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The microbial and chemical structure of the sea surface microlayer at

Guanabara Bay (Brazil)

Article · September 2006

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1 author:

Luciana Contador
Federal University of Rio de Janeiro
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 Étude de la structure chimique et microbiologique de
l’interface air-mer en Baie de Guanabara (Rio de
Janeiro, Brésil)
Luciana Contador

To cite this version:

Luciana Contador. Étude de la structure chimique et microbiologique de l’interface air-mer en Baie
de Guanabara (Rio de Janeiro, Brésil). Océan, Atmosphère. Université Pierre et Marie Curie - Paris
VI, 2006. Français. �tel-00122547�

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recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.
 THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS VI

Spécialité : Océanographie et Environnement Marin

présentée et soutenue publiquement le

08 septembre 2006
par

Luciana CONTADOR

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR de l’Université Paris VI

Étude de la structure chimique et microbiologique de

l’interface air-mer en Baie de Guanabara (Brésil)

Directeurs de thèse : Pr. Alain Saliot

Pr. Philippe Lebaron
Pr. Madre Fatima de Maron Ramos

JURY :
Madre Fatima de MARON RAMOS Professeur – Université Santa Úrsula, Brésil Examinateur
Mme Elaine ALBUQUERQUE Professeur – Université Santa Úrsula, Brésil Rapporteur

Mme Muriel BOURRAIN Chercheur – Équipe mixte de recherche Pierre Fabre / Examinateur
CNRS / UPMC, Banyuls
M Jean OUDOT Professeur – Muséum National d’Histoire Naturelle, Paris Rapporteur
M Jean-Claude NICOLAS Professeur – Université Paris VI, Paris Examinateur
M Alain SALIOT Professeur – Université Paris VI, Paris Examinateur
M Philippe LEBARON Professeur – Université Paris VI, Paris Examinateur

2
 Étude de la structure chimique et microbiologique de l’interface air-mer en Baie de
Guanabara (Rio de Janeiro, Brésil).

Résumé :

La microcouche de surface (SML) correspond au premier millimètre de la colonne

d’eau. Située à l’interface air-eau, la SML est un environnement unique, riche en
microorganismes, en matières organiques, en hydrocarbures et présentant des conditions
extrêmes par l’impact des radiations UV et les fortes concentrations de polluants. Les
échantillons ont été prélevés dans la SML et dans l’eau sous-jacente (UW) à 7 stations
de la Baie de Guanabara, Brésil. Cette étude a permis de caractériser l’abondance et la
diversité des bactéries et des hydrocarbures présents dans la SML de la baie. L’origine
des hydrocarbures a été analysée par des marqueurs chimiques par chromatographie en
phase gazeuse. Sur le plan microbiologique, 43 souches bactériennes ont été isolées et
identifiées. Leur résistance aux radiations UV a été évaluée à l’aide d’un simulateur
solaire. La SML de la baie est bien définie par rapport à l’UW et enrichie en
hydrocarbures et en bactéries. Le bactérioneuston est plus diversifié que le
bactérioplancton. La plupart des souches testées sont très résistantes aux UV et sont des
espèces potentiellement intéressantes sur le plan biotechnologique.

Mots-clés :
microcouche de surface ; Baie de Guanabara ; bactérioneuston ; hydrocarbures ;
radiations solaires ; chromatographie en phase gazeuse ; SSCP (single strand
conformation polymorphism)

The microbial and chemical structure of the sea surface microlayer at Guanabara Bay
(Brazil)

Abstract:

The surface microlayer (SML) covers the upper millimeter of the water. At the air-water
interface, the SML is a unique environment, where microorganisms, organic matter,
hydrocarbons and pollutants concentrate. The SML is considered an extreme
environment due to high concentrations of pollutants and intense solar radiation. The
SML and the underlying water (UW) were collected at 7 stations in Guanabara Bay,
Brazil. The SML of the bay was characterized by its hydrocarbons, total bacterial counts
and bacterioneuston diversity. Chemical markers analyzed by gas phase
chromatography were used to identify the hydrocarbons sources. A total of 43 bacterial
strains were isolated and identified, their resistance to UV radiation was evaluated by
exposition to simulated solar radiation. The SML at BG is well discriminated with
respect to UW, enriched in hydrocarbons and bacteria. The bacterioneuston shows a
higher diversity than the bacterioplankton. Most of the bacterial strains tested were
resistant to UV radiation and were potentially of great interest for biotechnology.

Key-words:
surface microlayer ; Guanabara Bay ; bacterioneuston ; hydrocarbons ; solar radiations ;
gas phase chromatography ; SSCP (single strand conformation polymorphism)

3
 Cette thèse a été réalisée :

au Laboratoire d’Écologie Microbienne, Observatoire Océanologique de Banyuls/mer –

Laboratoire d’Océanographie Biologique, Université Pierre et Marie Curie
BP 44, 66651 Banyuls-sur-Mer Cedex, France

au Laboratoire d’Océanographie et du Climat : Expérimentation et Approches

Numériques ; (LOCEAN) – Université Pierre et Marie Curie
4, place Jussieu – tours 46-00, 5e étage – 75252 Paris CEDEX 05

et au Laboratoire de Microbiologie Marine de l’Université Santa Úrsula

Rua Jornalista Orlando Dantas, 59 Botafogo – 22231-010 Rio de Janeiro, Brésil

Support financier (bourse d’étude) :

CAPES (Coordination pour le Perfectionnement du Personnel de l’Enseignement

Supérieur – Ministère de l’Éducation – Brésil)

4
 À João Paulo

À Vovó Santinha

5
Remerciements

Je tiens à exprimer mes sincères remerciements à mes directeurs de thèse Monsieur

Alain Saliot et Monsieur Philippe Lebaron, professeurs de l’Université Paris VI, pour
l'accueil cordial qu’ils m’ont réservé, pour la confiance qu’ils m’ont accordée et pour
l'attention avec laquelle ils ont dirigé ce travail. Merci pour votre disponibilité et vos
encouragements.

J'exprime également toute ma gratitude à Madre Fatima de Maron Ramos, chancelier de

l’Université Santa Úrsula. Vous avez été un des initiateurs de ce projet et vous avez
grandement contribué à son bon déroulement.

J'adresse à la CAPES (Coordination pour le Perfectionnement du Personnel de

l’Enseignement Supérieur – Ministère de l’Éducation – Brésil) mes remerciements pour
m'avoir attribué un support financier de trois ans qui m'a permis de mener à bien mes
recherches dans des conditions très satisfaisantes.

Je remercie vivement l'ensemble des membres du jury de cette thèse : Madame Elaine
Albuquerque, professeur de l’Université Santa Úrsula et Monsieur Jean Oudot,
professeur de l’Université Paris VII, d'avoir accepté d'être les rapporteurs de cette thèse.
Merci à Madame Muriel Bourrain, chercheur de l’équipe mixte de recherche Pierre
Fabre/CNRS/UPMC et au Monsieur Jean-Claude Nicolas, professeur de l’Université
Paris VI pour l’honneur qu’ils m’ont fait d’examiner ce travail. Je vous remercie tous
pour votre lecture critique de ce document.

Merci de tout cœur Anissa et Hélène, merci pour l’encouragement et l’amitié. Bonne
chance !

Je remercie tous les membres de l’équipe du Laboratoire LOCEAN, ancien LBCM :

Geneviève, André, Christian, Dany, Catherine, Anne, Joëlle. Merci aux thèsards :
Emilie, Claire, Saida, Antoine, Hatem.

Merci aux personnes du laboratoire d’écologie microbienne (aux microbes) : Marièle,

Laurent, Annabelle, Löetitia, Nicole, Ingrid, Fabien, Jeff, Muriel, Julia, Philippe. Merci
de votre disponibilité sans limite et vos encouragements.

Merci chaleureuse à ma famille brésilienne en France : Carmen, Cristian, Gabriela,

Isabel, Joel, Adriana et Marcio. (Muito obrigada por toda a ajuda e por fazerem com
que eu me sentisse de novo em casa.)

Je remercie à la meilleure famille du monde (la mienne). Merci pour l’affection infinie
et pour votre présence à mes cotés. C’est grâce à vous que je suis arrivée jusque là.

J'ai bien sûr une pensée toute particulière pour João Paulo, mon compagnon de chaque
instant. Merci pour ton amitié, ton écoute, ta patience, ton amour. Je t’aime à la folie.

6
TABLES DE MATIÈRES

7
 Chapitre I - Introduction
I.1 L’interface air-mer – la microcouche de surface (SML)___________________16
I.2 Le neuston ________________________________________________________18
I.2.1 Le virioneuston ______________________________________________________ 19

I.2.2 Le bacterioneuston ___________________________________________________ 20

I.2.3 Le phytoneuston _____________________________________________________ 21

I.2.4 Le zooneuston _______________________________________________________ 22

I.3 Les hydrocarbures de la microcouche de surface ________________________22

I.4 Les radiations solaires ______________________________________________25
I.5 Objectives_________________________________________________________29

Chapitre II – Présentation du site d’étude

II. Présentation du site d’étude - La Baie de Guanabara _____________________31

Chapitre III - Méthodologie

III.1 Stratégie d’échantillonnage_________________________________________38
III.2 Prélèvement des échantillons _______________________________________39
III.3 Analyses microbiennes ____________________________________________41
III.3.1 Bactéries cultivables_________________________________________________ 41

III.3.2 Bactéries totales ____________________________________________________ 41

III.3.3 Isolement de souches ________________________________________________ 42

III.3.4 Caracterisation moléculaire des isolats _________________________________ 42

III.3.4.1 Extraction de l’ADN ______________________________________________ 42

III.3.4.2 Amplification de l’ADNr 16S _______________________________________ 42
III.3.4.3 Criblage génotypique des isolats par RFLP ____________________________ 43
III.3.4.4 Séquençage _____________________________________________________ 45
III.3.5 SSCP _____________________________________________________________ 46

III.3.6 Expérience sur la résistance des souches aux radiations solaires ____________ 48

III.4 Analyses chimiques _______________________________________________51

III.4.1 Précautions prises au cours des manipulations ___________________________ 51

III.4.2 Séparation entre les fractions dissoute et particulaire _____________________ 51

III.4.3 Extraction _________________________________________________________ 52

III.4.3.1 Fraction dissoute _________________________________________________ 52

8
 III.4.3.2 Fraction particulaire_______________________________________________ 52
III.4.4 Séparation chromatographique sur gel de silice ___________________________ 53
III.4.5 Méthodes de quantification et d’identification ___________________________ 53

III.4.5.1 Chromatographie en phase gazeuse (GC) ______________________________ 53

Chapitre IV - Résultats
IV.1 Analyses chimiques: les hydrocarbures de la microcouche de surface______56
IV.2 Analyses microbiennes_____________________________________________61
IV.2.1 Quantification des bactéries totales et cultivables _________________________ 61

IV.2.2 Identification des bactéries ___________________________________________ 65

IV.2.3 Résistance aux radiations solaires______________________________________ 69

IV.2.3 La diversité du bactérioneuston (SSCP)_________________________________ 72

Chapitre V - Discussion
V.1 Les hydrocarbures à la microcouche de surface_________________________79
V.2 Le bactérioneuston ________________________________________________81
V.2.1 Identification des souches bactériennes __________________________________ 84

V.2.2 La résistance des souches bactériennes aux radiations solaires_______________ 85

V.2.4 La structure populationnelle des communautés bactériennes ________________ 88

V.3 Discussion générale ________________________________________________89

Chapitre VI - Conclusions & Perspectives

VI.1 Conclusions ______________________________________________________92
VI.2 Perspectives futures _______________________________________________94

Références Bibliographiques____________________________________________96

Annexes ____________________________________________________________118

9
INDEX DES FIGURES

10
 Chapitre I

Figure 1 - Mécanismes d'échange à l'interface air-mer_________________________16

Figure 2 - Distribution des microorganismes dans la couche de surface ___________18

Chapitre II
Figure 3 – La Baie de Guanabara - Rio de Janeiro – Brésil _____________________31

Figure 4 - Carte de la bathymétrie de la Baie de Guanabara_____________________33

Chapitre III
Figure 5 - Localisation des sites de échantillonnage dans la Baie de Guanabara _____38

Figure 6 - Échantillonnage de la microcouche à l'aide d'un tamis en métal _________40

Figure 7 - Simulateur solaire et microplaque avec souches en duplicat ____________50

Chapitre IV
Figure 8 - Chromatogramme en phase gazeuse des hydrocarbures aliphatiques extraits
de la microcouche de surface à la St1_______________________________________56

Figure 9 - Distribution des données (bactéries cultivables de l'année 2003) avant et

après transformation logarithmique ________________________________________63

Figure 10 - Arbre phylogénétique construit à partir des séquences partiels de l'ADNr

16S des souches isolées dans la Baie de Guanabara ___________________________68

Figure 11 - Courbes de croissance des souches résistantes après leur exposition au

simulateur solaire ______________________________________________________69

Figure 12 - Distribution des souches testées par rapport à leur résistance après leur
exposition au simulateur solaire___________________________________________71

Figure 13 - Distribution des souches pigmentées et non pigmentées testées par rapport à
leur résistance après leur exposition au simulateur solaire_______________________71

Figure 14 - Profils de SSCP pour la SML et l’UW dans la Baie de Guanabara ______73

Figure 15 - Profils de SSCP du suivi de 3 jours à 5h et à midi pour la SML et l’UW _74

Figure 16 - Dendrogramme construit à partir des distances euclidiennes entre les profils
de SSCP pour la SML et UW dans la Baie de Guanabara_______________________76

Figure 17 - Dendrogramme construit à partir des distances euclidiennes entre les profils
de SSCP du suivi de 3 jours à 5h et à midi pour la SML et l’UW ________________77

11
INDEX DES TABLEAUX

12
 Chapitre II
Tableau 1 - Classification de la qualité bactériologique des eaux de baignade ______35

Chapitre III

Tableau 2 - Localisation géographique des sites d'échantillonnage dans la Baie de

Guanabara____________________________________________________________39

Tableau 3 - Séquences des amorces utilisées pour l'amplification par PCR sur les ADN
totaux _______________________________________________________________43

Tableau 4 - Sources et séquences de reconnaissance pour la coupure des enzymes de

restriction ____________________________________________________________44

Tableau 5 - Solutions d'hydrolyse pour la criblage génotypique par RFLP _________44

Tableau 6 - Séquence d'amorce interne de séquençage_________________________45

Tableau 7 - Séquences des amorces utilisées pour l'amplification par PCR sur les ADN
totaux _______________________________________________________________47

Tableau 8 - Conditions expérimentales: intensités et doses horaires de PAR, UVA et

UVB________________________________________________________________48

Chapitre IV
Tableau 9 - Concentrations des hydrocarbures aliphatiques totaux, n-alcanes, pristane,
phytane et UCM (enveloppe des composés non résolus)________________________57

Tableau 10 - Rapports caracteristiques et indicateurs aliphatiques pour les échantillons

de la Baie de Guanabara_________________________________________________58

Tableau 11 - Facteurs d'enrichissement des hydrocarbures aliphatiques ___________59

Tableau 12 - Test t (Student) SML x UW___________________________________60

Tableau 13 - Test t entrée x fond__________________________________________60

Tableau 14 - Résultats des quantifications des bactéries totales et cultivables.

Campagne 2003 _______________________________________________________61

Tableau 15 - Résultats des quantifications des bactéries totales et cultivables.

Campagne 2004 _______________________________________________________62

Tableau 16 - Facteurs d'enrichissement des bactéries cultivables et totales dans la

microcouche de surface en comparaison avec l'eau sous-jacente (0,5m et 5m).
Campagne 2003 _______________________________________________________62

13
Tableau 17 - Facteurs d'enrichissement des bactéries cultivables et totales dans la
microcouche de surface en comparaison avec l'eau sous-jacente (0,5m). Campagne
2004 ________________________________________________________________63

Tableau 18 - Analyse des variations des bactéries totales et cultivables en fonction de la

profondeur (SML, UW et 5m) et de l'heure d'échantillonnage (5h et 12h) par le test t
(Student). Campagnes de prélèvement de 2003 et 2004 ________________________64

Tableau 19 - Analyse des variations des bactéries totales et cultivables en fonction de la

localisation des sites d’échantillonnage (entrée = St1, St2 et St3 x fond = St4, St5, St6 et
St7) par le test t (Student). Campagnes de prélèvement de 2003 et 2004 ___________64

Tableau 20 - Regressions linéaires entre les densités des bactéries totales et les
hydrocarbures non aromatiques ___________________________________________65

Tableau 21 - Résultats du séquençage des souches bactériennes isolées de la Baie de

Guanabara____________________________________________________________66

Tableau 22 - Résultats du séquençage des souches bactériennes isolées de la Baie de

Guanabara. Similarité aux séquences de clones du GenBank ____________________67

Tableau 23 - Classes de résistance des souches bactériennes aux rayons solaires ____69

Tableau 24 - Temps maximum de résistance des souches bactériennes testées au

simulateur solaire ______________________________________________________70

Tableau 25 - Nombre des pics prédominants (≥ 3% de la surface totale) dans les profils
de SSCP _____________________________________________________________72

Tableau 26 - Nombre des pics prédominants (≥ 3% de la surface totale) dans les profils
de SSCP _____________________________________________________________72

14
 Chapitre I

L’interface air-mer – La microcouche de surface

15
I.1 L’interface air-mer – la microcouche de surface (SML)

La microcouche de surface (SML) ou film de surface correspond à l’interface

entre l’eau et l’air (Liss, 1975). L’épaisseur de la microcouche dépend de plusieurs
facteurs, comme la concentration en matière organique (Cincinelli et al., 2001), les
conditions météorologiques (Liu & Dickhut, 1998) et la méthodologie
d’échantillonnage (Garrett, 1967a), mais est opérationnellement définie comme le
premier millimètre de la colonne d’eau (Macintyre, 1974 ; Hardy, 1982 ; GESAMP,
1995 ; Liss & Duce, 1997).

L’interface air-mer est le siège d’échanges de matière et d’énergie entre l’Océan

et l’Atmosphère (Hunter & Liss, 1981 ; Hardy, 1982 ; Carlson, 1993 ; GESAMP, 1995 ;
Liss & Duce, 1997) (Figure 1).

Évaporation
Vent ATMOSPHERE Dépôts
Aérosols secs et
Pluies
Bulles

APPORTS MICROCOUCHE
CONTINENTAUX DE SURFACE

Dissolution OCEAN Diffusion

Rivières
Ruissellement
Sédimentation Bulles

Hydrodynamisme Convection

Figure 1 - Mécanismes d'échange à l'interface air-mer (Liss, 1975)

La microcouche reçoit des substances gazeuses, liquides (pluies) et solides

(particules et aérosols) qui proviennent de l’atmosphère et des apports continentaux.

16
Ces substances sont transportées vers la colonne d’eau par dissolution, sédimentation et
l’hydrodynamisme. Les substances dissoutes et particulaires et les microorganismes
dans la colonne d’eau sont apportés à la surface par diffusion, adsorption sur des bulles
de gaz, convection et par la résurgence (upwelling) de l’eau sous-jacente. L’évaporation
des composés volatils et la formation, par le vent, d’aérosols et de bulles de gaz
transportent les substances de la microcouche vers l’atmosphère.

La cohésion de cette interface est assurée par les propriétés tensioactives de

composés organiques, particulièrement les lipides (Romano & Garabetian, 1996). Les
films organiques sont présents dans tous les milieux aquatiques. En général les films de
surface sont fins et invisibles à l’œil nu ; mais quand le film de surface est concentré,
grâce aux mouvements des courants par exemple, les ondes capillaires sont atténuées et
le film devient visible comme une nappe de surface (surface slicks) (Dietz & Lafond,
1950; Garrett, 1967 a et b; Lafond & Lafond, 1972; Cini et al., 1983; Romano &
Garabetian, 1996).

La stabilité physique de la microcouche, résultant de la tension de surface et des

propriétés tensioactives, permet la concentration des particules en suspension,
organismes et substances diverses à la surface. La microcouche est ainsi considérée
comme un environnement unique, caractérisé par une forte concentration de matières
organiques, telles les protéines, les acides aminés, les acides gras et les lipides (Jarvis et
al., 1967 ; Larsson et al., 1974 ; Marty et al., 1988), les hydrocarbures (Garrett, 1967 a ;
Marty & Saliot, 1974), les nutriments (Goering & Menzel, 1965 ; Williams, 1967), les
éléments métalliques associés à du matériel organique particulaire ou dissous
(Piotrowicz et al., 1972). On note également de fortes concentrations en
microorganismes (Blanchard & Syzdek, 1970 ; Marumo et al., 1971 ; Tsyban, 1971 ;
Dahlbach et al., 1982 ; Hardy, 1982).

Le rapport des concentrations des organismes, particules, composés chimiques

dans la microcouche à celles trouvées dans l’eau sous- jacente est le facteur
d’enrichissement (EF).

Les processus physiques, chimiques et biologiques de l’interface air-mer ne sont

pas limités à la microcouche de surface. Hardy et Word (1986) ont proposé une couche
de surface structurée en plusieurs strates horizontales (figure 2).

17
 Interface air - mer
I
II
III Profondeur (m)
IV Film lipidique
V
Composés protéiques 10 -9
Virioneuston Particules
10 -8
Bactérioneuston
10 -7
Phytoneuston
10 -6 (1µm)

10 -5

10 -4
Zooneuston
10 -3 (1 cm)

0.1 (10 cm)

Figure 2 - Distribution des microorganismes dans la couche de surface. I - couche de surface ; II –

centicouche de surface ; III – millicouche de surface ; IV – microcouche de surface (SML) ; V –
nanocouche de surface.

La nanocouche de surface (< ~ 1 µm) est riche en composés organiques. La

microcouche (< ~ 1000 µm) présent densités élevés en particules et microorganismes et
la millicouche de surface (< ~10 mm) est habitée par des petits animaux, des œufs et des
larves de poissons et d’invertébrés.

I.2 Le neuston

La plupart de microorganismes habitent aux interfaces (Costerton et al., 1985 ;

Schäfer et al., 1998) . L’adhésion des bactéries sur des solides est l’objet de plusieurs
études (van Loosdrecht et al ., 1987 ; Martin et al., 1992 ; Busscher et al., 1995 ; Grasso
et al., 1997). Le film de surface est aussi l’habitat d’espèces planctoniques,
particulièrement adaptées aux conditions spécifiques de ce milieu (Hardy, 1982 ; Hardy
& Apts, 1984 ; Hardy et al., 1987).

18
 La concentration de matière organique dans la microcouche assure la nourriture
nécessaire à la croissance des organismes qui habitent cette interface : le neuston
(Naumann, 1917). Virus, bactéries, petites ciliés (Zaitsev, 1971), protozoaires (Norris,
1965), levures et moisissures (Kjelleberg & Hakansson, 1977), algues, larves, œufs et
représentants (organismes) de tous les principaux groupes de plantes et animaux
habitent, se reproduisent et/ou se nourrissent dans les couches de surface (figure2).

En général la microcouche présente une forte concentration de microorganismes,

beaucoup plus importante que les eaux sous-jacentes (Dahlbach et al., 1982).

I.2.1 Le virioneuston

Les virus sont la forme de vie la plus abondante dans l’environnement aquatique.
Leur concentration dans l’océan est probablement supérieure à 1029 virus par litre
(Wilhelm & Suttle, 1999). Les études sur l’importance écologique des virus sont
récentes (Proctor & Fuhrman, 1990 ; Bratbak et al., 1990 ; Thingstad et al., 1993 ;
Bratbak et al., 1994 ; Suttle, 1994) et le virioneuston reste très peu documenté (Tapper
& Hicks, 1998).

Les virus participent activement aux flux d’énergie et de matière dans le réseau
trophique microbien. L’infection virale est signalée comme la principale cause de la
mortalité des procaryotes dans les écosystèmes aquatiques (Fuhrman, 1999 ; Wommack
& Colwell, 2000). D’ailleurs la lyse virale transforme la biomasse en matière organique
dissoute (MOD), utilisée dans la production et la respiration bactériennes (Fuhrman,
1999). Cette production de MOD par la lyse virale affecte encore la structure de la
communauté bactérienne (Lebaron et al., 1999 ; Middelboe, 2000 ; Riemann et al.,
2000 ; Arrieta & Herndl, 2002). Les virus infectent également des organismes
unicellulaires comme les flagellés et les algues. Dans les écosystèmes marins
pélagiques, entre 6% à 26% du carbone fixé par la photosynthèse est transformé en
MOD par lyse virale (Wilhelm & Suttle, 1999).

La mortalité des espèces dominantes par lyse virale affecte la composition des
communautés microbiennes et entretient la richesse en espèces (Thingstad & Lignell,
1997). Les virus sont aussi capables de transférer des gènes entre espèces (Jiang & Paul,
1996 et 1998 ; Paul, 1999 ; Brüssow & Hendrix, 2002).

19
 Dans les eaux de surface, l’abondance et l’infectivité des virus sont affectés par
les effets nocifs des rayons UV (Suttle & Chen, 1992 ; Wommack et al., 1996 ; Noble
& Fuhrman, 1997 ; Wilhelm et al., 1998 a et b). D’autre part, les radiations solaires
induisent le cycle lytique dans les bactéries lysogéniques (Freifelder, 1987).

