Découverte de nouvelles molécules

antibiotiques et caractérisation de
leurs modes d’action
Thèse de doctorat de l'université Paris-Saclay

École doctorale n° 577, Structure et Dynamique des Systèmes Vivants (SDSV)

Spécialité de doctorat : Sciences de la vie et de la santé
Unité de recherche : Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, MICALIS Institute,
78350, Jouy-en-Josas, France.
Référent : Faculté des sciences d’Orsay

Thèse présentée et soutenue à Jouy-en-Josas, le 04/02/2021, par

Cécile JACRY
Composition du Jury
Stéphanie BURY-MONE
Professeur Université Paris-Saclay – I2BC, Université Paris-Saclay/ Présidente
CNRS/ CEA, Orsay, France
Fabien LETISSE
Professeur Université de Toulouse – TBI, Université de Toulouse/ Rapporteur et examinateur
CNRS/ INRAE/ INSA, Toulouse, France.
Thèse de doctorat

Harald PUTZER
Directeur de recherche CNRS – EGM, IBPC, Université Sorbonne- Rapporteur et examinateur
Paris-Cité/ Université de Paris/ CNRS, Paris, France.
Louis COROLLER
Professeur Université de Bretagne Occidentale – ESIAB, LUBEM, Examinateur
Université de Bretagne Occidentale, Quimper, France
Gilles TRUAN
Directeur de recherche CNRS – TBI, Université de Toulouse/ CNRS/ Examinateur
NNT : 2021UPASL009

INRAE/ INSA, Toulouse, France.

Matthieu JULES
Directeur de thèse
Professeur AgroParisTech – MICALIS, Université Paris-Saclay/ INRAE/
AgroParisTech, Jouy-en-Josas, France.
Anne-Gaëlle PLANSON
Chargée de recherche INRAE – MICALIS, Université Paris-Saclay/ Co-Directrice de thèse
INRAE/ AgroParisTech, Jouy-en-Josas, France.
REMERCIEMENTS

Cette thèse a été réalisée au sein de l’équipe Systems Biology for bacterial Engineering and
Redesign (SyBER) qui à l’origine, était un groupe faisant partie de l’équipe Genetic Controls in Bacterial
Systems (GCBS) de l’unité Microbiologie de l’Alimentation au service de la Santé (MICALIS) co-dirigé
par Stéphane AYMERICH et Matthieu JULES. Le contrat de thèse s’inscrit dans le projet MEM financé
par l’Agence National pour la Recherche (ANR-15-CE21-0008).

Tout d’abord, je tiens à remercier chaleureusement mon directeur de thèse Matthieu JULES et ma
co-directrice de thèse Anne-Gaëlle PLANSON de m’avoir acceptée au sein de l’équipe en tant que
doctorante sur ce projet. Je tiens tout particulièrement à remercier Matthieu pour son expertise, son
esprit critique, sa bienveillance et ses encouragements qu’il a fait preuve à mon égard tout au long de
cette thèse. Je tiens aussi à exprimer toute ma reconnaissance et ma gratitude à Anne-Gaëlle pour nos
échanges scientifiques, sa patience, son aide, ses conseils et ses critiques constructives qui m’ont
permis de toujours me dépasser et d’apprendre toujours plus malgré les difficultés que j’ai pu
rencontrer. Je vous remercie de votre accompagnement mais surtout de tout le soutien que vous
m’avez accordé que ce soit sur le plan professionnel ou personnel.

Je remercie Stéphanie BURY-MONE d’avoir accepté d’être la présidente de mon jury de thèse. Je
remercie également Fabien LETISSE et Harald PUTZER qui ont accepté d’être rapporteurs de ma thèse
ainsi que, Louis COROLLER et Gilles TRUAN d’en être les examinateurs.

Je tiens à remercier les membres de mon comité de suivi : Gilles TRUAN et Rut CARBALLIDO LOPEZ
pour votre accompagnement, nos échanges et vos remarques pertinentes. Je tiens tout
particulièrement à remercier Gilles d’avoir accepté d’être mon tuteur de thèse au cours de ces quatres
années. Je tiens aussi à exprimer mes remerciements à Rut pour nos discussions matinales sur le
chemin de vauboyen et ses précieux conseils pour la suite de ma carrière.

Je tiens à remercier chaleureusement tous les membres et ex-membres de l’équipe SyBER et GCBS
qui m’ont aidée et soutenue pendant toute cette thèse : Aurélie BALIARDA pour sa gentillesse et son
soutien lorsque je doutais le plus de moi, Elena BIDNENKO pour son protocol d’extraction ARN du
tonnerre et ses astuces, Vladimir BIDNENKO, Teddy CHARBONNIER pour toutes ses blagues, nos
discussions et nos débats parfois tumultueux, Dominique LE COQ, Magali CALABRE pour toutes nos
discussions, nos fous rires et ses conseils amicaux, Olivier DELUMEAU pour nos discussions et ses
conseils, Yulia HAMEL, Vincent SAUVEPLANE pour toute son expertise sur les fermenteurs qui m’a
sauvée bien plus d’une fois et ses petites blagues qui me donnait le sourire, Lydia ROBERTet Michelle
WINKLER. Un remerciement tout particulier : à Rahma KAZI-TAN, à qui je souhaite exprimer toute ma
gratitude et ma reconnaissance pour toute l’aide qu’elle m’a apporté en biologie moléculaire mais
aussi pour son amitié, sa sensibilité et nos nombreux fous rires. A Stephen MCGOVERN qui a pris en
charge le projet CHASSIS et a été d’une grande aide tout au long de mes années de thèse. Je remercie
Stephen pour toutes nos discussions, son soutien sans faille et ses blagues mais aussi pour sa
personnalité unique qui va beaucoup me manquer. A ma collègue et amie Christina VERNANT, je serai
toujours reconnaissante pour toute l’aide qu’elle m’a apporté lors de mes derniers mois de thèse
particulièrement intense et tous les moments de convivialités qu’on a pu partager. A mon collègue,
voisin de paillasse et ami, Simon MORIN avec qui j’ai partagé les hauts et les bas du doctorat, mais
surtout de très bons moments dans la joie et la bonne humeur. A ma voisine de bureau et amie, Irène
TANNEUR pour toutes nos pauses thé et nos conversations. A mon collègue doctorant et ami, Arthur
LOUBAT, pour avoir été un rayon de soleil lors de ma dernière année de thèse. A mon collègue et ami,
Cedric WOLFENDER pour tout le soutien qu’il m’a apporté mais aussi pour son incroyable
interprétation de « Viva la vida » de Coldplay avec Vincent qui restera un de mes très beaux souvenirs
de mon passage. A Claire BAUDIER et Marwa ZAAROUR, pour tout ce que nous avons partagé et votre
soutien. Je tiens à remercier chaleureusement Etienne DERVYN, qui a été pour moi un pillier durant
cette thèse. Je n’ai pas les mots pour décrire à quel point je suis reconnaissante et exprimer toute la
gratitude que j’ai pour toute l’aide et le soutien qu’Etienne m’a apporté, pour toute son amitié, nos
moments passés, nos danses de la victoire, nos nombreuses conversations et ses précieux conseils. Il
a su me redonner confiance en moi et m’a montré qu’il existe du positif même dans le négatif. Il est
pour moi, l’un de mes modèles vers lequel j’aspire devenir, une personne exceptionnelle et
talentueuse avec un grand cœur. Je remercie toute mon équipe pour tous nos déjeuners et moments
de cohésion d’équipe, j’en garde de très beaux souvenirs !

Je remercie toute l’équipe BioRetroSynth (BRS), partenaire du projet MEM pour tout leur soutien,
leurs conseils et les moments de convivialités que nous avons pu partager tous ensemble. Je tiens à
remercier particulièrement Jean-Loup FAULON qui m’a toujours soutenue depuis des années dans
mon parcours scientifique. I would also like to thank Ioana GRIGORAS-POPESCU and Manish
KUSHWAHA for their support and advice which was invaluable to me at various times during my thesis.

Je tiens à remercier également Abolis, partenaire du projet MEM et notamment Tristan CERISY,
André LE JEUNE, Cyrille PAUTHENIER et Jessica LE VEN pour nos nombreux échanges et nos
collaborations.

Je tiens également à remercier les membres de l’équipe ProCeD de leur soutien et leur aide ainsi
que Pierre NICOLAS et Cyprien GUERIN (en particulier pour son aide dans le traitement des données

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de transcriptomique) de l’équipe MAIAGE. Et de manière générale, je tiens à remercier tous les
membres de MICALIS et en particulier la prépa qui ont contribué d’une manière ou d’une autre à la
réussite de cette thèse. Je remercie également les doctorants et post-doctorants du centre INRA de
Jouy-en-josas pour les moments de convivialités que nous avons passés ensemble.

Je remercie chaleureusement tous mes colocs, anciens comme nouveaux qui m’ont soutenue et
m’ont permis de me vider l’esprit quand j’en avais besoin, surtout lors de ma dernière année
particulièrement stressante. Je remercie particulièrement mon coloc et ami, Nidal BANJA qui a été
pour moi d’un grand soutien moral et a toujours répondu présent dans les moments de joie comme
de doute, pour m’avoir initiée à l’état de « flow » et pour tous ces nombreux petit-déjeuners qui m’ont
permis de bien commencer mes journées de travail.

Je tiens à remercier chaleureusement tous mes amis qui ont cru en moi et m’ont soutenu jusqu’à
la fin : Alice BARATEAU pour nos journées de télétravail et ses mots de motivation et d’encouragement,
Angelo CARDOSO BATISTA pour tous les moments qu’on a passé ensemble et ses mots
d’encouragements, Thomas BESSONNET pour toute sa bienveillance et ses petits mots d’amitié,
Romain BODINIER, Magali BOUTARD, David CHRISTIANY, William DIGAN pour toutes ces heures de
travail ensemble lors de notre dernière ligne droite , Ivan DUBOIS, Sandrine GOMADO, Anissa
GUERNICHE, Alec GUYOMARD, Anaïs LANDIER, Caroline KOTHE pour sa positivité, son aide et pour tous
les moments passés à l’institut ensemble qui ont égayé mes journées, Olivier LEPLUS pour son écoute
et ses conseils, Laura MATABISHI pour tous ces moments de relaxation et son écoute, Ombeline
MAYOL, Nandjafot MENDY, Amir PANDI, Nadéra ULCE, Vincent LE CORE pour ses mots
d’encouragements. Un remerciement tout particulier à : Joshua McCarthy et Sebastiàn RIZO, à qui je
souhaite exprimer toute ma reconnaissance pour avoir été toujours à mes côtés tout au long de cette
thèse. A Gabriela HENRIQUES, « my sweetie », pour qui je serai toujours reconnaissante pour tout le
soutien qu’elle m’a apporté, tous les moments que nous avons passés ensemble au laboratoire ou
dans la vraie vie. Je la remercie pour son optimisme, sa joie de vivre et sa gentillesse à tout épreuve
qui m’ont aidé bien plus d’une fois. A Audam CHHUN, mon « Ti nem », à qui je souhaite témoigner à
jamais toute ma reconnaissance et par qui, tout a commencé. Je le remercie pour sa disponibilité, son
aide à la préparation de l’oral de thèse, de m’avoir toujours « tiré vers le haut » et de m’avoir montré
que rien n’est impossible. A Sophia BELKHELFA, ma « Couscous » et Tiffany SOUTERRE, ma « Bobun »
sans qui tout ceci aurait été impossible. Je n’ai pas les mots pour exprimer à quel point je leur suis
éternellement reconnaissante de toute l’aide, le soutien qu’elles m’ont apporté durant ces dernières
années. Je les remercie d’avoir toujours assurer mes arrières, d’avoir toujours cru en moi et d’avoir été

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toujours présente dans les moments de joie, de peine ou de doute. Elles m’ont apporté un réconfort
tel que j’ai pu traverser de nombreuses épreuves. Merci pour tout !

Un remerciement tout particulier : à la famille CUGIER qui m’a soutenu et aidé tout au long de mon
parcours scolaire depuis mon enfance et qui sans eux, je n’aurais pas eu un si beau parcours ; à M.
FERRANT, mon professeur de science de la vie et de la terre qui m’a transmis sa passion pour la
biologie.

Je tiens également à remercier toute ma famille pour leurs encouragements, leur soutien, leur
affection mais surtout la patience dont ils ont fait preuve pendant toutes ses années de thèse. Je tiens
à remercier particulièrement mes cousines : Noémie COINTRE, Virginie COINTRE, Stella LOSBAR et
Mélanie POITOU pour tout leur soutien, leur affection et leur confiance qu’elles ont placé en moi
malgré mes nombreux doutes et pour tous nos moments de cousinade qui m’ont donné tant de fois le
sourire.

Et un grand merci à toutes les personnes qui ont participé à ma thèse (directement ou
indirectement) et que j'ai malencontreusement oublié de mentionner ci-dessus...

Merci pour cette incroyable aventure !

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Table des matières
Remerciements ................................................................................................................................................. 2
Liste des figures ................................................................................................................................................. 9
Liste des tables ................................................................................................................................................ 12
Lexique des abréviations ................................................................................................................................. 14
I Introduction générale .............................................................................................................................. 17
II Etudes bibliographiques .......................................................................................................................... 19
Bacillus subtilis ................................................................................................................................ 19
De la rhizosphère à Bacillus subtilis ........................................................................................ 19
Bacillus subtilis : un organisme modèle.................................................................................. 22
Bacillus subtilis et les biotechnologies ................................................................................... 23
Les antibiotiques, une classe d’antimicrobiens ............................................................................... 23
Classes d'antibiotiques ........................................................................................................... 24
Modes d’action des antibiotiques .......................................................................................... 28
Mécanismes de résistance aux antibiotiques ......................................................................... 36
Les flavonoïdes, produits naturels d'intérêt industriel ................................................................... 46
Flavonoïdes et médecine traditionnelle ................................................................................. 46
Biosynthèse et fonction des flavonoïdes ................................................................................ 47
Classification des flavonoïdes ................................................................................................. 50
Activités biologiques des flavonoïdes..................................................................................... 52
III Résultats .................................................................................................................................................. 60
Propriétés antibiotiques de la pinocembrine et de la naringénine ................................................. 60
Activité antibactérienne en milieu solide ............................................................................... 60
Test de toxicité vis-à-vis de B. subtilis .................................................................................... 63
Détermination du type d’antibiotique ................................................................................... 65
Etude de l’association de deux flavonoïdes ........................................................................... 67
Etude de la relation entre la structure et l’activité antibactérienne des flavonoïdes ..................... 73
Caractérisation d’une collection de flavonoïdes .................................................................... 73
Quantitative Structure-Activity Relationships (QSAR) ............................................................ 85
Recherche des déterminants moléculaires de la résistance aux flavonoïdes ................................. 91
Crible d’une collection de mutants en présence de flavonoïdes ........................................... 91
Etude du régulon LmrA/QdoR .............................................................................................. 101
Evolution adaptative en laboratoire de B. subtilis................................................................ 107
Régulation de l’expression génique en présence de différents flavonoïdes ................................. 114
Activité promotrice des gènes d’intérêt en présence de flavonoïdes .................................. 114
Etude globale de l’expression génique en réponse aux flavonoïdes .................................... 119
Comparaison des analyses transcriptomiques ciblée et globale .......................................... 140
IV Discussion .............................................................................................................................................. 144

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 Les flavonoïdes : un enjeu pour les biotechnologies et la santé ................................................... 144
Les flavonoïdes : des composés aux propriétés antimicrobiennes ...................................... 144
Identification de nouveaux flavonoïdes aux propriétés antibactériennes ........................... 145
Production de nouveaux flavonoïdes aux propriétés antibactériennes ............................... 146
Les flavonoïdes : des composés aux propriétés multiples chez l’homme ............................ 147
Mécanisme d’action des flavonoïdes en tant qu’antibactériens .................................................. 149
Mécanisme d’action potentiel via le régulon LmrA/QdoR ................................................... 149
Mécanismes d’action liés à la dérégulation des transports d’efflux multidrogues .............. 152
Mécanismes d’action liés aux dérégulations cellulaires et métaboliques ........................... 153
Mécanisme de résistance potentiel ..................................................................................... 155
V Matériels et Méthodes .......................................................................................................................... 157
Souches et milieux de culture ....................................................................................................... 157
Plasmides ...................................................................................................................................... 163
Composés chimiques ..................................................................................................................... 164
Techniques de biologie moléculaire .............................................................................................. 165
Réaction en chaîne par polymérase (PCR)............................................................................ 165
Purification des acides nucléiques........................................................................................ 174
Digestion enzymatique et ligation de plasmides .................................................................. 175
Assemblage de Gibson ......................................................................................................... 175
Quantification des ADN et ARN ............................................................................................ 176
Electrophorèse sur gel d’agarose ......................................................................................... 176
Transformation bactérienne ......................................................................................................... 177
Transformation d’Escherichia coli ........................................................................................ 177
Transformation de Bacillus subtilis ....................................................................................... 178
Construction de souches bactériennes ................................................................................ 178
Test de toxicité .............................................................................................................................. 179
Culture bactérienne et acquisition des données .................................................................. 179
Traitement des données ....................................................................................................... 180
Activité antibactérienne et propriété antibiotique des flavonoïdes ............................................. 183
L’antibiogramme via un test en goutte ................................................................................ 184
L’antibiogramme via un gradient de concentration ............................................................. 184
Test de viabilité .................................................................................................................... 185
Analyse transcriptomique ............................................................................................................. 185
Conditions de culture ........................................................................................................... 186
Broyage cellulaire mécanique .............................................................................................. 186
Extraction des ARNs ............................................................................................................. 186
Traitement à la DNase .......................................................................................................... 186
Contrôle qualité des ARN totaux .......................................................................................... 187

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 Evolution dirigée ........................................................................................................................... 187
VI Références ............................................................................................................................................. 189
VII Annexes .................................................................................................................................................. 206
Annexe 1 : Construction d’un châssis E. coli pour la production de naringénine ..................... 206
Voie de biosynthèse de la naringénine ................................................................................ 206
Construction du châssis E. coli pour la production de la naringénine. ................................. 208
Identification des séquences CHS pour sélectionner les enzymes avec une meilleure activité.
209
Annexe 2 : Séquences nucléotidiques codant les CHS commandées chez Twist: .................... 210
Annexe 3 : Structure des 18 flavonoïdes actifs ......................................................................... 216
Annexe 4 : Liste des flavonoïdes commandés chez Extrasynthèse :......................................... 217

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LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Décès imputables à la résistance aux antimicrobiens chaque année. .................................................. 17
Figure 2 : Pipeline design-build-test-learn (DBTL) appliqué au projet Metabolic Engineering Machine. ............. 18
Figure 3 : Morphologie de B. subtilis..................................................................................................................... 21
Figure 4 : Première observation de l’activité antibactérienne d’une molécule antibiotique par Fleming A.,
adapté de (Fleming 1980). ........................................................................................................................... 24
Figure 5 : Principales classes des antibiotiques. ................................................................................................... 26
Figure 6 : Structure moléculaire de deux nouveaux antibiotiques bactéricides. .................................................. 27
Figure 7 : Composition de la paroi et des membranes des bactéries à Gram positif et à Gram négatif. ............. 28
Figure 8 : Action du co-trimoxazole chez les bactéries (Amyes, Miles et al. 1996). ............................................. 31
Figure 9 : Vue d’ensemble du processus de traduction. ....................................................................................... 33
Figure 10 : Acquisition de la résistance aux antibiotiques (Alekshun and Levy 2007). ......................................... 37
Figure 11 : Structures de cinq familles de transporteurs d’efflux multidrogues adapté de (Du, van Veen et al.
2015). ........................................................................................................................................................... 40
Figure 12 : Hydrolyse d’un cycle β-lactame par une β-lactamase (Williams 1999). ............................................. 44
Figure 13 : Voie métabolique de la biosynthèse des flavonoïdes, adapté de (Winkel-Shirley 2001). .................. 49
Figure 14 : Structure du noyau flavane (Cushnie and Lamb 2005). ...................................................................... 50
Figure 15 : Structures moléculaires des principales classes de flavonoïdes. ........................................................ 51
Figure 16 : Différents mécanismes d’action supposés des flavonoïdes. ............................................................... 56
Figure 17 : Antibiogramme de la naringénine et de la pinocembrine en présence de B. subtilis BSB1................ 61
Figure 18: Antibiogramme de la naringénine et de la pinocembrine en présence de la souche B. subtilis
CS1 Δeps. ...................................................................................................................................................... 62
Figure 19 : Antibiogramme via un gradient de concentrations de la naringénine et de la pinocembrine. .......... 63
Figure 20 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis d'E. coli et de B. subtilis. ................................................... 65
Figure 21 : Caractérisation de l’activité bactéricide ou bactériostatique des flavonoïdes contre B. subtilis........ 66
Figure 22 : Réponses possibles à l’association de deux antibiotiques. ................................................................. 68
Figure 23 : Taux de croissance de B. subtilis en présence de naringénine et de la pinocembrine superposés aux
courbes dose-réponse de référence de naringénine et de pinocembrine. .................................................. 70
Figure 24 : Effet de l’association de la naringénine et de la pinocembrine par comparaison avec l’effet obtenu
avec le flavonoïde seul. ................................................................................................................................ 71
Figure 25 : Antibiogramme de la librairie de flavonoïdes en présence de B. subtilis BSB1. ................................. 78
Figure 26 : Antibiogramme via un gradient de concentration de la librairie de flavonoïdes en présence de B.
subtilis BSB1. ................................................................................................................................................ 81
Figure 27 : Workflow modulaire Knime pour l’analyse QSAR de toxicité des flavonoïdes envers B. subtilis. ...... 90
Figure 28 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis des souches BKK ΔbltD, ΔbmrR, ΔbmrU et ΔyvcD. ........... 95
Figure 29 : Tests de toxicité de la naringénine vis-à-vis des souches BKE et BKK. ................................................ 96

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Figure 30 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis des mutants B. subtilis sélectionnés (graphique semi-
logarithmique). ............................................................................................................................................. 99
Figure 31 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis des souches BSB1 ΔyfiS et ΔyfmP. .................................. 101
Figure 32 : Organisation du régulon LmrA/QdoR en présence de quercétine chez B. subtilis (adapté de (Hirooka
2014)). ........................................................................................................................................................ 101
Figure 33 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis des souches BKE ............................................................. 102
Figure 34 : Test de toxicité des doubles mutants B. subtilis. .............................................................................. 103
Figure 35 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis de B. subtilis BSB1 Phs yxaH. ........................................... 105
Figure 36 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis de B. subtilis BSB1 Phs lmrB (graphique semi-
logarithmique). ........................................................................................................................................... 106
Figure 37 : Test de toxicité de la naringénine vis-à-vis de la souche B. subtilis CS1 Δeps::ble (graphique semi-
logarithmique). ........................................................................................................................................... 108
Figure 38 : Evolution de la souche CS1 Δeps::ble en présence de naringénine à l’aide d’un fermenteur de
paillasse (Multifors II, Infors). ..................................................................................................................... 109
Figure 39 : Évolution adaptative en laboratoire de la souche CS1 Δeps en présence de naringénine. .............. 110
Figure 40 : Test de toxicité en présence de 90 mg.L-1 de naringénine de clones issus de l'expérience d'évolution
isolés du prélévement P3. .......................................................................................................................... 111
Figure 41 : Tests de toxicité des flavonoïdes les plus actifs vis-à-vis de B. subtilis. ............................................ 118
Figure 42 : Cinétiques des cultures de B. subtilis utilisées pour l’étude transcriptomique en présence et absence
de flavonoïdes. ........................................................................................................................................... 121
Figure 43: Table représentant le niveau d'expression des gènes dans la souche BSB1 en absence (WT) ou après
incubation en présence de 2’-hydroxyflavanone (2OHFlav), bavachine (Bavac), naringénine (Nar),
pinocembrine (Pino), résokaempférol (Resok) pendant 15 ou 60 minutes. .............................................. 124
Figure 44 : Diagramme de Venn.......................................................................................................................... 125
Figure 45 : Représentation schématique du métabolisme de B. subtilis adapté de (Hartig and Jahn 2012). .... 128
Figure 46 : Voies de synthèse et de dégradation du glutamate (Gunka and Commichau 2012). ....................... 131
Figure 47 : Voies de biosynthèse des acides gras (FAS II) et intégration des acides gras dans les phospholipides
(adaptée de (Diomande, Nguyen-The et al. 2015)). ................................................................................... 133
Figure 48 : Polymères d'acide techoïque localisés dans la paroi bactérienne, covalemment ancrés au
peptidoglycane (Brown, Santa Maria et al. 2013). ..................................................................................... 134
Figure 49 : Biosynthèse de l'acide téichoïque de la paroi bactérienne. .............................................................. 134
Figure 50: Représentation du transport des polymères de l'acide techoïque avec TagGH. ............................... 135
Figure 51 : Etapes de la biosynthèse du peptidoglycane (sous forme de monomère). ...................................... 136
Figure 52 : Régulation de la synthèse de (p)ppGpp et régulations transcriptionnelles qui en résultent chez les
bactéries Gram positif et Gram négatif (de (Planson, Sauveplane et al. 2020)). ....................................... 138
Figure 53 : Comparaison des structures des flavonols et des flavanones. ......................................................... 150
Figure 54 : Méthode d'assemblage de l'ADN via le kit HiFi NEBuilder (https://www.neb-online.fr/). ............... 176
Figure 55 : Structure d’une plaque 96 puits pour une expérience en LCA. ........................................................ 180

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Figure 56 : Courbes de croissance obtenues par le premier traitement MATLAB. ............................................. 181
Figure 57 : Traitement de données des courbes de croissance en log et cas d’exclusion. ................................. 182
Figure 58 : Rapport de contrôle qualité obtenu par le deuxième traitement de données. ................................ 182
Figure 59 : Test de toxicité d’un flavonoïde vis-à-vis de la souche d’intérêt. ..................................................... 183
Figure 60 : Etapes de fabrication d’un antibiogramme via un gradient de concentration. ................................ 185
Figure 61: Schéma du circuit de l’évolution en culture continue. ...................................................................... 188
Figure 62 : Voie de production de la naringénine chez E. coli. ........................................................................... 207
Figure 63 : Construction génétique de la voie de biosynthèse de la naringénine. ............................................. 207
Figure 64 : Représentation schématique de la construction du châssis E. coli pour la production de naringénine.
.................................................................................................................................................................... 208

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LISTE DES TABLES

Table 1 : Liste des inhibiteurs de la synthèse de la paroi cellulaire adaptée de (Amyes, Miles et al. 1996). ....... 29
Table 2 : Liste des inhibiteurs de la synthèse des folates adaptée de (Amyes, Miles et al. 1996). ....................... 30
Table 3 : Liste des inhibiteurs de la synthèse d’ADN adaptée de (Amyes, Miles et al. 1996). .............................. 32
Table 4 : Liste des inhibiteurs de la synthèse protéique adaptée de (Amyes, Miles et al. 1996). ........................ 34
Table 5 : Pour chaque famille d’antibiotiques, dates d’introduction des antibiotiques et d’apparition d’une
résistance. .................................................................................................................................................... 36
Table 6 : Transporteurs bactériens appartenant à la famille MATE, table adaptée de (Omote, Hiasa et al. 2006)
et (Kuroda and Tsuchiya 2009). .................................................................................................................... 43
Table 7 : Flavonoïdes ayant une activité antifongique (révisé par (Cushnie and Lamb 2005)). ............................ 53
Table 8 : Concentrations équivalentes en naringénine et pinocembrine pour chaque association de naringénine
et de pinocembrine. ..................................................................................................................................... 69
Table 9 : Effet de l’association de la naringénine et de la pinocembrine en comparaison avec l’effet obtenu par
le flavonoïde seul. ........................................................................................................................................ 72
Table 10 : Librairie des flavonoïdes utilisés dans cette étude et descriptif de leurs structures. .......................... 74
Table 11 : Récapitulatif du crible de la librairie des flavonoïdes par antibiogrammes avec gradients de
concentration des flavonoïdes. .................................................................................................................... 82
Table 12 : Concentrations minimales inhibitrices des 18 flavonoïdes toxiques contre B. subtilis. ....................... 85
Table 13 : Flavonoïdes et valeurs correspondantes utilisés pour le QSAR de toxicité envers B. subtilis. ............. 89
Table 14 : Librairie de 67 mutants B. subtilis. ....................................................................................................... 92
Table 15 : Gènes de B. subtilis impliqués dans la réponse aux flavonoïdes. ....................................................... 100
Table 16 : Liste des doubles et triples mutants B. subtilis. ................................................................................. 103
Table 17. Résultats de la comparaison des séquences de deux clones évolués contre le génome de CS1 Δeps.
.................................................................................................................................................................... 113
Table 18 : Liste des souches B. subtilis rapportrices de l'activité promotrice. .................................................... 114
Table 19 : Gammes de concentrations utilisées pour les 17 flavonoïdes actifs contre B. subtilis. ..................... 115
Table 20 : Résumé des cribles en LCA des souches B. subtilis rapportrices de l'activité promotrice en présence
de flavonoïdes. ........................................................................................................................................... 116
Table 21 : Comparaison de la MIC estimée sur gradients de flavonoïdes sur gélose et de l’IC 50 mesurées en
milieu liquide. ............................................................................................................................................. 119
Table 22 : Concentrations en flavonoïdes utilisées lors de l’étude transcriptomique. ....................................... 120
Table 23 : Contrôle qualité des ARNs totaux extraits des différents prélèvements effectués. .......................... 122
Table 24 : Nombre de gènes régulés (seuil ≥ 2) après 15 et 60 minutes d'incubation avec le flavonoïde. ........ 126
Table 25 : Nombre de gènes régulés après 15 minutes d'incubation avec le flavonoïde. .................................. 126
Table 26 : Résultat transcriptomique des gènes d’intérêt. ................................................................................. 142
Table 27 : Comparaison des résultats de transcriptomique avec ceux du LCA. .................................................. 143
Table 28 : Récapitulatif des modes d’action potentiels des cinq flavonoïdes principaux testés dans ce travail 151

12
Table 29 : Liste des souches utilisées au cours de cette étude. .......................................................................... 157
Table 30 : Milieux utilisées dans cette étude. ..................................................................................................... 161
Table 31 : Listes des antibiotiques utilisés dans cette étude. ............................................................................. 163
Table 32 : Listes des plasmides utilisées dans cette étude. ................................................................................ 163
Table 33 : Liste des oligonucléotides utilisés au cours cette étude. ................................................................... 166

13
LEXIQUE DES ABRÉVIATIONS

Abbreviations Full name

2OHFlav 2’-hydroxyflavanone
4CL 4-Coumarate-coenzyme A Lyase
ABC ATP-Binding Cassette
ADN Acide DésoxyriboNucléique
AMR AntiMicrobial Resistance
ANR Agence National de la Recherche
ARN Acide RiboNucléique
ARNm ARN messager
ARNt ARN de transfert
ATG Codon d’initiation
ATP Adenosine TriPhosphate
Bavac Bavachine
BSS Biologie des Systèmes et de Synthèse
C4H Cinnamique 4-Hydrolase
CEF CEFuroxime
CFU Colony-Forming Unit
CHI CHalcone Isomérase
CHS CHalcone Synthase
CYP CYtochrome P450
DAPI 4’,6-DiAmidino-2-PhenylIndole
DBTL Design-Build-Test-Learn
Ddl D-alanine:d-alanine ligase
DHFR DiHydroFolate Réductase
DMSO DiMéthylSulfOxyde
DPPC 1,2-DiPalmitoyl-L-a-PhosphatidylCholine
EFSA European Food Safety Authority
EtBr : Ethidium Bromide
FDA Food & Drug Administration
fMET N-formylméthionine
GRAS Generally Recognized As Safe
GTP Guanosine TriPhosphate
INRAE Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'alimentation et
l'Environnement
IS Insertion Sequence
Kan Kanamycine
LCA Live Cell Array
MATE Multidrug And Toxic compound Extrusion
MEM Metabolic Engineering Machine
MFS Major Facilitator Superfamily
MIC Minimal Inhibitory Concentration
mRFP monomeric Red Fluorescent Protein
 MRSA Methicillin-Eesistant Staphylococcus Aureus
NAG N-Acetyl-Glucosamine
NAM N-Acetyl-Muramique
Nar Naringénine
OMS Organisation Mondiale de la Santé
PABA acide p-aminobenzoïque
PAL Phénylalanine Ammonia Lyase
PCR Polymerase Chain Reaction
PFM Protéine de Fusion Membranaire
Pino Pinocembrine
PLP Protéines de Liaison des Pénicillines
POpe 1- palmitoyl-2-oleoyl-L-a-phosphatidylcholine
QPS Qualified Presumption of Safety
Resok Résokaempférol
RFCP Rhizobactéries Favorisant la Croissance des Plantes
RIN RNA Integrity Number
RND Résistance-Nodulation-Division cellulaire
RO Objectif de Recherche
ROS Reactive Oxygen Species
RSI Résistance Systémique Induite
sfGFP super folder Green Fluorescent Protein
SMR Small Multidrug Resistance
Spec Spectinomycine
SyBER Systems Biology for bacterial Engineering and Redesign
TAL Tyrosine Ammonia Lyase
THF TétraHydroFolate
TPP+ TetraPhenylPhosphonium
VIH Virus de l'Immunodéficience Humaine
WT Wild Type

Organisms and Plants

A. paniculata Nees Andrographis paniculata Nees
A. thaliana Arabidopsis thaliana
A. flavus Aspergillus flavus
A. tamarii Aspergillus tamarii
B. anthracis Bacillus anthracis
B. cereus Bacillus cereus
B. subtilis Bacillus subtilis
C. sinensis Camellia sinensis
C. albicans Candida albicans
C. angustifolia Vahl Cassia angustifolia Vahl
Cladosporium sp. Cladosporium species
C. sphaerospermum Cladosporium sphaerospermum
C. difficile Clostridium difficile
E. coli Escherichia coli

15
G. biloba Ginko biloba
G. inflata Glycyrrhiza inflata
L. amazonensis Leishmania amazonensis
L. monocytogenes Listeria monocytogenes
M. luteus Micrococcus luteus
N. nucefera Nelumbo nucefera
P. digitatum Penicillium digitatum
P. italicum Penicillium italicum
P. vulgaris Proteus vulgaris
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
S. baicalensis Georgi Scutellaria baicalensis Georgi
S. radix Scutellaria radix
S. rivularis Wall Scutellaria rivularis Wall
S. aureus Staphylococcus aureus
S. agalactiae Streptococcus agalactiae
S. mutans Streptococcus mutans
S. sobrinus Streptococcus sobrinus
T. viride Trichoderma viride
T. mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes
T. rubrum Trichophyton rubrum

16
I INTRODUCTION GENERALE

Les antibiotiques ont joué un rôle important dans la diminution de la mortalité due aux maladies
infectieuses, mais leur utilisation massive et répétée a entraîné l'émergence de souches
multirésistantes. Cette résistance aux antibiotiques est l'une des grandes menaces aujourd’hui pour la
santé humaine selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Si aucune mesure n'est prise, nous
ne disposerons plus d'une réponse thérapeutique adaptée contre les maladies infectieuses entrainant
ainsi la mort de millions de personnes (Figure 1). Parmi les bactéries impliquées dans la résistance aux
antibiotiques se trouvent les bactéries à Gram positif tel que Staphylococcus aureus résistant à la
méthiciline (famille des β-lactams), responsable de plus d’un tiers de toutes les infections
nosocomiales et hospitalières.

Figure 1 : Décès imputables à la résistance aux antimicrobiens chaque année.

En bleu, le nombre de décès de nos jours par les différentes causes suivantes : la résistance aux
antimicrobiens (AMR), le cancer, le choléra, le diabète, les maladies diarrhéiques, la rougeole, les
accidents de la route et le tétanos. En violet, une estimation du nombre de décès causé par la
résistance aux antimicrobiens en 2050 (O'Neill J., 2016).

Ainsi, l’un des enjeux de la recherche aujourd’hui est de découvrir de nouvelles molécules
antibiotiques permettant de lutter efficacement contre les bactéries multi-résistantes. Ces dernières
années, très peu de molécules antibiotiques ont été découvertes soit parce que le coût de production
de ces nouveaux composés est trop élevé, soit parce que les méthodes classiques utilisées (production
de composés actifs par synthèse ou hémisynthèse chimique) ne permettent pas d’explorer largement
les espaces chimiques pour la découverte et la production de nouvelles molécules antibiotiques.
Cependant, le couplage de la Biologie des Systèmes et de la Biologie de Synthèse (BSS) permet de
s’affranchir de ces problèmes et de trouver des solutions innovantes pour la découverte et la
production de nouveaux composées bioactifs.

Mon projet de thèse a été initié dans le cadre d’un financement par l’ANR du projet Metabolic
Engineering Machine basé sur ces deux approches (MEM ; ANR-15-CE21-0008 coordonné par Jean-
Loup Faulon, DR INRAE, MICALIS, Jouy-en-Josas, France). MEM propose de rationaliser l’ingénierie
métabolique en développant un cycle de conception, construction, caractérisation et apprentissage de
voies de biosynthèse d’antimicrobiens (Figure 2). Le projet MEM vise spécifiquement à construire un
châssis bactérien pour la production de flavonoïdes, composés d’intérêt industriel. Certains
flavonoïdes ont des propriétés antibactériennes spécifiques contre des bactéries à Gram positif. Mes
directeurs de thèse Matthieu Jules (PR AgroParisTech) et Anne-Gaëlle Planson (CR INRAE) sont
partenaires de MEM et nous avons construit mon travail de thèse pour répondre aux attentes du projet
MEM.

Figure 2 : Pipeline design-build-test-learn (DBTL) appliqué au projet Metabolic Engineering Machine.

Le pipeline sera utilisé pour quatre objectifs de recherche (RO). RO1 : DBTL sur les séquences
enzymatiques qui maximisent les titres de flavonoïdes ; RO2 : DBTL sur les niveaux d'expression
enzymatique pour augmenter le rendement du produit final et limiter l'accumulation de métabolites
intermédiaires ; RO3 : DBTL sur la régulation génétique au sein du génome de la souche châssis qui
maximise à la fois la croissance et les titres de flavonoïdes ; RO4 : DBTL sur les structures de flavonoïdes
maximisant la cytotoxicité envers les bactéries à Gram positif. Figure provenant de la proposition ANR-
15-CE21-0008.

18
 Mon travail de thèse pour la "découverte de nouvelles molécules antibiotiques et caractérisation
de leurs modes d’action" a pour but la caractérisation du ou des modes d'action antibactériens des
flavonoïdes afin d’identifier de nouveaux antibiotiques actifs à l’encontre de Bacillus subtilis, utilisé
comme organisme model des bactéries à Gram positif pour son caractère non pathogène, les
connaissances fondamentales disponibles sur son réseau génétique et métabolique et son réseau de
régulations et des outils génétiques disponibles pour la construction de banques de souches, de
plasmides et de promoteurs.

Des stratégies expérimentales ont ainsi été définies dans ce but et la première a été de caractériser
l’activité antibactérienne de deux flavonoïdes : la naringénine et la pinocembrine, deux précurseurs
pour la synthèse d'un grand nombre de dérivés de la famille des flavonoïdes. J’ai développé et mis en
place au sein du laboratoire une méthodologie de cribles efficaces et rapides appelée test de toxicité
afin d’évaluer l’activité antibactérienne des flavonoïdes via leur toxicité contre les bactéries à Gram
positif. Puis, mon travail a consisté à déterminer le ou les mode(s) d’action de l’activité antibactérienne
des flavonoïdes. A cette fin, différentes approches ont été utilisées telles que :

i) l'identification de nouveaux flavonoïdes actifs contre la bactérie à Gram positif

Bacillus subtilis,

ii) l'identification des gènes impliqués dans la réponse aux flavonoïdes via l’utilisation
d’une banque de mutants,

iii) l'obtention d’une souche de B. subtilis résistante aux flavonoïdes par évolution
dirigée,

iv) l'analyse de la réponse de B. subtilis en présence de différents flavonoïdes par

analyse transcriptomique.

II ETUDES BIBLIOGRAPHIQUES

Bacillus subtilis

De la rhizosphère à Bacillus subtilis

La rhizosphère est une région du sol enrichie par l’exsudat racinaire et par les micro-organismes du
sol. Parmi les micro-organismes vivant dans la rhizosphère, certains sont pathogènes pour les plantes
tandis que d’autres sont bénéfiques comme les Rhizobactéries Favorisant la Croissance des Plantes
(RFCP). Les RFCP colonisent les racines des plantes et aident la plante en augmentant sa croissance,
par exemple en permettant la fixation de l'azote dans les nodules racinaires (Bais, Park et al. 2004) ou
en réduisant les maladies (Lee, Kingston et al. 2012, Ali, Hameed et al. 2020). Les RFCP facilitent aussi
la disponibilité de nutriments tels que l’azote et le phosphore en cas de limitation des minéraux dans

19
l'environnement (Idriss, Makarewicz et al. 2002), et produisent des métabolites ou phytohormones
stimulant le développement de la plante (Gutiérrez-Mañero, Ramos-Solano et al. 2001, Idris, Iglesias
et al. 2007). Certaines espèces de Bacillus, comme B. subtilis (Figure 3), un bacille à Gram positif non
pathogène, sont des RFCP permettant d'améliorer considérablement la croissance des plantes (Ali,
Hameed et al. 2020) . B. subtilis appartient à la classe Bacilli de l’embranchement des Firmicutes
(constitué des trois classes principales : les Clostridia, les Mollicutes et les Bacilli (Wolf, Muller et al.
2004)), et appartient à la famille des Bacillaceae et au genre Bacillus. Cette rhizobactérie vivant dans
les couches supérieures du sol, est l’espèce bactérienne sporulante majoritaire dans la rhizosphère
(Fall, Kinsinger et al. 2004), et pousse autour des racines des plantes créant ainsi une symbiose entre
la plante et la bactérie.

En tant qu’agent de bio-contrôle (Gaskins, Albrecht et al. 1985, Stein 2005, Nagorska, Bikowski et
al. 2007, Haney, Samuel et al. 2015), Bacillus sp. permet au sein de la rhizosphère :

i) la protection de la plante contre les maladies causées par des pathogènes (bactéries ou
champignons) en produisant des agents antimicrobiens (Stein 2005),

ii) l’élimination de la concurrence avec d’autres microorganismes en produisant des biofilms

(Kumar, Lakshmanan et al. 2012) ou des enzymes de dégradations (Ochiai, Itoh et al. 2007),

iii) l’inhibition de l’activation du système immunitaire de l’hôte par résistance systémique

induite (RSI) pour faciliter la colonisation des rhizobactéries (Lakshmanan, Kitto et al. 2012).

Bacillus a ainsi été utilisé pour lutter contre la prédation et le parasitisme (Asaka and Shoda 1996,
Bais, Fall et al. 2004, Chen, Wang et al. 2010), et se révèle être un moyen efficace, écologique et
durable de lutte contre les agents phytopathogènes en remplacement des fongicides chimiques
(Shaikh and Sayyed 2015).

20
Figure 3 : Morphologie de B. subtilis.
(A) Colonies de B. subtilis sur milieu gélosé solide (LB) ; (B) Cellules de B. subtilis vues au microscope.

B. subtilis bénéficie en échange de composés organiques excrétés par les racines de plantes tels
que les sucres, les acides aminés, les lipides et autres métabolites secondaires. Ce type d’interaction
basée sur les nutriments a précisément été démontré pour B. subtilis FB15, qui est recruté comme
rhizobactérie bénéfique par Arabidopsis thaliana (A. thaliana) par la sécrétion de grandes quantités de
malate (Rudrappa, Czymmek et al. 2008). Cet exemple d’interaction est d’autant plus significatif que
le malate est de par la coévolution bactérie/plante devenu une source carbonée majeure pour B.
subtilis, équivalente au glucose. En effet, et comme pour le glucose, la présence de malate active la
répression catabolique et bloque l’utilisation des sources de carbone alternatives, à l’exception du
glucose lui-même avec lequel il est co-métabolisé (Kleijn, Buescher et al. 2010, Meyer, Jules et al. 2011,
Buescher, Liebermeister et al. 2012).

B. subtilis possède plusieurs stratégies adaptatives lui permettant de vivre dans des conditions
environnementales difficiles (i.e conditions de sécheresse ou de changements extrêmes de
température) (Earl, Losick et al. 2008). Par exemple, B. subtilis peut incorporer grâce à la compétence
naturelle (Anagnostopoulos and Spizizen 1961) du matériel génétique étranger qui sera utilisé comme
nutriments ou utilisé pour enrichir son patrimoine génétique. B. subtilis a également la capacité i) de
former des biofilms (Mielich-Suss and Lopez 2015) induits par des mécanismes moléculaires de type
quorum sensing permettant aux cellules de communiquer entre elles et de répondre rapidement aux
fluctuations environnementales, ii) de produire des antibiotiques pour lutter contre les attaques de
bactéries pathogènes (Kumar, Lakshmanan et al. 2012), et iii) de produire des endospores hautement
résistantes aux conditions extrêmes assurant sa survie « dans un état dormant » (Stephens 1998,
Higgins and Dworkin 2012). Au cours du processus de sporulation déclenché en cas de limitation en
nutriments, certaines cellules de B. subtilis produisent et exportent des facteurs induisant la lyse de
ses congénères, leur permettant de retarder la sporulation et d'accéder aux nutriments nécessaires à

21
leur croissance. Ce processus de cannibalisme permet aux cellules de n'entrer en sporulation qu'en cas
de limitation prolongée en nutriments (Gonzalez-Pastor, Hobbs et al. 2003).

Bacillus subtilis : un organisme modèle

En 1958, la compétence naturelle de B. subtilis 168, une souche non pathogène et auxotrophe pour
le tryptophane, a été décrite par John Spizizen (Spizizen 1958, Anagnostopoulos and Spizizen 1961).
Son génome complet de 4215 kb a été séquencé en 1997 (Kunst, Ogasawara et al. 1997) puis
reséquencé et réannoté en 2009 (Barbe, Cruveiller et al. 2009). Le génome de B. subtilis est composé
d’un faible pourcentage en bases guanine et en cytosine (43,5% GC) caractéristique de
l’embranchement des Firmicutes (Kunst, Ogasawara et al. 1997). B. subtilis a été largement étudié et
est considéré comme bactérie modèle (Sonenshein, Losick et al. 2002). Des études ont montré
qu’environ 260 gènes seulement sont essentiels à la croissance parmi les ~4100 gènes qui constituent
le génome de B. subtilis (Commichau, Pietack et al. 2013, Tanaka, Henry et al. 2013, Juhas, Reuss et al.
2014, Koo, Kritikos et al. 2017). De nombreuses connaissances ont été générées sur les réponses
adaptatives et les réseaux de régulation de B. subtilis (Buescher, Liebermeister et al. 2012),
l'identification de promoteurs et de signaux d’initiation de la traduction à travers un grand nombre de
conditions expérimentales (Nicolas, Mader et al. 2012, Borkowski, Goelzer et al. 2016), et à travers le
développement d'outils efficaces pour la construction de souches de B. subtilis (Tanaka, Henry et al.
2013). Notamment, une analyse transcriptomique de B. subtilis a été effectuée dans 104 conditions
différentes représentant les conditions nutritionnelles et environnementales que B. subtilis pourrait
rencontrer dans son habitat naturel (Nicolas, Mader et al. 2012). Des bases de données telles que
KEGG, Uniprot, PDB, ont pu ainsi être mises à jour grâce à différentes études de transcriptomique et
protéomique (Mader, Homuth et al. 2002, Otto, Bernhardt et al. 2010, Nicolas, Mader et al. 2012,
Kanehisa, Sato et al. 2016, Burley, Berman et al. 2017). La plateforme « SubtiWiki » a été créée par et
pour la communauté scientifique travaillant sur B. subtilis et regroupe les données obtenues sur les
gènes via la construction de banques de mutants et le séquençage du génome, les ARN messagers via
des études transcriptomiques, les protéines via des études de protéomique, etc. (Michna, Commichau
et al. 2014, Zhu and Stulke 2018).

Les études menées sur B. subtilis ont permis non seulement de comprendre la biologie
fondamentale chez d’autres bactéries à Gram positif phylogénétiquement proches comme les
bactéries pathogènes telles que Staphylococcus aureus ou Bacillus anthracis ; mais a aussi permis
d’élargir l’utilisation de B. subtilis dans l’industrie notamment en ouvrant la voie à des approches
innovantes de biologie de synthèse.

22
 Bacillus subtilis et les biotechnologies

B. subtilis est largement utilisé dans l’industrie (van Dijl and Hecker 2013, Cui, Han et al. 2018) grâce
notamment à son statut Generally Recognized As Safe (GRAS) attribué par la Food & Drug
Administration (FDA) des États-Unis, et est considéré par la European Food Safety Authority (EFSA)
comme pouvant bénéficier du statut Qualified Presumption of Safety (QPS). B. subtilis est par exemple
utilisé dans l’industrie agroalimentaire dans la fabrication du nattô, un plat traditionnel japonais à base
de soja fermenté. La capacité des espèces Bacillus à sécréter en très large quantité des composés,
métabolites ou protéines de l’ordre du g.L-1 a permis à l’industrie d’utiliser les espèces Bacillus comme
châssis (Westers, Westers et al. 2004, van Dijl and Hecker 2013) pour la production industrielle de
vitamines (Commichau, Alzinger et al. 2014), de protéases, d’amylases (Cao, van Heel et al. 2017), de
cellulases ou d’antibiotiques tels que la bacitracine (Wu, Cai et al. 2019 , Zhu, Cai et al. 2019) et la
polymyxine (Park, Choi et al. 2012 , Kim, Park et al. 2015). Des souches optimisées de B. subtilis ont
aussi été construites afin d’obtenir des usines cellulaires répondant à un besoin précis (Zhang and
Zhang 2010, Li, Wen et al. 2011, Zhang, Sathitsuksanoh et al. 2011, van Dijl and Hecker 2013). Par
exemple, une souche de B. subtilis surproduisant l’acétolactate synthase a été utilisée comme usine
cellulaire pour améliorer la production d’isobutanol en fermentation discontinue (Li, Wen et al. 2011).

Grâce aux nombreuses connaissances acquises et au développement d’outils et de matériels

génétiques sur l’organisme modèle des bactéries à Gram positif, B. subtilis est devenu un excellent
candidat pour le développement d’un châssis minimal dans lequel il est possible d’optimiser
précisément les circuits métaboliques (Reuss, Commichau et al. 2016). Des séquences de gènes et
d’intervalles non essentiels ont été éliminées avec succès dans la souche B. subtilis pour construire des
souches ayant un génome réduit pour des applications industrielles ciblées. C’est le cas de la souche
B. subtilis PG10 avec une réduction de 36% de son génome (Reuss, Commichau et al. 2016). Il a été
démontré dans l’étude de (Aguilar Suarez, Stulke et al. 2019) que la souche minimale PG10 est capable
de produire quatre antigènes staphylococciques différents en contournant plusieurs goulots
d’étranglements alors que la souche B. subtilis sauvage ne peut les produire.

Les antibiotiques, une classe d’antimicrobiens

Les antimicrobiens sont une famille de molécules ayant une activité microbicide (molécule tuant
les microbes) ou une activité microbiostatique (molécule ralentissant la croissance des microbes).
Parmi ces antimicrobiens, on retrouve des molécules qui visent les bactéries (molécules ayant une
activité antibactérienne), les virus (molécules ayant une activité antivirale), les parasites (molécules
ayant une activité antiparasitaire), ou les mycètes (molécules ayant une activité antimycosique).

23
 Classes d'antibiotiques

Les antibiotiques sont une classe d’antimicrobiens composée de plus de 10 000 molécules. Ce sont
des molécules principalement naturelles qui bloquent la croissance des bactéries (bactériostatique) ou
qui les tuent (bactéricide) et qui possèdent une toxicité sélective, c’est-à-dire qu’un antibiotique est
toxique pour les bactéries mais n’affecte pas l’hôte aux concentrations utilisées. L’activité
bactériostatique ou bactéricide peut être concentration-dépendante selon les molécules. En effet,
certaines molécules peuvent présenter un profil bactériostatique pour des concentrations faibles et
un profil bactéricide pour des concentrations fortes (Spizek and Rezanka 2017).

Le tout premier antibiotique identifié fut la pénicilline découverte par Alexander Fleming en 1928
qui a observé un halo autour de la colonie de Penicillium notatum (P. notatum, Figure 4). Le halo est
dû à l’activité antibactérienne de la pénicilline, molécule produite par P. notatum et inhibant ainsi la
croissance de colonies de Staphylococcus.

Figure 4 : Première observation de l’activité antibactérienne d’une molécule antibiotique par

Fleming A., adapté de (Fleming 1980).
(A) Photographie d’une culture de Staphylococcus en présence d’une colonie de Penicillium notatum
sur une boîte de Pétri ; (B) Représentation schématique de la boîte de Pétri.

Grâce à cette découverte, une communauté scientifique s’est construite ayant pour but la
recherche de molécules antibiotiques permettant le traitement de maladies infectieuses. A partir des
différentes études effectuées, les antibiotiques ont été classés en sous-groupes selon leurs modes
d’action et leurs similarités structurales (Figure 5).

Ainsi, il existe des sous-groupes d’antibiotiques capables d'inhiber la synthèse de la paroi cellulaire
notamment en ciblant la synthèse du peptidoglycane (les béta-lactamines : molécules ayant un cycle
béta-lactame (e.g. pénicilline), les glycopeptides : peptides ayant des glycanes (e.g. vancomycine), et

24
les polypeptides : chaîne de plus de 50 acides aminés reliés par des liaisons peptidiques (e.g.
bacitracine)). D’autres vont inhiber la synthèse des folates (les sulfamides : molécules dérivées de la
sulfanilamide qui ciblent la synthèse de l’acide folique), la synthèse des acides nucléiques (les
quinolones : molécules dérivées de l’acide nalidixique (e.g. norfloxacine)), la synthèse protéique en se
fixant sur la petite sous-unité du ribosome (les aminosides : sucres avec une fonction amine (e.g.
spectinomycine), les cyclines : molécules composées de 4 cycles benzéniques accolés (e.g.
tétracycline)) ou en se fixant sur la grande sous-unité du ribosome (les macrolides : molécules ayant
des macrocycles de lactone associés à des sucres neutres ou aminés (e.g. érythromycine A), les
phénicols : molécules possédant une fonction phénylpropanoïde (e.g. chloramphénicol), les
oxazolidinones : molécules constituées d’un cycle à 5 carbones contenant une fonction oxo, un atome
d’oxygène et un atome d’azote (e.g. linézolide)) (Figure 5).

25
Figure 5 : Principales classes des antibiotiques.
Antibiotiques classés selon leurs modes d’action (indiqué en gris) et leurs structures. Les classes d’antibiotiques ayant une activité bactériostatique sont
représentées en bordeaux et ceux ayant une activité bactéricide en bleu.

26
 On retrouve aussi les nitrofuranes et nitroimidazoles : molécules ayant un groupement nitro
respectivement fixé sur un cycle furanique (e.g. nitrofurantoïne) ou sur chaque imidazole
hétérocyclique (e.g. métronidazole) qui provoque des coupures au sein de l’acide désoxyribonucléique
(ADN) bactérien.

De nouvelles classes de molécules au pouvoir antibiotique continuent d'être découvertes. A titre

d’exemple, une nouvelle molécule a été découverte en 2004 par l’équipe de K. Sekimizu et M. Inoue
(Université de Tokyo, JAPON) nommé lysocine E (Figure 6A) (Hamamoto, Urai et al. 2015). Cette
molécule possède une structure complexe qui interagit avec la ménaquinone, autrement appelée
vitamine K (molécule présente dans les membranes bactériennes) entraînant la mort cellulaire. Au
cours de ces dernières années, le développement de nouvelles techniques pour la découverte et le
développement de nouveaux antibiotiques a connu un essor mondial. Ainsi, de nouveaux antibiotiques
ont été découverts par le biais de ces différentes techniques dont le deep learning (méthode
d’apprentissage reposant sur des couches de réseaux de neurones). L’équipe de J.J. Collins (MIT -
Harvard, USA) a ainsi identifié huit composés antibactériens qui sont structurellement éloignés des
antibiotiques connus en utilisant un modèle de deep learning (Stokes, Yang et al. 2020). Parmi ces huit
composés, se trouve l’halicine (Figure 6B) qui séquestre le fer à l’intérieur des bactéries. Cette
séquestration perturbe l’équilibre et le maintien du pH au sein de la membrane cellulaire provoquant
ainsi la mort des bactéries. La lysocine E et l’halicine possédant des mécanismes d’action différents par
rapport aux antibiotiques déjà existants, ont conduit à la création de nouvelles classes d’antibiotiques.

Figure 6 : Structure moléculaire de deux nouveaux antibiotiques bactéricides.

(A) Lysocine E, molécule découverte en 2004 ; (B) Halicine, molécule découverte en 2019.

27
 Modes d’action des antibiotiques

Les modes d’action des antibiotiques ciblent une étape essentielle pour la survie de la cellule. On
retrouve cinq grands modes d’action.

II.2.2.1 Inhibition de la synthèse de la paroi cellulaire

Les antibiotiques ciblent de manière différente les bactéries à Gram positif et à Gram négatif du fait
de la structure de leur membrane et paroi cellulaire. Les bactéries sont en effet classées en deux
catégories grâce à la coloration de Gram (bactéries à Gram positif ou négatif). Les bactéries à Gram
positif possèdent une paroi épaisse constituée de plusieurs couches de peptidoglycanes et d’acides
teichoïques tandis que les bactéries à Gram négatif possèdent une paroi mince constituée de quelques
couches de peptidoglycanes qui est entourée d’une membrane lipidique externe (Figure 7).

Figure 7 : Composition de la paroi et des membranes des bactéries à Gram positif et à Gram négatif.
Bactérie Gram positif : cas de Micrococcus luteus, possède une paroi cellulaire composée de
peptidoglycanes et d’acides téichoïques et une membrane plasmique. Bactérie à Gram négatif : cas
d’Escherichia coli (E. coli), possède une paroi cellulaire composée d’une membrane lipidique externe,
d’une fine couche de peptidoglycane, et une membrane plasmique (Stanley Illustration).

