulonéphrite/vascularite pulmonaire. Au-
 43

delà de la valeur pronostique, certains auto-anticorps ont des titres qui fluctuent en
fonction de l’activité de la maladie. C’est le cas des anti-PR3 associés à la GPA.
L’ascension de leurs titres peut être annonciatrice d’une rechute de la maladie. Le risque
de rechute dépend du type de vascularite, de la spécificité des ANCA, la spécificité anti-
PR3 étant la plus à risque de rechute. Un patient sur deux avec une GPA va récidiver, il
est donc important d’utiliser les ANCA pour suivre ces patients [73]. Pour deux tiers
des patients, le taux des ANCA est corrélé avec l’activité de la maladie. En
conséquence, des variations importantes du taux d’ANCA (le risque de récidive est
doublé à six mois en cas de forte augmentation), une réapparition ou la persistance des
ANCA peuvent être utilisées comme signaux d’alarmes. Il est important de rappeler
qu’en aucun cas, les ANCA doivent être utilisés seuls pour adapter le traitement puisque
la corrélation entre le titre des ANCA et la clinique est imparfaite. À l’inverse, un
ANCA négatif est bon indicateur pour considérer que la maladie est bien contrôlée.
Cependant, individuellement, l'interprétation de la fluctuation des taux d'auto-anticorps
peut être difficile. Cette fluctuation des taux doit toujours être confrontée à l'évolution
clinique. Dans cette cohorte, le stade de la maladie n’a pas été pris en compte, ni le
traitement de la vascularite. Les ANCA ont été demandés dans un but diagnostique mais
également pronostique, et ils ont également été prescrits dans le cadre de suivi de la
pathologie, autant dans les vascularites que dans les autres pathologies. On sait juste que
peu de patients étaient au début du diagnostic, et le score FFS ou Five Factor Score n’a
pas pu être fait que chez ces patients. Il n’y avait que 15 patients soit 17 ,85% des
patients atteints de vascularite qui étaient nouvellement diagnostiqués durant la période
d’étude dont 7 patients atteints de GPA, 4 de MPA, 3 d’EGPA et 1 de SGP. Rappelons
que le FFS est un score pronostique, développé par le Groupe français d'étude des
vascularites (GFEV) en 1996 mais qui a ensuite été revisité. Ce score aide à choisir la
thérapeutique la plus appropriée pour les patients atteints de vascularites nécrosantes. Il
est basé sur la présence ou l’absence de cinq critères qui sont : un seuil d’âge (65 ans),
l’existence d’une insuffisance rénale, la présence d’une atteinte gastro intestinale
spécifique (perforation, hémorragie ou pancréatite), d’une atteinte cardiaque
(cardiomyopathie spécifique) et d’une atteinte oto-rhino-laryngologique ou ORL
(considérée comme un facteur protecteur). Les formes de bon pronostic ont un score
 44

FFS à 0 et les formes de mauvais pronostic sont celles dont le FFS est supérieur ou égal
à 1.

En raison de la sensibilité élevée des nouvelles méthodes, il a été proposé que le

dépistage de la MPO- et de la PR3-ANCA pourrait être effectué à l'aide de tests
immunologiques sensibles [25] tels que ELISA et les résultats vont ensuite être
confirmés par IFI [34].

Certes, aucun immunodosage ne peut être ni sensible ni spécifique à 100%. Le

biologiste a besoin d’une stratégie avec des tests garantissant une bonne sensibilité pour
ne pas méconnaître le diagnostic d’AAV et une bonne spécificité pour ne pas démarrer à
tort un traitement immunosuppresseur lourd. Cette cohorte montre que l'identification
par CIA garantit une meilleure sensibilité (96,4%) par rapport à l’immunodot (78,6%).
Cependant, cette dernière a une meilleure spécificité avec 91,7% contre 48,8% pour la
CIA. Même si de nombreuses études comparatives ont déjà démontré que la méthode
CIA offre une plus grande précision diagnostique, un consensus général n'a pas encore
été atteint sur la meilleure stratégie à adopter pour la révélation des ANCA. En se basant
sur les résultats de cette présente étude, nous proposons tout d’abord d’effectuer une
recherche d’ANCA sur IFI comme il a été stipulé dans les recommandations de la
déclaration de consensus internationale. Nous recommandons ensuite de confirmer les
résultats de l’IFI en testant la présence de MPO-ANCA et PR3-ANCA par le QUANTA
FLASH puisque par sa bonne sensibilité, elle a la capacité à bien identifier les malades.
La CIA offre également un avantage par son automatisation et son intérêt réside dans le
suivi quantitatif du dosage des auto-anticorps. Donc pour le suivi, la CIA est préférable
à l’IFI ; la première technique donnant des valeurs quantitatives alors que la seconde
technique est semi-quantitative et dépendante du technicien et/ou biologiste qui effectue
la mesure. Nous proposons d’utiliser l’immunodot qui confère une meilleure spécificité
pour compléter la CIA, en confirmant les nouveaux dosages positifs en CIA. Pour le
diagnostic d’urgence des patients forts suspects d’AAV, l’immunodot semble y avoir sa
place par sa spécificité mais également par sa simplicité. Certains auteurs
recommandent l’utilisation de deux techniques de dosage différentes et indépendantes
de l’IFI, d’où nous proposons un dépistage en IFI, un suivi quantitatif par
chimiluminescence et une confirmation par immunodot [74].
 45