I.2.2 Le bacterioneuston

La microcouche présente une importante densité de bactéries métaboliquement

actives (Sieburth, 1971 ; Bezdek & Carlucci, 1972 ; Carlucci et al., 1985). Le
bacterioneuston est de 100 à 1000 fois plus abondant que les communautés bactériennes
de l’eau sous-jacente (MacIntyre, 1974; Dahlbach et al., 1982 ; Hardy, 1982).

Les bactéries jouent un rôle fondamental dans la structure et la dynamique des

réseaux trophiques et dans les cycles du carbone et des nutriments inorganiques dans les
environnements marins (Cho & Azam, 1988; Azam et al., 1983 ; Schauer et al., 2000).
Le bactérioplancton est responsable de la transformation du carbone organique dissous
produit par le phytoplancton en carbone organique particulaire (biomasse bactérienne),
qui est consommé ensuite par les flagellés et les ciliées (Azam et al., 1983). Le
bacterioneuston est essentiel dans la dégradation et la minéralisation de la matière
organique d’origine naturelle et anthropique dans la microcouche (Tsyban, 1971 ;
GESAMP, 1995 ; Walczak et al., 2001 a et b). Le bactérioneuston joue également un
rôle important dans la dégradation des polluants toxiques concentrés dans la
microcouche.

Bien que l’importance des bactéries soit reconnue depuis plusieurs décades
(Azam 1998, Ducklow, 2000), le nombre d’espèces bactériennes présents dans le
bactérioplancton reste inconnu. Pendant longtemps, la petite taille des cellules
bactériennes et l’impossibilité de cultiver la plupart (>99%) des bactéries présentes dans
l’environnement (Jannasch & Jones, 1959 ; Olsen & Bakken, 1987 ; Amman et al.,
1995) ont rendu difficile l’étude de l’écologie et de la taxonomie bactériennes.

Des nouvelles technologies, comme la cytométrie en flux et les techniques

d’empreintes moléculaires, ont permis l’approfondissement des études des
communautés bactériennes (Woese, 1987 ; Marie et al., 1997).

20
 L’utilisation du gène codant l’ARNr 16S en phylogénie moléculaire (Woese,
1987) a permis une évolution significative dans le domaine de l’identification et de la
taxonomie des bactéries. Les nouvelles méthodes biomoléculaires permettent une
description plus précise de la diversité, de la structure et de la dynamique des
communautés bactériennes (Muyzer, 1998).

Pour survivre aux conditions extrêmes de forte incidence des radiations UV et

d’importantes concentrations de polluants dans la microcouche, le bacterioneuston doit
présenter des mécanismes de protection et/ou de résistance. L’écologie et la diversité du
bacterioneuston restent peu étudiées. L’isolement des souches neustoniques peut
permettre l’identification des bactéries résistantes aux radiations UV ou capables de
dégrader certains polluants. Ces études présentent un grand intérêt pour les applications
biotechnologiques.

I.2.3 Le phytoneuston

Le phytoneuston rassemble une grande variété d’organismes de divers tailles et

taxons. Les principaux composants du phytoneuston sont les cyanobactéries, les
diatomées et les dinoflagellés.

La cyanobactérie Trichodesmium est un organisme phytoneustonique très

important dans la production primaire et la fixation d’azote atmosphérique (Carpenter &
Romans, 1991 ; Letelier & Karl, 1996 ; Capone et al., 1997 ; Zehr & Ward, 2002 ;
Rabouille et al., 2006).

Les diatomées du genre Nitzschia et les dinoflagellés du genre Prorocentrum

sont fréquemment observés dans la microcouche (Harvey, 1966 ; De Souza-Lima &
Chretiennot-Dinet, 1984). Dans les eaux protégées et subissant un processus
d’eutrophisation, la microcouche devient visible grâce à la forte densité (bloom) de
Prorocentrum et d’autres espèces phytoneustoniques (GESAMP, 1995).

Diverses études montrent que le phytoneuston présente une composition

spécifique distincte de celle du phytoplancton (Willians et al., 1986 ; Hardy & Apts,
1989)

21
 En général le phytoneuston présente un facteur d’enrichissement qui varie entre
10 à 1000 (Nestrova, 1980 ; Hardy et al., 1988 ; Liss & Duce, 1997). Néanmoins, la
photosynthèse du phytoneuston est inhibée par la forte incidence des rayons solaires
dans la microcouche (Marumo et al., 1971 ; Hardy 1982 ; Willians et al., 1986). Les
effets nocifs des rayons UV sur le phytoneuston sont indiqués par la forte concentration
de phaeopigments retrouvée dans la microcouche (Hardy & Apts, 1984 ; Falkowska,
1999 b).

I.2.4 Le zooneuston

Le microzooneuston comprend les ciliés (Zaitsev, 1971), les protozoaires

(Norris, 1965). Les dinoflagellés hétérotrophes Noctiluca scintillans et Oxyrrhis marina
sont très abondantes dans les échantillons neustoniques (Hardy, 1973). Les tintinnides
sont aussi très abondantes dans la microcouche et se nourrissent du bacterioneuston. La
prédation des bactéries et d’autres microorganismes par le microzooneuston, fonctionne
comme un lien entre le réseau trophique microbien et le réseau trophique classique.

Les organismes mesozooneustoniques consomment de grandes densités de

microneuston (Zaitev, 1971). Les copépodes sont très nombreux dans la microcouche,
surtout la famille des Pontellidés (Zaitev, 1971 ; Hardy, 1982). Le mesozooneuston
comprend encore les isopodes et amphipodes, en général attachés à des débris (Zaitev,
1971 ; Tully & O’Ceidigh, 1986). Certains poissons et invertébrés habitent dans la
microcouche pendant la période de développement embryonnaire (oeufs) et larvaire.

Les organismes du macroneuston sont beaucoup plus rares et incluent les

coelentérés comme les méduses et certains gastropodes (Prosobranchiata et
Nudibranchiata).

I.3 Les hydrocarbures de la microcouche de surface

Les hydrocarbures sont les composés organiques les plus simples, constitués
essentiellement de carbone et d’hydrogène. Ils présentent une grande valeur
économique vu leur utilisation comme carburants, combustibles, huiles lubrifiantes et
comme produits de base en synthèse pétrochimique.

22
 On distingue les hydrocarbures aliphatiques (à chaîne droite) et les composés
cycliques. Les hydrocarbures aliphatiques sont constitués d’une chaîne carbonée linéaire
saturée, pouvant présenter une ou plusieurs ramifications. Les gaz de combustion
(naturel et de pétrole liquéfié), l’essence et l’huile de moteur sont composés
d’hydrocarbures aliphatiques.

Les composés cycliques présentent un ou plusieurs cycles. Parmi les

hydrocarbures cycliques, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) possèdent
au moins deux cycles (aromatiques) insaturés à six atomes de carbone, dont les
électrons sont délocalisés sur tout le cycle (phénomène de conjugaison).

L’interface air-mer fonctionne comme puits et source des composées

anthropiques, des hydrocarbures chlorés ou pétroliers et métaux lourds, et participe
activement du cycle des polluants organiques persistants (POPs) dans les écosystèmes
aquatiques (Southwood et al., 1999). Dans plusieurs environnements côtiers des
concentrations élevés en métaux toxiques (Hoffmann et al., 1974 ; Hunter, 1980; Hardy
et al., 1985) et en polluants organiques (Williams et al., 1986 ; Hardy et al., 1987 ;
Cross et al., 1987 ; Sauer et al., 1989 ; Hardy et al., 1990 ; Cincinelli et al., 2001) sont
observées dans la SML en comparaison avec l’eau sous-jacente.

Les hydrocarbures non-aromatiques (aliphatiques et alicycliques - HNA) et

aromatiques (HAP) s’accumulent dans la SML en comparaison avec l’UW (Marty &
Saliot, 1976 ; Marty et al., 1979 ; Cincinelli et al., 2001). En général la fraction
particulaire présente des facteurs d’enrichissement plus importantes que la fraction
dissoute (Marty & Saliot, 1976 ; Cincinelli et al., 2001)

Les facteurs d’enrichissement des n-alcanes varient de 0,3 à 4 dans les eaux
côtières et dans les océans (Marty et al., 1979 ; Boehm, 1980 ; Hô et al., 1982). Pour les
HAP le facteur d’enrichissement moyen varie de 9 à 21,8 (Cincinelli et al., 2001). Dans
les zones contaminées par du pétrole, les hydrocarbures peuvent être 1000 fois plus
abondants dans la microcouche par rapport à l’eau sous-jacente (Marty & Saliot, 1976 ;
Hardy et al., 1987).

La toxicité des hydrocarbures est variable. En général, les hydrocarbures

aromatiques sont plus toxiques que les hydrocarbures aliphatiques. L’exposition du

23
neuston aux polluants résulte en un impact sur l’écologie de l’environnement marin
(Corsolini et al., 2002 ; Wurl & Obbard, 2004).

Toutefois certains bactéries et microalgues non seulement résistent mais peuvent

dégrader les hydrocarbures et autres polluants (Johnsen et al., 2002 ; Sho et al., 2004).

Les hydrocarbures présents dans l’environnement proviennent de processus

naturels ou anthropiques. Actuellement, on observe une augmentation des
hydrocarbures d’origine anthropique par comparaison avec les hydrocarbures d’origine
naturelle, notamment dans des endroits industrialisés et urbains (Bourbonniere &
Meyers, 1996).

La génération naturelle des hydrocarbures dérive des feux de forêt et d’herbage,

des éruptions volcaniques, de l’érosion des roches et des fuites des réservoirs naturels
(NRC, 1985). La production d’hydrocarbures par les végétaux supérieurs (cires) et par
les algues est importante et marquée par la prédominance des n-alcanes (Saliot, 1981).

Les sources anthropiques se partagent entre sources pétrolières (pétrogenèse de

basse température) et sources pyrolytiques (processus de combustion à haute
température) (NRC, 1985). Les principales sources anthropiques des hydrocarbures sont
la circulation automobile (surtout la combustion incomplète des carburants), le
chauffage urbain et les industries (Neff, 1979 ; NRC, 1985).

Les hydrocarbures sont introduits dans le milieu aquatique par des effluents
industriels et municipaux, par les eaux souterraines et de ruissellements urbains et
industriels, par les dépôts atmosphériques, ainsi que par les déversements accidentels de
pétrole brut et de produits pétroliers (Neff, 1979 ; Eganhouse & Kaplan, 1982 ;
Hoffman et al., 1984 ; Burns & Saliot, 1986 ; McVeety & Hites, 1988).

La caractérisation des hydrocarbures dans l’environnement et l’identification des

sources sont des tâches très importantes, mais aussi très difficiles à réaliser. L’analyse
des spectres des fractions aliphatiques et aromatiques constitue une source
d’informations très intéressante et indispensable dans l’identification de l’origine des
hydrocarbures. L’analyse fine des spectres permet la distinction des sources biologiques
et anthropiques et de différentier les origines pétrolières et pyrolytiques à partir des
traceurs chimiques. La fraction aliphatique permet principalement la différentiation des

24
sources biologiques et anthropiques et la fraction aromatique est idéale pour la
distinction des origines pétrolières et pyrolytiques.

I.4 Les radiations solaires

La microcouche de surface est fortement sensible aux irradiations du soleil qui

peuvent influencer les phénomènes chimiques et biologiques.

Les premières observations sur la raréfaction de la couche d’ozone dans

l’atmosphère (Molina & Rowland, 1974 ; Farman et al, 1985) et l’augmentation de
l’incidence des rayons UVB sur la Terre (Crutzen, 1992 ; Kerr & McElroy, 1993) ont
motivé de nombreuses études sur les effets des rayons UV et les réponses des
communautés biologiques.

Le soleil émet différentes types de rayonnement classés en fonction de leur

longueur d’onde : les rayons infrarouges (IR, >800nm), la lumière visible ou disponible
pour la photosynthèse (PAR, 400-750nm) et les radiations ultraviolettes A (UVA, 320-
400nm), B (UVB, 280-320nm) et C (UVC, 200-280nm) (Peak & Peak 1989). La
radiation UVC, de plus forte énergie et très dangereuse, est absorbée par l’atmosphère et
la couche d’ozone et n’arrive pas à la surface de la Terre. Les rayons UVB sont
sélectivement absorbés par la couche d’ozone. Les rayons UVA sont les moins
énergétiques et les plus pénétrants des UV et correspondent à 99% de la lumière UV qui
atteint la surface de la Terre (Stolarski, 1988).

La radiation UV qui atteint la surface de la Terre correspond à environ 4% de

l’énergie solaire et varie selon la latitude, la saison, l’heure, l’épaisseur de l’atmosphère
et de la couche d’ozone. Les régions tropicales sont caractérisées par des niveaux
naturels d’UVB très élevés (Madronich et al., 1995).

Un grand nombre d’études souligne les impacts des rayons UVA et UVB sur les
organismes marins, comme les bactéries (Herndl et al., 1993), le phytoplancton
(Ferreyra et al., 1997 ; Fauchot et al., 2000), les protistes (Wickham & Carstens, 1998 ;
Chatila et al., 1999 ; Mostajir et al., 1999), les métazoaires et les poissons (Rodriguez et
al., 2000 ; Zagarese & Williamson, 2000).

25
 Les rayons UV pénètrent profondément dans la colonne d’eau. Dans l’océan
atlantique subtropical, 10% du niveau des radiation de 340 et 380nm arrive à 35 et a
60m, respectivement ( Smith & Baker, 1981 ; Fleischmann, 1989 ; Vincent & Roy,
1993 ; Obernosterer et al., 1999 ). Dans les régions côtières les rayons UVB atteintent
au moins 20m de profondeur (Smith & Baker, 1981 ; Fleischmann, 1989). Si les
organismes benthiques sont affectés par les effets nocifs des rayons UV, les organismes
qui habitent à la surface et dans les zones intertidales sont exposés à des niveaux très
importants de rayons UVA et UVB (Booth et al., 2001).

Le bactérioplancton est particulièrement affecté par les effets nocifs des rayons
UV en comparaison au plancton eucaryote (Helbling et al., 1995 ; Jeffrey et al., 1996 a
et b ; Joux et al., 1999). La petite taille des cellules bactériennes et leur génome simple
et haploïde avec peut ou sans redondance fonctionnelle sont indiqués comme
responsables pour cette sensibilité (Joux et al., 1999).

Les cellules phytoplanctoniques synthétisent des pigments comme protection

contre les rayons UVB. L’importance et l’utilisation des pigments dans la protection des
bactéries contre les rayons UV reste contradictoire. La petite taille des cellules
bactériennes est responsable de l’empêchement d’une protection pigmentaire effective
(Garcia-Pichel, 1994 ; Jeffrey et al., 1996 a et b). Cependant la production des pigments
photoprotecteurs comme la mycosporine et la scytonemine est observé chez les
cyanobactéries (Ehling-Schulz et al., 1997) et certains bactéries sont capables de
convertir les mycosporines synthétisées par des algues en mycosporine-glycine,
molécule ayant des caractéristiques antioxydantes (Dunlap et al., 1998 ; Shick &
Dunlap, 2002). Les pigments caroténoïdes jouent un rôle important dans la protection
contre les effets nocifs de la radiation UVA et sont présents dans les bactéries (Wu et
al., 1983 ; Miki et al., 1994 ; Sundin & Jacobs, 1999).

Les effets des rayons UV sur les bactéries varient selon la longueur d’onde. Les
rayons UVA entraînent des dommages indirects sur l’ADN, protéines et lipides à partir
de la formation d’espèces réactives de l’oxygène, comme le peroxyde d’hydrogène
H2O2 et les radicales superoxyde O2- et hydroxyle OH- (Xenopoulos & Bird, 1997).

La radiation UVB est fortement absorbée par l’ADN et entraîne des dommages
directs et indirects aux bactéries.

26
 Les effets indirects des UVB sur le bactérioplancton peuvent à la fois inhiber la
production bactérienne ou la stimuler (Lindell et al., 1996). Parmi les effets indirects
nocifs on pourrait citer la production photochimique de substances toxiques comme les
radicaux superoxydes et le peroxyde d’hydrogène et la libération photochimique des
métaux toxiques (cuivre, aluminium) antérieurement liés (chelated) à des
macromolécules organiques (Karentz et al., 1994). La radiation UV augmente la
libération de matière organique dissoute (DOM) par le phytoplancton (Sommaruga et
al, 1997) et transforme la MOD réfractaire en formes plus labiles et vice-versa (Benner
& Biddanda, 1998 ; Tranvik & Kokalj, 1998 ; Obernosterer et al., 1999 ; Pausz &
Herndl, 1999).

Les effets directs des rayons UVB sur les bactéries incluent la formation de
lésions dans les acides nucléiques (Mitchell & Karentz, 1993), la diminution de
l’activité enzymatique (Herndl et al., 1993) et la réduction de la perméabilité des
membranes (Klamen & Tuveson, 1982). Ces dommages résultent en la réduction de la
viabilité du bactérioplancton (Vincent & Roy, 1993), la diminution de l’abondance
bactérienne (Müller-Niklas et al., 1995 ; Pakulski et al., 1998) et la réduction de la
production bactérienne (Aas et al., 1996, Pakulski et al., 1998 ; Visser et al., 1999).

Les effets plus nocifs des rayons UVB sur les bactéries sont les lésions de
l’ADN. Les rayons UVB induisent la liaison entre les bases pyrimidines adjacentes
résultant surtout en la formation des dimères de pyrimidine cyclobutane (CPDs)
(Mitchell & Karentz, 1993). La formation des CPDs peut bloquer la synthèse de l’ADN
ou la transcription de l’ARN (Jeffrey et al 1996 a et b).

En réponse aux agressions des rayons UV, les bactéries on développé divers
mécanismes de réparation. La photoréparation enzymatique (PER ou light repair) est
activée par la lumière visible ou les UVA et permet la réparation des CPDs par l’action
d’une enzyme, la photolyase, qui catalyse le clivage chimique du dimère (Friedberg,
1985 ; Miller et al., 1999).

Les mécanismes qui ne nécessitent pas de lumière visible (dark repairs) sont la
réparation par excision de nucléotide (NER), la réparation inductible ou réparation SOS
et la réparation par recombinaison. Ces mécanismes de réparation sont régulés par la
protéine RecA, qui est induite pendant les périodes d’obscurité (Miller et al., 1999).

27
 La sensibilité aux UV et la capacité de récupération des dommages causés par
les radiations UV varient fortement entre les différentes espèces bactériennes (Joux et
al., 1999; Arrieta et al., 2000). Subséquemment l’incidence des radiations UV sur un
écosystème interfère dans la composition de la communauté bactérienne (Bothwell et
al., 1993) et affect le transfert de l’énergie entre les niveaux trophiques (Mostajir et al.,
1999).

Les autres composants de la boucle microbienne sont aussi affectés par la

radiation UV. Les effets négatifs des UV sur les protistes diminuent la prédation des
bactéries (Chatila et al, 1999). La radiation solaire UV entraîne des effets négatifs sur
l’abondance virale et sur l’infectivité (Suttle & Chen, 1992 ; Wommack et al., 1996 ;
Noble & Fuhrman, 1997 ; Wilhelm et al., 1998 a et b), mais est signalée comme un
facteur d’induction du cycle lytique dans les bactéries lysogéniques (Freifelder, 1987).

Les effets des rayons solaires sur les bactéries isolées ne sont pas comparables
aux effets du soleil sur le bactérioplancton totale dans les communautés marines. Dans
l’environnement les effets directs et indirects de la radiation solaire sur le
bactérioplancton sont divers et simultanés ; d’autres facteurs jouent avec la sensibilité et
la capacité régénératrice de chaque bactérie. Par exemple, l’inhibition du
bactérioplancton par la radiation solaire est plus prononcée quand le bactérioplancton
est séparé de la communauté phytoplanctonique (Sommaruga et al., 1997). Cependant
l’étude de la résistance des souches bactériennes isolées aux radiations solaires envisage
la découverte de souches très sensibles ou très résistantes et d’informations sur les
mécanismes spécifiques de protection et de régénération des bactéries exposées aux
rayons solaires.

28
I.5 Objectives

Ce travail a été réalisé en deux étapes. Pendant la première année, les

hydrocarbures et les microorganismes présents dans la microcouche supérieure de la
mer et dans l’eau sous-jacente (0,5 m) sont quantifiés et identifiés. De nombreuses
bactéries présentes dans la microcouche sont isolées et cultivées afin de réunir une
collection d’espèces, nécessaire à la deuxième étape du projet. Les buts de la première
étape sont les suivants:

Déterminer l’abondance et la structure taxonomique des communautés bactériennes

présentes dans la microcouche et dans l’eau sous-jacente (0,5 m) ;

Identifier et isoler plusieurs espèces bactériennes qui habitent dans la microcouche

afin de réunir une collection d’organismes ayant un potentiel important vis-à-vis de
la résistance aux radiations ultraviolettes et de la dégradation de polluants ;

Quantifier et identifier les hydrocarbures présentent dans la microcouche et dans

l’eau sous-jacente.

Pendant la deuxième étape de cette étude les bactéries isolées sont soumises à des
essais au laboratoire afin de vérifier leur résistance à la radiation UV.

En résume les objectifs de la deuxième étape du projet sont les suivants:

Évaluer les effets de la radiation UV sur différentes bactéries, isolées à partir des
échantillons de la microcouche et de l’eau sous-jacente prélevés dans la Baie de
Guanabara;

29
 Chapitre II

Présentation du site d’étude - La Baie de Guanabara

30
II. Présentation du site d’étude – La Baie de Guanabara

La Baie de Guanabara (22° 57’ à 22° 41’ S; 43° 02’ à 43° 16’ W) est située au
Sud-Est du Brésil (figure 3). La baie s'étend en direction nord sur près de 36 km, avec
une embouchure en direction est/ouest, de 1,7 km de largeur. La largeur maximale de la
baie est de 23 km. Sur la rive ouest de la baie se situe la ville de Rio de Janeiro, sur la
rive est, la ville de Niterói. Sur les eaux tranquilles de la baie, on recense 42 îles, 53
plages, des sites historiques, des attractions touristiques et une nature exubérante
menacée par les activités anthropiques.

Figure 3 - La Baie de Guanabara - Rio de Janeiro - Brésil

31
 Le climat est tropical et humide. La température moyenne annuelle est de 24°C,
avec une humidité de 75%. L’été présente des températures supérieures à 40°C. Les
précipitations atmosphériques, d’une valeur totale annuelle d’environ 1500 mm, sont
plus abondantes pendant l’été. Les saisons ne sont pas bien marquées, mais on peut en
général distinguer deux saisons, une saison humide en été (décembre - avril) et une
saison sèche en hiver (juin - août) (Amador, 1997).

Les vents prédominants sont d’est et du nord-est. Pendant l’hiver, environ une
fois par semaine, les fronts polaires arrivent à la côte et provoquent une diminution de la
température de 5 à 10°C et de forts vents du sud, quelques fois d’intensité de plus de 25
m /s (Amador, 1997 ; Kjerfve et al., 2000). Avant l’arrivée des fronts polaires, des
houles (swells) océaniques de 2m à 4m arrivent à la côte et forment des vagues
d’environ 1,3-1,8m (Souza, 1988).

La Baie de Guanabara s’est formée à partir de l’inondation d’un bassin fluvial

par les eux marines pendant l’augmentation du niveau de la mer à la fin du Pléistocène
(Amador, 1980). La baie présente une bathymétrie irrégulière avec plusieurs canaux
correspondant aux anciennes rivières (Ruellan, 1944), qui convergent en direction d’un
canal principal, central. Ce canal, d’une profondeur supérieure à 20m, traverse la baie
depuis l’entrée jusqu’au fond (figure 4). Ces canaux influencent la circulation de l’eau
dans la baie.

La baie a une surface de 377 km2 et un volume d’environ 3,058 x109 m3. La
profondeur moyenne de la baie est de 7,7 m et varie de 3 m à l’intérieur de la baie,
environ 17 m à l’entrée et à plus de 50 m dans le canal central (Amador, 1997). Les
sédiments argileux et les sables argileux prédominent dans la baie, mais le canal central
présente un fond de sable.

La circulation des eaux dans la baie est contrôlée par les cycles des marées, qui
sont de type diurne et dont l’amplitude est comprise entre 0,20m et 1,40m (Mayr et al.,
1989 ; Amador, 1997). Par les courants de flot, l’eau océanique (plus propre, froide et
saline) rentre dans la baie. Les courants de jusant transportent l’eau océanique qui est
rentrée plus une partie de l’eau polluée de la baie. Ces échanges entre l’eau de la baie et
l’eau de l’Océan adjacent se passent principalement par le canal central (Oliveira, 1996 ;
Amador, 1997). Le temps nécessaire pour renouveler 50% de l’eau de la baie est de
11,4 jours (Kjerfve et al., 1997).

32
 Figure 4 - Carte de la bathymétrie de la Baie de Guanabara. D'après Amador, 1997.

En conséquence de la canalisation des fleuves et la déforestation de la forêt

tropicale Atlantique, le taux de sédimentation moyen de la baie est élevé (5cm/an). La
sédimentation combinée aux remblais ont réduit la surface de la baie de 29,1% depuis
1500 (Amador, 1997). La circulation des eaux est donc affectée et la dégradation de la
baie en est aggravée (Amador, 1980 ; Amador 1997).