La biosynthèse du peptidoglycane se réalise en 3 étapes : i) biosynthèse des précurseurs

nucléotidiques de l’uridine, ii) polymérisation et structuration des brins de peptidoglycane et
iii) transpeptidisation. Les catégories d’inhibiteurs bloquant la synthèse de la paroi se composent des
glycopeptides (e.g. vancomycine), des polypeptides (e.g. bacitracine), et des β-lactamines (e.g.
pénicillines, céphalosporines) et sont détaillées en Table 1.

28
Table 1 : Liste des inhibiteurs de la synthèse de la paroi cellulaire adaptée de (Amyes, Miles et al.
1996).

Antibiotic class Representative compound Metabolic effect

Β-lactams
Benzylpenicillins Penicillin G Bactericidal
Phenoxypenicillins Penicillin V Bactericidal
Penicillinase-resistant penicillins Methicillin Bactericidal
Aminopenicillins Ampicillin Bactericidal
Carbopenicillins Carbenicillin Bactericidal
Uredopenicillins Piperacillin Bactericidal
Cephalosporins
1st generation Cefazolin Bactericidal
2nd generation Cefaclor Bactericidal
3rd generation Ceftriaxone Bactericidal
4th generation Cefpirome Bactericidal
5th generation Ceftaroline Bactericidal
Others agents
Polypeptides Bacitracin Bactericidal
Glycopeptides Vancomycin Bactericidal

La vancomycine se fixe sur les extrémités peptidyl D-Ala-D-Ala des précurseurs lipopeptidiques
(deuxième étape de la biosynthèse de la paroi cellulaire), et inhibe la polymérisation de l’acide N-
acétyl-muramique (NAM) et du N-acétyl-glucosamine (NAG) en peptidoglycane par l’enzyme
peptidoglycane synthétase (Sheldrick, Jones et al. 1978 , Reynolds 1989).

La bacitracine inhibe la déphosphorylation du pyrophosphate de deux lipides : le C55-isoprenyle et

le bactoprénol (Stone and Strominger 1971) qui ont pour fonction de transporter des éléments
nécessaires à la synthèse du peptidoglycane à l’extérieur de la membrane interne.

Les β-lactamines dont l’intégrité du cycle β-lactame est cruciale pour son activité antibactérienne,
ont une structure similaire à l’extrémité D-Ala-D-Ala des pentapeptides de la paroi et se lient de
manière covalente au site actif des enzymes transpeptidases (appelés aussi protéines de liaison des
pénicillines (PLP)), inhibant ainsi leur activité dans l’étape de transpeptidisation (réticulation des brins
de peptidoglycane : création des liaisons par des chaînes latérales peptidiques) (Yocum, Waxman et al.
1979).

II.2.2.2 Dégradation de la membrane plasmique

La membrane plasmique possède quatre grands rôles : elle permet i) le maintien des métabolites à
l’intérieur de la cellule, ii) la communication intracellulaire, iii) l’adhérence des cellules et iv) le
transport de molécules. Ces fonctions sont nécessaires au bon fonctionnement de la cellule. Une

29
perturbation de la perméabilité de la membrane peut être causée par certains antibiotiques comme
ceux de la famille des polymyxines, la lysocine E ou encore la gramidicine et provoquer la mort des
bactéries. La lysocine E interagit avec un élément de la membrane appelé ménaquinone, plus connu
sous le nom de vitamine K2. Cette interaction entraîne une perturbation de la perméabilité
membranaire et in fine la destruction des cellules (Hamamoto, Urai et al. 2015).

II.2.2.3 Inhibition de la synthèse des folates

Les folates, plus connus sous le nom d’acide folique ou vitamine B9 sont des précurseurs
métaboliques du coenzyme tétrahydrofolate (THF), et sont impliqués après incorporation d’un groupe
méthylène dans la synthèse de bases nucléiques (purines et pyrimidines) et d’acides aminés (Crider,
Yang et al. 2012). Deux familles d’antibiotiques bactériostatiques, les sulfamides et les
diaminopyrimidines, agissent sur la voie de biosynthèse de l’acide folique via des mécanismes
d’inhibition compétitive (Table 2).

Table 2 : Liste des inhibiteurs de la synthèse des folates adaptée de (Amyes, Miles et al. 1996).

Antibiotic class Representative coumpound Metabolic effect

Sulfonamides Sulphamethoxazole Bacteriostatic
Diaminopyrimidines Trimetroprim Bacteriostatic
Combinations Co-trimoxazole Bactericidal

Les sulfamides tels que les sulfanilamides sont des analogues structurels de l’acide p-
aminobenzoïque (PABA). Les sulfamides inhibent la dihydroptéroate synthase qui catalyse la
condensation du 6-hydroxyméthyl-7,8-dihydroptéridine pyrophosphate à PABA pour former le 7,8-
dihydroptéroate (Figure 8). En effet, la réaction catalysée de la dihydroptéroate synthase avec les
sulfanilamides comme substrats au lieu de PABA produit un composé inactif inutilisable pour la
synthèse du dihydrofolate par la cellule provoquant ainsi une carence en bases nucléiques. Les
triméthoprimes inhibent la dihydrofolate réductase (DHFR) bactérienne qui catalyse la réduction du
dihydrofolate en tétrahydrofolate. L’association de deux antibiotiques, le sulfaméthoxazole (famille
des sulfamides) et le triméthoprime (famille des diaminopyrimidines), appelée co-trimoxazole possède
une activité bactéricide et rend l’inhibition de la synthèse de l’acide folique et donc l’inhibition de la
croissance bactérienne plus efficace. Le sulfaméthoxazole et le triméthoprime agissent en synergie par
blocage simultané de l’activité de deux enzymes de la voie métabolique des folates (Figure 8).

30
Figure 8 : Action du co-trimoxazole chez les bactéries (Amyes, Miles et al. 1996).
Voie de synthèse de l’acide tétrahydrofolique à partir de la ptéridine et de l’acide p-aminobenzoïque
(PABA) en orange. Composants du co-trimoxazole agissant à différents niveaux dans la voie de
synthèse représentés en vert.

II.2.2.4 Inhibition de la synthèse des acides nucléiques

La synthèse des acides nucléiques (ADN et ARN) est une étape essentielle pour la survie des cellules
et nombreux sont les composés interférant ou bloquant les voies de biosynthèse des acides
nucléiques.

• Inhibition de la synthèse de l'acide désoxyribonucléique (ADN)

L’ADN chromosomique bactérien est une double hélice circulaire, et est constitué d’acides
désoxyribonucléiques contenant toute l’information génétique nécessaire au développement, au
fonctionnement et à la reproduction des cellules. Lors de la réplication, la topoisomérase IV et la gyrase
(enzyme tétramérique composé de deux sous-unités GyrA et deux sous-unités GyrB) possèdent des
fonctions bien distinctes : la gyrase permet de convertir les supertours positifs en supertours négatifs
permettant ainsi le surenroulement de l’ADN tandis que la topoisomérase IV permet l’élimination des
noeuds. Ces topoisomérases peuvent aussi générer des cassures en réponse à un stress (Atkin, Raimer
et al. 2019). Les antibiotiques de la classe des aminocoumarines, des quinolones (Table 3) et ses
dérivés tels que les fluoroquinolones bloquent l’activité des topoisomérases II. Les sous-unités GyrA
sont inactivées par la famille des quinolones (ex. acide oxolinique ou nalidixique), tandis que les sous-

31
unités GyrB sont inactivées par la famille des aminocoumarines. Les fluoroquinolones quant à elles
interagissent avec les deux sous-unités de la gyrase.

Table 3 : Liste des inhibiteurs de la synthèse d’ADN adaptée de (Amyes, Miles et al. 1996).

Antibiotic class Representative coumpound Metabolic effect

Aminocoumarines Novobiocin Bacteriostatic
Quinolones Nalidixic acid Concentration-dependent
Fluoroquinolones Ciprofloxacin Bactericidal
Nitroimidazoles Metronidazole Bactericidal

Cas des quinolones : ces molécules antibactériennes se fixent sur le site actif de l’enzyme et
s’intercalent dans l’ADN lors de la réplication. Cette intercalation est appelée complexe de clivage
enzyme-ADN. Lorsque les fourches de réplication ou autres éléments entrent en collision avec ces
complexes, le réassemblage des brins d’ADN est interrompu et l’activité de surenroulement de la
gyrase est inhibée provoquant des cassures irréversibles de l’ADN et entraînant la mort cellulaire
(Aldred, Kerns et al. 2014).

• Inhibition de la synthèse des acides ribonucléiques (ARN)

Les ARNs sont des polymères linéaires de ribonucléotides produits lors de la transcription par les
ARN polymérases. Ils sont essentiels pour la production de protéines nécessaires à la cellule. Parmi les
antibiotiques qui inhibent l’ARN polymérase et bloquent la transcription, nous pouvons citer la
rifampicine largement utilisée dans le traitement de la tuberculose. La rifampicine inhibe l’ARN
polymérase en se liant directement sur un site adjacent au centre actif, bloquant physiquement la
formation de la deuxième ou troisième liaison phosphodiester dans le squelette de l’ARN produisant
des ARNs d’une longueur maximale de 2 à 3 nucléotides (Hartmann, Honikel et al. 1967, McClure and
Cech 1978).

II.2.2.5 Inhibition de la synthèse protéique

Les protéines résultent de la traduction des ARN messagers (ARNm) par les ribosomes (i.e. synthèse
protéique). Le ribosome bactérien est constitué de la grande sous unité 50S et de la petite sous-unité
30S, et possède trois sites essentiels à la traduction : les sites A, P et E (Figure 9). Tout comme les
processus de réplication et de transcription, la traduction peut être divisée en trois phases principales.

i) Initiation : cette étape marque le début de la biosynthèse d’une chaîne polypeptidique et

commence au niveau du premier codon codant pour la N-formylméthionine (fMet). Trois facteurs
d’initiation (IF1, IF2 et IF3) s’associent à la petite sous-unité 30S et interviennent dans la formation

32
 du complexe ternaire entre la petite sous-unité 30S, l’ARNm et l’ARN de transfert (ARNt). IF1 se fixe
au site A contribuant ainsi à la fixation de l’ARNt sur le site P du ribosome. Le facteur IF2 fixé à la
guanosine triphosphate (GTP) entraîne le complexe ternaire sur le site P. Le facteur IF3 après
vérification du complexe ternaire se dissocie de celui-ci. Puis suite à la fixation du premier ARNt sur
le site P, IF1 se dissocie du site A, entraînant le recrutement de la grande sous-unité 50S. L’hydrolyse
du GTP permet la libération de facteur IF2 et la phase d’élongation peut ainsi commencer.

Figure 9 : Vue d’ensemble du processus de traduction.

La traduction est constituée de trois étapes : l’initiation (), l’élongation () et la terminaison ().
 : Le ribosome (bleu), constitué de deux sous-unités : 50S (large) et 30S (small), débute la traduction
avec un complexe ternaire (tRNA, jaune) porteur du premier acide aminé (AA1, violet) qui reconnaît le
codon d’initiation (AUG, séquence en vert) sur un ARN messager (mRNA, 5’ ➔ 3’, séquence en rose).
 : Ajout de manière séquentielle des acides aminés (AA2, AA3, etc.) selon la séquence du mRNA par
les tRNA formant une chaîne polypeptidique.  : Un facteur de terminaison (release factor, rouge)
reconnaît le codon stop (UAG, séquence en rouge) provoquant la dissociation du complexe ribosome-
tRNA du mRNA et libérant ainsi la chaîne polypeptidique complète.

ii) Elongation : cette étape consiste à synthétiser la chaîne polypeptidique en parcourant le brin
d’ARNm. Pour cela, des facteurs d’élongation interviennent pour aider le ribosome dans sa
progression. En effet, pendant l’élongation, c’est le facteur EF-Tu qui permet le recrutement d’un
aminoacyl-ARNt et catalyse la liaison au site A du ribosome en tirant son énergie de l’hydrolyse du
GTP. Le facteur EF-G (translocase) catalyse ensuite la translocation du peptidyl-ARNt du site A vers
le site P et l’ARNt du site P est déplacé vers le site E. Cette étape de translocation est couplée à

33
 l'hydrolyse du GTP fixé à EF-G. L’ARNt au site E est libéré et le ribosome se déplace d’un codon. Le
site A du ribosome est ainsi prêt à accueillir un nouvel aminoacyl-ARNt. Ce cycle est répété jusqu’à
ce que le codon stop soit atteint.

iii) Terminaison : cette étape permet de stopper la traduction. En effet, une fois que le ribosome
rencontre un codon stop, le facteur de terminaison RF1 ou RF2 reconnaît la séquence et se
positionne sur le codon inhibant ainsi le recrutement d’un ARNt. Le facteur RF3 se fixe ensuite sur
le site A du ribosome et catalyse l’hydrolyse du GTP provoquant la dissociation du ribosome. Cette
hydrolyse permet la libération de la protéine et le recyclage du ribosome pour une nouvelle
synthèse protéique.

Ce processus essentiel pour la survie des cellules est la cible de nombreux groupes d’antibiotiques
(Table 4).

Table 4 : Liste des inhibiteurs de la synthèse protéique adaptée de (Amyes, Miles et al. 1996).

Antibiotic class Representative coumpound Metabolic effect

Aminoglycosides Streptomycin Bactericidal
Macrolides Erythromycin Bacteriostatic
Cyclines Tetracyclin Bacteriostatic
Amphenicol Chloramphenicol Bacteriostatic
Oxazolidinones Linezolid Bacteriostatic
Lyncomycins Lincomycin Bacteriostatic

Les différents groupes d’antibiotiques inhibent pour la plupart la traduction en se fixant sur une des
deux sous-unités du ribosome (30S et/ou 50S). Les différents inhibiteurs de la traduction ont des
structures chimiques et modes d’action différents.

• Les inhibiteurs de la petite sous-unité ribosomique

La famille des aminoglycosides comprend la streptomycine, la néomycine ou encore la kanamycine

qui se fixent à la sous-unité ribosomique 30S. L’interaction des aminoglycosides avec le ribosome
bactérien produit trois effets toxiques sur la bactérie : la perturbation de la perméabilité de la
membrane, une inhibition de la synthèse des acides nucléiques (ADN et ARN) et une lecture erronée
de l’ARNm entraînant un arrêt complet de la traduction ou la production de protéines erronées (Davis
1987). Par exemple, la streptomycine, antibiotique bactéricide, interagit avec l’ARN ribosomique 16S
de la sous-unité ribosomique 30S et interfère avec la liaison de l’ARNt de la N-formylméthionine à la
sous-unité 30S. Le complexe ternaire (ribosome-ARNm-streptomycine) bloque ainsi l’initiation de la
traduction (Luzzatto, Apirion et al. 1968).

34
 Dans la famille des tétracyclines (tétracycline et ses dérivés), la tétracycline, antibiotique
bactériostatique, se fixe sur le site A de la sous-unité 30S du ribosome bactérien et inhibe la fixation
de l’aminoacyl-ARNt bloquant l’addition de nouveaux acides aminés à la chaîne peptidique (Vazquez
1974).

• Les inhibiteurs de la grande sous-unité ribosomique

Les macrolides (molécules ayant des macrocycles de lactone contenant 14, 15 ou 16 atomes et
associés à des sucres), comme l’érythromycine, sont des inhibiteurs du domaine peptidyl-transférase
et bloquent la synthèse protéique par encombrement stérique. L’érythromycine, antibiotique
généralement bactériostatique (dose-dépendant), se fixe sur le site P et inhibe la translocation du
ribosome en perturbant l’association du peptidyl-ARNt à la grande sous-unité 50S durant l’élongation
(Alvarez-Elcoro and Enzler 1999).

Les phénicols (ex. chloramphénicol) inhibent la peptidyl-transférase de la grande sous-unité

empêchant ainsi la liaison peptidique. Le chloramphénicol, antibiotique bactériostatique, inhibe
l’activité de la peptidyl-transférase en se fixant directement sur le brin d’ARNr 23S de la grande sous-
unité (Pathak, Mondal et al. 2017).

Les lincosamides comprennent la lincomycine et son dérivé la clindamycine, et se fixent sur le

même site que les macrolides mais leurs effets sont différents. Les lincosamides empêchent l’initiation
de la formation de la chaîne peptidique. La lincomycine, antibiotique généralement bactériostatique
(dose-dépendant), se fixe sur la grande sous-unité 50S et possède trois effets différents sur l’inhibition
de la synthèse protéique :

i) inhibition de la fixation des deux sous-unités ribosomiques 30S et 50S (Kirillov, Porse et al. 1999),

ii) inhibition de la fixation des ARNt sur les sites A et P de la grande sous-unité 50S inhibant la
formation des liaisons peptidiques,

iii) inhibition de la formation du ribosome en se fixant sur le brin 23S de la grande sous-unité (Spizek
and Rezanka 2004).

En définitive, de nombreux et différents effets d’inhibition de la synthèse protéique sont possibles

grâce à une forte diversité structurale d’un grand nombre de molécules antibiotiques avec différents
mécanismes d’action.

35
 Mécanismes de résistance aux antibiotiques

L’émergence de la résistance aux antibiotiques a engendré de nombreux problèmes au sein des

hôpitaux, notamment dans la prévention d’infection post-opératoire (ex : transplantation) ou le
traitement de maladies infectieuses. En effet, des bactéries résistantes ont été découvertes peu de
temps après l’introduction sur le marché de l’antibiotique en question (Table 5). La résistance à un
antibiotique peut être soit intrinsèque soit acquise. La résistance intrinsèque est généralement
présente chez les bactéries productrices d’antibiotiques permettant l’élimination d’une compétition
au sein d’un même environnement avec d’autres bactéries. Ces bactéries productrices ont ainsi
développé des mécanismes de résistance pour ne pas subir l’effet de leur propre antibiotique. La
résistance acquise quant à elle, est présente chez les bactéries qui étaient sensibles à l’origine pour un
antibiotique donné.

Table 5 : Pour chaque famille d’antibiotiques, dates d’introduction des antibiotiques et d’apparition
d’une résistance.

Antibiotic Discovery year Emergence year of Source

resistance
Sulfonamides 1930s 1940s (Palumbi 2001)
Penicillin 1943 1946 (Palumbi 2001)
Streptomycin 1943 1959 (Palumbi 2001)
Chloramphenicol 1947 1959 (Palumbi 2001)
Tetracycline 1948 1953 (Palumbi 2001)
Erythromycin 1952 1988 (Palumbi 2001)
Vancomycin 1956 1988 (Palumbi 2001)
Methicillin 1960 1961 (Palumbi 2001)
Ampicillin 1961 1973 (Palumbi 2001)
Cephalosporins 1960s Late 1960s (Palumbi 2001)
Ciprofloxacin 1987 2006 (Robicsek, Jacoby et al.
2006)

Mécanismes génétiques d’acquisition de la résistance aux antibiotiques

Les bactéries à l’origine sensible acquièrent une résistance suite à une mutation (ponctuelle ou
délétion) dans le chromosome ou par transfert horizontal de gènes à partir d’ADN hétérologue (Figure
10, (Alekshun and Levy 2007)). Les différents cas sont détaillés dans les sections suivantes.

36
Figure 10 : Acquisition de la résistance aux antibiotiques (Alekshun and Levy 2007).
L’acquisition de la résistance i) par transformation : un ADN exogène portant la résistance Abr intègre
le chromosome bactérien par compétence naturelle et recombinaison, ii) par transduction : l’ADN
exogène est transduit au sein de la bactérie via un bactériophage et est transposé dans le
chromosome, iii) par conjugaison : la cassette de résistance Abr est transmise d’une bactérie donneuse
à une receveuse, iv) par mutation : la résistance est acquise par une mutation au sein du chromosome
bactérien.

II.2.3.1 Mutation et sélection chromosomique

La résistance dite « chromosomique » est un phénomène rare qui est acquis par une mutation
spontanée dans le chromosome bactérien (Figure 10). Cette résistance acquise par la bactérie est
révélée en présence de l’antibiotique par la sélection de ceux qui possèdent la mutation et par la
destruction des bactéries sensibles. Cette mutation peut provoquer soit une modification du rôle de
la protéine soit une inhibition de celle-ci ou contribuer à l’acquisition de la résistance. La rifampicine
est un antibiotique historiquement utilisé pour quantifier le taux de mutation spontanée chez les
bactéries (Matic, Radman et al. 1997). En effet, les mutations ponctuelles conférant la résistance à cet
antibiotique ont été caractérisées, et sont par exemple considérées comme étant au nombre de 4 chez
B. subtilis, toutes localisées au sein du gène rpoB codant la sous-unité β de l’ARN polymerase, chacune
entraînant une modification de l’activité de la polymérase. Dans l’étude de B. Casadewall et P.
Courvalin (Casadewall and Courvalin 1999), il a également été démontré qu’une mutation dans le gène
ddl de Enterococcus faecium BM4339 entraînait un changement du cadre de lecture et codait pour une
ligase D-Alanine-D-Alanine non fonctionnelle. Cette mutation dans le gène ddl contribue à l’acquisition
de la résistance aux glycopeptides.

37
II.2.3.2 Transfert horizontal de gènes

Le transfert horizontal de gènes est une méthode utilisée par les bactéries pour intégrer à leur
chromosome de l’ADN hétérologue. Au sein des procaryotes, il existe trois méthodes différentes de
transfert horizontal de gènes permettant l’intégration d’un gène de résistance.

i) La conjugaison : c’est une méthode de transfert d’ADN entre deux bactéries phylogénétiquement
proches (une donneuse et une receveuse) via un contact de cellule à cellule (e.g. pilus sexuel). Il existe
deux types de conjugaison : la transmission d’ADN plasmidique ou d’ADN chromosomique. Le transfert
de l’ADN plasmidique est effectué grâce à des plasmides conjugatifs ou mobilisables et s’effectue en
quatre grandes étapes. Tout d’abord, un contact entre le donneur et la receveuse est effectué via le
pilus, synthétisé à l’aide du plasmide conjugatif présent chez le donneur. Une fois le contact établi
entre les deux bactéries, le pilus se transforme en pore permettant ainsi le transfert de l’un des deux
brins de l’ADN plasmidique. Lorsque la conjugaison est terminée, la bactérie receveuse va alors
synthétiser le brin complémentaire du plasmide. La transmission d’ADN chromosomique est effectuée
de la même façon que pour la transmission de l’ADN plasmidique à l’exception du fait que le matériel
génétique transmis sera une partie du chromosome de la bactérie donneuse, mais cet évènement
reste rare.

ii) La transduction est une méthode de transfert d’ADN effectuée par un bactériophage entre deux
cellules. Brièvement, le bactériophage infecte la bactérie donneuse en injectant son ADN viral
permettant à celui-ci de se répliquer. Parmi ces nouveaux phages, certains possèdent alors des
fragments d’ADN de la bactérie donneuse acquis lors de l’encapsidation. Ils infectent ensuite des
bactéries receveuses qui vont intégrer par recombinaison homologue la séquence d’ADN.

iii) La transformation est une méthode d’intégration d’un ADN exogène (plasmide ou séquence
d’ADN) dans une cellule naturellement compétente. L’ADN exogène peut ensuite s'intégrer au
chromosome par recombinaison homologue.

Mais la présence de plusieurs gènes de résistance au sein d’une même bactérie (bactérie multi-
résistante) suggère qu’il existe d’autres mécanismes permettant le transfert de ces gènes. Ainsi,
l’intégration via des transposons ou des intégrons expliquerait la rapide propagation des gènes de
résistance dans une population bactérienne (Roberts and Mullany 2011).

iv) Les transposons sont des groupements d’éléments génétiques mobiles composés d’un gène
encadré par deux séquences d’insertion (IS pour Insertion Sequence) qui peuvent se déplacer d’une
molécule d’ADN à une autre (entre bactéries phylogénétiquement éloignées par exemple) ou d’un

38
endroit à l'autre sur une même molécule. Les IS sont composés d’un gène codant pour une transposase
et de séquences inversement répétées. Cette transposase permet le transfert d’un gène de plasmide
à plasmide, de chromosome à plasmide ou de plasmide à chromosome (Saier, Kukita et al. 2017).

v) Les intégrons sont des systèmes de capture et d’expression de gènes de résistance (Stokes and
Hall 1989). Les intégrons sont définis par deux segments conservés. Ils sont composés du gène intl
codant pour une intégrase, d’un site de recombinaison attL et d’un promoteur fort, flanquant une
cassette, que l’on retrouve en particulier chez les bactéries à Gram négatif. Les intégrons de résistance
peuvent être associés à des transposons et /ou des plasmides conjugatifs facilitant le transfert de
gènes. Il existe 5 classes d’intégrons dit « mobiles » groupés en fonction de la séquence protéique de
leur intégrase, toutes impliquées dans la résistance aux antibiotiques (Deng, Bao et al. 2015).

Mécanismes biochimiques de la résistance aux antibiotiques

Plusieurs mécanismes permettent aux bactéries de lutter contre les antibiotiques soit en produisant
une enzyme qui va modifier ou détruire l’antibiotique, soit en modifiant la cible initiale de
l’antibiotique ou encore en diminuant la perméabilité de la membrane. Les différents cas sont détaillés
dans les sections suivantes.

II.2.3.3 Diminution de la perméabilité membranaire

L’imperméabilité de la membrane est un mécanisme de résistance intrinsèque que l’on retrouve le

plus fréquemment chez les bactéries à Gram négatif. La diminution de l’absorption de l’antibiotique
par la membrane empêche par conséquent celui-ci d’atteindre sa cible intracellulaire. Elle résulte de
la diminution du nombre de porines présentes dans la membrane externe. Les molécules hydrophiles
comme les béta-lactames, les tétracyclines et certaines fluoroquinolones qui entrent dans la cellule au
moyen des porines, sont particulièrement affectées par ce changement de perméabilité (Pages, James
et al. 2008). Un changement du type de porines exprimées ou du niveau d’expression des porines ou
encore une modification de la fonction des porines peuvent être la cause de l’altération de la
perméabilité de la membrane. La diminution de la perméabilité par l’un de ces processus est souvent
renforcée par d’autres mécanismes de résistance comme la surexpression d’une pompe à efflux
(Nikaido 2003).

Etude de cas de la résistance de Pseudomonas aeruginosa à l’antibiotique imipenème. Les

mutations du gène codant la porine OprD – porine impliquée dans l’assimilation d’acides aminés et
d’antibiotiques – chez Pseudomonas aeruginosa sont à l’origine de la diminution du nombre de porines
au sein de la membrane externe. En plus de ces mutations entrainant une résistance à l’imipenème,

39
une surexpression d’une pompe à efflux et/ou une production d’une enzyme hydrolysant les
carbapénèmes – destruction du cycle béta-lactame – peut être associée à cette résistance (Trias and
Nikaido 1990).

II.2.3.4 Efflux de l’antibiotique

L’efflux de l’antibiotique est un mécanisme de pompage assuré par des transporteurs d’efflux (i.e.
protéines transmembranaires) permettant de rejeter l’antibiotique dans le milieu extracellulaire. Il
existe cinq familles de pompes d’efflux catégorisées selon leur structure, la source d’énergie utilisée
pour le pompage, leur organisation au sein de la membrane et les molécules qu’elles effluent (Figure
11, (Cattoir 2004)).

Figure 11 : Structures de cinq familles de transporteurs d’efflux multidrogues adapté de (Du, van
Veen et al. 2015).
En noir : les noms des cinq familles, en marron : un exemple de la famille de transporteurs associée.

i) Famille Résistance-Nodulation-Division cellulaire (RND) : les transporteurs d’efflux multidrogues

appartenant à la famille RND ont été identifiés seulement au sein des bactéries à Gram négatif. Ils
forment un complexe ternaire avec une protéine de fusion membranaire (PFM) et une porine de la
membrane externe. Pour fonctionner, ces pompes utilisent l’énergie fournie par dissipation d’un
gradient de protons (Putman, van Veen et al. 2000). AcrAB, pompe d’efflux chez Escherichia coli, a été
identifié comme la pompe d’efflux responsable du caractère résistant des souches d’E. coli
multirésistantes aux antibiotiques tels que la tétracycline, le chloramphénicol, l’ampicilline, l’acide
nalidixique et la rifampicine (Okusu, Ma et al. 1996).

40
 ii) Famille de transporteurs ATP-Binding Cassette (ABC) : les transporteurs ABC ont été identifiés
non seulement chez les bactéries mais aussi chez les archées et les eucaryotes. Ils sont composés de
deux domaines membranaires hydrophobes (composés de six hélices transmembranaires) et de deux
domaines hydrophiles de liaisons des nucléotides (composés de la signature ABC). Pour permettre
l’efflux de molécules toxiques tels que les antibiotiques, les transporteurs ABC hydrolysent l’ATP
comme source d’énergie. Le premier transporteur ABC bactérien découvert est une protéine
membranaire de 590 acides aminés codée par le gène lmrA chez Lactococcus lactis. Ce transporteur a
la particularité de ne posséder qu’un domaine hydrophobe N-terminal avec 6 hélices α et un domaine
hydrophile C-terminal contenant la cassette de liaison à l’ATP (van Veen, Venema et al. 1996). Dans
l’étude de (van Veen, Venema et al. 1996), il a été démontré que LmrA est homologue à chaque moitié
de la glycoprotéine P du transporteur humain laissant suggérer que LmrA est fonctionnel en tant
qu’homodimère. Dans le génome de B. subtilis, on retrouve neuf protéines de type ABC (BmrA, BmrC,
BmrD, LnrL, LnrM, LnrN, AlbC, AlbD, SunT) qui permettent l’efflux d’antibiotiques. Ils appartiennent
aux opérons bmrA yvcD, bmrBCD, lnrLMN, sboAX albABCDEFG et sunAT bdbA yolJ bdbB
respectivement. D’autres protéines ABC permettent l’efflux de peptides toxiques dont les protéines
codées par les gènes bceA et bceB appartenant à l’opéron bceAB, impliquées dans la résistance à la
bacitracine. Parmi les protéines ABC référencées de B. subtilis, la fonction de 26 d’entre elles reste
encore inconnue à ce jour.

iii) Famille Major Facilitator Superfamily (MFS) : les transporteurs de la famille MFS sont composés
d’un ensemble de protéines membranaires comportant 12 ou 14 hélices transmembranaires et sont
présents chez les bactéries comme chez les eucaryotes. Ces transporteurs sont impliqués dans le
transport de petites molécules telles que les sucres, les intermédiaires du cycle de Krebs, les
oligosaccharides, les esters de phosphate et tirent l’énergie dont ils ont besoin pour exporter les
molécules vers l’extérieur, de la dissipation d’un gradient de protons (Marger and Saier 1993). Parmi
eux, certains sont spécialisés dans le transport d’antibiotiques comme NorA, transporteur d’efflux de
la quinolone chez S. aureus ou TetA, transporteur d’efflux de la tétracycline chez E. coli (Marger and
Saier 1993, Karami, Nowrouzian et al. 2006).

iv) Famille Small Multidrug Resistance (SMR) : les transporteurs de la famille SMR sont composés
d’environ 100 à 120 résidus d’acides aminés avec quatre hélices transmembranaires présumées qui
utilisent l’énergie fournie par la dissipation d’un gradient de protons. Le premier transporteur de la
famille SMR à avoir été identifié, est le transporteur d’efflux multidrogue Smr de S. aureus,
anciennement connu sous le nom QacC, QacD ou encore Ebr. Ce transporteur a été détecté sur des
plasmides conjugatifs parmi les S. aureus résistants aux antiseptiques et aux désinfectants tels que le

41
bromure de cétyltriméthylammonium ou le chlorure de benzalkonium (Littlejohn, DiBerardino et al.
1991, Leelaporn, Firth et al. 1995). Le transporteur d’efflux EmrE d’E. coli, précédemment connu sous
le nom MvrC et Ebr, est un transporteur antiport multidrogue/proton qui confère la résistance aux
cations tels que l’éthydium, la proflavine, la pyronine Y, la safranine et le méthyl viologène ainsi que
l’érythromycine, la sulfadiazine et la tétracycline (Purewal 1991, Morimyo, Hongo et al. 1992,
Yerushalmi, Lebendiker et al. 1995)). Dans le génome de B. subtilis, on retrouve sept protéines de type
SMR dont six sont codées à partir de paires de gènes dans 3 opérons distincts, ebrAB, ykkCD et yvdRS.
L’étude de (Masaoka, Ueno et al. 2000), a démontré que l’expression des gènes ebrA ou ebrB seuls ne
confère pas la résistance au bromure d’éthidium. Cependant, l’expression des deux gènes chez B.
subtilis ou E. coli a permis l’activation de l’efflux de bromure d’éthidium et a ainsi rendu les souches
résistantes (Morimyo, Hongo et al. 1992).

v) Famille Multidrug And Toxic compound Extrusion (MATE) : les transporteurs de la famille MATE
sont présents chez les bactéries, archées et eucaryotes et effluent des substances cationiques,
lipophiles et xénobiotiques endogènes conférant une résistance aux agents pathogènes et cellules
cancéreuses. La famille MATE est composée soit de transporteurs antiports multidrogue/proton ou
multidrogue/sodium possédant entre 400 et 700 résidus avec 12 hélices transmembranaires
présumées (Omote, Hiasa et al. 2006). Chez les bactéries, 17 transporteurs MATE ont été caractérisés
(Table 6) dont NorM, transporteur d’efflux multidrogue de Vibrio parahaemolyticus ainsi que son
homologue, YdhE d’E. coli (Morita, Kodama et al. 1998). En effet, le transporteur NorM est un
transporteur antiport multidrogue/Na+ qui efflue la norfloxacine et d’autres drogues. Il partage avec
son homologue d’E. coli, 57% d’identité et 85% de similarité, et ont été les premiers transporteurs de
la famille MATE à avoir été découverts en 1998 (Morita, Kodama et al. 1998).

42
Table 6 : Transporteurs bactériens appartenant à la famille MATE, table adaptée de (Omote, Hiasa et
al. 2006) et (Kuroda and Tsuchiya 2009).

Organisms MATE Coupling ion Examples of Multidrug resistance

Acinetobacter baumannii AbeM H+ Ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin, etc.
Bacteroides BexA - Ciprofloxacin, norfloxacin, EtBr.
thetaiotaomicron
Brucella melitensis NorMI - Ciprofloxacin, norfloxacin, gentamicin, etc.
Clostridium difficile CdeA Na+ Ciprofloxacin, norfloxacin, acriflavine, EtBr.
Erwinia amylovora NorM - Ciprofloxacin, Norfloxacin, Ampicillin, etc.
Escherichia coli YdhE - Ciprofloxacin, norfloxacin, kanamycin, etc.
Haemophilus influenza HmrM Na+ Norfloxacin, streptomycin, doxorubicin, etc.
Neisseria gonorrhoeae NorM Na+ Ciprofloxacin, enoxacin, lomefloxacin, etc.
Neisseria meningitides NorM - Ciprofloxacin, norfloxacin, EtBr, etc.
Pseudomonas aeruginosa PmpM H+ Ciprofloxacin, norfloxacin, fradiomycin, etc.
Ralstonia solanacearum DinF - Nalidixic acid, ampicillin, EtBr, etc.
Salmonella enterica MdtK - Norfloxacin, doxorubicin, acriflavine.
Serovar Typhimurium
Staphylococcus aureus MepA - Norfloxacin, ciprofloxacin, acriflavine, etc.
Vibrio cholerae VcmA Na+ Ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin,
VcmB Na+ kanamycin, streptomycin, etc.
VcmD Na+
VcmH Na+
VcmN -
VcrM Na+ Chloramphenicol, acriflavine, DAPI, EtBr, etc.
Vibrio parahaemolyticus NorM Na+ Norfloxacin, EtBr, Ciprofloxacin, etc.
VmrA Na+ Acriflavine, DAPI, EtBr, TPP+.
Abréviations : DAPI, 4’,6-diamidino-2-phenylindole ; EtBr, ethidium bromide ; TPP+, tetraphenylphosphonium.

II.2.3.5 Destruction de l’antibiotique

La destruction de l’antibiotique repose sur un seul mécanisme basé sur l’action des β-lactamases.
La production de ces enzymes par la bactérie permet d’hydrolyser la liaison amide du cycle β-lactame
présent dans la famille des β-lactamines (pénicillines, céphalosporines et carbapénèmes) rendant
l’antibiotique inefficace (Figure 12).

43
Figure 12 : Hydrolyse d’un cycle β-lactame par une β-lactamase (Williams 1999).

Chez les bactéries à Gram positif, les β-lactamases sont produites dans le cytoplasme et exportées
à travers la membrane dans le milieu de culture contrairement aux bactéries à Gram négatif, où les β-
lactamases sont exportées dans l’espace périplasmique situé entre les deux membranes permettant
ainsi une destruction plus efficace des β-lactames.

Peu de temps après la mise sur le marché de la pénicilline, des souches résistantes de S. aureus ont
fait leur apparition (Table 5). Dans l’étude de (Medeiros 1984), il a été démontré qu’un plasmide
codant une pénicillinase est à l’origine de la dissémination de la résistance chez S. aureus.

II.2.3.6 Modification de l’antibiotique

La modification d’un antibiotique a le même effet que la destruction de celui-ci, il est inactivé et
n’interagit plus avec sa cible. Il existe des gènes, généralement présents sur un plasmide, qui ajoutent
un groupe fonctionnel à l’antibiotique. Trois actions peuvent avoir lieu :

i) ajout d’un groupe acétyle par une acétyltransférase,

ii) ajout d’un groupe adényle par une adényltransférase,

iii) ajout d’un groupe phosphate par une phosphotransférase.

Les principaux antibiotiques modifiés par ces enzymes sont le chloramphénicol et les
aminoglycosides. Dans le cas du chloramphénicol, l’acétytransférase ajoute un groupe acétyle à partir
d’acétyl-CoA au chloramphénicol pour former de l’acétate de chloramphénicol et ainsi empêchant le
chloramphénicol de se fixer aux ribosomes (Shaw, Packman et al. 1979).

44
II.2.3.7 Altération de la cible

L’altération de la cible de l’antibiotique est le mécanisme de résistance le plus courant lié à une
mutation chromosomique. Dans le cas de la résistance aux aminoglycosides par altération de la cible,
la protéine cible de la sous-unité 30S du ribosome bactérien est modifiée, ce qui empêche la liaison
avec l’antibiotique. L’un des exemples d’altération de la cible parmi les plus étudiés est la résistance à
la 4-quinolone. Dans l’étude de (Oram and Fisher 1991), il a été démontré qu’une mutation sur la sérine
83 de la sous-unité A de la gyrase en leucine conférait une résistance aux quinolones, et suggère donc
que Ser-83 a une fonction importante dans l’action des quinolones. Un autre exemple d’altération de
la cible est l’acquisition d’une transpeptidase exogène MecA altérée par S. aureus qui lui confère la
résistance à la méthicilline et à la plupart des antibiotiques de la famille des β-lactames. Le gène mecA
code pour une protéine de liaison à la pénicilline appelé PBP2a, protéine impliquée dans l’assemblage
du peptidoglycane de la paroi cellulaire. Les antibiotiques β-lactames se lient aux PLP intrinsèques
inhibant la réticulation du résidu D-Ala-D-Ala d’un monomère de peptidoglycane à la chaîne
pentaglycine d’un autre. Contrairement aux PLP intrinsèques, PBP2a reconnaît le peptidoglycane et
possède une très faible affinité avec les β-lactames. Cette particularité permet aux souches de S.
aureus possédant le gène mecA de se développer même en présence d’antibiotiques (Hiramatsu,
Katayama et al. 2002).

II.2.3.8 Production d’une deuxième cible

La production d’une deuxième cible n’est possible qu’avec la présence d’un plasmide contenant le
gène codant la cible supplémentaire pour laquelle l'antibiotique ne possède qu'une faible affinité. Un
exemple de ce mécanisme est la production d’une dihydrofolate réductase supplémentaire dans la
résistance à la triméthoprime. En effet, le triméthoprime inhibe fortement l’activité de la dihydrofolate
réductase bactérienne mais inhibe plus faiblement celle de la dihydrofolate réductase supplémentaire
codée par le plasmide (Amyes, Miles et al. 1996).

II.2.3.9 Hyperproduction de la cible

L’hyperproduction de la cible peut permettre à la bactérie de se maintenir en vie malgré la présence

de l’antibiotique. Par exemple, l’hyperproduction de la dihydrofolate réductase permet à la bactérie
d’avoir assez de molécules pour convertir le dihydrofolate en tétrahydrofolate malgré le fait que la
majorité des enzymes est inhibée par le triméthoprime (Amyes, Miles et al. 1996).

45
 Les flavonoïdes, produits naturels d'intérêt industriel

Les produits naturels issus de plantes sont une source de composés d'intérêt thérapeutique et sont
une alternative pour combattre les pathogènes multi-résistants grâce à leur activité antibactérienne
(Shin, Prabhakaran et al. 2018).

Flavonoïdes et médecine traditionnelle

Depuis des siècles, les flavonoïdes à travers les plantes médicinales sont utilisés dans la médecine
traditionnelle comme remède contre les maladies inflammatoires ou la jaunisse par exemple (Tai,
Tsang et al. 2005). Les herbes médicinales (telles que Scutellaria baicalensis Georgi, Scutellaria rivularis
Wall, Andrographis paniculata Nees et Nelumbo nucefera) sont riches en flavonoïdes et sont largement
utilisées en médecine traditionnelle chinoise pour traiter diverses infections comme des abcès
parodontaux et des plaies buccales infectées (Tsao, Newman et al. 1982, Tungmunnithum, Pinthong
et al. 2018). Les flavones, baicaléine, wogonine et baicaline, provenant de la plante Scutellaria
baicalensis seraient en grande partie responsables des effets antimicrobiens (Lu, Joerger et al. 2011).
Un autre exemple, Scutellaria radix, une racine séchée de S. baicalensis Georgi, contient en grande
quantité des flavonoïdes dont la wogonine qui possède de nombreuses propriétés (e.g. activité anti-
inflammatoire, neuroprotecteur) (Lee, Kim et al. 2003). Cette racine est utilisée en Chine et au Japon
depuis l’Antiquité pour le traitement de l’hépatite, la jaunisse, l’hépatome, la leucémie,
l’hyperlipidémie, l’athérosclérose et certaines maladies inflammatoires (Tai, Tsang et al. 2005).

La propolis, une résine végétale également connue depuis des siècles, a été largement utilisée
comme médicament par les grecs, les romains et les égyptiens de l’antiquité pour ses propriétés
curatives (antibactériennes, antiseptiques, anti-inflammatoires, antifongiques, anesthésiques et
cicatrisantes) (Kuropatnicki, Szliszka et al. 2013, Zabaiou, Fouache et al. 2017). Son efficacité en tant
que traitement antibactérien proviendrait en particulier de la présence en grande quantité de
pinocembrine et galangine (Pepeljnjak, Jalsenjak et al. 1982).

D'autres plantes médicinales que celles présentées ci-dessus provenant de la pharmacopée

chinoise sont utilisées à travers le monde pour traiter ou prévenir de nombreuses maladies. L’extrait
de feuilles de Ginko biloba est utilisé pour traiter les symptômes de la maladie d’Alzheimer à un stade
précoce, la démence vasculaire, la claudication et les acouphènes d’origine vasculaire (Sierpina,
Wollschlaeger et al. 2003). A noter qu'une étude clinique a démontré que l'utilisation à long terme
d'un extrait standardisé de G. biloba n'a pas réduit le risque de progression vers la maladie d'Alzheimer
par rapport au placebo (Vellas, Coley et al. 2012). En Argentine, la plante Tagetes minuta contenant la
quercetagetin-7-arabinosyl-galactoside est utilisée pour traiter les maladies de l'estomac et de

46
l'intestin (Tereschuk, Riera et al. 1997). Cet extrait de plante dont le composant majeur est la
quercetagetin-7-arabinosyl-galactoside montre une activité biologique de type antimicrobien et en
particulier contre des pathogènes (Tereschuk, Riera et al. 1997). Les feuilles de la plante médicinale
Cassia angustifolia Vahl, sont utilisées en médecine traditionnelle sous forme de poudre en tant que
vermifuge. Elles sont également utilisées en cas de typhoïde, de constipation (Silva, Monteiro et al.
2008, Parveen and Shahzad 2011).

Les nombreuses études portant sur l’extraction, l’identification et la caractérisation des propriétés
des flavonoïdes provenant de différentes plantes démontrent l’intérêt de la communauté scientifique
pour ces composés. La diversité de la famille des flavonoïdes est telle que les flavonoïdes ont été
divisés en différentes classes selon leur structure.

Biosynthèse et fonction des flavonoïdes

Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires de plantes, composés phénoliques ayant une
structure hétérocyclique oxygénée C6-C3-C6, présents en grande abondance chez les végétaux et les
fruits (Havsteen 1983, Havsteen 2002). A l’état naturel, les flavonoïdes sont majoritairement sous
forme de glycosides (Crozier, Clifford et al. 2006). Les composés hydrophiles, (flavonoïdes possédant
un sucre ou un groupe hydroxyle) sont accumulés dans la vacuole tandis que les composés à caractère
lipophile (flavonoïdes possédant d’autres substituants tels qu’un groupe méthyle ou isopentyle) sont
accumulés dans les cellules épidermiques ou exsudés des racines.

La biosynthèse des flavonoïdes chez les plantes débute par la voie des phénylpropanoïdes, et est
constituée de trois réactions enzymatiques permettant la conversion de la phénylalanine ou tyrosine
en 4-coumaroyl-CoA, précurseur métabolique permettant la synthèse des flavonoïdes ou composés
phénylpropanoïdes (Figure 13). Les précurseurs de la voie des phénylpropanoïdes sont obtenus par la
voie du shikimate pour la production de la phénylalanine, et par le cycle de Krebs pour la production
du malonyl-Coenzyme A (malonyl-CoA, (Winkel-Shirley 2001)).

La première étape implique soit l’enzyme Phénylalanine Ammonia Lyase (PAL), qui convertit la L-
phénylalanine en acide cinnamique, soit l’enzyme Tyrosine Ammonia Lyase (TAL), qui convertit la L-
tyrosine en acide p-coumarique, deux enzymes omniprésents chez les plantes. L’acide cinnamique
obtenu à partir de la L-phénylalanine, est ensuite hydrolysé en acide p-coumarique par l’enzyme C4H
(Cinnamique 4-Hydrolase). Le composé résultant est converti en un complexe acide - coenzyme A
(CoA) appelé 4-coumaroyl-CoA par l’enzyme 4CL (4-Coumarate-coenzyme A Lyase). Le 4-coumaroyl-
CoA est un substrat de l’enzyme CHS (CHalcone Synthase) qui catalyse la condensation d’un complexe
acide-CoA avec trois molécules de malonyl-CoA marquant la première étape de la biosynthèse des

47
flavonoïdes en formant la base du squelette. La formation de flavanones à partir des chalcones
s’effectue par une isomérisation catalysée par l'enzyme CHI (CHalcone Isomérase). A cette jonction de
la voie métabolique, différents enzymes interviennent dans la catalyse de la conversion des flavanones
en différents dérivés. Plus particulièrement la (2S)-naringénine est un précurseur commun de nombre
de flavonoïdes et peut être convertie en différents dérivés par des réactions d'hydroxylation,
d'oxydation, de réduction, de glycosylation, de méthylation ou encore d'acylation.

Les dérivés de la naringénine tels que les isoflavones, les flavones, les flavonols, les anthocyanines
(Figure 13) possèdent différentes fonctions : ils sont responsables de la couleur et de l’arôme des fleurs
permettant d’attirer les pollinisateurs (Harborne and Williams 2000) et sont impliqués dans la
photosensibilisation, le transfert d'énergie, et le contrôle de la respiration et de la photosynthèse. Ils
régulent la croissance des plantes et inhibent le transport de la phytohormone auxine (acide indole
acétique) (Brown, Rashotte et al. 2001). Les flavonoïdes ont également un rôle de protection chez les
plantes pour lutter contre les bactéries ou protozoaires pathogènes et les virus. Leur activité antivirale
fait par ailleurs des flavonoïdes des antiviraux prometteurs pour lutter contre certaines infections
virales telles que l'infection par le virus herpès simplex (Zakaryan, Arabyan et al. 2017).

48
Figure 13 : Voie métabolique de la biosynthèse des flavonoïdes, adapté de (Winkel-Shirley 2001).
La phénylalanine est convertie en 4-coumaroyl-CoA par les enzymes PAL, C4H et 4CL. S'ensuit la
formation de chalcone via la condensation de malonyl-CoA avec l'acide-CoA par la CHS. La dernière
étape d'isomérisation est catalysée par la CHI. La naringénine (R1=OH), une flavanone, est un
précurseur d'un grand nombre de voies métaboliques telles que celles des isoflavonoïdes, des
flavones, des flavonols et des flavan 3-4-diols, des anthocyanines, des proanthocyanidines (tanins) et
des phlobaphènes.

Outre leur intérêt pour les plantes, les flavonoïdes sont également importants pour la santé
humaine, notamment en raison de leur activité antioxydante (Yao, Jiang et al. 2004). La famille des
flavonoïdes rassemble plus de 4000 molécules (chalcones, flavones, (iso)flavonols) identifiées à ce jour
(Cook and Samman 1996). Les flavonoïdes présentent de nombreuses propriétés pharmacologiques
telles que anti-inflammatoire, antivirale, antimicrobienne, hormonales (phytoœstrogène), inhibiteur
enzymatique (Havsteen 1983), antiallergique, antioxydante, et pourraient réduire les risques
cardiovasculaires et agir comme agent antitumoral (Harborne and Williams 2000). Les flavonoïdes sont

49
par conséquent des composés d’intérêt majeur pour les industries nutraceutiques, pharmaceutiques,
médicales et cosmétiques (c.f. § II.3.4).

Classification des flavonoïdes

Les flavonoïdes se présentent sous différentes formes : aglycones, glycosides ou dérivés méthylés
(Kühnau 1976). La base structurale des flavonoïdes est un noyau flavane, composé de deux cycles
benzènes (cycle A et B) et d’un cycle pyrane (cycle C) (Figure 14). Dans la nature, les glycosides formés
ont généralement leur liaison glycosidique située en position 3 ou 7. Les glucides associés à un aglycone
peuvent être le L-rhamnose, le D-glucose, le galactose, l’arabinose ou encore le diglycoside
glucorhamnose (Havsteen 1983).

Figure 14 : Structure du noyau flavane (Cushnie and Lamb 2005).

Le noyau flavane est composé de deux cycles benzènes (cycle A et B) et d’un cycle pyrane (cycle C).
Chaque carbone de la structure du cycle A et C est numéroté de 1 à 8. Chaque carbone du cycle B est
numéroté de 1’ à 6’.

Les flavonoïdes sont divisés en différentes classes selon le degré d’insaturation et d’oxydation du
cycle C et selon le carbone du cycle C sur lequel est fixé le cycle B (Brown 1980, Hendrich 2006). Les
principales classes de flavonoïdes (Figure 15) sont les suivantes.

i) Les flavones sont des colorants de couleur jaune. Ils possèdent tous une fonction carbonyle sur
le carbone 4. La structure du squelette flavone autrement appelé 2-phényl-1-benzopyran-4-one, est
illustrée en Figure 15A. Il existe environ 300 flavones naturelles connues dont les plus courantes sont
l’apigénine, la lutéoline et la baicaléine. La plupart des flavones sont sous forme de 7-O-glycosides (e.g.
le glycoside baicaline est constitué d’un aglycone baicaléine avec un acide glucuronique en position 7).

50
Figure 15 : Structures moléculaires des principales classes de flavonoïdes.
(A) Structure des flavones ; (B) structure des flavonols ; (C) structure des flavan-3-ols ; (D) structure
des isoflavones ; (E) structure des flavanones ; (F) structure des anthocyanidines.

ii) Les flavonols sont des pigments de couleur jaune plus ou moins clair dérivés des flavones. C’est
la classe la plus répandue chez les végétaux à l’exception des champignons et des algues. Ils possèdent
une fonction hydroxyle sur le carbone 3 (Figure 15B). D’autres substituts tels qu’un groupe hydroxyle
ou méthoxy peuvent s’ajouter sur les carbones 5, 7, 4’, 3’ et 5’, source de diversité des composés dans
cette classe (Havsteen 1983). Les principaux flavonols sont la fisétine, le kaempférol et la quercétine.
Le kaempférol et la quercétine sont généralement sous la forme 3-O-glycosides chez les végétaux.

iii) Les flavan-3-ols ou flavanols sont des composés incolores dérivés du noyau flavane et possèdent
une fonction hydroxyle sur le carbone 3 (Figure 15C). Ces composés sont plus connus sous le nom de
catéchines. Ayant deux carbones asymétriques (C2 et C3), il existe 4 stéréoisomères : (+)-catéchine
(configuration 2R, 3S) ; (-)-épicatéchine (2R, 3R) ; (-)-catéchine (2S, 3R) et (+)-épicatéchine (2S, 3R). La
(+)-catéchine et la (-)-épicatéchine sont les deux isomères les plus fréquents dans la nature tandis que
les deux autres isomères sont beaucoup plus rares (Kallithraka, Bakker et al. 1997).

51
 iv) Les isoflavones sont des isomères de flavones mais, contrairement aux flavones, les isoflavones
sont incolores. Elles possèdent un groupe phényle sur le carbone 3, alors que le groupe phényle est
fixé sur le carbone 2 chez les flavones (Figure 15D). Les principales molécules connues de cette classe
sont la daidzéine et la génistéine.

v) Les flavanones sont des composés incolores dérivés des flavones. Elles possèdent un groupe
phényle en configuration S sur le carbone 2 (Figure 15E). La configuration S des flavanones est obtenue
grâce à l’enzyme CHI. Les flavanones les plus courantes sont l’hespéridine, la naringénine et la
pinocembrine. Des hétérosides peuvent être formés comme la naringine, formée à partir de la
naringénine et d’un disaccharide (néohespéridose) sur le carbone 7.

vi) Les anthocyanidines sont des pigments de couleur variant de l’orange au violet. Ce sont des
dérivés du noyau flavane ayant un ion flavylium (Figure 15F) en position 1. Leurs dérivés hétérosides
(3-O-glycosides) sont appelé anthocyanes, plus connus sous le nom anthocyanines et forment des
molécules beaucoup plus stables que les aglycones seuls (e.g. cyanidine, delphinidine, etc.).

Les dérivés de chaque classe peuvent avoir différents substituts. Les groupes hydroxyles sont
présents, dans la plupart des cas, sur les carbones 4, 5 et/ou 7. Il existe d’autres classes secondaires
regroupant des intermédiaires de la biosynthèse des flavonoïdes (e.g. les chalcones) ou des produits
finaux plus rares (e.g. les aurones).

Activités biologiques des flavonoïdes

Il est à noter que l’activité antibactérienne des flavonoïdes sera spécifiquement traitée dans le
paragraphe II.3.4.2 et de ce fait davantage détaillée.

II.3.4.1 Propriétés des flavonoïdes

Les flavonoïdes, qu'ils soient naturels ou synthétiques, ont fait l’objet de nombreuses études de par
les différentes activités biologiques qu’ils possèdent. En effet, les flavonoïdes possèdent de
nombreuses propriétés telles que les suivantes.

i) Antioxydante : l’activité antioxydante d’un flavonoïde est caractérisée par sa capacité à capturer
des radicaux, à chélater des métaux tels que le fer ou à inhiber l’activité de certains enzymes impliqués
dans la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) (Cotelle, Bernier et al. 1992, Peterson and
Dwyer 1998, Nijveldt, van Nood et al. 2001). Les flavonoïdes naturels les plus connus possédant cette
activité sont les flavones morine, quercétine et myricétine. Les activités de dix flavones synthétiques
ont été étudiées par N. Cotelle et son équipe afin de mettre en évidence l’importance de l’effet des

52
groupes hydroxyles dans l’activité antioxydante des flavones (Cotelle, Bernier et al. 1992). Il a été
démontré que la capture des radicaux libres est favorisée par la présence d’un groupement pyrogallol
sur le cycle B et/ou un groupement hydroxyle en position C-6 du cycle A. De même qu’un flavone ayant
un groupement hydroxyle en position C-7 est un inhibiteur potentiel de la xanthine oxydase.

ii) Antifongique : l’activité antifongique des flavonoïdes est caractérisée par l’inhibition de la
germination des spores des phytopathogènes (Harborne and Williams 2000). Plusieurs études ont
démontré que les flavonoïdes ayant cette activité peuvent être utilisés contre différents champignons
pathogènes de l’homme (Table 7). Une étude sur la propolis a démontré une activité antifongique à
l’encontre de dermatophytes et de plusieurs espèces de Candida grâce à sa forte teneur en flavonoïdes
(Cafarchia, De Laurentis et al. 1999, Cushnie and Lamb 2005). Il a en effet été démontré que le flavonol
galangine que l’on retrouve dans la propolis possède une activité antifongique à l’encontre de divers
champignons tels que Penicillium digitatum et P. italicum (Afolayan and Meyer 1997).

Table 7 : Flavonoïdes ayant une activité antifongique (révisé par (Cushnie and Lamb 2005)).