CONCLUSION
Les vascularites systémiques sont des atteintes vasculaires caractérisées par une
inflammation de la paroi des vaisseaux sanguins artériels, veineux et des capillaires. Les
vascularites associées aux ANCA regroupent différentes entités de vascularites à petits
vaisseaux : la GPA, la MPA et l’EGPA. Le diagnostic de ces maladies repose sur un
faisceau d’arguments clinico-biologiques. Ainsi, l’identification des anticorps anti-PR3
ou anti-MPO a un rôle majeur dans l’orientation diagnostique vers la GPA pour les anti-
PR3 ou vers la MPA et l’EGPA pour les anti-MPO. D’autre part, des anticorps anti-
membrane basale glomérulaires sont présents dans la maladie de Goodpasture dans
laquelle on ne retrouve pas d’ANCA et qui constitue un diagnostic différentiel des
vascularites à ANCA. Devant l’importance de la biologie dans l’aide au diagnostic, il
convient d’avoir des méthodes diagnostiques robustes ayant une sensibilité et une
spécificité élevées. Cette étude est une cohorte prospective de patients du CHU de
Montpellier pour lesquels les ANCA ont été prescrits courant de l’année 2022. Cette
cohorte avait pour objectif d’évaluer la chimiluminescence et de l’immunodot pour
l’identification des anticorps anti-MPO et anti-PR3 sur les sérums des patients suivis au
niveau du CHU de Montpellier. Ainsi cette étude montre une meilleure sensibilité de la
chimiluminescence (96,43%) mais avec une spécificité moins bonne (48,81%) tandis
que l'immunodot est plus spécifique (91,67%) mais peu sensible (78,57%). Toutefois,
les deux méthodes peuvent être complémentaires. La présence d’ANCA serait d’abord
recherchée par IFI et la CIA serait utilisée pour identifier la spécificité antigénique en
cas d’IFI positive. L’immunodot pourrait être réalisé en seconde intention en cas de
doute diagnostique ou dans le cas de faibles positifs par chimiluminescence. Nous
recommandons également d’utiliser l’immunodot en première intention chez les patients
forts suspects de vascularite à ANCA nécessitant un diagnostic d’urgence. Pour
terminer, ce travail a été très bénéfique pour le laboratoire d’Immunologie du CHU de
Montpellier puisqu’il a permis une réévaluation des méthodes du laboratoire en secteur
d’auto-immunité. Cette étude sert également de base pour Madagascar dans le choix des
techniques à utiliser pour la mise en place d’un plateau technique d’auto-immunité.
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ANNEXE 1 : CLASSIFICATION DE CHAPEL HILL ACTUALISEE EN 2012

Selon le calibre des vaisseaux touchés

Vascularites des gros vaisseaux

Maladie de Horton ou artérite à cellules géantes

Maladie de Takayasu

Vascularites des vaisseaux de moyen calibre

Périartérite noueuse

Maladie de Kawasaki

Vascularites des petits vaisseaux

Vascularites associées aux anticorps anti-cytoplasme de polynucléaires

neutrophiles
Vascularites associées aux cryoglobulinémies

Purpura rhumatoïde

Vascularites leucocytoclasiques
ANNEXE 2 : ALGORITHME DECISIONNEL POUR LA RECHERCHE
D’ANCA DANS LE CADRE DU DIAGNOSTIC DE VASCULARITE
AUTOIMMUNE