La baie présente des zones spatiales et temporelles de caractéristiques distinctes

et de qualités de l’eau différentes (Mayr et al., 1989 ; Contador & Paranhos, 1996 ;
Amador,1997 ; Valentin et al., 1999). Les régions les plus influencées par l’eau
océanique sont considérées comme un estuaire salin. Les régions du fond de la baie sont
classées comme un estuaire aux eaux partiellement mélangées (Mayr et al., 1989 ;
Villac et al., 1991). Le renouvellement des eaux au fond de la baie est réduit, surtout
dans la partie nord-ouest, qui présente de faibles profondeurs (moins d’un mètre), et où
la pollution atteint son maximum d’intensité.

33
 Le bassin versant de la Baie de Guanabara (22°24’ à 22°57’ S ; 42°33’ à 43°19’
W) draine une surface de 4000 km2 et englobe 35 fleuves. La région située dans le
bassin de Guanabara est fortement urbanisée et industrialisée et comprend : 15 villes, où
vivent plus de 7 millions d’habitants et où l’on recense 14000 industries, 12 chantiers de
construction et de réparation navale, 14 terminaux de ravitaillement, 2 installations
portuaires, 2 raffineries de pétrole et plus de 1000 stations d’essence (Amador, 1997).
Le trafic des bateaux y est important.

L’activité anthropique autour de la Baie de Guanabara résulte en la dégradation

de la qualité de l’eau. L’apport d’effluents domestiques, évalué à 20m3.s-1, représente
340t DBO/jour de déchets in natura et 84t DBO/jour de déchets traités (Amador 1997 ;
FEEMA, 1998). La baie reçoit environ 150 t/jour de rejets industriels et 18 t/jour de
rejets pétroliers, ainsi que des rejets accidentels (FEEMA, 1990 ; Ferreira, 1995 ;
Amador, 1997).

La pollution de la baie par les hydrocarbures est la conséquence principale des

apports urbains (85%), des activités portuaires et de la navigation dans la baie.
L’industrie du pétrole et les activités industriels sont responsables d’accidents. Par
exemple, en janvier 2000 une brèche est ouvert dans un oléoduc et l,2 million de litres
de carburant (marine fuel oil – MF-380) se sont déversés dans la baie de Guanabara. Les
courants de flot et le vent ont dispersé le carburant vers le Nord, Nord-Est de la baie
contaminant des îles, des plages et des mangroves. La réserve naturelle de Guapimirim,
qui abrite des espèces en voie de disparition, comme l'alligator à ventre jaune, a été
inondée de pétrole.

L’apport de rejets domestiques et industriels dans la baie est nuisible à la pêche

et au tourisme. Les 53 plages situées dans la Baie de Guanabara présentent
fréquemment des concentrations en germes supérieures aux normes réglementaires
(tableau 1 – CONAMA, 2000). Il faut noter que, même polluées, les plages sont
fréquentées par la population locale, ce qui constitue un risque de la santé publique. Le
nombre de coliformes fécaux atteignent à 50 x 104 coliformes /100mL à l’ouest et
moins de 1000 coliformes/100mL dans la partie est de la baie.

34
Tableau 1 - Classification de la qualité bactériologique des eaux de baignade, selon la norme
réglementaire 274/2000 (CONAMA, 2000).

Qualité Entérocoques fécaux

Coliformes fécaux Escherichia coli
bactériologique des (Streptocoques fécaux)
eaux de baignade (CF / 100mL) E. coli / 100mL)
(SF / 100mL)

A - Excellente < 250 < 200 < 25

B - Bonne < 500 < 400 < 50

C - Médiocre < 1000 < 800 < 100
D - Polluée (fermée) > 2500 > 2000 > 400

Le développement urbain et industriel de la région du bassin de Guanabara

provoque l’eutrophisation du milieu et un processus progressif de dégradation
environnementale (Sevrin-Reyssac et al., 1979 ; Schutze et al., 1989 ; Villac, 1990 ;
Valentin et al., 1999). La Baie de Guanabara est maintenant un des écosystèmes les plus
eutrophisés du monde (Valentin et al., 1999). Entre 1981 et 1990, la salinité moyenne
de la baie a diminué d’environ 10%, probablement à cause de l’augmentation des
effluents continentaux (Mayr, 1998).

Les eaux de surface présentent des teneurs élevées d’oxygène dissous, en

général supersaturées, avec un gradient croissant en direction du fond de la baie.
Cependant la couche profonde des zones plus intérieures est totalement anoxique. Mayr
(1998) a observé une diminution significative de la teneur en oxygène dissous dans la
région ouest de la baie pendant la décennie de 1980.

La baie présente de fortes teneurs en nutriments, principalement dans les régions

situés au fond de la baie. Nonobstant, la capacité d’oxydation de matière organique de la
baie est indiquée par l’observation des valeurs d’ammonium plus faibles à marée basse,
qu’à marée haute (Valentin et al., 1999).

La production primaire est très élevée (Sevrin-Reyssac et al., 1979 ; Rebello et

al., 1988) ainsi que les teneurs en chlorophylle a, régulièrement supérieures à 30 µg/L.
Une tendance à l’augmentation de chlorophylle est observée dans le canal central, mais
la région ouest présente une tendance à la diminution, attribuée à la faible transparence
des eaux (Barreto, 1992 ; Valentin et al., 1999).

35
 Les formes nanoplanctoniques, notamment les cyanobactéries, dominent le
phytoplancton, qui est plus important à l’intérieur de la baie (Valentin et al., 1999).
Concernant la diversité du phytoplancton, sur 159 taxons identifiés, 102 sont des
diatomées et 42 sont des dinoflagellés (Villac, 1990).

Encore que la disponibilité de nourriture (phytoplancton et bacterioplancton) soit

très importante, les populations de zooplancton, abondantes dans l’eau côtière,
diminuent de l’entrée de la baie en direction au fond.

Malgré la pollution, la pêche reste encore une des activités importantes dans la
baie. Environ 2.700t de poisson sont pêcher par an dans la baie, ainsi que 200t de
moules sont récoltées. La concentration de métaux lourds dans les moules est de deux à
quatre fois supérieure aux valeurs permises (Rezende & Lacerda, 1986). Grâce à la
faible solubilité des métaux dans les régions anoxiques et aux basses teneurs en oxygène
dissous du fond de la baie, la bioconcentration des métaux lourds n’est pas encore
critique dans la baie.

Un programme de récupération de la Baie de Guanabara est en cours

d’exécution. Malgré la construction des 5 usines de traitement et le renforcement de 3
autres, seulement 25% des eaux usées qui arrivent dans la baie sont préalablement
traitées. Les travaux n’accompagnent pas l’augmentation des villes et de la population.
Dix ans après le début du programme, les résultats ne sont pas encourageants. D’autres
estuaires dans le monde ont été récupérés, comme la Baie de San Francisco. La Baie de
Guanabara est un important estuaire tropical, mais quelle sera la limite au-delà de la
récupération ?

Les bactéries sont très importantes pour le recyclage de la matière organique et

la dégradation des composés toxiques. Les études sur la diversité des populations
bactériennes et leur réponse aux facteurs environnementaux sont d’extrême importance
pour la meilleure compréhension des processus de récupération, y inclus le potentiel de
dégradation des polluants comme les hydrocarbures pétroliers et les métaux lourds.

36
 Chapitre III

Méthodologie

37
III. Méthodologie

III.1 Stratégie d’échantillonnage

Les prélèvements ont été réalisés pendant l’été en 2003 et 2004 dans la Baie de
Guanabara (Rio de Janeiro – Brésil). La microcouche de surface et l’eau sous-jacente
(0,5mm, 0,5m et 5m) sont prélèves à sept sites d’échantillonnage, dont 6 dans la baie et
1 à l’extérieur de la baie (figure 5).

5
4

3
2

rejets domestiques
rejets industriels
rejets pétroliers

Figure 5 - Localisation des sites de échantillonnage dans la Baie de Guanabara – Brésil. Modifié à
partir de carte géographique (#1501) de la Marine Brésilienne et identification des sources de pollution
d’après Andrade et al., 2003.

38
 Les sites d’échantillonnage ont été déterminés en fonction de leurs
caractéristiques physicochimiques, la localisation des principales sources de pollution,
les courants, le trafic des bateaux et la coïncidence avec des sites utilisés pour autres
études, afin de garantir la comparaison des résultats (tableau 2).

Tableau 2 - Localisation géographique des sites d'échantillonnage dans la Baie de Guanabara

Site Localisation Coordonnés géographiques

St1 Hors de la baie 22°59’S et 43°09,7’W
St2 Urca 22°56,6’S et 43°09,5’W
St3 Ponta da Jurujuba 22°55,4’S et 43°11,54’W
St4 Ilha do Manoel João 22°51,3’S et 43°07’W
St5 Ilha do Governador 22°50,3’S et 43°11,5’W
St6 Ilha de Paqueta 22°46,5’S et 43°06,5’W
St7 APA de Guapimirim 22°43,7’S et 43°05,5’W

Afin de vérifier les effets de l’incidence de lumière solaire et des radiations UV

naturelles, le site St1 dans la baie est prélevé au midi solaire et 1-2 heures avant le lever
du soleil, pendant 3 jours consécutifs à chaque campagne (2003 et 2004).

III.2 Prélèvement des échantillons

Diverses études ont proposé différents échantillonneurs pour le prélèvement de

la microcouche, comme le tamis métallique (Garrett, 1965), la plaque en verre (Harvey
& Burzell, 1972), la plaque en téflon (Larsson et al, 1974), le rouleau en céramique et
en téflon (Harvey, 1966 ; Hardy et al., 1988) et le plateau (Hatcher & Parker, 1974b).
Les échantillonneurs varient en fonction du mécanisme de prélèvement, de l’épaisseur
de la couche et du volume d’eau prélevés.

Les études sur l’efficacité des échantillonneurs pour la microcouche sont rares
(Daumas et al., 1976 ; Carlson, 1982 ; Falkowska, 1999a et 1999b ; Agogué et al.,
2004 ; Momzikoff et al., 2004 ; Garcia-Flor et al., 2005). Ces études d’intercalibration
de divers échantillonneurs ont considéré le tamis de Garrett comme l’engin le plus
adéquat pour le prélèvement de la microcouche pour les paramètres biologiques et
chimiques et dans les études multiparamétriques (Falkowska, 1999a et 1999b ; Agogué
et al., 2004 ; Momzikoff et al., 2004 ; Garcia-Flor et al., 2005).

39
 Dans cette étude la microcouche de surface est collectée manuellement à l’aide
d’un tamis (60x80cm) de Garrett (figure 6) (Garrett, 1967a ; Marty et al., 1988 ;
Agogué et al., 2004 ; Momzikoff et al., 2004). La grille du tamis est faite de fil
métallique en acier inoxydable de diamètre 0,36mm et d’ouverture de maille de
1,25mm. Grâce aux forces de tension intermoléculaires, la surface de l’eau est prise par
la grille. (Garrett, 1965 ; Daumas et al., 1976 ; Falkowska, 1999a et b). Le tamis est
immergé obliquement et remonté horizontalement à la surface, prélevant ainsi un film
d’eau d’une épaisseur approximative de 0,44mm. L’eau prise par la grille est versée par
l’intermédiaire d’un entonnoir dans une bonbonne en verre de 12 litres.

Figure 6 - Échantillonnage de la microcouche à l'aide d'un tamis en métal

L’eau sous-jacente est collectée à environ 50cm de profondeur par immersion de

flacons stériles (microbiologie) et de bonbonnes en verre de 4 litres (chimie). Avant le
prélèvement les bonbonnes ont été nettoyées au méthanol et au dichlorométhane,
séchées et rincées 3 fois par l’eau échantillonnée.

Pour les analyses microbiennes, l’eau sous-jacente est aussi prélevée à 5m de

profondeur à l’aide d’une bouteille Niskin.

40
III.3 Analyses microbiennes

III.3.1 Bactéries cultivables

Environ 2 litres de l’échantillon sont séparés pour les analyses microbiennes.

Tout le matériel utilisé dans les analyses microbiennes est stérilisé.

L’analyse des bactéries cultivables est réalisée dans un délai maximum de 4

heures après le prélèvement.

À partir de l’échantillon et des dilutions successives jusqu’à 10-5, les bactéries

sont étalées en duplicat sur Marine Agar (Difco 2216) en boîtes de Pétri. Les unités de
formation de colonie (CFU) sont quantifiées après 7 et 10 jours d’incubation à
l’obscurité à 25°C.

III.3.2 Bactéries totales

La fraction de l’échantillon destinée aux analyses de bacterioplancton total

(environ 4mL) est immédiatement fixée avec le formaldéhyde (concentration finale
2%) ; incubée à l’obscurité pendant 10 minutes et conservée dans l’azote liquide jusqu’à
l’analyse.

Au moment de l’analyse, après décongélation, 1 mL de l’échantillon est inoculé

par 0,1 µL du marqueur fluorescent SYBR Green I (Molecular Probes) et est incubé à
l’obscurité pendant 30 minutes. Une solution de billes de référence (yellow-green 0.92-
mm Polysciences latex beads (106 billes mL-1) est ajouté à l’échantillon comme
standard interne.

L’analyse est réalisée en utilisant un cytomètre en flux (FACScan, Becton

Dickinson) équipé d’un laser à argon (15mv, 488nm). Les bactéries sont quantifiées et
discriminées à partir des caractéristiques de la lumière diffusée à l’angle droit et de la
fluorescence dans le verte mesurée à 530/30nm (Marie et al., 1997, 2000). Le nombre
de cellules bactériennes ayant un taux élevée d’acide nucléique (HNA) et réduite
d’acide nucléique (LNA) est déterminé en suivant la méthodologie de Lebaron et
collaborateurs (2002) et de Servais et collaborateurs (2003).

41
 III.3.3 Isolement de souches

L’isolement des souches est réalisé à partir des colonies sur les boîtes de Pétri
utilisées pour la quantification des bactéries cultivables. Les colonies d’aspect
morphologique différent sont prélevées, repiquées et purifiées 3 fois sur milieu Marine
Agar. Les colonies pures sont inoculées en Marine Broth (Difco 2216) et sont ensuite
cryopréservées dans le DMSO pour les analyses biomoléculaires et la formation d’une
collection de souches.

III.3.4 Caracterisation moléculaire des isolats

III.3.4.1 Extraction de l’ADN

Une suspension cellulaire est préparée dans 50µL d’eau distillée et stérile (EUP)
à partir des colonies pures et isolées sur Marine Agar. Les cellules en suspension sont
soumises à une lyse thermique (96°C pendant 10 minutes).

La plupart des produits PCR (polymerase chain reaction) sont obtenus

directement des suspensions cellulaires soumises à une à une lyse thermique (96°C
pendant 10 minutes), sans la nécessitée d’une étape d’extraction. Dans l’impossibilité
d’amplifier l’ADN à partir des suspensions, l’ADN est extrait à l’aide du kit
d’extraction UltraClean (Mo Bio 12800-50).

La qualité de l’ADN est vérifié par dépôt sur gel d’agarose. L’ADN dégradé se
traduit par une traînée sur le gel.

III.3.4.2 Amplification de l’ADNr 16S

Le gène de l’ARN 16S est amplifié sélectivement avec les amorces SAdir et
S17-rev (tableau 3). Ces amorces s’hybrident sur des régions conservées situées au
début et à la fin de l’ADN 16S et permettent l’amplification d’un fragment d’environ
1500 pb. Les réactions d’extension sont catalysées par l’enzyme Taq-polymérase (Super
Taq, HT Biotechnology Ltd).

42
Tableau 3 - Séquences des amorces utilisées pour l'amplification par PCR sur les ADN totaux
(Brosius et al., 1978)

Amorce Position de référence Séquence

Sadir 8-28 (E. coli) 5'-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AGA-3'

S17rev 1493-1509 (E. coli) 5’-GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3’

Pour l’analyse, 5µL de lysat ou d’ADN purifié est ajouté à un mélange de 5µ L

de tampon 10x (correspondant à l’enzyme Super Taq), 2µL de dNTPs, 1µL de chaque
amorce, 1µL de l’enzyme Super Taq (1U) et 35 µL d’eau ultra-pure stérile.
L’amplification PCR est réalisée à l’aide d’un thermocycleur multi-bloc
(RobocyclerGradient 96, Stratagene) avec la programmation suivante: un cycle initial à
94°C pendant 3 minutes; 30 cycles de dénaturation (1 minute à 94°C) ; d’appariemment
(1 minute à 50°C) et extension (2 minutes à 72°C) et un cycle final d’extension à 72°C
pendant 5 minutes. Les produits PCR sont vérifiés par électrophorèse sur gel d’agarose
1% et coloration avec le bromure d’éthidium. Un marqueur de taille (Smart Ladder,
Eurogentec) permet la vérification de la taille de l’amplifiat (1500 pb).

III.3.4.3 Criblage génotypique des isolats par RFLP

La technique de RFLP (restriction fragment length polymorphism) à partir des

produits PCR est un outil qui permet la comparaison des souches bactériennes et est
aussi utilisée pour la caractérisation des communautés bactériennes (Massol-Deya et al.,
1995). La technique utilise les enzymes de restriction pour sectionner la molécule de
l’ADN dans les sites de coupure où y se trouvent séquences de nucléotides
caractéristiques. À chaque coupure, la molécule originale donne origine à fragments de
diverses tailles. Le nombre et la taille des ces fragments dépendent de la séquence du
gène de la bactérie. Après l’étape de fragmentation les fragments sont séparés par une
électrophorèse sur gel d’agarose à 2% et visualisés par bromure d’éthidium. Les profils
de migration sont spécifiques et permettent la comparaison des isolats afin d’éliminer
les redondances.

43
 Cependant, des bactéries de différents groupes phylogénétiques peuvent
présenter un même profil de RFLP (Priemé et al., 2002). L’efficacité de discrimination
de la RFLP augmente quand plusieurs enzymes de restriction sont utilisées (Savelkoul
et al., 1999).

Les enzymes de restriction utilisées dans cette étude sont Rsa I et Hha I (tableau
4). L’efficacité de différentiation des ces enzymes a été vérifiée par d’autres études
(Dowling et al., 1990 ; Moyer et al., 1996 ; Urakawa et al., 1998 ; Caldeira et al., 2003).

Tableau 4 – Sources et séquences de reconnaissance pour la coupure des enzymes de restriction.

Enzymes de Séquences de reconnaissance

Source
restriction pour la coupure
Rsa I GT’AC Rhodopseudomonas sphaeroides
Hha I GCG’C Haemophilus haemolyticus

Pour l’analyse de RFLP, les produits PCR sont mélangés avec une solution
d’hydrolyse (contenant l’enzyme Hha I), discriminée ci-dessous (tableau 5). La quantité
de produit PCR ajoutée dépend de l’intensité de l’amplifiat sur le gel d’agarose et varie
de 8µL et 15µL. Après une incubation à 37°C pendant la nuit (12 heures), les fragments
sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose 2% et coloration avec le bromure
d’éthidium. Un marqueur de taille (Amplisize, Biorad) est utilisé dans la détermination
de la taille des fragments. Les profils sont visualisés sous UV et photographiés.

Les différents profils sont comparés et chaque nouveau profil reçoit un code. Les
souches très différentes morphologiquement, mais qui présentent des profils identiques
sont soumises à une deuxième analyse par RFLP avec l’enzyme de restriction Rsa I.

Tableau 5 - Solutions d'hydrolyse pour la criblage génotypique par RFLP.

Solutions d’hydrolyse
Hha I Rsa I
1,3 µL de tampon de restriction 10x ; 0,4 µL de tampon de restriction 10x ;
1,1 µL d’eau ultra-pure stérile; 3,8 µL d’eau ultra-pure stérile;
3U d’enzyme Hha I ; 1U d’enzyme Rsa I ;
0,3 µL de BSA (Bovine Serum Albumin) 0,04 µL de BSA (Bovine Serum Albumin)

44
 Un représentant de chaque profil est inclus dans la collection des souches. Un
volume de 950 µL de culture en phase exponentielle est mélangé avec 50 µL de DMSO
filtré sur 0,2 µm et conservé à -80°C.

III.3.4.4 Séquençage

Les souches qui ont présenté des profils de RFLP distincts sont envoyées à
Genome Express (Grenoble, France) pour la séquençage partiel du rADN 16S.

Pour séquencer la moitié (750pb) de l’ADN 16S, des amorces internes 907RC
(antisens) sont utilisés (tableau 6).

Tableau 6 - Séquence d'amorce interne de séquençage (Brosius et al., 1978)

Amorce Position de référence Séquence

907RC (antisens) 907-927 (E. coli) 5’-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3’

Les séquences sont visualisées sous forme d’électrophorégramme à l’aide du

logiciel Chromas. Les pics indéfinis du début et de la fin des séquences sont supprimés,
la correction manuelle est réalisée quand nécessaire. La séquence antisens est
transformée en séquence sens. Le logiciel BioEdit est utilisé pour assembler les
séquences et constituer une séquence "consensus".

Les séquences obtenus dans cette étude et d’autres disponibles au GenBank

(Benson et al., 2000) sont comparées pour une recherche de similarités, à l’aide du
programme BLASTN (Altschul et al., 1997). Les séquences ayant une similarité
supérieure à 97% à une séquence de souche type présent au GenBank sont considérées
de même genre.

Les séquences sont comparées deux à deux et alignées par le logiciel CLUSTAL
W (Thompson et al., 1994). L’alignement des séquences est vérifié à l’aide du logiciel
SEAVIEW (Galtier et al., 1996), afin de déterminer les zones réellement informatives.

A fin d’établir les relations phylogénétiques entre les souches isolées par cette
étude et d’autres au Genbank, les distances évolutionnaires (pairwise evolutionary
distances) entre les séquences sont calculées avec la méthode de Kimura (1980), par le

45
logiciel PHYLO-WIN (Galtier et al., 1996). Les arbres phylogénétiques sont construits à
partir de la méthode de "neighbour-joining" (Saitou & Nei, 1987).

La robustesse de chaque embranchement d’un arbre phylogénétique est évaluée

par la méthode de Bootstrap ou d’analyse par échantillonnage (Felsentein, 1985). Les
arbres sont visualisés à partir du logiciel NJPLOT (Perrière & Gouy, 1996).

III.3.5 SSCP

L’amplification et le séquençage des gènes de l’ADNr 16S extraits directement

des échantillons naturels permettent l’étude de la diversité microbienne sans la mise en
culture des bactéries.

La technique de SSCP (single strand conformation polymorphism) permet la

séparation des molécules d’ADNr 16S en fonction de leur séquence (Orita et al., 1989 ;
Hayashi, 1991).

Pour cette analyse, un volume de 250 mL de l’eau prélevée est filtré sur une
membrane de polycarbonate, 0,2µm. Les filtres sont préservés à -80°C avant d’être
analysés.

Les membranes sont découpés à l’aide de scalpels et de pinces stériles et

immergés dans 900µL d’une solution de lyse (40 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,
0.75 M sucrose). Après l’addition de 1mg de lysozyme, la suspension est incubée à
37°C pendant 45 minutes. Ensuite, 9µL de Proteinase K (0.2 mg mL–1 concentration
finale) et 45µL de sodium dodecyl sulfate (1% concentration finale) sont ajoutés à la
suspension qui est incubée à 55°C pendant 1 heure (Servais et al., 2003).

L’ADN est extrait avec un volume égal de phénol-chloroforme-alcool

isoamylique (25:24:1, v:v:v) et précipité par l’addition de 1/10 en volume d’acetate de
sodium 3M et de 2 volumes d’isopropanol froid.

Après une incubation à -20°C pendant 12 heures l’ADN est récupéré par
centrifugation à 10000 g pendant 30 minutes. Le pellet est rincé avec de l’éthanol à 70%
à froid, séché et remis en suspension dans 100µL d’eau ultra pure.

46
 L’amplification d’une partie du gène ADNr 16S est réalisée avec les amorces
universelles (tableau 7) W49 dir et TET W34 rev (Applied Biosystems). L’amorce W34
rev est marqué en 5’ avec la tetrahydrochloro-6-carboxy-fluorescéine (TET) (Applied
Biosystems) (Servais et al., 2003). Les réactions de PCR sont catalysées par l’enzyme
Pfu-polymerase (Promega). Le programme de PCR utilise une dénaturation initiale à
94°C pendant 2 minutes, 20 cycles de température à 96°C pendant 1 minute, 50°C
pendant 1 minute et 72°C pendant 1 minute, et une étape finale d’extension à 72°C
pendant 10 minutes (Delbès et al., 2000).

L’amplification PCR est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2%. Les
produits PCR (200 bp) sont purifiés avec QIAGEN columns (QIAquick PCR
purification kit).

Tableau 7 - Séquences des amorces utilisées pour l'amplification par PCR sur les ADN totaux.

TAmorce Position de référence Séquence

W49 dir 331 (E. coli) 5’-ACG-GTC-CAGACT- CCT-ACG-GG-3’

W34 rev 533 (E. coli) 5’-TTA-CCG-CGG-CTG-CTG-GCA-C-3’

Les produits SSCP-PCR sont dilués en fonction de l’intensité de l’amplificat sur

gel d’agarose. Le produit PCR dilué (1µL) est ajouté à 0,1µL d’un marqueur de
migration fluorescent (Genesca n-400 Rox) et 18,9µL de formamide désionisée
(Applera). Ce mélange contenant l’ADN est chauffé à 94°C pendant 5 minutes et
immédiatement refroidi dans la glace. Le choc thermique cause l’adoption d’une
conformation structure secondaire par les fragments d’ADN. La structure secondaire
varie en fonction de la séquence des nucléotides du fragment.