Name Isolated from Activity against Source

5,7,4’-trihydroxy-8- Eysenhardtia texana Candida albicans (Wächter,
methyl-6-(3-methyl-[2- (shrub) Hoffmann et al.
butenyl])-(2S)-flavanone 1999)
7-hydroxy-3’,4’- Terminalia bellerica C. albicans (Valsaraj,
(methylenedioxy)flavan (fruit rind) Pushpangadan
et al. 1997)
6,7,4’-trihydroxy-3’,5’- Artemisia giraldii Aspergillus flavus (Zheng, Tan et
dimethoxyflavone Trichoderma viride al. 1996)
5,5’- dihydroxy-8,2’,4’-
trimethoxyflavone
5,7,4’-trihydroxy-3’,5’-
dimethoxyflavone
Galangin Bee propolis Aspergillus tamarii, A. flavus, (Afolayan and
Cladosporium Meyer 1997)
sphaerospermum, Penicillium
digitatum and Penicillium
italicum

iii) Antivirale : certains flavonoïdes présentent une activité inhibitrice contre le VIH (virus de
l'immunodéficience humaine) et ses enzymes. Par exemple, une étude in vitro a démontré que la
baicaline inhibe l’infection et la réplication du VIH (Li, Fu et al. 2000). D’autres études ont mis en
évidence l’activité antivirale de la quercétine, la baicaline, la morine, la rutine, la chrysine, du
kaempférol et des catéchines (Cushnie and Lamb 2005). De récentes études in vitro ont démontré que

53
les flavonoïdes connus pour leur activité antivirale comme la quercétine, la baicaline interfèrent avec
le cycle infectieux du coronavirus (covid-19) en inhibant des protéines telles que la Papain-like cysteine
protease PLpro (Russo, Moccia et al. 2020).

iv) Anti-inflammatoire : l’activité anti-inflammatoire des flavonoïdes est caractérisée notamment

par la modification de l’acide arachidonique plaquettaire. En effet, la flavanone lipophilique tanetine
inhibe des cyclo-oxygénases et /ou des lipoxygénases (Williams, Hoult et al. 1995). L’hespéridine
possède aussi une activité anti-inflammatoire et analgésique (Galati, Monforte et al. 1994).

v) Anticancéreuse : les facteurs alimentaires ont une influence importante dans la prévention des
cancers. Ainsi, les flavonoïdes sont considérés comme agents chimiopréventifs (Mishra, Sharma et al.
2013). De nombreux flavonoïdes possèdent des propriétés antitumorales, tels que l’apigénine, la
lutéonine, la quercetine et le kaempférol (Cushman and Nagarathnam 1991, Chen and Dou 2008). Par
exemple, les effets anti-tumoraux de la quercétine, la fisétine ou la lutéoline passent par l'inhibition
de la protéine kinase C (Ferriola, Cody et al. 1989). Des études épidémiologiques ont mis en évidence
la relation entre la consommation de flavonoïdes dans notre alimentation et le développement de
cancer. Par exemple, des résultats préliminaires indiquent que la mortalité peut être réduite par de
grandes quantités de flavones et d’isoflavones alimentaires chez des patientes ménopausées atteintes
d'un cancer du sein (n=1210) (Fink, Steck et al. 2007).

II.3.4.2 Activité antibactérienne des flavonoïdes

• Caractérisation de l’activité antibactérienne des flavonoïdes

L’activité antibactérienne se retrouve principalement au sein des classes suivantes : les flavones
hydroxylées, les isoflavones, les flavanones, les isoflavanones et les flavans. Il existe de nombreuses
études sur différents flavonoïdes tels que l’apigénine, la galangine, la pinocembrine, la naringénine, la
sophoraflavanone G, la quercétine et bien d’autres, qui confirment que les flavonoïdes sont des agents
antibactériens efficaces (Cushnie and Lamb 2005). Par exemple, il a été démontré que la naringénine
et la sophoraflavanone G ont une activité antibactérienne à l’encontre de S. aureus résistant à la
méthicilline (MRSA ; methicillin-resistant S. aureus), et à l'encontre des streptocoques en altérant la
fluidité membranaire (Tsuchiya and Iinuma 2000). Plusieurs groupes hydroxyles dans la structure de la
flavanone tels que la 5,7-dihydroxylation du cycle A et la 2,4 ou 2,6-dihydroxylation du cycle B ont été
identifiés comme importants pour l’activité antibactérienne à l’encontre des MRSA (Haraguchi,
Tanimoto et al. 1998).

54
 Dans l’étude de (Goc, Niedzwiecki et al. 2015), les activités antibactériennes des flavonoïdes
suivants : fisétine, kaempférol, baicaléine, lutéoline et morine, ont été testées sur les espèces de
Borrelia (bactéries à Gram négatif) responsables de la maladie de Lyme. Il y est démontré que la
baicaléine possède l’activité antibactérienne la plus efficace contre toutes les formes de Borrelia (i.e.
spirochetes, formes rondes et biofilms) (Goc, Niedzwiecki et al. 2015). La baicaléine possède aussi une
activité antibactérienne contre S. aureus. En effet, la baicaléine aurait des effets sur la perméabilité de
la membrane bactérienne, et sur les activités de la succinate déshydrogénase, de la malate
déshydrogénase et de l’ADN topoisomérase I et II (Goc, Niedzwiecki et al. 2015).

Des échantillons de propolis, composés en partie de pinocembrine et galangine, possèdent une

activité antimicrobienne contre le pathogène Streptococcus pyogenes (Grange and Davey 1990, Bosio,
Avanzini et al. 2000). Une autre étude a montré qu’un substituant brome ou chlore sur le cycle B des
3-méthylèneflavanones augmente leurs activités antibactériennes contre les bactéries à Gram positif
(Ward, Garling et al. 1981).

Il a été reporté qu’il peut exister une synergie entre les flavonoïdes naturels et d’autres agents
antibactériens : c’est le cas de l'épicatéchine gallate qui agit en synergie avec la méthicilline contre les
MRSA (Hamilton-Miller and Shah 2000). La combinaison de différents flavonoïdes peut également
permettre d'augmenter les activités antibactériennes. Par exemple, les combinaisons de quercétine et
quercitrine, ou de quercétine et morine augmentent leurs activités antibactériennes contre Salmonella
enteritidis et Bacillus cereus, et la rutine (inactive seule contre ces mêmes espèces) permet
d'augmenter les activités antibactériennes de la quercétine, de la morine, de la galangine, du
kaempférol, de myricétine et de la fisétine lorsque ces composés sont combinés (Arima, Ashida et al.
2002).

• Mécanismes antibactérien des flavonoïdes

Au vu de la diversité structurale de la famille des flavonoïdes, et d'après la littérature, les

flavonoïdes interagissent avec différentes cibles cellulaires pour leur activité antibactérienne. Ainsi,
plusieurs hypothèses sur leurs modes d’action antibactériens ont été répertoriées en Figure 16.

55
Figure 16 : Différents mécanismes d’action supposés des flavonoïdes.
En noir, est indiqué l’effet du flavonoïde en tant qu’agent antibactérien ; en vert, sont indiqués les
flavonoïdes capables de provoquer cet effet ; en bleu, est indiqué le mécanisme d’action.

o Dégradation de la membrane cytoplasmique :

Le (-)-gallate d'épigallocatéchine (EGCG), provenant d’extraits de thé vert Camellia sinensis,

possède une activité bactéricide forte en provoquant le relargage de petites molécules comme les 5,6-
carboxyfluorescéine dans l’espace intraliposomal (perforation) tandis que la (-)-épicatéchine (EC),
catéchine provenant du même extrait de plante, possède une très faible activité bactéricide et cause
donc très peu de dommage à la membrane cytoplasmique (Ikigai, Nakae et al. 1993). Il a été démontré
que l’action de ce flavonoïde est réduite lorsque celui-ci est retrouvé en présence de lipides chargés
négativement. Ainsi, les bactéries à Gram négatif seraient à priori plus résistantes aux catéchines
bactéricides que les bactéries à Gram positif grâce en partie à la forte charge négative des
lipopolysaccharides localisés à l’extérieur de la membrane externe (Ikigai, Nakae et al. 1993). Bien qu’il
ait été démontré que les catéchines jouent un rôle dans la dégradation de la membrane, la question
« comment endommagent-t-elles la membrane ? » reste sans réponse.

56
 o Inhibition de la synthèse des acides nucléiques :

La synthèse d’ADN chez Proteus vulgaris ainsi que la synthèse d’ARN chez S. aureus sont fortement
affectées voire inhibées en présence de robinétine, myricétine et (-)-épigallocatéchine. Il a été
démontré que les groupements hydroxyles en position C-3’, C-4’ et C-5’ sur le cycle B et un groupement
hydroxyle en position C-3 sont nécessaires pour l’activité antibactérienne (Mori, Nishino et al. 1987).

L’inhibition de l’ADN gyrase d’E. coli a été testée en présence de 15 flavones différentes et 8 d'entre
elles telles que la quercétine, l’apigénine et la 3,6,7,3’,4’- pentahydroxyflavone sont capables d'inhiber
l’activité catalytique de l’ADN gyrase. A l’exception de la 7,8-dihydroxyflavone, les flavonoïdes portant
un groupe hydroxyle sur le cycle B parmi ceux testés sont impliqués dans l’inhibition de l’enzyme
(Ohemeng, Schwender et al. 1993). Par ailleurs, il a été démontré que la quercétine se lie à la sous-
unité GyrB de l’ADN gyrase d’E. coli et inhibe son activité ATPase (Plaper, Golob et al. 2003), indiquant
ainsi que l’activité antibactérienne de la quercétine dirigée contre E. coli est en partie due à l’inhibition
de l’ADN gyrase.

L’inhibition de la synthèse des acides nucléiques peut être causée par l’inhibition spécifique de
certaines topoisomérases. En effet, le flavanol rutine (i.e. quercetin 3-O-β-D-glucose-[1,6]-O-α-L-
rhamnose) inhibe la topoisomérase IV, essentielle à la survie des cellules, et entraîne une réponse SOS
et l’inhibition de croissance d'E. coli (Bernard, Sablé et al. 1997). L'inhibition de la topoisomérase IV de
S. aureus semble être également impliquée dans le mécanisme d'action de la galangine contre S.
aureus résistant à la 4-quinolone. De manière intéressante, la souche S. aureus dont la sous-unité GrlB
de la topoisomérase IV a été mutée (S410 -> P410) a une plus forte sensibilité (par comparaison avec la
souche sauvage) vis-à-vis de la galangine (Cushnie and Lamb 2006).

o Inhibition du métabolisme énergétique :

Deux rétrochalcones (se différencient des chalcones par l'absence d'atome d'oxygène en position
2), les licochalcones A et C de Glycyrrhiza inflata, ont des activités antibactériennes contre les bactéries
à Gram positif, telles S. aureus et Micrococcus luteus (Haraguchi, Tanimoto et al. 1998). Les deux
rétrochalcones inhibent la respiration chez S. aureus et M. luteus, et plus particulièrement inhibent la
cytochrome C réductase. Les licochalcones inhibent la chaîne respiratoire, et ciblent
vraisemblablement l'étape située entre CoQ et le cytochrome C (ni la cytochrome C oxydase ni la CoQ
réductase ne sont inhibées par les licochalcones) (Haraguchi, Tanimoto et al. 1998).

57
 o Inhibition de la synthèse de la paroi cellulaire :

Le mode d'action de deux flavonoïdes antibactériens; la quercétine (3,3′,4′,5,7-

pentahydroxyflavone) et l’apigénine (4′,5,7-trihydroxyflavone), a été étudié chez Helicobacter pylori et
E. coli (Wu, Kong et al. 2008). Plus particulièrement, les cinétiques d'inhibition d'une cible de ces deux
flavonoïdes ; la D-alanine:D-alanine ligase (Ddl), un enzyme impliqué dans la biosynthèse du
peptidoglycane ont été caractérisées. La quercétine et l’apigénine agissent comme inhibiteurs
compétitifs avec le substrat ATP et comme inhibiteurs non compétitifs avec le substrat D-ala de la Ddl.
La quercétine est un inhibiteur plus fort de la Ddl par comparaison avec l’apigénine, suggérant que les
deux groupes hydroxyles supplémentaires de la quercétine par rapport à l’apigénine interviennent
dans l’activité inhibitrice de la Ddl et l'affinité du flavonoïde pour la Ddl (Wu, Kong et al. 2008).

o Réduction de la fluidité de la membrane :

Comme les catéchines, le flavonoïde sophoraflavanone G (5,7,2',4'-tetrahydroxy-8-

lavandulylflavanone) réduit la fluidité des membranes (Tsuchiya and Iinuma 2000). Les effets sur la
membrane du sophoraflavanone G ont été comparés à ceux de la naringénine sur des modèles de
membranes (liposomes) préparés à partir de 1,2-dipalmitoyl-L-α-phosphatidylcholine (DPPC) et de 1-
palmitoyl-2-oleoyl-L-α-phosphatidylcholine (POpe) en utilisant une méthode de polarisation de
fluorescence. La sophoraflavanone G réduit la fluidité membranaire des couches externe et interne
des deux membranes modèles dès 0.05 mg.L-1, tandis qu'une réduction significative de la fluidité n’a
pu être observée qu’au-delà de 2.5 mg.L-1 de naringénine. Le groupe lavandulyle en position C-8
semble permettre à la sophoraflavanone G de renforcer son activité antibactérienne par réduction de
la fluidité membranaire (Tsuchiya and Iinuma 2000).

o Inhibition de la synthèse membranaire :

Les propriétés d'inhibition de la synthèse des acides gras de type II des bactéries du gallate
d'épigallocatéchine et de ses dérivés polyphénols ont été caractérisées (Zhang and Rock 2004). L’EGCG
inhibe les étapes catalysées par les réductases FabG (β-ketoacyl-ACP réductase) et FabI (trans-2-enoyl-
ACP réductase) du cycle d’élongation des acides gras de type II. L’EGCG est un inhibiteur de FabG et
FabI en interférant avec la liaison des cofacteurs NAD(P)H aux enzymes (Zhang and Rock 2004).

II.3.4.3 Relation structure-activité

Dans la littérature, plusieurs études ont caractérisé l’effet antibactérien des flavonoïdes mais très
peu d’entre elles émettent une relation entre la structure et l’activité du composé. L'importance de
certains groupes chimiques pour l’activité antibactérienne d’un flavonoïde spécifique a été soulignée.

58
Par exemple les groupes hydroxyles en position 7, 2’ et 4’ du 5-hydroxyflavanone et 5-
hydroxyisoflavanone sont importants pour l’inhibition de la croissance de Streptococcus mutans et
Streptococcus sobrinus (Osawa, Yasuda et al. 1992). Ou encore l'hydroxyle en C-5 d’un flavanone ou
flavone a son importance dans l’activité antibactérienne contre les MRSA (Alcaràz, Blanco et al. 2000).
De plus, l’absence d’un groupe hydroxyle en C-3 (flavone) diminue a priori l’activité antibactérienne
des flavonoïdes par rapport aux flavonols (Tripoli, Guardia et al. 2007, Karioti, Sokovic et al. 2011). Il a
aussi été démontré que la présence d’un sucre dans la structure d’un flavonoïde (flavonoïde glycosylé)
possède une activité antibactérienne plus faible par rapport à leur aglycone (Xu, Wang et al. 2015).
Une étude plus approfondie sur la relation activité-structure des flavanones par l’équipe de Tsuchiya
a été effectuée à partir des MIC obtenues avec MRSA. La 2’,4’ ou 2’,6’-dihydroxylation du cycle B et la
5,7-dihydroxylation du cycle A dans la structure flavanone sont importantes pour l'activité anti-MRSA
(Tsuchiya and Iinuma 2000). Bien qu’il y ait eu des études comparatives de la structure avec l’activité
antibactérienne des flavonoïdes, une analyse plus approfondie reste nécessaire pour comprendre les
effets des différentes structures des flavonoïdes sur leur effet antibactérien.

II.3.4.4 Action des flavonoïdes : bactériostatique ou bactéricide ?

Plusieurs équipes à travers les études de caractérisation de l’activité antibactérienne ont essayé de
déterminer le type d’activité des flavonoïdes. Par exemple, il a été déterminé par antibiogramme que
la galangine possède une activité bactéricide contre S. aureus, P. aeruginosa et quelques entérocoques
(Pepeljnjak and Kosalec 2004). Cependant, des études portant sur des modèles de membranes
montrent que les flavonoïdes provoquent l’agrégation des cellules (Ikigai, Nakae et al. 1993). Une
étude plus récente a effectivement mis en évidence que le flavonol galangine provoque une agrégation
des cellules de S. aureus (Cushnie, Hamilton et al. 2007). L’agrégation des cellules entraîne une
diminution du nombre de colonies formées (CFU). Par conséquent, la caractérisation du type d’activité
pour un flavonoïde entraînant une agrégation des cellules est difficile à déterminer avec les méthodes
actuelles. Néanmoins, l’agrégation des cellules par un flavonoïde reste un indice sur le mécanisme
d’action potentiel de celui-ci.

59
III RÉSULTATS

Propriétés antibiotiques de la pinocembrine et de la naringénine

Activité antibactérienne en milieu solide

Avec l'objectif de déterminer l’activité antibactérienne de la naringénine et de la pinocembrine

contre B. subtilis, nous avons dans un premier temps effectué un test Kirby–Bauer (test de diffusion
sur disques) pour déterminer la sensibilité de la souche à ces deux composés en déterminant la
Concentration Minimale Inhibitrice (MIC, pour Minimal Inhibitory Concentration). L’antibiogramme a
été réalisé avec la souche B. subtilis BSB1 sur LB-Agar (Figure 17) et la souche CS1 ∆eps sur milieu LB-
Agar + gélose molle supplémenté de 1% de DMSO (Figure 18). La BSB1 et sa dérivée CS1 ∆eps ont été
testées en vue des expériences programmées : BSB1 pour les expériences de caractérisation de
l'activité antibactérienne et sa dérivée pour l’expérience d’évolution adaptative en laboratoire (car la
souche CS1 ∆eps est moins propice à la formation de biofilm ; cf. § V.1).

La spectinomycine (0.1 g.L-1, 1 g.L-1, 10 g.L-1) et la kanamycine (5 mg.L-1, 50 mg.L-1, 500 mg.L-1) ont
été utilisées ici comme contrôles positifs lors de cette expérience (Figure 17). Le DMSO et H2O, utilisés
pour la solubilisation des antibiotiques ont été utilisés comme contrôles négatifs. Les solutions
d'antibiotiques ont été déposées à différentes concentrations sur les disques de papier pour évaluer
la MIC grâce à la diffusion des composées à travers la gélose. Chaque valeur numérique indiquée en
Figure 17 pour chaque antibiotique correspond à la concentration de la goutte déposée. Après 18 h à
37°C, nous avons obtenu les résultats présentés en Figure 17.

Les contrôles négatifs (DMSO, H2O) et positifs (spectinomycine et kanamycine) donnent les
résultats attendus sur les deux boîtes. Aucune inhibition de croissance n'est observée pour les
contrôles négatifs, et un halo d'inhibition de croissance bactérienne est présent pour les
concentrations intermédiaires (spectinomycine 1 g.L-1 et kanamycine 50 mg.L-1) et élevées
(spectinomycine 10 g.L-1 et kanamycine 500 mg.L-1) des antibiotiques contrôles. On observe un halo
d’inhibition à 30 g.L-1 de naringénine et des halos d'inhibition à 1,5 g.L-1 et 15 g.L-1 de pinocembrine.
Après 18 h d'incubation à 37°C, on constate que les halos obtenus en présence de naringénine 30 g.L-
1
et de pinocembrine 1,5 g.L-1 ne sont pas uniformes contrairement aux autres halos. Ces halos
correspondent au diamètre de la goutte déposée et non à la diffusion du composé dans la gélose, ce
qui suggère que la naringénine et la pinocembrine n’ont pas, ou peu, diffusé sur la gélose en LB.

60
Figure 17 : Antibiogramme de la naringénine et de la pinocembrine en présence de B. subtilis BSB1.
Test de Kirby-Bauer en présence de naringénine noté Nar (A) et pinocembrine noté Pino (B) en milieu
riche (LB) et en présence des contrôles : spectinomycine (noté Spec, antibiotique bactériostatique) et
kanamycine (noté Kan, antibiotique bactéricide) comme contrôles positifs ; DMSO et H2O comme
contrôles négatifs. Les antibiotiques ont été testés à trois concentrations : spectinomycine (0.1 g.L-1,
1 g.L-1, 10 g.L-1), kanamycine (5 mg.L-1, 50 mg.L-1, 500 mg.L-1), naringénine (0.3 g.L-1, 3 g.L-1, 30 g.L-1),
pinocembrine (0.15 g.L-1, 1,5 g.L-1, 15 g.L-1).

Un antibiogramme a aussi été effectué en présence de la souche CS1 Δeps (Figure 18) dans des
conditions similaires à celles décrites ci-dessus. Pour améliorer la diffusion des flavonoïdes,
l’antibiogramme a été effectué sur boîte LB + gélose molle supplémentée de 1% de DMSO. Aucune
inhibition n’est observée pour les contrôles négatifs et un halo d’inhibition est présent pour les trois
contrôles positifs testés excepté pour le chloramphénicol qui ne présente qu’un halo d’inhibition pour
sa concentration la plus forte (10 g.L-1). Quant aux flavonoïdes, un halo d’inhibition asymétrique est
observable à 30 g.L-1 et 15 g.L-1 pour la naringénine et à 15 g.L-1 et 7,5 g.L-1 pour la pinocembrine. La
gélose molle supplémentée de 1% de DMSO n’a pas permis d’augmenter la diffusion de la naringénine
et de la pinocembrine de manière significative.

Les résultats démontrent la toxicité de la naringénine et de la pinocembrine envers B. subtilis mais

ne permettent cependant pas de déterminer précisément la MIC de ces deux composés. Afin de
déterminer si l'absence du papier filtre permettrait une meilleure diffusion des composés, des
antibiogrammes ont été effectués sans filtre sur boîte LB supplémenté ou non de DMSO. Cependant,
la valeur du MIC en milieu solide reste toujours difficile à déterminer par cette méthode.

61
Figure 18: Antibiogramme de la naringénine et de la pinocembrine en présence de la souche B.
subtilis CS1 Δeps.
Test de Kirby-Bauer des différents contrôles (A) et de la naringénine et de la pinocembrine (B). Les
contrôles sont : la spectinomycine (noté Spec, antibiotique bactériostatique), le chloramphénicol (noté
Cam, antibiotique bactériostatique) et la kanamycine (noté Kan, antibiotique bactéricide) comme
contrôles positifs ; DMSO et H2O comme contrôles négatifs. Les antibiotiques ont chacun été testés
pour des concentrations différentes : spectinomycine (1 g.L-1, 10 g.L-1, 100 g.L-1), kanamycine (0,05 g.L-
1
, 0,5 g.L-1, 10 g.L-1), naringénine (1,5 g.L-1, 3 g.L-1, 15 g.L-1, 30 g.L-1), pinocembrine (0,75 g.L-1, 1,5 g.L-1,
7,5 g.L-1, 15 g.L-1).

Dans le but de pouvoir déterminer la MIC de ces deux composés, un antibiogramme via un gradient
de concentrations a alors été effectué. Des gradients de 0 à 100 mg.L-1 de pinocembrine et de 0 à
300 mg.L-1 de naringénine ont été réalisés sur boîte LB-Agar. Il a été observé un effet toxique de la
pinocembrine et de la naringénine contre la souche B. subtilis BSB1 : présence d’un front d’inhibition
en présence des deux flavonoïdes (ligne noire en pointillé, Figure 19). La distance à laquelle le front
d'inhibition se situe par rapport à la ligne de départ (gélose en absence de flavonoïdes) a été mesurée,
et rapportée à la longueur du gradient de flavonoïdes pour chacun des composés testés. La MIC a été
ainsi estimée à 70 mg.L-1 de pinocembrine et à 100 mg.L-1 de naringénine (Figure 19).

62
Figure 19 : Antibiogramme via un gradient de concentrations de la naringénine et de la
pinocembrine.
Gradient de concentrations de 0 à 100 mg.L-1 de pinocembrine (à gauche) et de 0 à 300 mg.L-1 de
naringénine (à droite). Une culture de B. subtilis BSB1 a été utilisée à une densité optique DO600nm = 0,3
pour chaque expérience.

Les valeurs de MIC déterminées lors de cette expérience ont permis d’établir une gamme de
concentrations pour chaque flavonoïde qui a été utilisée lors des tests de toxicité (cf. § III.1.2).

Test de toxicité vis-à-vis de B. subtilis

Des tests de toxicité à haut débit en plaque 96 puits ont été réalisés pour mesurer avec précision
l'activité antibactérienne des flavonoïdes et obtenir les courbes de dose-réponse des souches d’E. coli
et de B. subtilis en présence de pinocembrine et de naringénine. Basés sur des résultats préliminaires
obtenus au sein de l’équipe SyBER (données fournies gracieusement par Vincent Sauveplane), le test
de toxicité vis-à-vis d'E. coli a été effectué avec la gamme de concentration suivante : 0 - 50 - 100 - 150
- 200 - 250 - 300 mg.L-1 de naringénine et 0 - 50 - 80 - 100 - 150 - 200 mg.L-1 de pinocembrine. Les seuils
de solubilité en milieu de culture de la naringénine et de la pinocembrine sont de 300 et 200 mg.L-1
respectivement. Dans le cas du test de toxicité vis-à-vis de B. subtilis, une gamme de concentration a
été définie pour chacun des composés, basée sur les résultats décrits en paragraphe III.1.1. Cette
gamme a été affinée au fur et à mesure des réplicats effectués nous permettant ainsi de définir les
gammes suivantes : 0 - 10 - 20 - 30 - 40 - 50 - 60 - 70 - 80 - 90 - 100 - 120 - 140 - 150 - 160 mg.L-1 de
naringénine et 0 - 9 - 10 - 12 - 15 - 18 - 20 - 25 - 30 - 35 - 40 - 43 - 46 - 49 - 52 mg.L-1 de pinocembrine
dans un milieu riche. Dans un milieu minimum, les gammes suivantes qui ont été utilisées : 0 - 2,45 -
4,9 - 6,9 - 9,8 - 14,7 - 19,6 - 24,5 - 29,4 - 39,2 - 44,1 - 49 - 53,8 - 63,7 - 68,6 - 73,5 - 78,4 - 83 - 88 mg.L-1
de naringénine et 0 - 3 - 6 - 9 - 12 - 15 - 18 - 20 - 25 - 30 - 35 - 40 - 43 - 52 - 55 - 58 mg.L-1 de pinocembrine.

63
 Un premier traitement des données de croissance bactérienne a été effectué avec le logiciel
MATLAB (MathWorks) pour la visualisation des courbes de croissance bactérienne en échelle
logarithmique (log) pour chacune des cultures. Ce traitement nous a permis de réaliser un premier
contrôle qualité des courbes de croissance pour chacun des puits de la microplaque et de définir la
phase exponentielle (phase linéaire des courbes en échelle logarithmique) de l’ensemble des courbes.
Certaines cultures n'ont débuté qu'après 10 heures d'incubation à 37°C. Dans ce cas, lorsque les
cultures nécessitaient plus de 10 h avant d’entrer en phase exponentielle, les cultures ont été exclues
du calcul du taux de croissance. En effet, nous ne pouvons pas exclure dans ces cas que la croissance
a été rendue possible i) par l’émergence d’un mutant moins sensible à l’antibiotique ou ii) par la
dégradation du flavonoïde. Un deuxième traitement des données avec MATLAB a été effectué pour
calculer les taux de croissance (µ) pour chaque triplicat. Un exemple de traitement MATLAB est
présenté dans la section Matériels et Méthodes, §V.6. Chaque courbe de dose-réponse est
représentée de sorte que le taux de croissance de B. subtilis est exprimé en pourcentage par rapport
au taux de croissance en absence de flavonoïde – valeur du µ rapporté à la valeur du µ en absence de
flavonoïde – en fonction de la concentration en flavonoïde.

La courbe de dose-réponse de la souche E. coli BL21 est représentée en fonction des concentrations
de naringénine et de pinocembrine (Figure 20). La naringénine n’a presque pas d’effet toxique jusqu'à
300 mg.L-1 (proche de la limite de solubilité de la naringénine dans le milieu) et la pinocembrine
possède un très léger effet toxique vers 200 mg.L-1 sur cette bactérie à Gram négatif (Figure 20).

Pour chaque concentration de flavonoïdes, la courbe dose-réponse de la souche B. subtilis BSB1

représente une moyenne d'au moins 9 valeurs de taux de croissance de cultures indépendantes de B.
subtilis. Dès 10 mg.L-1 de flavonoïde, un effet toxique sur la croissance bactérienne des deux composés
a été observé. Une diminution de 50% du taux de croissance de B. subtilis a été observée à 81 mg.L-1
de naringénine et à 37 mg.L-1 de pinocembrine en milieu riche et 74 mg.L-1 de naringénine et à 42 mg.L-
1
de pinocembrine en milieu pauvre (Figure 20), valeurs correspondant à l’IC50 – concentration en
flavonoïde pour laquelle le taux de croissance est divisé par deux.

64
Figure 20 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis d'E. coli et de B. subtilis.
Taux de croissance en présence de naringénine (bleu foncé) et de pinocembrine (rouge) (graphique
semi-logarithmique). Courbes dose-réponse d'E. coli en milieu riche (CHG) (à gauche) et de B. subtilis
en CHG (au centre), en milieu pauvre (malate M9) (à droite). Les courbes en pointillé bleu foncé et
rouge représentent le meilleur « fit » semi-logarithmique des données expérimentales en présence de
naringénine : (R2=0,9708 ; y=-23,37ln(x)+152,8), (R2=0,9382 ; y=-36,81ln(x)+208,52) et de
pinocembrine : (R2=0,9806 ; y=-60,15ln(x)+267,1), (R2=0,988 ; y=-30,13ln(x)+162,72) en CHG et M9
malate respectivement. Le taux de croissance maximal (µmax) de B. subtilis est de 2,3 h-1 en absence de
flavonoïde. A titre indicatif, les zones grises (au centre et à droite) correspondent aux concentrations
d'antibiotiques couramment utilisées en laboratoire. Les flèches en orange montrent le point
d’inflexion des courbes.

Les courbes dose-réponse de B. subtilis en présence de naringénine ou pinocembrine présentent

deux phases, et un point d’inflexion est observé (, Figure 20). Plusieurs hypothèses ont alors été
émises telles que : i) l'action de deux mécanismes différents dépendant de la concentration en
flavonoïdes ; ii) la saturation d’une pompe à efflux.

Détermination du type d’antibiotique

La viabilité des cellules a été testée afin de déterminer si la naringénine et la pinocembrine sont des
antibiotiques de type bactériostatique ou bactéricide. Cette expérience a été réalisée sur la souche B.
subtilis BSB1 avec différents temps d’incubation (t = 0 h, t = 3 h et t = 24 h) et en présence ou absence
de flavonoïdes en milieu liquide. Deux antibiotiques contrôles ont été utilisés : l'antibiotique
bactéricide kanamycine à 5 mg.L-1 et l’antibiotique bactériostatique spectinomycine à 100 mg.L-1. La
naringénine et la pinocembrine ont été testées à une concentration de 200 mg.L-1 et 60 mg.L-1
respectivement. Les cellules des différentes conditions ont été étalées sur boîtes LB puis les colonies
obtenues des différentes conditions à J+1 ont été comptabilisées permettant d’obtenir une tendance
de la viabilité des cellules dans les différentes conditions testées (cf. §V.7.3).

65
Figure 21 : Caractérisation de l’activité bactéricide ou bactériostatique des flavonoïdes contre B.
subtilis.
Test de viabilité de B. subtilis en présence de deux antibiotiques contrôles : l'antibiotique bactéricide
kanamycine (noté Kan, 5 mg.L-1) et l'antibiotique bactériostatique spectinomycine (noté Spec,
100 mg.L-1), et deux flavonoïdes : naringénine (noté Nar, 200 mg.L-1) et pinocembrine (noté Pino,
60 mg.L-1) testés à différents temps d’incubations : à t = 0 h (bleu), à t = 3 h (orange) et à t = 24 h (gris).
Contrôle négatif : B. subtilis sans antibiotique (Ø) en milieu LB.

La culture de B. subtilis sans antibiotique (Ø) a été utilisée comme contrôle négatif permettant
d’avoir un profil de croissance en fonction des différents temps d’incubation (Figure 21). Le profil de
croissance en présence de pinocembrine (Pino) est similaire à celui de la kanamycine (Kan),
antibiotique bactéricide. A t = 24 h, aucune colonie n’a été observée dans ces deux conditions. La
culture en présence de naringénine (Nar) a un profil de croissance similaire à celui de la spectinomycine
(Spec), antibiotique bactériostatique. En effet, à t = 24 h la présence de colonies (≈ 400) sur boîtes
indique que les cellules étaient encore viables après une longue période d’incubation en présence de
spectinomycine et naringénine.

Ainsi après 24 heures d'incubation, la viabilité était complètement perdue lorsque les cellules
étaient en présence de pinocembrine ou en présence de kanamycine, mais toujours viables en
présence de naringénine et spectinomycine (Figure 21). La pinocembrine possède par conséquent une
activité bactéricide tandis que la naringénine possède une activité bactériostatique (aux
concentrations utilisées).

66
 Etude de l’association de deux flavonoïdes

Dans le but de caractériser les effets sur B. subtilis que peuvent avoir les deux flavonoïdes, la
naringénine et la pinocembrine, lorsqu'ils sont tous les deux présents dans un même milieu, un test de
toxicité a été réalisé en présence de ces deux flavonoïdes et comparé à ceux obtenus en présence de
pinocembrine seule ou de naringénine seule aux concentrations équivalentes. Nous présupposons en
effet que quatre types d’interactions peuvent être observés lors d’une association d’antibiotiques :

i) l’indépendance de l’un vis-à-vis de l’autre : aucun changement de l’activité de l’un des

antibiotiques en présence de l’autre ;

ii) l’addition : l’effet de l’association est identique à la somme des effets de chaque antibiotique
pour une même concentration ;

iii) la synergie : l’effet de l’association est supérieur à la somme des effets de chaque antibiotique
pour une même concentration ;

iv) l’antagonisme : l’effet de l’association est inférieur à l’effet de l’un ou l’autre antibiotique (Denes
and Hidri 2009).

Différents profils peuvent être attendus. Si l’antibiotique N correspond à la naringénine et

l’antibiotique P correspond à la pinocembrine (Figure 22), l’association de ces deux flavonoïdes peut
soit être antagoniste (zone violette), soit indépendante (zone grise), soit synergique (zone verte), soit
additive (zone jaune).

67
Figure 22 : Réponses possibles à l’association de deux antibiotiques.

L'effet sur le taux de croissance de B. subtilis en concentration équivalente naringénine ou en

concentration équivalente pinocembrine est indiqué par les zones bleues et rouges respectivement.
On détermine la concentration de P pour laquelle on observe un effet équivalent à celui observé pour
N (concentration équivalente P). Inversement, on détermine la concentration de N pour laquelle on
observe un effet équivalent à celui observé pour P (concentration équivalente N). Ainsi, on parlera de
concentration équivalente en naringénine si le profil de l’association simule l’action de la naringénine
seule (zone bleue) ou de concentration équivalente en pinocembrine si au contraire le résultat de
l’association correspond à l’action de la pinocembrine seule (zone rouge) (Figure 22). Les unités
équivalentes sont utiles conceptuellement, et d’un point de vue moléculaire, cela peut permettre de
comprendre l’action de deux antibiotiques ciblant au moins une cible moléculaire (fonction
enzymatique, machinerie cellulaire, etc.) identique, et dont l’addition refléterait principalement la
toxicité liée à l’inactivation de cette cible par une augmentation de la concentration en « inhibiteur ».

Plusieurs combinaisons de concentrations en flavonoïdes ont alors été utilisées lors de cette
expérience : i) association de 14 mg.L-1 de naringénine (N) et 18 mg.L-1 de pinocembrine (P) noté
N14+P18 ; ii) association de 20 mg.L-1 de naringénine et 40 mg.L-1 de pinocembrine (N20+P40) ; iii)
association de 70 mg.L-1 de naringénine et 20 mg.L-1 de pinocembrine (N70+P20) ; iv) association de
81 mg.L-1 de naringénine et de 37 mg.L-1 de pinocembrine (N81+P37) et v) association de 125 mg.L-1 de
naringénine et 44 mg.L-1 de pinocembrine (N125+P44). Les courbes de dose-réponse de la naringénine
et de la pinocembrine nous ont servi à déterminer l'effet attendu sur le taux de croissance aux

68
concentrations équivalentes N ou P (Figure 22, Table 8). Les gammes de concentrations suivantes ont
été utilisées : 0 - 14 - 20 -70 -81 et 125 mg.L-1 de naringénine et 0 - 18 - 20 - 37 - 40 - 44 mg.L-1 de
pinocembrine afin de déterminer leur toxicité aux différentes concentrations testées.

Table 8 : Concentrations équivalentes en naringénine et pinocembrine pour chaque association de

naringénine et de pinocembrine.
Pour chaque association de flavonoïdes, la concentration équivalente en naringénine (Neq) ou en
pinocembrine (Peq) (mg.L-1) a été calculée et la valeur du taux de croissance obtenu pour la
concentration du flavonoïde équivalent a été calculée (à partir des courbes de toxicité des flavonoïdes
seuls, Figure 20).

Flavonoid association N14+P18 N20+P40 N70+P20 N81+P37 N125+P44

Naringenin equivalent (Neq) N60 N101 N123 N191 N279
Growth rate (%) for Neq 57% 45% 40% ~30% 
Pinocembrin equivalent (Peq) P30 P55 P55 P71 P91
Growth rate (%) for Peq 62% ~30% ~30%  
 : Lethal

Les courbes dose-réponse (représentées Figure 20) dont les points expérimentaux sont une
moyenne de 9 valeurs de taux de croissance de cultures indépendantes de B. subtilis, sont
représentées Figure 23 en bleu clair et rouge. Les taux de croissance obtenus lors de cette expérience
en présence de naringénine (bleu foncé) ou de pinocembrine (orange) sont indiqués également Figure
23, et comparés aux courbes de référence de la naringénine (bleu clair) et de la pinocembrine (rouge)
(Figure 23). Cette comparaison a permis de contrôler la reproductibilité des mesures des taux de
croissance et de caractériser l’activité du composé à chaque concentration testée. Nous avons observé
que les taux de croissance sont proches de la courbe de référence pour les deux flavonoïdes excepté
les points obtenus à 14 et 20 mg.L-1 de naringénine qui présentent une plus grande variabilité. Ces taux
de croissance ont ensuite été utilisés comme témoin de l’effet de la naringénine et de la pinocembrine
sur B. subtilis.

69
Figure 23 : Taux de croissance de B. subtilis en présence de naringénine et de la pinocembrine
superposés aux courbes dose-réponse de référence de naringénine et de pinocembrine.
Courbes de dose-réponse en présence de naringénine (⚫ bleu clair) et de pinocembrine (◼ rouge clair)
utilisées comme référence (noté R) (graphique semi-logarithmique). Taux de croissance obtenus au
cours de cette expérience en présence de naringénine (⚫ bleu foncé) ou de pinocembrine (◼
bordeaux).

L’effet de l’association des deux flavonoïdes a ensuite été déterminé (Figure 24) et résumé Table 9
sauf pour la condition N125+P44 car la culture a mis plus de 10 h pour atteindre la phase exponentielle
et a donc été exclue des analyses.

Le taux de croissance (exprimé en pourcentage du taux de croissance de la souche en absence de

flavonoïde) déterminé pour N14 est sensiblement plus élevé qu'attendu (µ= 87% au lieu de 75%) et
inversement le taux de croissance à P18 est plus faible qu'attendu (µ= 68,8% au lieu de 75%) (Figure
23, Figure 24). L’association de la naringénine à 14 mg.L-1 (N14) et de la pinocembrine à 18 mg.L-1 (P18)
présente un effet additif des deux flavonoïdes (Figure 24A). Dans ce cas précis, il est difficile de
conclure si l’effet observé (taux de croissance à 63,2 % ± 1,8) est similaire à celui de la concentration
équivalente en naringénine (60 mg.L-1 , µ ≈ 57%) ou à celui de la concentration équivalente de la
pinocembrine (30 mg.L-1, µ ≈ 62%) (Table 8, Table 9). Le taux de croissance déterminé en présence de
N20 ou P40 est sensiblement plus élevé qu’attendu (µN = 83,7% et µP = 52,2% au lieu de µN = 71,5% et
µP = 45,2% respectivement) (Figure 23, Figure 24).

70
Figure 24 : Effet de l’association de la naringénine et de la pinocembrine par comparaison avec l’effet
obtenu avec le flavonoïde seul.
Sont indiqués les taux de croissance de B. subtilis en présence de naringénine ou de pinocembrine, et
les taux de croissance en présence des deux flavonoïdes associés dans le milieu. Association de la
naringénine et de la pinocembrine à N14+P18 (A), à N20+P40 (B), à N70+P20 (C), à N81+P37 (D) et à
N125+P44 (E).

71
Table 9 : Effet de l’association de la naringénine et de la pinocembrine en comparaison avec l’effet
obtenu par le flavonoïde seul.
Taux de croissance (µ en %) obtenu pour chaque condition. Lorsqu’il nous a été impossible de calculer
le taux de croissance (retard de croissance de plus de 10h), l’abréviation N/A a été inscrite dans la
table.

Flavonoid N14+P18 N20+P40 N70+P20 N81+P37 N125+P44

Naringenin équivalent 87,0 ± 4,9 83,7 ± 6,4 56,9 ± 4,6 57,7 ± 2,2 38 ± 1,8
Pinocembrin équivalent 68,8 ± 4,3 52,2 ± 2,5 64,1 ± 4,3 44,4 ± 2,6 40 ± 2,3
Association 63,2 ± 1,8 48,3 ± 1,5 47,3 ± 4,1 33,9 ± 1,6 N/A
N/A : non mesurable

Un effet additif est observé dans le cas de l’association de 20 mg.L-1 de naringénine et 40 mg.L-1 de
pinocembrine (N20+P40) et équivaut au taux de croissance à la concentration équivalente en
naringénine (ligne en pointillé bleu) à 101 mg.L-1 (Figure 24B). En effet, l’effet sur le taux de croissance
obtenu à N20+P40 ne correspond pas à celui déterminé pour la concentration équivalente en
pinocembrine : l’effet est moins toxique que celui prédit (ligne en pointillé rouge). Le taux de croissance
à 70 mg.L-1 de naringénine est similaire à celui attendu (µobtenu = 56,9% proche du µattendu = 53,5%). En
présence de pinocembrine le taux de croissance est légèrement plus faible (µ = 64,1% au lieu de
71,9%). L’association de 70 mg.L-1 de naringénine et 20 mg.L-1 de pinocembrine (N70+P20) induit un
taux de croissance plus faible que ceux des deux flavonoïdes seuls (Table 9). L’effet sur le taux de
croissance de l’association de ces deux flavonoïdes est similaire à la somme des effets observés pour
chaque flavonoïde étudié séparément et exprimé en équivalent naringénine. En effet, l’effet observé
est additif et équivaut à l’effet de la naringénine seule pour une concentration à 123 mg.L-1 (Figure
24C, Table 8). Un effet similaire est observé à N81+P37 (Figure 24D). La naringénine (N81) et la
pinocembrine (P37) induisent des réductions de taux de croissance attendues (proche de 50%).
L’association de 81 mg.L-1 de naringénine et 37 mg.L-1 de pinocembrine induit une forte diminution du
taux de croissance (34%) qui correspond à un effet additif des deux flavonoïdes (Figure 24D) et
équivaut à l’effet sur le taux de croissance à concentration équivalente de la naringénine à 191 mg.L-1
(Figure 24D, Table 8) et non à celle de la pinocembrine (71 mg.L-1), concentration létale pour B.
subtillis. Les taux de croissance obtenus en présence de N125 ou P44 correspondent à ceux attendus
(environ 40% du taux de croissance en absence de flavonoïde) (Figure 24E, Table 9). Le taux de
croissance de l’association de 125 mg.L-1 de naringénine et 44 mg.L-1 de pinocembrine n’a pas été pris
en compte du fait du retard de croissance de plus de 10h d’incubation à 37°C (qui est d’ailleurs prédit
pour être létale en cas d’additivité des effets de toxicité, que ce soit en équivalent pinocembrine ou
en équivalent naringénine).

72
 En conclusion et au vu des résultats, l’association de ces deux flavonoïdes montre un effet additif
prédictible en se basant sur l’effet de chacun des deux flavonoïdes pris de manière indépendante et
exprimé en équivalent naringénine, ce qui traduit le fait que certaine(s) cible(s) de la naringénine et de
la pinocembrine sont communes. En effet, l’effet observé de toxicité par l’association de ces deux
flavonoïdes résulte principalement de l’inhibition de la cible majeure de la naringénine, commune à la
pinocembrine. Ces résultats démontrent également que la pinocembrine possède de nombreuses
cibles moléculaires chez B. subtilis, du fait de sa forte toxicité (faible µ à faible dose de pinocembrine).

Etude de la relation entre la structure et l’activité antibactérienne des flavonoïdes

Caractérisation d’une collection de flavonoïdes

Nous avons constitué une collection de 63 flavonoïdes (Table 10) sélectionnés sur la base de leur
disponibilité commerciale, et de leur diversité structurelle notamment concernant leur degré
d'hydroxylation. Dans le but de caractériser ces 63 flavonoïdes et de déterminer parmi eux lesquels
sont actifs contre B. subtilis, différentes expériences de caractérisation ont été entreprises.

III.2.1.1 Détermination de l'activité antibactérienne de flavonoïdes par antibiogramme

Des antibiogrammes (cf. § V.7.1) ont été réalisés dans le but d’identifier de nouveaux flavonoïdes
actifs contre B. subtilis et de déterminer une valeur approximative de la MIC pour chacun d’eux. Au
total, sept boîtes d’antibiogramme ont été réalisées (Figure 25), chacune comportant des antibiotiques
contrôles tels que la spectinomycine, la kanamycine et le chloramphénicol, et deux flavonoïdes
contrôles précédemment caractérisés ; la naringénine et la pinocembrine. Les contrôles de solvant, le
DMSO et H2O sont également testés (Figure 25). Les résultats obtenus en présence des contrôles
(solvants et antibiotiques) permettent de valider le contrôle qualité des sept antibiogrammes. Parmi
les 61 nouveaux flavonoïdes testés, 22 ont montré un effet toxique sur B. subtilis. Nous avons constaté
aussi que 18 flavonoïdes de la librairie ont une coloration différente après incubation (Figure 25). Le
diamètre du halo de la coloration et/ou de l’inhibition a été mesuré et lorsque cela a été possible,
l'ordre de grandeur de la MIC a été estimé. Pour une concentration à 10 mg.L-1 de flavonoïde, certains
composés ont précipité en contact avec la gélose (e.g. la sakuranetine, Figure 25, antibiogramme C).
Afin de s’affranchir de ce problème et d’être plus précis dans la valeur numérique du MIC pour les
flavonoïdes toxiques, des antibiogrammes via des gradients de concentrations ont été effectués.

73
Table 10 : Librairie des flavonoïdes utilisés dans cette étude et descriptif de leurs structures.

Substituents at carbon position :

Compound 2 3 4 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ 6’
Flavones and their glycosides
Acacetin - - - - OH OH - - - OCH3 - -
Apigenin - - - OH - OH - - - OH - -
Apigenin-7-O-glucoside - - - OH - OR1 - - - OH - -
Baicalein - - - OH OH OH - - - - - -
Baicalein-5,6,7-trimethylether - - - OCH3 OCH3 OCH3 - - - - - -
Chrysin - - - OH - OH - - - - - -
Diosmetin - - - OH - OH - - OH OCH3 - -
Eupatorin - - - OH OCH3 OCH3 - - OH OCH3 - -
Flavone - - - - - - - - - - - -
Luteolin - - - OH - OH - - OH OH - -
Wogonin - - - OH - OH OCH3 - - - - -
7,8 Dihydroxyflavone - - - - - OH OH - - - - -
3',4'-Dihydroxyflavone - - - - - - - - OH OH - -
3',4'-Dimethoxyflavone - - - - - - - - OCH3 OCH3 - -
7-Hydroxyflavone - - - - - OH - - - - - -
3-Methoxyflavone - OCH3 - - - - - - - - - -
7-Methoxyflavone - - - - - OCH3 - - - - - -
3',4',7,8-Tetrahydroxyflavone - - - - - OH OH - OH OH - -
Flavonols and their glycosides
Datiscetin - OH - OH - OH - OH - - - -
Fisetin - OH - - - OH - - OH OH - -
Flavonol - OH - - - - - - - - - -
Galangin - OH - OH - OH - - - - - -
Hibifolin - OH - OH - OH OR4 - OH OH - -
Hyperoside - OR1 - OH - OH - - OH OH - -
Isorhamnetin - OH - OH - OH - - OCH3 OH - -

74
 Kaempferol - OH - OH - OH - - - OH - -
Morin - OH - OH - OH - OH - OH - -
Quercetin - OH - OH - OH - - OH OH - -
Quercetin-3-O-glucopyranoside - OR3 - OH - OH - - OH OH - -
Resokaempferol - OH - - - OH - - - OH - -
Rhamnetin - OH - OH - OCH3 - - OH OH - -
Robinetin trimethylether - OH - - - OH - - OCH3 OCH3 OCH3 -
Syringetin - OH - OH - OH - - OCH3 OH OCH3 -
3,6-Dihydroxyflavone - OH - - OH - - - - - - -
7-Hydroxyflavonol - OH - - - OH - - - - - -
7-Methoxyflavonol - OH - - - OCH3 - - - - - -
Flavanones and their glycosides
Bavachin - - - - OR5 OH - - - OH - -
Dihydromyricetin - OH - OH - OH - - OH OH OH -
Dihydrorobinetin - OH - - - OH - - OH OH OH -
Flavanone - - - - - - - - - - - -
Hesperidin - - - OH - OR2 - - OH OCH3 - -
Homoeriodictyol - - - OH - OH - - - OH OCH3 -
Isosakuranetin - - - OH - OH - - - OCH3 - -
Liquiritigenin - - - - - OH - - - OH - -
Naringenin - - - OH - OH - - - OH - -
Naringenin-7-O-glucoside - - - OH - OR1 - - - - - -
Naringin - - - OH - OR2 - - - OH - -
Pinocembrin - - - OH - OH - - - - - -
Pinocembrin-7-methylether - - - OH - OCH3 - - - - - -
Pinocembrin dimethylether - - - OCH3 - OCH3 - - - - - -
Sakuranetin - - - - - OCH3 - - - OH - -
2'-Hydroxyflavanone - - - - - - - OH - - - -
4'-Hydroxyflavanone - - - - - - - - - OH - -
6-Hydroxyflavanone - - - - OH - - - - - - -
7-Hydroxyflavanone - - - - - OH - - - - - -
6-Methoxyflavanone - - - - OCH3 - - - - - - -

75
Isoflavones and their glycosides
Daidzein - - - - - OH - - - OH - -
Daidzin - - - - - OR1 - - - OH - -
Genistein - - - OH - OH - - - OH - -
Genistin - - - OH - OR1 - - - OH - -
Ipriflavone - - - - - OC-2CH3 - - - - - -
3'-Hydroxydaidzein - - - - - OH - - OH OH - -
5-Methyl-7-methoxyisoflavone - - - CH3 - OCH3 - - - - - -
R1: glucose ; R2: rhamnose-glucose ; R3: glucopyranoside ; R4: glucuronic acid ; R5: prenyl group

76
77
Figure 25 : Antibiogramme de la librairie de flavonoïdes en présence de B. subtilis BSB1.
Les contrôles (deux premières lignes en haut de chaque boîte) sont : spectinomycine 2,5 g.L-1 (Spec),
chloramphénicol 2,5 g.L-1 (Cam) et kanamycine 2,5 g.L-1 (Kan) comme contrôles positifs ; DMSO et H2O
comme contrôles négatifs et naringénine et pinocembrine à 10 g.L-1 comme flavonoïdes contrôles. Ces
contrôles ont été utilisés sur chaque boîte d’antibiogramme. Toute la librairie a été testée à une
concentration de 10 g.L-1.
(A) Quercétine, apigénine, kaempférol, galangine, flavone, 3',4',7,8-tétrahydroxyflavone (1307),
isorhamnétine (1120 S), syringétine (1239 S) et acacétine.
(B) Datiscétine (1141 S), génistine (1325 S), flavanone (1038), hespéridine (1116 S), 3-méthoxyflavone
(1188), wogonine (1304 S), dihydrorobinétine (1037), morine (1344 S) et rhamnétine (1136 S).
(C) Génistéine (1372 S), hyperoside (1027 S), isosakuranétine (1122 S), dihydromyricétine (1351),
sakuranétine (1247 S), 7-hydroxyflavone (1060), quercétine-3-O-glucopyranoside (1327 S), 7-
hydroxyflavanone (1212) et 6-hydroxyflavanone (1182).
(D) Apigénine-7-O-glucoside (1004 S), homoériodictyol (1118 S), pinocembrine-7-methyléther (1095),
lutéoline (1125 S), 2'-hydroxyflavanone (1180), résokaempférol (1251), bavachine (1374),
pinocembrine diméthyléther (1296) et acacétine (1101 S).
(E) 7,8 dihydroxyflavone (1013), chrysine (1362 S), daidzine (1371 S), naringine (1129 S), naringénine-
7-O-glucoside (1160 S), 4'-hydroxyflavanone (1181), 3',4'-dihydroxyflavone (1204), 5-méthyl-7-
méthoxyisoflavone (1329) et flavonol (1026).
(F) Baicaléine (1171), ipriflavone (1328), 3'-hydroxydaidzéine (1309), fisétine (1167 S), daidzéine (1370
S), 7-méthoxyflavone (1289), 7-hydroxyflavonol (1258), 3,6-dihydroxyflavone (1345) et liquiritigénine
(1150 S).
(G) Eupatorine (1014), 3',4'-diméthoxyflavone (1297), 7-méthoxyflavonol (1194), diosmétine (1108 S),
hibifoline (1364 S), baicaléine-5,6,7-triméthyléther (1323), robinétine triméthyléther (1293) et 6-
méthoxyflavanone (1079).

III.2.1.2 Caractérisation par un antibiogramme via un gradient de concentration

Plusieurs antibiogrammes avec gradients de concentrations ont été effectués en plaque 8 puits afin
d’obtenir la valeur de la MIC pour chaque flavonoïde toxique contre B. subtilis. Le premier crible a été
effectué avec un gradient de 0 à 300 mg.L-1 pour l’ensemble de la librairie, et intégre la naringénine et
la pinocembrine comme contrôles des flavonoïdes (Figure 26).

78
 Nos résultats montrent des profils de réponse différents avec un nombre conséquent de
flavonoïdes au-dessus de leur seuil de solubilité (présence de cristaux et/ou de précipités), ce qui dans
ces cas-là n’a pas permis de conclure sur la toxicité de ces flavonoïdes. Toutefois, la MIC a été
déterminée pour les profils montrant un front d’inhibition (Table 11). Il a été aussi remarqué, comme
indiqué dans paragraphe précédent, que de nombreux gradients possèdent une coloration différente
par rapport aux contrôles (Table 11).

79
80
Figure 26 : Antibiogramme via un gradient de concentration de la librairie de flavonoïdes en
présence de B. subtilis BSB1.
Gradient de concentration de la librairie de flavonoïdes (0 à 300 mg.L-1). Une culture de B. subtilis BSB1
a été utilisée à une densité optique DO600nm ≈ 0,3*10-3.
(A) Flavone, galangine, quercétine, 3-méthoxyflavone (1188) et 7,8 dihydroxyflavone (1013).
(B) Datiscétine (1141 S), syringétine (1239 S), bavachine (1374), homoériodictyol (1118 S) et
isosakuranétine (1122 S).
(C) Liquiritigénine (1150 S), sakuranétine (1247 S), 2'-hydroxyflavanone (1180), 4'-hydroxy-flavanone
(1181) et 7-hydroxyflavanone (1212).
(D) 3'-Hydroxydaidzéine (1309), baicaléine (1171), lutéoline (1125 S), 3',4',7,8-tétrahydroxy-flavone
(1307) et morine (1344 S).
(E) Acacétine, apigénine, apigénine-7-O-glucoside (1004 S), baicaléine-5,6,7-triméthyléther (1323) et
chrysine (1362 S).
(F) Diosmétine (1108 S), eupatorine (1014), wogonine (1304 S), 3',4'-dihydroxyflavone (1204) et 3',4'-
diméthoxyflavone (1297).
(G) 7-Hydroxyflavone (1060), 7-méthoxyflavone (1289), fisétine (1167 S), flavonol (1026) et hibifoline
(1364 S).
(H) Hyperoside (1027 S), isorhamnétine (1120 S), rhamnétine (1136 S), quercétine-3-O-
glucopyranoside (1327 S) et résokaempférol (1251).
(I) Robinétine triméthyléther (1293), 3,6-dihydroxyflavone (1345), 7-hydroxyflavonol (1258), 7-
méthoxyflavonol (1194) et dihydromyricétine (1351).
(J) Dihydrorobinétine (1037), flavanone (1038), hespéridine (1116 S), naringénine-7-O-glucoside (1160
S) et naringine (1129 S).
(K) Daidzine (1371 S), génistéine (1372 S), génistine (1325 S), ipriflavone (1328) et 5-méthyl-7-
méthoxyisoflavone (1329).
(L) Pinocembrine-7-méthyléther (1095), pinocembrine diméthyléther (1296), 6-hydroxyflavanone
(1182), 6-méthoxyflavanone (1079) et daidzéine (1370 S).
Les contrôles sont : la naringénine (0 à 300 mg.L-1) et la pinocembrine (0 à 100 mg.L-1) comme
flavonoïdes contrôles et absence de flavonoïde comme contrôle négatif. Ces contrôles ont été utilisés
sur chaque boîte d’antibiogramme.

81
Table 11 : Récapitulatif du crible de la librairie des flavonoïdes par antibiogrammes avec gradients
de concentration des flavonoïdes.
Les MICs des flavonoïdes sont estimées à partir du front d'inhibition obtenu sur chaque gradient de
concentrations (0 à 300 mg.L-1). Le cas échéant, la couleur du gradient est précisée. Lorsque le gradient
ne nous a pas permis de déterminer la valeur de la MIC des flavonoïdes actifs ou lorsque le composé a
précipité, N/A est indiqué. Les valeurs de MICs de la naringénine et de la pinocembrine correspondent
à la moyenne des valeurs estimées sur l’ensemble des plaques.