Algorithme décisionnel proposé par l’European autoimmunity standardisation

initiative (EASI) group
ANNEXE 3 : IDENTIFICATION DES ANCA PAR IMMUNOFLUORESCENCE
INDIRECTE

⎯ Le substrat est représenté par des PNN de sujets sains de groupe O fixés à l'éthanol
(5 minutes à +4°C avec de l'éthanol à 96-99 %). Cependant, compte tenu des
difficultés de lecture, notamment liées à la présence d'AAN, d'autres fixateurs
peuvent être utilisés principalement le formol, mais aussi le méthanol.
⎯ Le sérum est à diluer au 1/40 dans du tampon phosphate salin (PBS) additionné de
sérum-albumine bovine (BSA) à 1 % pour diminuer le bruit de fond.
⎯ L'antisérum marqué par le fluorochrome est un anti-immunoglobuline humaine qui
peut être soit polyvalent, reconnaissant les trois isotypes majeurs
d'immunoglobulines (anti-IgG, -IgA, -IgM), soit monospécifique anti-IgG.
⎯ Les préparations sont montées entre lame et lamelle, en glycérine tamponnée.
⎯ Chaque série doit inclure un témoin négatif (sérum humain normal), et au moins
deux témoins positifs.
⎯ La lecture se fait au microscope à fluorescence, au grossissement 400, avec ou sans
immersion.
⎯ Si le test est positif, la description de l’aspect de la fluorescence doit être faite.
⎯ Trois aspects d'IFI sur PNN fixés par l'éthanol avec une relevance clinique ont été
décrits. Ils s'expliquent par la localisation des cibles.

1. Fluorescence cytoplasmique :
La fluorescence est cytoplasmique granulaire diffuse le plus souvent avec un
renforcement entre les lobes du noyau correspondant au c-ANCA. Sur PNN fixés par le
formol, la fluorescence reste cytoplasmique granulaire diffuse, avec le même
renforcement interlobaire, mais avec des grains plus grossiers. Sur PNN fixés par le
méthanol, l'aspect est identique à celui observé avec les PNN fixés par l'éthanol. Cet
aspect typique de c-ANCA est le plus souvent produit par des ANCA qui reconnaissent
la PR3.
 Ethanol Formol

c-ANCA

Aspect cytoplasmique des ANCA ; PNN fixés à l’éthanol et au formol

2. Fluorescence périnucléaire

Il correspond au p-ANCA. Il apparaît comme un marquage intense de la périphérie des

lobes nucléaires avec un centre presque négatif, conférant une image de "chou-fleur".
Le marquage est inhomogène d'une cellule à l'autre, avec plus ou moins de fines
ponctuations cytoplasmiques associées. Sur PNN fixés par le formol, l'aspect est
identique à celui observé avec les c-ANCA, à savoir grossièrement granulaire diffus à
renforcement interlobaire. Sur PNN fixés par le méthanol, il n'y a habituellement pas de
marquage. La variabilité de la fluorescence périnucléaire s'explique par le caractère
artéfactuel du marquage. Les antigènes reconnus, et plus spécialement la MPO, sont des
molécules cationiques qui, lors de la fixation par l'éthanol, sont capables de diffuser
dans le cytosol et d'interagir avec des molécules anioniques de la membrane nucléaire.
La perméabilisation de la membrane des granules est inégale d'une cellule à l'autre,
responsable de l'hétérogénéité de la fluorescence.
 Ethanol Formol

p-ANCA

Aspect périnucléaire des ANCA ; PNN fixés à l’éthanol au formol

3. Aspect atypique

Un aspect qui combine les caractéristiques des deux premiers est appelé atypique (x-
ANCA). Il associe un marquage du pourtour des lobes nucléaires, avec des pleins et des
déliés évoquant le dessin au pinceau d'une calligraphie japonaise, et un très faible
marquage cytoplasmique finement ponctué. Selon la nature de la cible, qui n'est pas
toujours identifiable, loin s'en faut, le résultat du marquage sur des PNN fixés par le
formol peut être négatif ou de type c-ANCA, à savoir grossièrement granulaire diffus à
renforcement interlobaire. Sur des PNN fixés par le méthanol, l'aspect est identique,
voire encore plus intense, à celui donné sur PNN fixés par l'éthanol.