L’électrophorèse capillaire SSCP est réalisée comme décrit par Servais et

collaborateurs (2003) à l’aide de l’appareil ABI Prism 310 genetic analyzer (Applied
Biosystems), correctement calibré. Chaque échantillon migre 30 minutes à 15kV. La
migration des fragments de l’ADN dépend de leur conformation, et subséquemment de
la séquence du gène. L’ADN simple brin marqué par le fluorochrome est détecté par un
système de laser.

47
 Les données résultantes sont analysées par le programme 310 Genescan
Analysis (Applied Biosystems). Les profils sont alignés à l’aide des marqueurs de taille.

Afin de comparer les profils de migration, le rapport entre la surface du pic et la

surface totale de la somme de tous les pics est calculé. Ce rapport donne une idée semi
quantitative de l’abondance des séquences dans la population.

Des dendrogrammes pour la comparaison entre les échantillons sont construits

par la méthode UPGMA (unweighted-pair-group method with arithmetic averages) à
partir d’une matrice de distance calculée selon le coefficient de communauté de Jaccard
(coefficient binaire excluant les doubles zéros).

III.3.6 Expérience sur la résistance des souches aux radiations solaires

L’expérience sur la résistance des souches aux radiations solaires est réalisée à
l’aide d’un simulateur solaire 1000 W – lampe xenon (Loti-Oriel, France). L’utilisation
de 2 filtres correctifs (AM0 et AM1) assure une illumination dans les UVB, UVA et le
visible, identique à celle du rayonnement solaire à la surface de la terre.

Les conditions d’exposition sont déterminées pour atteindre les intensités de

PAR, UVA et UVB indiqués sur le tableau 8 (Agogué et al., 2005b). La surface
d’exposition est de 20 x 20 cm (2 microplaques de 24 puits), et la distance entre la
source lumineuse et les microplaques est de 30cm.

Les intensités et les doses horaires de PAR, UVA et UVB reçues au niveau des
microplaques sont mesurées à l’aide d’un spectro-radiomètre ELDONET (European
Light Dosimeter Network) à large bande (Hader et al., 1999) (tableau 8).

Tableau 8 - Conditions expérimentales: intensités et doses horaires de PAR, UVA et UVB

(Agogué et al., 2005b)

PAR (400-700 nm) UVA (320-400 nm) UVB ( 280 – 320 nm)
2 2
intensités à 30 cm 352 W/m 40 W/m 1,2 W/m2
dose horaire 1267 KJ/m2 144 KJ/m2 4,32 KJ/m2

48
 Un suivi de croissance des souches dans du Marine Broth (Difco 2216) est
préalablement réalisé à fin de déterminer pour chaque souche le temps mis pour
atteindre la phase stationnaire. Le suivi est réalisé en microplaques de 24 puits et lecture
des densités optiques à 590nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. La courbe de
croissance des souches est observée en triplicat (3 puits pour chaque souche). Un
contrôle de contamination (3 puits avec du milieu de culture sans inoculation) est réalisé
pour chaque microplaque.

Pour l’expérience de résistance des bactéries aux irradiations solaires, les

souches sont mises en culture dans du Marine Broth à 25°C sous agitation. Au début de
la phase stationnaire de croissance, le bouillon est centrifugé à 6000g pendant 10
minutes. Le culot est rincé à partir de la remise en suspension dans l’eau de mer filtrée
et autoclavée. La suspension est centrifugée à 6000g pendant 10 minutes. Cette
opération est répétée une fois.

La suspension bactérienne résultant de l’étape de rinçage est fixée au formol à

une concentration finale de 2%, marquée par le fluorochrome SYBR Green I (Molecular
Probes Inc.) à une concentration finale de 0,01% et incubée pendant 15 minutes à
l’obscurité.

Dans une microplaque de 24 puits, chaque souche est inoculée en duplicate (2

puits) à partir de 1 mL de la suspension à 104 cellules/mL. Un contrôle de
contamination est réalisé pour chaque microplaque : deux puits sont remplis avec 1 mL
de l’eau de mer filtrée et autoclavée (figure 7).

Les microplaques sont exposées aux radiations par le simulateur solaire pendant
des temps d’exposition croissants. Pendant l’exposition sous le simulateur solaire les
échantillons sont maintenus en agitation orbitale sur un plateau. Une température de 20-
25°C est assurée par une plaque réfrigérante placée sous le plateau agitateur et reliée à
une cryothermostat ministat (Roucaire, France) (figure 7). La température de la salle de
manipulation est maintenue à 25°C grâce à un climatiseur.

Une première série d’expériences sur la résistance des souches aux radiations
solaires est réalisée avec 3 durées d’exposition 10, 20 et 30 minutes. Comme la majorité
des souches sont résistantes à ces durées d’exposition, une deuxième série d’expériences
a été conduit en utilisant les temps d’exposition de 1, 3, 5 et 7 heures.

49
 Suite à l’exposition au simulateur solaire, 1 mL du milieu Marine Broth
concentré deux fois est ajouté dans chaque puits et la croissance des bactéries est suivie
par la mesure de la densité optique à 590nm, pendant 6 jours, avec un lecteur de
microplaques.

Figure 7 - Simulateur solaire et microplaque avec souches en duplicat.

50
III.4 Analyses chimiques

II.4.1 Précautions prises au cours des manipulations

Pour éviter la contamination des analyses, tout le matériel utilisé pour les
prélèvements et pour les analyses est décontaminé par rapport aux hydrocarbures.

Avant usage, toute la verrerie est passée au four pendant 4 heures à 450°C et
rincée au éthanol et au dichlorométhane. La verrerie de précision est nettoyée à l’acide
sulfochromique pendant au moins trois heures, puis rincée à l’eau pure déminéralisée
(milliQ), à l’éthanol et au dichlorométhane. Les spatules, pinces et ciseaux sont
nettoyés à l’eau milliQ, à l’éthanol et au dichlorométhane. Les desséchants (Na2SO4,
CaCl2, MgSO4), la silice et le coton sont extraits au soxhlet pendant 24 heures au
dichlorométhane. Tous les solvants sont distillés deux fois.

Le système de filtration ainsi que les tuyaux en téflon utilisés sont nettoyés au
dichlorométhane. Entre les échantillonnages, le système est lavé à l’eau milliQ. Les
filtres sont pré-extraits au dichlorométhane et conservés dans du papier aluminium
passé au four à 450°C pendant 4 heures.

Afin de minimiser les risques de photodégradation des hydrocarbures

aromatiques, les extraits lipidiques et les systèmes d’extraction de la phase particulaire
sont mis à l’abri de la lumière (Sanders et al., 1993).

II.4.2 Séparation entre les fractions dissoute et particulaire

Les échantillons sont transportés au laboratoire. Quelques heures après le

prélèvement, ils sont filtrés pour séparer le matériel dissous et le matériel particulaire.
Afin d’éliminer le zooplancton de grande taille, une pré-filtration est réalisée sur des
toiles à bluter de 200 µm. La filtration a été réalisée sous faible pression sur des filtres
en fibre de verre (Whatman® GF/F, porosité de 0,7 µm, diamètre de 147 ou 290mm)
pré-extraits au dichlorométhane (Saliot, 1981). Le système de filtration se compose d’
une pompe à vide et de porte-filtres Millipore® en acier inoxydable rincés au
dichlorométhane. La filtration est stoppée dès le ralentissement de l’écoulement du
filtrat.

Chaque filtre est stocké dans des tubes SVL à -30°C et transporté en France pour
son analyse au laboratoire. L’eau filtrée (fraction dissoute) est stockée dans des
bouteilles de verre pendant un maximum de 3 heures avant le traitement de la fraction
dissoute.

51
II.4.3 Extraction

II.4.3.1 Fraction dissoute

Dans un maximum de 3 heures après la filtration on procède à l’extraction

liquide-liquide. Environ 10 litres de l’eau filtrat (fraction dissous) sont extraits trois fois
par 200 mL de dichlorométhane dans 3 ampoules en verre avec une clé en téflon. Les
deux premières extractions sont faites à pH 8 et la troisième à pH 2, par addition
d’environ 25 mL d’acide chlorhydrique à 36% (Sicre et al., 1987). Les trois extraits sont
réunis dans une bouteille en verre brun, séchés sur CaCl2 et stockés au réfrigérateur à –
5°C jusqu’à analyse.

L’extrait total est filtré sur coton, récupéré dans un ballon, et concentré par
évaporation rotative. L’extrait concentré est stocké dans des vials SVL en verre à -30°C
et transporté au laboratoire à Paris. L’extrait dissous est soumis par la suite au même
traitement que l’extrait des phases particulaires.

II.4.3.2 Fraction particulaire

Dans le but de favoriser le contact entre la phase particulaire et les solvants, les
filtres sont découpés en morceaux à l’aide de pinces métalliques et de ciseaux rincés au
méthanol et au dichlorométhane. Les morceaux des filtres sont extraits pendant 15
minutes dans une cuve à ultrasons par 50mL d’un mélange de
méthanol/dichlorométhane/solution saline (10:5:4). Un mélange d’étalons internes
aliphatique (C24D50) et aromatique (paraD10terphényl) est ajouté à l’extrait. Les
étalons internes sont des composés deutériés de concentration connue et permettent la
détermination de la concentration des différents hydrocarbures. L’utilisation d’étalons
permet aussi la vérification des pertes occasionnées lors de la préparation des
échantillons (Barrick, 1982).

L’extrait total obtenu est transvasé sur un fritté et filtré sous vide en récupérant
le filtrat dans une ampoule à décanter. Le fritté est rincée avec 20 mL d’un mélange de
méthanol/dichlorométhane/solution saline (10:5:4). Les solvants sont récupérés dans
l’ampoule. L’extraction est répétée une deuxième fois. Ensuite le fritté est rincé deux
fois par 37 mL de dichlorométhane. Le filtré est enlevé et 37 mL de solution saline sont
ajoutés dans l’ampoule, l’ensemble est agité et la phase organique est récupéré dans un
ballon après décantation. La phase aqueuse restante dans l’ampoule à décanter est ré-
extrait deux fois par 15 mL de dichlorométhane. La phase organique est séchée sur
MgSO4, mélangée pendant 20 secondes dans une cuve à ultrasons et conservée au
frigidaire pendant 24 heures. La phase organique est transvasée dans un entonnoir muni
de coton et récupérée dans un ballon. Le ballon et l’entonnoir sont rincés avec
dichlorométhane. Les extraits sont concentrés dans un évaporateur rotatif, transférés
dans un vial et conservés au congélateur jusqu’à l’analyse.

52
II.4.4 Séparation chromatographique sur gel de silice

Après l’extraction, l’extrait dissous et l’extrait des phases particulaires sont

soumis au même traitement. Les composés organiques contenus dans les extraits sont
séparés en deux fractions : la fraction aliphatique et la fraction aromatique. Ce
fractionnement est réalisé par chromatographie en phase normale sur gel de silice, avec
un gradient de dilution par polarité croissante (Peltzer et al., 1984 ; Peltzer & Gagosian,
1987 ; Fernandes et al., 1997).

Une colonne en verre munie de coton est rincée trois fois avec successivement
de l’hexane, du dichlorométhane et du méthanol. La colonne est ensuite rempli de 0,4 g
de silice (pré extraite, activée pendant 1 heure à 150°C et recouverte d’hexane) et rincée
à l’hexane. L’extrait total est mis à sec, dissous dans 250 µL d’hexane et déposé en tête
de colonne à l’aide d’une pipette passée au four et rincée au dichlorométhane. Les
hydrocarbures non-aromatiques, ou dit aliphatiques (n-alcanes, alcanes ramifiés,
alcènes, cyclo-alcanes et dérivés) sont élués avec 3 mL d’hexane et récupérés dans un
ballon poire. La fraction aromatique est éluée avec 10 mL d’un mélange hexane/toluène
(9 :10) et récupérée dans un autre ballon poire (Fernandes, 1997).

Les fractions sont concentrées dans un évaporateur rotatif, transférées dans des
vials, mises à sec et reprises par le dichlorométhane. Les hydrocarbures aliphatiques et
aromatiques sont conservés au congélateur.

II.4.5 Méthodes de quantification et d’identification

II.4.5.1 Chromatographie en phase gazeuse (GC)

Les hydrocarbures aliphatiques sont injectés (1µL) dans un chromatographe en

phase gazeuse équipé avec une colonne capillaire de 30 m de longueur et 0,25 mm de
diamètre interne. La phase stationnaire, DB-5 (J&W Scientific), est d’une épaisseur de
0,25 µm. Le gaz vecteur est l’hydrogène.

La programmation de température de la colonne est la suivante: température

initiale de 60°C, augmentation de 25°C/min jusqu’à 100°C, augmentation de 2°C par
minute jusqu’à la température finale de 310°C maintenue pendant 80 minutes.

L’analyse est assistée par le logiciel Saphir (SRA Instruments) qui permet
d'intégrer la surface des pics obtenus. Cette surface, comparée à celle du pic obtenu
pour l’étalon interne, permet de déterminer la concentration des différents
hydrocarbures.

53
 Une série de n-alcanes de C10 à C36 est injecté comme un mélange de standards
à fin de déterminer le temps de rétention des composés. L’identification des
hydrocarbures aliphatiques résolus est réalisée par la comparaison des temps de
rétention avec le mélange de standards.

Les échantillons correspondants aux blancs d’extraction, blancs de solvants,

blancs de séparation et standards sont également analysés par chromatographie en phase
gazeuse.

54
Chapitre IV

Résultats

55
IV.1 Analyses chimiques : les hydrocarbures de la microcouche de surface

La fraction aliphatique des hydrocarbures est caractérisée par la prédominance

des composés non-résolus (UCM) et des n-alcanes (figure 8).

Figure 8 – Chromatogramme en phase gazeuse des hydrocarbures aliphatiques extraits de la microcouche de

surface à la St1. Std = standard interne; n-C15 à 37 = n-alcanes ayant 15 à 37 atomes de carbone; UCM = enveloppe
de composés non résolus.

Les hydrocarbures aliphatiques résolus consistent principalement en des n-

alcanes ayant de 15 à 37 atomes de carbone. La concentration totale des n-alcanes varie
entre 643 et 11927 µg.L-1 (tableau 9).

Dans la plupart des échantillons, le n-alcane C17 est prédominant dans les
hydrocarbures aliphatiques résolus. La concentration du n-alcane C29 est aussi très
importante dans les échantillons (tableau 9).

56
 Tableau 9 - Concentrations des hydrocarbures aliphatiques totaux, n-alcanes, pristane, phytane et UCM
(enveloppe des composés non résolus).
-1
Hydrocarbures (µg.L ) St1 SML St1 UW St2 SML St2 UW St3 SML St3 UW St4 SML St4 UW St6 SML St6 UW St7 SML St7 UW
n-C15 15 23 25 20 27 13 545 258 317 47 177 124
n-C16 11 0 19 14 11 4 80 20 26 6 23 9
n-C17 122 843 40 28 802 561 9016 9423 3117 2364 1184 2554
pristane 40 54 0 9 76 54 1541 773 791 317 362 409
n-C18 14 8 38 16 14 6 68 12 18 3 36 9
phytane 0 5 28 11 11 6 43 8 13 0 41 0
n-C19 18 9 51 36 29 9 114 14 19 4 85 17
n-C20 24 13 79 19 59 9 57 13 26 3 61 7
n-C21 37 10 123 18 108 60 141 11 38 4 64 7
n-C22 55 11 178 22 121 9 194 12 60 4 55 10
n-C23 78 9 220 24 122 9 109 11 89 4 54 10
n-C24 91 11 229 29 103 10 228 10 119 4 45 14
n-C25 106 8 220 32 89 11 213 13 127 5 43 13
n-C26 104 10 212 39 78 12 195 31 134 4 43 9
n-C27 115 10 208 48 73 13 112 14 137 7 47 14
n-C28 103 11 109 52 68 29 34 12 116 5 31 7
n-C29 150 14 193 59 62 13 114 17 117 9 58 15
n-C30 86 10 129 45 39 19 145 14 73 7 25 6
n-C31 108 11 120 45 40 13 211 43 72 22 40 11
n-C32 68 9 79 29 24 8 150 7 40 5 17 0
n-C33 83 8 41 24 35 7 185 3 59 8 29 12
n-C34 45 6 0 16 0 5 17 5 15 0 0 0
n-C35 47 6 0 13 0 7 0 0 0 0 17 0
n-C36 0 6 0 9 0 0 0 0 0 0 0 8
n-C37 35 5 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0
n-alcanes 1515 1050 2312 643 1906 826 11927 9943 4719 2515 2135 2856
résolus 1555 1110 2340 663 1993 886 13512 10724 5523 2831 2538 3265
UCM 42025 17234 40386 29378 11031 12641 63081 14494 59794 14100 56837 33564
Total 43579 18344 42726 30041 13024 13527 76593 25218 65317 16931 59376 36829

Les composés non résolus ou UCM (unresolved complex mixture) prédominent

sur les hydrocarbures aliphatiques résolus et correspondent à plus de 80% des
hydrocarbures aliphatiques totaux (tableau 10). Le rapport entre les concentrations des
composés non-résolus et résolus (U/R) confirme l’importance de l’enveloppe des
composés non résolus (tableau 10).

57
Tableau 10 - Rapports caracteristiques et indicateurs aliphatiques pour les échantillons de la Baie de
Guanabara. U/R = rapport entre les concentrations des composés non résolus et résolus ; CPI = index de
prédominance calculé dans la gamme des carbones C15 à C20 et C21 à C35 ; %C17 = pourcentage du C17 parmi les
hydrocarbures résolus ; C17/C29 = rapport des n-alcanes ayant 17 et 29 atomes de carbons ; MH = major
hydrocarbon, le n-alcane prédominant ; LMW/HMW = low/high molecular weight hydrocarbons, rapport de la
somme des n-alcanes de faible poids moléculaire ( ≤ 20C) et le total de n-alcanes de haut poids moléculaire (>20C);
Pri/Phy= rapport entre les concentrations de pristane et de phytane
St1 SML St1 UW St2 SML St2 UW St3 SML St3 UW St4 SML St4 UW St6 SML St6 UW St7 SML St7 UW
%UCM 96,43% 93,95% 94,52% 97,79% 84,70% 93,45% 82,36% 57,47% 91,54% 83,28% 95,73% 91,13%
U/R 27,03 15,53 17,26 44,33 5,54 14,27 4,67 1,35 10,83 4,98 22,39 10,28
CPI 15-20 3,17 43,10 0,86 1,74 10,27 30,98 47,16 214,33 50,00 200,18 12,06 107,60
CPI 21-35 1,31 1,11 1,20 1,14 1,23 1,46 1,13 1,25 1,15 2,05 1,63 1,76
%C17 7,87% 75,94% 1,70% 4,28% 40,26% 63,32% 66,73% 87,87% 56,44% 83,49% 46,66% 78,23%
C17/C29 0,81 61,44 0,21 0,48 12,88 43,68 78,92 539,17 26,70 265,38 20,43 169,45
MH C29 C17 C24 C29 C17 C17 C17 C17 C17 C17 C17 C17
LMW/HMW 0,16 5,76 0,12 0,26 0,98 2,68 4,83 48,11 2,94 27,66 2,76 20,11
Pri/phy - 10,11 0,00 0,81 7,07 9,57 35,65 92,84 60,86 - 8,83 -
n17/Pri 3,07 15,59 - 3,22 10,54 10,34 5,85 12,18 3,94 7,47 3,27 6,24
n18/Phy - 1,42 1,36 1,46 1,30 1,06 1,57 1,43 1,35 - 0,87 -

Les hydrocarbures ayant des chaînes carbonées inférieures ou égales à 20 atomes

de carbone sont considérés comme ayant un faible poids moléculaire (LMW ou low
molecular weight), tandis que ceux présentant plus de 20 atomes de carbone sont les
composés de haut poids moléculaire (HMW ou high molecular weight). Les
hydrocarbures de faible poids moléculaire prédominent dans les échantillons de
l’intérieur de la baie (St4, St6 et St7). À l’entrée de la baie (St1, St2 et St3) les
composés de haut poids moléculaire sont plus abondants (tableau 10).

Le CPI (carbon preference index) correspond au rapport entre les n-alcanes dont
le nombre de carbones est impair et ceux ayant nombre de carbones pair (Wang et al.,
1999). C’est un indicateur aliphatique très utilisé (Bence & Burns, 1995). Le CPI
calculé dans la gamme des n-alcanes ayant de 15 à 20 carbones indique une
prédominance des composés impairs. Les n-alcanes de haut poids moléculaire
présentent une valeur du CPI proche de 1 (tableau 10).

On observe un enrichissement des hydrocarbures aliphatiques dans la

microcouche de surface par rapport à l’eau sous-jacente. L’enrichissement est plus
évident pour les composés de haut poids moléculaire par rapport aux composés de faible
poids moléculaire (tableau 11).

58
 Tableau 11 - Facteurs d'enrichissement des hydrocarbures aliphatiques.
St1 St2 St3 St4 St6 St7
C15 0,66 1,29 2,10 2,11 6,78 1,42
C16 - 1,36 2,64 3,97 4,43 2,50
C17 0,15 1,40 1,43 0,96 1,32 0,46
pristane 0,74 - 1,40 1,99 2,50 0,89
C18 1,87 2,41 2,34 5,72 5,37 3,98
phytane - 2,59 1,90 5,19 - -
C19 2,02 1,42 3,32 8,15 4,37 5,09
C20 1,88 4,23 6,76 4,32 8,64 8,92
C21 3,83 6,76 1,80 13,12 9,28 9,50
C22 5,21 8,16 13,43 16,52 16,06 5,33
C23 9,07 9,06 14,12 9,58 20,93 5,61
C24 8,43 8,03 10,38 23,18 31,27 3,33
C25 13,38 6,94 7,78 16,58 23,57 3,38
C26 10,39 5,41 6,50 6,19 31,61 4,93
C27 11,35 4,33 5,72 8,02 19,00 3,43
C28 9,12 2,10 2,38 2,85 21,54 4,45
C29 10,97 3,25 4,85 6,54 13,10 3,85
C30 8,34 2,85 2,11 10,70 10,35 3,94
C31 9,56 2,65 3,12 4,89 3,34 3,75
C32 7,76 2,69 2,99 21,71 8,88 -
C33 10,19 1,72 4,99 65,14 7,81 2,37
C34 7,02 - - 3,54 - -
C35 7,36 - - - - -
C36 - - - - - -
C37 7,06 - - - - -
n-alcanes 1,44 3,59 2,31 1,20 1,88 0,75
UCM 2,44 1,37 0,87 4,35 4,24 1,69
LMW 0,23 1,90 1,57 1,01 1,45 0,58
HMW 8,44 4,03 4,29 10,11 13,64 4,20
Total 2,38 1,42 0,96 3,04 3,86 1,61

La distribution normale des données est vérifiée par le test de Ryan-Joiner

(Shapiro & Wilk, 1965). La différence entre les échantillons de la SML et ceux de l’eau
sous-jacente est analysée par le test t (Student, 1908). Les différences sont considérées
significatives quand p < 0,05 (niveau de confiance 95%).

Les hydrocarbures non aromatiques totaux, les composés non résolus (UCM),
les composés de haut poids moléculaire (HMW), le phytane et le n-alcane n-C17
présentent des concentrations significativement différentes dans la microcouche et dans
l’eau sous-jacente (tableau 12).

59
 Tableau 22 - Test t (Student) SML x UW. * p < 0,05 ; ** p < 0,01.
n-C15 n-C17 Pris Phy n-C27 n-C29 LMW HMW n-alc UCM Total
t 1,09 2,83* 0,72 2,39* 0,59 0,74 0,12 4,54** 0,51 2,91* 2,71*
p 0,302 0,036 0,485 0,038 0,571 0,480 0,991 0,005 0,621 0,022 0,032
n 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

Les concentrations des hydrocarbures sont, en général, plus importantes pour les
échantillons prélevés au fond de la baie (tableau 9). Afin d’analyser la variation spatiale
des hydrocarbures dans la Baie de Guanabara, les données sont regroupées en fonction
de la localisation des sites dans la baie (entrée de la baie = St1 ; St2 et St3 et fond de la
baie = St4 ; St6 et St7).

La différence observée pour les composés organiques aux sites du fond de la

baie en comparaison de ceux situés à l’entrée est significative pour les n-alcanes totaux
et les composés de faible poids moléculaire (LMW), y compris le n-C15 et le n-C17 et
le pristane (tableau 13).

Tableau 13 - Test t entrée x fond. * p < 0,05 ; ** p < 0,01.

n-C15 n-C17 Pris Phy n-C27 n-C29 LMW HMW n-alc UCM Total
t 3,13* 2,83* 3,49** 0,83 0,59 0,74 2,87* 0,38 2,48* 1,37 1,76
p 0,011 0,018 0,006 0,424 0,562 0,478 0,017 0,714 0,033 0,200 0,11
n 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

60
IV.2 Analyses microbiennes

IV.2.1 Quantification des bactéries totales et cultivables

Les densités des bactéries totales observées dans la microcouche de surface de la

Baie de Guanabara sont d’environ 1,22x107 cellules.mL-1 pour la campagne de l’année
2003 et 8,31x106 cellules.mL-1 pour la campagne de 2004 (tableaux 14 et 15). Les sites
d’échantillonnage situés au fond de la baie présentent des concentrations en bactéries
plus élevées en comparaison des sites proches de l’entrée de la baie (tableaux 14, 15 et
19).