Flavonoids Active (Yes / No) Estimated MIC Color

(mg.L-1)
Controls
Naringenin Yes 150 Yellow colonies
Pinocembrin Yes 17 -
Plate A
Flavone Yes N/A -
Galangin No - -
Quercetin Yes 73 Yellow gradient
3-Methoxyflavone No - -
7,8 Dihydroxyflavone Yes 73 -
Plate B
Datiscetin Yes N/A Yellow gradient
Syringetin N/A N/A Yellow gradient
Bavachin Yes 25.7 -
Homoeriodictyol Yes 128.6 Yellow colonies
Isosakuranetin Yes 34.2 -
Plate C
Liquiritigenin Yes 227 Yellow gradient
Sakuranetin Yes 51 -
2'-Hydroxyflavanone No - -
4'-Hydroxyflavanone Yes N/A -
7-Hydroxyflavanone Yes 51 -
Plate D
3'-Hydroxydaidzein No - Light orange gradient
Baicalein Yes 77 Orange gradient
Luteolin N/A N/A N/A
3',4',7,8- No - Light orange gradient
Tetrahydroxyflavon
Morin No - Yellow gradient
Plate E
Acacetin N/A N/A N/A
Apigenin N/A N/A N/A
Apigenin-7-O-glucoside N/A N/A N/A
Baicalein-5,6,7- N/A N/A N/A
trimethylether
Chrysin N/A N/A N/A
Plate F

82
Flavonoids Active (Yes / No) Estimated MIC Color
(mg.L-1)
Diosmetin No - -
Eupatorin N/A N/A -
Wogonin N/A N/A Ligh yellow gradient
3',4'-Dihydroxyflavone Yes 133 Yellow gradient
3',4'-Dimethoxyflavone N/A N/A -
Plate G
7-Hydroxyflavone N/A N/A -
7-Methoxyflavone N/A N/A -
Fisetin Yes 120 Yellow gradient
Flavonol N/A N/A -
Hibifolin No - -
Plate H
Hyperoside No - Yellow gradient
Isorhamnetin N/A N/A Light orange gradient
Rhamnetin N/A N/A Light orange gradient
Quercetin-3-O- No - Yellow gradient
glucopyranoside
Resokaempferol N/A N/A -
Plate I
Robinetin N/A N/A Yellow gradient
trimethylether
3,6-Dihydroxyflavone N/A N/A Light orange gradient
7-Hydroxyflavonol No - N/A
7-Methoxyflavonol N/A N/A Light orange gradient
Dihydromyricetin No - Dark orange gradient
Plate J
Dihydrorobinetin No - Dark orange gradient
Flavanone N/A N/A -
Hesperidin No - -
Naringenin-7-O- No - Orange gradient
glucoside
Naringin No - -
Plate K
Daidzin No - -
Genistein N/A N/A -
Genistin N/A N/A -
Ipriflavone N/A N/A -
5-Methyl-7- N/A N/A -
methoxyisoflavone
Plate J
Pinocembrin-7- N/A N/A -
methylether

83
 Flavonoids Active (Yes / No) Estimated MIC Color
(mg.L-1)
Pinocembrin N/A N/A -
dimethylether
6-Hydroxyflavanone No - -
6-Methoxyflavanone N/A N/A -
Daidzein No - -

Au cours de ce crible, 16 flavonoïdes ont été identifiés comme actifs – i.e. ayant un effet toxique –
contre B. subtilis. Pour trois d’entre eux, il nous a été impossible de définir leur MIC avec le gradient
utilisé car aucun front d’inhibition net n’a été observé. Dû au seuil de solubilité propre de chaque
composé, 27 flavonoïdes ont cristallisé et/ou précipité dans le milieu (Table 11).

D’autres cribles avec différent gradients (gradients à 0 à 100, 200, 500 ou 700 mg.L -1 selon le
flavonoïde) ont été réalisés afin d’affiner l'estimation de la MIC pour les flavonoïdes identifiés comme
actifs, ou de déterminer si les autres flavonoïdes sont actifs en réduisant le gradient pour être inférieur
à leur seuil de solubilité. Après analyse des résultats obtenus au cours de ces différents cribles, deux
flavonoïdes supplémentaires ont été identifiés comme actifs : le résokaempférol et la 2’-
hydroxyflavanone. Ainsi, 18 flavonoïdes sur notre librairie de 63 flavonoïdes possèdent un effet
toxique et leur MIC ont été listées Table 12. Pour certains flavonoïdes comme l’acacétine ou
l’apigénine, les problèmes de solubilité ont persisté malgré un crible avec un gradient de flavonoïde
supplémenté de 1% de DMSO.

L’ensemble des données MICs obtenues a été utilisé comme premier jeu de données pour établir
un modèle QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship, § III.2.2). L'expression génique de
quelques rapporteurs transcriptionnels prédéfinis a été évaluée en présence de chacune de ces 18
molécules actives (cf. § III.3.3). Enfin, les trois composés les plus actifs c’est-à-dire le résokaempférol,
bavachine et le 2’-hydroxyflavanone, en plus de la naringénine et de la pinocembrine, ont été
sélectionnés pour des analyses transcriptomiques (cf. § III.4.2).

84
Table 12 : Concentrations minimales inhibitrices des 18 flavonoïdes toxiques contre B. subtilis.
La MIC de chaque flavonoïde et le gradient final de concentrations utilisé pour déterminer la valeur
numérique de la MIC sont indiqués.

Flavonoids Class Estimated MIC (mg.L-1) Range (mg.L-1)

Resokaempferol Flavonol 20 0 to 100
Bavachin Flavanone 26 0 to 300
2’-Hydroxyflavanone Flavanone 31 0 to 100
3’,4’-Dihydroxyflavone Flavone 43 0 to 100
Sakuranetin Flavanone 44 0 to 100
Datiscetin Flavonol 57 0 to 100
Pinocembrin Flavanone 62 0 to 100
Isosakuranetin Flavanone 66 0 to 100
7,8 Dihydroxyflavone Flavone 73 0 to 300
Flavone Flavone 86 0 to 100
Baicalein Flavone 91 0 to 200
Quercetin Flavonol 91 0 to 100
4’-Hydroxyflavanone Flavanone 93 0 to 200
7-Hydroxyflavanone Flavanone 97 0 to 200
Fisetin Flavonol 120 0 to 300
Homoeriodictyol Flavanone 129 0 to 300
Naringenin Flavanone 159 0 to 300
Liquiritigenin Flavanone 227 0 to 300

Quantitative Structure-Activity Relationships (QSAR)

III.2.2.1 Contexte de l’analyse de toxicité - QSAR

La modélisation quantitative des relations structure-activité (Quantitative Structure−Activity

Relationships, ou QSAR) est une technique bien connue qui s'est avérée extrêmement utile dans
plusieurs domaines de recherche, notamment la pharmacie, l'écotoxicité des produits chimiques
industriels, la science des matériaux, etc. (Roy 2017). Plusieurs approches de modélisation avancée
telles que les algorithmes d'apprentissage automatique (comme Random Forest, Neural network, et
Deep learning) (Lo, Rensi et al. 2018) sont mises en œuvre pour réaliser la modélisation QSAR. L'objectif
principal de toute modélisation QSAR est d'établir une relation entre la ou les variables de réponse
(par exemple, activité/toxicité/etc.) et les caractéristiques structurelles de composés chimiques, en
utilisant suffisamment de composés dont la ou les réponses sont connues. L'approche dépend de la
capacité à représenter les structures chimiques en termes quantitatifs ou numériques - ce qu'on
appelle les descripteurs (moléculaires) - et à trouver ensuite des relations entre les valeurs des
descripteurs et, la ou les, variable(s) de réponse ciblée(s). Les modèles QSAR peuvent être divisés en
modèles basés sur la classification (i.e. classification-based), lorsque l'on cherche à établir une relation
entre les descripteurs et les valeurs catégorielles de la ou des variables de réponse, ou en modèles

85
basés sur la régression (i.e. regression-based), lorsque l'on cherche à trouver une relation entre les
descripteurs et les valeurs quantitatives de la ou des variables de réponse (Roy, Kar et al. 2015).

III.2.2.2 Objectif de l’approche QSAR pour la toxicité des flavonoïdes envers B. subtilis

Dans le cadre de ce travail, nous souhaitions identifier une relation quantitative entre la toxicité
des flavonoïdes que nous avons criblés et leur structure afin d’être en capacité de prédire la toxicité
de nouveaux flavonoïdes. Nous nous plaçons par conséquent dans la seconde catégorie de modèle dit
regression-based. Il a déjà été montré qu’il est possible d’obtenir de bonnes relations structure-toxicité
pour les flavonoïdes chez E. coli et Listeria monocytogenes (Araya-Cloutier, Vincken et al. 2018).
Néanmoins, autant ces travaux ont montré que les approches QSAR étaient efficaces pour prédire la
toxicité des flavonoïdes en se basant sur des données de MICs issues de la littérature chez E. coli,
autant les prédictions pour les bactéries à Gram positif comme L. monocytogenes se sont avérées très
limitées. Une des raisons probables de cette faiblesse de prédiction peut provenir de la taille du jeu
d’apprentissage (la quantité de données pour cet organisme étant relativement très faible par rapport
à E. coli) et de la qualité des données (liée à la méthodologie d’acquisition). Dans ce contexte, nous
souhaitions en utilisant les données accumulées dans cette thèse (Table 13) revisiter la toxicité des
flavonoïdes envers la bactérie à Gram positif, B. subtilis, afin éventuellement d’identifier les
déterminants structuraux responsables de cette toxicité.

III.2.2.3 Approche expérimentale et workflow

Nous avons utilisé le logiciel libre et open-source d'analyse de données KNIME

(https://www.knime.com/). Ce logiciel comprend un ensemble d'outils pour l'apprentissage
automatique et l'exploration de données. Une interface graphique permet la construction de workflow
modulaire par assemblage de « nœuds » (i.e. nodes), chacun réalisant une opération spécifique telle
que le formatage des données, leur modélisation, leur analyse et la visualisation des résultats. KNIME
est en outre une plateforme extensible et de nombreux nodes sont rendus disponibles par la
communauté, ce qui en fait un outil de choix pour des études de chémoinformatique (e.g. QSAR). Enfin,
ce logiciel ne nécessite pas de compétences avancées en programmation pour pouvoir l’utiliser.

En assemblant et paramétrant un certain nombre de nodes simples permettant la lecture de fichier

(e.g. .csv), l’estimation de descripteurs moléculaires numériques basés sur la formule chimique de la
molécule, la construction de modèle d’apprentissage (dans notre cas, le Random Forest), etc., nous
avons obtenu le workflow représenté sur la Figure 27. Le fichier d’entrée (Table 13) se présente sous
la forme d’une liste de flavonoïdes pour lesquels nous avons préalablement évalué la MIC, suivie pour
chaque molécule de la valeur pMIC (= -log10(MIC) ; avec la MIC exprimée en mol.L-1) et de la formule

86
InChI (signature spécifique à chaque molécule, par exemple récupérable sur la base de donnée
PubChem ; https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/).

III.2.2.4 Résultats de l’analyse QSAR, conclusion et perspectives

Malgré la construction d’un modèle QSAR permettant l’obtention de régressions linéaires très
correctes (Figure 27), à la fois en utilisant comme entrée les données de toxicité évaluée en milieu
gélosé (MIC) ou en milieu liquide (IC50, valeurs expérimentales indiquées dans la Table 21), les
différents tests de validation des modèles QSAR se sont avérés infructueux. Brièvement, il existe sous
KNIME de nombreux nodes permettant de construire des modèles d’apprentissage QSAR, et chacun de
ces nodes peut être paramétré de manière différente. Après plusieurs tests, nous avons choisi d’utiliser
l’algorithme Random Forest Learner qui est particulièrement adapté à notre objectif dans le cas de
l’utilisation de descripteurs moléculaires. Il s’est ainsi avéré que nous obtenions sur notre échantillon
d’une quinzaine de flavonoïdes (Table 13) des régressions de prédiction basées sur la structure des
molécules d’un très bon niveau (R2 ~ 0.9 ; Figure 27 ; encadré noir). Néanmoins, en utilisant une
méthode de validation croisée (ici la validation croisée d'un contre tous, ou « leave-one-out cross-
validation » ; i.e. à chaque itération d'apprentissage-validation, l'apprentissage se fait sur n − 1
observations et la validation sur l'unique observation restante), le modèle QSAR restait incapable de
prédire correctement les valeurs de notre jeu d’apprentissage (Figure 27 ; encadré rouge). Nous avons
malgré tout prédit la toxicité de flavonoïdes (Figure 27 ; encadré bleu), en utilisant une liste fournie
par la société EXTRASYNTHESE (https://www.extrasynthese.com/) mais les résultats obtenus ne peuvent
pas être exploités tant que des validations croisées du modèle ne seront pas obtenues.

L’échec surprenant de construction d’algorithmes de prédiction fiable de toxicité des flavonoïdes

envers B. subtilis ne nous semble explicable que par i) une taille du jeu d’apprentissage trop réduite,
ou ii) une qualité « pauvre » des valeurs de MIC et d’IC50, ou iii) une représentation biaisée des modes
d’action des flavonoïdes envers B. subtilis. Le point i) ne nous semble pas pertinent en lui-même car
une quinzaine de composés chimiques est un nombre suffisant pour effectuer une modélisation QSAR
fiable d’après de nombreuses études précédentes. Le point ii) ne peut être exclu mais au vu du nombre
de réplicats effectués montrant des résultats cohérents (à la fois pour la MIC et l’IC50), une mauvaise
qualité du jeu de données d’apprentissage est peu probable. Enfin, le point iii) sous-entendrait que
dans notre échantillon d’apprentissage, de nombreuses molécules sont différemment toxiques pour
B. subtilis, ce qui in fine rejoindrait le point i) car un trop grand nombre de modes d’action différents
serait représenté dans le jeu d’apprentissage. Cette idée est cohérente avec le fait qu'au moins quatre
modes d’action de toxicité ont été mis en évidence chez les bactéries (cf. §II.3.4.2), et que si le jeu
d’apprentissage est biaisé, c’est-à-dire par exemple que 5 à 6 modes d’action différents seraient

87
représentés alors chaque mode d’action ne serait décrit statistiquement que par 1 à 3 flavonoïdes ce
qui rendrait caduque toute modélisation QSAR. En priorisant cette hypothèse, nous avons donc
entrepris des études de transcriptomiques ciblées et globales afin d’évaluer les modes d’action des
flavonoïdes.

88
Table 13 : Flavonoïdes et valeurs correspondantes utilisés pour le QSAR de toxicité envers B. subtilis.

MW IC50 MIC
Flavonoids (1) ± ± pIC50 pMIC InChI
(g.mol-1) (M) (M)
2'-Hydroxyflavanone 240.27 2.61E-04 3.43E-05 1.29E-04 6.45E-06 3.583 3.889 InChI=1S/C15H12O3/c16-12-7-3-1-5-10(12)15-9-13(17)11-6-2-4-8-14(11)18-15/h1-8,15-16H,9H2
3',4'- 254.25 1.14E-04 0.00E+00 1.22E-04 6.10E-06 3.943 3.914 InChI=1S/C15H10O4/c16-11-7-6-10-12(17)8-13(19-15(10)14(11)18)9-4-2-1-3-5-9/h1-8,16,18H
dihydroxyflavone
4'-Hydroxyflavanone 240.27 5.18E-04 8.52E-05 3.87E-04 1.94E-05 3.286 3.412 InChI=1S/C15H12O3/c16-11-7-5-10(6-8-11)15-9-13(17)12-3-1-2-4-14(12)18-15/h1-8,15-16H,9H2
7,8- 254.25 - - 2.87E-04 1.44E-05 - 3.542 InChI=1S/C15H10O6/c16-8-2-3-9-12(6-8)21-15(14(20)13(9)19)7-1-4-10(17)11(18)5-7/h1-6,16-18,20H
dihydroxyflavone
7-Hydroxyflavanone 240.27 2.80E-04 1.56E-05 4.04E-04 2.02E-05 3.553 3.394 InChI=1S/C15H12O3/c16-11-6-7-12-13(17)9-14(18-15(12)8-11)10-4-2-1-3-5-10/h1-8,14,16H,9H2
Baicalein 270.25 - - 3.37E-04 1.68E-05 - 3.473 InChI=1S/C15H10O5/c16-9-6-11(8-4-2-1-3-5-8)20-12-7-10(17)14(18)15(19)13(9)12/h1-7,17-19H
Bavachin 324.38 5.55E-05 2.16E-05 8.02E-05 4.01E-06 4.256 4.096 InChI=1S/C20H20O4/c1-12(2)3-4-14-9-16-18(23)11-19(24-20(16)10-17(14)22)13-5-7-15(21)8-6-13/h3,5-
10,19,21-22H,4,11H2,1-2H3
Datiscetin 286.25 6.17E-05 6.21E-06 9.96E-05 4.98E-06 4.210 4.002 InChI=1S/C15H10O6/c16-7-5-10(18)12-11(6-7)21-15(14(20)13(12)19)8-3-1-2-4-9(8)17/h1-6,16-18,20H
Fisetin 286.25 - - 4.19E-04 2.10E-05 - 3.378 InChI=1S/C15H10O6/c16-8-2-3-9-12(6-8)21-15(14(20)13(9)19)7-1-4-10(17)11(18)5-7/h1-6,16-18,20H
Flavone 222.24 3.50E-04 7.09E-05 3.87E-04 1.93E-05 3.456 3.412 InChI=1S/C15H10O2/c16-13-10-15(11-6-2-1-3-7-11)17-14-9-5-4-8-12(13)14/h1-10H
Homoeriodictyol 302.29 3.26E-04 8.27E-05 4.27E-04 2.13E-05 3.487 3.370 InChI=1S/C16H14O6/c1-21-14-4-8(2-3-10(14)18)13-7-12(20)16-11(19)5-9(17)6-15(16)22-13/h2-6,13,17-
19H,7H2,1H3
Isosakuranetin 286.29 9.78E-05 1.92E-05 2.31E-04 1.15E-05 4.010 3.637 InChI=1S/C16H14O5/c1-20-11-4-2-9(3-5-11)14-8-13(19)16-12(18)6-10(17)7-15(16)21-14/h2-7,14,17-
18H,8H2,1H3
Liquiritigenin 256.27 6.77E-04 5.28E-05 8.86E-04 4.43E-05 3.170 3.053 InChI=1S/C15H12O4/c16-10-3-1-9(2-4-10)14-8-13(18)12-6-5-11(17)7-15(12)19-14/h1-7,14,16-17H,8H2
Naringenin 272.25 3.25E-04 4.41E-05 5.84E-04 2.92E-05 3.488 3.234 InChI=1S/C15H12O5/c16-9-3-1-8(2-4-9)13-7-12(19)15-11(18)5-10(17)6-14(15)20-13/h1-6,13,16-18H,7H2
Pinocembrin 256.25 1.37E-04 1.37E-05 2.42E-04 1.21E-05 3.865 3.616 InChI=1S/C15H12O4/c16-10-6-11(17)15-12(18)8-13(19-14(15)7-10)9-4-2-1-3-5-9/h1-7,13,16-17H,8H2
Quercetin 302.24 - - 3.01E-04 1.51E-05 - 3.521 InChI=1S/C15H10O7/c16-7-4-10(19)12-11(5-7)22-15(14(21)13(12)20)6-1-2-8(17)9(18)3-6/h1-5,16-19,21H
Resokampferol 270.25 6.66E-05 1.23E-05 7.40E-05 3.70E-06 4.176 4.131 InChI=1S/C15H12O3/c16-12-7-3-1-5-10(12)15-9-13(17)11-6-2-4-8-14(11)18-15/h1-8,15-16H,9H2
Sakuranetin 286.29 2.10E-04 2.27E-05 1.54E-04 7.68E-06 3.679 3.813 InChI=1S/C16H14O5/c1-20-11-6-12(18)16-13(19)8-14(21-15(16)7-11)9-2-4-10(17)5-3-9/h2-7,14,17-
18H,8H2,1H3
(1)
The three flavonoids with the highest and lowest activities against B. subtilis are underlined in red and blue, respectively.

89
 QSAR model validation

IC50-based estimation
4.4
4.2

Predicted pMIC
4.0
3.8
QSAR model construction
3.6 R2 = 0.89
y = 0.55x + 1.65
3.4
3.2
3.0
3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4
pMIC

MIC-based estimation
4.4
4.2

Predicted pMIC
4.0
3.8
R2 = 0.92
3.6 y = 0.56x + 1.59
3.4
3.2
3.0
3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4
pMIC

QSAR model prediction

Figure 27 : Workflow modulaire Knime pour l’analyse QSAR de toxicité des flavonoïdes envers B. subtilis.
Le workflow est sous-divisé en 3 parties (encadrées par des boîtes en pointillées), i) la construction du modèle QSAR (en noir – nodes de 1 à 8), ii) la validation de l’approche
de modélisation QSAR (en rouge – nodes de 4b à 6b), et iii) la prédiction de nouvelles activités potentielles à partir d’une banque de données de flavonoïdes (en bleu – nodes
de 1c à 8c). Chaque node permet d’effectuer une opération simple (https://www.knime.com/) et les flèches représentent les flux d’information entre les nodes. Les graphiques
et régressions (sur la droite) représentent les prédictions en sortie du QSAR avec un jeu d’apprentissage d’une quinzaine de flavonoïdes (cf. Table 13) et en utilisant pour la
toxicité envers B. subtilis soit les valeurs de MIC (obtenues en milieu gélosé) soit les valeurs d’IC50 (obtenues en milieu liquide). Le coefficient de détermination (R2) et
l’équation du modèle linéaire représenté en pointillé rouge sur la figure sont indiqués sur la droite du graphique.

90
 Recherche des déterminants moléculaires de la résistance aux flavonoïdes

Crible d’une collection de mutants en présence de flavonoïdes

Avec le but d’identifier les cibles potentielles des flavonoïdes chez B. subtilis, une sélection
d’environ 70 gènes a été effectuée à l’aide de la base de données SubtiWiki (Zhu and Stulke 2018).
Cette sélection de gènes comprend des gènes codant des transporteurs d’efflux, des gènes de
résistance aux antibiotiques, des gènes impliqués dans la réponse au flavonoïde quercétine, etc. A
partir de souches disponibles dans l'équipe, un crible basé sur des tests de toxicité en Live Cell Array
(LCA ; crible à haut débit en plaque 96 puits comme défini dans (Buescher, Liebermeister et al. 2012))
a été réalisé. De manière plus détaillée, nous avons sélectionné 67 mutants B. subtilis issus de la
collection de Caroll Gross (Koo, Kritikos et al. 2017), nommée collection BKK (KanR) ou BKE (ErmR). Ces
67 mutants présélectionnés sont délétés d’un gène codant un transporteur d’efflux multidrogues, ou
d’un gène codant un régulateur transcriptionnel d’un transporteur d’efflux ou d’une protéine de
résistance multidrogues, ou d’un gène de fonction connue ou inconnue au sein d’un opéron
comportant un gène codant pour une pompe à efflux (Table 14).

91
Table 14 : Librairie de 67 mutants B. subtilis.
Les 67 souches ont été répertoriées selon leur numéro d’accession (collection de Caroll GROSS ; (Koo, Kritikos et al. 2017)). Pour chacune d’entre elles, le nom
du gène délété, le produit de ce gène et sa fonction associée sont indiqués (Zhu and Stulke 2018).

ID strain Deletion Product Function

BKE 02670 ∆lmrB lincomycin-resistance protein (multidrug resistance pump) resistance to lincomycin
BKE 02680 ∆lmrA transcriptional regulator (TetR family) regulation of lincomycin resistance, control
of qdoI yxaH and lmrA lmrB operon
BKK 02960 ∆yceJ similar to multidrug-efflux transporter unknown
BKK 02970 ∆yceK similar to transcriptional regulator (ArsR family) unknown
BKK 03070 ∆mdr multidrug-efflux transporter (puromycin, nerfloxacin, tosufloxacin) drug resistance
BKK 03840 ∆ycnB c-di-AMP exporter secretion of cyclic di-AMP
BKK 03850 ∆ycnC similar to transcriptional regulator (TetR family) unknown
BKK 05460 ∆ydfL similar to multidrug-efflux transporter regulator (MerR family) unknown
BKK 05610 ∆vmlR F-type ATP-binding cassette protein dissociation of antibiotics (virginiamycin M,
lincomycin) from the ribosome
BKK 07160 ∆yetH similar to antibiotic binding protein unknown
BKE 07220 ∆yetL transcriptional repressor of yetM and yetL regulation of yetM and yetL expression,
induction in response to flavonoids
BKE 07230 ∆yetM FAD-dependent monooxygenase unknown
BKK 07370 ∆yfmR similar to ABC transporter (ATP-binding protein) unknown
BKK 07380 ∆yfmQ unknown unknown
BKK 07390 ∆yfmP transcription repressor (MerR family) of the yfmP-yfmO operon regulation of the yfmP-yfmO operon
BKK 07400 ∆yfmO similar to multidrug-efflux transporter unknown
BKK 07420 ∆yfmM similar to ABC transporter (ATP-binding protein) unknown
BKK 07450 ∆yfmJ similar to predicted oxidoreductase, Zn-dependent and NAD(P)-binding unknown
BKK 07460 ∆yfmI similar to macrolide-efflux transporter unknown
BKK 07860 ∆yfkL similar to multidrug resistance protein unknown
BKK 07870 ∆yfkK unknown unknown

92
BKK 07910 ∆yfkF similar to multidrug-efflux transporter unknown
BKK 08370 ∆yfiR transcriptional regulator (TetR family) of the yfiS-yfiR operon control of yfiS expression
BKK 08380 ∆yfiS similar to multidrug resistance protein unknown
BKK 08400 ∆yfiU similar to multidrug-efflux transporter unknown
BKK 08410 ∆yfiV similar to transcriptional regulator (MarR family) unknown
BKK 09010 ∆yhcA c-di-AMP exporter secretion of cyclic di-AMP
BKK 09700 ∆bmrB regulatory leader peptide control of bmrC-bmrD expression
BKK 09710 ∆bmrC multidrug ABC transporter (ATP-binding protein) multiple antibiotic resistance
BKK 09720 ∆bmrD multidrug ABC transporter (ATP-binding protein) multiple antibiotic resistance
BKK 10580 ∆yhjO similar to multidrug-efflux transporter unknown
BKK 11480 ∆yjbB similar to macrolide-efflux transporter unknown
BKK 17290 ∆ebrB multidrug efflux transporter multidrug resistance
BKK 17300 ∆ebrA multidrug efflux transporter multidrug resistance
BKK 24000 ∆bmrU multidrug resistance protein multidrug resistance
BKK 24010 ∆bmr general stress protein, multidrug-efflux transporter multidrug resistance
BKK 24020 ∆bmrR general stress protein, transcriptional activator (MerR family) of the regulation of multidrug resistance
bmr bmrR operon
BKK 26580 ∆bltR transcriptional regulator (MerR family) of the blt-bltD operon regulation of spermidine efflux and
degradation
BKK 26590 ∆blt spermidine-efflux transporter spermidine export
BKK 26600 ∆bltD permidine/ spermine acetyltransferase spermidine degradation
BKK 31480 ∆yuxJ similar to multidrug-efflux transporter unknown
BKK 32870 ∆mdtR transcription repressor (MarR family) regulation of the multidrug-resistance
mdtR-mdtP operon
BKK 32880 ∆mdtP multidrug-efflux transporter multidrug resistance
BKK 33560 ∆yvaD subunit of unidentified multidrug transporter unknown
BKK 33570 ∆yvaE subunit of unidentified multidrug transporter unknown
BKK 33580 ∆yvaF Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator unknown
BKK 34810 ∆yvcD unknown unknown

93
BKK 34820 ∆bmrA multidrug ABC transporter (ATP-binding protein) multiple antibiotic resistance
BKK 35200 ∆yvkB similar to transcriptional regulator (TetR family) unknown
BKK 35210 ∆yvkA similar to multidrug-efflux transporter unknown
BKK 38640 ∆yxlH similar to multidrug-efflux transporter unknown
BKE 39970 ∆yxaH putative transporter unknown
BKE 39980 ∆qdoI Fe-containing quercetin 2,3-dioxygenase resistance to plant product quercetin
BKE 39990 ∆qdoR transcriptional regulator (TetR family) control of quercetin utilization, control of
qdoI-yxaH and lmrA-lmrB
BKK 08290 ∆lnrJ two-component sensor kinase involved in resistance to linearmycin
BKK 08300 ∆lnrK two-component response regulator involved in resistance to linearmycin
BKK 08310 ∆lnrL similar to ABC transporter (ATP-binding protein) resistance to linearmycin
BKK 08320 ∆lnrM similar to ABC transporter (membrane protein) resistance to linearmycin
BKK 08330 ∆lnrN similar to ABC transporter (membrane protein) resistance to linearmycin
BKK 10820 ∆yisQ putative multidrug exporter unknown
BKK 10830 ∆yisR similar to transcription factor (AraC family) unknown
BKK 18370 ∆yoeA putative multidrug exporter unknown
BKK 19440 ∆yojI putative multidrug exporter unknown
BKK 21710 ∆ypnP putative damage inducible, Na+ driven multidrug efflux pump unknown
BKK 34480 ∆yvdT similar to transcriptional regulator (TetR family) unknown
BKK 34490 ∆yvdS subunit of unidentified multidrug transporter unknown
BKK 34500 ∆yvdR subunit of unidentified multidrug transporter unknown

94
 Les 67 souches ont fait l’objet d’un crible sur microplaque de 96 puits en utilisant un test de toxicité
en présence de flavonoïdes à différentes concentrations : 0, 20, 40 et 70 mg.L-1 de naringénine ou 0,
15, 25 et 40 mg.L-1 de pinocembrine. Sur chaque microplaque 96 puits quatre souches BKK ont été
finement caractérisées, et la souche parentale B. subtilis 168 trpC2 utilisée comme contrôle.

Figure 28 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis des souches BKK ΔbltD, ΔbmrR, ΔbmrU et ΔyvcD.
Courbes dose-réponse des souches BKK ΔbltD (BKK26600), ΔbmrR (BKK24020), ΔbmrU (BKK24000) et
ΔyvcD (BKK34810) en milieu riche (CHG) en présence de naringénine (A) et de pinocembrine (B)
(graphique semi-logarithmique). La courbe en bleu représente la courbe de dose-réponse pour la
souche B. subtilis 168 trpC2.

Sur la Figure 28 sont indiquées à titre d’exemple, les courbes dose-réponse des souches ΔbltD,
ΔbmrR, ΔbmrU et ΔyvcD, pour lesquelles les taux de croissance de B. subtilis sont représentés en
fonction des concentrations de la naringénine (Figure 28A) et de la pinocembrine (Figure 28B). En
présence de naringénine, seuls les taux de croissance de la souche ΔbltD (BKK26600) sont similaires à
ceux obtenus pour la souche contrôle. En effet, les souches ΔbmrR (BKK24020), ΔbmrU (BKK24000)
sont plus résistantes aux concentrations de 20 et 40 mg.L-1 de naringénine tandis que la souche ΔyvcD
(BKK34810) est plus sensible aux concentrations de 20 et 70 mg.L-1 de naringénine par comparaison
avec la souche B. subtilis 168 trpC2. En présence de pinocembrine, les souches ΔbltD, ΔbmrR, ΔbmrU
sont plus résistantes pour toutes les concentrations testées (excepté pour la souche ΔbmrR en
présence de 40 mg.L-1 de pinocembrine) et la souche ΔyvcD est plus sensible (excepté à 40 mg.L-1 de
pinocembrine pour laquelle µΔyvcD > µtrpC2) par comparaison aux taux de croissance de la souche
contrôle. Tous les autres tests de toxicité sur la totalité des mutants présélectionnés ont été réalisés
et analysés de manière similaire. Seuls ceux pour qui nous avons pu observer un taux de croissance
plus faible (en vert Figure 29) ou plus élevé (en orange Figure 29) par rapport au taux de croissance du
contrôle, ont été sélectionnés pour un second crible plus précis (Figure 29).

95
Figure 29 : Tests de toxicité de la naringénine vis-à-vis des souches BKE et BKK.
Courbes dose-réponse de la librairie BKE et BKK en milieu riche (CHG) en présence de naringénine
(graphique semi-logarithmique). La courbe en bleu représente la courbe de dose-réponse (courbe de
référence) de la souche B. subtilis 168 trpC2. Courbes dose-réponse de souches plus sensibles à la
naringénine par comparaison avec le contrôle, représentées en vert (ΔbmrR, ΔlmrA et ΔyvcD). Courbes
dose-réponse de souches plus résistantes à la naringénine par comparaison avec le contrôle,
représentées en orange (Δbmr, ΔbltR, ΔbmrU, ΔbmrC, ΔbmrB, ΔbmrD, ΔvmlR, ΔyvkA, ΔyfiV, ΔyfiS,
ΔyfmP, ΔyceK, ΔycnB, ΔycnC, ΔebrB, ΔebrA et ΔqdoI).

Au total, 20 de ces 67 mutants ont été sélectionnés pour un second crible avec une gamme en
flavonoïde plus large (5 concentrations). Cette gamme de concentration est déterminée pour chaque
souche en fonction de la courbe de dose-réponse obtenue au premier crible pour permettre d'affiner
la caractérisation de la réponse des mutants B. subtilis à la naringénine et la pinocembrine. La délétion
des 20 souches répondant aux flavonoïdes a été vérifiée par PCR sur colonies afin de s’assurer que le
phénotype observé correspond au mutant caractérisé. Cinq d’entres elles ont été exclus car les profils
PCR ne correspondaient pas aux profils attendus (ceci s’explique malheureusement par des erreurs
liées à la génération et au stockage des collections BKK et BKE dans le laboratoire de C. Gross – de

96
nombreux laboratoires autour du monde et travaillant sur B. subtilis ont noté ces dernières années des
problèmes similaires).

Comme pour le premier crible, seules certaines courbes sont présentées pour illustrer l’analyse
effectuée (Figure 30). Les courbes de dose-réponse ont été obtenues avec les gammes de naringénine
suivantes : 0, 5, 10, 20, 30, 50 mg.L-1 et 0, 20, 50, 70, 90, 110 mg.L-1 pour les souches ΔbmrR, Δbmr
(Figure 30A); 0, 10, 20, 50, 90, 110 mg.L-1 et 0, 20, 50, 70, 90, 130 mg.L-1 pour la ΔbmrU et la ΔyvcD
(Figure 30B) ; 0, 10, 20, 50, 70 et 90 mg.L-1 pour les souches ΔyfiS et ΔyfmP (Figure 30C) ; 0, 5, 10, 20,
30, 50 mg.L-1 et 0, 10, 20, 50, 70, 90 mg.L-1 pour les souches ΔyceK et ΔycnB (Figure 30D) ; 0, 5, 10, 20,
30, 50, 70, 90, 110 et 130 mg.L-1 pour la souche ΔycnC (Figure 30E) ; 0, 10, 20, 50, 70 et 90 mg.L-1 pour
la souche ΔyfiV (Figure 30F) et 0, 5, 10, 20, 30, 50, 70 et 90 mg.L-1 pour la souche ΔbmrB (Figure 30G).

La souche ΔbmrR est plus résistante à 5, 10 et 20 mg.L-1 de naringénine par rapport à la souche
parentale (Figure 30A) tandis que la souche ΔyvcD est plus sensible que la souche 168 trpC2 pour
toutes les concentrations de naringénine testées (Figure 30B). Les souches ΔyfiS et ΔyfmP sont plus
résistantes à 20, 50, 70 mg.L-1 de naringénine (même profil phénotypique) par rapport à la souche 168
trpc2 (Figure 30C). La souche ΔycnB est légèrement plus résistante aux trois concentrations les plus
élevées et la souche ΔbmrB est plus résistante pour toutes les concentrations de naringénine testées.
Bien que les souches Δbmr, ΔbmrU, ΔyceK, ΔycnC et ΔyfiV aient été préselectionnées suite au 1er crible
basé sur trois concentrations en flavonoïdes (Figure 29), les taux de croissance obtenus lors du 2ème
crible sont proches de ceux de la souche sauvage en présence de naringénine. Ces souches n’ont donc
pas été retenues pour la suite des expériences.

97
98
Figure 30 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis des mutants B. subtilis sélectionnés (graphique
semi-logarithmique).
Courbes dose-réponse en milieu riche (CHG) en présence de naringénine des souches BKK. (A) : ΔbmrR
(BKK24020) et Δbmr (BKK24010) ; (B) : ΔbmrU (BKK24000) et ΔyvcD (BKK34810) ; (C) : ΔyfiS (BKK08380)
et ΔyfmP (BKK07390) ; (D) : ΔyceK (BKK02970) et ΔycnB (BKK03840) ; (E) : ΔycnC (BKK03850) ; (F) :
ΔyfiV (08410) ; (G) : ΔbmrB (BKK09700). La courbe en bleu représente la courbe dose-réponse pour la
souche 168 trpC2.

Au vu des résultats présentés sur la Figure 30, nous avons établi une liste de six gènes de B. subtilis
impliqués dans la résistance ou sensibilité aux flavonoïdes auxquels s’ajoutent les gènes lmrA et qdoI
(Figure 29). Parmi cette liste de gènes répondant aux deux flavonoïdes étudiés, trois de ces gènes dont
le gène lmrA se sont avérés coder des régulateurs transcriptionnels (Table 15). A noter que la souche
ΔlmrA est la souche caractérisée la plus sensible en présence de flavonoïdes (cf. §III.3.2).

99
Table 15 : Gènes de B. subtilis impliqués dans la réponse aux flavonoïdes.
Pour chaque gène, l’opéron dans lequel il est présent est indiqué ainsi que le produit de la traduction
et la fonction de celui-ci. Le résultat obtenu pour les souches BKE/BKK par comparaison avec à la
souche contrôle B. subtilis 168 trpC2 est indiqué dans la dernière colonne.

Name Operon Product Function Results

bmrB bmrB Regulatory leader peptide for Control of bmrC-bmrD Resistant to both
the control of bmrC-bmrD expression flavonoids
expression
bmrR bmr bmrR Transcriptional activator (MerR Regulation of Resistant to
family) of the bmr-bmrR multidrug resistance naringenin
operon, general stress protein
lmrA lmrB lmrA Transcriptional regulator, Regulation of Remarkably more
control of qdoI-yxaH and lmrA- lincomycin resistance sensitive to both
lmrB operon flavonoids
qdoI qdoI yxaH Fe-containing quercetin 2,3- Resistance to plant Resistant to
dioxygenase product quercetin pinocembrin
ycnB ycnB ycnC c-di-AMP exporter Secretion of cyclic di- Resistant to
AMP naringenin
yfiS yfiR yfiS Similar to multidrug resistance Unknown Resistant to
protein naringenin
yfmP yfmP Transcriptional repressor Regulation of the Resistant to
yfmO (MerR family) of the yfmP- yfmP-yfmO operon naringenin
yfmO operon
yvcD yvcD Unknown Unknown Sensitive
bmrA

Certains de ces 8 mutants ont été reconstruits dans un fond génétique prototrophe pour le
tryptophane (i.e. souche BSB1) car nous avions observé une plus grande variabilité sur le taux de
croissance de la souche contrôle 168 trpC2 sur milieu CHG en présence de flavonoïdes, peut-être liée
à l’auxotrophie au tryptophane. Quelques-unes de ces nouvelles constructions ont pu être
caractérisées et ont confirmé les effets de résistance et de sensibilité aux flavonoïdes observés
précédemment.

A titre d’exemple, les courbes dose-réponse des souches BSB1 ΔyfiS et ΔyfmP sont représentées en
fonction des concentrations de la naringénine (Figure 31A) et de la pinocembrine (Figure 31B). En
présence de naringénine, les taux de croissance des deux souches sont plus élevés tandis que les taux
de croissance de ces deux souches, obtenus en présence de pinocembrine sont similaires à ceux
obtenus pour la souche BSB1. Ces résultats confirment les effets de résistance observé précédemment
pour les souches 168 trpC2 ΔyfiS et ΔyfmP en présence de naringénine.

100
Figure 31 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis des souches BSB1 ΔyfiS et ΔyfmP.
Courbes dose-réponse des souches BSB1 ΔyfiS et ΔyfmP en milieu riche (CHG) en présence de
naringénine (A) et de pinocembrine (B) (graphique semi-logarithmique). La courbe en bleu représente
la courbe de dose-réponse pour la souche BSB1.

Etude du régulon LmrA/QdoR

III.3.2.1 Analyse des simples et doubles mutants de B. subtilis

Le gène lmrA code un régulateur transcriptionnel qui a fait l’objet d’une étude (Hirooka 2014) qui
démontre que LmrA régule négativement son propre opéron lmrAB, ainsi que l'opéron qdoI yxaH et le
gène qdoR codant un auto-régulateur – lui-même régulant négativement les deux opérons décrits
précédemment (Figure 32A). En présence de quercétine, le dimère LmrA forme un complexe avec le
flavonoïde permettant la dérépression des opérons (Figure 32B) (Hirooka 2014).

Figure 32 : Organisation du régulon LmrA/QdoR en présence de quercétine chez B. subtilis (adapté

de (Hirooka 2014)).
Le régulon est composé de deux gènes codant des régulateurs transcriptionnels : lmrA et qdoR, de
deux gènes codant des transporteurs d’efflux multi-drogues putatifs : lmrB et yxaH, et d’un gène
codant la quercétine 2,3-dioxygénase : qdoI. A) Les régulateurs transcriptionnels LmrA et QdoR sont

101
des homodimères (représentés par deux ovales bleus et violets respectivement) se liant sur quatres
« boîtes » différentes (carré orange) entraînant la répression des gènes en aval. B) En présence de
quercétine, les régulateurs forment un complexe inactif avec le composé permettant ainsi la
dérépression des gènes cibles.

Afin de savoir si les gènes présents dans les régulons lmrA et qdoR sont impliqués dans la réponse
aux flavonoïdes, naringénine et pinocembrine, un test de toxicité a été réalisé avec les souches BKE
délétées des gènes suivants : lmrA, lmrB, qdoR, qdoI ou yxaH.

Figure 33 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis des souches BKE

Courbes dose-réponse (graphiques semi-logarithmiques) des souches BKE ΔlmrB (BKE 02670) (),
ΔlmrA (BKE 02680) (vert), ΔyxaH (BKE 39970) (⧫), ΔqdoI (BKE 39980) (orange), ΔqdoR (BKE 39970) (◼)
et de la souche trpC2 (bleu) en milieu riche (CHG) en présence de naringénine (A) et de pinocembrine
(B). La courbe en bleu représente la courbe dose-réponse pour la souche 168 trpC2.

Les courbes dose-réponse des souches en présence des flavonoïdes sont représentées en fonction
des concentrations de naringénine (0 à 150 mg.L-1, Figure 33A) ou de pinocembrine (0 à 40 mg.L-1,
Figure 33B), et chaque point représente la moyenne des taux de croissance de 6 cultures
indépendantes. La souche ΔlmrA est plus sensible – taux de croissance plus faible – que la souche
contrôle 168 trpc2 aux deux composés. La souche ΔqdoI est plus résistante – taux de croissance plus
élevé – par comparaison avec la souche contrôle 168 trpc2 en présence de pinocembrine (Figure 33B).
La souche ΔyxaH est légèrement plus résistante que la souche contrôle en présence de pinocembrine
(Figure 33B).

Ces résultats nous suggèrent qu’il existe a minima deux mécanismes d’action différents : i) un
mécanisme via le régulateur LmrA et ii) un mécanisme spécifique à la pinocembrine.

Dans le cadre de la publication de ce travail, il nous faudra évaluer la réponse des doubles mutants
et du triple mutant répertoriées dans la

102
 Table 16 afin d’observer leur phénotype de croissance et de déterminer l’importance et le rôle de
chaque gène dans la réponse aux flavonoïdes.

Table 16 : Liste des doubles et triples mutants B. subtilis.

Strain Deletion
B. subtilis 168 trpc2 ΔlmrA ΔlmrB ΔlmrB::erm, ΔlmrA::kan
B. subtilis 168 trpc2 ΔlmrA ΔdqoR ΔlmrA::erm, ΔqdoR::kan
B. subtilis 168 trpc2 ΔlmrB ΔqdoR ΔlmrB::erm, ΔqdoR::kan
B. subtilis 168 trpc2 ΔqdoI ΔyxaH ΔyxaH::erm, ΔqdoI::kan
B. subtilis 168 trpc2 ΔqdoI ΔlmrA ΔqdoI::erm, ΔlmrA::kan
B. subtilis 168 trpc2 ΔyxaH ΔlmrA ΔyxaH::erm, ΔlmrA::kan
B. subtilis 168 trpc2 ΔlmrA ΔyxaH ΔqdoI ΔlmrA, ΔyxaH, ΔqdoI::kan

Une première caractérisation a été effectuée avec les souches ΔlmrA ΔqdoR et et ΔlmrB ΔqdoR via
un test de toxicité en présence de naringénine. Chaque double mutant a été testé avec les contrôles
suivants : B. subtilis 168 trpc2, mutant délété du gène 1 et mutant délété du gène 2. Les différentes
courbes de dose-réponse obtenues ont été regroupées dans la Figure 34.

Figure 34 : Test de toxicité des doubles mutants B. subtilis.

Courbes dose-réponse des souches ΔlmrA-ΔqdoR (A) et ΔlmrB-ΔqdoR (B) en présence de naringénine.
La courbe en bleu représente la courbe dose-réponse de la souche 168 trpC2.

Les courbes dose-réponse des souches ΔlmrA ΔqdoR et ΔlmrB ΔqdoR ont été représentées en
fonction de la naringénine à 0, 20, 40, 70 et 90 mg.L-1 (Figure 34). Les taux de croissance de la souche
ΔlmrA ΔqdoR n’ont pas été calculés car les cultures ont mis ~10h pour entrer en phase exponentielle,
indiquant une forte sensibilité de la souche en présence de naringénine aux concentrations testées
excepté à 20 mg.L-1. Or, la souche parentale ainsi que les souches simples mutants (ΔlmrA et ΔqdoR)

103
poussent correctement pour toutes les concentrations de la gamme choisie ([naringénine]<MIC)
(Figure 34A). Par conséquent, a minima l’un de ces deux gènes est impliqué dans la résistance aux
flavonoïdes permettant ainsi une meilleure croissance en présence de naringénine. Quant à la souche
ΔlmrB ΔqdoR, aucun effet toxique n’a été observé en présence de naringénine en comparaison avec
les souches 168 trpc2, ΔlmrB::erm et ΔqdoR::kan (Figure 34B). Ainsi, le régulateur LmrA continue à
priori, à réprimer l’opéron qdoI yxaH en présence de naringénine. Un test de toxicité en présence de
pinocembrine pourra être effectué en vue de déterminer la réponse de ces doubles mutants en
présence d’un autre flavonoïde autre que la naringénine.

La souche ΔlmrA ΔyxaH a été construite et validée par PCR sur colonie, et un test de toxicité devra
être entrepris par la suite (Table 16). Ces expériences sont actuellement en cours dans l’équipe pour
finaliser ce travail de caractérisation.

III.3.2.2 Surexpression de transporteurs d’efflux

La souche B. subtilis dont le gène codant pour le régulateur LmrA est délété présente une plus
grande sensibilité vis-à-vis des flavonoïdes naringénine et pinocembrine (cf §III.3.1). D'après le modèle
proposé par Hirooka et al. (Hirooka 2014), LmrA régule la production de LmrB et YxaH (Figure 32). Pour
mieux comprendre le mécanisme d’action via le régulateur LmrA (Figure 32), deux souches de B.
subtilis (BSB1 Phs yxaH et BSB1 Phs lmrB) exprimant le gène codant un transporteur d‘efflux multi-
drogues putatif LmrB ou YxaH, sous le contrôle d’un promoteur inductible à l’IPTG (Phyperspank noté Phs)
ont été construites (cf. § V.5.3.2). Des tests de toxicité en LCA de ces souches en présence de
naringénine ou de pinocembrine et/ou d’IPTG ont été réalisés.

• Test de toxicité sur la souche BSB1 Phs yxaH

Le test de toxicité en LCA de la souche BSB1 Phs yxaH a été effectué avec les gammes de
concentrations suivantes : 0, 20, 35, 50, 70, 90, 110 et 130 mg.L-1 de naringénine et 0, 5, 10, 15, 20, 30,
40, 50 mg.L-1 de pinocembrine, en présence ou absence de l'inducteur IPTG (1 mM). La souche BSB1 a
été utilisée comme contrôle lors de cette expérience. Les courbes de dose-réponse de la souche en
présence de flavonoïde sont représentées en fonction des concentrations de naringénine (Figure 35A)
et de pinocembrine (Figure 35B) où chaque point représente la moyenne des taux de croissance issus
de 3 cultures indépendantes.

104
Figure 35 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis de B. subtilis BSB1 Phs yxaH.
Courbes dose-réponse de BSB1 (⧫), BSB1 Phs yxaH (◼) induites avec l'IPTG (vert) ou non induites (bleu)
en présence de naringénine (A) et de pinocembrine (B) (graphique semi-logarithmique).

Aucun effet significatif de la naringénine ou de la pinocembrine sur le taux de croissance de la

souche BSB1 Phs yxaH induite à l’IPTG n’est observé (Figure 35). La surexpression du gène yxaH n’induit
pas de différence du taux de croissance en comparaison avec le taux de croissance de la souche BSB1
aux différentes concentrations de flavonoïdes. Ainsi, la surexpression du gène codant le transporteur
YxaH chez B. subtilis n'induit pas de changement de croissance ni de changement dans la capacité de
résistance de la bactérie en présence des flavonoïdes naringénine et pinocembrine.

• Test de toxicité sur la souche BSB1 Phs lmrB

Un test de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis de la souche BSB1 Phs lmrB surproduisant le transporteur
LmrB a été réalisé dans les mêmes conditions que ci-dessus.

105
Figure 36 : Tests de toxicité des flavonoïdes vis-à-vis de B. subtilis BSB1 Phs lmrB (graphique semi-
logarithmique).
Courbes dose-réponse de BSB1 (⧫), BSB1 Phs lmrB (⚫) induites avec de l'IPTG (orange) ou non induites
(bleu) en présence de naringénine (A) et de pinocembrine (B).

En présence de pinocembrine, un effet toxique sur la croissance bactérienne de BSB1 Phs lmrB est
observé tandis qu’aucun effet n’est observé en présence de naringénine (Figure 36). Les taux de
croissance de la souche BSB1 Phs lmrB sont plus faibles à partir de 20 mg.L-1 de pinocembrine que les
taux de croissance de la souche BSB1 aux concentrations en pinocembrine correspondantes (Figure
36B). B. subtilis est plus sensible à la pinocembrine lorsque le transporteur LmrB est surproduit. Ainsi,
le transporteur LmrB, référencé dans la littérature comme transporteur d’efflux présumé (Hirooka
2014), pourrait avoir dans ces conditions expérimentales le rôle de transporteur de pinocembrine.

Ces résultats nous permettent de conclure qu’il existe au moins deux mécanismes d'action
différents de la naringénine et de la pinocembrine puisque nous avons obtenu des courbes
phénotypiques différentes pour la souche BSB1 Phs lmrB en présence de naringénine ou de
pinocembrine. Le régulateur LmrA intervient dans le mécanisme de résistance de la souche B. subtilis
Phs lmrB vis-à-vis de la pinocembrine. En effet, la courbe dose-réponse obtenue lors de la surexpression
du gène lmrB est similaire à celle de la souche BKK délétée du gène codant le régulateur LmrA en
présence de pinocembrine (Figure 33). Cependant, la surexpression du gène lmrB n'a pas d'effet sur
les taux de croissance de B. subtilis en présence de naringénine. Ceci suggère que le régulateur LmrA
reconnaît une cible autre que LmrB ou YxaH.

Neuf gènes sur les 67 sélectionnés dans ce chapitre l’ont été car ils étaient des cibles potentielles
de flavonoïdes. Les gènes du régulon LmrA entrent dans cette catégorie. Les expériences visant à
caractériser l’expression génique en présence de différents flavonoïdes (e.g. caractérisation de

106
l’activité promotrice - § III.4.1 - et étude transcriptomique - § III.4.2) permettront d’identifier et de
mieux caractériser de nouveaux gènes de B. subtilis impliqués dans la réponse aux flavonoïdes.

Evolution adaptative en laboratoire de B. subtilis

Nous avions également comme objectif d'obtenir une souche de B. subtilis résistante vis-à-vis d'un
flavonoïde pour décrypter les éventuels mécanismes de résistance vis-à-vis des flavonoïdes et de
nouvelles cibles éventuelles. Nous avons donc réalisé une expérience d’évolution adaptative en
laboratoire de la souche B. subtilis CS1 Δeps::ble - possède la propriété de ne pas former de biofilm -
en présence de naringénine. Nous avons dans un premier temps déterminé l'IC50 et la MIC de la souche
CS1 Δeps::ble par un test de toxicité en présence de naringénine. L’évolution a ensuite été réalisée en
milieu riche (LB) à 37°C avec un suivi de la croissance bactérienne (manuellement), du pH et l'O2 tout
au long de l’expérience, et un stockage de prélèvements réguliers chaque 24 heures. A la fin de
l'expérience, des prélèvements ont été caractérisés (test de toxicité par LCA et séquençage).

III.3.3.1 Test de toxicité vis-à-vis de B. subtilis CS1 Δeps

Dans le but de définir les paramètres de l’expérience d’évolution, des tests de toxicité de la
naringénine vis-à-vis de la souche B. subtilis CS1 Δeps::ble ont été réalisés en microplaque, en milieu
riche défini (LB) pour 20 concentrations en naringénine (de 0 à 150 mg.L-1). La courbe dose-réponse
représentée ci-dessous illustre la variation du taux de croissance de la CS1 Δeps::ble en fonction des
concentrations en naringénine (Figure 37). Pour chaque concentration de flavonoïde, chaque point de
la courbe représente une moyenne d'au moins 6 valeurs de taux de croissance de cultures
indépendantes de B. subtilis. Dès 10 mg.L-1 de naringénine, un effet toxique sur la croissance
bactérienne est alors observé (µ = 80% x µmax, où µmax est le taux de croissance de la souche en absence
de naringénine).

107
Figure 37 : Test de toxicité de la naringénine vis-à-vis de la souche B. subtilis CS1 Δeps::ble (graphique
semi-logarithmique).
Courbe dose-réponse de B. subtilis CS1 Δeps::ble en LB. La courbe en pointillé bleu foncé représente
le meilleur « fit » semi-log des données expérimentales pour la naringénine (R2=0,9666 ; y=-
43,92ln(x)+253,66). Le taux de croissance maximal (µmax) de B. subtilis est de 1,99 h-1 en absence de
flavonoïde. La ligne en pointillé bleu clair représente la concentration inhibitrice pour laquelle le taux
de croissance est égale à 50% (IC50=103.5 mg.L-1). La concentration maximale de naringénine testée
dans l'expérience est de 150 mg.L-1 et permet à B. subtilis CS1 Δeps::ble de croître (µ150=30% x µmax,
où µ150 est le taux de croissance calculé à 150 mg. L-1 de naringénine). Le point d’inflection de la courbe
() a été déterminé à 70 mg.L-1 de naringénine.

Grâce à la courbe dose-réponse obtenue pour la souche CS1 Δeps::ble, l’IC50 a été déterminée à
103,5 mg.L-1 de naringénine et un point d’inflection est observé à 70 mg.L-1 de naringénine. A 150 mg.L-
1
de naringénine, le taux de croissance de la souche CS1 Δeps::ble est de 30% du µmax (Figure 37).

III.3.3.2 Expérience d’évolution de la souche CS1 Δeps en présence de naringénine

L’évolution a été réalisée à l’aide d’un fermenteur de paillasse en culture continu sous chemostat
en milieu riche (LB) avec une concentration initiale (Ci) de 90 mg.L-1 de naringénine (Figure 38). Cette
Ci a été déterminée en fonction de la courbe de référence où la Ci doit être inférieure à l’IC50 afin que
les cellules disposent du temps nécessaire pour s’adapter à la présence de la naringénine.

108
Figure 38 : Evolution de la souche CS1 Δeps::ble en présence de naringénine à l’aide d’un fermenteur
de paillasse (Multifors II, Infors).
(A) Vue globale du fermenteur de paillasse ; (B) couvercle composé d’un capteur antimousse, d’une
sonde pH, d’une sonde pO2, d’un condenseur de gaz, d’une entrée d’air, d’un système de prélèvement
d’échantillons ; (C) cuve de culture entourée d’un système chauffant.

Avant le début de l’expérience, les sondes pH et pO2 ont été calibrées puis les valeurs de ces
paramètres ont été enregistrées tout au long de l’expérience afin de contrôler les conditions de culture
(la pO2, par exemple, doit impérativement être comprise entre 80 et 100%). La culture de la souche
CS1 Δeps::ble a été effectuée à partir d’une préculture à DO600nm = 0,3 (phase exponentielle) dans la
cuve B du fermenteur (cf. Figure 61) contenant le milieu LB supplémenté de naringénine. L’évolution
a été suivie pendant 470 générations avec des doses croissantes de naringénine de 90 mg.L-1 à
240 mg.L-1 (Figure 39).

109
Figure 39 : Évolution adaptative en laboratoire de la souche CS1 Δeps en présence de naringénine.
L'évolution est réalisée en culture continue sous chemostat (basé sur un volume et un taux de dilution
fixes). Sont représentés les différents palliers de concentrations testées (gradient de couleur) et sa
courbe (noir épais) ; la biomasse (nuage de points blancs) et le nombre de générations (noir) en
fonction du temps. La valeur de la MIC de la naringénine en présence de CS1 Δeps est représentée par
la ligne rouge. Les différents prélèvements sélectionnés sont indiqués par une flèche rouge ().

La concentration en naringénine a été augmentée à chaque fois que la culture était stable sur
plusieurs lectures de la DO (même valeur de DO obtenue). Ainsi, la culture de B. subtilis a été incubée
en présence de 90 mg.L-1 de naringénine pendant 107 générations, de 110 mg.L-1 de naringénine
pendant 65 générations, de 130 mg.L-1 de naringénine pendant 37 générations, 150 mg.L-1 de
naringénine pendant 17 générations, 160 mg.L-1 de naringénine pendant 115 générations, 180 mg.L-1
de naringénine pendant 23 générations, 200 mg.L-1 de naringénine pendant 51 générations et
240 mg.L-1 de naringénine pendant 22 générations (Figure 39). Une lecture journalière de la DO a été
effectuée pour suivre l’évolution de la biomasse dans le fermenteur ainsi que des prélèvements
journaliers ont été réalisés et étalés sur boîte LB et LB supplémenté de phléomycine. L’étalement sur
boîte nous a permis d’effectuer un contrôle phénotypique (résistance à la phléomycine) et
morphologique (couleur, taille de la colonie) de la population présente dans la cuve du fermenteur.

A la fin de l’évolution, nous avons observé le maintien de la culture en présence de 180, 200 et
220 mg.L-1 de naringénine (concentrations supérieures à la valeur estimée de la MIC) indiquant une
potentielle adaptation de la souche à la naringénine.