Ethanol Formol

x-ANCA

Aspect atypique des ANCA ; PNN fixés à l’éthanol et au formol

Aspect de fluorescence des ANCA selon le fixateur utilisé :

PNN fixés à l’éthanol PNN fixés au formol PNN fixés au méthanol

c-ANCA Cytoplasmique Cytoplasmique Cytoplasmique

p-ANCA Périnucléaire Cytoplasmique Négatif

x-ANCA Périnucléaire/ atypique Négatif Périnucléaire/atypique

 ANNEXE 4 : POSITIVITE DES ANCA AU COURS DES VASCULARITES
A ANCA

ANCA + ANCA + ANCA+ ANCA

anti-PR3 anti-MPO indéterminé négatif
(%) (%) (%) (%)

Granulomatose avec
polyangéite (maladie 75 15 5 5
de Wegener)

Granulomatose
éosinophilique avec
10 60 30
polyangéite (syndrome
de Churg et Strauss

Polyangéite
45 45 5 5
microscopique
 PERMIS D’IMPRIMER

LU ET APPROUVE
Le Président et Directeur de Mémoire
Signé : Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andriamiliharison Jean

VU ET PERMIS D’IMPRIMER
Le Doyen de la Faculté de Médecine d’Antananarivo
Signé : Professeur RANDRIAMAROTIA Harilalaina Willy Franck
Name and first name: SAMBANY RASOANARIVAO Heryliva

Title of the thesis: ASSESSMENT OF CHEMILUMINESCENCE

AND IMMUNODOT FOR THE DIAGNOSIS OF ANCA-ASSOCIATED
VASCULITIS AT THE UNIVERSITY HOSPITAL OF MONTPELLIER IN 2022

Category : BIOLOGY Number of pages : 45

Number of tables : 10 Number of annexes : 4

Number of figures : 15 Number of references : 74

SUMMARY

Introduction: The identification of anti-PR3 or anti-MPO antibodies plays an important

role in the diagnostic orientation of ANCA associated vasculitis. The purpose of this
study is to evaluate chemiluminescence and immunodot in the diagnosis of ANCA
associated vasculitis.

Methods: This is a prospective cohort investigating the sensitivity, specificity, positive

and negative predictive values and overall value of chemiluminescence and immunodot
testing in the diagnosis of ANCA associated vasculitis.

Results: Half had vasculitis. For the diagnosis of ANCA-associated vasculitis,

chemiluminescence had a sensitivity of 96.43% and a specificity of 48.81%, regardless
of the involved pathology. Immunodot gives a sensitivity of 78.57% and a specificity of
91.67%. The statistical analyses also show that these two methods do not have the same
performance.

Conclusion: This study allowed a re-evaluation of the laboratory methods in the area of
autoimmunity : indirect immunofluorescence and chemiluminescence in the first
instance and immunodot in case of diagnostic doubt and for patients in diagnostic
emergency.

Keywords: myeloperoxidase, proteinase 3, sensitivity, specificity, ANCA associated

vasculitis
Director of thesis : Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andriamiliharison Jean
Author’s address : Lot II I 49 BC Alarobia Amboniloha
Noms et Prénom: SAMBANY RASOANARIVAO Heryliva

Titre du mémoire: EVALUATION DE LA CHIMILUMINESCENCE

ET DE L’IMMUNODOT POUR LE DIAGNOSTIC DES VASCULARITES
A ANCA AU NIVEAU DU CHU DE MONTPELLIER EN 2022

Rubrique : BIOLOGIE Nombre de pages : 45

Nombre de tableaux : 10 Nombre d’annexes : 4

Nombre de figures : 15 Nombre de références bibliographiques : 74

RESUME

Introduction: L’identification des anticorps anti-PR3 ou anti-MPO tient une place

importante dans l’orientation diagnostique des vascularites à ANCA. L’objectif de ce
travail est d’évaluer la chimiluminescence et l’immunodot dans le diagnostic des
vascularites à ANCA.

Méthode: Il s’agit d’une cohorte prospective portant sur la sensibilité, la spécificité, les
valeurs prédictives positive et négative ainsi que la valeur globale du test de la
chimiluminescence et de l’immunodot dans le diagnostic des vascularites à ANCA.

Résultats: La moitié des patients présentaient une vascularite. Pour le diagnostic des
vascularites associées aux ANCA, la chimiluminescence présente une sensibilité de
96,43% et une spécificité de 48,81%, quel que soit la pathologie en cause. L’immunodot
donne une sensibilité de 78,57% et une spécificité de 91,67%. Les analyses statistiques
faits montrent également que ces 2 méthodes n’ont pas la même performance.

Conclusion : Cette étude a permis une réévaluation des méthodes du laboratoire en

secteur d’auto-immunité : l’immunofluorescence indirecte et la chimiluminescence en
première intention et l’immunodot en cas de doute diagnostique et pour les patients dans
l’urgence diagnostique.

Mots clés : myélopéroxydase, protéinase 3, sensibilité, spécificité, vascularites à ANCA

Directeur de mémoire: Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andriamiliharison

Jean
Adresse de l’auteur : Lot II I 49 BC Alarobia Amboniloha