Les cellules à haut contenu en ADN (HNA) correspondent à la plupart des

bactéries totales quantifiées par cytométrie en flux (>70% en 2003 et >60% en 2004)
(tableaux 14 et 15).

Comparées au bactérioplancton total analysé par cytométrie en flux, les bactéries

cultivables sont une fraction minoritaire, d’environ 4% pour la campagne
d’échantillonnage de l’année 2004 (tableau 15). Dans l’année 2003 les bactéries
cultivables correspondent à environ 3% pour la microcouche et 1% pour l’eau sous
jacente (0,5m et 5m) (tableau 14).

Tableau 14 - Résultats des quantifications des bactéries totales et cultivables. Campagne 2003.
-1 -1
Site Date Bactéries cultivables ( cellules.mL ) Bactéries totales ( cellules.mL ) % cultivables/total % HNA

SML UW (0,5m) 5m SML UW (0,5m) 5m SML UW (0,5m) 5m SML UW (0,5m) 5m

St1 10-mars - - - - 1,38E+06 1,54E+06 - - - - 67% 79%

St1 27-mars 1,18E+05 8,00E+03 3,95E+04 2,40E+06 1,76E+06 1,09E+06 5% 0% 4% 80% 73% 73%
St3 11-mars 3,00E+04 1,34E+04 8,00E+04 5,52E+06 2,01E+06 3,80E+06 1% 1% 2% 89% 84% 74%
St3 27-mars 1,25E+05 3,05E+04 8,00E+04 3,95E+06 3,78E+06 2,55E+06 3% 1% 3% 87% 81% 80%
St4 12-mars 1,15E+06 1,26E+06 - 2,45E+07 4,57E+07 4,65E+07 5% 3% - 72% 84% 76%
St4 31-mars 1,55E+05 4,50E+04 5,85E+04 3,65E+07 3,17E+07 6,68E+06 0% 0% 1% 78% 66% 66%
St5 12-mars - - 4,95E+04 1,30E+07 1,56E+07 5,52E+06 - - 1% 70% 75% 67%
St5 31-mars 9,50E+05 2,85E+04 2,55E+04 1,88E+07 1,88E+07 9,75E+06 5% 0% 0% 77% 86% 71%
St6 13-mars 2,08E+05 1,97E+05 1,10E+04 2,91E+07 2,40E+07 3,19E+06 1% 1% 0% 76% 77% 68%
St7 13-mars 2,45E+05 1,93E+05 6,00E+03 3,00E+07 3,05E+07 4,57E+06 1% 1% 0% 88% 88% 66%
St2 24-mars 5h 3,10E+04 2,00E+04 2,75E+04 2,00E+06 1,73E+06 1,03E+06 2% 1% 3% 45% 57% 42%
St2 24-mars 12h 5,40E+04 8,65E+03 2,10E+04 4,35E+06 4,59E+06 2,03E+06 1% 0% 1% 70% 76% 61%
St2 25-mars 5h 1,62E+05 1,10E+05 1,49E+04 4,35E+06 3,27E+06 1,51E+06 4% 3% 1% 86% 85% 72%
St2 25-mars 12h 3,30E+05 2,65E+04 2,70E+04 3,84E+06 3,70E+06 2,27E+06 9% 1% 1% 79% 82% 73%
St2 26-mars 5h 5,45E+04 3,10E+04 1,70E+04 2,96E+06 1,97E+06 2,06E+06 2% 2% 1% 77% 73% 72%
St2 26-mars 12h 1,36E+05 2,65E+05 5,10E+03 2,02E+06 4,85E+06 2,02E+06 7% 5% 0% 79% 88% 78%
moyenne 2,68E+05 1,60E+05 3,30E+04 1,22E+07 1,22E+07 6,01E+06 3% 1% 1% 77% 78% 70%
max 1,15E+06 1,26E+06 8,00E+04 3,65E+07 4,57E+07 4,65E+07 9% 5% 4% 89% 88% 80%
min 3,00E+04 8,00E+03 3,95E+04 2,40E+06 1,38E+06 1,09E+06 0% 0% 1% 72% 66% 66%
écart-type 3,23E+05 3,00E+05 2,52E+04 1,18E+07 1,35E+07 1,07E+07 3% 1% 1% 21% 9% 9%

61
 Tableau 15 - Résultats des quantifications des bactéries totales et cultivables. Campagne 2004.
-1 -1
Site Date Bactéries cultivables (cellules.mL ) Bactéries totales (cellules.mL ) % cultivables/total % HNA
SML UW SML UW SML UW SML UW
St1 31-mars 12h 6,40E+04 2,00E+04 4,93E+06 3,27E+06 1% 1% 81% 73%
St3 11-mars 12h 8,35E+04 7,60E+04 5,84E+06 1,50E+06 1% 5% 86% 76%
St4 29-mars 12h 1,60E+05 2,50E+04 1,18E+07 1,11E+07 1% 0% 62% 58%
St5 29-mars 12h 2,35E+05 1,75E+05 2,58E+07 2,16E+07 1% 1% 72% 72%
St6 30-mars 12h 4,15E+05 3,00E+04 1,29E+07 1,13E+07 3% 0% 72% 67%
St7 30-mars 12h 1,25E+04 4,00E+04 1,36E+07 1,17E+07 0% 0% 69% 66%
St1 04-mai 5h 5,25E+03 8,50E+03 2,96E+06 1,18E+06 0% 1% 23% 61%
St2 04-mai 5h 2,50E+05 3,55E+05 3,82E+06 3,98E+06 7% 9% 67% 65%
St2 04-mai 12h 7,10E+04 3,93E+04 6,40E+06 4,63E+06 1% 1% 62% 63%
St2 05-mai 5h 8,95E+04 7,42E+04 3,15E+06 2,16E+06 3% 4% 59% 64%
St2 05-mai 12h 7,26E+05 6,01E+05 6,56E+06 4,89E+06 11% 12% 66% 67%
St2 06-mai 5h 1,54E+05 1,45E+05 1,98E+06 1,65E+06 8% 9% 62% 62%
St2 06-mai 12h 3,18E+04 3,02E+04 3,82E+06 3,41E+06 1% 1% 67% 66%
moyenne 1,89E+05 1,32E+05 8,31E+06 6,57E+06 4% 4% 64% 65%
max 7,26E+05 6,01E+05 2,58E+07 2,16E+07 16% 18% 86% 76%
min 5,25E+03 8,50E+03 1,98E+06 1,18E+06 0% 0% 23% 58%
écart-type 1,96E+05 1,69E+05 6,49E+06 5,89E+06 4% 5% 11% 4%

À part quelques exceptions, les facteurs d’enrichissement observées dans la

microcouche de surface sont plus grands que 1 et atteignent 40,82 pour les bactéries
cultivables et 9,13 pour les bactéries totales (tableaux 16 et 17). L’enrichissement de la
microcouche présente une forte variabilité entre les échantillons.

Tableau 16 - Facteurs d'enrichissement des bactéries cultivables et totales dans la microcouche de

surface en comparaison avec l'eau sous-jacente (0,5m et 5m). Campagne 2003.
Bactéries cultivables Bactéries totales
Site Date
EF (sml x uw) EF (sml x 5m) EF (sml x uw) EF (sml x 5m)
St1 27-mars 14,75 2,99 1,36 2,21
St3 11-mars 2,24 0,38 2,75 1,45
St3 27-mars 4,10 1,56 1,05 1,55
St4 12-mars 0,91 - 0,54 0,53
St4 31-mars 3,44 2,65 1,15 5,47
St5 12-mars - - 0,83 2,35
St5 31-mars 33,33 37,25 1,00 1,93
St6 13-mars 1,06 18,91 1,21 9,13
St7 13-mars 1,27 40,83 0,98 6,57
St2 24-mars 5h 1,55 1,13 1,15 1,94
St2 24-mars 12h 6,24 2,57 0,95 2,14
St2 25-mars 5h 1,48 10,87 1,33 2,88
St2 25-mars 12h 12,45 12,22 1,04 1,69
St2 26-mars 5h 1,76 3,21 1,50 1,43
St2 26-mars 12h 0,51 26,57 0,42 1,00

62
 Tableau 17 - Facteurs d'enrichissement des bactéries cultivables et totales dans la microcouche de
surface en comparaison avec l'eau sous-jacente (0,5m). Campagne 2004.

Site Date Bactéries cultivables Bactéries totales

St1 31-mars 3,20 1,51
St3 11-mars 1,10 3,89
St4 29-mars 6,40 1,07
St5 29-mars 1,34 1,20
St6 30-mars 13,83 1,14
St7 30-mars 0,31 1,16
St1 04-mai 6h 0,62 2,50
St2 04-mai 6h 0,70 0,96
St2 04-mai 12h 1,82 1,39
St2 05-mai 6h 1,23 1,61
St2 05-mai 12h 1,21 1,34
St2 06-mai 6h 1,14 1,23
St2 06-mai 12h 1,05 1,12

La distribution normale des données est vérifiée par le test de Ryan-Joiner

(Shapiro & Wilk, 1965). Les densités bactériennes (totales et cultivables) ne présentent
pas une distribution normale. Une transformation logarithmique des concentrations des
bactéries totales et cultivables est réalisée pour la normalisation de la distribution des
données (figure 9).

test normalité BC03 test normalité BC03

Normal Normal
99 99
Mean 139642 Mean 4,714
StDev 292178 StDev 0,5791
95 N 39 95 N 39
RJ 0,656 RJ 0,986
90 90
P-Value <0,010 P-Value >0,100

80 80

70 70
Percent
Percent

60 60
50 50
40 40
30 30

20 20

10 10

5 5

1 1
-500000 0 500000 1000000 1500000 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5
BC03 BC03 LOG

Figure 9 - Distribution des données (bactéries cultivables de l'année 2003) avant et après
transformation logarithmique. Analysé par le test Ryan-Joiner, l'hypothèse nulle (la distribution
est normale) est rejetée à partir d'une valeur de p inférieure à 0,05.

Les variations des bactéries totales et cultivables dans l’espace (SML x UW et

entrée x fond) et dans les temps (5h et 12h) sont analysées par le test t (Student, 1908)
(tableaux 18 et 19). Les différences sont considérées comme significatives quand les
probabilités sont inférieures à 0,05 (niveau de confiance 95%).

63
 Dans l’année 2003, les échantillons prélevés dans la microcouche (SML) sont
significativement différents de ceux de l’eau sous jacente (UW et 5m) pour les bactéries
cultivables et les bactéries totales (SMLx5m). La campagne de 2004 présent une
différence significative pour les bactéries totales de la microcouche de surface et l’eau
sous-jacente. Par contre en 2004, les différences entre les concentrations des bactéries
cultivables dans la SML et dans l’UW ne sont pas significatives (tableau 18).

L’échantillonnage à 5h et à midi présente des résultats significativement

différents dans les deux campagnes par rapport aux bactéries totales (tableau 18)

Tableau 18 - Analyse des variations des bactéries totales et cultivables en fonction de la profondeur
(SML, UW et 5m) et de l'heure d'échantillonnage (5h et 12h) par le test t (Student). Campagnes de
prélèvement de 2003 et 2004. t = valeur du test t ; p= probabilité; n=nombre d'observations ; * p < 0,05 ;
** p < 0,01.
Campagne 2003 Campagne 2004
Bactéries cultivables Bactéries totales Bactéries cultivables Bactéries totales
SML x UW SML x 5m 5h x 12h SML x UW SML x 5m 5h x 12h SML x UW 5h x 12h SML x UW 5h x 12h
t 3,85* 4,04* 0,29 0,5 4,14** 2,27 2,04 0,3 4,43** 10,37**
p 0,002 0,002 0,776 0,627 0,001 0,053 0,053 0,766 < 0,001 < 0,001
n 26 26 18 30 30 18 46 28 46 28

On observe une différence très significative (p < 0,001) entre les stations situées
à l’entrée et au fond de la baie par rapport aux concentrations du bacterioplancton total
(tableau 18). Quant aux bactéries cultivables, les différences entre l’entrée et le fond ne
sont pas significatives (tableau 19).

Tableau 19 - Analyse des variations des bactéries totales et cultivables en fonction de la localisation
des sites d’échantillonnage (entrée = St1, St2 et St3 x fond = St4, St5, St6 et St7) par le test t
(Student). Campagnes de prélèvement de 2003 et 2004. t = valeur du test t; p= probabilité; n=nombre
d'observations; * p < 0,05 ; ** p < 0,01.
Campagne 2003 Campagne 2004
Bactéries cultivables Bactéries totales Bactéries cultivables Bactéries totales
t 1,31 6,12** 0,27 5,86**
p 0,207 < 0,001 0,7879 < 0,001
n 9 (entrée) et 12 (fond) 9 (entrée) et 12 (fond) 6 (entrée) et 8 (fond) 6 (entrée) et 8 (fond)

64
 Dans le but de vérifier les corrélations entre les données chimiques et
microbiennes, une analyse par régression linéaire est réalisée entre les concentrations
des bactéries totales et cultivables et les données des hydrocarbures non aromatiques
analysés par chromatographie en phase gazeuse (tableau 20). Les bactéries cultivables
ne présentent aucune corrélation significative avec le restant des données. Les bactéries
totales présentent une corrélation significative avec le n-alcane C17. Le n-C17 présente
encore des corrélations significatives avec le n-C15, le pristane et les hydrocarbures
légers (LMW).

Tableau 30 - Regressions linéaires entre les densités des bactéries totales et les hydrocarbures non
aromatiques, R2 (valeur de p). Ne sont pas répresentés ci-dessous que les regressions avec R2 > 50%
et une valeur de p < 0,01.
BT n-C15 n-C17 Pristane n-C18 Phytane n-C27 n-C29 LMW HMW UCM Total
BT 1 0,41 (0,025) 0,51 (0,009) 0,48 (0,013) 0,52 (0,008)
n-C15 0,41 (0,025) 1 0,70 (0,001) 0,97 (0,001 0,47 (0,0134) 0,34 (0,045) 0,73 (0,001) 0,41 (0,026)
n-C17 0,51 (0,009) 0,70 (0,001) 1 0,78 (0,001) 0,99 (0,001)
Pristane 0,48 (0,013) 0,97 (0,001) 0,78 (0,001) 1 0,38 (0,031) 0,81 (0,001)
n-C18 0,47 (0,0134) 0,38 (0,031) 1 0,84 (0,001) 0,61 (0,003) 0,54 (0,007)
Phytane 0,34 (0,045) 0,84 (0,001) 1 0,37 (0,037) 0,46 (0,015)
n-C27 1 0,95 (0,001) 0,86 (0,001) 0,36 (0,040) 0,62 (0,002)
n-C29 0,95 (0,001) 1 0,85 (0,001) 0,39 (0,030) 0,54 (0,007)
LMW 0,52 (0,008) 0,73 (0,001) 0,99 (0,001) 0,81 (0,001) 1
HMW 0,61 (0,003) 0,37 (0,037) 0,86 (0,001) 0,85 (0,001) 1 0,41 (0,024) 0,44 (0,017)
UCM 0,41 (0,026) 0,54 (0,007) 0,46 (0,015) 0,36 (0,040) 0,39 (0,030) 0,41 (0,024) 1
Total 0,62 (0,002) 0,54 (0,007) 0,44 (0,017) 1

IV.2.2 Identification des bactéries

Les bactéries cultivables ne correspondent qu’à une minorité du baterioplancton

total et pourtant l’isolement des souches cultivables reste fondamental pour les études
sur la physiologie et l’écologie des bactéries.

L’analyse RFLP a discriminé 43 ribotypes différents à partir des 58 souches

bactériennes isolées dans cette étude. Les résultats du séquençage de chaque ribotype
sont présentés dans le tableau 21.

Les séquences de l’ADNr 16S des souches isolées sont comparées à celles
présentes au GenBank, à l’aide du programme BLAST. Les souches isolées présentant
des similarités aux souches types supérieures ou égales à 97% sont considérées comme
représentatives de la même espèce. Les similarités entre 97% et 93% représentent les
différentes espèces d’un même genre et les similarités inférieures à 93% sont
considérées comme des différences en-dessous du genre (Hagström et al., 2000).

Sur le total des 43 souches séquencées, la plupart (33) présentent des similarités
par rapport aux souches du GenBank supérieures ou égales à 97% (tableau 21). Huit

65
souches sont d’espèces différentes, mais du même genre que les souches actuellement
connues et 2 souches sont probablement de nouveaux genres. Les souches isolées sont
comparées encore avec les séquences de clones non cultivées présentes au GenBank
(tableau 22).

Certaines souches présentent une similarité plus importante avec les clones non
cultivées que avec les souches types. Trois clones proviennent d’environnements
contaminés par du pétrole (tableau 22).

Tableau 21 – Résultats du séquençage des souches bactériennes isolées de la Baie de Guanabara.

Souche Groupe Souche Type Similarité à la souche type Identité Pigment
LuP1 FLGC Bacillus vietnamensis 98% 851/862 +
LuP2 CFB Lewinella cohaerens 92% 310/336 +
LuP3 Actinobacteria Arthrobacter monumenti 95% 809/849 -
LuP4 CFB Winogradskyella poriferia 99% 796/800 +
LuP5 GAMMA Pseudoalteromonas tetraodonis 97% 786/803 +
LuP6 GAMMA Providencia rettgeri 99% 778/785 -
LuP7 GAMMA Vibrio harveyi 98% 719/731 -
LuP8 GAMMA Alteromonas macleodii 99% 695/699 -
LuP9 FLGC Staphylococcus aureus 99% 856/857 +
LuP10 GAMMA Pseudoalteromonas ganghwensis 98% 696/704 -
LuP11 ALPHA Citricella thiooxidans 98% 784/797 +
LuP12 GAMMA Pseudomonas aeruginosa 99% 820/821 +
LuP13 GAMMA Alteromonas macleodii 98% 777/796 -
LuP14 CFB Hongiella marincola 99% 666/672 +
LuP15 GAMMA Pseudomonas pachastrellae 98% 714/722 -
LuP16 GAMMA Pseudoidiomarina taiwanensis 99% 800/849 -
LuP17 ALPHA Thioclava pacifica 95% 708/739 -
LuP18 ALPHA Erythrobacter aquimaris 97% 786/803 -
LuP19 ALPHA Ruegeria aff. gelatinovorans 97% 787/804 +
LuP20 GAMMA Plesiomonas shigelloides 91% 658/722 +
LuP21 GAMMA Alteromonas macleodii 98% 838/848 -
LuP22 FLGC Bacillus thuringiensis 100% 866/866 -
LuP23 GAMMA Pseudoalteromonas tetraodonis 98% 786/802 +
LuP24 CFB Olleya marilimosa 94% 605/649 +
LuP25 FLGC Halobacillus trueperi 99% 892/898 +
LuP26 ALPHA Rhodobacter veldkampii 97% 794/815 +
LuP27 ALPHA Erythrobacter citreus 99% 798/802 +
LuP28 FLGC Bacillus pumilus 99% 755/756 -
LuP29 ALPHA Rhodobacter massiliensis 97% 790/810 +
LuP30 GAMMA Photobacterium leiognathi 100% 892/892 -
LuP31 GAMMA Pseudomonas oleovorans 99% 848/855 +
LuP32 FLGC Bacillus megaterium 100% 877/877 +
LuP33 ALPHA Phycococcus omphalius 95% 789/823 +
LuP34 ALPHA Ruegeria aff. gelatinovorans 98% 801/815 -
LuP35 Actinobacteria Microbacterium schleiferi 98% 683/695 +
LuP36 ALPHA Roseobacter gallaciensis 96% 764/795 +
LuP37 FLGC Bacillus subtilis 96% 849/881 -
LuP38 ALPHA Rhodobacter massiliensis 97% 810/831 +
LuP39 CFB Winogradskyella poriferia 96% 788/817 +
LuP40 ALPHA Rhodobacter massiliensis 97% 758/777 +
LuP41 CFB Psychroserpens mesophilus 96% 648/670 +
LuP42 FLGC Bacillus licheniformis 99% 866/867 -
LuP43 Actinobacteria Micrococcus luteus 99% 841/846 +

66
 Tableau 22 – Résultats du séquençage des souches bactériennes isolées de la Baie de Guanabara.
Similarité aux séquences de clones du GenBank.
Souche Clone plus proche code d'acess Similarité Identité Origine du clone

LuP1 Bacillus sp BWDY-7 DQ314535 98% 856/869 estuaire du fleuve jaune

LuP2 Uncultured bacterium clone E2aCO8 DQ103646 94% 586/610 biofilm microbien

LuP3 Uncultured bacterum clone KUF2 AY739684 98% 809/849 sol tropical contaminé par du pétrole

LuP4 Uncultured bacterium clone RS DQ117431 97% 840/864 corail

LuP5 Uncultured gamma proteobacterium IB300-1 AB197184 99% 780/781 source hydrothermale

LuP6 Providencia sp UTDM314 AY870456 99% 809/813 déchets industriels

LuP7 Uncultured bacterium clone PDC-OTU2 AY700621 98% 719/731 Grand barrière de corail, Australie

LuP8 Uncultured pseudoalteromonas JL-ETNP-F14 AY727023 99% 695/699 Océan Pacifique, picoplancton

LuP9 Uncultured Staphylococcus sp MT01A-G05 DQ169307 99% 857/857 humaine

LuP10 Pseudoalteromonas sp 01/121 AY874345 99% 794/795 mortalité d'huîtres

LuP11 Hydrothermal vent strain AG33 AF254108 98% 794/808 source hydrothermale

LuP12 Pseudomonas aeruginosa X13 AY631241 99% 820/821 ?

LuP13 Uncultured proteobacterium 270 AJ310692 97% 791/808 saumon

LuP14 Hongiella sp AY612772 94% 808/852 microcouche de surface

LuP15 Uncultured bacterum clone W26 AY770966 99% 807/809 gisement de pétrole

LuP16 Uncultured gamma proteobacterium GWS-BW-H33M AY515442 96% 822/856 Mer de Wadden

LuP17 Uncultured marine eubacterium HstpL2 AB017796 94% 749/790 zostère marine Halophila stipulacea

LuP18 Uncultured alpha proteobacterium 4%N-26d-5 AF432337 99% 787/792 plage contaminé par du pétrole

LuP19 Filamentous photosynthetic bacterium F190-32 AB046591 99% 796/803 cultive de Chattonella marina

LuP20 Gamma proteobacterium MF9 AF509477 97% 742/762 lacs d'haute altitude
eau marine, film de polymère produit
LuP21 Alteromonas sp SHY1-1 AB078014 99% 845/850
par bactérie
LuP22 Bacillus sp TB3-10-I AY599744 100% 866/866 fungal ascocarp

LuP23 Pseudoalteromonas sp 03/034 AJ874351 99% 805/807 mortalité d'huîtres

LuP24 Mucus bacterium 117 AY654753 93% 785/838 Oculina patagonica

LuP25 Halobacillus sp NT N168 AB167053 99% 880/883 sédiment de l'océan profond

LuP26 Rhodobacter sp AP-10 AB079681 98% 792/801 ?

LuP27 Paracoccus sp 88/2-4 AJ313424 99% 798/802 particules de l'océan Antarctique

LuP28 Bacillus sp GSP46 AY505514 99% 755/756 grand plaines de l'Oklahoma

LuP29 Uncultured alpha clone AKIW1037 DQ336987 97% 795/816 eau, Kalahari Shield

LuP30 Photobacterium sp YS27-3 AB095447 99% 866/870 mortalité de poissons

LuP31 Uncultured alpha clone AKIW1037 DQ129302 99% 866/873 aérosol urbain, Texas

LuP32 Bacillus sp R3 AY939830 100% 866/873 ?

LuP33 Bacterium K2-53B AY345413 99% 823/829 eau, archipel de Hawaï

LuP31 Uncultured bacterium clone AKIW103 DQ129302 99% 866/873 aérosol urbain, Texas
sol urbain, ultramicrobactérie aérobic
LuP35 Gram-positive bacterium 13-2 AB008512 98% 687/695
copiotrophique
LuP36 Rhodobacteriacea bacterium #63 AB180391 99% 801/801 environnements côtiers

LuP37 Bacillus sp A7(2006) DQ343614 96% 847/881 sol

LuP38 Rhodobacter sp AP-10 AB079681 98% 807/817 ?

LuP39 Uncultured bacteroidetes bacterium GCDEO8-K AY701469 95% 767/802 dinoflagellé Gymnodinium catenatum

LuP40 Rhodobacter sp AP-10 AB079681 98% 762/770 ?

LuP41 Uncultured Psychroserpens sp CFB1A AY494673 99% 671/677 saumon

LuP42 Bacillus sp MO11 AY553104 99% 865/867 grand plaines de l'Oklahoma

estuaire du Changjiang, bactérie avec
LuP43 Micrococcus sp JL-76 AY745846 99% 842/846
caroténoïde

67
 Les bactéries prélevées dans la Baie de Guanabara appartiennent à différents
groupes taxonomiques : les α-Proteobactéries, les γ-Proteobactéries, les CFB
(Cytophaga / Flavobacterium / Bacteroides), les FLGC (firmicutes avec faibles
contenus en C+G) et les Actinobactéries (tableau 21). Les proteobactéries correspondent
à la plupart des souches isolées et identifiées (figure 10).