110
III.3.3.3 Crible de clones issus de l'expérience d'évolution en présence de naringénine

Un crible a été entrepris sur les colonies issues de l'expérience d'évolution en présence de
naringénine, en utilisant des tests de toxicité pour tester leur résistance à la naringénine. Pour cela,
des clones isolés provenant d’un prélèvement au cours de l'expérience d'évolution à 180 mg.L-1 (P1),
200 mg.L-1 (P2) et 240 mg.L-1 (P3) de naringénine (Figure 39) ont été caractérisés par LCA. Des tests de
toxicité ont ensuite été effectués en LB sur 19 clones pour chacun des 3 prélèvements à deux
concentrations de naringénine différentes : à la concentration initiale (90 mg.L-1) et à la concentration
du prélèvement. Ainsi, les clones issus du prélèvement P1 sont testés à 90 mg.L-1 et 180 mg.L-1 ; ceux
du prélèvement P2 à 90 mg.L-1 et à 200 mg.L-1 et ceux du prélèvement P3 à 90 mg.L-1 et à 240 mg.L-1.
Seuls sont représentés ici les résultats de P3 à 90 mg.L-1 de naringénine (Figure 40). En effet, aucune
croissance n’a été observée pour les prélèvements, P2 et P3 à 200 et 240 mg.L-1 de naringénine,
respectivement. Une faible croissance a été observée pour le prélèvement P1 à 180 mg.L-1 de
naringénine (données non exploitables). Concernant les prélèvements P1 et P2 à 90 mg.L-1, une
augmentation du taux de croissance de 15 à plus de 20 % selon les clones testés a été observée par
rapport au taux de croissance de la souche parentale.

Figure 40 : Test de toxicité en présence de 90 mg.L-1 de naringénine de clones issus de l'expérience

d'évolution isolés du prélévement P3.
Taux de croissance de la souche parentale (1) et de 19 clones provenant du prélèvement P3 (2 à 20).

111
 Les taux de croissance en présence de naringénine 90 mg.L-1 des clones issus du prélèvement P3
sont indiqués Figure 40. Les taux de croissance (µ) en h-1 sont représentés en fonction du numéro de
chaque clone : le numéro 1 correspond à la souche parentale et les numéros de 2 à 20 (2 à 20)
correspondent aux clones 1 à 19 respectivement. Chaque point de la figure représente une moyenne
de trois valeurs de taux de croissance. Une augmentation d'environ 30% du taux de croissance à
90 mg.L-1 a été observée pour les clones issus du prélèvement P3 en comparaison avec le taux de
croissance de la souche parentale (Figure 40). Six clones issus de trois prélèvements (2 clones par
prélèvement - P1, P2, P3 ; Figure 39) ont été envoyées pour séquençage (Illumina, Eurofins). Pour
rappel, les prélèvements P1, P2 et P3 ont été réalisés après 364 générations (à 180 mg.L-1 de
naringénine), 415 générations (à 200 mg.L-1 de naringénine) et 437 générations (à 240 mg.L-1 de
naringénine) respectivement. Les séquençages de ses souches indiquent la présence de mutations (de
9 à 15 mutations par clone). L'analyse des mutations identifiées dans les 6 clones est en cours. A titre
indicatif et suite à une analyse préliminaire, seules les mutations des deux souches du prélèvement P3
sont indiquées dans la Table 17, pour lesquelles 12 mutations ont été identifiées. De manière
intéressante, l'expression de gènes impliqués dans la réponse au stress ont été la cible de mutations
(yceF, sufD, sufC), et le gène quasi-essentiel topA codant l'ADN topoisomérase I est la cible d’une
mutation pour le clone CJ99_17 qui fait apparaître un codon stop et donc génère une protéine
tronquée. Il est intéressant de noter que l'expression du gène topA est réprimé en présence de
naringénine (données de transcriptomique, cf. §III.4.2), et que parmi les clones isolés au cours des
prélèvements P1 et P2, le gène topA est également la cible de mutations ponctuelles différentes de
celle du clone CJ99_17 (Table 17).

L'analyse de l'apparition des mutations au cours de l'évolution en présence de naringénine, la

validation des mutations identifiées et liées à une résistance éventuelle à la naringénine seront
effectuées de manière plus détaillée dans les semaines qui viennent. Le cas échéant, certaines
mutations seront « transférées » (i.e. backcross) dans le contexte génétique BSB1 pour confirmer la
résistance observée à la naringénine. Quoiqu’il en soit, il apparaît avec ces premiers résultats que la
naringénine pourrait cibler directement la protéine TopA, et que des mutations ponctuelles dans le
gène topA permettraient d’échapper à cette toxicité. Bien évidemment, il est attendu qu’un tel mutant
soit affecté sur sa capacité de croissance en absence de naringénine au vu du fait que ce gène est
quasi-essentiel, même si l’apparition d’un codon stop en position 652 (sur 691 acides aminés) pourrait
générer un variant partiellement fonctionnel. Il nous faudra donc effectuer une mesure de la
croissance de ces clones en croissance sur LB sans naringénine.

112
Table 17. Résultats de la comparaison des séquences de deux clones évolués contre le génome de CS1 Δeps.
STRAIN POS TYPE REF ALT FTYPE STRAND AA_POS EFFECT GENE PRODUCT
296607 ins T TG CDS + 22/257 frameshift_variant c.64dupG p.Glu22fs yceF putative stress adaptation transporter
358542 del AG A
786458 snp G A CDS + 80/238 missense_variant c.239G>A p.Gly80Asp treR transcriptional regulator (GntR family)
conservative_inframe_deletion
c.316_321delGAGAAG
857893 del GCTTCTC G CDS - 106/305 p.Glu106_Lys107del yfhF putative nucleotide binding protein
1085001 del GA G CDS + 32/301 frameshift_variant c.96delA p.Lys32fs yisK putative catabolic enzyme
1582102 del AG A
1595947 del GA G
CJ99_11
synonymous_variant c.996T>C
2454240 snp T C CDS + 332/349 p.Arg332Arg adhA putative dehydrogenase
3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-
phosphate synthase; chorismate mutase-
2742517 snp G A CDS - 313/358 missense_variant c.938C>T p.Ala313Val aroA isozyme
synonymous_variant c.550T>C
2819199 snp T C CDS + 184/209 p.Leu184Leu upp from deletion cassette reminant
3042082 snp G A CDS - 379/437 missense_variant c.1136C>T p.Ala379Val sufD FeS assembly protein SufD
3197209 snp A G CDS + 28/72 missense_variant c.83A>G p.His28Arg yvfG conserved hypothetical protein
296607 del TG T CDS + 22/257 frameshift_variant c.64delG p.Glu22fs yceF putative stress adaptation transporter
786458 snp G A CDS + 80/238 missense_variant c.239G>A p.Gly80Asp treR transcriptional regulator (GntR family)
conservative_inframe_deletion
c.316_321delGAGAAG
857893 del GCTTCTC G CDS - 106/305 p.Glu106_Lys107del yfhF putative nucleotide binding protein
1584068 snp G A CDS + 652/691 stop_gained c.1955G>A p.Trp652* topA DNA topoisomerase I
1595947 del GA G
1619648 del AG A
GATGCTG frameshift_variant
CJ99_17
1821583 del CGCGT G CDS - 145/422 c.434_444delACGCGCAGCAT p.Tyr145fs xynC endo-xylanase
synonymous_variant c.318A>G phosphotransferase system (PTS)
2459011 snp T C CDS - 106/162 p.Gly106Gly levE fructose-specific enzyme IIB component
synonymous_variant c.550T>C
2819199 snp T C CDS + 184/209 p.Leu184Leu upp from deletion cassette reminant
3043969 snp T C CDS - 18/261 missense_variant c.52A>G p.Lys18Glu sufC sulfur mobilizing ABC protein, ATPase
3197209 snp A G CDS + 28/72 missense_variant c.83A>G p.His28Arg yvfG conserved hypothetical protein
synonymous_variant c.1224C>T
3627453 snp C T CDS + 408/457 p.Ser408Ser yxlA putative purine-cytosine permease

113
 Régulation de l’expression génique en présence de différents flavonoïdes

Activité promotrice des gènes d’intérêt en présence de flavonoïdes

Pour comprendre la réponse de B. subtilis aux flavonoïdes, 10 promoteurs répondant

potentiellement à des flavonoïdes ont été sélectionnés en se basant sur les premiers résultats du crible
des mutants B. subtilis, et également sur une étude transcriptomique réalisée précédemment en
présence de quercétine et fisétine (Hirooka 2014). Ainsi, des souches synthétiques chacune contenant
le gène rapporteur sfgfp (i.e. superfolder gfp ; cf. §V.5.3.1) sous le contrôle d’un des 10 promoteurs
présélectionnés ont été construites. L'activité transcriptionnelle de chacune de ces souches en
présence et absence de flavonoïdes (Table 18) a été caractérisée.

Table 18 : Liste des souches B. subtilis rapportrices de l'activité promotrice.

Strain Transcriptional fusion

BSB1 40 Promoter lmrA lmrB (PlmrA) - sfgfp
BSB1 41 Promoter yetL (PyetL) - sfgfp
BSB1 43 Promoter qdoR (PqdoR) - sfgfp
BSB1 44 Promoter qdoI (PqdoI) - sfgfp
BSB1 45 Promoter bmrA yvcD (PbmrA) - sfgfp
BSB1 46 Promoter bmr bmrR (Pbmr) - sfgfp
BSB1 47 Promoter ynfC (PynfC) - sfgfp
BSB1 48 Promoter yxdJ yxeA (PyxdJ) - sfgfp
BSB1 49 Promoter yhjC (PyhjC) - sfgfp
BSB1 50 Promoter yybN (PyybN) - sfgfp

III.4.1.1 Crible des souches rapportrices de l'activité promotrice d'intérêt en présence de flavonoïdes

Les 10 souches construites (Table 18) ont fait l’objet d’un crible en LCA permettant le suivi de la
croissance et la fluorescence de la protéine sfGFP au cours du temps en présence de chacun des 17
flavonoïdes actifs identifiés (Table 19 ; pour des raisons techniques, le 18ème flavonoïde, la quercétine,
n’a pas pu être évalué dans ce crible). Pour chaque flavonoïde, le LCA a été réalisé en présence d'une
gamme de 5 concentrations proches de la ½ MIC estimée à partir de la MIC obtenue sur gélose (Table
19).

La souche BSB1 a été utilisée comme contrôle sur chaque microplaque (96 puits) en LCA. Les
résultats obtenus pour ce crible ont été résumés en Table 20. Nous avons observé que la coloration
des solutions de flavonoïdes 3’,4’-dihydroflavone, 7,8-dihydroflavone, baicaleine, datiscetine, fisetine
et résokaempférol affectait la lecture de la fluorescence de la sfGFP. Ainsi, aucune donnée
expérimentale liée à la sfGFP n’a pu être obtenue pour ces flavonoïdes (Table 20, cases grises).

114
Table 19 : Gammes de concentrations utilisées pour les 17 flavonoïdes actifs contre B. subtilis.

½ MIC ~ Predicted Concentrations used for

Flavonoids MIC (mg.L-1) a
IC50 (mg.L-1) b liquid culture (mg.L-1)
2'-Hydroxyflavanone 31 16.5 0 / 10 / 20 / 30 / 60
3'-4'-dihydroxyflavone 43 21.5 0 / 10 / 20 / 40 / 80
4'-Hydroxyflavanone 93 46.5 0 / 20 /50 / 70 / 100
7,8 Dihydroxyflavone 73 36.5 0 / 20 / 40 / 60 / 80
7-Hydroxyflavanone 97 48.5 0 / 20 /40 / 80 / 100
Baicalein 91 45.5 0 / 20 / 50 / 80 / 100
Bavachin 26 13.0 0 / 10 / 15 / 20 / 30
Datiscetin 57 28.5 0 / 10 / 20 / 30 / 40
Fisetin 120 60.0 0 / 20 / 60 / 100 / 130
Flavone 86 43.0 0 / 20 /40 / 80 / 100
Homoeriodictyol 129 64.5 0 / 40 / 90 / 120 / 150
IsoSakuranetin 66 33.0 0 / 15 / 30 / 60 / 120
Liquiritigenin 227 113.5 0 / 40 / 90 / 150 / 230
Naringenin 159 79.5 0 / 10 / 40 / 80 / 160
Pinocembrin 62 31.0 0 / 15 / 30 / 45 / 60
Resokampferol 20 10.0 0 / 10 / 15 / 20 / 30
Sakuranetin 44 22.0 0 / 10 / 20 / 40 / 80
a
Estimation based on solid medium
b
According to toxicity assays on solid and liquid media in the presence of naringenin and
pinocembrin, the ½MIC seems to be close to the IC50 and was therefore used to approximate the IC50 of
other flavonoids and define the range of flavonoid concentrations to be tested.

Une induction du promoteur lmrA lmrB est observée en présence de chacun des flavonoïdes testés,
excepté pour la sakuranétine où aucune régulation n’est détectée. Le promoteur yetL est induit
seulement en présence de flavone. Les données expérimentales obtenues en présence de
liquiritigenine, pinocembrine et sakuranétine ne nous ont pas permis de conclure quant à la régulation
de ce promoteur. Le promoteur qdoR est induit en présence du 2’-hydroxyflavanone, de la flavone, de
l’isosakuranétine et de la pinocembrine tandis qu’il est réprimé en présence d’homoeriodictyol.
Aucune régulation du promoteur qdoR n’est observée en présence des autres flavonoïdes. Concernant
le promoteur qdoI, une induction a été observée pour 6 flavonoïdes (2’-hydroxyflavanone, 7-
hydroxyflavanone, flavone, homoeriodictyol, liquiritigenine et naringénine) tandis qu’aucune
régulation n’a été observée pour les autres. Dans le cas du promoteur bmrA yvcD, une induction est
observée pour les flavonoïdes bavachine, flavone et naringénine alors que ce même promoteur est
réprimé en présence de 4’-hydroxyflavanone, de liquiritigénine et de pinocembrine.

115
Table 20 : Résumé des cribles en LCA des souches B. subtilis rapportrices de l'activité promotrice en présence de flavonoïdes.
Les résultats du crible des souches rapportrices en présence des différents flavonoïdes testés sont indiqués. Trois conclusions possibles en fonction de la
réponse obtenue lors du LCA : induction (rouge), inhibition (bleu) et pas de régulation (-). Lorsqu’une conclusion était impossible, l’abréviation N/A est inscrite
dans la table.

BSB1 40 BSB1 41 BSB1 43 BSB1 44 BSB1 45 BSB1 46 BSB1 47 BSB1 48 BSB1 49 BSB1 50
Flavonoid
PlmrA PyetL PqdoR PqdoI PbmrA Pbmr PynfC PyxeA PyhjC PyybN
2’-hydroxyflavanone induction - induction induction - - induction - - -
3’,4’-dihydroxyflavone
4’-hydroxyflavanone induction - - - inhibition - - inhibition inhibition -
7,8-dihydroxyflavone
7-hydroxyflavanone induction - - induction - - induction - - -
Baicalein
Bavachin induction - - - induction induction induction - - induction
Datiscetin
Fisetin
Flavone induction induction induction induction induction induction - - - induction
Homoeriodictyol induction - inhibition induction - inhibition - - - -
Isosakuranetin induction - induction - - - induction - - -
Liquiritigenin induction N/A - induction inhibition - induction - - -
Naringenin induction - - induction induction induction - - - -
Pinocembrin induction N/A induction - inhibition - induction inhibition - -
Resokaempferol
Sakuranetin - N/A - - - - - - - induction

116
 Une induction par la bavachine, la flavone et la naringénine et une répression par l’homoeriodictyol
du promoteur de l’opéron bmr bmrR sont observées. Aucune régulation de ce promoteur par les autres
flavonoïdes n'est observée. L’induction du promoteur du gène ynfC est observée pour 6 flavonoïdes :
2’-hydroxyflavanone, 7-hydroxyflavanone, bavachine, isosakuranetine, liquiritigenine, et la
pinocembrine. Pour les promoteurs de l’opéron yxdJ yxeA et du gène yhjC, aucune régulation induite
par les flavonoïdes n’est observée, excepté une répression par la 4’-hydroxyflavanone pour les deux
promoteurs et par la pinocembrine pour le promoteur de l’opéron yxdJ yxeA. En présence de
bavachine, de flavone et de sakuranetine, le promoteur du gène yybN est induit tandis qu’aucune
régulation n’est observée en présence des autres flavonoïdes.

Cette expérience nous a permis d’observer la réponse des promoteurs à un flavonoïde spécifique.
Parmi les promoteurs testés, tous répondent à au moins un flavonoïde. Par exemple, la sakuranetine
n’induit que le promoteur PyybN. De même que le promoteur PyhjC ne répond qu’à la présence de 4’-
hydroxyflavanone contrairement, par exemple, au promoteur PlmrA qui répond la majorité des
flavonoïdes testés. Ces résultats permettent de confirmer certaines cibles potentielles des flavonoïdes
et l’implication de ces cibles dans différents mécanismes d’action vu l’ensemble des profils de réponses
obtenus. Une étude transcriptomique nous permettra de caractériser plus en détail l’expression des
gènes impliqués dans le mécanisme d’action de certains de ces flavonoïdes. Néanmoins, nous pouvons
d’ores et déjà conclure que chaque flavonoïde testé possède un mode d’action qui lui est propre à la
concentration utilisée dans le test.

III.4.1.2 Test de toxicité des 18 flavonoïdes sur la souche BSB1

Lors de la caractérisation des souches rapportrices exprimant le gène sfgfp, la souche BSB1 a été
utilisée comme contrôle pour les différentes gammes décrites dans la Table 19. Pour chaque
flavonoïde, un effet toxique a été observé sur la croissance bactérienne de la souche BSB1 en milieu
liquide. A titre d’exemple, les courbes de dose-réponse de la souche BSB1 aux trois flavonoïdes les plus
actifs contre B. subtilis ont été générées avec les gammes de concentrations suivantes : (0, 10, 15, 20
et 30 mg.L-1) pour le résokaempférol, (0, 3, 5, 7, 10 et 15 mg.L-1) pour la bavachine et (0, 10, 20, 30 et
60 mg.L-1) pour la 2’-hydroxyflavanone. Chaque point de la courbe dose-réponse de chaque flavonoïde
testé, représente une moyenne d'au moins 3 valeurs de taux de croissance de cultures indépendantes
de B. subtilis (Figure 41). Les valeurs d’IC50 ont été estimées, répertoriées et comparées à ½MIC (en
culture solide, Table 12) en présence de chacun des flavonoïdes (Table 21). Dans certains cas, une
nouvelle gamme de concentrations de flavonoïdes a été définie lorsque la première gamme ne
permettait pas d’obtenir l’IC50.

117
Figure 41 : Tests de toxicité des flavonoïdes les plus actifs vis-à-vis de B. subtilis.
Taux de croissance en présence de résokaempférol (jaune), de bavachine (violet) et de 2’-
hydroxyflavanone (vert) (graphique semi-logarithmique). Les courbes en pointillé représentent le
meilleur « fit » semi-log des données expérimentales pour le résokaempférol (R2 = 0,69 ; y = -
47,23 ln(x) + 182,93), la bavachine (R2 = 1 ; y = -16,65 ln(x) + 92,753) et pour la 2’-hydroxyflavanone
(R2 = 0,89 ; y = -35,18 ln(x) + 194,42) respectivement.

Sur l’ensemble des flavonoïdes, six d’entre eux (7-hydroxyflavanone, bavachine, isosakuranétine,
naringénine, pinocembrine et résokaempférol) présentent une concordance entre les valeurs
obtenues en milieux solide et liquide dont la naringénine et la pinocembrine. Les flavonoïdes 7,8
dihydroxyflavone, bacaléine et fisétine étant des flavonoïdes fortement colorés en solution, l’IC50 en
milieu liquide n’a pas pu être déterminée (N/A). Les valeurs d’IC50 de 5 flavonoïdes sur 14, i.e. la 2’-
hydroxyflavanone, la 4’-hydroxyflavanone, la flavone, le résokaempférol et la sakuranetin (Table 21,
surligné en rouge), ont été a priori sous-estimées en milieu solide à cause de leur solubilité. Le fait que
les d’IC50 de quelques flavonoïdes (5 sur un total de 18) aient été sous-estimées implique que l’analyse
de la réponse des promoteurs (cf. §III.4.1.1) pour ces flavonoïdes ne permet pas de conclure sur de
potentiels modes d’action spécifiques. En effet, à des concentrations plus élevées de ces flavonoïdes,
il est possible que quelques profils de réponse deviennent similaires. Néanmoins, au vu de la diversité
de réponse au niveau de la régulation des promoteurs testés, nous pouvons conclure qu’il existe un
grand nombre (> 6 mais néanmoins < 17) de modes d’action différents pour les flavonoïdes testés.

118
Table 21 : Comparaison de la MIC estimée sur gradients de flavonoïdes sur gélose et de l’IC50
mesurées en milieu liquide.

Flavonoids MIC (mg.L-1) in ½MIC (mg.L-1) IC50 (mg.L-1) in MIC (mg.L-1) in 𝐈𝐂𝟓𝟎
Ratio
solid media in solid media liquid media liquid media ½𝐌𝐈𝐂
2’-hydroxyflavanone 31 16.5 62.8 >60 4.0
3’,4’-dihydroxyflavone 43 21.5 29.0 >80 1.3
4’-hydroxyflavanone 93 46.5 124.4 >100 2.7
7,8-dihydroxyflavone 73 36.5 N/A N/A N/A
7-hydroxyflavanone 97 48.5 67.3 >100 1.4
Baicalein 91 45.5 N/A N/A N/A
Bavachin 26 13.0 18.0 >30 1.4
Datiscetin 57 28.5 17.7 >30 0.6
Fisetin 120 60.0 N/A N/A N/A
Flavone 86 43.0 77.8 >100 1.8
Homoeriodictyol 129 64.5 98.5 >150 1.5
Isosakuranetin 66 33.0 28.0 <60 0.8
Liquiritigenin 227 113.5 173.4 >230 1.5
Naringenin 159 79.5 88.5 <160 1.1
Pinocembrin 62 31.0 35.0 <60 1.1
Quercetin 91 45.5 N/A N/A N/A
Resokaempferol 20 10.0 18.0 >30 1.8
Sakuranetin 44 22.0 60.0 >80 2.7

Enfin, les nouvelles données obtenues pour l’IC50 des 17 flavonoïdes ont été implémentées dans le
modèle QSAR (cf. §III.2.2) mais la cross validation de ce nouveau modèle n’a pas confirmé les
prédictions. Au vu de l’ensemble de nos résultats, il est dorénavant évident que le grand nombre de
modes d’action différents des flavonoïdes ne permet pas de mener une approche QSAR rigoureuse
avec seulement une vingtaine de flavonoïdes (car le jeu d’apprentissage n’est pas suffisamment grand
pour couvrir l’ensemble des effets).

Etude globale de l’expression génique en réponse aux flavonoïdes

Une étude transcriptomique a été effectuée pour caractériser la réponse de B. subtilis aux
flavonoïdes et ainsi, identifier et/ou confirmer les gènes potentiels impliqués dans le mécanisme
d’action de ces composés. Dans le but d’obtenir les ARN totaux nécessaires à cette étude, des cultures
de B. subtilis en milieu riche CHG ont été effectuées en duplicat avec l’un des cinq flavonoïdes
sélectionnés (naringénine, pinocembrine, résokaempférol, bavachine et 2’-hydroxyflavanone ; cf.
§V.8) et du DMSO pour les contrôles. La concentration des flavonoïdes utilisées pour cette étude
transcriptomique a été déterminée à partir de la ½ MIC – MIC obtenue lors du crible des flavonoïdes
en milieu solide (cf. §III.2.1 ; et donc significativement sous-estimée pour la 2’-hydroxyflavanone)
(Table 22). Les courbes de chaque duplicat ont été représentées sur la Figure 42.

119
Table 22 : Concentrations en flavonoïdes utilisées lors de l’étude transcriptomique.

Flavonoids Used concentrations (en mg.L-1; ½ MIC)

Pinocembrin 35.5
Naringenin 80.5
Resokaempferol 10
Bavachin 13
2’-hydroxyflavanone 15

Chaque point de la courbe représente une moyenne d’au moins deux valeurs de la DO600nm de
cultures indépendantes de B. subtilis. Les duplicats de culture pour chaque flavonoïde sont corrects
puisqu’aucune variabilité significative n’a été observée (Figure 42). Aucun effet sur la croissance n’a
été observé sur toutes les courbes contrôles en présence de DMSO (culture sans flavonoïde) ainsi le
DMSO n’affecte pas la croissance de B. subtilis. Un effet sur la croissance a été observé en présence de
naringénine et de pinocembrine (Figure 42A) ainsi que pour la bavachine (Figure 42B), après injection.
En revanche, aucun effet visible n’a été observé sur la courbe phénotypique du résokaempférol et de
la 2’-hydroxyflavanone aux concentrations testées ici par rapport à la souche sans flavonoïde.

120
Figure 42 : Cinétiques des cultures de B. subtilis utilisées pour l’étude transcriptomique en présence
et absence de flavonoïdes.
Chaque point sur la courbe représente la moyenne du duplicat pour chaque flavonoïde testé. (A)
Courbe de croissance de B. subtilis sans flavonoïde (noir), en présence de naringénine (bleu) et de
pinocembrine (rouge). (B) Courbes de croissance de B. subtilis sans flavonoïde (noir), en présence de
résokaempferol (jaune) et de bavachine (violet). (C) Courbe de croissance de B. subtilis sans flavonoïde
(noir) et en présence 2’-hydroxyflavanone (vert). Trois prélèvements effectués à trois temps différents
pour chaque réplicat () : avant injection (T0), 15min (T1) et 60 minutes (T2) après injection.

Trois prélèvements à trois temps donnés : avant injection (T0), 15 minutes (T1) et 60 minutes (T2)
après injection, ont été effectués pour chaque condition. A partir de ces échantillons, l'extraction des
ARN totaux a été effectuée par extraction acide-phénol suivi d’un traitement à la DNase (cf. §V.8.3).
Quatre puces Bioanalyser ont ensuite été effectuées pour contrôler la qualité des ARN totaux obtenus
et les résultats de ce contrôle sont présentés dans la Table 23. Parmi toutes les données obtenues,
trois sont importantes pour valider la qualité d’un ARN : i) la concentration d’ARN pour chaque
échantillon, ii) le ratio 23S/16S – ici, la valeur doit être d'environ 1,8 pour B. subtilis - et iii) le numéro
d’intégrité de l’ARN (RIN) – valeur comprise entre 9 et 10.

121
Table 23 : Contrôle qualité des ARNs totaux extraits des différents prélèvements effectués.

Samples Name [RNA] Agilent rRNA ratio [23S/16S] RIN

Chip N1
Replicat 1 – Control - T0 250 1,7 9,4
Replicat 1 – Naringenin - T0 480 2 9,4
Replicat 1- Pinocembrin - T0 400 1,7 10
Replicat 1 – Control - T1 1410 1,8 9,6
Replicat 1 – Naringenin - T1 830 1,8 9,8
Replicat 1- Pinocembrin - T1 470 1,8 9,7
Replicat 1 – Control - T2 1630 1,4 9,2
Replicat 1 – Naringenin - T2 1130 1,8 9,8
Replicat 1- Pinocembrin - T2 710 1,7 9,1
Replicat 2 – Control - T0 450 1,7 9,5
Replicat 1 - Resokaempferol T0 500 1,9 9,9
Replicat 1 - Bavachin T0 670 1,7 9,7
Chip N2
Replicat 2 – Control – T1 390 1.5 9.9
Replicat 1- Resokaempferol T1 570 1.6 9.6
Replicat 1 - Bavachin T1 470 1.6 9.6
Replicat 2 – Control – T2 1330 1.3 9.2
Replicat 1- Resokaempferol T2 1180 1.3 9.1
Replicat 1 - Bavachin T2 1470 1.4 9.4
Replicat 3 – Control - T0 460 1.7 9.8
Replicat 2 – Naringenin - T0 620 1.6 9.8
Replicat 2- Pinocembrin - T0 650 1.8 9.9
Replicat 3 – Control - T1 1110 1.6 9.8
Replicat 2 – Naringenin - T1 770 1.6 9.9
Replicat 2- Pinocembrin - T1 690 1.6 9.7
Chip N3
Replicat 3 – Control – T2 1110 1.3 9.5
Replicat 2 – Naringenin – T2 1410 1.5 9.6
Replicat 2- Pinocembrin – T2 570 1.6 9.9
Replicat 4 – Control - T0 360 1.8 10
Replicat 2 - Resokaempferol T0 490 1.8 10
Replicat 2 - Bavachin T0 460 1.8 10
Replicat 4 – Control – T1 470 1.7 10
Replicat 2 - Resokaempferol T1 1100 1.7 9.8
Replicat 2 - Bavachin T1 730 1.7 10
Replicat 4 – Control – T2 1240 1.3 9.5
Replicat 2 - Resokaempferol T2 1020 1.1 9.4
Replicat 2 - Bavachin T2 1590 1.4 9.7
Chip N4
Replicat 5 – Control – T0 290 1.7 9.8
Replicat 1 – 2’-hydroxyflavanone –T0 470 1.7 9.9
Replicat 5 – Control – T1 790 1.6 9.6
Replicat 1 – 2’-hydroxyflavanone –T1 1240 1.6 9.6
Replicat 5 – Control – T2 1370 1.3 9.1
Replicat 1 – 2’-hydroxyflavanone –T2 980 1.2 9.2

122
 Replicat 6 – Control – T0 550 1.8 9.9
Replicat 2 – 2’-hydroxyflavanone –T0 390 1.8 10
Replicat 6 – Control – T1 950 1.6 9.8
Replicat 2 – 2’-hydroxyflavanone –T1 940 1.7 9.9
Replicat 6 – Control – T2 630 1.1 8.9
Replicat 2 – 2’-hydroxyflavanone –T2 500 1.2 8.7

Les ARN totaux ont été envoyés à la plateforme iPS2 pour séquençage et les données de RNAseq obtenues ont
été réaggrégées statistiquement par Cyprien GUERIN de l’unité MaIAGE.

III.4.2.1 Analyse macroscopique de la réponse globale de B. subtilis aux flavonoïdes

On observe que les échantillons à T0 (barre rose fushia, ligne "time", Figure 43), se clusterisent
relativement correctement, excepté pour l'échantillon traité avec la 2’-hydroxyflavanone pendant 15
minutes dont le profil transcriptomique se rapproche de celui d'un échantillon à T0 ou de celui de la
souche en absence de flavonoïde, indiquant une faible réponse de B. subtilis à ce flavonoïde dans ces
conditions expérimentales. Les deux réplicats de chacune des conditions expérimentales apparaissent
tout à fait corrects, malgré quelques divergences comme par exemple pour l'échantillon traité au
résokaempférol pendant 60 minutes, ou à la 2’-hydroxyflavanone pendant 15 minutes (Figure 43).

On observe également que les échantillons traités avec la pinocembrine et la bavachine pendant
15 minutes sont relativement proches en termes de réponse globale de l'expression génique (Figure
43 ; les 4 dernières colonnes à droite). Le traitement à la 2’-hydroxyflavanone pendant 60 minutes
semblent avoir un moindre impact du fait que l'échantillon correspondant clusterise avec l'échantillon
en absence de flavonoïde. Enfin, un réplicat de l'échantillon traité au résokaempférol pendant 60
minutes clusterise avec l'échantillon traité à la bavachine pendant 60 minutes, qui semble relativement
similaire au profil transcriptomique de l'échantillon traité à la pinocembrine pendant 60 minutes.

Globalement, les traitements à la pinocembrine et bavachine induisent une très forte réponse de
l'expression génique de B. subtilis, dans une moindre mesure la naringénine induit de fortes
modifications de l'expression de certains clusters de gènes et le résokaempférol et la 2’-
hydroxyflavanone induisent une faible réponse transcriptomique à travers seulement la dérégulation
de quelques clusters de gènes.

A noter que, pour la suite de l'analyse transcriptomique, nous comparerons les niveaux d'expression
des gènes de B. subtilis en présence de flavonoïde avec ceux de la souche en absence de flavonoïde aux
mêmes temps d'incubation.

123
Figure 43: Table représentant le niveau d'expression des gènes dans la souche BSB1 en absence (WT)
ou après incubation en présence de 2’-hydroxyflavanone (2OHFlav), bavachine (Bavac), naringénine
(Nar), pinocembrine (Pino), résokaempférol (Resok) pendant 15 ou 60 minutes.
Les clusters des gènes sont représentés à gauche, et les clusters par échantillons représentés en haut
de la figure.

III.4.2.2 Comparaisons croisées des gènes dérégulés à travers les différentes conditions

Le diagramme de Venn (Figure 44) représente 31 groupes de gènes régulés par les flavonoïdes
(c'est-à-dire les gènes différentiellement exprimés en présence de flavonoïdes par rapport à leur
niveau d'expression en absence de flavonoïdes). Ces 31 groupes sont définis par les gènes

124
spécifiquement régulés par l'un des 5 flavonoïdes testés, et par les gènes régulés de manière similaire
(surexprimés ou réprimés) par deux flavonoïdes ou plus.

Figure 44 : Diagramme de Venn.

Le nombre de gènes régulés sont indiqués (nombre de gènes surexprimés | nombre de gènes réprimés)
pour la 2’-hydroxyflavanone (F), la bavachine (B), la naringénine (N), la pinocembrine (P), le
résokaempférol (R).

Les changements d'expression en présence de flavonoïdes sont plus nombreux et plus marqués
après 15 minutes d'incubation par comparaison aux 60 minutes d'incubation, excepté dans le cas de
la 2’-hydroxyflavanone où l'on observe le phénomène inverse (Table 24).

Seuls les gènes d'une expression différentielle d'au moins égale à un facteur 2 sont considérés,
incorporant les gènes annotés "misc features" dans la base de données Subtiwiki (Michna, Commichau
et al. 2014). La bavachine induit une dérégulation de 2774 gènes dont 1487 gènes surexprimés et 1287

125
gènes réprimés (Table 25). Parmi ces gènes, 487 et 306 sont respectivement surexprimés et réprimés
qu’en présence de bavachine (Figure 44) ; les autres pouvant être également dérégulés en présence
d’un des quatre autres flavonoïdes. Le nombre de gènes dont la régulation répond à la présence de
pinocembrine suit la même tendance que celui répondant à la présence de la bavachine avec un
nombre similaire de dérégulations (Table 25). La naringénine est responsable de la dérégulation de
846 gènes (Table 25) dont 78 et 134 spécifiquement surexprimés et réprimés respectivement (Figure
44). Les effets de la 2’-hydroxyflavanone et du résokaempférol sont moindres en nombre de gènes
régulés, avec respectivement 66 et 13 gènes surexprimés et réprimés par la 2’-hydroxyflavanone, et
42 et 11 gènes respectivement surexprimés et réprimés par le résokaempférol (Table 25).

Table 24 : Nombre de gènes régulés (seuil ≥ 2) après 15 et 60 minutes d'incubation avec le flavonoïde.

Number of regulated genes Number of regulated genes

after 15 minutes of incubation after 60 minutes of incubation
Up-regulated Down-regulated Up-regulated Down-regulated
2’-hydroxyflavanone 70 14 171 167
Bavachin 1842 1649 397 432
Naringenin 570 548 323 290
Pinocembrin 1596 1579 852 786
Resokaempferol 44 17 11 2

Table 25 : Nombre de gènes régulés après 15 minutes d'incubation avec le flavonoïde.

Number of Number of up- Number of down-

regulated genes regulated genes regulated genes
Threshold Threshold Threshold Threshold Threshold Threshold
<2 ≥2 <2 ≥2 <2 ≥2
2’-hydroxyflavanone 84 79 70 66 14 13
Bavachin 3491 2774 1842 1487 1649 1287
Naringenin 1118 846 570 431 548 415
Pinocembrin 3175 2556 1596 1306 1579 1250
Resokaempferol 61 53 44 42 17 11

Parmi les gènes réprimés par la bavachine, 42 gènes sont surexprimés par au moins un parmi les 4
autres flavonoïdes. De manière similaire, parmi les gènes réprimés par la naringénine ou le
résokaempférol, respectivement 14 gènes et 2 gènes sont surexprimés par au moins un flavonoïde
parmi les 4 autres.

La bavachine et la pinocembrine induisent une dérégulation importante du métabolisme bactérien,

de même que la naringénine et de façon moindre le résokaempférol et la 2’-hydroxyflavanone. Il est à
noter que la concentration utilisée de 2’-hydroxyflavanone est 4 fois inférieure à son IC50 expliquant
ainsi la faible réponse de B. subtilis face à ce flavonoïde. A l’inverse, la réponse transcriptionnelle à la
présence de résokaempférol, dont la concentration utilisée est proche de son IC50, est très limitée alors

126
que l’effet d’une concentration relativement faible (par rapport aux autres flavonoïdes) est significatif
sur la croissance de B. subtilis.

III.4.2.3 La bavachine, la pinocembrine et la naringénine ciblent le métabolisme carboné central de

Bacillus subtilis

Alors que les injections de flavonoïdes ont été effectués sur des cultures en CHG (i.e. présence de
glucose) en phase exponentielle de croissance, le gène ptsG codant la permease au glucose du PTS
(phosphotransferase system ; Figure 45) normalement induit par la présence de glucose dans le milieu
est réprimé en présence des flavonoïdes bavachine, naringénine et pinocembrine. L'expression de ptsG
est sous le contrôle de l'antiterminateur GltC, et son activité est elle-même négativement contrôlée
par le système PTS. L'expression de glcT est également réprimée en présence de bavachine et
pinocembrine.

Le gène pgi est faiblement surexprimé en présence de pinocembrine. Le gène cggR codant le
répresseur (également auto-répresseur) de l'opéron gapA n'est pas régulé, tandis que l'opéron gapA
(gapA, pgK, pgm, eno, tpiA) est réprimé après 60 minutes d'incubation en présence de pinocembrine.
L'opéron pfkA-pyk, réputé pour être exprimé de manière constitutive, est également réprimé en
présence de bavachine et pinocembrine, et pfkA est surexprimé après 60 minutes d'incubation avec la
pinocembrine. En présence de bavachine et pinocembrine, les gènes codant les enzymes de
néoglucogenèse, fbp (bavachine et pinocembrine), gapB (bavachine) sont surexprimés.

Ces résultats indiquent que la voie glycolytique est réprimée au profit de la néoglucogenèse, après
incubation avec la pinocembrine, la bavachine ou la naringénine. Cette régulation est plus fortement
prononcée après 60 minutes d'incubation avec la pinocembrine. Ce résultat est inattendu dans des
conditions de croissance où la source carbonée principale (i.e. le glucose) n’est pas encore totalement
consommée.

L'opéron pdhABCD, codant la pyruvate déshydrogénase (Figure 45), est réprimé après 15 minutes
d'incubation en présence de bavachine et pinocembrine, et est surexprimé après 60 minutes
d'incubation en présence de 2’-hydroxyflavanone, bavachine, et naringénine. Les gènes citB, citZ, icd,
mdh, odhAB, sdhABC, sucCD (codant respectivement pour l’aconitase, la citrate synthase, la malate
dehydrogenase, la 2-oxoglutarate dehydrogenase, la succinate dehydrogenase, la succinyl-CoA
synthetase ; Figure 45) sont surexprimés en présence de bavachine, naringénine et pinocembrine. Ces
dérégulations montrent une forte activité du cycle de Krebs.

127
Figure 45 : Représentation schématique du métabolisme de B. subtilis adapté de (Hartig and Jahn
2012).
Est représentée à côté des gènes, la réponse transcriptomique de B. subtilis en présence des
flavonoïdes suivants : 2’-hydroxyflavanone (◼), bavachine (◼), naringénine (◼), pinocembrine (◼) et
résokaempférol (◼) à T=15min (carré plein) et à T=60min (carré en damier). ptsG, glucose perméase
du système phosphotransférase (PTS) composant de l'enzyme IICBA; pgi, phospho glucose isomérase;
fbp, fructose-1,6-bisphosphatase; pfk, 6-phosphofructokinase; fbaA, fructose-1,6-bisphosphate
aldolase; tpi, triose-phosphate isomérase; gapA and gapB, glycolytic and gluconéogénic glycéraldéhyd-

128
3-phosphate déhydrogénase; pgm, phosphoglycérate mutase; eno, enolase; pykA, pyruvate kinase;
pckA, phosphoenolpyruvate carboxykinase; pycA, pyruvate carboxylase, pdhABCD, pyruvate
déhydrogénase; citA, citrate synthase I; citZ, citrate synthase II; citB, aconitase; icd, isocitrate
déhydrogénase; odhAB, 2-oxoglutarate déhydrogénase; pdhD, dihydrolipoamide déhydrogénase sous-
unité E3; sucCD, dihydrolipoamide déhydrogénase; sdh, succinate déhydrogénase; citG, fumarase;
citH, malate déhydrogénase; ldh, lactate déhydrogénase; alsS, α-acétolactate synthase; alsD, α-
acétolactate déhydrogénase; bdhA, 2,3-butanediol déhydrogénase; pta, phosphotransacétylase; ackA,
acétate kinase; ndh, NADH déhydrogénase; yumB, putative NADH déhydrogénase; yutJ, putative NADH
déhydrogénase; narGHJI, nitrate réductase.

Lors de la fermentation, le pyruvate est converti en lactate, acétate, éthanol et acétoïne elle-même
convertie en 2,3 butanediol (Figure 45). Les gènes pta et ackA (production d'acétate), connus pour être
induits par la présence de glucose dans le milieu, sont réprimés en présence de bavachine (pta, ackA)
et pinocembrine (ackA). Les gènes alsSD (production d'acétoïne) sont surexprimés en présence de
pinocembrine et réprimés en présence de bavachine et naringénine sachant qu’alsR (codant le
répresseur de l’opéron alsSD) est surexprimé dans ces mêmes conditions. Le gène bdhA (production
de 2,3 butanediol) est surexprimé en présence de bavachine et pinocembrine. Ces gènes font partie
du métabolisme de l’ "overflow".

En conclusion, nos résultats montrent que la bavachine, la pinocembrine et la naringénine ciblent

particulièrement le métabolisme carboné central de B. subtilis en induisant une réponse
transcriptionnelle typique d’une absence de source carbonée glycolytique.

III.4.2.4 Les cinq flavonoïdes induisent une réponse transcriptionnelle spécifique de croissance en
condition microaérobie ou anaérobie

Les gènes ldh (codant pour une L-lactate dehydrogenase, et induit dans des conditions d'anaérobie
(Larsson, Rogstam et al. 2005)) et cydA (codant pour le cytochrome bd ubiquinol oxidase, et activé
dans des conditions de faible disponibilité d'oxygène (Larsson, Rogstam et al. 2005)) sont surexprimés
en présence des 5 flavonoïdes (aire FBNPR, Figure 44). Les gènes ldh et cydA appartiennent au régulon
du répresseur Rex dont les gènes (yjlc ndh, alsS alsD, et hemZ) sont réprimés. Le gène rex est lui-même
surexprimé en présence de bavachine et de pinocembrine. Le régulateur redox Rex répond de manière
indirecte aux variations d'oxygène disponible en réagissant au rapport [NADH+H+] / NAD+ au sein de la
cellule. En présence de NADH, le complexe Rex-NADH perd son affinité vis-à-vis des promoteurs cibles
tandis qu'à faible rapport [NADH+H+] / NAD+ Rex réprime des gènes cibles spécifiques. Dans des
conditions de croissance typiques de fermentation, en faible teneur en oxygène, la concentration
[NADH+H+] augmente à cause d'une plus faible réoxydation en NAD+ (respiration réduite), induisant
une dérépression des gènes contrôlés par Rex. Les gènes contrôlés par Rex tels les opérons ldh lct,
cydABCD et le gène ywcJ sont en effet déréprimés, tandis que l’opéron yjlc ndh, et le gène hemZ sont
réprimés en présence de bavachine et pinocembrine, et alsSD réprimé en présence de bavachine et

129
naringénine. L’opéron alsS alsD est également activé par AlsR (alsR surexprimé en présence de
bavachine et pinocembrine). Il est à noter qu’en condition anaérobie, la transcription des opérons
ldh lct, cydABCD et du gène ywcJ est également activée par le régulateur ResD (cf. §III.4.2.5).

Les gènes nasDEF (codant une nitrite réductase) et hmp (codant une flavohémoglobine de
détoxification pour le NO en le convertissant en nitrate) sont surexprimés en présence de
pinocembrine (nasDEF, hmp), bavachine (nasDEF) et naringénine (nasDEF) après 15 minutes
d'incubation (aires BNP et P, Figure 44 ; effet non observé après 60 minutes d'incubation). Cette
surexpression peut être due à une dérépression via NsrR (nsrR faiblement induit en présence de
bavachine et pinocembrine) par la présence de NO (complexe NsrR-NO inactif) et donc une respiration
nitrate. L'opéron nasDEF et le gène hmp sont également activés par ResD/E en absence ou limitation
d'oxygène. Les gènes fnr, hmp, nasDEF, ykuNOP appartenant au régulon NsrR sont surexprimés en
présence d'au moins un flavonoïde, seul narK (appartenant exclusivement au régulons NsrR et FnrR)
est réprimé en présence de bavachine, naringénine et pinocembrine, par un mécanisme de régulation
encore non identifié.

En conclusion, ces résultats suggèrent une probable dérégulation du ratio [NADH+H+] / NAD+ au
sein de la cellule quelque soit le flavonoïde testé, indépendamment de l’action de certains de ces
flavonoïdes (i.e. la bavachine, la pinocembrine et la naringénine) sur le métabolisme carboné central.
Par ailleurs, nos résultats indiquent que les flavonoïdes de manière générale induisent une réponse
transcriptionnelle typique d’une absence (ou faible disponibilité) en oxygène.

III.4.2.5 La bavachine et la pinocembrine induisent une dérégulation du métabolisme de

l’ammonium chez B. subtilis

B. subtilis assimile l'ammonium par le cycle ATP dépendent de GS-GOGAT (glutamine synthetase –
glutamate synthase). La GS catalyse la conversion (ATP dépendante) du glutamate et de l'ammonium
en glutamine. GS et le répresseur GlnR (codé par l'opéron glnRA) sont produits en absence de
glutamine (source préférentielle en azote). La répression de glnRA en présence de bavachine et
pinocembrine semble indiquer la présence de glutamine car dans cette condition (i.e. présence de
glutamine), GlnR inhibe l'expression de l'opéron glnRA. L'opéron gltAB (surexprimé en présence de
bavachine et réprimé en présence de pinocembrine) code les deux sous-unités de GOGAT qui catalyse
la formation de 2 molécules de glutamate à partir de la glutamine et de l'oxoglutarate.

130
Figure 46 : Voies de synthèse et de dégradation du glutamate (Gunka and Commichau 2012).
La biosynthèse du glutamate relie le métabolisme carboné et le métabolisme azoté. Le glutamate est
synthétisé par la glutamate dehydrogenase (GDH) dépendante du NADPH2 à partir du 2-oxoglutarate,
et par la glutamate synthase (GOGAT) à partir de la glutamine.

L'expression de gltAB est contrôlée par des signaux du métabolisme carboné et azoté et dépend du
facteur de transcription GltC (gltC non régulé en présence des 5 flavonoïdes) et TnrA (tnrA faiblement
réprimé en présence de pinocembrine après 15 minutes d'incubation et surexprimé après 60 minutes
d'incubation). En présence d'azote, TnrA est inactivé par GS et n'est plus capable d'inhiber la
transcription de gltAB. GOGAT n'est produit que si les deux substrats, le 2-oxoglutarate (intermédiaire
du cycle de Krebs) et la glutamine, sont disponibles pour la production de glutamate. Cet effet est
concordant avec l'observation d'une forte activité du cycle de Krebs (Figure 46).

La glutamate déshydrogénase RocG (rocG surexprimé en présence de bavachine) est le seul enzyme
glutamate déshydrogénase actif chez B. subtilis (GudB est inactif). Sa régulation est indépendante des
facteurs de transcription ahrC (codant un activateur des gènes du catabolisme de l'arginine mais
réprimé en présence de bavachine et pinocembrine) et rocR (activant les gènes nécessaires à
l'utilisation de l'arginine, et non régulé en présence de flavonoïde). En présence de glucose, le
régulateur transcriptionnel de la répression catabolique CcpA réprime le promoteur rocG dépendant
de sigma L (L). Les surexpressions de rocG (en présence de bavachine) et L (en présence de
bavachine, naringénine et pinocembrine) semblent liées à la dérépression de CcpA (ccpA réprimé en
présence de bavachine et pinocembrine ; pas de régulateur identifié à ce jour) ou à une activité de
répression plus faible du complexe CcpA/HPr (potentiellement liée à un taux réduit de phosphorylation
de HPr-Ser46-P) malgré la présence de glucose (cf. §III.4.2.3). En effet, le régulateur de la répression

131
catabolique, CcpA, réprime de nombreux gènes et opérons cataboliques, principalement ceux
impliqués dans le métabolisme du carbone, de l'azote et du phosphate (Tojo, Satomura et al. 2011).

III.4.2.6 La bavachine et la pinocembrine (et dans une moindre mesure la naringénine) ciblent la
synthèse des membranes et paroi cellulaires

L'activation d'une réponse au stress de l'enveloppe cellulaire, suite à un stress physique ou

chimique affectant l'intégrité de la paroi et/ou de la membrane, permet la régulation des propriétés
biophysiques de la membrane (adaptation homéoviscidaire) chez les bactéries. Cette adaptation est
régulée par le facteur σW et il a été montré que la surexpression de W réduit la fluidité membranaire
en altérant l'expression des gènes de la biosynthèse des acides gras (Kingston, Subramanian et al.
2011). Les régulons de σW et σX régulent les réponses de détoxification et protection contre les
antimicrobiens, et les processus de modifications de l'enveloppe cellulaire respectivement (Turner and
Helmann 2000). Nous observons une répression en présence de flavonoïdes de sigW (bavachine,
naringénine, pinocembrine) et sigX (naringénine, pinocembrine), et la répression de sigW pourrait
dans notre cas être médiée par RocG (Lee, Kingston et al. 2012). En effet, l'opéron yuaFGI connu pour
réduire la fluidité membranaire sous le contrôle de W en réponse à l'antibiotique cefuroxime (Lee,
Kingston et al. 2012) est surexprimé en présence de bavachine et pinocembrine, et réprimé après 60
minutes en présence de naringénine. Ainsi, la bavachine et la pinocembrine semblent cibler la
membrane bactérienne. De même que le régulon de σW, le régulon de σM est également induit par les
antibiotiques qui inhibent la biosynthèse de la paroi cellulaire (Cao, Wang et al. 2002). Le gène sigM
est surexprimé après 15 minutes en présence de bavachine, pinocembrine, et réprimé après 60
minutes d'incubation en présence de bavachine et naringénine. Seul 39 % du régulon SigW est
surexprimé (contre ~21% réprimé) en présence de bavachine et pinocembrine. Une tendance similaire
est observée pour les régulons de SigM et SigX.

La biosynthèse des acides gras est la première étape dans la formation des lipides membranaires.
L'acétyl-CoA est converti en malonyl-CoA par l'acétyl-CoA carboxylase AccA/B/C/D. La biosynthèse des
acides gras débute ensuite par une étape de condensation (malonyl-ACP et acétyl-CoA), suivie par une
étape d'élongation (catalysée par les enzymes FabG, FabZ, FabI, FabL et FabZ). FapR est un auto-
répresseur, et le régulateur majeur des gènes impliqués dans la biosynthèse des acides gras et des
phospholipides. FapR assure ainsi le couplage de la biosynthèse des acides gras avec l'expression des
gènes impliqués dans le métabolisme des lipides (Schujman, Paoletti et al. 2003). Dans des conditions
d'inhibition de la biosynthèse des acides gras provoquant l'accumulation de malonyl-CoA (précurseur
de la biosynthèse des acides gras), le malonyl-CoA en se liant à FapR le rend inactif induisant la
dérépression du régulon FapR. Après 15 minutes d'incubation en présence de bavachine ou de

132
pinocembrine, le régulon FapR est réprimé, de même que l'opéron de biosynthèse du malonyl-CoA,
accDA (Figure 47). Seul le gène yhdN du régulon FapR est surexprimé en présence de bavachine et
pinocembrine. Le gène yhdN code une aldo-keto reductase impliquée dans la détoxification du
méthylglyoxal (MG) et fait également partie du régulon SigB (impliqué dans la réponse au stress). A
noter que la dégradation des lipides ne semble que faiblement impactée à travers la régulation des
gènes lcfA, lcfB, fadB, fadN, fadA, fadE, fadR.

Figure 47 : Voies de biosynthèse des acides gras (FAS II) et intégration des acides gras dans les
phospholipides (adaptée de (Diomande, Nguyen-The et al. 2015)).
Les enzymes sont indiqués en gras. Le principal régulateur de cette voie ; FapR ; est indiqué, et les
enzymes dont les gènes appartiennent au régulon fap sont indiqués en vert. Les traits rouges indiquent
une répression. AccABCD, acétyl-CoA carboxylase ABCD ; FapR, régulateur de la biosynthèse des acides
gras et des phospholipides ; FabD, malonyl-CoA : ACP transacylase ; FabH, β-ketoacyl-ACP synthase III,
FabZ, β-hydroxyacyl-ACP déshydratase, FabI, enoyl-ACP réductase I ; FabL, enoyl-ACP réductase III ;
FabF, β-ketoacyl-ACP synthase II ; PlsX, acyl-acyl-ACP-phosphate acyltransférase ; PlsY, acyl-phosphate-
glycérol-phosphate acyltransférase ; PlsC, 1-acylglycérol-3-P acyltransférase ; Des, désaturase.

Le gène ywaC est surexprimé en présence de bavachine, pinocembrine après 15 minutes et 2’-
hydroxyflavone après 60 minutes. YwaC (ou SasA) code pour une (p)ppGpp synthetase (indépendante
de la réponse stringente), et répond pratiquement exclusivement aux antibiotiques ciblant la paroi
bactérienne (Czarny, Perri et al. 2014). La paroi bactérienne est composée du peptidoglycane et d'acide
téichoïque (Figure 48), synthétisé sur le undecaprenol phosphate (lipid carrier).

133
Figure 48 : Polymères d'acide techoïque localisés dans la paroi bactérienne, covalemment ancrés au
peptidoglycane (Brown, Santa Maria et al. 2013).

Les antibactériens ciblant la paroi bactérienne sont principalement des inhibiteurs de la

biosynthèse du peptidoglycane, mais il est à noter que la biosynthèse de l'acide teichoïque et du
undecaprenol sont des cibles antibiotiques prometteuses (Swoboda, Meredith et al. 2009, Tidten-
Luksch, Grimaldi et al. 2012, Farha, Leung et al. 2013, Wang, Gill et al. 2013, Czarny, Perri et al. 2014).
L'acide téichoïque de la paroi est covalemment lié au peptidoglycane et représente 60% de la masse
du la paroi bactérienne chez les bactéries à Gram positif. Les trois premières étapes de la biosynthèse
de l'acide téichoïque sont catalysées par TagO, TagA et TagB (Figure 49).

Figure 49 : Biosynthèse de l'acide téichoïque de la paroi bactérienne.

(A) étapes initiales, (B) étapes finales de la biosynthèse (Brown, Santa Maria et al. 2013).

Les opérons tagABC, et tagDEFGH sont réprimés en présence de bavachine et pinocembrine (tagO
faiblement réprimé après 60 minutes en présence de bavachine). Les gènes codant TagT (YwtF), TagU

134
(LytR), TagV (YvhJ) et DltABCDE (Figure 50) sont réprimés en présence de bavachine, pinocembrine et
naringénine.

Figure 50: Représentation du transport des polymères de l'acide techoïque avec TagGH.
Le polymère est ensuite accroché au peptidoglycane par TagTUV. DltABCD est responsable de
l'adénylation extracellulaire de l'acide téichoïque (Brown, Santa Maria et al. 2013).

L'assemblage du monomère peptidique disaccharide pour la biosynthèse du peptidoglycane

consiste en une voie métabolique linéaire comprenant des nucléotides UDP et des intermédiaires
lipidiques (Figure 51). Les étapes cytoplasmiques conduisent à la formation du pentapeptide UDP-
MurNAc à partir de l'UDP-GlcNAc par les synthétases MurA à MurF. La transférase MraY catalyse
ensuite le transfert du groupe phospho-MurNAc-pentapeptide de l'UDP-MurNAc-pentapeptide sur
l'accepteur membranaire undécaprényl phosphate pour former le lipide I. Le lipide II est formé par
l'ajout de N-acétylglucosamine sur l'acide N-acétylmuramique du lipide I, catalysé par MurG. Le lipide
II est constitué de l'unité monomérique disaccharide-peptide : GlcNAc-β-(1-4)-MurNAc-I-Ala-y-d-Glu-
A2pm (ou L-Lys)-D-Ala-D-Ala.

135
Figure 51 : Etapes de la biosynthèse du peptidoglycane (sous forme de monomère).
A2pm, acide diaminopimélique ; GlcNAc, N-acétylglucosamine ; MurNAc, acide N-acétylmuramique.

Les gènes glmS, glmU (gcaD), murA, murC, murD, murE, murF, mraY sont réprimés en présence de
bavachine, et pour certains également en présence de naringénine (glmS, glmU, murA) et de
pinocembrine (glmU, murA, murC, murD, murE, mraY).

En conclusion, la bavachine, la pinocembrine et dans une moindre mesure la naringénine semblent

cibler la synthèse de l’enveloppe bactérienne, à la fois à travers une dérégulation de l’expression de la
voie de biosynthèse des lipides, et la répression de la synthèse des acides téichoiques et du
peptidoglycane. Ces réponses sont en partie liées à l’activation des régulons σW et σM, et de l’induction
de ywaC codant une (p)ppGpp synthetase indépendante de la réponse stringente.

136
III.4.2.7 La bavachine et la pinocembrine induisent/simulent la réponse stringente

La réponse stringente, permettant l'adaptation de la bactérie à des conditions de croissance

défavorables, est un mécanisme de régulation contrôlé par les protéines de la famille RelA-SpoT, et
médiée par les alarmones guanosine tetraphosphate et guanosine pentaphosphate (collectivement
dénotées (p)ppGpp ; Figure 52). Les cibles transcriptionnelles du (p)ppGpp sont indirectes chez B.
subtilis (contrairement à E. coli) et répondent aux variations de concentration du nucléotide initiateur.
Le (p)ppGpp régule la biosynthèse des protéines, la réplication, la réponse au stress acide, le
métabolisme polyphosphate, la biosynthèse et incorporation des nucléotides et la réponse stringente
elle-même (à travers la régulation de la synthèse de GTP).