P42 Bacillus licheniformis 99%

P28 Bacillus pumilus 99%
P37 Bacillus subtilis 96%
0.02 P22 Bacillus thuringiensis 100%
P1 Bacillus vietnamensis 98%
FLGC P32 Bacillus megaterium 100%
P9 Staphylococcus aureus 97%
P25 Halobacillus trueperi 99%

Actinobacteria P43 Micrococcus luteus 99%

P3 Arthrobacter monumenti 95%
P35 Microbacterium schleiferi 98%
P31 Pseudomonas oleovorans 99%
P15 Pseudomonas pachastrellae 98%
P12 Pseudomonas aeruginosa 99%
GAMMA P30 Photobacterium leiognathi 100%
P7 Vibrio harveyi 98%
P23 Pseudoalteromonas haloplanktis 98%
P5 Pseudoalteromonas haloplanktis 97%
P10 Pseudoalteromonas ganghwensis 98%
P6 Providencia rettgeri 99%
P20 Plesiomonas shigelloides 91%
P21 Alteromonas macleodii 98%
P8 Alteromonas macleodii 99%
P13 Alteromonas macleodii 96%
P16 Pseudoidiomarina taiwanensis 99%
P27 Erythrobacter citreus 99%
P18 Erythrobacter aquimaris 97%
P36 Phaeobacter inhibens 96%
P33 Phycococcus omphalius 95%
P34 Ruegeria aff. gelatinovorans 98%
P19 Ruegeria aff. gelatinovorans 97%
ALPHA P11 Citricella thiooxidans 98%
P17 Thioclava pacifica 95%
P29 Rhodobacter massiliensis 97%
P40 Rhodobacter massiliensis 97%
P38 Rhodobacter massiliensis 97%
P26 Rhodobacter veldkampii 97%
P41 Psychroserpens mesophilus 96%
P24 Olleya marilimosa 94%
CFB P39 Winogradskyella poriferia 96%
P4 Winogradskyella poriferia 99%
P2 Lewinella cohaerens 92%
P14 Hongiella marincola 99%

Figure 10 - Arbre phylogénétique construit à partir des séquences partiels de l'ADNr 16S des
souches isolées dans la Baie de Guanabara (Brésil).

68
IV.2.3 Résistance aux radiations solaires

La plupart des souches bactériennes isolées dans la Baie de Guanabara

présentent une forte résistance aux radiations émises par le simulateur solaire (tableau
24).

La classification des souches en fonction de leur résistance aux radiations

solaires utilisée dans cette étude est définie par Agogué et collaborateurs (2005b)
(tableau 23).

Tableau 23 – Classes de résistance des souches bactériennes aux rayons solaires.

(Agogué et al., 2005b)
Classe de résistance
sensible (S)
faiblement résistante (R)
moyennement résistante (R+)
très résistante (R++)
(+) croissance et (-) pas de croissance
Temps d´exposition
30 minutes 1 heure 3 heures 5 heures 7 heures
- - - - -
+ + - - -
+ + + - -
+ + + + +

Les souches très résistantes (R++) sont classés également selon leur type de
croissance aprés l´exposition aux radiations solaires : croissance similaire au contrôle
(R++a) et croissance avec une phase lag prolongée (R++b) (figure 11).

Résistance faible ( R ) Résistance moyenne ( R+ )

Bacillus licheniformis Thioclava pacifica
1,2 1
densité optique

densité optique

1 contrôle
0,8
0,8 1 heure
0,6
0,6 3 heures
0,4 0,4
5 heures
0,2 0,2
7 heures
0 0
0

15
25

35

45

55

65

75

85

95

105

115

125

135
145

165

200

temps (heures) temps (heures)

Résistance élevée ( R++ a ) Résistance élevée ( R++ b )

Alteromonas macleodii Phycococcus omphalius

1,2 1
densité optique
densité optique

1 0,8
0,8 0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0
0
0

15

25

35

45

55

65

75

85

95

105

115

125

135

145

165

200
0

10

25

40

55

70

85

100

115

130

160

temps (heures)
temps (heures)

Figure 11 - Courbes de croissance des souches résistantes après leur exposition au simulateur
solaire.

69
Tableau 24 - Temps maximum de résistance des souches bactériennes testées au simulateur solaire

Groupe Souche type % MAX Classe Pigment

FLGC Bacillus subtilis 96% 1h R -

Actinobacteria Arthrobacter monumenti 95% 3h R+ -
FLGC Bacillus thuringiensis 100% 3h R+ -
GAMMA Providencia rettgeri 99% 3h R+ -
ALPHA Ruegeria aff. gelatinovorans 97% 3h R+ -
ALPHA Thioclava pacifica 95% 3h R+ -
GAMMA Pseudoidiomarina taiwanensis 99% 5h R++ b -
GAMMA Alteromonas macleodii 98% 7h R++ a -
FLGC Bacillus pumilus 99% 7h R++ a -
ALPHA Erythrobacter aquimaris 97% 7h R++ b -
GAMMA Photobacterium leiognathi 100% 7h R++ a -
GAMMA Pseudoalteromonas ganghwensis 98% 7h R++ a -
GAMMA Pseudomonas pachastrellae 98% 7h R++ b -
GAMMA Vibrio harveyi 98% 7h R++ a -
CFB Olleya marilimosa 94% 10' S +

Actinobacteria Micrococcus luteus 99% 1h R +

FLGC Bacillus licheniformis 99% 1h R +

FLGC Bacillus vietnamensis 98% 3h R+ +

CFB Lewinella cohaerens 92% 3h R+ +

GAMMA Pseudoalteromonas tetraodonis 98% 3h R+ +

GAMMA Pseudomonas aeruginosa 99% 3h R+ +

ALPHA Rhodobacter veldkampii 97% 3h R+ +

FLGC Bacillus megaterium 100% 5h R++ a +

ALPHA Phycococcus omphalius 95% 5h R++ b +

CFB Winogradskyella poriferia 99% 5h R++ b +

ALPHA Citricella thiooxidans 98% 7h R++ b +

ALPHA Erythrobacter citreus 99% 7h R++ b +

FLGC Halobacillus trueperi 99% 7h R++ a +

CFB Hongiella marincola 99% 7h R++ a +

Actinobacteria Microbacterium schleiferi 98% 7h R++ a +

GAMMA Pseudomonas oleovorans 99% 7h R++ b +

GAMMA Plesiomonas shigelloides 91% 7h R++ b +

ALPHA Rhodobacter massiliensis 97% 7h R++ b +

ALPHA Roseobacter gallaciensis 96% 7h R++ b +

FLGC Staphylococcus aureus 97% 7h R++ b +

70
 D´aprés la classification utilisée par Agogué et collaborateurs (2005b) (tableau
23), seulement 1 souche isolée dans la Baie de Guanabara est considerée sensible (S)
aux radiations solaires (tableau 24). La grand majorité des souches (59%) est trés
résistante (R++) (figure 12) ; 29% des souches présentent une résistance moyenne (R+) et
9% des bactéries sont faiblement résistantes (R).

Résistance des souches bactériennes au

simulateur solaire
R++
R+
9% 3%
R
S

29%
59%

Figure 12 - Distribution des souches testées par rapport à leur résistance après leur exposition au
simulateur solaire.

Parmi les souches visiblement pigmentées (21) et les souches apparemment non
pigmentées (14), les bactéries trés résistantes aux radiations solaires prédominent
(figure 13). La distribution des classes de résistance dans les groupes de bactéries
pigmentées et non pigmentées est similaire à la distribution observée pour l’ensemble
des souches testées.

Résistance au simulateur solaire Résistance au simulateur solaire

souches pigmentées souches non pigmentées
R++
R+
5% 7% 0%
10%
R
S

24% 36%
61% 57%

Figure 13 - Distribution des souches pigmentées et non pigmentées testées par rapport à leur
résistance après leur exposition au simulateur solaire.

71
IV.2.3 La diversité du bactérioneuston (SSCP)

La structure populationnelle des communautés bactériennes présentes dans la

microcouche de surface et dans l’eau sous jacente est déterminée par la méthode
d’empreinte moléculaire, la technique de SSCP (Single Strand Conformation
Polymorphism). La communauté microbienne est représentée par un profil, où chaque
pic correspond à une séquence et par extension à une « espèce » de microorganisme ou
un OTU (Operational Taxonomic Units) (figures 14 et 15).

L’analyse SSCP est réalisée pour les échantillons de la microcouche et de l’eau

sous-jacente prélevées au midi solaire dans différents sites (figure 14) et prélevées à 5h
et au midi solaire dans le site St2 pendant 3 jours consécutifs (figure 15).

Les profils de SSCP présentent de 3 à 12 pics prédominants (correspondant à

plus de 3% de la surface totale). Les échantillons prélevés au midi solaire exhibent un
nombre plus important de pics dans la microcouche de surface par arpport à l’eau de
surface (tableaux 25 et 26, figures 14 et 15).

Tableau 25- Nombre des pics prédominants (≥ 3% de la surface totale) dans les profils de SSCP
St1 St3 St4 St5 St6 St7
SML SML UW SML UW SML UW SML UW UW
nombre de pics 11 11 11 10 5 8 5 11 6 12

Au contraire pour les échantillons prélevés au midi solaire, les profils SSCP des
prélèvements réalisés à 5 heures du matin présentent un nombre plus important de pics
dans l’eau sous-jacente par rapport à la surface (tableau 26).

Tableau 26 - Nombre des pics prédominants (≥ 3% de la surface totale) dans les profils de SSCP.
J1 = 04 mai 2004 ; J2 = 05 mai 2004 ; J3 = 06 mai 2004.
St2 J1 5h St2 J1 12h St2 J2 5h St2 J2 12h St2 J3 5h St2 J3 12h
SML SML UW SML UW SML UW SML UW SML UW
nombre de pics 6 5 5 3 4 10 10 6 12 11 7

Certains pics sont présents dans presque tous les profils SSCP. Par exemple : les
pics identifiés dans les profils par les signes ♣, ∗ et #.

72
 St1 St3

 ♣ 

♣
SML
♠ # #


UW
♣ #

St4 St5

 ♣
SML
♠ * ♣
♠ #
#

 ♣ 

UW
♠
# ♠

St6 St7
♠

SML ♣


♦ #

♠ ♠

UW 
♣

♦ #


Figure 14 - Profils de SSCP pour la SML et l’UW dans la Baie de Guanabara.

73
 J1 (04 mai 2004)
5H 12H

* *

SML
♣
♣♦ #
♦

UW
♣♦

J2 (05 mai 2004)

* ♦

SML
♦
*
♣

* ♦

UW *
♣ ♣

J3 (06 mai 2004)

# ♣ ♦

♦ *
SML #

♣ *

# ♦ *
♣♦
*
♣
UW
#

Figure 15 - Profils de SSCP du suivi de 3 jours à 5h et à midi pour la SML et l’UW.

74
 On observe une différence de structure des communautés bactériennes de la
microcouche de surface et de l’eau sous-jacente. En général la microcouche présente
des pics que ne sont pas représentés dans l’eau sous-jacente. Par contre ces pics trouvés
dans la microcouche, mais non dans l’eau sous-jacente ne sont pas les mêmes dans les
différents profils. Les exceptions sont le site St3 et les échantillons du 05 mai 2004,
quand les profils de la SML sont très similaires à ceux de l’eau sous-jacente (figures 14
et 15).

La similarité entre le profil obtenu pour le site St1, située en dehors de la baie et
la microcouche de surface du site St5, localisée au fond de la baie est surprenante.

La figure 14 représente la structure des communautés bactériennes obtenue au

cours de 3 jours de prélèvement au site St2. Au midi du premier jour (04 mai 2004) la
microcouche de surface présente des pics qui ne sont pas observés dans la microcouche
prélevée à 5 heures ou dans l’eau sous jacente de 12 heures. Malheureusement il
manque l’échantillon de la microcouche de surface à 5 heures du matin. Le deuxième
jour présente une grande similarité entre les profils de surface et de l’eau sous-jacente.
Le troisième jour exhibe une similarité plus importante entre la microcouche de surface
de 5 heures et l’eau sous-jacente de 12 heures, où quelques pics présents dans les deux
autres profils sont absents.

La surface de chaque pic donne une indication sur la proportion d’une OTU dans
la communauté. Chaque profil est représenté par une matrice avec l’abondance relative
(rapport entre la surface du pic et la somme totale des surfaces) de chaque pic observé.
Les pics minoritaires, correspondant à moins de 3% de la surface totale sont exclus.
Afin de comparer les différents profils, des dendrogrammes sont réalisés par la méthode
UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with arithmetic Averages) à partir du calcul
des distances euclidiennes (figures 16 et 17).

Les clusters réalisés à partir des échantillons prélevés aux différents sites de la
baie distinguent, à part quelques exceptions, deux groupes principaux : un
correspondant aux communautés de la microcouche et un autre aux communautés de
l’eau sous-jacente (figure 16).

75
 70

60

50
Distance

40

30

20

10

St5 SML
St6 SML

St3 SML
St4 SML

St1 UW
St6 UW

St7 UW
St5 UW

St4 UW

St3 UW
ST5_UW ST6_UW ST7_UW ST4_SML ST5_SML

Figure 16 - Dendrogramme construit à partir des distances euclidiennes entre les profils de SSCP.

Le dendrogramme réalisé à partir des échantillons prélevés au site St2 à 5 heures

et au midi solaire au cours de 3 jours présente deux groupes principaux. Un groupe
correspond aux échantillons du premier jour (J1) et aux échantillons de 5 heure du
matin du deuxième jour (J2). L’autre groupe rassemble les échantillons prélevés au midi
solaire du deuxième jour et les échantillons du troisième jour (J3). Au troisième jour, la
similarité apparente entre la microcouche de surface de 5 heures et l’eau sous-jacente de
12 heures, signalée par les pics présents dans ces profils et absents dans les deux autres
profils, n’a pas été confirmée par le dendrogramme (figure 17).

76
 70

60

50

40
Distance

30

20

10

UW 12h J1
SML 12h J2

SML 5h J1
UW 5h J3

SML 12h J1
SML 5h J3

UW 12h J2

UW 5h J2
UW 12h J3

SML 5h J2
SML 12h J3

Figure 17 - Dendrogramme construit à partir des distances euclidiennes entre les profils de SSCP.

77
Chapitre V

Discussion

78
V.1 Les hydrocarbures dans la microcouche de surface

Les hydrocarbures aliphatiques sont très concentrés à la surface des eaux de la

Baie de Guanabara. Les concentrations des n-alcanes (tableau 9) sont similaires à celles
observées dans la microcouche de surface d’autres environnements pollués, comme
Pudget Sound (2057 µg.L-1 ; Hardy et al., 1987b) et Leghorn, mer Thyrénienne, (3674
µg.L-1 ;Cincinelli et al., 2001). À l’exception du site 4, où les concentrations sont
beaucoup plus élevées et atteignent 11927µg.l-1. L’origine des hydrocarbures est
indiquée par les marqueurs chimiques.

La dominance des hydrocarbures à chaîne impaire dans la gamme des n-alcanes

à faibles poids moléculaires (n-C15 à n-C20) et la forte concentration du n-C15 et du n-
C17 indiquent une production biogénique d’hydrocarbures par les bactéries
photosynthétiques et les algues (Blumer et al., 1971 ; Giger et al., 1980 ; Saliot, 1981 ;
Cranwell et al., 1987). Ceci peut être mis en relation avec la présence d’une forte
proportion de bactéries actives (HNA) dans la microcouche de surface.

Un important apport continental est indiqué par la forte abondance des n-alcanes
de haut poids moléculaire centrés sur le n-C29. Les n-alcanes n-C27, n-C29, n-C31 et n-
C33 reflètent la contribution de végétaux supérieurs terrestres (Eglinton & Hamilton,
1963 ; Lipiatou & Albaiges, 1994 ; Bouloubassi et al., 1997), ce qui est cohérent avec la
présence d’apports importants venant du continent.

Ces résultats sont similaires à ceux observés par Ehrardt et Petrick (1993) et
Dachs et collaborateurs (1999) en Méditerranée.

L’enveloppe non résolue est un mélange complexe d’hydrocarbures alicycliques

(Gough & Rowland, 1990) et est un indicateur des résidus pétroliers (Farrington &
Quinn, 1973; Farrington, 1980 ; Brassell & Eglinton, 1980 ; Venkatesan & Kaplan,
1982 ; Laureillard et al., 1997). La forte majorité des composés non résolus (UCM)
dans la fraction aliphatique indique une contamination pétrolière chronique dans la Baie
de Guanabara, ce qui est cohérent avec le contexte pétrolier local.

Malgré la grande concentration des n-alcanes impairs d’origine végétale, les n-

alcanes lourds (n-C21 à n-C37) présentent un CPI proche de 1, une signature
d’hydrocarbures pétrogéniques (Colombo et al., 1989). Cette valeur de CPI,
caractéristique des sources anthropiques, confirme la contamination par le pétrole dans
la Baie de Guanabara.

79
 Les fortes concentrations d’hydrocarbures pétroliers dans un environnement
productif comme la Baie de Guanabara (Gonzalez et al., 2000 ; Andrade et al., 2003)
méritent une attention spéciale. Les blooms phytoplanctoniques jouent un rôle
fondamental dans la bioaccumulation des hydrocarbures petrogéniques et dans leur
transport vers la colonne d’eau (Dachs et al., 1997). Les cellules phytoplanctoniques
adsorbent les hydrocarbures, qui sont accumulés à travers de la chaîne alimentaire. La
chute de cellules planctoniques et les pelotes fécales transfèrent les hydrocarbures de la
surface vers le fond et le sédiment.

L’analyse des marqueurs chimiques permet donc de distinguer différentes

origines dans les hydrocarbures de la baie. La contribution aux hydrocarbures par les
algues et bactéries est en accord avec les productions primaire et bactérienne élevées
(Sevrin-Reyssac et al., 1979 ; Rebello et al., 1988 ; Paranhos et al., 2001), les fortes
teneurs en chlorophylle a (Barreto, 1992 ; Valentin et al., 1999) et les importantes
densités de phytoplancton (Villac, 1990 ; Valentin et al., 1999) et de bactérioplancton
(Andrade et al., 2003). Les hydrocarbures originaires des végétaux terrestres arrivent à
la baie grâce à la forte contribution d’eau douce par les 35 fleuves du bassin versant et
par le ruissellement qui résulte des précipitations abondantes, surtout en été (1100-2100
mm.an-1, dont 300-350mm en janvier, Amador, 1997). Les hydrocarbures pétroliers sont
le résultat des apports urbains qui arrivent par ruissellement, par la navigation, les
activités portuaires, les fleuves pollués par les industries et les accidents.

La microcouche de surface est enrichie en hydrocarbures non aromatiques,

surtout les composés à haut poids moléculaire (HMW). L’évaporation des composés
légers à la surface peut être la cause des faibles facteurs d’enrichissement observés pour
les n-alcanes de faible poids moléculaire (LMW).

Dans les environnements contaminés par le pétrole et/ou des produits pétroliers,
la microcouche de surface peut être 1000 fois plus concentrée en hydrocarbures par
rapport à l’eau sous-jacente, aboutissant à la formation d’un film visible. Dans la Baie
de Guanabara le film de surface est visible la plupart du temps, mais les facteurs
d’enrichissement des hydrocarbures non aromatiques varient de 0,96 à 3,86 et sont
similaires aux valeurs observées dans des eaux côtières et océaniques (Marty et al.,
1979; Boehm, 1980; Ho et al., 1982 ; Cincinelli et al., 2001).

80
V.2 Le bactérioneuston

Les bactéries totales présentent une corrélation significative avec le n-alcane n-

C17, confirmant l’origine microbienne de cet hydrocarbure.

La microcouche de surface de la Baie de Guanabara présente d’importantes

densités de bactéries totales. Les concentrations du bactérioplancton total à l’entrée de
la baie (SML = 3,94 x 106 et UW = 2,93 x 106) sont comparables aux résultats obtenus
dans la même région de la baie au cours d’une étude précédente (Andrade et al., 2003 –
UW = 1,10 x 106) et à Barcelone (Agogué et al., 2005a – SML = 1,43 x 106 et UW =
1,30 x 106). Les sites d’échantillonnage situés au fond de la baie présentent des
concentrations plus importantes (SML = 2,07 x 107 et UW = 2,08 x 107) qui pourraient
s’expliquer par une concentration plus faible en prédateurs en raison de la toxicité du
film de surface.

Les analyses du bactérioplancton par cytométrie en flux permettent la

discrimination entre les cellules à haut contenu en acides nucléiques (HNA) et les
cellules à faible contenu (LNA) (Li et al., 1995 ; Gasol et al., 1999 ; Lebaron et al.,
2001). Ces deux groupes de cellules sont fréquemment observés dans les ecosystéms
aquatiques (Li et al., 1995 ; Marie et al., 1997 ; Gasol et al., 1999 ; Lebaron et al.,
2001 ; Andrade et al., 2003) et présentent des différences sur la plan physiologique. De
nombreuses études ont mis en évidence que les cellules HNA sont plus actives que les
cellules LNA (Li et al., 1995 ; Jellett et al., 1996 ; Lebaron et al., 2001 ; Gregori et al.,
2001). Gasol et collaborateurs (1999) ont proposé l´utilisation de la fraction des cellules
HNA comme un indicateur du pourcentage des bactéries actives dans le
bacterioplancton.

Dans la Baie de Guanabara les cellules HNA correspondent à 60-90% du

bacterioplancton total analysé par cytométrie en flux (tableaux 14 et 15). Les cellules
actives représentent donc une fraction importante du bactérioplancton. Ces résultats sont
similaires à ceux observés antérieurement dans la Baie de Guanabara (Andrade et al.,
2003) et dans d’autres environnements (Li et al., 1995 ; Jellett et al., 1996).

81
 Le grand pourcentage de bactéries actives à la surface de la baie indiqué par la
fraction majoritaire des cellules HNA est en accord avec l´importante activité
bactérienne observée précédemment dans la Baie de Guanabara (Paranhos et al., 2001).

La culturabilité d’une cellule bactérienne dépend de sa viabilité (Deming &

Baross, 2000), mais surtout de sa capacité de se reproduire en milieu de culture riche en
carbone organique complexe (Button et al., 1993 ; Button et al., 1998 ; Connon &
Giovannoni, 2002). La fraction cultivable des bactéries marines océaniques est
inférieure à 1% (Jannasch & Jones, 1959 ; Olsen & Bakken, 1987 ; Amman et al.,
1995). Cependant la fraction cultivable du bactérioplancton des environnements
eutrophes est plus importante et peut atteindre 15% (Amman et al., 1995), parce que ces
cellules sont mieux adaptées à des fortes concentrations en nutriments.

Dans la Baie de Guanabara la fraction de bactéries cultivables de la microcouche

de surface est d’environ 3% en 2003 et 4 % en 2004. En 2004, la microcouche et l’eau
sous-jacente présentent des pourcentages de bactéries cultivables semblables. Par contre
en 2003 la microcouche présente une fraction cultivable (3%) plus importante que celle
des eaux sous-jacentes (1%). Les facteurs d’enrichissement peuvent atteindre des
valeurs de 33,3. Des facteurs d’enrichissement similaires sont présentés dans d’autres
études (Tsyban, 1971 ; Agogué et al., 2004). Cette forte culturabilité du bactérioneuston
par rapport à l’eau sous-jacente a également été observée en Méditerranée (Agogué et
al., 2005a). La concentration des nutriments dans la microcouche (Goering & Menzel,
1965 ; Williams, 1967) peut stimuler l’adaptation des bactéries aux conditions de
culture mais il est possible que cet enrichissement de la microcouche de surface en
bactéries cultivables (donc viables) soit lié à leur polarisation (membranaire par gradient
de protons) et à leur attachement électrostatique aux particules qui s’accumulent à la
surface de l’eau de mer. Ceci permettrait d’expliquer le fort pourcentage en bactéries
HNA et en bactéries cultivables.

Selon des études précédentes, le bactérioplancton total est 100 à 1000 fois plus
abondant dans la microcouche que dans l’eau sous-jacente (MacIntyre, 1974; Dahlbach
et al., 1982 ; Hardy, 1982). Cependant dans la Baie de Guanabara l’enrichissement des
bactéries totales est faible, environ 1,4. Ces résultats sont équivalents à ceux observés
en Méditerranée en utilisant le tamis métallique comme échantillonneur et la cytométrie
en flux comme méthode de quantification du bacterioplancton (Agogué et al., 2004 ;

82
Obernosterer et al., 2005). Obernosterer et collaborateurs (2005) ont observé des
concentrations de bactéries attachés à des particules 10 fois plus importantes dans la
microcouche en comparaison à l’eau sous-jacente.

L’enrichissement des microorganismes à la surface présente une forte variabilité

entre les échantillons, peut-être à cause d’une distribution dans l’espace non uniforme
(patches) de la microcouche.

La microcouche de surface est significativement différente de l’eau sous-jacente

par rapport aux bactéries totales et aux hydrocarbures non aromatiques totaux, aux
composés non résolus (UCM), aux composés de haut poids moléculaire (HMW), au
phytane et au n-alcane n -C17 (tableaux 12 et 18).

L’échantillonnage réalisé à 5h et à midi pendant 3 jours consécutifs avait comme

but de vérifier les effets de l’incidence de la lumière solaire et des radiations UV
naturelles. On a observé des densités de bactéries totales significativement différentes à
5h et à midi, dans les deux campagnes de prélèvement (tableau 19).

La Baie de Guanabara présente différentes zones en regard de la qualité de l’eau

(Contador & Paranhos, 1996). L’entrée de la baie est plus influencée par les eaux
océaniques, alors que dans les régions situées au fond de la baie le renouvellement des
eaux est réduit. Cette variation spatiale est retrouvée dans la microcouche de surface.

Les sites d’échantillonnage situés au fond de la baie (St4, St5, St6 et St7)
présentent des concentrations en bactéries et en hydrocarbures plus élevées par rapport
aux sites localisés à l’entrée de la baie (St1, St2 et St3).

L’entrée de la baie est significativement différente du fond par rapport aux

concentrations en bactérioplancton total et en composés organiques comme les n-
alcanes totaux, les composés de faible poids moléculaire (LMW), y inclus le n-C15 et le
n-C17 et le pristane (tableau 13).

83
V.2.2 Identification des souches bactériennes

Cette étude est la première à isoler et à identifier des souches du bactérioneuston

dans la Baie de Guanabara. D’autres études ont révélé un grand nombre d’espèces
bactériennes nouvelles dans la fraction cultivable du bactérioplancton (Pinhassi et al.,
1997 ; Bowman et al., 1997 ; Agogué et al., 2005a). Dans la Baie de Guanabara, des 43
souches bactériennes séquencées la plupart sont des espèces déjà identifiées dans
d’autres environnements. Seulement 8 souches correspondent à de nouvelles espèces et
2 souches sont probablement de nouveaux genres.

Ces résultats suggèrent l’existence de nombreuses espèces cosmopolites. Par

contre, les isolements des souches de la baie ne sont pas exhaustifs. Des espèces
nouvelles et/ou d’autres espèces connues peuvent se trouver dans la fraction des
bactéries cultivables non observées dans cette étude et/ou parmi les bactéries non
cultivables.

Certaines souches sont proches de clones non cultivés mais dont les séquences
ont été déposées dans la banque de référence GenBank. Cela signifie que ces isolats
représentent un intérêt pour la communauté internationale. Parmi ces souches on en
retrouve trois (AF432337 - Roling et al, 2002 ; AY739684 - O’Donnell et al., 2004 non
publié ; AY770966 - She et al., 2004 non publié) qui sont similaires à des clones isolés
à partir d’environnements contaminés par du pétrole. Par ailleurs, ces souches sont
résistantes aux radiations solaires. Il serait intéressant de vérifier leur sensibilité au
pétrole et aux hydrocarbures aromatiques (HAP) car elles peuvent avoir un intérêt sur le
plan biotechnologique.

La présence des souches pathogénes, Pseudomonas aeruginosa et

Staphylococcus aureus, parmi les souches isolées dans la Baie de Guanabara confirme
la contamination des eaux de la baie par des eaux usées non préalablement traitées. La
présence des ces souches pathogénes dans l’eau de mer a été constatée antérieurement
en Méditerranée (Yoshpe-Purer & Golderman, 1987).

Le nombre de coliformes fécaux, fréquemment supérieur aux normes

réglementaires (100/100ml), donne une indication de la possible contamination de l’eau
de la Baie de Guanabara par diverses bactéries pathogénes.

84
 L’espèce Staphylococcus aureus est un bon indicateur de la contamination
anthropique et elle est à la base de beaucoup de contamination nosocomiales (Baird-
Parker, 1974). Pseudomonas aeruginosa est une bactérie ubiquiste car elle se trouve
dans la plupart des environnements (Costerton, 1979). Sa concentration dans les eaux
usées est supérieure à 105 cellules par 100mL (Rhame, 1979). Un grand nombre de
maladies sont attribuées à la contamination des eaux de baignade par Pseudomonas
aeruginosa.

Du fait que la population des villes autour de la Baie de Guanabara utilise les
plages de la baie comme lieu de baignade, de loisir et du fait que les riverains
consomment parfois les poissons ou les coquillages qui y sont péchés ou récoltés, la
présence de bactéries pathogènes dans les eaux de la baie et dans le film de surface
constitue un véritable risque en matière de santé publique.

La plupart des souches isolées dans la Baie de Guanabara appartiennent aux

groupes de Alpha- et Gamma- Proteobactéries. Ce résultat est semblable à celui observé
dans autres études (Hagström et al., 2002 ; Pinhassi et al., 1997 ; Bowman et al., 1997 ;
Agogué et al., 2005a). En général les Gamma-Proteobactéries représentent le groupe
phylogénétique dominant dans les souches cultivables (Hagström et al., 2002).

V.2.3 La résistance des souches bactériennes aux radiations solaires

La forte exposition du bactérioneuston aux radiations solaires motive un

questionnement sur l’existence d’une photoadaptation des souches neustoniques.
Toutefois la profondeur du prélèvement ne semble pas affecter la sensibilité des
bactéries aux radiations solaires (Herndl et al., 1993 ; Arrieta et al., 2000 ; Wangberg et
al., 2001 ; Agogué et al., 2005b).

Dans la Baie de Guanabara la plupart des souches bactériennes testées (62%) ont
montré une forte résistance (R++) aux radiations émises par le simulateur solaire (tableau
21, figure n). Les souches résistantes (R, R+ et R++) équivalent à 97% des souches
testées.

85
 Un grand pourcentage des souches bactériennes résistantes aux rayons solaires
est aussi observé dans d’autres environnements. Dans une étude qui a testé la sensibilité
du bactérioplancton prélevé au Mer du Nord aux radiations UV, seulement 10% des
bactéries a montré une sensibilité aux radiations (Winter et al., 2001). Et même les
souches sensibles ont été présentes dans les horizons de surface pendant l’été. Agogué
et collaborateurs (2005b) ont testé la sensibilité de 90 souches bactériennes, prélevées
dans la microcouche et dans l’eau sous-jacente (0,5m), dans la baie de Banyuls sur mer
et à Barcelone, aux radiations émises par un simulateur solaire (aux mêmes conditions
que la présente étude) et ont observé que seulement 16% des souches sont sensibles aux
radiations solaires.

La sensibilité aux UV et la capacité de réparation des dommages causés par les

rayons solaires varient entre les différentes souches testées, indépendamment du groupe
taxinomique. Cette variation interspécifique est observée dans d’autres études (Joux et
al., 1999; Arrieta et al., 2000 ; Agogué et al., 2005b). L’incidence des radiations UV sur
un écosystème peut donc influencer la composition de la communauté bactérienne
(Bothwell et al., 1993 ; Joux et al., 1999) mais il est toutefois intéressant de noter que la
forte résistance des souches marines leur permet certainement de coloniser la colonne
d’eau, et notamment la zone de mélange, sans que leur activité soit fortement affectée
par le rayonnement solaire.

Les bactéries résistantes aux radiations doivent posséder des mécanismes de

protection et/ou de récupération par rapport aux dommages causés par les radiations
solaires. La pigmentation des bactéries a été suggérée comme une protection des
cellules aux radiations UV (Wu et al., 1983; Maki & Herwig, 1991). Par contre, la
petite taille des cellules bactériennes est considérée comme un facteur limitant la
protection pigmentaire (Garcia-Pitchel, 1994 ; Jeffrey et al., 1996 a et b). Certaines
études ont montré que les bactéries non pigmentées peuvent être à la fois plus
résistantes aux rayons UV que les bactéries pigmentées (Gascón et al., 1995 ; Agogué et
al., 2005b).

Dans notre étude, la pigmentation ne semble pas influencer la résistance des

souches aux radiations solaires. Les classes de résistance des bactéries sensibles à très
résistantes sont également présentes dans les groupes des bactéries pigmentées et non
pigmentées.

86
 D’autres mécanismes possibles de photoprotection sont la production
d’exopolysaccharides (Elasri & Miller, 1999), la conversion des mycosporines
synthétisées par des algues en mycosporine-glycine (Dunlap et al., 1998 ; Shick &
Dunlap, 2002) et l’ADN à haut contenu en guanine et cytosine (G+C) (Singer & Ames,
1970 ; Kellog & Paul, 2002). Dans l’environnement les bactéries peuvent utiliser
l’ombre produit par d’autres cellules ou les particules détritiques ou abiotiques comme
protection, par exemple. L’inhibition du bacterioplancton par les radiations solaires est
plus prononcée quand la communauté phytoplanctonique est exclue (Sommaruga et al.,
1997) en raison d’une réduction de l’effet protectant et/ou de la réduction de la
production d’exopolymères.

La connaissance des mécanismes de protection des bactéries aux rayons UV

reste contradictoire, mais l’importance des mécanismes de récupération de l’ADN est
constaté dans de nombreuses études (Jeffrey et al., 1996 b; Kaiser & Herndl, 1997;
Lyons et al., 1998 ; Pakulski et al., 1998). Il est possible que les bactéries les plus
résistantes soient capables de réparer les dommages à l’ADN en temps réel.

Les souches bactériennes très résistantes aux radiations présentent deux types
généraux de réponses après leur exposition au simulateur solaire. Une partie des
souches (a) présente une croissance similaire au contrôle et une autre partie (b) récupère
sa croissance après une phase lag prolongée.

Les bactéries résistantes du type (a) possèdent des mécanismes de réparation de

l’ADN endommagé très efficaces. La réparation débute probablement pendant
l’exposition aux radiations solaires grâce à la photoréparation enzymatique (PER),
activée par la lumière visible ou les UVA (Friedberg, 1985 ; Miller et al., 1999).

Pendant les périodes d’obscurité, d’autres mécanismes (dark repairs) sont

responsables de la réparation de l’ADN : la réparation par excision de nucléotide
(NER), la réparation inductible ou réparation SOS et la réparation par recombinaison.
Ces mécanismes sont régulés par la protéine RecA (Miller et al., 1999). Dans les
bactéries résistantes du type (b), les mécanismes de réparation à l’obscurité doivent
prédominer dans la réparation de l’ADN. Boelen et collaborateurs (2001) ont démontré
une accumulation des dommages de l’ADN par les rayons UV et une forte réparation
des dommages pendant la nuit par excision de nucléotide (NER).

87
V.2.4 La structure populationnelle des communautés bactériennes

La structure populationnelle du bactérioplancton prélevé au midi solaire présente

un enrichissement d’espèces (pics/OTUs) dans la microcouche de surface (SML) par
rapport à l’eau sous-jacente (UW). Cette différence est constatée sur le dendrogramme
(figure 16), où les échantillons de la microcouche sont regroupés. Une différence
significative entre la SML et la UW est observée à Barcelone (Agogué et al., 2005b).

Les échantillons du site St2 (deuxième jour, le 05 mai 2004) et du site St3
présentent des profils SSCP très similaires en surface et dans l’eau sous-jacente (figures
14 et 15). Ces résultats peuvent indiquer une homogénéisation entre la microcouche de
surface et l’eau sous-jacente. Par contre l’étude des bactéries totales et cultivables,
analysées à partir des mêmes échantillons utilisés par SSCP, démontre un
enrichissement dans la microcouche (tableaux 16 et 17). La similarité entre les profils
SSCP de la SML et de l’UW est observée aussi par Agogué et collaborateurs (2005b) en
Méditerranée.

D'autre part, les pics supplémentaires, présents dans la SML et non dans l’UW,
ne sont pas toujours les mêmes et pas exclusifs de la microcouche et dont ne sont pas
attribués à des espèces dites neustoniques. Il faut remarquer que certaines espèces
actives dans l’environnement peuvent être insuffisamment abondantes pour être visibles
sur les profils SSCP (Moeseneder et al., 2001).

On n’observe pas de type de distribution associé à la variation spatiale des

structures populationnelles du bactérioplancton entre les différents sites
d’échantillonnage de la Baie de Guanabara. Certains pics sont communs dans presque
tous les profils SSCP et indiquent probablement des espèces habituellement présentes
dans la baie. Par exemple, on peut remarquer une ressemblance entre les profils SSCP
du site St1, localisé en dehors de la baie, et le site St5, au fond de la baie.

Les échantillons prélevés à 5 heures du matin exhibent un nombre plus

important de pics dans l’UW par rapport à la SML. Les prélèvements réalisés au cours
de 3 jours indiquent que ces pics supplémentaires trouvés dans l’eau sous-jacente à 5
heures, sont retrouvés dans la microcouche et absents de l’UW à midi. Ces résultats
suggèrent une migration verticale des bactéries et/ou des prédateurs au cours de la
journée (diel variation). La migration verticale du zooplancton et du microzooplancton
(heteronanoflagellés) est largement connue. Cette migration verticale des prédateurs

88
affecte fortement les communautés du phytoplancton et du bactérioplancton (Lampert &
Taylor, 1985 ; Lampert et al., 1986 ; Atkinson et al., 1992 ; Pearce & Butler, 2002 ;
Nakano & Ban, 2003). Le phytoplancton et les bactéries sont aussi capables de migrer
verticalement à travers de la colonne d’eau (Takamura & Yasuno, 1984 ; Jones, 1988 ;
Pedros-Alio & Sala, 1990 ; Nadeau et al.,1999).

V.3 Discussion générale

La Baie de Guanabara est un environnement important pour les activités

récréatives, le transport et même pour la survie des communautés de pêcheurs qui
traditionnellement récoltent des poissons et des coquillages dans la baie. Malgré son
importance, la baie reste très peu étudiée.

Les résultats de cette étude confirment la contamination des eaux de la baie par
les eaux usées non traitées et par des hydrocarbures pétroliers que l’on trouve dans les
eaux mais aussi dans le film de surface de l’eau de mer : la microcouche de surface.

Les environnements situés dans les régions tropicales sont connus pour leur
biodiversité en général. Cette étude est la première à isoler et à identifier des souches du
bactérioplancton présentes dans la Baie de Guanabara. L’isolement de souches
bactériennes est une étape essentielle pour pouvoir étudier ces bactéries, souvent
inconnues, et pour réaliser des études de biodégradation des polluants ou encore pour
recherche des souches présentant des caractéristiques bactéricides, des propriétés de
résistance à des virus, aux radiations solaires, etc. Si cette biodiversité est fondamentale
pour l’homme, pour la société et si elle est à ce jour encore très largement inexplorée et
inexploitée, la pollution incessante des eaux de la Baie de Guanabara par des effluents
domestiques et industriels peut amener à la diminution de la diversité du
bactérioplancton de la baie et en conséquence porter atteinte à la diversité de toute la
chaîne alimentaire.

Nous avons montré au cours de ce travail que la microflore de la Baie de

Guanabara, présente dans l’eau et à l’interface air-eau, est très diversifiée. Cette
microflore présente des propriétés de résistance au rayonnement ultra-violet, ce qui lui
permet certainement de rester active à la surface de l’eau. De la même manière, cet
environnement se caractérise par la présence de fortes concentrations d’hydrocarbures.

89
Il serait important de poursuivre ce travail en étudiant le rôle de la microflore dans la
transformation et la dégradation des hydrocarbures par la conduite d’expérimentation
spécifiques qui peuvent se faire en laboratoire. Si des bactéries très efficaces dans la
dégradation de ces hydrocarbures sont identifiées, les gènes impliqués dans ce
processus pourraient être identifiés et utilisés pour la bioremédiation, soit à l’aide de
souches naturelles qui pourraient être apportées dans les environnements pollués, soit à
partir de souches utilisées dans des filières d’épuration spécialisées.

90
 Chapitre VI

Conclusions et perspectives

91
VI.1 Conclusions

La microcouche de surface (SML) de la Baie de Guanabara est enrichie en

hydrocarbures non aromatiques (HNA), en bactéries totales et en bactéries cultivables
par rapport à l’eau sous-jacente. Les facteurs d’enrichissement sont d’environ 2,2 pour
les hydrocarbures non aromatiques, 7,4 pour les bactéries cultivables et 1,4 pour les
bactéries totales.

Le film de surface est visible la plupart du temps et la microcouche est bien

définie, significativement différent de l’eau sous-jacente (UW) par rapport aux bactéries
totales, aux hydrocarbures non aromatiques totaux, aux composés non résolus (UCM),
aux composés de haut poids moléculaire (HMW), au phytane et au n-alcane n-C17.

La forte concentration des hydrocarbures dans la BG résulte de la somme d’une

importante production bactérienne et primaire, de l’apporte significatif d’hydrocarbures
d’origine végétale par les fleuves et le ruissellement ainsi que de la pollution
anthropique par les apportes urbains, la navigation, les activités portuaires et les
industries.

La Baie de Guanabara présente diverses zones de différentes caractéristiques

chimiques et microbiennes. Les concentrations en bactéries et en hydrocarbures sont
plus élevées au fond de la baie. Les sites d’échantillonnage situés à l’entrée de la baie
sont significativement différents des sites du fond de la baie par rapport aux
concentrations du bactérioplancton total, des n-alcanes totaux et des composés de faible
poids moléculaire (LMW).

La plupart des souches isolées à la Baie de Guanabara appartient au groupe des

proteobactéries et sont similaires à celles déjà identifiés dans autres environnements.
D’autre part, certaines souches cultivées sont des espèces bactériennes nouvelles.

La plupart des souches testées au simulateur solaire sont résistantes aux

radiations solaires. La sensibilité aux UV et la capacité de récupération des dommages
causés par les rayons solaires varient entre les différentes souches testées. Cette
variation interspécifique est indépendante des groupes taxonomiques.

92
 La pigmentation des souches ne semble pas affecter leur résistance aux rayons
solaires. La résistance des souches est probablement due à des mécanismes efficaces de
réparation de l’ADN endommagé, comme la réparation enzymatique et la réparation par
excision de nucléotide. D’autres mécanismes de photoprotection, comme la production
d’exopolysaccharides, peuvent participer à la résistance des bactéries aux radiations.
Les facteurs et les mécanismes responsables de la forte de résistance des souches
bactériennes aux rayons solaires demandent des études additionnelles.

La structure populationnelle du bactérioplancton, analysée par la SSCP, indique

un enrichissement d’espèces dans la microcouche de surface (SML) par rapport à l’eau
sous-jacente (UW). Par contre, les profils SSCP n’ont pas révélé d’espèces exclusives
(neustoniques) de la microcouche de surface.

Les résultats de la SSCP des échantillons provenant des différents sites

d’échantillonnage ne présentent pas un profil consistant de variation spatiale des
structures populationnelles du bactérioplancton de la Baie de Guanabara.

Les profils SSCP des échantillons de la microcouche de surface et de l’eau sous-

jacente, prélevées à 5 heures du matin et au midi solaire, indiquent une possible
migration verticale des bactéries et/ou des prédateurs au cours de la journée (diel
variation). Des études supplémentaires sont nécessaires pour la compréhension de cette
variation des structures populationnelles du bactérioplancton.

93
VI.2 Perspectives

Identifier les principaux polluants dans la microcouche de la Baie de Guanabara, y

compris les hydrocarbures aromatiques polycycliques, les polluants organiques
persistants et les pesticides;

Évaluer la résistance des bactéries isolées vis-à-vis des principaux polluants

identifiés dans la Baie de Guanabara, afin d’identifier les bioindicateurs de pollution
et les bactéries capables de dégrader les hydrocarbures;

Accompagner les variations des hydrocarbures aromatiques à 5 heures du matin et

au midi solaire ;

Analyser les effets de la photodégradation sur les principaux polluants identifiés

dans la Baie de Guanabara.

94
Références bibliographiques

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117
Annexes

118
FLGC 99 Bacillus thurigiensis AF155954
P22
P37
84 Bacillus subtilis AF333249
0.014
Bacillus licheniformis AY786999
62
98 P42
Bacillus pumilus AY112667
100 P28
55 100 Microbacterium schleiferi Y17237
P35
100 Micrococcus luteus AF501366
100 P43
0.015
37 99 Arthrobacter albus AJ243421
59 56 Arthrobacter cumminsii X93354
Arthrobacter sp. D88211
17
93 48 97 P3
Arthrobacter protophormiae X80745
Arthrobacter keyseri AF256196
100 Virgibacillus carmonensis AJ316302
57 Bacillus halodenitrificans AB021186
44 Bacillus megaterium AY030338
100
P32
Bacillus marisflavi AF483624
47 Marinococcus albus X90834
12
Halobacillus halophilus X62174
73 Halobacillus trueperi AJ310149
50
8
17
99 P25
Halobacillus salinus AF500003
Bacillus marisflavi AF483625

94 Bacillus vietnamensis AB099708

4
51 P1
Bacillus acidogenesis AF547209
0.051 Staphylococcus aureus L37597
0.05 P9

119
CFB
0.012
Rhodovirga winosgradskii AJ575263
96
0.014
100 0.108 P14
0.045
Honginella marincola
AY533664
0.030
Flavobacteriaceae bacterium AY259501
77
0.028
68 P41
0.026
0.015 75 Marine bacterium SCRIPS AF359548
0.038
Psychroserpens burtonensis U629130

39 0.036
64 Calefactosor algoritergicola AY694003
0.028
Sphingobacteria bacterium AY317117

0.024
100 Winogradskyella poriferia AY848823
0.051 100
100 P4
100
91 0.023
P39
0.043
P24
0.089
49 Uncultured bacteria AF314431
0.062
Uncultured bacteriaAY711636
0.038 0.069
68
P2
0.02 0.113
Lewinella cohaerens AF039292

120
GAMMA 100
83 Gamma proteobacterium (deep sea, Japan) AB010858
P20
Uncultured bacteria (from methane hydrate-bearing deep marine sediments) AY093457
Plesiomonas shigelloides M59159
48 95 Providencia alcalifaciens AJ301684
Providencia stuartii AF008581
55
100 80 P6
Proteus vulgaris (Enterobacteriaceae) AB099401
Aeromonas culicicula AY130992
99 Aeromonas hydrophila AJ508765
Pseudoalteromonas piscicida X82215
100 Pseudoalteromonas nigrifaciens X82146
100 19
Alteromonas distincta AF043742
37 Pseudoalteromonas aurantia X82135
P23
36 100 P5
21
55
P10
63Alteromonas macleodii X82145
53 Endocytic bacterium (in Noctiluca scintillans)
100 P21 AF262751
68
100 P8
Alteromonas alvinellae (Mediterranean Sea)
100 AY136113
P13
42 Thalassomonas viridans AJ294747
27 Idiomarina baltica AJ440214
56
99 P16
57 Vibrio parahaemolyticus X74721
49
100 Vibrio campbellii X74692
Vibrio alginolyticus X56576
P7
85 Photobacterium leiognathi X74686
100 P30
79 Pseudomonas oleovorans D84018
100
Pseudomonas psychrotolerans AJ575816
P31
100 Pseudomonas pachastrellae AY880300
96
P15
Pseudomonas pavonaceae D84019
0.01 49 Pseudomonas aeruginosa AF094718
100 P12

121
ALPHA
95 Citricella thiooxidans AY639887
78
P11
Roseobacter gallaeciensis AJ867254
47 Bacterium K2-53B AY345413
97
90
P33
P36
99 57
Phycococcus omphalius
AB193438
99 Filamentous photosynthetic bacterium
41 AB046591
P34
Ruegeria aff. gelatinovorans AJ295988
100
P19
Thioclava pacifica AY656719

99 Paracoccus sp AJ313424

72 P38

72
89 P26
P40
100 73
67 56 P29
Rhodobacter massiliensis
AF452106
P17

100 Erytrobacter citreus AF118020

P27
100 Uncultured alpha proteobacterium
AF432337
P18
98
0.01 Eritrobacter aquimaris AY461443

122
123
124
125
126
Séquences partielles de l’ADNr 16S des souches isolées de la Baie de Guanabara :

P1
CATGGCTCAGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATTGATGGAGCTTGCTCCCTGAAATT
CAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGAATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA
CCGGATAATTCATTTCCTCGCATGAGAAAATGTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTACAGATGGACCCGCGGCGC
ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGG
GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC
AACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAATAGGG
CGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG
CGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCG
TGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGT
AGATATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGA
GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAG
TGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG

P2
TCATGGCTCAGGATGAACGCTAGCGGGAGGCTTAATACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGGGACTTCGGTCCTGATG
GCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTACGCAACTTGCCTCCAAGCGGGGGATAGCCCCGGGAAACTGGGATTAA
TACCCCATAGCATCATTTTATCGCCTGGTAAAATGATTAAAGCTTAGGCGCTTGGAGATGGGCGTGCGTGCCATTAGC
TAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATGGCTAGGGGGCGTGAGAGCGTGGCCCCCCACACGGGTACTG
AGACACGGACCCGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGACAATGGAGGCAACTCTGATCCAGCCATCC
CGCGTGCAGGATGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTGCGAGGGAAGAAACGGTGCTATTTATAGCATTTTGAC
GGTACCTCGAGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAA
TCACTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCATTATAAGTCAGAGGTGAAAGCCCGTCGCTTAACGATGGAATTGCCTT
TGATACTGTAGTGCTTGAATCAAGTTGAGGCTGGCGGAATGTGGCATGTAGCGGTGAAATGCATAGATATGCCATAG
AACACCAATTGCGAAGGCAGCTGGCTGGGCTTGAATTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTA
GATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTTTACTCGTTACTAGGCACCATGTTGTCTGGGACCAAGCGAAAGCGT
TAAGT