Nos résultats montrent que 87% des gènes appartenant au régulon de la réponse stringente sont
réprimés en présence de bavachine et pinocembrine, contre 22% en présence de naringénine, et aucun
gène n’est dérégulé en présence de 2-hydroxyflavone et de résokampférol. Les gènes impliqués dans
la traduction (gènes rpIA-B-C-E-F-J-K-L-M-N-O-P-Q-R-S-T-U-V-W-X, rpsB-C-D-E-F-G-H-I-J-K-L-M-N-O-P-
Q-R-S, rpmA-B-C-D-E-F-I-J codant les protéines ribosomales, infA-B-C codant les facteurs d'initiation,
tsf et tufA codant les facteurs d'élongation), la transcription (nusA codant le facteur d'élongation, rpoA-
B codant l'ARN polymérase, nusB codant le facteur antiterminaison), la synthèse d'ATP (atpA-B-C-D-E-
F-G-H-I) sont des cibles directes de la réponse stringente et sont fortement réprimés en présence de
bavachine ou de pinocembrine.

L'augmentation de la concentration en (p)ppGpp réduit de facto la concentration en GTP

intracellulaire ce qui a pour conséquence de réduire l'activité du répresseur CodY (lié au GTP ; Figure
52). Après 15 minutes d'incubation en présence de bavachine, 55% des gènes appartenant au régulon
CodY sont déréprimés (surexprimés), versus 32% en présence de pinocembrine, et seulement 17% en
présence de naringénine (1% et 3% en présence de 2-hydroxyflavone et résokampférol,
respectivement). Cet effet est pratiquement perdu après 60 minutes d'incubation excepté en présence
de pinocembrine pour laquelle l'effet est atténué. A titre d’exemple, les gènes codant pour les voies
de biosynthèse des acides aminés branchés (isoleucine, valine, leucine) sont surexprimées
(déréprimés), et les gènes de biosynthèse tels que l'opéron ilvBHC-leuABCD (ilv-leu), ilvA et ilvD sont
des cibles directes de CodY.

137
Figure 52 : Régulation de la synthèse de (p)ppGpp et régulations transcriptionnelles qui en résultent
chez les bactéries Gram positif et Gram négatif (de (Planson, Sauveplane et al. 2020)).
Représentation de la voie métabolique du (p)ppGpp chez les bactéries Gram négatif (gauche) et Gram
positif (droite). Les réactions enzymatiques sont indiquées en noir, les inhibitions et répressions
médiées par le (p)ppGpp en rouge, les activations en bleu, et l'induction médiée par le GTP en cyan.
Les bactéries Gram positif et Gram négatif utilisent une stratégie globale similaire pour contrôler la
biosynthèse des GTP. Le (p)ppGpp exerce un contrôle direct sur l'abondance du GTP en inhibant
HprT/Hpt et GuaB, et spécifiquement Gmk chez B. subtilis et Gpt, PurA, et PurF chez E. coli. La
nucléosidase PpnN régule l'homéostasie des purines en clivant les monophosphates de nucléosides en
réponse à la liaison du (p)ppGpp, et la liaison directe de l'alarmone à RelA régule positivement la
synthèse de (p)ppGpp. À une concentration élevée de (p)ppGpp chez les bactéries Gram négatif, la
RNAP, avec la protéine DksA, arrête la transcription des rrn et des gènes codant les protéines
ribosomales. Chez B. subtilis, l'abondance du GTP influence directement l'initiation de la transcription
en fonction de la composition en nucléotides du départ de transcription en modifiant la préférence de
la RNAP pour ses promoteurs. Le répresseur transcriptionnel CodY est activé par le GTP chez B. subtilis.
HX, hypoxanthine ; PRPP, 1-pyrophosphoribosyl-5-phosphate ; IMP, inosine 5′-monophosphate ; XMP,
xanthosine 5′-monophosphate ; AMPs, adénylosuccinate ; X, xanthine ; G, guanine ; PurA,
adénylosuccinate synthétase ; GuaB, IMP déshydrogénase ; GuaA, GMP synthétase ; HprT/HpT,
guanine/hypoxanthine phosphoribosyltransférase ; Gpt, guanine phosphoribosyltransférase ; PurF,
amidophosphoribosyl transferase.

En conclusion, il apparaît que la pinocembrine et la bavachine induisent la réponse stringente, alors

que le 2'-hydroxyflavone et le résokampférol ne l’induisent pas du tout, malgré le fait que les cinq

138
flavonoïdes altèrent fortement la respiration aérobie (cf. §III.4.2.4). Il est donc possible que la
pinocembrine et la bavachine agissent directement sur l’activité de RelA ou sur une des enzymes
impliquées dans la synthèse de GTP. Certaines drogues comme la relacin et d’autres analogues du
(p)ppGpp sont connus pour avoir des effets qui simulent la réponse stringente en agissant très
probablement sur une des activités pré-citées (Wexselblatt, Katzhendler et al. 2010, Wexselblatt,
Oppenheimer-Shaanan et al. 2012, Wexselblatt, Kaspy et al. 2013). Alternativement, il se pourrait que
la pinocembrine et la bavachine agissent au niveau de l’appareil de traduction en bloquant l’activité
des ribosomes. Ceci aurait pour conséquence de créer un déséquilibre entre la « demande » en
protéine et la capacité de synthèse des protéines, et résulterait en une induction de la réponse
stringente (Planson, Sauveplane et al. 2020). Dans les deux cas, certains flavonoïdes comme la
pinocembrine et la bavachine seraient des candidats prometteurs pour le développement d’agents
antibactériens efficaces.

III.4.2.8 Régulation globale de la réponse transcriptionnelle et de gènes codant des transporteurs

en présence de flavonoïdes

Dans la catégorie des transporteurs, 71 et 59 % des gènes sont régulés après 15 minutes
d'incubation en présence de bavachine et pinocembrine respectivement, contre 25 % en présence de
naringénine. Des transporteurs d'incorporation d'acides aminés (codés par artP-Q-R pour
l'incorporation de l'arginine, metN-P-Q pour l'incorporation de la méthionine, tcyA-B-C pour
l'incorporation de la cystine, yrbd-ytnA pour l'incorporation de l'alanine) voient leurs productions
diminuer après incubation avec les flavonoïdes. Certains transporteurs d'antibiotiques sont également
régulés. Le gène codant un transporteur à efflux bmrA est réprimé en présence de bavachine et
pinocembrine, de même que lnrM-N (impliqués dans la résistance à linearmycin et induit en présence
de linearmycin). Les gènes albC-D (export de la subtilosine) ne sont réprimés qu'après 60 minutes
d'incubation en présence de bavachine et naringénine. Les gènes bmrC-D codant un transporteur sont
réprimés par la naringénine après 60 minutes d'incubation.

De manière intéressante, l'expression du gène sunT codant pour le transporteur à efflux du

glycopeptide antimicrobien sublancine est induite en présence de 2’-hydroxyflavone et pinocembrine.
En présence de bavachine, pinocembrine et naringénine, une augmentation de production des
transporteurs pour l'import de peptides est observée via l'augmentation de l'expression des gènes
appB-C-D-F, dppB-C-D-E, oppA-B-C-D-F. L'expression des gènes bceA-B (impliquée dans la résistance à
la bacitracine) est augmentée en présence de naringénine et pinocembrine, et celles de psdA-B (export
de lantibiotiques) et yxdL-M (export de peptides toxiques) sont réprimées en présence de bavachine.

139
 Comparaison des analyses transcriptomiques ciblée et globale

Une comparaison entre les résultats obtenus lors de la caractérisation de l’activité promotrice
(culture « steady-state » en présence du flavonoïde) et l’étude transcriptomique (perturbation par
injection d’un flavonoïde d’une culture « steady-state » sans flavonoïde) pour les gènes d’intérêt
suivants : bmr, bmrA, bmrR, lmrA, lmrB, qdoI, qdoR, yhjC, ynfC, yvcD, yxdJ, yxeA et yybN a été effectuée
afin de comparer les deux approches.

Les données de transcriptomique obtenues pour ces gènes ont été résumées Table 26. Chaque
colonne correspond à la comparaison de l’expression du gène en présence d’un flavonoïde avec
l’expression du gène sans flavonoïde pour un même temps donné. Cette comparaison a été effectuée
à T1 = 15 minutes (orange) et à T2 = 60 minutes (vert). Les différences observées entre les profils de
régulation à T1 et T2 ont été mise en évidence (en bleu ; Table 26). Une induction des gènes bmr, bmrR
et yhjC et une répression des gènes bmrA, qdoR et yybN sont observées uniquement en présence de
la bavachine et de la pinocembrine à T1. Les gènes lmrA et lmrB sont induits à T1 par la bavachine, la
naringénine et le résokaempférol uniquement tandis qu’à T2, ces deux gènes sont aussi induits par la
pinocembrine. Le gène qdoI est régulé positivement par tous les flavonoïdes excepté la 2’-
hydroxyflavanone. En effet, la 2’-hydroxyflavanone induit uniquement l’expression du gène ynfC sur
les 13 gènes étudiés, qui est régulé positivement à T1 et T2. A noter que le gène ynfC est aussi
surexprimé en présence de bavachine, naringénine et pinocembrine. Les gènes yvcD et yxdJ sont
réprimés en présence de bavachine (yvcD, yxdJ), naringénine (yvcD, yxdJ), pinocembrine (yvcD), et
résokaempférol (yxdJ). Le gène yxeA n'est régulé que par la bavachine et une répression forte est
observée à T1.

Au vu des résultats obtenus pour l’étude transcriptomique, trois mécanismes d’action des
flavonoïdes ont été mis en évidence ici : i) un mécanisme d’action spécifique à la 2’-hydroxyflavanone
(profil de régulation différent des autres profils obtenus) ; ii) un mécanisme d’action commun à la
bavachine et à la pinocembrine et iii) un mécanisme d’action commun à la naringénine et le
résokaempférol.

Les résultats de l’étude transcriptomique ont ensuite été couplés avec ceux du crible en LCA (Table
27). Après analyse, nous avons observé qu’il y avait une concordance pour les gènes bmrA
(pinocembrine) et yybN (naringénine) spécifiquement avec le profil de régulation à T1, et pour les
gènes bmr (naringénine), lmrA (pinocembrine), lmrB (pinocembrine), qdoR (bavachine), yhjC
(bavachine), yxdJ (naringénine) et yxeA (bavachine) spécifiquement avec le profil de régulation obtenu
à T2. Le gène ynfC a un profil LCA identique pour trois des cinq flavonoïdes testés à celui des deux

140
profils à T1 et T2. De même que pour le gène bmrR pour lequel le profil LCA avec la 2’-hydroxyflavanone
ou la bavachine correspond aux résultats de transcriptomique. Concernant les gènes qdoI et yvcD,
seuls les profils LCA avec la naringénine sont en accord avec ceux de la transcriptomique à T1 et T2
(qdoI), et T2 (yvcD) respectivement. Environ 58 % des réponses mesurées en LCA sont communes à
celles observées en transcriptomique globale, sachant que de nouvelles réponses à la 2’-
hydroxyflavanone ont été mises en évidence avec le crible LCA.

Nous pouvons ainsi conclure que pour la majorité des gènes d’intérêts étudiés dans cette partie, la
régulation est liée à la séquence du promoteur cloné en amont de la sfgfp ; pour les autres gènes il est
donc probable que la régulation s’effectue en aval de la zone promotrice stricto senso, i.e. au niveau
de la séquence 5’UTR proche de la séquence codante du gène, ou alors liée à une dégradation ou
stabilisation spécifique de l’ARN en présence des flavonoïdes en question, ou encore à une réponse
dans l’expression génique différente entre une condition d’incubation (steady-state) ou de
perturbation (par injection de flavonoïdes).

141
Table 26 : Résultat transcriptomique des gènes d’intérêt.
Chaque expression de gène en présence de flavonoïdes a été rapportée à l’expression de gène sans flavonoïde (WT) obtenue pour les deux conditions à T1
(orange) et à T2 (vert). Plusieurs profils ont été obtenus suivant la régulation de l’expression des différents gènes : fortement induit (U), légérement induit
(uSmall), pas de régulation (-), fortement réprimé (D) et légèrement réprimé (dSmall). Les profils de régulation qui diffèrent significativement à T1 par rapport
aux profils de régulation obtenus à T2 pour un même gène ont été surlignés en bleu.

2’-Hydroxy- Bavachin _ Naringenin Pinocem- Resokaemp- 2’-Hydroxy- Bavachin _ Naringenin Pinocem- Resokaemp-
flavanone _ vs _ WT _ vs _ WT brin _ vs _ ferol _ vs _ flavanone _ vs _ WT _ vs _ WT brin _ vs _ ferol _ vs _
vs _ WT WT WT vs _ WT WT WT
bmr - U - uSmall - - U U U -
bmrA - D - D - - - - - -
bmrR - U - U - - U - U -
lmrA - U U - U - U U U -
lmrB - U U - U - U U U -
qdoI - U U U U - U U U U
qdoR - D - D - - - - D -
yhjC - U - U - - - - U -
ynfC U U U U - U U U U -
yvcD - D dSmall D - - - - - -
yxdJ - dSmall D - dSmall - dSmall - - -
yxeA - D - - - - - - - -
yybN - dSmall - D - - - dSmall D -

142
Table 27 : Comparaison des résultats de transcriptomique avec ceux du LCA.
Rappel des profils de régulation pour chaque gène à T1 et T2 (colonne 2 et 3). Rappel des résultats du LCA obtenus pour la 2’-hydroxyflavanone, la bavachine,
la naringénine, la pinocembrine et le résopkaempférol (colonne 4 à 8). La concordance des résultats du LCA a été représentée en bleu lorsque celui-ci est
similaire avec l’étude transcriptomique à T1, en bleu gris lorsque la concordance est correcte pour les deux temps et en gris clair à T2.

Transcriptomic LCA
Gene T1 T2 2'-Hydroxyflavanone Bavachin Naringenin Pinocembrin Resokaempferol
bmr -U-u- -UUU- - induction induction - N/A
bmrA -D-D- ----- - induction induction inhibition N/A
bmrR -U-U- -U-U- - induction induction inhibition N/A
lmrA -UU-U -UUU- induction induction induction induction N/A
lmrB -UU-U -UUU- induction induction induction induction N/A
qdoI -UUUU -UUUU induction - induction - N/A
qdoR -D-D- ---D- induction - - induction N/A
yhjC -U-U- ---U- - - - - N/A
ynfC UUUU- UUUU- induction induction - induction N/A
yvcD -DdD- ----- induction induction - induction N/A
yxdJ -dD-d -d--- - - - inhibition N/A
yxeA -D--- ----- - - - inhibition N/A
yybN -d-D- --dD- - induction - - N/A

concordance with transcriptomic profile at 15 minutes (T1)

concordance with both transcriptomic profiles
concordance with transcriptomic profile at 60 minutes (T2)

143
IV DISCUSSION

Les flavonoïdes : un enjeu pour les biotechnologies et la santé

Les flavonoïdes : des composés aux propriétés antimicrobiennes

Dans la grande famille des flavonoïdes, certains composés ont une activité antibactérienne dirigée
contre des bactéries à Gram positif (cf. § II.3.4.2). Au cours de ce travail, B. subtilis a été utilisé comme
bactérie modèle de bactérie à Gram positif. Les bactéries à Gram positif, en particulier au sein de la
division des Firmicutes, regroupent de nombreux pathogènes tels que des Clostridia (e.g. Clostridium
difficile), des Mollicutes (e.g. Mycoplasma sp.), et des Bacilli (e.g. B. cereus, B. anthracis, L.
monocytogenes, Streptococcus agalactiae ou encore S. aureus) responsables de nombreuses maladies
et/ou infections. Plusieurs pathogènes tels que S. aureus ou L. monocytogenes, sont sensibles à
certains flavonoïdes tels que la naringine, la naringénine et des esters de prunine (Céliz, Daz et al.
2011). L’utilisation des flavonoïdes en tant qu’agent antibactérien est par ailleurs très prometteuse
pour lutter contre les souches multi-résistantes qui restent un problème de santé public majeur.
Plusieurs flavonoïdes (chalcones, flavanones et flavones) ont en effet d'ores et déjà été identifiés pour
inhiber la croissance de MRSA (Alcaràz, Blanco et al. 2000).

Dans le cadre de ce travail, nous avons réalisé le crible d’une librairie de 63 flavonoïdes, et identifié
18 flavonoïdes actifs contre B. subtilis. Les toxicités de ces 18 flavonoïdes mesurées en milieu solide
envers B. subtilis se répartissent dans une gamme de MICs comprises entre 20 et 227 mg.L-1. Des tests
de toxicité en milieu liquide (LCA) en présence de B. subtilis ont aussi été réalisés avec 14 flavonoïdes
(parmi les 18 actifs), car la détermination de l’IC50 de la 7,8 dihydroxyflavone, la baicaléine , la fisétine
et la quercétine n'a pas été possible du fait de leur forte coloration intrinsèque. Les IC50 des 14
flavonoïdes (2’-hydroxyflavanone ; 3’,4’-dihydroxyflavone ; 4’-hydroxyflavanone ; 7-hydroxyflavanone
; bavachine ; datiscétine ; flavone ; homoeriodictyol ; isosakuranétine ; liquiritigénine ; naringénine ;
pinocembrine ; résokaempférol et sakuranétine) ont été déterminées et sont comprises entre 18 et
175 mg.L-1 (cf. Table 21). Il est à noter que les valeurs d'IC50 ont été déterminées par un "fit" (ou
ajustement) des courbes dose-réponse avec une équation de premier ordre et l'allure spécifique des
courbes dose-réponse pour chacun des 18 flavonoïdes n'a pas été déterminée. Nous estimons en effet
que la détermination des IC50 par un tel "fit" est correcte en nous basant sur les courbes dose-réponse
de la pinocembrine et de la naringénine que nous avons obtenues.

Parmi les 18 flavonoïdes antibactériens que nous avons identifiés, plusieurs d’entre eux possèdent
aussi une activité antifongique (Al Aboody and Mickymaray 2020). Par exemple, la pinocembrine

144
possède une activité antifongique contre P. italicum et C. albicans (MICC. albicans = 100 mg.L-1)
responsables de la maladie post-récolte des agrumes (moisissure bleue) et de la candidose (infection
fongique chez l’homme) respectivement (López, Ming et al. 2002, Peng, Yang et al. 2012). De même
que la sakuranétine possède une activité antifongique contre les phytopathogènes Cladosporium sp.,
Trichophyton rubrum et T. mentagrophytes (MICT. rubrum de 31,2 à 62,5 mg.L-1, MICT. mentagrophytes de 31,2
à 125 mg.L-1), responsable de phæohyphomycoses et de dermatophytoses respectivement (Danelutte,
Lago et al. 2003, Pacciaroni, de los Angeles Gette et al. 2008). D’autres possèdent une activité
antiparasitaire telle que la 2’-hydroxyflavanone contre Leishmania amazonensis responsable de la
leishmaniose, maladie chronique pouvant être de type viscérale ou tégumentaire (Gervazoni,
Gonçalves-Ozório et al. 2018).

Identification de nouveaux flavonoïdes aux propriétés antibactériennes

Il est intéressant de noter que l'activité inhibitrice des flavonoïdes testés dans ce travail vis-à-vis de
B. subtilis est effectrice à des concentrations comparables à celles des antibiotiques utilisés en routine
en laboratoire de recherche (par exemple en fonction des sous-espèces, les MICs de la kanamycine,
du chloramphénicol, de l’érythromycine ou de la tétracycline sont respectivement de 0,5 à 6 mg.L-1, 3
à 10 mg.L-1, 2 à 10 mg.L-1, et de 4 à 10 mg.L-1 (Tochikubo, Hayakawa et al. 1981, Lin, Connelly et al.
2005, Wu, Wang et al. 2011, Adimpong, Sørensen et al. 2012)).

La diversité des structures des 18 flavonoïdes antimicrobiens (cf. Annexe 3 VII.3) indique que la
nature et la position de chaque groupement sur les cycles A, B et C jouent un rôle déterminant dans
l’activité. Parmi ces 18 flavonoïdes actifs contre B. subtilis, quatre flavonoïdes (datiscétine, fisétine,
quercétine et résokaempférol) appartiennent à la classe des flavonols, quatre flavonoïdes (3’,4-
dihydroxyflavone, 7,8-dihydroxyflavone, baicaléine et flavone) appartiennent à la classe des flavones
et dix autres flavonoïdes (2’-hydroxyflavanone, 4’-hydroxyflavanone, 7-hydroxyflavanone, bavachine,
homoeriodictyol, isosakuranétine, liquiritigénine, naringénine, pinocembrine et sakuranétine)
appartiennent à la classe des flavanones. On observe que la 2’-hydroxyflavanone (MIC = 129 µM ;
IC50 = 261 µM ; Table 13) a une activité antibactérienne plus forte que la 4’-hydroxyflavanone
(MIC = 387 µM ; IC50 = 518 µM) et légèrement plus élevée que la 7-hydroxyflavanone (MIC = 404 µM ;
IC50 = 280 µM), suggérant l’importance du groupe hydroxyle en position C-2’. Parmi les 18 composés
actifs, 7 composés possèdent des groupes hydroxyles en position C-7 et C-4’ (e.g. liquiritigénine,
résokaempférol), suggérant l’importance de ces positions pour l’activité antibactérienne. D’autres
positions de groupements hydroxyles semblent également importantes pour renforcer l’activité. C'est
le cas de l'hydroxyle en position C-3 du résokaempférol (MIC = 74 µM ; IC50 = 67 µM) qui permet
d’augmenter considérablement l’activité antibactérienne dirigée contre B. subtilis par comparaison

145
avec la liquiritigénine (MIC = 886 µM ; IC50 = 677 µM). De même, le groupement 3-méthyl-2-butényle
en position C-6 du cycle A de la bavachine (MIC = 80 µM ; IC50 = 56 µM) semble améliorer l'activité
antibactérienne par comparaison avec la liquiritigénine. Il est tout à fait envisageable que ce
groupement facilite par exemple le transport à travers la membrane, améliorant ainsi l'action du
flavonoïde sur la bactérie.

Une modélisation QSAR a par conséquent été effectuée dans le but de corréler la ou les structure(s)
chimique(s) à l’activité antibactérienne des flavonoïdes contre B. subtilis et de prédire par la suite la
toxicité de nouveaux flavonoïdes en se basant sur des bibliothèques de molécules (e.g. PubChem). La
construction du modèle d’apprentissage nous a permis d’obtenir des régressions linéaires correctes
en utilisant différents jeux de données pour les 18 flavonoïdes actifs contre B. subtilis (e.g. MIC, IC50,
structure). Pourtant, la validation du modèle via la méthode de validation croisée a échoué car le
modèle ne permettait pas la prédiction correcte d'IC50 d'un flavonoïde sur un jeu d’apprentissage des
17 autres flavonoïdes (validation par "leave-one-out"). L'impossibilité de la validation du modèle
pourrait être due au fait que les 18 flavonoïdes présentent plusieurs mécanismes d’action distincts, ce
qui sous-échantillonne le jeu d’apprentissage. Pour pallier à ce problème de diversité des modes
d’action, et en posant l’hypothèse qu’il existerait de 5 à 10 classes de mécanismes moléculaires
différents contribuant à la toxicité des flavonoïdes sur B. subtilis (cf. §II.3.4.2), il faudrait augmenter la
taille du jeu d’apprentissage de 18 flavonoïdes à environ une cinquantaine. L’exploitation du pouvoir
de prédiction du QSAR, et également la caractérisation des éléments structuraux des flavonoïdes
contribuant à leur toxicité, passeront forcément par une première expérience de crible d’une centaine
de flavonoïdes supplémentaires pour extraire un nombre suffisant de nouveaux composés actifs. A
l’issu de ce crible, nous serions alors en capacité de prédire la structure de flavonoïdes potentiellement
plus actifs envers B. subtilis.

Production de nouveaux flavonoïdes aux propriétés antibactériennes

Fort de ces prédictions, trois possibilités s’offrent aux industries du secteur de la Santé, la première
repose sur (1) l’extraction des composés actifs à partir des producteurs naturels, à savoir les plantes,
(2) une synthèse chimique des composés actifs prédits par le QSAR, ou (3) la production des composés
actifs chez des hôtes hétérologues par des approches de biologie de synthèse à condition que la voie
de biosynthèse soit connue. La stratégie (1) peut être difficile à mettre en place suivant l’hôte naturel
de production et son coût est relativement élevé. La stratégie (2) à l’inverse est moins coûteuse mais
souvent compliquée à mettre en œuvre pour obtenir la molécule d’intérêt isolée de ses isomères qui
sont souvent toxiques chez l’homme. Enfin la stratégie (3), l'ingénierie métabolique pour la

146
biosynthèse de produits naturels est une alternative à l'extraction et à la synthèse chimique qui est
souvent envisagée dans le cadre de molécule à forte valeur ajoutée.

Plusieurs travaux d’ingénierie métabolique pour la production de flavonoïdes ont été publiés,
l'objectif étant de produire en grande quantité ces composés à forte valeur ajoutée. Les voies de
biosynthèse de flavonoïdes ont été intégrées et optimisées dans des souches châssis (ou usines
cellulaires) telles qu’E. coli ou S. cerevisiae, elles-mêmes optimisées pour la production des précurseurs
des flavonoïdes (Stahlhut, Siedler et al. 2015, Rodriguez, Strucko et al. 2017, Levisson, Patinios et al.
2018). Dans le cadre du projet ANR MEM, nous avons construit une souche productrice d’E. coli pour
la production de naringénine, ce composé étant un précurseur de nombreux flavonoïdes (cf.II.3.2). J’ai
contribué à la conception de cette souche châssis d’E. coli (cf. Annexe 1 VII.1), et ce travail aboutira à
une publication que je cosignerai courant 2021.

Les flavonoïdes : des composés aux propriétés multiples chez l’homme

L'intérêt thérapeutique des flavonoïdes étant établi, afin de prévoir d'éventuels effets cytotoxiques
chez les mammifères et notamment chez l’homme, certaines études ont analysé l'effet de l’exposition
aux flavonoïdes et de la consommation de flavonoïdes par voie alimentaire (i.e. en tant que
médicaments ou compléments alimentaires) (Calderon-Montano, Burgos-Moron et al. 2011, Andres,
Pevny et al. 2018). A ce jour, l'éventuelle cytotoxicité des flavonoïdes et les interactions potentielles
avec d’autres médicaments ou nutriments nécessitent d'être évaluées en détail notamment lorsque
les flavonoïdes sont utilisés en grande quantité. En effet, un même flavonoïde peut avoir plusieurs
activités. Par exemple, nous avons démontré que la fisétine, la naringénine et la quercétine possèdent
une activité antibactérienne tandis que de précédentes études ont caractérisé leurs propriétés
antioxydantes, chémopréventives et anticancérigènes (Nijveldt, van Nood et al. 2001, Palumbi 2001).
A noter que l’activité des flavonoïdes dans le traitement du cancer est souvent liée à leur activité
antioxydante permettant la réduction et le piégeage des espèces réactives de l’oxygène (ROS) telles
que les radicaux libres. Les flavonoïdes (e.g. quercétine, rutine) possédant une activité antioxydante
peuvent aussi avoir une activité pro-oxydante (e.g. en fonction des conditions de pH), pouvant de ce
fait entraîner une potentielle cytotoxicité (Decker 1997). Un autre effet qui pourrait entraîner une
cytotoxicité est l’interaction des flavonoïdes avec d’autres médicaments. Il a en effet été démontré
que la naringénine et ses dérivés glycosidiques, présents en grande quantité dans le jus de
pamplemousse (concentration variant de 100 à 800 mg.L-1), inhibent l’enzyme intestinal CYP3A4 du
cytochrome P450 (CYP). La prise concomitante de jus de pamplemousse avec un médicament tel que
la félodipine, un inhibiteur calcique, entraîne une augmentation de 2 à 3 fois l'effet dose de félodipine
pouvant ainsi induire un risque de toxicité (Fuhr 1998). La naringénine peut également avoir des effets

147
létaux et tératogènes, comme l’a montré l’étude de (Pérez-Coll and Herkovits 2004) sur des embryons
d’amphibien, un modèle utilisé pour sa sensibilité aux stress physico-chimiques.

Des embryons d’amphibien exposés à des doses de 10 mg.L-1 de naringénine présentent des
malformations dans 100 % des cas et ont une mortalité de 30 %. Cette étude met en évidence un
potentiel effet embryotoxique de la naringénine à des concentrations supérieures à 5 mg.L-1 (Pérez-
Coll and Herkovits 2004). Une autre étude a démontré que la puérine, un isoflavone, pouvait avoir un
effet indésirable au stade blastocystes sur des embryons de souris in vitro et sur le développement
embryonnaire in vivo (après implantation) (Chen and Chan 2009). Ils ont observé qu’un traitement à
la puérine (2,5 - 10 µM) induit l’apoptose chez les blastocystes de souris. Cependant, d’autres études
ont montré que la puérine pouvait induire ou prévenir l’apoptose des cellules HT-29 du cancer du côlon
ou des cellules du cancer du sein grâce à son activité chémopréventive (Yu and Li 2006, Lin, Hou et al.
2009), suggérant ainsi que l’effet de la puérine sur les cellules dépend des conditions expérimentales
et du type de cellules utilisées (Chen and Chan 2009). Ces quelques travaux, étudiant la cytotoxicité
potentielle de certains flavonoïdes, mettent en évidence l’importance d’effectuer i) des études
supplémentaires afin d’examiner l’effet des flavonoïdes sur le métabolisme et l’embryogenèse
humaine, ii) des essais cliniques permettant déterminer les précautions et les conditions d’emploi de
ces composés. Ainsi, de nombreux essais cliniques ont comme objet d’étude des flavonoïdes
consommés en tant que complément alimentaire (i.e. antioxydant) ou injecté par voie intraveineuse
en tant qu’anticancéreux (https://clinicaltrials.gov/, plus de 200 études à ce jour). C’est le cas de la
quercétine qui a fait l’objet d’un essai clinique pour son activité antitumorale et a passé avec succès la
phase I (Ferry, Smith et al. 1996). Malgré des études montrant un vif intérêt pour l’activité
antibactérienne des flavonoïdes notamment dans la lutte contre des souches multi-résistantes, aucune
étude clinique ne référence à ce jour un flavonoïde en tant qu’antibiotique seul ou en combinaison
avec des antibiotiques classiques. Pourtant, la baicaléine pourrait par exemple être un bon candidat
potentiel pour un essai clinique (pour rappel nous avons estimé dans ce travail la MIC à 91 mg.L-1). En
effet, une précédente étude a montré que la baicaléine et son glucoside (la baicaline), restaure
l’activité de la céfazoline (céphalosporine de 1ère génération) contre des souches MRSA (Qiu, Meng et
al. 2016).

De par la diversité des modes d'action antibactériens proposés pour les flavonoïdes, des études
approfondies de leurs mécanismes d’action, de leur cytotoxicité et des potentielles interactions
médicamenteuses, associées à des essais cliniques, sont indispensables préalablement à leur
utilisation future.

148
 Mécanisme d’action des flavonoïdes en tant qu’antibactériens

Mécanisme d’action potentiel via le régulon LmrA/QdoR

Nous avons réalisé le crible d’une librairie de 67 mutants de B. subtilis en réalisant des tests de
toxicité (par LCA) en présence de flavonoïdes. L'analyse des courbes dose-réponse de B. subtilis en
présence de flavonoïdes a permis d'identifier des gènes ayant un rôle direct ou indirect dans les
mécanismes de résistance ou à l'inverse dans les mécanismes responsables de la sensibilité de B.
subtilis vis-à-vis des flavonoïdes. Une liste de huit mutants (bmrB, bmrR, lmrA, qdoI, ycnB, yfiS, yfmP et
yvcD) affectés dans la réponse aux flavonoïdes a été établie. La délétion du gène codant le régulateur
LmrA (répresseur des opérons lmrA lmrB et qdoI yxaH) induit une augmentation de la sensibilité de B.
subtilis en présence de naringénine ou de pinocembrine. Ce résultat concorde avec notre observation
qu'en présence de pinocembrine, la surexpression de lmrB induit une augmentation de la sensibilité
de B. subtilis envers ce flavonoïde (Hirooka 2014). La délétion du gène yxaH codant un transporteur
potentiel induit une faible augmentation de la résistance envers la pinocembrine (à 40 mg.L-1), tandis
que la surexpression d’yxaH n'induit pas d'effet ou une très faible sensibilité de B. subtilis envers la
pinocembrine (de 10 à 50 mg.L-1). Enfin, la délétion du gène qdoI induit également une plus grande
résistance de B. subtilis envers les flavonoïdes (naringénine et pinocembrine). Il est de ce fait tout à
fait envisageable que la surexpression de qdoI (non testée) pourrait induire une plus grande sensibilité
de B. subtilis vis-à-vis de la pinocembrine.

Les données de transcriptomique globale indiquent de manière inattendue une surexpression des
opérons lmrA lmrB et qdoI yxaH en présence de naringénine à T1 – 15 minutes – et T2 – 60 minutes –
ou pinocembrine à T2. Cette observation est confirmée par les transcriptomiques ciblée et globale
pour l’ensemble des 18 flavonoïdes que nous avons testés (à l’exception de la sakuranetin). Bien que
le gène qdoI soit impliqué dans le mécanisme de détoxification des flavonols tel que la quercétine chez
d’autres espèces (e.g. Rhizobia sp.) (Rao and Cooper 1994), il a été démontré que parmi les flavonols
testés (Figure 53A), les produits de dégradation de la quercétine et de la tamarixétine, sont toxiques
pour B. subtilis, entraînant une diminution de la viabilité des cellules (e.g. forte diminution de la
viabilité des cellules de B. subtilis ΔlmrA ΔqdoR en présence de quercétine) (Hirooka and Fujita 2010).
Ces composés sont notamment décyclisés sur le cycle C par la quercétine 2,3-dioxygénase QdoI. Ils en
résultent deux produits de dégradation : l’acide phloroglucinique et l’acide protocatéchique, ce
dernier est proposé comme étant le composé toxique de la dégradation. Comme illustré sur la Figure
53, la pinocembrine ne possède pas la même structure du squelette carboné et il est peu probable
qu’une réaction du même type que celle opérant sur la quercétine puisse avoir lieu pour la
pinocembrine. Ceci suggère donc que le produit de la dégradation (inconnue) de la pinocembrine par

149
QdoI s’avère aussi toxique pour B. subtilis et qu’YxaH n’est probablement pas capable de le prendre
en charge pour le rejeter à l’extérieur de la cellule. Si tel était le cas, alors l’ajout de pinocembrine dans
le milieu simulerait en réalité une addition de deux flavonoïdes actifs contre B. subtilis, la pinocembrine
plus son dérivé. Ainsi l’effet positif de la délétion de qdoI s’expliquerait par le fait que le(s) produit(s)
de dégradation présumé(s) n’est plus présent dans la cellule. Ceci semble cohérent avec un effet très
légèrement positif de la délétion du gène qdoI en présence de naringénine également, sachant que la
naringénine possède la même structure du squelette carboné que la pinocembrine (Figure 53B).

Figure 53 : Comparaison des structures des flavonols et des flavanones.

(A) Structure des molécules flavonols reconnue par QdoI (quercétine 2,3-dioxygénase). Est indiqué en
rose le site de clivage de QdoI ; en noir, le squelette carboné commun à la quercétine, la fisétine, la
tamarixétine et la galangine. Le groupe hydroxyle (-OH en orange) (position en C-5) est présent sur la
galangine, la quercétine et la tamarixétine ; le groupe –OH en vert (position en C-3’) est présent sur la
fisétine, la quercétine et la tamarixétine ; le résidu -R1 en bleu (position en C-4’) peut être soit un
groupe -OH présent sur la fisétine et la quercétine, soit un groupe méthyle (–OCH3) présent sur la
tamarixétine. (B) Structure des molécules flavanones testés en présence de la souche ΔqdoI. Est
indiqué en noir le squelette carboné commun à la naringénine et la pinocembrine. Le groupe –OH en
bleu (position C-4’) est présent sur la naringénine.

Les résultats obtenus (Table 28) suggèrent donc une possible dégradation de la pinocembrine par
la quercétine 2,3-dioxygénase (QdoI) par une réaction inconnue à ce jour. La surexpression du gène
qdoI devrait être effectuée pour confirmer l’effet prédit d’une hausse de toxicité de la pinocembrine.
La souche ΔqdoI, devrait aussi être testée en présence des 18 flavonoïdes actifs afin de tester si les
produits de dégradation des flavonoïdes cités sur la Figure 53A induisent également une toxicité chez
B. subtilis. Pour les flavonoïdes pour lesquels la souche ΔqdoI ne montrerait pas une résistance accrue,
une étude comparative devrait être menée avec les mutants yxaH et lmrB (codant également une
pompe d’efflux) pour potentiellement mettre en évidence un composé de dégradation capable d’être
exporté par YxaH ou LmrB. Une étude in vitro de l’activité de QdoI sur les flavonoïdes sélectionnés
pourrait ensuite être réalisée afin d’identifier les produits de dégradation par spectrométrie de masse.

150
Table 28 : Récapitulatif des modes d’action potentiels des cinq flavonoïdes principaux testés dans ce travail

Mode of action 2’-Hydroxyflavanone Bavachin Naringenin Pinocembrin Resokaempferol

Nucleic acid synthesis inhibition
topA, coding for a DNA topoisomerase I X
gyrA, coding for the subunit A of the DNA gyrase X
LmrA/QdoR regulon
lmrA, coding for a transcriptional regulator X
qdoI, coding for a quercetin 2,3-dioxygenase X
Membrane synthesis inhibition
fabG and/or fabI coding for reductases X X X
fabF, coding for a β-ketoacyl-ACP synthase II X X X
fabHA and/or fabHB, coding for two β-ketoacyl-ACP
X X
synthase III
Reduction of the fluidity of the membrane
W, coding for a RNA polymerase ECF-type sigma factor
X X X
SigW
Cell wall inhibition
murA and/ or murCDE coding for synthases X X X
glmUS, coding for an acetyltransferase and a tranaminase X
Folate synthesis inhibition
folC, coding for a folyl- polyglutamate synthetase X X
Energy metabolism inhibition (respiration)
ldH, coding for a L-lactate dehydrogenase (as example) X X X X X
Stringent response
RelA regulon (as example) X X
Multidrug efflux transporters
albCD, coding for an ABC transporter (as example) X X
sunT, coding for an ABC transporter (as an example) X X

151
 Mécanismes d’action liés à la dérégulation des transports d’efflux multidrogues

Il est vraisemblable qu’un transporteur d’efflux pourrait être impliqué dans un des mécanismes de
résistance aux flavonoïdes chez B. subtilis. L'activité de promoteurs de gènes codant des transporteurs
et/ou leurs régulateurs associés a été déterminée en présence des 17 flavonoïdes actifs envers B.
subtilis. Les promoteurs des opérons lmrA lmrB, qdoI yxaH, bmrA yvcD, bmr bmrR sont régulés par au
moins 4 flavonoïdes parmi les 17 testés, et régulés par jusqu'à 10 flavonoïdes dans le cas de l'opéron
lmrA lmrB, à noter que l'activité des promoteurs n'a pas pu être analysée pour 6 flavonoïdes (du fait
de leur coloration intrinsèque, cf. Table 20). La régulation des opérons lmrA lmrB et qdoI yxaH semble
être commune aux différents flavonoïdes. L'expression du gène ynfC (non caractérisé) est également
induite par plusieurs flavonoïdes (au moins 7 flavonoïdes). Nous avons observé une bonne
concordance entre les résultats obtenus par la transcriptomique ciblée et la transcriptomique globale.
Ces résultats ne nous permettent cependant pas de poser des hypothèses concernant l'implication des
groupements chimiques (groupements hydroxyles) dans les mécanismes de régulation, du fait
qu'aucun flavonoïde ne possède de profils de régulation spécifiques. Une étude à plus grande échelle
avec une gamme plus large de flavonoïdes, et donc une plus grande diversité structurale, pourrait
permettre d'identifier les groupements chimiques indispensables à l’activité antibactérienne et
importants pour l'induction de la réponse transcriptionnelle chez B. subtilis. A ce stade, à travers nos
analyses de la réponse transcriptionnelle de B. subtilis, nous pouvons émettre l’hypothèse qu’il existe
a minima trois mécanismes d’action différents. Nous supposons que la 2’-hydroxyflavanone possède
un mécanisme différent des autres flavonoïdes qui impliquerait le groupe hydroxyle en position C-2’,
qu’il existe un mécanisme commun entre la bavachine et la pinocembrine et entre la naringénine et le
résokaempférol (en plus de leur mécanisme propre), du fait de leurs profils de régulation des gènes.

Enfin, les analyses transcriptomiques ont permis d’identifier d’autres transporteurs de type ABC
dérégulés en présence de flavonoïdes (Table 28). Ainsi, la bavachine régule spécifiquement les gènes
psdAB (codant les transporteurs ABC exportant des lantibiotiques) et yxdLM (codant les transporteurs
ABC exportant des peptides toxiques) et régule en commun, par exemple, avec la pinocembrine les
gènes lnrMN (codant les transporteurs ABC présumés impliqués dans l’export de la lineamycine) ou
avec la naringénine les gènes albCD (codant les transporteurs ABC impliqués dans l’export de la
subtilosine). La naringénine réprime des gènes spécifiquement tels que les gènes bmrCD (à T2 = 60
minutes). Le transporteur ABC sunT exportant le glycopeptide sublancine est surexprimé en présence
de deux flavonoïdes, la 2’-hydroxyflavanone et la pinocembrine.

Les régulations des gènes codant les transporteurs et leurs régulateurs associés chez B. subtilis en
présence de flavonoïdes sont très peu documentées et leur caractérisation est pourtant nécessaire à

152
la compréhension des mécanismes d'action et de résistance des flavonoïdes. Une étude comparative
structurale des flavonoïdes permettrait d'identifier les déterminants structuraux importants dans les
mécanismes de résistance et dans l'interaction avec des cibles cellulaires.

Mécanismes d’action liés aux dérégulations cellulaires et métaboliques

Au vu de la diversité structurale des flavonoïdes, plusieurs études ont émis différentes hypothèses
concernant les mécanismes d’action possibles des flavonoïdes. A ce jour, les cibles des flavonoïdes
impliquées dans les différents mécanismes d’action de l’activité antibactérienne restent encore peu
connues. Une étude transcriptomique en présence de cinq flavonoïdes différents, sélectionnés pour
leurs propriétés antibactériennes et leurs structures chimiques significativement distinctes, a été
effectuée pour identifier des cibles cellulaires/moléculaires responsables de l’activité antibactérienne
des flavonoïdes. En premier lieu, nous avons cherché si la 2’-hydroxyflavanone, la bavachine, la
naringénine, la pinocembrine et le résokaempférol intervenaient dans les mécanismes antibactériens
décrits dans la littérature.

Comme nous l'avons vu précédemment, nous avons observé que les flavonoïdes peuvent avoir un
mécanisme d’action qui leur est propre mais aussi un mécanisme en commun avec un ou plusieurs
flavonoïdes (e.g. la bavachine et la pinocembrine possèdent à priori plusieurs mécanismes d’action en
commun). La bavachine et la pinocembrine induisent la répression de plusieurs gènes impliqués dans
la voie de biosynthèse du peptidoglycane notamment les gènes codant pour les synthétases MurACDE
(Table 28). A noter que la naringénine réprime aussi le gène murA, et les gènes glmUS, codant pour
une acetyltransférase et une transaminase. La bavachine, la naringénine et la pinocembrine régulant
in fine la même cible moléculaire (murA), on peut alors imaginer qu’il existe un mécanisme commun à
la bavachine et la pinocembrine, et dans une moindre mesure à la naringénine, agissant sur la synthèse
de la paroi cellulaire.

La bavachine et la pinocembrine interviennent au niveau de la synthèse membranaire en réprimant

l’expression des gènes fabG (codant la β-ketoacyl-ACP réductase) et fabI (codant la trans-2-enoyl-ACP
réductase), fabF (codant la β-ketoacyl-ACP synthétase II), fabHA (et fabHB uniquement réprimé par la
pinocembrine) codant la β-ketoacyl-ACP synthétase III, ainsi que le gène fabD (codant la malonyl CoA-
ACP transacylase). La naringénine, quant à elle, réprime les gènes fabF et fabG. Sachant que ces gènes
codent pour des enzymes catalysant des réactions de la voie de biosynthèse des acides gras, on peut
s’attendre à ce que la répression de ces gènes affecte la biosynthèse de la membrane. A ce jour, aucune
étude ne référence l’inhibition de l’expression de ces gènes par les flavonoïdes. Seuls des travaux
étudiant l’interaction des flavonoïdes avec les protéines catalysant la voie de biosynthèse des acides

153
gras sont référencés (Heath and Rock 1995, Zhang, Wu et al. 2003, Zhang and Rock 2004). Plusieurs
mécanismes possiblement communs de la bavachine, pinocembrine et naringénine conduisent à des
régulations reliées au W et M requis pour l’adaptation de la membrane aux agents antibactériens
(Turner and Helmann 2000) (Table 28).

Les cinq flavonoïdes, 2’-hydroxyflavanone, bavachine, naringénine, pinocembrine et

résokaempférol, induisent une réponse du métabolisme énergétique de B. subtilis. La réponse
transcriptionnelle de B. subtilis suggère que la respiration en anaérobie ou microaérobie (faible coût
énergétique) a été favorisée par rapport à une respiration en aérobie (Table 28). En effet, la
surexpression de gènes tels que ldh ou cydA a lieu typiquement en condition de culture anaérobique.
Ces résultats sont à relier avec l'observation de l'induction de gènes (nasDEF, hmp) impliqués dans la
respiration au nitrate, et indiquent une problable dérégulation du rapport [NADH+H+]/[NAD+] (cf.
§III.4.2.4). Il est possible d'imaginer que les flavonoïdes de manière générale inhibent des étapes de la
respiration, puisqu'il a été précédemment démontré que les licochalcones A et C inhibent une étape
située entre le CoQ et le cytochrome C de la chaîne respiratoire (cf. §II.3.4.2).

Le métabolisme est fortement dérégulé, comme illustré par le fait que les régulateurs majeurs de
B. subtilis sont affectés tels CodY et CcpA. Environ 50 % des gènes appartenant aux régulons de CodY
et CcpA sont déréprimés après 15 minutes d’incubation en présence de bavachine et pinocembrine
(seulement 20 % de ces régulons sont déréprimés en présence de naringénine). L’étude
transcriptomique a aussi mis en évidence des régulations plus globales du métabolisme telles que
l’induction de la réponse stringente qui conduit à l’accumulation de (p)ppGpp en présence de
flavonoïdes. La réponse stringente est notamment induite par la bavachine et la pinocembrine qui
répriment 87% des gènes appartenant au régulon. Par ailleurs, l'augmentation de l'expression génique
de 50 % des gènes appartenant au régulon du régulateur transcriptionnel Spx indique aussi la présence
d'un stress oxydatif (surexpression des gènes trxA-B codant la thioredoxin et thioredoxin reductase,
bshB2 impliqué dans la biosynthèse du bacillithiol ; thiol à faible masse moléculaire, cysK impliqué dans
la biosynthèse de la cystéine importante pour son rôle d'anti-oxydant chez B. subtilis). De manière
générale, l’étude transcriptomique chez B. subtilis en présence des cinq flavonoïdes a permis
d’identifier de potentielles cibles cellulaires et métaboliques. De par leur toxicité à faible dose et les
dérégulations induites, la bavachine et la pinocembrine semblent par exemple être des candidats
prometteurs en tant qu’agents antibactériens et des études plus approfondies pourront le confirmer.

154
 Mécanisme de résistance potentiel

Dans le but d’élucider le(s) mécanismes de résistance aux flavonoïdes, nous avons réalisé une
évolution dirigée de B. subtilis pour obtenir un résistant naturel. Afin d’éviter la formation de biofilms
qui auraient limitée l’apparition de variants génétiques, nous avons opté pour l’utilisation d’une
souche châssis du laboratoire, dérivée de la 168 trp+ (i.e. BSB1), dénotée CS1 Δeps::ble. Préalablement
à l’évolution dirigée en présence de naringénine, nous avons testé sa sensibilité à la naringénine via
un test de toxicité et nous avons ainsi déterminé l’IC50 (IC50 = 103,5 mg.L-1 pour la souche CS1
Δeps::ble). Nous avons remarqué que la souche Δeps::ble est plus résistante que la souche BSB1
(IC50 = 81 mg.L-1). Ceci est probablement dû à un gène délété au sein de la souche CS1 Δeps::ble qui
favorise une légère résistance à la naringénine comparé à la souche BSB1.

Concernant l’évolution adaptative en laboratoire, la naringénine a été choisie en croisant deux

critères qui sont censés faciliter l’évolution dirigée (et qui sont certainement liés dans notre cas) : i)
elle est un des flavonoïdes les moins actifs parmi l’ensemble des composés actifs, et ii) elle possède a
priori le moins de cibles d’après notre analyse transcriptomique parmi les cinq flavonoïdes testés. Ces
critères devraient permettre de faciliter la sélection de variants génétiques présentant une résistance
accrue avec un nombre réduit de mutations par rapport à la souche sauvage. La concentration en
naringénine a été augmentée de manière séquentielle au cours des 470 générations. Une culture en
présence de concentrations supérieures à la MIC a été obtenue, indiquant l’émergence d’un potentiel
résistant au sein de la population. Un crible sur clones isolés a été effectué à partir des prélèvements
P1 (180 mg.L-1 de naringénine), P2 (200 mg.L-1 de naringénine) et P3 (240 mg.L-1 de naringénine). Les
clones issus des prélèvements P1, P2 et P3 présentent une augmentation du taux de croissance de 15
à 30% par rapport à la souche parentale en présence de naringénine 90 mg.L-1 . A partir du séquençage
de 6 clones (2 clones par prélèvement), nous avons identifié 9 à 15 mutations par clone liées à une
potentielle résistance à la naringénine. A titre d’exemple pour le clone CJ99_17, une mutation non-
sens dans le gène quasi-essentiel topA a été identifiée. Les données transcriptomiques montrent
également que le gène topA n’est régulé (négativement) que par la naringénine parmi les cinq
flavonoïdes testés. Ceci suggère que la répression du gène codant la topoisomérase TopA est un effet
direct de la naringénine. De manière intéressante, nous avions également observé que la bavachine
est le seul flavonoïde qui induit la répression du gène gyrA, codant pour la sous-unité A (GyrA) de l’ADN
gyrase impliquée dans la stabilisation des nœuds positifs et le clivage de l’ADN lors de la réplication.
Ces résultats suggèrent que le métabolisme de l’ADN (réplication et/ou structure) constitue une cible
générique des flavonoïdes, comme observé pour la naringénine et la bavachine (Table 28).

155
 Il est également intéressant de noter que le nombre de mutations obtenues après l’évolution (entre
9 et 15) est plus élevé que ce à quoi nous nous attendions au vu du taux de mutation naturel de B.
subtilis, autour de 10-9 - 10-10 mutations par nucléotide et par génération. Avec un taux de mutation
équivalent et malgré une forte sélection au cours de la culture continue, nous aurions dû observer de
l’ordre de 1 à 2 mutations par clones. Au-delà des mutations que nous avons identifiées, il est donc
évident que le stress induit par la présence de naringénine dans le milieu a augmenté d’au moins un
facteur 10 le taux de mutation, ce qui nous a permis d’obtenir aisément des clones plus résistants.

Enfin, des mutations ponctuelles ont été observées sur le gène sufC, un transporteur ABC (ATP-
binding protein) essentiel à B. subtilis et impliqué dans le métabolisme du fer, et sur le gène yceF, une
protéine de stress impliquée dans la résistance au manganèse au niveau de la membrane. Cependant,
il est important de noter que nos données indiquent également que ces deux gènes ne sont pas
dérégulés en présence de naringénine. Une analyse de la chronologie d’apparition des mutations au
cours de l’évolution en présence de naringénine devrait être effectuée pour mieux comprendre
l’importance de chaque variant dans l’évolution adaptative. Egalement, les variants sélectionnés
devraient être transférés dans une souche B. subtilis avec un fond génétiquement pur ("backcross")
afin de valider leurs effets positifs sur la résistance à la naringénine. Il serait également intéressant de
combiner les mutations obtenues par évolution adaptative avec les délétions de gènes responsables
d'une résistance accrue de B. subtilis vis-à-vis des flavonoïdes identifiés au cours des cribles de mutants
(cf. §III.3.1). L'obtention de souches B. subtilis super-résistantes aux flavonoïdes pourrait permettre de
décrypter les mécanimes de résistance aux flavonoïdes, mais également la construction de souches
châssis pour la production de flavonoïdes par ingénierie métabolique.

156
V MATERIELS ET METHODES

Souches et milieux de culture

Les souches bactériennes utilisées au cours de ce travail sont listées en Table 29. Les souches E. coli
DH5α, Top10, XL1 et TG1 ont été utilisées pour les clonages et les amplifications de plasmides. La
souche E. coli BL21(DE3) a été utilisée comme modèle de bactérie à Gram négatif dans les tests de
toxicité des flavonoïdes. La souche E. coli MG1655 a été utilisée comme souche châssis pour la
production de flavonoïdes. Les souches B. subtilis 168 et ses dérivées (CS1 ∆eps, 168 trpC2, BSB1,
souches BKK et BKE) ont été utilisées dans les tests de toxicité des flavonoïdes et dans l’expérience
d’évolution en continu en laboratoire.

Table 29 : Liste des souches utilisées au cours de cette étude.