P3
CGTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGATGCTGGTGCTTGCACCGGTGGATTAG
TGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTTCGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGG
ATATGACTTCCTGCTGCATGGCAGGGGGTGGAAAGATTTATCGGTTGGGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGG
TGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACG
GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGA
GGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCCCCTTTTGGGGGTGACGGTACTTGCAGAAG
AAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAA
GAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCCGTGAAAGTCCGAGGCTCAACCTCGGATCTGCGGTGGGTACGGGCAGAC
TAGAGTGATGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCG
AAGGCAGGTCTCTGGGCATTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
TCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCC
CGCC

P4
TCATGGCTCAGGATGAACGCTAGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGAAAAAAAGCTTGCTTTTT
TGCTGACGAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATACAATCTACCTTTTACTGGGGAATAGCCTTTGGAAACGAAGA
ATAATACCCCATAGTATCTAAATTTCGCATGTTATTTAGATTAAAGTTTCGGCGGTAAGAGATGAGTATGCGTTCTAT
TAGCTAGATGGTGTGGTAACGGCACACCATGGCAACGATAGATAGGGGCCCTGAGAGGGGGATCCCCCACACTGGT
ACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCC
ATGCCGCGTGCAGGAAGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATACGGGAAGAAACCCATCTACGTGTAGATGG
CTGACGGTACCGTAAGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATC
CGGAATCATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGTGGATTGGTAAGTCAGAGGTGAAAGCCTGCAGCTCAACTGTAGAACT
GCCTTTGATACTGCTAGTCTTGAATTATTGTGAAGTGGTTAGAATATGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTAC
ATAGAATACCAATTGCGAAGGCAGATCACTAACAATATATTGACACTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACGGG
ATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGTCACTAGCTGTTCGGATTTCGGTCTGAGTGGCTAAGCGAAA
GTGATAAGTGACCCCCCTGG

P5
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACATTTCTAGCTT
GCTAGAAGATGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATATGCCTTAGGGTGGGGGACAACAGTTGGAAA
CGACTGCTAATACCGCATAACGTCTACGGACCAAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCCTTAGATTAGCCCAAGTGGGAT
TAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAA
CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA
TGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCT
AGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGT
TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGG
AACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG
ATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAA
ACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGT

127
P6
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGGGGAAGCTT
GCTTCTCGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGGATCTGCCCGATAGAGGGGGATAACTACTGGAAAC
GGTGGCTAATACCGCATAATCTCTTAGGAGCAAAGCAGGGGAACTTCGGTCCTTGCGCTATCGGATGAACCCATATG
GGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACT
GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCA
GCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGGGAGGAAGGCGTTGATGCTAATATC
ATCAGCGATTGACGTTACCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCA
AGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTGATTAAGTTAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAAC
CTGGGAATGGCATCTAAGACTGGTCAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCG
TAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGG
AGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGT

P7
GTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATTCACCTGAATAGTGGGGGATAACCCAATTGGAAACGATGGC
TAATACCGCATAACGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCCCGGATATGCCTAGGTCGGATT
AGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAAT
TGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCAT
GCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTAGTTAATAGCTGCAT
TATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTT
AATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGA
ATTGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGA
TCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAA
CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGT

P8
GATGACCGAGTGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACTTGCCTTTGCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCT
AATACCGCATAATGTCTTCGGACCAAACGGGGCTTCGGCTCCCGGCGCAAAGAGAGGCCCAAGTGAGATTAGCTAGT
TGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGTTCTGAGAGGAAGATCAGCCACACTGGGACTGAGACA
CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGT
GTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGTGAGGAAAAGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCCGTGA
CGTTAACAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGG
AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGCTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGATGGTCA
TTTAGAACTGGCAGACTAGAGTCTTGGAGAGGGGAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGA
GGAACATCCGTGGCGAAGGCGACTCCCTGGCCAAAGACTGACGCTCATGTGCGAAAGTGTGGGTACGCGAACAGGC
TTAGATACCCTGGTAGTCCA

P9
GGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGA
GTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTTGAAC
CGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTA
ACGGCTTACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGA
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA
AGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACATATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACGGTACCTAA
TCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGC
GTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGG
AAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAG
TGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTG
GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATAAGCA
CTCCGCCTGG

P10
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGAAGAGGTGC
TTGCACCTCTGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATATGCCTTATGGTGGGGGACAACAGTTGGA
AACGACTGCTAATACCGCATGATGTCTACGGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACGCCATAAGATTAGCCCAA
GTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCAC
ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGAT
GCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAAGGAGGAAAGGTTAAGTGTTAAT
AGCACTTAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTG
CGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCA
ACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATG
CGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTGCGAAAGCGTGG
GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA

128
P11
TTGAATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAGACCTTCGGGTCTAGCGGC
GGACGGGTTAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCTTCTCTGCAGGATAGCCACTGGAAACGGTGAGTAATACTGCATACG
CCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGAGAAGGATCGGCCCGCGTTAGATTAGATAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAA
GTCTACGATCTATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCAACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG
CAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTCG
TAAAGCTCTTTCGCTGGGGAAGATAATGACTGTACCCAGTAAAGAAACCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGGGTTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGATCAGAAAGTTGGGGGTG
AAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCCTCCAAAACTCCTGGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAG
TGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAG
GTGCGAAAGTGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGC
AAGCATGCTTGTCCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATCCGCCTGGGG

P12
CTAGAGTTTGGAATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAG
CTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAA
CGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGT
CGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACAC
TGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCC
AGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATAC
CTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCA
AGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAAC
CTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCG
TAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGG
AGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTATGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCC

P13
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCAGGATGTGCTT
GCACATCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACTTGCCTTTGCGAGGGGGATAACAGTTGGAAAC
GACTGCTAATACCGCATAANGTCTACGGACCAAACGGGGCTTTTAGCTCCGGCGCAAAGAGAGGCCCAAGTGAGATT
AGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGTTCTGAGAGGAAGATCAGCCACACTGGGAC
TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCAT
GCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGTGAGGAAAGGTTGGTAGTTAATACCTGCCA
GCTGTGACGTTAACAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGT
TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGCTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGG
ATGGTCATTTAGAACTGGCAGACTAGAGTCTTGGAGAGGGGAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT
ATCTGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGACTCCCTGGCCAAAGACTGACGCTCATGTGCGAAAGTGTGGGTAGCGA
ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGCTGT

P14
AGAGTTTGATCATGGCTCAGGATGAACGCTAGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGATACTTCGGG
TATTTTGAGAGCGGCGCACGGGTGCGTAACACGTATGCAACCTACCTTATACAGGGGGATAGCCCGGAGAAATCCGG
ATTAATACCCCATGGTACTGATGGATGGCATCGTTTATCAGTTAAAGATTTATCGGTATAAGATGGGCATGCGTCTGA
TTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACACTGGC
ACTGAGATACGGGCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGGGCAATGGACGAGAGTCTGACCCAGCC
ATGCCGCGTGCAGGAAGACGGCCTATTGGGTTGTAAACTGCTTTTATACGGGAAGAAAAGGCCCATGCGTGGGACAT
TGCCGGTACCGTATGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTGTCC
GGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCTGATTAAGTCAGCGGTGAAAGACTTCGGCTCAACCGGAGCAGTG
CCGTTGATACTGGTTAGCTTGAGTGCTGCAGGGGTACATGGAATTGATGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATACCAT
CAGGAACACCGATAGCGAAGGCATTGTACTGGGCAGCAACTGACGCTGATGCACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG
ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATTACTCGCTGTTATGCCTTTTGGTGTATGCGGCCAAGCGAAA
GCGTTAAGTAATCCACCTGG

P15
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGC
TCCCGGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGACTCGAAAGGGTC
GCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGAT
TAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCAACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAA
CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCA
TGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGTTTAATACGCTGC
AATCTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGT
TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTTGATAAGATGGGTGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGG
AACTGCATCCATAACTGTCTGGCTAGAGTACAGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT
ATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAA
ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGT

129
P16
TAGAGTTTTGGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGGAAGAA
GCTTGCTTCTTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACTTGCCTTTAGGAGGGGGATAACCATTG
GAAACGATGGCTAATACCGCATAATGTCTCCGGACCAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCACCTAAAGATAGGCCC
AAGTGAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCC
ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTG
ATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGTGAGGAAGGGTTGTAAGTTA
ATACCTTGCAACATTGACGTTAGCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGG
TGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGTAGGCGGCCTATTAAGCAAGATGTGAAAGCCCCGGGCT
CAACCTGGGAATGGCATTTTGAACTGGTAGGCTCGAGTTCTGAAGAGGGTGGTAGAATTTCCAGTGTAGCGGTGAAA
TGCGTAGAGATTGGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCACCTGGTCAGAAACTGACGCTGAGGTACGAAAGCGT
GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGTTGTTCGTGTCATAAATGAT
GTGAGTAACGCAGCTAACG

P17
ATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAGACCTTCGGGTCTAGCGGCGGACGG
GTTAGTAACGCGTGGGAATATGCCCAAAGGTACGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGTATGTGCCCTTC
GGGGGAAAGATTTATCGCCTTTGGATTAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGAC
GATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCAACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA
GTGGGGAATCTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAG
CTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAGCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA
CGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGACTATTAAGTCGGGGGTGAAATCC
CGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTCGATACTGGTAGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGA
GGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGA
AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTACGTCGGCAAGT
ATATCTTGTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATACCGCCTGGG

P18
ATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAACCCTTCGGGGTTAGTGGCGCAC
GGGTGCGTAACGCGTGGGAACCTGCCTTTAGGTTCGGAATAACTCAGAGAAATTTGAGCTAATACCGGATGATGTCT
TCGGACCAAAGATTTATCGCCTTTAGATGGGCCCGCGTTAGATTAGATAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGTCG
ACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC
AGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAA
AGCTCTTTTACCAGGGATGATAATGACAGTACCTGGAGAATAAGCTCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA
TACGGAGGGAGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTTTTTAAGTCAGGGGTGAAAT
CCCGGAGCTCAACTCCGGAACTGCCCTTGAAACTGGGAAGCTAGAATATTGGAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTA
GAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTACTGGACAATTATTGACGCTGAGGTGC
GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAAGCTAGCTGTCCGGGCT
CAAAGAGTTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGG

P19
GCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAGGACTTCGGTTCTAGCGGCGGACGGGTT
AGTAACGCGTGGGAACGTGCCCTTTTCTACGGAATAGCCTCGGGAAACTGAGAGTAATACCGTATACGCCCTTCGGG
GGAAAGATTTATCGGAGAAGGATCGGCCCGCGTTAGATTAGATAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGTCTACGAT
CTATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCAACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG
GGGAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTCGTAAAGCTC
TTTCGCCTGTGAAGATAATGACTGTAGCAGGTAAAGAAACCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG
AGGGGGTTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGACATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGG
GGCTCAACCCCGGAACTGCCCTTGATACTGGGTGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGT
GAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAA
GTGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGTATAC
TGTTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGC

P20
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTTTTCGGACCTAGCG
GCGGACGGGTGAGTAATGTGTAGGAAGCTACCCGATAGAGGGGGATACCAGTTGGAAACGACTGTTAATACCGCAT
AATGTCTACGGACCAAAGTGTGGGACCTTCGGGCCACATGCTATCGGATGCGCCTACATGGGATTAGCTAGTTGGTG
AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTC
CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGA
AGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGGTTAGTAGTTAATAGCTGCTAACTTTGACGTTAC
TCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACT
GGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGTTGGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGAAA
CTGGCCAACTAGAGTATGTGAGAGGGGGGTAGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAATA
CCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGCACAATACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA
CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGT

130
P21
AGAGTTTGAATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGCCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACATTTCTAGCT
TGCTAGAAGATGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGACCTTGCCTTTGCGAGGGGGATAACAGTTGGAAA
CGACTGCTAATACCGCATAATGTTTTCGAACCAAACGGGGCTTAGGCTCCGGCGCAAAGAGAGGCCCAAGTGAGATT
AGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGTTCTGAGAGGAAGATCAGCCACACTGGGAC
TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCAT
GCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGTGAGGAAAAGTTAGTAGTTAATACCTGCTA
GCCGTGACGTTAACAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGT
TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGCTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGG
ATGGTCATTTAGAACTGGCAGACTAGAGTCTTGGAGAGGGGAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT
ATCTGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGACTCCCTGGCCAAAGACTGACGCTCATGTGCGAAAGTGTGGGTAGCGA
ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGCTGTCTACTAGCTGTGTGTGCCTTTAAGGCGTGCGTAGCGA
AGCTAACGCGATAAGTAG

P22
TGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTGAGAGCTTGCTCTCAAGAAG
TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAAT
ACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGC
ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGG
GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC
AACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGC
TGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG
CGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGT
GGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA
GAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAG
CAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGT
GCTGAAGTTAACGCATTAAGC

P23
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACATTTCTAGCTT
GCTAGAAGATGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATATGCCTTAGGGTGGGGGACAACAGTTGGAAA
CGACTGCTAATACCGCATAACGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCCTTAGATTAGCCCAAGTGGGATT
AGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAAC
TGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCAT
GCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTA
GCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTT
AATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGA
ACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGA
TCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAA
CGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGT

P24
TCATGGCTCAGGATGAACGCTAGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGGGGTAACAGGGAGTAGCTTGCTACTTT
GCTGACGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATACAATCTGCCTTGTACTGGGGGATAGCCTTTAGAAATGAAGAT
TAATACCCCATAGTATATGACTGTGGCATCACAGCCATATTAAAGGTTACGGTACAAGATGAGTATGCGTCCTATTAG
CTAGATGGTGTGGTAACGGCACACCATGGCGACGATAGGTAGGGGCCCTGAGAGGGGGATCCCCCACACTGGTACTG
AGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGAGGCAACTCTGATCCAGCCATGC
CGCGTGCAGGAAGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATACGGGAAGAAACACCCCCACGTGTGGGGGCTTGA
CGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGA
ATCATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGACGATTAAGTCAGAGGTGAAAGTCTGCAGCTCAACTGTAGAATTGCCT
TTGATACTGGTTGTCTTGAATTATTGTGAAGTGGTTAGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTTAG
AATACCAATTGCGAAGGCAGATCACTAACAATATATTGACGCTGAGGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTA
GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTTCGATTTTCGGATTGAGTGGCTAAGCGAAAGTGA
TAAGT

P25
TGATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCGGGAAGCGAGTGGATCCCCTT
CGGGGGTGAAGCTCGTGAAACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGATCGGAATAAC
CCCGGGAAACCGGGGCTAATGCCGGGTAATACTTTCTTTCGCATGAAGGAAAGTTGAAAGATGGCTTCTTGCTATCA
CTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTG
AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCA
ATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGAAG
AACAAGTACCGTGCGAATAGAGCGGTACCTTGACGGTACCTAACGAGGAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC
GCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGAT
GTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGGACAGAAGAGGAGAGTGGAATTC
CACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTTTCTGACGC
TGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGT
TAGGGGGCTTCCACCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG

131
P26
TAGAGTTTTGATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAGACCTTCGGGTCT
AGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCCTTTGCTACGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACC
GTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGC
CTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA
CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGAAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCT
TAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGC
AGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATTGGAAAGTT
GGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTCCAAAACTCCCAGTCTTGAGGTCGAGAGAGGTGAGTGGA
ATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTG
ACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCA
GTCGTCGGGTAGCATGCTATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGG

P27
ATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAACCCTTCGGGGTGAGTGGCGCAC
GGGTGCGTAACGCGTGGGAACCTGCCTTTAGGTTCGGAATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGGATAATGTCT
TCGGACCAAAGATTTATCGCCTTTAGATGGGCCCGCGTTAGATTAGATAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGTCG
ACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC
AGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAA
AGCTCTTTTACCAGGGATGATAATGACAGTACCTGGAGAATAAGCTCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA
TACGGAGGGAGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTTCAAGTCAGGGGTGAAAT
CCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCCTTGAAACTGGATGGCTAGAATACTGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTA
GAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCACTGGACAGTTATTGACGCTGAGGTGC
GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGCTC
ATGGAGCTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTATCCGCCTGG

P28
TGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATAAAGACGGTTTCG
GCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGC
CGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC
TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTT
AGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCC
AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAA
GTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT
GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAA
CTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG
CTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAG

P29
TAGAGTTTGATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAGGACTTCGGTCCTA
GCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCTTTGCTACGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCG
TATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAACGGCC
TACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGAAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTT
AGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATTGGAAAGTTG
GGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCCTCCAAAACTCCCAGTCTTGAGGTCGAGAGAGGTGAGTGGAAT
TCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGAC
GCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGT
CGTCGGGTAGCATTTTATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCG

P30
CNTTAGAGTTTTATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGACTTAA
CTGAACCTTCGGGGAACGTTAAGGNCGGCGANCGNCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGAATATGCCCTGATGTGGG
GGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAATCTCTTCGGAGCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGT
CAGGATTAGCCCAGGTGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTCTGAGA
GGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATG
GGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTAGGGAGGAAG
GCAGTGTCGTTAATAGCGGCATTGTTTGACGTTACCTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGCGGTCTGTTAAGCAAGATGTGA
AAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACAGCATTTTGAACTGGCAGACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGT
GTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAG
ATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGT
GGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAATAGACCGCCTGGGATACGTCGCAGT

132
P31
AGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTC
TCTCGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTAGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACG
CTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATTAGATGAGCCTAGGTCGGATT
AGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAAC
TGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCAT
GCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCTCATAGCGAATACCTGTGA
GTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTT
AATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGCTTGATAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGA
ACTGCATCCAAAACTGTCTGGCTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATA
TTGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTAACACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAA
CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGC
AGCTAACGCATTAAGTGACCGCCTGGG

P32
GAGTTTGATCATGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTG
CTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAAC
CGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGG
CCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCG
GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT
CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACAAG
AGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTA
GGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACG
GCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGT
GAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAA
GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCC
GCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGG

P33
TTAGAGTTGATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCGCCCTTCGGGGTGA
GCGGCGGACGGGTTAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCAGATCTAAGGAATAGCCACTGGAAACGGTGAGTAATACCT
TATACGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGATTTGGATCGGCCCGCGTTAGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCT
ACCAAGCCTACGATCTATAGCTGGTTTTAGAGGATGATCAGCAACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG
GGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTA
GGGTCGTAAAGCTCTTTCGCCTGTGATGATAATGACAGTAGCAGGTAAAGAAACCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG
CCGCGGTAATACGGAGGGGGTTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGACTATTAAGTCAG
AGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGTAGTCTAGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATT
CCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACG
CTGAGGTGCGAAAGTGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGATGAATGCCAGTC
GTCGGATAGCATGCTATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTAC

P34
CTAGAGTTTGATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAGGACTTCGGTTCT
AGCGGCGGACGGGTTAGTAACGCGTGGGAACGTACCCTTTTCTACGGAATAGCCTCGGGAAACTGAGAGTAATACCG
TATACGCCCTTAGGGGGAAAGATTTATCGGAGAAGGATCGGCCCGCGTTAGATTAGATAGTTGGTGGGGTAATGGCC
TACCAAGTCTACGATCTATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCAACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTT
AGGGTCGTAAAGCTCTTTCGCCTGTGAAGATAATGACTGTAGCAGGTAAAGAAACCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACGGAGGGGGTTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGACATTTAAGTCA
GAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGTGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAAT
TCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGAC
GCTGAGGTGCGAAAGTGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGATGAATGCCAGT
CGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCT

P35
TCTGGGATAAGCGNTGGAAACGGCGTCTAATACCGGATACGAGGTNCGAAGGCATCTTCAGCAGCTGGAAAGAACTT
CGGTCTGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCC
TGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGA
AGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCG
CAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCGCGTCTGCTGTGAAAACCCGAGGCTCA
ACCTCGGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATG
CGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGG
GGAGCAAACAGGCTTAGATAACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGTCCATTCCACTGA
TTCCG

133
P36
TTAGAGTTTGATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCGCCCTTCGGGGTG
AGCGGCGGACGGGTTAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCAGATCTAAGGAATAGCCACTGGAAACGGTGAGTAATACC
TTATACGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGATTTGGATCGGCCCGCGTTAGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCC
TACCAAGCCTACGATCTATAGCTGGTTTTAGAGGATGATCAGCAACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTT
AGGGTCGTAAAGCTCTTTCGCCTGTGATGATAATGACAGTAGCAGGTAAAGAAACCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACGGAGGGGGTTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGATTAGTCAGTTA
GAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTAATACTGCTAGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAAT
TCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGAC
GCTGAGGTGCGAAAGTGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGATGAATGCCAGT
CGTCGGCAAGCATGCTTGTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGG

P37
TCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGATCTTTGGGAGCTTGCTCCCAAAG
ATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGATTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAAT
ACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGTGGCTTTTGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCG
CATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTG
GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAG
CAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCAAATAGG
GCGGTACCATGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA
AGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAAC
CGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTACAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGC
GTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGG
GAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTT
AGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGA

P38
TTAGAGTTTGATCATGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAGACCTTCGGGTCT
AGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCCTTTGCTACGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACC
GTATGTGCCCTTAGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGC
CTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA
CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGAAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCT
TAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGC
AGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATTGGAAAGTT
GGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTCCAAAACTCCCAGTCTTGAGGTCGAGAGAGGTGAGTGGA
ATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTG
ACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCA
GTCGTCGGGTAGCATGCTATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGT

P39
AGCTTGCTTTTCCGCTGACGAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATACAATCTGCCTCTTACTGGGGGATAGCCTTT
GGAAACGAAGAATAATACCCCATGGTATCCAGGTTTCGCATGGAATCTGGATTAAAGTTTCGACGGTAAGAGATGAG
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CCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGCGGAAGC
CTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTGTACGGGAAGAAACCCACCTA
CGTGTAGGTGGCTGACGGTACCGTAAGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATG
CAAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGTGGATCGGTCAGTCAGAGGTGAAATCCTGCAGCTCA
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ATAGATATTACATAGAATACCGATTGCGAAGGCAGATCACTAACGATACATTGACACTGATGGACGAAAGCGTGGGG
AGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGTCACTAGCTGTTCGGACTTCGGTCTGAGTGG
CTAAGCGAAAGTGATAAGTGACCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAG

P40
GCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAGGACTTCGGTCCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA
CGCGTGGGAACGTACCCTTTGCTACGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGTATGTGCCCTTA
GGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTAC
CAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC
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TATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGT
GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGTAG
CATTTTATTCCGGTGACACACCTAACGGNNCAAGCATNCCGNCCTCNGGACGTCGCNNG

134
P41
TTAGAGTTTGATCATGGCTCAGGATGAACGCTAGCGGCAGGCCTAACACATGCCAGTCGAGGGGGTAACAGGGAGA
GCTTGCTCTTGCTGACGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATACAATCTACCTTATACTGGAGAATAGCCCAGAG
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CGTTCTATTAGCTAGATGGTGTGGTAACGGCACACCATGGCAACGATAGATAGGGGCCCTGAGAGGGGGATCCCCCA
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CGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGA

P42
GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAATTCGAGCGGACCGACGGGAGCTTGCTCCCTTAGGTCAGCGGCGG
ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTT
GATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGT
TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC
ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCG
TGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTT
GACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCG
GAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTC
ATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTG
GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG
ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCA
AACGCATTAAGCACTCCGCCTG

P43
TAGAGTTTGATCATGGGTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTG
CTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTAACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTG
GGTCNTAATACCGGATAGGAGCGCCCACCGCATGGTGGGTGTTGGAAAGATTTATCGGTTTTGGATGGACTCGCGGC
CTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACT
GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCA
GCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCT
GCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGG
GCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGTCGTGAAAGTCCGGGGCTTAACCCCGGATCTGCGGTGGGTACG
GGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACC
GATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACC
CTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGACCATTCCACGGTTTCCGCGCCGCGAGCTAACGCATT
AAA

135
Protocole – Courbes de croissance des souches bactériennes cultivées dans Marine
Broth

Souchier Tubes 6 ml MB

1 puits - contrôle contamination (2mL MB)

23 souches (1,9 mL MB + 0,1mL bouillon)

Incuber à 25°C (salle climatisée); suivre la croissance

(mesure de DO à 590nm) pendant 6 jours

À la fin de l’incubation, inoculer les souches de la

microplaque dans MA pour vérifier la pureté des
souches.

136
 Protocole – Résistance des souches aux radiations solaires (simulateur solaire)

Tubes à centrifugation
Souche MB
12 ml MB

t = début de la phase stationnaire

Centrifuger 6000g /10 minutes

2x
Culot -remis en + 12 mL d’eau de mer filtrée et
suspension avec autoclavée (110°C)
une pipette

Vortex
N 1/10 1/100 1/1000 Dilution jusqu’au 1/1000
(tubes avec 9mL d’eau de mer)

Fixer 1mL pour la cytométrie: déterminer la concentration de 10 4 cellules/mL

* Sybr Green I (0,25µL/1mL)

Inoculation de chaque puit: 1mL de la suspension à 104 cellules/mL

2 puits - contrôle contamination

11 souches en duplicate

Exposer les microplaques à: sans exposition

1h condition A
3h condition B
5h condition C
7h condition D

Rajouter dans chaque puit 1mL de MB 2x

Incuber à 25°C (salle climatisée); suivre la croissance

(mesure de DO à 590nm) pendant 6 jours.
Boîtes contrôle MA.

137

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