Strain Characteristics Source

Bacillus subtilis BSB1
B. subtilis CS1 Δeps
B. subtilis 168 trpC2
B. subtilis BKE 02670
B. subtilis BKE 02680
B. subtilis BKK 02960
B. subtilis BKK 02970
B. subtilis BKK 03070
B. subtilis BKK 03840
B. subtilis BKK 03850
B. subtilis BKK 05460
B. subtilis BKK 05610
B. subtilis BKK 07160
B. subtilis BKE 07220
B. subtilis BKE 07230
B. subtilis BKK 07370
B. subtilis BKK 07380
B. subtilis BKK 07390
B. subtilis BKK 07400
B. subtilis BKK 07420
B. subtilis BKK 07450
B. subtilis BKK 07460
B. subtilis BKK 07860
trp+ SyBER lab
ΔφP1 (from alkA to skfH); Δ(from srfAB to sfpY)
ΔφP2(from ydcL to yddM); ΔφP3(from ydzT to y
djC) ; ΔφPBSX(from yjoA to xlyA); Δ(from flgC t
o ylxH) ; ΔφSPb(from yotN to yokA); Δ(sigF,spoI
IAA,spoIIAB) ; ΔφSKIN(from arsR to yqaB); Δ(yt SyBER lab (EDJ1497)
oA,ytpAB) ; Δ(from dhbA to dhaF)
upp::Plamdaneo
Δ(from albA to albG) : Δ(from bacA to bacF) ;
Δeps::ble
trpC2 SyBER lab
∆lmrB::erm Carol Gross collection1
∆lmrA::erm Carol Gross collection1
∆yceJ::kan Carol Gross collection1
∆yceK::kan Carol Gross collection1
∆mdr::kan Carol Gross collection1
∆ycnB::kan Carol Gross collection1
∆ycnC::kan Carol Gross collection1
∆ydfL::kan Carol Gross collection1
∆vmlR::kan Carol Gross collection1
∆yetH::kan Carol Gross collection1
∆yetL::erm Carol Gross collection1
∆yetM::erm Carol Gross collection1
∆yfmR::kan Carol Gross collection1
∆yfmQ::kan Carol Gross collection1
∆yfmP::kan Carol Gross collection1
∆yfmO::kan Carol Gross collection1
∆yfmM::kan Carol Gross collection1
∆yfmJ::kan Carol Gross collection1
∆yfmI::kan Carol Gross collection1
∆yfkL::kan Carol Gross collection1

157
 Strain Characteristics Source
B. subtilis BKK 07870 ∆yfkK::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 07910 ∆yfkF::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 08370 ∆yfiR::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 08380 ∆yfiS::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 08400 ∆yfiU::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 08410 ∆yfiV::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 09010 ∆yhcA::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 09700 ∆bmrB::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 09710 ∆bmrC::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 09720 ∆bmrD::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 10580 ∆yhjO::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 11480 ∆yjbB::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 17290 ∆ebrB::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 17300 ∆ebrA::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 24000 ∆bmrU::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 24010 ∆bmr::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 24020 ∆bmrR::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 26580 ∆bltR::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 26590 ∆blt::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 26600 ∆bltD::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 31480 ∆yuxJ::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 32870 ∆mdtR::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 32880 ∆mdtP::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 33560 ∆yvaD::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 33570 ∆yvaE::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 33580 ∆yvaF::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 34810 ∆yvcD::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 34820 ∆bmrA::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 35200 ∆yvkB::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 35210 ∆yvkA::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 38640 ∆yxlH::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKE 39970 ∆yxaH::erm Carol Gross collection1
B. subtilis BKE 39980 ∆qdoI::erm Carol Gross collection1
B. subtilis BKE 39990 ∆qdoR::erm Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 08290 ∆lnrJ::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 08300 ∆lnrK::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 08310 ∆lnrL::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 08320 ∆lnrM::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 08330 ∆lnrN::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 10820 ∆yisQ::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 10830 ∆yisR::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 18370 ∆yoeA::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 19440 ∆yojI::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 21710 ∆ypnP::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 34480 ∆yvdT::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 34490 ∆yvdS::kan Carol Gross collection1
B. subtilis BKK 34500 ∆yvdR::kan Carol Gross collection1
B. subtilis trpC2 ΔlmrA ΔqdoR ΔlmrA::erm, ΔqdoR::kan This study

158
 Strain Characteristics Source
B. subtilis trpC2 ΔlmrB ΔqdoR ΔlmrB::erm, ΔqdoR::kan This study
B. subtilis trpC2 ΔqdoI ΔlmrA ΔqdoI::erm, ΔlmrA::kan This study
B. subtilis trpC2 ΔyxaH ΔlmrA ΔyxaH::erm, ΔlmrA::kan This study
B. subtilis BSB1 ΔbmrB ΔbmrB::kan This study
B. subtilis BSB1 ΔbmrC ΔbmrC::kan This study
B. subtilis BSB1 ΔbmrR ΔbmrR::kan This study
B. subtilis BSB1 ΔebrB ΔebrB::kan This study
B. subtilis BSB1 ΔlmrA ΔlmrA::erm This study
B. subtilis BSB1 ΔycnB ΔycnB::kan This study
B. subtilis BSB1 ΔyfiS ΔyfiS::kan This study
B. subtilis BSB1 ΔyfmP ΔyfmP::kan This study
B. subtilis BSB1 ΔyvcD ΔyvcD::kan This study
B. subtilis BSB1 Phs lmrB amyE::Phs lmrB This study
B. subtilis BSB1 Phs yxaH amyE::Phs yxaH This study
B. subtilis BSB1 40 PlmrA sfgfp, spcR This study
B. subtilis BSB1 41 PyetL sfgfp, spc R This study
B. subtilis BSB1 43 PqdoR sfgfp, spc R This study
B. subtilis BSB1 44 PqdoI sfgfp, spc R This study
B. subtilis BSB1 45 PbmrA sfgfp, spc R This study
B. subtilis BSB1 46 Pbmr sfgfp, spc R This study
B. subtilis BSB1 47 PynfC sfgfp, spc R This study
B. subtilis BSB1 48 PyxdJ sfgfp, spc R This study
B. subtilis BSB1 49 PyhjC sfgfp, spc R This study
B. subtilis BSB1 50 PyybN sfgfp, spc R This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ60 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ61 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ62 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ63 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ64 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ65 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ66 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ67 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ68 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ70 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ71 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ72 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ73 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ74 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ75 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ76 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ77 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ78 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ79 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ80 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ81 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ82 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ83 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ84 Δeps::ble This study

159
 Strain Characteristics Source
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ85 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ86 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ87 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ88 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ89 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ90 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ91 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ92 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ93 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ94 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ95 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ96 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ97 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ98 Δeps::ble This study
B. subtilis CS1 Δeps Evo.CJ99 Δeps::ble This study
F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI
Escherichia coli BL21(DE3) SyBER Lab
lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
F– endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR
E. coli DH5α nupG purB20 φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA- SyBER Lab
argF)U169, hsdR17(rK–mK+), λ–
E. coli DH5α 39 pAGP39 This study
E. coli DH5α 40 pAGP40 This study
E. coli DH5α 41 pAGP41 This study
E. coli DH5α 43 pAGP43 This study
E. coli DH5α 44 pAGP44 This study
E. coli DH5α 45 pAGP45 This study
E. coli DH5α 46 pAGP46 This study
E. coli DH5α 47 pAGP47 This study
E. coli DH5α 48 pAGP48 This study
E. coli DH5α 49 pAGP49 This study
E. coli DH5α 50 pAGP50 This study
E. coli DH5α 51 pAGP51 This study
E. coli DH5α 52 pAGP52 This study
E. coli MG1655 F– λ– ilvG– rfb-50 rph-1 SyBER Lab
E. coli MG1655 ΔrecA ΔrecA::kan This study
E. coli TG1 K-12 supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5, SyBER Lab
(rK-mK-)
E. coli TG1 40 pAGP40 This study
E. coli TG1 41 pAGP41 This study
E. coli TG1 43 pAGP43 This study
E. coli TG1 44 pAGP44 This study
E. coli TG1 45 pAGP45 This study
E. coli TG1 46 pAGP46 This study
E. coli TG1 47 pAGP47 This study
E. coli TG1 48 pAGP48 This study
E. coli TG1 49 pAGP49 This study
E. coli TG1 p50 pAGP50 This study

160
 Strain Characteristics Source
E. coli Top10 mcrA, Δ(mrr-hsdRMS- SyBER Lab
mcrBC), Phi80lacZ(del)M15, ΔlacX74, deoR, rec
A1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK,
rpsL(SmR), endA1, nupG
E. coli Top10 pBSBII pBSBII SyBER Lab
E. coli Top10 pSG13 pSG13 SyBER Lab
E. coli XL1 pDR111 pDR111 SyBER Lab
1
(Koo, Kritikos et al. 2017)

Les milieux de culture utilisés dans ce travail sont détaillés en Table 30. Les milieux LB et M9-malate
(Harwood and Cutting 1990) ont été utilisés pour la culture des souches d’E. coli et de B. subtilis. Le
milieu SOB a été utilisé dans la préparation des cellules compétentes pour les souches E. coli DH5α et
TG1. Le milieu SOC a été utilisé lors de la transformation par choc thermique. Le milieu MC a été utilisé
lors de la transformation de B. subtilis. Le milieu de culture CHG (milieu riche défini) (Partridge and
Errington 1993) a été utilisé dans les expériences de caractérisation de l’activité antibactérienne des
flavonoïdes et dans les expériences de transcriptomique.

Table 30 : Milieux utilisées dans cette étude.

Final concentration
Medium – Components Supplier, #Reference
(in the medium)
LB Medium
LB 25 g.L-1 BD, #24620
NaOH 0.04 g.L-1 Hach Lange, #245053

M9 Malate Medium
M9 5X
Na2HPO4•2H2O 8.5 g.L-1 Merck, #1.06580.1000
KH2PO4 3 g.L-1 Merck, #1.04877.1000
NH4Cl 1 g.L-1 Merck, #1.01145.1000
NaCl 0.5 g.L-1 Sigma, #59625
Trace element solution 100X
MnCl2•4H2O 1 g.L-1 Merck, #1.05927.1000
ZnCl2 1.7 g.L-1 Merck, #1.088160.250
CuCl2•2H2O 0.43 g.L-1 Merck, #1.027330.250
CoCl2•6H2O 0.6 g.L-1 Merck, #8.025400.100
Na2MoO4•2H2O 0.6 g.L-1 Merck, #1.05927.1000
CaCl2 0.1M
CaCl2•2H2O 0.01 g.L-1 Merck, #1.02382.1000
MgSO4 1M
MgSO4•7H2O 0.25 g.L-1 VWR, #1.05886
FeSol
FeCl3•6H2O 0.01 g.L-1 Merck, #1.039430.250
C6H8O7•H2O 0.02 g.L-1 Merck, #1.00244.1000

161
 Final concentration
Medium – Components Supplier, #Reference
(in the medium)
CHG Medium
CH I+II solution
Casein hydrolysate 10 g.L-1 BD, #211610
L - acide glutamique•NaH2O 4 g.L-1 Acros, #11994-0010
L - alanine 1.3 g.L-1 Fluka, #05130
L - asparagine 1.5 g.L-1 Sigma, #A0884
KH2PO4 1.36 g.L-1 Merck, #1.04877.1000
NH4Cl 1.32 g.L-1 Merck, #1.01145.1000
Na2SO4 0.1 g.L-1 Merck, #1.06649.500
NH4NO3 0.1 g.L-1 Merck, #1.011880.500
FeSol
CH III solution
CaCl2•2H2O 7.35 g.L-1 Merck, #1.02382.1000
MgSO4•7H2O 12.3 g.L-1 VWR, #1.05886
CH IV solution
MnSO4•H2O 0.34 g.L-1 Merck, #1.059410.250

MC Medium
MC 10X
K2HPO4•3H2O 14.04 g.L-1 Merck, #1.051090.250
KH2PO4 5.24 g.L-1 Merck, #1.04877.1000
Glucose 20 g.L-1 Sigma, #47829
Casein hydrolysate 1 g.L-1 BD, #211610
Glutamate•K+ 2 g.L-1 Sigma, #G1501
Tri-Na citrate solution
C₆H₅Na₃O₇•2H₂O 0.88 g.L-1 Merck, #1.06447.1000
Ferric NH4 citrate solution
(NH4)5[Fe(C6H4O7)2] 0.22 g.L-1 Sigma, #F5879
MgSO4 1M
MgSO4•7H2O 0.82 g.L-1 VWR, #1.05886
Tryptophan solution
C11H12N2O2 0.05 g.L-1 Sigma, #T0254

SOB Medium
Bacto tryptone 20 g.L-1 BD, #211705
Yeast extract 5 g.L-1 BD, #212750
NaCl O.6 g.L-1 Sigma, #59625
KCl 0.2 g.L-1 Merck, #1.04936.250

SOC Medium
SOC medium
Glucose solution
Glucose 3.6 g.L-1 Sigma, #47829

162
 Les cultures bactériennes ont été réalisées à 37°C sous agitation à 200 rpm ou 180 rpm dans le cas
des cultures bactériennes pour les expériences de transcriptomique. Quand adapté, l'antibiotique a
été ajouté au milieu de culture aux concentrations indiquées Table 31.

Table 31 : Listes des antibiotiques utilisés dans cette étude.

Les concentrations désirées ont été indiquées pour E. coli et B. subtilis.

Antibiotic Stock concentration Desired concentration

-1
Ampicillin 50 mg.L E. coli : 100 mg.L-1
E. coli : 30 mg.L-1
Chloramphenicol 10 mg.L-1
B. subtilis : 5 mg.L-1
E. coli : 40 mg.L-1
Kanamycin 10 mg.L-1
B. subtilis : 5 mg.L-1
E. coli : 200 mg.L-1
Erythromycin 25 mg.L-1
B. subtilis : 5 mg.L-1
E. coli : 100 mg.L-1
Spectinomycin 100 mg.L-1
B. subtilis : 100 mg.L-1
Phleomycin 20 mg.L-1 B. subtilis : 8 mg.L-1

Plasmides

Les plasmides, utilisés dans cette étude, ont été listés en Table 32. Le plasmide pSG13 a été utilisé
pour amplifier le gène sfgfp. Le gène sfgfp a été intégré dans le plasmide pBSBII (pAGP39). Les
plasmides dérivés de pBSBII (pAGP40 à pAGP50) contiennent le gène codant pour la sfGFP (super folder
Green Fluorescent Protein) sous le contrôle des promoteurs listés Table 32. Ces plasmides ont été
utilisés pour le suivi de l’activité transcriptionnelle de promoteurs spécifiques en présence de
flavonoïdes chez B. subtilis. Les plasmides dérivés de pDR111 (pAGP51 et pAGP52) contiennent un
gène codant un transporteur d’efflux multi-drogue potentiel (lmrB, yxaH) sous le contrôle du
promoteur Phyperspank (promoteur inductible par l’IPTG). Ils ont été utilisés pour la construction des
souches BSB1 surexprimant le gène lmrB ou yxaH au locus amyE (BSB1 Phs lmrB, BSB1 Phs yxaH, Table 29)
(cf. § V.5.3.2). Les plasmides pTwist contiennent les séquences chs provenant de différents organismes,
et ont été implémentés dans une librairie combinatoire dans le cadre du projet MEM.

Table 32 : Listes des plasmides utilisées dans cette étude.

Plasmid Characteristics Source

R R
pBSBII gfpmut3 amp spec SyBER Lab
pDRIII amyE::lacI ampR specR SyBER Lab
pSG13 amyE::sfgfp ampR specR SyBER Lab
pQlinkN lpal (A. thaliana), scccl6 (S. coelicolor), hchs (A. (Feher, Planson et al.
thaliana) hchiopt (A. thaliana) 2014)
pAGP39 pBSBII sfgfp ampR specR This study
pAGP40 pBSBII PlmrA sfgfp ampR specR This study
pAGP41 pBSBII PyetL sfgfp ampR specR This study

163
 Plasmid Characteristics Source
R R
pAGP43 pBSBII PqdoR sfgfp amp spec This study
pAGP44 pBSBII PqdoI sfgfp ampR specR This study
pAGP45 pBSBII PbmrA sfgfp ampR specR This study
pAGP46 pBSBII Pbmr sfgfp ampR specR This study
pAGP47 pBSBII PynfC sfgfp ampR specR This study
pAGP48 pBSBII PyxdJ sfgfp ampR specR This study
pAGP49 pBSBII PyhjC sfgfp ampR specR This study
pAGP50 pBSBII PyybN sfgfp ampR specR This study
pAGP51 pDRIII Phs lmrB ampR specR This study
pAGP52 pDRIII Phs yxaH ampR specR This study
pTwist AtCHS atchs (Arabidopsis thaliana) ampR This study
pTwist AtCHS-F165M atchs (atCHS F165M) (Arabidopsis thaliana) This study
ampR
pTwist BsCHS bschs (Bacillus subtilis) ampR This study
pTwist BsCHS-CM bschs-ConservedMotif (B. subtilis) ampR This study
pTwist BsCHS-N45K-R38K bschs:N45K-R38K (B. subtilis) ampR This study
pTwist ClCHS-1 clchs-1 (Curcuma longa L.) ampR This study
pTwist GaCHS1 gachs1 (Grewia asiatica) ampR This study
pTwist GmCHS1a gmchs1s (Glycine max) ampR This study
pTwist GmCHS gmchs (G. max) ampR This study
pTwist GuCHS guchs (Glycyrrhiza uralensis) ampR This study
pTwist GuCHS-3 guchs-3 (G. uralensis) ampR This study
pTwist GuCHS-S165A guchs:S165A (G. uralensis) ampR This study
pTwist GuCHS-S165F guchs:S165F (G. uralensis) ampR This study
pTwist GuCHS-S165M guchs:S165M (G. uralensis) ampR This study
pTwist HaCHS hachs (Hypericum androsaemum) ampR This study
pTwist MdCHS1 mdchs1 (Malus x domestica) ampR This study
pTwist MdCHS2 mdchs2 (M. x domestica) ampR This study
pTwist MsCHS mschs (Medicago sativa) ampR This study
pTwist PcCHS pcchs (Petroselinum crispum) ampR This study
pTwist PhCHS1 phchs1 (Petunia x hybrida) ampR This study
pTwist PhCHS1-F165M phchs1:F165M (P. x hybrida) ampR This study
pTwist PpCHS ppchs (Physcomitrella patens) ampR This study
pTwist SbCHS2b sbchs2b (Scutellaria baicalensis) ampR This study

Composés chimiques

Les flavonoïdes suivants : naringénine (#N5893), pinocembrine (#P5239), apigénine (#10798),

quercétine (#Q4951), galangine (#Q4951), acacétine (#00017), flavone (#F2003) et kaempférol
(#60010) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO, USA). 56 flavonoïdes supplémentaires
listés dans l’annexe (cf. Annexe 3 VII.4) ont été achetés chez ExtraSynthese (Genay, France) à une
concentration de 100 g.L-1 solubilisés dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).

164
 Techniques de biologie moléculaire

Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

La PCR est une technique basée sur des cycles successifs de différentes températures permettant
l’amplification de séquences d’ADN et d’ARN (RT-PCR) de façon exponentielle. Différentes ADN
polymérases ont été utilisées dans cette étude selon l’application souhaitée pour l’amplification. L'ADN
polymérase Q5 (NEB, #M0491S) est très processive grâce à la fusion de la polymérase avec le domaine
de liaison à l'ADN de Sso7d. Elle a été utilisée dans les expériences de construction de plasmides et de
vérification par séquençage. Le milieu de réaction de PCR [1X buffer de réaction, 200 µM dNTPs,
0,5 µM de chaque amorce, <1 µg d’ADN, 0,02 U/µL polymérase Q5 haute-fidélité] a été effectué dans
un volume final de 50 µL et le cycle PCR a été réalisé selon les indications du fournisseur (98°C-30s, 25
cycles x [98°C-10 sec, 50°C-30 sec, 30 sec/Kb-72°C],72°C-2 min,10°C-∞). La polymérase
DreamTaqTM (Thermo scientific, #K1082) a l'avantage d'être moins coûteuse et est utilisée pour les
expériences de crible (PCR sur colonie ou sur ADN génomique). Le milieu de réaction a été effectué à
partir du Master Mix (2X) (Thermo scientific, #K1082) dans un volume final de 20 µL, et le cycle de PCR
réalisé selon les recommandations du fournisseur (95°C-3min, 25 x [95°C-30s, 50°C-30s, 72°C-60s],
72°C-15min, 10°C-∞). Les amorces utilisées au cours de ce travail sont listées dans la Table 33. Les
amorces ont été synthétisées chez Eurofins (Allemagne) et ont une teneur en GC d’environ 50%,
une taille de la région d'hybridation d’environ 20 nucléotides, se terminent par une cytosine ou une
guanine et ont un contenu en structures secondaires minimisé.

165
Table 33 : Liste des oligonucléotides utilisés au cours cette étude.

Name Description Sequence 5' to 3'

PR_CJ17 Forward sequence lpal gene pQLinkN CTTTCGTCTTCACCTCGAGC
PR_CJ18 Forward sequence lpal gene pQLinkN CCAATTCCAAAGCTACTGGTCC
PR_CJ19 Forward sequence lpal gene pQLinkN CTTTGGGACTAATCTCGTCTCG
PR_CJ20 Forward sequence promoter region pQLinkN upstream scccl GGACTCCTGTTGATAGATCCAG
PR_CJ21 Forward sequence scccl gene pQLinkN GTTCTTCCACATCTACGGCCTG
PR_CJ22 Forward sequence promoter region pQLinkN upstream chs GGAGAGCGAGATCATGATGTAC
PR_CJ23 Forward sequence chs gene pQLinkN GCCAGCCCAAGTCAAAGATC
PR_CJ24 Forward sequence promoter region pQLinkN between chs & chi GTCAGCTAAGGATGGTGTGG
PR_CJ25 Forward sequence promoter region pQLinkN between chi & cat GTCGCCATCTGGAAACAACTG
PR_CJ26 Forward sequence cat gene pQLinkN CGTTCAGCTGGATATTACGGC
PR_CJ27 Forward sequence laqI gene pQLinkN GTGCAGTCGATGATAAGCTGTC
PR_CJ28 Reverse sequence laqI gene pQLinkN CAATGGCATCCTGGTCATCC
PR_CJ29 Forward sequence terminal region downstream kan gene GTATTGTACACGGCCGCATAATC
PR_CJ54 Forward sequence lmrB deletion GTTGATAGAGAGGGGAAATG
PR_CJ55 Reverse sequence lmrB deletion GTCAGGGGCTTTTCATATTA
PR_CJ56 Forward sequence lmrA deletion AGTAAGGTGGGAATGTTATG
PR_CJ57 Reverse sequence lmrA deletion GTAGTATGTCGTTTTTTTTA
PR_CJ60 Forward sequence yetL deletion TACGGGAGCTAATTGCGATG
PR_CJ61 Reverse sequence yetL deletion CGGATCGGACGGGTTTTTTA
PR_CJ62 Forward sequence yetM deletion AAAAGGTGGTTATTGATATG
PR_CJ63 Reverse sequence yetM deletion TTCTGGACTTTTCCTATTTA
PR_CJ64 Forward sequence yxaH deletion AAAGGAGCGTGATGGCTATG
PR_CJ65 Reverse sequence yxaH deletion GAAAAAAGTCTAGACGCC

166
Name Description Sequence 5' to 3'
PR_CJ66 Forward sequence qdoI deletion TTGGAGGAAGCGATAATATG
PR_CJ67 Reverse sequence qdoI deletion TTACAATCTTGTCATCTTTA
PR_CJ68 Forward sequence qdoR deletion TAGGAGGGAATGTTTTAATG
PR_CJ69 Reverse sequence qdoR deletion GAAAGGATAACAAAATGCTA
PR_CJ70 Forward sequence bmrU deletion TAAAGGAGCAGTTGTATATG
PR_CJ71 Reverse sequence bmrU deletion CTAAAGCCTTATGACAGTTA
PR_CJ72 Forward sequence bmrR deletion ATAGAAGGAGTGATGGCATG
PR_CJ73 Reverse sequence bmrR deletion TCTTTTTCTATGCTTTATTA
PR_CJ74 Forward sequence bmrA deletion AAACAGGAGGAAAATATATG
PR_CJ75 Reverse sequence bmrA deletion GCTGATTCGACCAAAATTTA
PR_CJ76 Forward sequence yvcD deletion TAAAACGGAGGGTAGTTGTG
PR_CJ77 Reverse sequence yvcD deletion CAACTCTTTAAAATTTACTA
PR_CJ78 Forward sequence blt deletion GTAAAAGGGGAATTCAGATG
PR_CJ79 Reverse sequence blt deletion ACTTTATAGAAAATGAATTA
PR_CJ80 Forward sequence bltD deletion AAAAAGGAGAATGTAGTATG
PR_CJ81 Reverse sequence bltD deletion GTTTCTCAGCAAACAAGGAG
PR_CJ82 Forward sequence bltR deletion TAGTCAAGGAGGTTTTTATG
PR_CJ83 Reverse sequence bltR deletion ATGAAAATCTCGTAATTTTA
PR_CJ84 Forward sequence bmr deletion GAAAAAGGGGAAGTCATATG
PR_CJ85 Reverse sequence bmr deletion GTACACAAAGAATGCGCTTC
PR_CJ86 Forward sequence bmrC deletion TGAGGAGATGGGGATAGATG
PR_CJ87 Reverse sequence bmrC deletion CCTGCTCCCCCTTCTTCCGC
PR_CJ88 Forward sequence bmrB deletion TATGCCAAGGAATTTGCGTG
PR_CJ89 Reverse sequence bmrB deletion CATACACCTGTCTTTCCTTA
PR_CJ90 Forward sequence bmrD deletion TAGGAAAAACGTTATGGAGA

167
Name Description Sequence 5' to 3'
PR_CJ91 Reverse sequence bmrD deletion TTTTGGGTTTTTGAGCGTTA
PR_CJ92 Forward sequence yfiU deletion AAAAGGAGTTGACGAAAATG
PR_CJ93 Reverse sequence yfiU deletion CGGATGGGGTGGTCTTAACG
PR_CJ94 Forward sequence yfiR deletion AAAGGAGCACAAGGATAAAC
PR_CJ95 Reverse sequence yfiR deletion GCTCCTGCCGCGTTTCTTTA
PR_CJ96 Forward sequence yvaD deletion AGCGGGCAGTACAAATGAGA
PR_CJ97 Reverse sequence yvaD deletion TATAAAAGCGGCACCTGTCA
PR_CJ98 Forward sequence yxlH deletion AGGGGTGGAGAGATACGATG
PR_CJ99 Reverse sequence yxlH deletion ATCATGTTACGTTTTTGCGC
PR_CJ100 Forward sequence erm gene CCAAGTTTTAAACAAGGATATATTGCAG
PR_CJ101 Reverse sequence erm gene CTCGAGAAGATCCCCCTATTAC
PR_CJ102 Forward sequence erm/kan junction GTAATAGGGGGATCTTCTCGAGGAATTCGTTTGATTTTTAATGGATAATG
PR_CJ103 Reverse sequence Δ2670 kan +500bp GTGAGAAAGGAGCTGGCTGAC
PR_CJ104 Reverse sequence Δ39970 kan +500bp CAGAGGAGAGAGAAAAATACATGG
PR_CJ105 Forward sequence yetH deletion AACTTGGAGGTTTCCCTATG
PR_CJ106 Reverse sequence yetH deletion CCGCCGTGCGCAACAGTTTA
PR_CJ107 Forward sequence yfmI deletion TCCAAGGGAGGATACATATG
PR_CJ108 Reverse sequence yfmI deletion TAAATTTTATATATTTATTA
PR_CJ109 Forward sequence yuxJ deletion AGAAAAACTTTGTCATTGTG
PR_CJ110 Reverse sequence yuxJ deletion TTAGTTTTTTCTCGGAATCA
PR_CJ111 Forward sequence vmlR deletion TAAAGCGAGGGATATGGATG
PR_CJ112 Reverse sequence vmlR deletion CGCTTGAACTTTCTCCCTCA
PR_CJ113 Forward sequence ydfL deletion ACAGAAAGGTTGTTAGAATG
PR_CJ114 Reverse sequence ydfL deletion AAAACATATTCATGAGATTA
PR_CJ115 Forward sequence yhcA deletion AAAGGAGGTTGTCTTAGATG

168
Name Description Sequence 5' to 3'
PR_CJ116 Reverse sequence yhcA deletion AAACCTCCCTGTACAGATTA
PR_CJ117 Forward sequence yfkF deletion TAAGGAGAACTGACACGATG
PR_CJ118 Reverse sequence yfkF deletion GTCGGGAGGCTTTTTGATTA
PR_CJ119 Forward sequence yfkK deletion AGAAAGGATGGAACCCTTTG
PR_CJ120 Reverse sequence yfkK deletion TTTCCGGCCAGTCTCCATTA
PR_CJ121 Forward sequence mdtR deletion ACAGAGGGGAAATGAATATG
PR_CJ122 Reverse sequence mdtR deletion TTTCCTCTTTTCATGTTTTG
PR_CJ123 Forward sequence yvaF deletion GAAAGCGGGGGATTAATATG
PR_CJ124 Reverse sequence yvaF deletion GCATCAGCCTCCTCATCAGC
PR_CJ125 Forward sequence yvkB deletion TCGTGAGGTGAAACGTATTG
PR_CJ126 Reverse sequence yvkB deletion TTTATTATGCCAAGGAGTTA
PR_CJ127 Forward sequence yfmQ deletion AACGGAGATGATGAAGTATG
PR_CJ128 Reverse sequence yfmQ deletion GTCTTTCACTTTCCTGTTTA
PR_CJ129 Forward sequence yfmJ deletion GTGATAGGAGGATGAAAATG
PR_CJ130 Reverse sequence yfmJ deletion CCCGTTTTCATCTTCATTCA
PR_CJ131 Forward sequence yvkA deletion TAAAAAGGAGGATCCCAATG
PR_CJ132 Reverse sequence yvkA deletion TGCCGGGCTGTTTTGTGTTA
PR_CJ133 Forward sequence yfiV deletion GATGAGGAAGTGATGAAATG
PR_CJ134 Reverse sequence yfiV deletion ATGACAGACTTACTGATTTA
PR_CJ135 PrAGP140 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCTCTACACCCACTGCCTCGGC
PR_CJ136 PrAGP141 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCATTCGTTGTGACACGATTATAAAGG
PR_CJ137 PrAGP142 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCGTTGTCAGTTCAATGCTGAT
PR_CJ138 PrAGP143 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCAGCTCTATATGTATTAGTTAGG
PR_CJ139 PrAGP144 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCCGACGGTGACGTCCATGGCG
PR_CJ140 PrAGP145 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCGTATGGTAGAGCGACTTATA

169
Name Description Sequence 5' to 3'
PR_CJ141 PrAGP146 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCAAGAAGAACTAGCAATTGAAGCGG
PR_CJ142 PrAGP147 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCTTAGACCAGTCTATATATTATCATTC
PR_CJ143 PrAGP148 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCTCCTTATTTTCAGAAAGTGA
PR_CJ144 PrAGP149 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCAGCGTTCAGAAAGGTGAAAA
PR_CJ145 PrAGP150 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCAATCAGCTATTTTACAAGTGCC
PR_CJ146 PrAGP151 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCAGTGTGTATCCCTTATACTG
PR_CJ147 PrAGP152 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCAAATATAAAATAGGTATTTCCAGATG
PR_CJ148 PrAGP153 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCTTATTAAATTTAAAAATAAATTTAACTTTGTTAAGTATATATC
PR_CJ149 PrAGP154 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCGCGGATATCACGGAATGTGA
PR_CJ150 PrAGP155 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCCTTACACTGCTGCCATCATC
PR_CJ151 PrAGP156 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCTGCCCATGGCCATTACGATT
PR_CJ152 PrAGP157 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCAGGATTGAGGTGTACAAGCC
PR_CJ153 PrAGP158 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCGGGTGATAACGTCTATGTGC
PR_CJ154 PrAGP159 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCATATATATTTTATACTATCGGTTAG
PR_CJ155 PrAGP160 TTGTGAGCGGATAACAATTAATGATTTTGGAAACAACAGCTAAAG
PR_CJ156 PrAGP161 CATGCGGCTAGCTGTCGACTATTAATGATCTACTTTAACGCGTTTC
PR_CJ157 PrAGP134 TCTCCCGGGAAGGAGGAACTACTATGTCAAAAGGAGAAGAAC
PR_CJ158 PrAGP135 CTCAAGCTTATTATTTATAAAGTTCGTCCATACCG
PR_CJ159 PrAGP136 CTTTTACCGCGGGCTTTCCCTCGCCGCTGACGTTTGCAAT
PR_CJ160 PrAGP137 CATAGTAGTTCCTCCTTCCCAATTGCAATCAAAAATATAGTGACTGG
PR_CJ165 PrAGP138 CTTTTACCGCGGGCTTTCCC
PR_CJ166 PrAGP139 CATAGTAGTTCCTCCTTCCC
PR_CJ167 PrAGP177 TTGTGAGCGGATAACAATTAATGTCTTCATTACAGCCGACTTTAAC
PR_CJ168 PrAGP178 CATGCGGCTAGCTGTCGACTACTAGACTTTTGTTTTCTTTGCAATAGGC
PR_CJ169 Reverse sequence qdoI GGCCGAACATGCAGGCTTTG

170
Name Description Sequence 5' to 3'
PR_CJ170 Forward upstream promoter seq pBSBII CCTCTTCGCTATTACGCCAG
PR_CJ171 Reverse sequence sfGFP CAAGAGTAGGCCAAGGAACAG
PR_CJ172 Reverse downstream sfGFP sequence pBSBII CTCTTGCCAGTCACGTTACG
PR_CJ173 Forward (P1-pDR111) CAATGGCAAGAACGTTGCTC
PR_CJ174 Reverse (P2-pDR111) GATCTTTCAGCCGACTCAAACATC
PR_CJ175 Reverse sequence lmrB GGATTGGTTCTGGAGCATCTC
PR_CJ176 Forward sequence lmrB CGGCAGAAGCAGCATAGATG
PR_CJ177 Reverse sequence yxaH GAAGGTTAATGGCGCTTCTC
PR_CJ178 Forward sequence yxaH GTAAATGCCATCCTCCCAAC
PR_CJ179 PrAGP141 (modified) CATAGTAGTTCCTCCTTCCCCGTTGTGACACGATTATAAAGG
PR_CJ180 PrAGP142 (modified) CTTTTACCGCGGGCTTTCCCCTGTTGTCAGTTCAATGCTG
PR_CJ181 Forward sequence yfiS deletion AATCAGGAGGATGAATCATG
PR_CJ182 Reverse sequence yfiS deletion CGCCTGCTTTCTGCAATTTT
PR_CJ183 Forward sequence yfmP deletion GCGAAGGGGGATTTACCTTG
PR_CJ184 Reverse sequence yfmP deletion AGCGTTTAACAAACTTTTCA
PR_CJ185 Forward sequence ycnB deletion AGAAGGGATATGTATTGAAC
PR_CJ186 Reverse sequence ycnB deletion GGCTCTTTTTTTGTTAATCA
PR_CJ187 Forward sequence ebrB deletion TGATGAAGATGAGAGGATTG
PR_CJ188 Reverse sequence ebrB deletion ACAGACGGTCACTCACAGGC
PR_CJ189 P1 amyE seq1 GTGATTATGCCGCGATTTCC
PR_CJ190 PrAGP22 CTTCCCGTTCCGCTATCGGC
PR_CJ191 P3-pDR111 sequencing CAGCAATGGCAAGAACGTTG
PR_CJ192 P4-pDR111 sequencing GATGTTTGAGTCGGCTGAAAGATC
PR_CJ193 Forward sequence yceK deletion CTTTTTCAACACCCATTATG
PR_CJ194 Reverse sequence yceK deletion CAGATATGTATAGAGAAAACCCTTTGTTA

171
Name Description Sequence 5' to 3'
PR_CJ195 Forward sequence ycnC deletion AAGAAGGAAGCCATGAGATG
PR_CJ196 Reverse sequence ycnC deletion ATCCCTTCTTTTCTCTAAGT
PR_CJ197 Forward sequence ebrA deletion AGTGAGGAGAATTCATGATG
PR_CJ198 Reverse sequence ebrA deletion TCACTCCTTTACGGCCAATT
PR_CJ199 Forward sequence mdtP deletion TGAGTAAAGAAGGCAAACAA
PR_CJ200 Reverse sequence mdtP deletion CGCGGGGTGCTCTATTAATG
PR_CJ201 Forward sequence yvaE deletion GTGTTTCTATGCTTGGCG
PR_CJ202 Reverse sequence yvaE deletion TACTGCCCGCTTTTATGTAC
PR_CJ203 Forward sequence yfkL deletion TTTGAAGGAGTACAAGCATG
PR_CJ204 Reverse sequence yfkL deletion CGTCCGTTTTTTTGTTGC
PR_CJ205 Forward sequence yfmO deletion GATGGAGGTTAGGTCAAATG
PR_CJ206 Reverse sequence yfmO deletion CGCAGTGTCTTTCGTTATTA
PR_CJ207 Forward sequence yfmR deletion GAGGATTGATAGGAACCATG
PR_CJ208 Reverse sequence yfmR deletion CGGCCACGCTTTTTA
PR_CJ209 Forward sequence yfmM deletion ACGATAGAGGTGTAAACATG
PR_CJ210 Reverse sequence yfmM deletion GCAGGCGGGTTTTTTTATAAAT
PR_CJ211 Forward sequence yhjO deletion CGAAAGGCGGCGATCAC
PR_CJ212 Reverse sequence yhjO deletion CCTTTTTCACGTAACACTCC
PR_CJ213 Forward sequence yjbB deletion CAATTAGAGGAAAAAGCGGAG
PR_CJ214 Reverse sequence yjbB deletion GTTCATTTTGAAGTGTTTCTCA
PR_CJ215 Forward sequence mdr deletion AAGAGGAGGTAGAACAAATG
PR_CJ216 Reverse sequence mdr deletion GTACTGCTTTTTTTATGTTA
PR_CJ217 Forward sequence yceJ deletion GTTATAAAACAATAGGAGTGATAAAATTTG
PR_CJ218 Reverse sequence yceJ deletion CTCTTGAATGAGGTGCTTTTTTA
PR_CJ219 Forward sequence lnrN deletion GGAGGTACAAAAGGTGAAAAAAATT

172
Name Description Sequence 5' to 3'
PR_CJ220 Reverse sequence lnrN deletion CTGCACCCATACGAATGTAC
PR_CJ221 Forward sequence lnrM deletion GGACGGCAATGAAAAAAAGC
PR_CJ222 Reverse sequence lnrM deletion CCTTTTGTACCTCCTTATCTTGTATG
PR_CJ223 Forward sequence lnrL deletion AAAAGGAGTGAGACGACGTG
PR_CJ224 Reverse sequence lnrL deletion TCCCTCCTCAATCCCGCAA
PR_CJ225 Forward sequence yvdR deletion CCGGGAGGTGAAAAATAATG
PR_CJ226 Reverse sequence yvdR deletion CAGCTGTATATGCCTTGATTTTA
PR_CJ227 Forward sequence yvdS deletion CATTCATAAAATAGAGAGGTG
PR_CJ228 Reverse sequence yvdS deletion TTCACCTCCCGGCTGAG
PR_CJ229 Forward sequence yisQ deletion GAAAGGGGTTAGACACGATG
PR_CJ230 Reverse sequence yisQ deletion CTTGATTGAGCCGGGTGTTA
PR_CJ231 Forward sequence yisR deletion CTTAAAAAGGAGGATGATTCAAATG
PR_CJ232 Reverse sequence yisR deletion CATCCCTCGTCTGGTTATTG
PR_CJ233 Forward sequence yvdT deletion CACGCGATAAAATGAATGAG
PR_CJ234 Reverse sequence yvdT deletion GCGGTGTTACCCAGTCATTT
PR_CJ235 Forward sequence yoeA deletion CGATTTCAAATAAAGGAGTCC
PR_CJ236 Reverse sequence yoeA deletion AACGGTGTGATTCGGAGG
PR_CJ237 Forward sequence yojI deletion GAAACGGAGATCAATGTATG
PR_CJ238 Reverse sequence yojI deletion GATTGATCACCTCTTTTAAATGTG
PR_CJ239 Forward sequence ypnP deletion GAGAACACAAGGAGAAAAGATG
PR_CJ240 Reverse sequence ypnP deletion GATATATAGGTATGTGCTTTTCG
PR_CJ241 Forward sequence lnrJ deletion TATCGGGAGTGATGAGCGTG
PR_CJ242 Reverse sequence lnrJ deletion AAACTCTCCTTTTGCTGCAC
PR_CJ243 Forward sequence lnrK deletion TAAGATCATCATTACCGACG
PR_CJ244 Reverse sequence lnrK deletion ATGCAAAACGTCATATGTCA

173
 Purification des acides nucléiques

V.4.2.1 Extraction d’ADN génomique

L’ADN génomique bactérien a été isolé en utilisant le kit GenEluteTM (Sigma-Aldrich, #NA2120). A
partir d’un culot de cellules, une étape de lyse a été effectuée par traitements au lysozyme puis à la
protéinase K. Après ajout d’éthanol, les lysats ont ensuite été transférés sur des colonnes
préalablement préparées avec la solution de préparation du kit. Les colonnes ont subi par la suite deux
étapes de lavage et une étape d’élution (H2O). Afin d'optimiser l’étape d’élution de l’ADN génomique,
une étape d’incubation à température ambiante a été effectuée pendant une minute avant l'élution.
Les ADN génomiques élués ont été conservés à -20°C.

V.4.2.2 Mini-préparation d'ADN plasmidiques

Le kit QIAprep (Qiagen, #27106) a été utilisé pour extraire les plasmides à partir de précultures de
DH5α ou TG1 par lyse alcaline des cellules (Birnboim and Doly 1979). A partir d’un culot de cellules, un
traitement par RNAse A (solution P1) a été effectué suivi d’une étape de lyse (solution P2). Le lysat a
été ensuite neutralisé et la concentration en sels ajustée (solution N3). Après centrifugation (10 min,
12 000 xg), le surnageant a été déposé sur une colonne ayant une membrane de silice. Après
centrifugation, l’ADN plasmidique absorbé par la membrane a subi ensuite des étapes de lavage
(solutions PB et PE) suivies par une étape d’élution (H2O). Pour une meilleure efficacité d’élution des
plasmides, les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant cinq minutes avant
l'élution. Les plasmides extraits ont été déposés sur gel agarose 1% et leurs concentrations
déterminées par spectrométrie avant stockage à -20°C.

V.4.2.3 Purification des fragments d’ADN obtenus après PCR ou digestion enzymatique

Les fragments obtenus par PCR ou après digestion enzymatique ont été purifiés avec le kit QIAquick
PCR Clean-Up (Qiagen, #28106) selon les instructions du fournisseur. Brièvement, un tampon de liaison
(solution PB) a été ajouté directement à l’échantillon PCR puis le mélange a été déposé sur colonne.
L'ADN se fixe à la membrane de la colonne grâce aux hautes concentrations de sels présents dans le
tampon. Les impuretés ont été ensuite éliminées par une étape de lavage (solution PE) et l’ADN ainsi
purifié est élué avec 50 µL H2O. Les fragments d'ADN ont été également purifiés avec le kit QIAquick
gel extraction (Qiagen, #28706) à partir d'un gel d’agarose 1%. Un tampon de solubilisation et de liaison
(solution QG) a été ajouté dans le tube avec la bande d’agarose contenant l'ADN et incubé à 50°C
pendant dix minutes pour dissoudre l’agarose. L’isopropanol a été ensuite ajouté à l’échantillon en
préparation à l'étape de fixation sur colonne des fragments d’ADN. Des étapes de lavages (solution PE)
suivies de l'étape d’élution (H2O) ont été effectuées. Pour améliorer l’efficacité d’élution de l’ADN, les

174
échantillons ont été incubés à température ambiante pendant cinq minutes avant l'élution. Les
fragments d’ADN purifiés ont été déposés sur gel agarose 1% et leurs concentrations déterminées par
spectrométrie avant stockage à -20°C.

V.4.2.4 Purification d'ARN totaux

Le kit de purification et de concentration d’ARNs (Norgen Biotek, #23600) a été utilisé pour purifier
les ARN totaux après traitement à la DNAse. Afin de préparer les ARNs pour l’étape de fixation sur
colonne, le tampon de liaison (solution RL) puis de l’isopropanol ont été ajoutés. Les ARNs fixés sur la
membrane subissent ensuite trois étapes de lavage (solution de lavage A) suivies d’une étape d’élution
(H2O). Pour maximiser l’efficacité d’élution des ARN et ainsi obtenir une concentration élevée en ARN,
les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant cinq minutes avant l'élution. Une
dilution au 10ème a été effectuée pour mesurer la quantité et l’intégrité des ARNs (RIN, cf. §III.4.2). Tous
les ARN totaux purifiés ont été conservés à -80°C.

Digestion enzymatique et ligation de plasmides

Les plasmides ont été digérés par des enzymes de restriction selon les recommandations du
fournisseur. La digestion enzymatique a été utilisée dans des étapes de vérification (e.g. profil de
digestion de plasmide) et de construction de plasmides ou de souches (e.g. intégration dans le
chromosome de B. subtilis). La ligation des fragments d’ADN a été effectuée avec la T4 ADN ligase
(NEB, #M0202S). Les ligations ont été effectuées à 16°C en respectant le rapport molaire vecteur-insert
1 :3 et ont été stockées au -20°C quand nécessaire.

Assemblage de Gibson

L’assemblage de Gibson développé par Daniel G. Gibson (Gibson, Young et al. 2009) est une
méthode de clonage permettant d’assembler plusieurs fragments d’ADN simultanément par une
réaction isothermique. Cette méthode permet d’assembler plusieurs fragments d’ADN ayant une
séquence d'homologie de ~20 à 40 nucléotides chevauchant les fragments d’ADN adjacents, à l’aide
d’un mélange de trois enzymes. Ce mélange est composé d’une exonucléase qui clive nucléotide par
nucléotide l’extrémité 5’ ; d’une ADN polymérase qui incorpore des nucléotides à chaque espace et
d’une ADN ligase qui lie les fragments adjacents d’ADN. Le kit NEBuilder® HIFI DNA Assembly Master
Mix (NEB, USA) basé sur la méthode d’assemblage de Gibson a été utilisé selon les instructions du
fournisseur avec un rapport molaire vecteur-insert de 1 :2 (Figure 54). Le produit d’assemblage obtenu
a été ensuite transféré dans la souche E. coli DH5α chimio compétente.

175
Figure 54 : Méthode d'assemblage de l'ADN via le kit HiFi NEBuilder (https://www.neb-online.fr/).
Etape 1 : Préparation des différents fragments à assembler (vecteur, fragments). Etape 2 : Assemblage
des fragments par l’action de l’exonucléase, de l'ADN polymérase et de l'ADN ligase à 50°C pendant
15min pour deux à trois fragments, ou 60min pour quatre à six fragments. Etape 3 : Transformation
du produit de la réaction dans des cellules chimio compétentes. Etape 4 : Vérification de la
construction obtenue par digestion, PCR colonie et séquençage.

Quantification des ADN et ARN

La quantification des ADN et des ARN a été effectuée avec un spectromètre Nanodrop (#ND-2000)
qui permet de déterminer la concentration (ng.µL-1) et la qualité de l’échantillon (rapport 260/280 et
260/230). La qualité des ARNs obtenus pour l’étude transcriptomique a été vérifiée avec un
bioanalyzer Agilent (décrit au §III.4.2).

Electrophorèse sur gel d’agarose

L’électrophorèse sur gel d'agorose est une technique basée sur le déplacement d’ions induit par un
champ électrique et a été utilisée pour séparer l’ADN en fonction de la masse molaire et de la charge

176
électrique. En pratique, un gel d’agarose 1% supplémenté de Midori Green (#MG06, Nippon Genetics)
a été utilisé pour toutes les étapes de vérification et les étapes d’extraction de fragments d’ADN.
L’électrophorèse a été effectuée à 125 mV pendant 30 min avec un marqueur de masse molaire (Smart
ladder – 200 à 10000 pb, #MW-1700-10, Eurogentec).

Transformation bactérienne

La compétence est la capacité d'une cellule à intégrer de l'ADN exogène. Il existe deux types de
compétence : i) la compétence naturelle que possèdent certaines bactéries (e.g. B. subtilis) et ii) la
compétence artificielle des bactéries obtenue en laboratoire par traitement avec un tampon
contenant des sels (e.g E. coli).

Transformation d’Escherichia coli

V.5.1.1 Préparation des cellules compétentes d’E. coli

Les souches E. coli DH5α ou TG1 ont été traitées avec le tampon CCMB80 (80mM CaCl2, 20mM
MnCl2, 10mM MgCl2, 10mM CH3CO2K, 10% glycérol) pour les rendre chimio compétentes. Brièvement,
à partir d’une pré-culture d’E. coli, une culture en milieu SOB a été effectuée à 37°C jusqu’en phase
exponentielle (DO600nm < 0,3). Les cellules ont été incubées sur glace pendant 10 minutes, et
centrifugées (5000 xg, 10 min, 4°C). Les cellules ont été ensuite lavées avec le tampon CCMB80
permettant de fragiliser la membrane. Après centrifugation (5000 xg, 10 min, 4°C), les cellules ont été
suspendues dans le milieu CCMB80 et distribuées en aliquotes avant d'être stockées à -80°C quand
nécessaire pour une durée maximale de 6 mois.

V.5.1.2 Transformation par choc thermique

Les souches chimio compétentes E. coli ont été transformées par choc thermique. Les cellules ont
été incubées avec l’ADN d’intérêt dans la glace pendant 20 min. Un choc thermique a été réalisé (42°C,
45s puis 2 min dans la glace) suivi de l’ajout immédiat de milieu SOC (qsp 1 mL), et les cellules ont été
incubées à 37°C pendant une heure permettant l’expression du marqueur de résistance. Les cellules
ont été étalées sur boîtes de Pétri contenant du LB-Agar supplémenté avec l’antibiotique adéquat et
incubées 20 h à 37°C.

177
 Transformation de Bacillus subtilis

V.5.2.1 Préparation des cellules compétentes

B. subtilis est naturellement compétent (Harwood and Cutting 1990) et sa compétence est induite
dans des conditions de privation de nutriments. Les cellules ont été cultivées dans le milieu de
compétence (cf. §IV.1) jusqu’en phase de transition.

V.5.2.2 Transformation

Une méthode basée sur la compétence naturelle de B. subtilis a été utilisée avec le milieu MC (cf.
§V.1) pour transformer B. subtilis 168 et ses dérivés. Succinctement, une colonie de B. subtilis est mise
en culture dans 2 mL de MC à 37°C pendant cinq heures, 400 µL de culture bactérienne sont mis en
présence l’ADN d’intérêt (100 à 500 ng selon les applications) et incubés à 37°C pendant deux heures.
Les transformants sont sélectionnés sur boîtes LB supplémentées de l’antibiotique requis (37°C, 20 h).

Construction de souches bactériennes

V.5.3.1 Construction et intégration de fusions transcriptionnelles chez B. subtilis

Le plasmide pAGP39 (réplicatif chez E. coli et intégratif chez B. subtilis) contenant le gène codant la
sfGFP a été construit à partir du plasmide pBSBII par digestion-ligation, et amplifié dans la souche E.
coli DH5α. pAGP39 a ensuite été digéré par l’enzyme de restriction SmaI (site unique de digestion
présent sur le plasmide). Les promoteurs sélectionnés été amplifiés par PCR à partir d’ADN génomique
de B. subtilis utilisé comme matrice, puis assemblés avec le vecteur pAGP39 par la méthode Gibson.
Les plasmides résultants (pAGP40 à pAGP50) ont été intégrés au chromosome de B. subtilis par simple
crossing-over. Les transformants contenant la fusion transcriptionnelle promoteur-sfgfp ont été
sélectionnés sur boîtes LB supplémenté de spectinomycine, et la région génomique modifiée
séquencée.

V.5.3.2 Construction de souches B. subtilis de surexpression de transporteurs d’efflux multi-drogue

putatifs

Les gènes lmrB et yxaH ont été amplifiés par PCR à partir d’ADN génomique de B. subtilis BSB1. Le
plasmide pDR111 a été digéré par HindIII et déphosphorylé par la phosphatase alcaline rSAP (Shrimp
Alkaline Phosphatase, #M0371, NEB). Les fragments d’ADN (vecteur digéré et fragments PCR) ont été
assemblés par la méthode Gibson, et les produits d'assemblage amplifiés dans la souche E. coli DH5α.
Les plasmides préalablement digérés par ScaI ont été intégrés dans B. subtilis par double crossing-over

178
au locus amyE. Les transformants ont été sélectionnés sur boîtes LB supplémenté de spectinomycine
et criblés avec un test amylase en présence d’amidon.

Test de toxicité

Le test de toxicité se base sur la méthodologie du Live Cell Array (LCA, (Borkowski, Goelzer et al.
2016)) permettant de réaliser des cinétiques de croissance bactérienne et des mesures de fluorescence
à haut débit en plaque 96 puits.

Culture bactérienne et acquisition des données

Une colonie bactérienne isolée a été cultivée en triplicata en milieu CHG dans les 60 puits (B2 à
G11) d’une plaque 96 puits (CELLSTAR®, Greiner Bio-One) pendant 18 heures à 37°C (Figure 55). Les
puits situés aux extrémités de la plaque (lignes A et H et colonnes 1 et 12, Figure 55) ont été remplis
avec du milieu afin de minimiser l'évaporation des 60 puits centraux. Deux précultures successives ont
été réalisées ; la première en LB (Prec1) après une dilution au vingtième de la culture de 18 heures, et
la deuxième (Prec2) en milieu adéquat (CHG ou M9) après une dilution au vingtième de Prec1. Les
précultures Prec1 et Prec2 ont été incubées à 37°C jusqu’à ce que la culture atteigne la phase
exponentielle (DO600nm≈0.3). Prec2 a été utilisée pour ensemencer la culture (typiquement à une
dilution 100 en milieu pauvre ou une dilution 1000 en milieu riche) et la croissance bactérienne est
mesurée avec un lecteur de plaque (Synergy™ 2, BioTek®) sous agitation à 37°C. Dans les expériences
nécessitant la lecture de la fluorescence de la sfGFP, une gamme de référence de fluorescéine a été
déposée dans les puits A2 à A4 et H9 à H11. Les mesures de la DO600nm et de la fluorescence (excitation =
485 nm, émission = 528 nm ± 20 nm) ont été enregistrées à intervalle de 10 minutes pendant environ 20
heures.

179
Figure 55 : Structure d’une plaque 96 puits pour une expérience en LCA.
Ici, est représentée à titre d’exemple, la structure d’une plaque pour des mesures de DO600nm et de
fluorescence. Les différentes souches : la souche contrôle (C- Strain), et les souches à caractériser
(Strain 1, Strain 2 et Strain 3), sont disposées en colonne par triplicata (colonne 2 à 11, lignes B à G)
pour chaque concentration en flavonoïde (0 à C4 g.L-1 de flavonoïde). Une gamme de référence de
fluorescéine est présente de part et d’autre de la plaque à des concentrations de 1, 10 et 100 nM (puits
en vert). Les puits extérieurs ont été remplis avec le milieu utilisé au cours de l’expérience, ici du CHG
(puits en jaune). Les données sont exportées dans un fichier Excel qui regroupe les données, de DO600nm
et de fluorescence, obtenues ainsi que des mesures à λ = 900 nm et λ = 977 nm permettant de calibrer
le volume des puits.

Traitement des données

Un premier traitement de données a d’abord été effectué avec le logiciel MATLAB (MathWorks)
pour visualiser les courbes de croissance. Deux représentations graphiques des courbes de croissance
sont obtenues : i) DO600nm en fonction du temps et ii) DO600nm en échelle logarithmique en fonction du
temps, pour chaque colonne de la plaque (Figure 56).

180
Figure 56 : Courbes de croissance obtenues par le premier traitement MATLAB.
A titre d’exemple, des courbes de croissance provenant d’une expérience en LCA sont représentées
ici. (A) Courbes de croissance : la DO600nm est représentée en fonction du temps. (B) Courbes de
croissance en échelle logarithmique : la DO600nm en échelle logarithmique est représentée en fonction
du temps. Sont représentées à gauche, les données expérimentales obtenues en colonne 2 et à droite,
celles obtenues en colonne 4. Les courbes de croissance 1 à 6 correspondent aux lignes B à G de la
plaque d’expérience, respectivement.

A partir des figures en log (Figure 56B) obtenues par le premier traitement MATLAB, la valeur minimale
(Vmin) et maximale (Vmax) de la phase exponentielle, appelées « bornes » sont déterminées en vue d’un
deuxième traitement Matlab. Ce deuxième traitement des données a été réalisé selon la méthode
décrite par (Borkowski, Goelzer et al. 2016). Les bornes [Vmin ; Vmax] permettent de délimiter la partie
de la courbe pour laquelle le calcul du taux de croissance va être effectué pour chaque puit (Figure
57A). Suite au deuxième traitement avec MATLAB, un rapport de contrôle qualité des cultures est
obtenu et illustré en Figure 58.

181
Figure 57 : Traitement de données des courbes de croissance en log et cas d’exclusion.
Ici, est représenté à titre indicatif, les courbes de croissance en échelle logarithmique de la colonne 2
(A) et 5 (B) d’une plaque d’expérience en LCA. (A) Les valeurs Vmin et Vmax délimitent la phase
exponentielle des courbes de croissance (zone orange). (B) Les courbes de croissance dont la phase
exponentielle débute après 10h d’incubation sont automatiquement exclues (zone rouge) du calcul du
taux de croissance.

Figure 58 : Rapport de contrôle qualité obtenu par le deuxième traitement de données.

Courbes de croissance des cultures de la plaque d’expérience. (A) Visualisation de la DO600nm en
fonction du temps (h) de la souche contrôle (en triplicat, en absence de flavonoïde). (B) Visualisation
des courbes de croissance de la souche contrôle (en triplicat) en échelle logarithmique. (C)
Histogramme des temps de génération des bactéries dans les 60 puits contenant les cultures. (D)
Histogramme des écarts-type des temps de génération des 60 cultures. (E) Représentation de la phase
exponentielle sélectionnée en échelle logarithmique des courbes de croissance en fonction du temps
(h). (F) Représentation graphique des temps de génération calculés des souches dans les 60 puits.

182
Ce rapport de contrôle qualité nous a permis de contrôler i) la culture en triplicat de la souche contrôle
dans les puits B2 à D2 (Figure 58A et B) ; ii) la distribution des temps de génération et de leurs l’écarts-
type (Figure 58C et D) ; iii) la sélection de la phase exponentielle des 60 cultures (délimitée par les
bornes choisies préalablement) (Figure 58E) et de contrôler iv) l'homogénéité des taux de croissance
obtenus au sein de chaque triplicat grâce à une visualisation graphique avec un gradient de couleur
(Figure 58F).

Le taux de croissance a été déterminé pour chaque triplicata excepté pour les cultures entrant en
phase exponentielle après 10h d’incubation à 37°C (Figure 57B). La moyenne et l'écart moyen des
triplicats ont ensuite été calculés. Ces taux de croissance ont ensuite été exprimés en pourcentage par
rapport au taux de croissance mesuré en absence de flavonoïde et reportés sur un graphique en
fonction des concentrations en flavonoïdes, permettant d'obtenir ainsi la courbe dose-réponse de la
souche d’intérêt en présence d'un flavonoïde spécifique (Figure 59).

Figure 59 : Test de toxicité d’un flavonoïde vis-à-vis de la souche d’intérêt.

Courbe de dose-réponse obtenue à partir des taux de croissances obtenus avec le traitement MATLAB.

Quand adapté, la fluorescence de la sfGFP a été calculée par soustraction de l'autofluorescence à

la fluorescence mesurée. La fluorescence de la sfGFP a été ensuite normalisée par la DO600nm corrigée
(soustraction de la valeur de la DO à t=0 à la valeur de DO à t=x pour chaque puit). La moyenne et
l'écart moyen des triplicats ont été ensuite calculés.

Activité antibactérienne et propriété antibiotique des flavonoïdes

L’activité antibactérienne d’un composé peut être déterminée par différentes méthodes. Parmi
elles se trouvent :

183
 L’antibiogramme via un test en goutte

Sur une boîte de Pétri contenant du milieu LB (+ gélose molle supplémenté de DMSO 1 % quand
adapté), 100 µL de culture bactérienne a été étalé. La spectinomycine à une concentration de 25
mg.mL-1, la kanamycine et le chloramphénicol à une concentration de 2,5 mg.mL-1 ont été utilisés
comme contrôles positifs, et le DMSO et H2O comme contrôles négatifs pour toutes les boîtes
effectuées. Un volume de 10 µL de composés chimiques a été déposé sur boîte. Ces boîtes ont ensuite
été incubées 18 h à 37°C.

L’antibiogramme via un gradient de concentration

L’antibiogramme via un gradient de concentration est une méthode de crible sur milieu solide
permettant de tester rapidement la sensibilité d’une souche bactérienne pour un composé et de
déterminer sa MIC. La toxicité du flavonoïde vis-à-vis de B. subtilis est mise en évidence par l'apparition
d'un front d’inhibition. La préparation du gradient a été effectuée en deux étapes sur une plaque
contenant 8 puits rectangulaires ou sur une boîte de Pétri carrée, pour lesquelles une ligne
correspondant au début du gradient (0 mg.L-1 de flavonoïde) a été préalablement indiquée. La 1ère
étape a consisté à couler une première couche de LB Agar (maintenu à 55°C) supplémenté de 300 mg.L-
1
de flavonoïde (excepté pour la pinocembrine à 100 mg.L-1) sur une plaque 8 puits ou sur boîte de
Pétri de format carré posées sur un plan incliné. Après refroidissement et solidification de cette
première couche, une deuxième couche a été coulée (plaques ou boîtes posées sur un plan horizontal).
Puis les plaques ou boîtes ont été laissées à température ambiante à l'obscurité (recouvertes d’un
papier aluminium) pendant 4 heures, permettant la diffusion des flavonoïdes et créant ainsi un
gradient de concentrations. Chaque puit a été ensemencé avec 50 µL d’une dilution de 10-3 (sur plaque
8 puits) ou 100 µL d’une dilution de 10-2 (sur boîte carrée) d’une culture de B. subtilis à OD600nm ≈ 0,3 et
les plaques ou boîtes ont été incubées pendant 16 heures à 37°C (Figure 60).

184
Figure 60 : Etapes de fabrication d’un antibiogramme via un gradient de concentration.
Etape 1 : première couche de LB (T = 55°C) supplémenté de flavonoïdes, ici 300 mg.L-1 de naringénine
(boîte sur sur support incliné). Etape 2 : deuxième couche de LB sans flavonoïde (boîte sur support
horizontal). Etape 3 : temps de diffusion de 4 h. Etape 4 : ensemensement de la boîte avec une culture
de B. subtilis (DO600nm ≈ 0.3) pendant 16 h.

Pour chaque expérience, trois contrôles ont été réalisés (absence de composé, gradients de
concentration de pinocembrine (0 à 100 mg.L-1) et de naringénine (0 à 300 mg.L-1)). La distance
existante entre la ligne à 0 mg.L-1 de flavonoïde et le front d’inhibition, et la longueur du gradient ont
été mesurée et la MIC calculée (rapport de la distance du front de migration et de la longueur du
gradient, rapporté à la concentration en flavonoïde déposé).

Test de viabilité

Un test de viabilité a été réalisé sur B. subtilis BSB1 afin de déterminer le caractère bactériostatique
ou bactéricide de la naringénine et pinocembrine. A partir d’une préculture, une culture a été
effectuée pour chaque souche et chaque condition : en absence d'antibiotique, en présence de
kanamycine 5 mg.L-1 (contrôle positif d'antibiotique bactéricide), en présence de chloramphénicol
5 mg.L-1 ou spectinomycine 100 mg.L-1 (contrôles positifs d'antibiotique bactériostatique), en présence
de pinocembrine 60 mg.L-1, ou en présence de naringénine 200 mg.L-1. A DO600nm ≈ 0,3 une injection
du composé adéquat dans la culture B. subtilis été réalisée. Les cultures bactériennes ont été incubées
à 37°C pendant t = 0, t = 3 h et t = 24 h. Pour chaque condition (temps d’incubation, composé chimique),
une dilution à 10-5 et à 10-6 ont été effectuées et 100 µL de chaque dilution a été ensemencé sur boîte
LB, incubée ensuite à 37°C pendant 20 h. A J+1, les colonies sur boîtes ont été comptabilisées.

Analyse transcriptomique

Une étude transcriptomique a été menée pour caractériser l’expression des ARNm en présence des
flavonoïdes suivants : naringénine, pinocembrine, résokaempférol, bavachine et 2’-hydroxyflavanone
à une concentration de ½MIC (défini au §III.4.2) pour trois temps différents (T0 avant injection du
flavonoïde, T1 = 15 min et T2 = 60 min après injection du flavonoïde). Les ARNm ont été obtenus en
utilisant le protocole de (Nicolas, Mäder et al. 2012) adapté de la méthode décrite par (Eymann,
Homuth et al. 2002). Les étapes majeures sont décrites plus en détails dans les sections suivantes.

185
 Conditions de culture

A partir d’une culture d’environ 20 h de la souche B. subtilis BSB1 en milieu CHG, une préculture
(Prec1) des cellules jusqu’en phase exponentielle est réalisée. A DO600nm = 0,2 Prec1 est diluée au 100ème
et incubée à 37°C. L’injection du composé chimique (ou DMSO pour le contrôle) a été réalisée lorsque
la culture a atteint une DO600nm égale à 0,2. L’expérience a été réalisée en duplicat - cultures effectuées
sur deux jours différents avec deux lots de milieu CHG préparé in situ - aux trois temps : avant injection
(T0), 15 min (T1) et 60 min (T2) après injection. A chaque prélèvement, a été ajouté un volume de
tampon d’arrêt de croissance froid (killing buffer : 20 mM Tris•HCl pH = 7, 5 mM MgCl2, 20 mM NaN3).
Après centrifugation (8000 xg, 4°C, 10 min), les culots de cellules ont été congelés dans de l’azote
liquide et conservés à -80°C.

Broyage cellulaire mécanique

Les culots des 36 prélèvements (traitement indépendant avec 5 flavonoïdes et un contrôle (DMSO),
3 temps (T0, T1, T2) en duplicat (6 x 3 x 2) ont été resuspendus dans 200 µL de tampon d’arrêt de
croissance froid et immédiatement déposés dans un récipient en téflon (préalablement refroidi et
rempli d’azote liquide). Chaque récipient en téflon a été ensuite mis dans le Mikro-Dismembrator S
(Sartorius, Allemagne) pendant 2 min à 2600 rpm. Le lyophilisat obtenu a été remis en suspension dans
4 mL de solution de lyse (C2H6N4S 4 M, C2H3NaO2 25 mM (pH = 4.8), C15H28NNaO3 0,5 %) préchauffé
préalablement à 50°C. Par la suite, des aliquots de 1 mL de lysat ont été transférés dans des tubes à
centrifuger de 2 mL et congelés dans de l’azote liquide. Les lysats ont été conservés à -80°C.

Extraction des ARNs

Les ARN totaux ont été isolés par extraction à l'acide-phénol. Les échantillons ont été lavés
successivement avec un volume égal de solution phénol/chloroforme/alcool iso-amylique (25 :24 :1)
et avec une solution de chloroforme/alcool iso-amylique (25 :1, pH=8). Chaque étape de lavage est
suivie d'une étape de centrifugation à 12000 xg. Après avoir ajouté 1/10 de volume d’acétate de
sodium (3 M C2H3NaO2, pH = 4.8) au surnageant, l’ARN a été précipité dans 1 mL d’isopropanol pendant
20 h à -20°C. Les échantillons ont ensuite été lavés deux fois avec de l’éthanol 70% puis une fois avec
de l’éthanol 100 % et dissous dans 75 µL H2O puis incubés 3 h à 4°C et 30 min à température ambiante.

Traitement à la DNase

Pour l’analyse transcriptomique, 55 µg d’ARN totaux ont été traités par DNase (Qiagen, #79254) et
incubés à température ambiante pendant 10 minutes. Les échantillons ont été ensuite purifiés (cf. §
V.4.2.4).

186
 Contrôle qualité des ARN totaux

La qualité des ARN totaux a été évaluée selon les instructions du fournisseur à partir des dilutions
1/10 par électrophorèse automatisée au moyen d’un bioanalyseur (Agilent 2100. USA). Son utilisation
nous permet d’obtenir en direct les électrophérogrammes ainsi que les données numériques sur la
taille, la quantité, l’intégrité (RIN : Numéro d’intégrité de l’ARN) et la pureté (rapport ARN 23S/16S)
des ARN totaux.

Evolution dirigée

L’évolution en culture continue a été réalisée dans un fermenteur de paillasse (Multifors II, Infors)
dont le circuit est présenté en Figure 61. La boîte de contrôle du fermenteur a éte paramétrée de sorte
que les cuves A et B soient respectivement dans les conditions suivantes : température : 37°C ;
agitation : 150 rpm ; pompe : 2 mL/min (cuve A) et température : 37°C ; agitation : 150 rpm ; pO2 :
80% ; pH = 7 ; pompe : 2 mL/min (cuve B). Une sonde pO2 et une sonde pH ont été installées sur la
cuve B et permettent d’enregistrer les valeurs en O2 et de pH en temps réel. L’antimousse SB 2121
(Struktol) a été ajouté manuellement à la culture quand nécessaire. La culture bactérienne est réalisée
en milieu LB supplémenté de naringénine (90 mg.L-1). La concentration en naringénine a été
augmentée au cours de l’expérience d’évolution. Des prélèvements journaliers ont été effectués tout
au long de l'expérience et stockés à -80°C avant caractérisation par LCA.

187
Figure 61: Schéma du circuit de l’évolution en culture continue.
L’entrée du milieu dans la cuve A a été automatisée à 2 mL.min-1 par une pompe péristaltique. La cuve
A a été utilisée pour préchauffer le milieu avant son entrée dans la cuve B. Le passage du milieu de la
cuve A vers la cuve B a été prise en charge par une deuxième pompe péristaltique configurée à
2 mL.min-1. La cuve B a été utilisée pour la culture de la souche B. subtilis CS1 ∆eps. Une troisième
pompe a été utilisée comme pompe de sortie.

188
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205
VII ANNEXES

Annexe 1 : Construction d’un châssis E. coli pour la production de naringénine

Parallèlement à mon projet de thèse, il était prévu pour l’ANR MEM de construire une souche
chassis d’E. coli surproductrice de naringénine et de pinocembrine. J’ai contribué à la conception de la
voie de biosynthèse en récupérant à partir de la littérature un ensemble de séquences codant
potentiellement les activités nécessaires à la synthèse de ces deux flavonoïdes. Ce travail de
bibliographie conséquent a été utilisé par l’équipe du coordinateur (J.L. Faulon) pour tester différentes
combinatoires de la voie de biosynthèse et sélectionner les meilleurs candidats. Une fois cette voie
construite par le troisème partenaire Abolis (Evry), mon équipe d’accueil également spécialisée dans
l’ingéniérie des génomes a initié la construction d’une souche châssis d’E. coli optimisée pour la
production des précurseurs de la voie de biosynthèse de la naringénine afin d’y implémenter la voie
synthétique. J’ai eu une contribution modérée à ce travail mené par S. McGovern sous la conduite de
A.G. Planson.

Voie de biosynthèse de la naringénine

La naringénine est produite à partir de la tyrosine et du malonyl-coA, substrats endogènes à E. coli.

La voie de biosynthèse de la naringénine se compose de quatre enzymes : la tyrosine amonia-lyase
(TAL), la 4-coumarate:CoA ligase (4CL), la chalcone synthase (CHS), et la chalcone isomerase (CHI)
(Figure 62).

206
Figure 62 : Voie de production de la naringénine chez E. coli.
En rouge sont indiqués les précurseurs endogènes à E. coli et en bleu est représentée la voie
hétérologue de biosynthèse de la naringénine.

Une voie synthétique fonctionnelle a été assemblée par Abolis (Evry) dans le cadre de la
collaboration de l'ANR MEM, dans laquelle chaque gène est sous le contrôle de son propre promoteur
(Figure 63).

Figure 63 : Construction génétique de la voie de biosynthèse de la naringénine.

207
 Construction du châssis E. coli pour la production de la naringénine.

Figure 64 : Représentation schématique de la construction du châssis E. coli pour la production de

naringénine.

Les gènes ont été délétés par transduction au phage P1 obtenu de la collection Keio (Baba, Ara et
al. 2006). A chaque étape de délétion, la cassette de sélection à la kanamycine bornée par des
séquences FRT est éliminée par la recombinase FLP, permettant ainsi d'accumuler différentes délétions
au sein d'une même souche. Les délétions publiées dans la littérature comme les plus efficaces pour
la production de flavonoïdes ont été sélectionnées et combinées entre elles, et associées à des
surexpressions de gènes de biosynthèse de précurseurs de la voie. L'intégration des gènes dans le

208
chromosome a été réalisée par la méthode utilisant le Red (recombinase du phage ) (Datsenko and
Wanner 2000).

Identification des séquences CHS pour sélectionner les enzymes avec une
meilleure activité.

Nous avons sélectionné 24 séquences chs pour être testées dans la voie de biosynthèse de la
naringénine et optimisé les séquences nucléotidiques pour une production E. coli (cf VII.1). La synthèse
des séquences ont été sous-traitées chez Twist Bioscience. Les constructions et tests de l'efficacité de
ces séquences sont en cours dans l'équipe BioRetroSynth (J.L. Faulon, INRAE).

209
 Annexe 2 : Séquences nucléotidiques codant les CHS commandées chez Twist:

>1_AtCHS

GGTCTCACATATGGTGATGGCAGGCGCATCGTCACTGGACGAAATCCGTCAGGCCCAGCGTGCCGACGGCCCAGCCGGGATTTTAGCCATCGGTACT
GCCAACCCGGAAAACCACGTTTTGCAGGCAGAATATCCGGATTATTATTTCCGTATTACCAACAGCGAACACATGACCGATCTGAAAGAGAAATTTAAGCG
CATGTGCGATAAATCCACAATCCGCAAACGCCATATGCACCTGACCGAAGAGTTTTTAAAAGAGAATCCGCATATGTGTGCCTATATGGCGCCTAGTCTGG
ATACCCGACAGGATATCGTTGTAGTCGAAGTACCGAAACTCGGCAAAGAAGCGGCAGTCAAAGCAATCAAAGAGTGGGGCCAGCCGAAGTCTAAAATCA
CCCATGTCGTTTTTTGCACCACGTCAGGTGTGGATATGCCGGGGGCTGATTACCAGCTCACCAAATTGTTAGGCCTCCGACCATCCGTTAAACGTTTGATGA
TGTATCAGCAGGGGTGCTTTGCCGGCGGTACCGTGCTACGAATAGCTAAAGACCTGGCGGAAAATAACCGTGGTGCTAGGGTGCTGGTCGTCTGCTCTGA
GATCACCGCAGTTACTTTCCGCGGCCCGTCAGACACGCATCTCGACAGCCTGGTGGGTCAGGCGCTCTTCTCTGACGGTGCGGCCGCGCTGATTGTGGGG
AGTGACCCAGATACCAGCGTCGGGGAAAAACCGATTTTTGAAATGGTTTCAGCTGCACAGACAATCCTGCCTGATTCTGATGGTGCGATTGATGGGCATTT
GAGAGAAGTCGGTCTGACCTTCCATCTGCTGAAAGATGTGCCTGGGCTGATCAGTAAAAATATCGTGAAATCGCTCGATGAAGCATTTAAACCTCTGGGCA
TTTCAGACTGGAACTCGCTGTTCTGGATTGCACATCCGGGAGGGCCGGCTATACTGGATCAGGTTGAGATTAAACTGGGCCTTAAAGAAGAAAAAATGCG
GGCGACACGTCATGTACTCTCTGAATACGGTAATATGAGCTCTGCCTGCGTGCTGTTTATTCTTGATGAGATGCGCCGGAAATCAGCGAAAGATGGCGTTG
CCACCACCGGTGAAGGGCTGGAATGGGGTGTATTGTTCGGTTTTGGTCCGGGCTTAACTGTTGAAACGGTTGTTCTGCATTCTGTGCCGCTGTAATCGAAG
AGACCC

>2_AtCHS-F165M

GGTCTCACATATGGTGATGGCCGGTGCCAGTTCGCTGGACGAAATCCGTCAGGCTCAGCGTGCCGATGGACCCGCCGGAATATTAGCGATTGGTACT
GCAAACCCGGAAAACCATGTACTGCAAGCAGAATATCCGGATTACTATTTTCGCATCACCAACTCGGAACATATGACCGACCTGAAAGAGAAATTTAAACG
TATGTGTGATAAATCTACGATTAGGAAGCGGCATATGCATTTGACTGAGGAATTTTTAAAAGAAAATCCGCATATGTGCGCTTATATGGCGCCCAGCCTGG
ATACCCGCCAGGATATTGTTGTGGTTGAAGTGCCTAAGTTAGGTAAAGAAGCCGCGGTGAAGGCCATTAAGGAGTGGGGACAGCCGAAATCCAAAATTA
CTCATGTCGTATTTTGCACCACCTCTGGTGTAGATATGCCAGGCGCTGATTATCAGCTAACCAAATTATTGGGCCTCAGGCCAAGCGTAAAACGCCTGATGA
TGTACCAGCAGGGCTGTATGGCAGGTGGCACTGTGCTGCGCATTGCAAAGGACCTGGCGGAGAATAACCGCGGTGCGCGGGTGCTGGTTGTGTGCAGCG
AAATTACCGCGGTTACCTTCCGTGGCCCGTCTGACACTCATCTGGATAGCCTCGTTGGGCAGGCGCTGTTCTCGGATGGCGCAGCGGCGTTAATAGTGGGT
TCTGATCCGGACACCTCGGTAGGCGAGAAACCAATCTTTGAAATGGTCAGTGCCGCACAGACCATTCTGCCAGACTCCGACGGCGCTATCGATGGTCATCT
GCGTGAAGTCGGCCTTACCTTTCACCTGTTGAAAGATGTGCCGGGCCTGATTAGCAAAAATATCGTGAAAAGTCTGGATGAAGCATTCAAACCGCTGGGG
ATCAGCGACTGGAACAGCCTCTTCTGGATTGCTCACCCGGGCGGTCCAGCCATCCTCGATCAGGTGGAAATAAAACTTGGACTCAAAGAAGAAAAAATGC
GCGCGACACGCCACGTTCTAAGTGAATACGGCAACATGAGCAGCGCCTGCGTCTTATTTATTCTCGACGAGATGCGTAGGAAATCGGCGAAAGACGGCGT
TGCTACAACGGGCGAAGGTCTGGAATGGGGCGTGCTGTTTGGTTTCGGTCCTGGTCTTACGGTGGAGACAGTTGTGCTGCATTCAGTGCCCCTGTAATCGA
AGAGACCC

>3_BsCHS

GGTCTCACATATGGCGTTTATTCTGTCCATCGGCACGTCGCTGCCGGCCTATAACGTGAATCAGGAGAAAGCCGCGGAATTTGCCCGCTATATGTTTC
AGCATTCATTTAAGGATATCGATCGCCTCCTGTCCAGTTTTAAAAATGGACAAATCCATAGTCGCCAGTTTGTGAAACCGATTGAGTGGTATAAAGAAGGTC
ATTCATTTGAAGAGAAAAACCAGATTTATATCGAAGAAACGTTAAAGCATTCGCGTGCAGCAGTTCGCGAGTGCCTGAGCCATCCGGAATTCTTCCAGGAA
GCTATTCCTTACGAAAAAGTCGAAGCGGTCTTTTTTGTCTCCAGCACCGGGCTCAGCACGCCGTCCATTGAAGCACGGTTGATGAACGAACTGCCGTTTTCG
CCATACACCAAACGTATCCCCATCTGGGGCCTTGGCTGTGCGGGCGGAGCAAGTGGATTAGCCCGAGCTGCTGAATATTGTAAAGCTTATCCGGAAGCCTT
TGTCCTGGTGATCTCAGCTGAGTTATGCAGCCTGACATTCCAGCCGGAAGATAAAACGAAATCGAACTTGATCGGTACTTCCCTTTTTGGCGATGGCATTGC
CGCAGCGCTCTTGTGCGGCGAAAAAGCGGATCGTAGGGTCAGTAAATTAAAACTCGCGCCGAAAATCATGGATGCTCAGTCCGTACTGATGAAACAGTCT
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AAGAGACCC

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GCGATTCCGTATGAGAAAGTTGAGGCCGTCTTTTTTGTCTCTTCTACCGGCCTTTCCACCCCGTCAATCGAAGCACGCCTGATGAATGAACTTCCGTTCTCGC
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TGCCGCACTGCTGTGCGGTGAAAAAGCAGATCGCCGCGTCAGCAAATTAAAACTGGCGCCTAAAATCATGGATGCCCAATCTGTGCTCATGAAACAGTCTG
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GGCCATAAAAAAGAGGCCGAACGGGGCCTGATTGGCGCGCTTGGCCCGGGCTTTTCATCGGAACTGCTGTTGTTCAGCTGGGAAAAAGGCGCATAATCG
AAGAGACCC

>5_BsCHS-N45K-R38K

GGTCTCACATATGGCGTTTATTTTAAGCATCGGCACCTCGCTGCCGGCTTATAACGTGAATCAGGAAAAAGCGGCGGAATTTGCCCGCTATATGTTTC
AGCACAGCTTCAAAGATATCGATAAGCTTCTGTCCAGCTTTAAAAAGGGACAAATTCACTCTCGTCAGTTCGTAAAACCGATTGAGTGGTATAAAGAGGGG
CATTCCTTTGAAGAGAAAAACCAGATTTACATTGAAGAAACCTTGAAGCATTCAAGAGCCGCAGTGCGTGAATGCCTGAGCCATCCGGAATTCTTCCAGGA
GGCGATTCCGTATGAAAAGGTTGAGGCAGTATTCTTTGTCTCTTCCACCGGCTTATCCACACCGAGCATCGAAGCGCGCCTGATGAACGAACTACCCTTTAG

210
CCCCTATACCAAACGTCTGATGATGTATCAGCAGGGCTGCTTCGCGGGCGGAACGGTTTTACGCCGTGCTGCAGAATATTGCAAAGCATATCCGGAAGCGT
TCGTGTTGGTTATCAGTGCCGAACTGTGTAGCCTGACTTTCCAGCCGGAAGATAAAACGAAATCAAATTTAATTGGCACGTCGCTGTTTGGCGATGGCATT
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GCAGATTTTTCTGGATAAACACAAATTATCCTTCCATGACATCAGCGTATTTTTAGCGCATCCCGGTGGCAAAAAAGTGATTGATGCGTATATTAAATCCCT
GGGCCTTAGCTCTGAAAAACTGTCCAGTGCTCAAAGCATACTCCAGAAACATGGCAATATGTCCAGCGCCACCATCCTGTATGTTATCAAAGATCATCTGCA
AAACGGTCATAAAAAAGAAGCAGAACGTGGACTGATCGGCGCTCTCGGCCCGGGGTTCAGCTCCGAATTGCTGCTTTTTTCCTGGGAAAAAGGCGCGTAA
TCGAAGAGACCC

>6_ClCHS-1

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GGCCAACCCAGTAGGAAATCTTCTGGATCAGGAAAGCTTCGCTGACTATTACTTCAACATCACCAAATCCGAACACCTGCAACCGCCGAAGGAGAAACTGA
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CTGGAAGCCCGCCTCGGGGTTATGATCGACTCTGTCCCAGAATTAGGTAAAGAGGCTGCGCTCCGCGCCCTAAAAGAATGGGGTCGCCCGATGAGCTCCA
TTACCCACGTGGTGTTTTGCGCGGGAGCGGGCGTCGATATGCCGGGTGCGGATTATCAGTTAGTTAAGCGCCTGGGCTTGTCCCCTTCGGTAAAACGTGTG
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GGTGTCAGTGACTGGAACAGCATTTTCTGGGTTGCTCATCCGGGCGGTCCAGCTATTCTTAACCAGGTGGAAGCAAAATTACAGCTGAAACCGGAAAAACT
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GGTGGTGGGCCCGCTGCCGTGGTTCCGCTAAACGCCGCCGTAAGGGGCCGTCAAAAAGCGGTGCGCGTCCGTCGCCGCGCTCGCCAACCAGTAGCTGCG
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GTCTGCTGGGCCGCCGACCCTTACCTGGACACCGTGGTGGGCGCAGGCGCTGTTTGGCGATGGGGCAGGTGCGCTGGTAGTAGGTGCCGATCCGGATCT
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>8_GmCHS1a

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ATTGTGTTGATCAATCCACCTACCCGGATTACTACTTCCGCATCACCAACAGCGAACATATGACTGAACTGAAAGAAAAATTTAAACGAATGTGCGATAAAT
CGATGATCAAAAAGCGTTACATGTATCTGAACGAAGAGATTCTAAAAGAAAATCCGTCTGTTTGCGCCTATATGGCGCCGTCGCTAGACGCGCGTCAGGAT
ATGGTTGTCATGGAAGTACCGAAGCTCGGTAAAGAGGCCGCGACCAAAGCAATCAAGGAGTGGGGCCAGCCGAAAAGTAAAATTACCCATCTGATTTTCT
GCACCACCAGCGGCGTGGATATGCCTGGCGCGGACTATCAGTTGACAAAACTGTTGGGGTTGCGTCCCTCGGTGAAACGTTATATGATGTACCAGCAGGG
CTGTTTTGCCGGTGGTACGGTGTTACGTCTGGCAAAAGATCTGGCAGAGAATAATAAAGGTGCCCGGGTGCTCGTAGTCTGCTCTGAAATCACTGCCGTTA
CCTTCCGTGGTCCGACCGATACCCATCTGGACAGCCTCGTTGGTCAGGCCCTGTTTGGTGACGGCGCAGCGGCGGTGATCGTTGGGAGTGATCCGCTGCC
GGTTGAAAAACCGCTTTTCCAGCTGGTCTGGACCGCGCAAACAATATTACCCGATTCAGAAGGTGCTATCGATGGTCATCTTCGCGAAGTGGGCTTAACCT
TTCATCTATTAAAAGACGTCCCTGGTTTGATATCGAAAAATATTGAAAAAGCCTTAGTCGAGGCGTTTCAGCCATTGGGGATCAGCGATTATAACTCTATTT
TCTGGATTGCGCATCCGGGTGGGCCAGCGATTCTGGATCAGGTGGAAGCCAAATTGGGCCTGAAACCGGAAAAAATGGAAGCTACCCGTCATGTTCTTTC
TGAGTACGGTAATATGAGCTCGGCCTGTGTTCTCTTTATTTTGGACCAGATGCGTAAAAAAAGCATCGAAAACGGTCTGGGAACAACCGGTGAAGGCCTC
GACTGGGGAGTGCTGTTCGGCTTTGGCCCGGGTCTGACCGTTGAGACAGTTGTATTACGAAGTGTGACCGTCTAATCGAAGAGACCC

>9_GmCHS

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TGTGTGGACCAAAGCACCTATCCGGATTACTATTTTCGTATCACCAACAGCGAGCATATGACCGAACTGAAAGAAAAATTCAAACGCATGTGCGATAAATC
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GGTTGTAGTAGAAGTTCCTAAGCTGGGTAAAGAGGCAGCCACCAAAGCCATAAAGGAATGGGGGCAGCCCAAGTCGAAAATTACCCACCTGATTTTCTGC
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TTTTGCCGGCGGTACGGTGCTTCGTCTGGCCAAAGACCTGGCCGAAAATAATAAAGGCGCTCGCGTGCTGGTCGTCTGCTCAGAAATTACCGCAGTCACTT
TTCGCGGCCCAACCGATACCCATCTAGATTCGTTAGTTGGACAGGCCCTGTTCGGTGACGGTGCTGCGGCTGTGATCGTTGGTAGCGATCCGTTACCTGTT
GAAAAGCCTCTATTCCAGCTGGTCTGGACAGCCCAGACGATCCTACCTGACAGCGAAGGCGCAATCGACGGCCATTTACGCGAAGTGGGATTGACATTCC
ATCTGTTGAAAGATGTGCCGGGCCTGATCAGCAAAAATATTGAAAAAGCGCTGGTGGAGGCGTTTCAGCCGCTGGGTATTAGTGATTATAACAGTATTTTC
TGGATTGCTCATCCTGGCGGCCCCGCGATCCTGGATCAGGTCGAAGCAAAACTGGGGCTCAAGCCGGAAAAAATGGAAGCTACCCGTCATGTACTGTCGG
AATATGGCAATATGAGCAGCGCCTGCGTGCTGTTTATTCTGGATCAGATGCGTAAGAAATCGATCGAAAATGGTCTGGGCACCACCGGCGAAGGACTAGA
CTGGGGCGTTTTATTTGGCTTTGGTCCCGGCCTAACGGTGGAAACGGTGGTGCTGCGCTCGGTGACTGTATAATCGAAGAGACCC

>10_GuCHS

211
 GGTCTCACATATGGTTAGCGTGGCTGAAATTCGTAAAGCACAGCGCGCAGAAGGTCCGGCTAATATTCTGGCCATCGGTACCGCGAATCCGCCGAAT
TGTGTTGACCAGAGTACCTATCCGGACTTTTATTTTAAAATCACTAATAGCGAACATAAAACTGAGCTGAAAGAAAAATTCCAGCGTATGTGCGATAAGTC
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TGGTGGTGGTCGAAGTGCCCAGACTGGGTAAAGAGGCAGCTGTTAAAGCCATCAAAGAGTGGGGCCAGCCGAAAAGTAAAATTACCCACCTGATCTTCTG
CACCACGTCGGGGGTTGATATGCCGGGGGCAGATTATCAGCTTACCAAACTGTTGGGTCTGCGTCCGTACGTAAAACGTTATATGATGTACCAGCAGGGCT
GCTCCGCGGGCGGCACCGTTCTGCGGCTGGCAAAAGATCTTGCCGAAAATAATAAAGGCGCACGTGTGCTGGTTGTTTGCTCTGAGATAACCGCCGTGAC
TTTTCGCGGCCCGACTGATACTCATCTGGATTCCCTGGTGGGTCAGGCGCTTTTCGGTGATGGCGCTGCAGCGGTTATTGTTGGCAGTGATCCCGTCCCTGA
AATCGAAAAACCGATTTTTGAACTGGTCTGGACCGCGCAGACCATCGCTCCGGATAGCGAAGGGGCTATCGACGGTCACCTGCGCGAAGTCGGCCTTACT
TTCCATCTATTAAAAGACGTGCCGGGCATTGTGAGCAAAAACATCGATAAAGCGCTGACGGAAGCGTTTCAGCCTTTAGGTATCTCCGACTATAACAGCAT
ATTCTGGATTGCCCACCCTGGCGGTCCTGCTATTCTGGATCAGGTGGAGCAGAAACTCGCACTGAAACCAGAAAAAATGAAAGCGACCCGCGACGTTTTAT
CCGACTACGGTAATATGAGCTCCGCGTGCGTACTCTTTATTCTCGATGAAATGCGCAAAAAATCCGCGCAAGATGGTCTGAAAACCACCGGCGAAGGCCTG
GAATGGGGGGTACTGTTTGGCTTTGGGCCTGGATTGACCATTGAAACGGTAGTGCTGCATTCGGTGGCGATTTAATCGAAGAGACCC

>11_GuCHS-3_

GGTCTCACATATGGCGACCACGGTGGGTGAAATCCGCAAAGCGCAACGTGCGGAAGGCCCGGCTACCGTACTGGCGATCGGCACTGCAACGCCGCC
GAACTGCGTGGAACAGTCCAGCTATCCGGATTACTACTTCCGTATCACCAACAGCGAACATAAAACTGAATTAAAGGAGAAATTTAAACGCATGTGCGAAA
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GGACATGGTGGTCGTAGAAGTGCCGAAACTGGGTAAAGAAGCTGCAACCAAAGCAATCAAAGAGTGGGGACAACCCAAAAGCAAAATCACACATCTGAT
TTTTTGCACCACATCGGGCGTGGATATGCCGGGCGCGGATTATCAATTAACCAAATTGCTTGGCCTGCGTCCGTATGTGAAGCGCTATATGATGTATCAGC
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CAGTGACGTTCCGCGGACCTACCGATACCCATCTTGACAGCCTGGTTGGCCAGGCGCTGTTTGGCGATGGTGCGGCAGCAGTTATTGTGGGGTCAGATCC
GGTTCCGGAAGTTGAAAAGCCTCTGTTTGAACTGGTCTGGACGGCACAAACTATTCTGCCGGACTCCGAAGGGGCTATCGACGGTCATTTGCGTGAAGTC
GGCTTAACCTTTCATCTCCTGAAAGATGTTCCCGGGCTGATTTCTAAAAATATTGAAAAAGCTCTGGTGGAAGCATTCCAGCCGCTGAATATTAGTGACTAC
AACTCGATCTTCTGGATCGCCCACCCAGGTGGGCCAGCAATTTTAGATCAGGTGGAGGCGAAGTTAGGACTCAAACCGGAAAAAATGGAAGCCACCCGGC
ATGTTCTCAGCGAGTACGGTAATATGAGCTCAGCATGTGTCCTGTTTATCCTGGATGAAATGCGTCGCAAGAGCAAGGAAAATGGTTTAGCTACCACCGGC
GAAGGTCTGGAATGGGGCGTTCTGTTCGGCTTTGGCCCTGGTCTTACAGTGGAAACCGTCGTCCTGCACAGCGTTGCAACCTAATCGAAGAGACCC

>12_GuCHS-S165A

GGTCTCACATATGGTGAGCGTGGCTGAGATTCGTAAAGCGCAGCGTGCTGAAGGACCTGCAAACATTCTGGCGATTGGTACTGCCAACCCGCCGAAC
TGCGTTGACCAGTCTACCTACCCGGATTTTTATTTTAAAATTACTAACTCGGAACATAAAACCGAGCTGAAAGAGAAATTCCAGCGTATGTGCGACAAATCG
ATGATCAAAAAACGCTATATGTACCTAACAGAAGAAATTCTCAAAGAAAATCCTAATATTTGTGCCTATATGGCGCCCTCCCTTGATGCCCGTCAGGACATG
GTCGTTGTGGAGGTCCCTCGCTTGGGCAAAGAAGCTGCCGTTAAGGCCATTAAAGAGTGGGGCCAACCGAAATCAAAAATCACCCACTTAATTTTCTGTAC
CACTAGCGGAGTTGATATGCCGGGCGCGGATTACCAGCTGACCAAACTGCTGGGGCTGCGCCCGTATGTGAAACGTTACATGATGTATCAGCAGGGTTGT
GCGGCCGGTGGTACGGTGTTACGTCTTGCGAAAGATTTAGCGGAAAACAACAAAGGCGCGCGCGTTTTAGTGGTGTGCAGCGAAATTACAGCGGTTACCT
TTCGTGGCCCCACCGATACGCATCTGGATTCTCTGGTGGGCCAGGCGCTGTTTGGCGATGGGGCAGCGGCGGTGATTGTCGGGTCCGATCCGGTACCAGA
AATCGAAAAACCAATTTTTGAACTGGTCTGGACGGCCCAGACCATTGCGCCGGACTCTGAAGGCGCAATTGACGGTCACCTGCGTGAAGTTGGCCTTACAT
TCCACCTATTGAAGGATGTCCCTGGTATCGTCAGTAAAAACATCGATAAAGCTCTGACTGAAGCATTTCAGCCTTTGGGTATTAGCGATTATAACAGCATCT
TCTGGATTGCCCATCCGGGGGGTCCGGCGATCCTGGATCAGGTTGAACAGAAACTTGCCTTGAAACCGGAAAAAATGAAAGCAACGCGCGATGTGCTTAG
CGACTATGGTAACATGTCTAGCGCCTGCGTGCTATTTATCCTCGATGAAATGCGTAAAAAAAGTGCTCAGGATGGTCTGAAAACAACCGGCGAAGGACTG
GAATGGGGTGTTCTCTTTGGCTTTGGTCCCGGACTTACCATTGAAACCGTCGTATTGCATTCTGTAGCCATATAATCGAAGAGACCC

>13_GuCHS-S165F

GGTCTCACATATGGTTTCCGTAGCTGAGATTCGCAAAGCTCAGCGTGCTGAAGGGCCGGCGAACATCCTCGCCATTGGAACCGCCAACCCGCCAAACT
GCGTGGACCAGAGCACCTATCCGGATTTCTATTTTAAAATTACCAACAGCGAGCATAAAACCGAACTGAAAGAGAAATTCCAGCGCATGTGCGACAAAAGT
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GGTGGTTGTCGAAGTCCCTCGGTTAGGTAAAGAAGCAGCAGTGAAAGCCATCAAAGAATGGGGCCAGCCGAAAAGCAAAATCACCCATCTTATTTTTTGC
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CTTTGCCGGTGGCACCGTGCTCCGTCTGGCGAAAGATCTGGCAGAAAACAACAAAGGTGCACGCGTGCTTGTGGTATGTTCAGAGATCACTGCAGTTACAT
TTCGCGGCCCAACCGATACGCATCTGGATTCCCTGGTCGGTCAGGCGCTGTTCGGCGATGGTGCGGCTGCGGTGATCGTCGGGAGCGACCCGGTTCCAGA
AATCGAAAAACCGATTTTTGAATTAGTCTGGACGGCGCAAACCATTGCTCCGGACAGCGAAGGCGCGATCGACGGTCATCTACGTGAAGTGGGCCTGACC
TTTCATCTCCTTAAAGACGTTCCAGGCATTGTTTCGAAAAATATTGATAAAGCGTTAACGGAAGCCTTTCAGCCTCTAGGCATCAGCGATTACAACAGTATTT
TCTGGATTGCCCATCCGGGCGGTCCTGCGATTTTAGATCAGGTGGAACAAAAACTGGCACTCAAGCCGGAAAAAATGAAAGCAACCCGTGACGTATTGTC
AGATTATGGCAACATGTCTAGTGCCTGTGTTCTGTTTATTCTCGATGAAATGCGTAAAAAATCGGCCCAGGATGGCTTAAAAACGACTGGCGAAGGTCTGG
AGTGGGGTGTTTTGTTCGGTTTTGGTCCTGGCTTAACAATTGAAACCGTAGTATTACACAGTGTCGCCATATAATCGAAGAGACCC

>14_GuCHS-S165M

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TGCGTTGATCAGAGCACCTATCCGGATTTTTATTTTAAAATCACCAACAGCGAACATAAAACGGAATTAAAGGAGAAGTTCCAGCGTATGTGCGATAAAAG
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GGTCGTAGTTGAAGTGCCGCGTCTGGGTAAAGAAGCTGCAGTAAAAGCAATTAAGGAATGGGGTCAGCCGAAATCGAAAATTACTCACCTGATTTTCTGC
ACCACCAGCGGCGTGGACATGCCGGGTGCCGATTATCAGCTAACCAAATTGTTAGGCTTACGTCCGTACGTTAAACGTTACATGATGTACCAGCAGGGCTG
CATGGCCGGTGGAACCGTTCTTAGACTCGCTAAAGACCTGGCGGAAAATAATAAAGGCGCGCGCGTGCTGGTAGTTTGTTCCGAGATTACCGCCGTCACCT
TCCGCGGCCCGACGGATACGCATCTGGATTCGTTGGTTGGGCAGGCGCTGTTTGGCGATGGAGCGGCCGCAGTGATCGTCGGCTCAGACCCGGTACCCGA
AATTGAAAAACCAATTTTTGAACTGGTGTGGACGGCGCAAACCATCGCGCCAGATAGTGAAGGTGCGATTGATGGCCATCTCCGTGAGGTGGGATTAACA
TTCCATCTTCTTAAAGATGTCCCGGGTATTGTGTCTAAAAACATCGATAAGGCACTGACCGAAGCGTTTCAACCACTTGGTATCTCGGACTACAACTCCATCT
TCTGGATCGCGCACCCTGGCGGTCCTGCCATTTTGGACCAGGTGGAACAGAAACTGGCGTTAAAGCCGGAGAAAATGAAAGCCACCCGTGATGTTCTGAG

212
CGATTACGGCAATATGTCCTCGGCGTGCGTCCTATTTATTCTCGATGAAATGCGGAAAAAGTCCGCCCAGGACGGCCTGAAAACCACAGGTGAAGGCCTC
GAGTGGGGAGTGCTGTTCGGTTTCGGCCCGGGACTTACTATCGAAACCGTTGTGCTCCACTCGGTGGCGATCTAATCGAAGAGACCC

>15_HaCHS

GGTCTCACATATGGTGACCGTTGAAGAAGTCCGTAAAGCCCAGCGCGCCGAGGGTCCAGCAACGGTGATGGCAATTGGCACCGCGGTCCCGCCGAA
CTGCGTCGATCAGGCGACCTATCCGGATTATTATTTTCGCATCACCAACAGCGAGCATAAAGCTGAGTTGAAGGAAAAATTCCAGCGTATGTGTGATAAAA
GCCAGATCAAAAAACGCTATATGTATCTGAACGAAGAGGTACTGAAAGAAAATCCCAATATGTGCGCCTACATGGCGCCATCTCTGGATGCTCGTCAGGAT
ATCGTGGTCGTAGAGGTACCAAAACTGGGCAAAGAGGCCGCGGTGAAAGCGATTAAAGAGTGGGGTCAGCCGAAATCGAAAATCACTCACCTGGTCTTT
TGTACAACATCTGGTGTGGATATGCCGGGGGCCGATTATCAGCTGACCAAATTACTAGGGCTGCGTCCGAGTGTCAAGCGACTGATGATGTACCAGCAGG
GCTGCTTCGCTGGTGGGACTGTGCTGCGCCTCGCAAAAGACCTGGCGGAAAACAACAAAGGCGCACGCGTACTTGTGGTATGTAGTGAAATTACCGCCGT
CACCTTCCGCGGCCCGACCGATACCCACCTTGATAGTTTGGTGGGACAAGCTTTGTTTGGCGATGGCGCGGCAGCGATCATTATTGGGAGTGATCCGATCC
CTGAGGTTGAGAAACCACTTTTTGAACTGGTGTCGGCGGCACAGACCATCCTGCCAGACAGCGAAGGGGCCATTGATGGGCATCTGCGTGAAGTTGGACT
GACCTTTCATCTCCTCAAAGATGTCCCTGGTTTAATCAGCAAAAATGTGGAAAAGTCGCTGACAGAAGCCTTTAAACCGCTGGGTATATCGGACTGGAACA
GTTTGTTCTGGATCGCGCATCCAGGTGGGCCAGCGATCCTTGACCAGGTCGAAGCTAAGCTGTCGTTAAAGCCGGAAAAATTACGTGCGACCAGACACGT
CTTGTCTGAATACGGCAACATGTCCTCCGCCTGCGTATTGTTTATTCTGGATGAAATGCGCCGTAAGTCGAAAGAAGATGGTCTGAAAACGACTGGCGAAG
GCATTGAATGGGGCGTGCTTTTCGGATTCGGCCCGGGTCTAACGGTAGAAACCGTGGTGTTACACTCTGTCGCCATTAACTAATCGAAGAGACCC

>16_MdCHS1

GGTCTCACATATGGTCACGGTGGAAGAAGTGCGTAAAGCACAACGCGCGGAAGGCCCGGCGACCGTGATGGCGATTGGCACGGCAACGCCAAGTA
ACTGCGTCGACCAGGCAACCTATCCGGACTACTATTTCCGCATCACGAACTCCGAACATAAAGTTGAGCTGAAAGAAAAATTCCAGCGTATGTGCGATAAA
TCGATGATTAAAAAACGTTATATGTACCTGACTGAAGAGATTCTAAAGGAAAACCCGAGCGTGTGTGAATACATGGCACCGTCCATTGATGCTCGTCAGGA
TATGGTGGTGGTGGAAGTGCCGAAACTTGGCAAAGAGGCGGCAACCAAAGCCATCAAAGAATGGGGCCAGCCGAAATCAAAAATCACCCATCTGGTTTTC
TGCACCACGTCTGGGGTCGATATGCCGGGTGCTGATTACCAATTAACGAAACTACTTGGATTGCGCCCCAGCGTGAAGCGGCTGATGATGTATCAGCAGG
GCTGCTTTGCCGGCGGCACCGTATTGCGCCTGGCGAAAGATTTAGCAGAAAATAATAAAGGTGCGCGCGTTCTGGTAGTCTGTTCAGAAATTACAGCGGTT
ACCTTTCGTGGCCCGAGTGATACCCACCTGGACAGCTTGGTTGGGCAGGCGTTATTCGGCGATGGCGCAGCGGCGGTGATCATTGGGGCTGACCCGGTGC
CGGAAGTTGAAAAACCGTTGTTTGAACTGGTGAGCGCCGCACAGACCATCCTGCCCGATTCCGATGGTGCAATCGACGGTCACCTGCGCGAAGTAGGTCT
GACCTTCCATTTGCTGAAAGACGTACCAGGTCTGATCAGCAAAAATATTGAAAAGTCGCTAAATGAAGCATTTAAACCGATCGGCATATCGGACTGGAACA
GCTTGTTCTGGATCGCCCATCCCGGTGGTCCCGCTATTCTGGATCAGGTGGAAGCGAAGCTCGCATTAAAACCTGAAAAACTGGAAGCTACGAGACAGGTT
CTATCAGACTATGGCAATATGAGCTCTGCCTGTGTCCTGTTTATTCTTGATGAAGTCCGTCGTAAGTCTGCTGAGAAAGGCTTAAAAACGACAGGTGAAGG
GCTGGAGTGGGGAGTGTTGTTTGGTTTCGGTCCTGGCCTCACTGTGGAAACCGTTGTGCTGCATTCGGTGGGATTGACAGCTTAATCGAAGAGACCC

>17_MdCHS2

GGTCTCACATATGGTGACCGTCGAAGAAGTGCGTAAAGCACAACGCGCAGAAGGTCCCGCTACCGTATTAGCTATTGGTACGGCAACGCCGCCAAAC
TGTGTCGATCAGGCAACTTATCCGGATTACTATTTCCGTATTACCAACAGCGAACATAAAACCGAACTGAAAGAGAAATTCCAGCGTATGTGCGATAAATC
GATGATCAAGACTCGTTATATGTATCTGACTGAGGAAATTCTGAAAGAAAATCCGACGGTGTGTGAATACATGGCGCCGTCACTGGACGCACGTCAGGAT
ATGGTAGTGGTAGAAGTCCCGCGACTAGGCAAAGAGGCCGCCACCAAAGCCATTAAAGAATGGGGTCAGCCGAAAAGTAAAATCACTCATCTGGTGTTTT
GCACCACTAGCGGTGTTGACATGCCGGGGGCCGACTATCAGTTGACTAAGCTGCTGGGTCTGCGACCGTCTGTGAAAAGATTGATGATGTACCAGCAGGG
CTGCTTCGCCGGGGGCACCGTTCTTCGCCTGGCGAAAGATCTCGCGGAAAACAACAAAGGTGCACGCGTGCTGGTCGTATGTAGTGAAATCACCGCGGTG
ACATTTCGCGGCCCCTCTGACACGCACCTGGATAGTTTAGTCGGCCAGGCGCTGTTTGGCGATGGAGCCGCTGCGGTCATCATTGGGAGCGACCCCGTTCC
GGAAGTTGAAAAGCCGCTGTTTGAACTAGTCAGTGCCGCTCAAACCATTCTCCCCGATTCCGACGGCGCGATTGATGGTCACTTGCGTGAAGTGGGGCTAA
CATTCCATCTCCTCAAAGACGTGCCGGGCCTGATTTCAAAAAACATTGAAAAATCCTTAAATGAAGCGTTTAAACCCATTGGCATCTCGGACTGGAACTCGT
TATTCTGGATTGCGCATCCGGGTGGCCCGGCGATCCTAGACCAGGTGGAATCCAAGCTTGCGTTAAAACCTGAAAAACTGGAAGCGACCCGCCAGGTATT
GTCCGATTATGGGAATATGAGCTCCGCCTGCGTTTTGTTTATTCTTGATGAGGTACGGCGGAAGTCAGCTGAAAAAGGATTGAAAACGACTGGCGAAGGC
CTGGAGTGGGGCGTGCTGTTTGGTTTTGGCCCAGGCTTGACAGTAGAAACCGTGGTGCTGCATTCTGTAGGTGCCTAATCGAAGAGACCC

>18_MsCHS

GGTCTCACATATGGTTTCTGTTTCAGAAATTCGCAAAGCGCAGCGGGCTGAGGGTCCGGCGACCATTTTGGCTATCGGTACAGCCAACCCTGCCAACT
GCGTGGAACAGTCCACCTATCCGGATTTTTACTTTAAAATCACGAACAGCGAACATAAAACCGAACTGAAAGAGAAATTTCAGCGGATGTGCGATAAAAGT
ATGATTAAAAGGCGCTATATGTACCTGACTGAAGAAATCCTGAAGGAAAATCCGTCGGTCTGCGAGTATATGGCTCCAAGCCTTGATGCGCGTCAGGACAT
GGTGGTCGTCGAAGTGCCGCGGTTGGGCAAAGAAGCCGCAGTGAAAGCCATCAAAGAATGGGGGCAACCGAAATCGAAAATCACCCATTTAATTGTTTG
CACCACGAGTGGTGTGGATATGCCGGGCGCAGATTACCAGCTAACGAAACTGCTGGGGCTCAGACCCTATGTTAAACGTTACATGATGTATCAGCAGGGC
TGTTTTGCCGGCGGCACTGTACTGCGTCTAGCGAAAGATTTAGCCGAAAACAATAAAGGTGCGCGCGTACTAGTAGTATGTTCAGAGGTCACTGCGGTCAC
CTTCCGGGGGCCGAGCGATACCCACCTGGATTCACTTGTGGGTCAGGCGCTTTTTGGCGACGGCGCGGCAGCCCTTATCGTCGGTTCAGACCCGGTACCA
GAAATAGAAAAACCAATTTTTGAAATGGTCTGGACGGCACAGACCATCGCTCCAGATAGCGAAGGGGCGATTGATGGTCATCTGCGTGAAGCAGGCCTTA
CCTTTCATCTGCTAAAAGATGTTCCTGGCATCGTTTCAAAAAACATCGACAAAGCTCTGGTTGAAGCGTTCCAGCCGCTGGGTATCTCCGACTACAACAGTA
TTTTCTGGATCGCCCACCCGGGGGGGCCAGCGATCCTCGATCAGGTTGAGCAAAAACTTGCACTGAAACCGGAAAAAATGCGCGCGACGCGTGAAGTCCT
TAGTGAATATGGTAATATGAGTTCAGCCTGTGTGCTCTTTATCCTGGATGAGATGCGTAAAAAATCAACCCAGGATGGGTTAAAAACGACTGGCGAAGGTC
TGGAGTGGGGCGTTTTGTTTGGCTTTGGTCCAGGCCTGACGATCGAAACCGTGGTGCTTCGGAGTGTTGCCATTTAATCGAAGAGACCC

>19_PcCHS

GGTCTCACATATGGCGAATCATCATAATGCCGAAATCGAAGAGATCCGCAACCGTCAGCGCGCGCAGGGGCCGGCTAACATTTTAGCCATCGGCACG
GCCACTCCTTCTAACTGCGTGTATCAAGCGGATTATCCGGACTATTACTTTCGCATTACCAACAGCGAACATATGACCGATCTTAAACTGAAGTTTAAACGTA
TGTGTGAAAAAAGCATGATCCGTAAACGTTATATGCATATCACCGAAGAATATCTTAAGGAGAACCCGAACGTCTGCGCCTATGAAGCCCCTAGCTTAGAT
GCGCGGCAGGATCTCGTTGTGGTGGAGGTGCCGCGTCTTGGTAAAGAAGCGGCCAGTAAAGCGATTAAAGAATGGGGCCAACCCAAAAGCAAAATCACC
CACTTAATATTCTGCACCACGTCCGGAGTTGATATGCCAGGAGCCGATTATCAGCTTACCAAACTACTCGGCCTGCGCCCTTCGGTGAAACGCTTTATGATG
TATCAGCAGGGCTGTTTTGCGGGCGGCACCGTCCTGCGTCTGGCAAAAGATCTGGCGGAAAACAATGCGGGGGCGCGTGTTCTTGTTGTCTGTTCAGAAA

213
TTACGGCGGTGACATTCCGTGGGCCATCCGATTCTCATCTTGACAGCCTCGTCGGGCAGGCGCTGTTTGGCGATGGTGCTGCTGCAGTTATTCTAGGCTCC
GATCCGGACCTGAGCGTCGAACGTCCGCTGTTTCAGCTGATTTCCGCGGCTCAAACGATTTTGCCGGATTCCGATGGTGCCATTGACGGCCACCTTCGCGA
AGTGGGTCTGACCTTCCATTTGCTGAAGGATGTGCCGGGGCTGATCTCAAAAAATATTGAAAAATCCCTGAAAGAGGCGTTTGGCCCGATCGGCATCAGC
GACTGGAATTCGTTGTTCTGGATTGCACATCCGGGCGGTCCAGCTATTCTCGATCAGGTTGAACTGAAACTTGGCCTAAAAGAAGAGAAAATGCGCGCAAC
GCGCCAGGTCTTGTCAGATTACGGTAATATGAGCAGTGCCTGTGTCCTCTTTATCCTGGATGAAATGCGTAAAAAATCAATAGAAGAAGGCAAAGCCACGA
CCGGCGAAGGGCTGGACTGGGGAGTCCTTTTCGGCTTCGGCCCCGGCCTAACTGTGGAAACGGTTGTTCTGCATTCAGTTCCAGCGACCTTTACCCATTAA
TCGAAGAGACCC

>20_PhCHS1

GGTCTCACATATGGTGACCGTGGAAGAATATCGCAAAGCGCAGCGTGCAGAAGGTCCTGCGACGGTGATGGCAATCGGTACGGCCACACCAACCAA
CTGCGTTGATCAAAGCACTTACCCGGACTATTATTTCCGTATTACCAATAGTGAGCACAAAACCGATCTGAAAGAAAAATTTAAACGGATGTGTGAAAAAA
GCATGATCAAAAAACGCTATATGCATCTGACCGAAGAGATATTGAAGGAAAATCCTTCAATGTGCGAGTACATGGCGCCCAGCTTGGACGCCCGCCAGGA
TATTGTCGTCGTGGAAGTTCCGAAGCTTGGCAAAGAGGCGGCACAGAAAGCGATTAAAGAATGGGGGCAACCGAAAAGCAAAATCACTCATCTGGTATTT
TGCACAACGAGCGGTGTGGATATGCCGGGCTGCGATTACCAGTTGACCAAACTCTTAGGTCTGCGTCCTAGCGTTAAACGTCTGATGATGTATCAGCAGGG
ATGCTTTGCTGGAGGAACAGTGCTACGGCTAGCTAAAGATTTGGCCGAAAACAACAAAGGCGCGCGGGTTCTGGTCGTTTGCTCCGAAATCACCGCAGTA
ACCTTTCGCGGTCCGAACGATACCCACCTTGATTCCCTGGTGGGGCAGGCGCTGTTCGGCGATGGTGCCGGCGCCATTATCATCGGCTCCGATCCGATTCC
CGGTGTAGAACGTCCACTCTTTGAATTAGTGAGTGCGGCGCAAACGCTATTGCCTGACAGCCACGGCGCTATTGATGGCCACCTGCGCGAAGTGGGTTTG
ACATTCCATTTATTGAAAGACGTTCCAGGATTGATTTCGAAAAATATTGAAAAAAGTCTGGAAGAAGCCTTCCGCCCCCTGAGCATTTCTGACTGGAACTCC
TTGTTCTGGATCGCTCATCCGGGTGGCCCGGCGATTTTGGATCAGGTGGAGATTAAGCTGGGCCTCAAACCGGAAAAGCTAAAAGCCACCCGTAATGTGC
TTAGCAACTACGGCAATATGAGTAGCGCTTGCGTACTGTTTATTCTTGATGAAATGCGTAAAGCGTCTGCAAAAGAGGGCTTAGGTACCACCGGTGAAGGC
CTGGAGTGGGGCGTCCTGTTTGGCTTTGGGCCGGGACTGACGGTTGAAACCGTGGTGCTGCATTCTGTGGCAACGTAATCGAAGAGACCC

>21_PhCHS1-F165M

GGTCTCACATATGGTGACAGTAGAAGAATATCGCAAAGCCCAACGCGCCGAAGGTCCGGCAACTGTGATGGCAATCGGCACAGCGACACCGACCAA
CTGCGTAGATCAGTCAACTTATCCGGACTATTATTTCCGCATTACAAACAGCGAGCATAAAACCGATCTCAAAGAGAAATTTAAACGCATGTGTGAAAAATC
GATGATCAAAAAACGTTATATGCATTTAACTGAAGAGATATTGAAAGAAAACCCGTCCATGTGCGAATACATGGCACCATCTCTCGATGCGCGTCAGGATA
TCGTGGTGGTCGAAGTGCCGAAGCTGGGGAAAGAGGCAGCACAAAAAGCTATCAAAGAATGGGGACAGCCGAAAAGTAAAATCACCCATCTGGTTTTTT
GCACCACCTCAGGTGTCGATATGCCGGGTTGTGATTATCAACTAACAAAATTACTGGGCCTGCGCCCAAGTGTGAAGCGCCTGATGATGTATCAGCAAGG
GTGCATGGCCGGTGGCACCGTGTTGAGGCTGGCGAAAGACCTTGCTGAAAATAATAAAGGCGCCCGGGTACTGGTCGTCTGTTCCGAAATTACTGCCGTT
ACATTTCGCGGCCCGAATGATACCCACCTCGATTCTTTGGTCGGTCAGGCGTTGTTTGGTGACGGCGCGGGTGCCATTATCATTGGCAGCGATCCGATCCC
GGGCGTAGAACGCCCGTTGTTTGAGCTAGTAAGCGCGGCGCAAACCCTACTCCCGGATAGCCATGGCGCAATTGATGGCCACCTGAGGGAAGTAGGTCTG
ACCTTCCACCTTTTGAAAGATGTACCTGGCCTGATTTCAAAAAATATTGAAAAAAGCCTGGAGGAAGCCTTTCGTCCGCTGTCAATCTCTGACTGGAACAGC
CTCTTCTGGATTGCGCATCCGGGTGGTCCCGCAATTCTGGACCAGGTGGAAATCAAGCTTGGGCTAAAACCGGAAAAGCTGAAAGCGACTCGCAACGTTC
TGAGCAATTATGGCAATATGTCGTCTGCCTGCGTGCTTTTTATCCTAGATGAAATGCGTAAAGCATCTGCGAAGGAGGGGCTGGGAACCACGGGCGAAGG
CTTAGAGTGGGGCGTGCTGTTCGGCTTCGGTCCCGGCCTTACGGTTGAAACCGTCGTGCTGCATTCCGTCGCCACGTAATCGAAGAGACCC

>22_PhCHS2

GGTCTCACATATGGTGACAGTTGAAGAATACCGTAAAGCACAACGCGCGGAAGGGCCGGCAACCGTGATGGCCATTGGTACGGCGACCCCGACCAA
CTGCGTTGATCAGTCGACCTATCCGGATTACTATTTCCGTATTACCAACAGTGAACATAAAACCGATCTCAAAGAGAAATTCAAACGTATGTGTGAAAAGTC
GATGATCAAGAAACGATACATGCACCTGACCGAAGAAATTCTGAAAGAAAATCCGAGCATGTGCGAATATATGGCGCCATCGCTGGATGCGCGTCAGGAT
ATCGTCGTGGTGGAAGTGCCGAAACTGGGTAAAGAAGCGGCGCAGAAAGCGATTAAAGAGTGGGGGCAACCAAAAAGCAAAATTACGCATTTATTTTTC
TGCACCACCAGCGGCGTTGATATGCCGGGCTGCGATTACCAGTTAACCAAATTGTTAGGACTGCGGCCCAGCGTGAAACGCCTGATGATGTATCAGCAGG
GCTGTTTCGCTGGTGGGACAGTATTGCGGCTGGCAAAAGATCTGGCTGAAAACAACAAAGGTGCACGAGTACTGGTGGTGTGCAGCGAGATTACTGCTGT
AACCTTCCGCGGCCCGAACGATACTCACTTGGACTCACTTGTGGGGCAGGCGCTGTTTGGTGATGGTGCCGGGGCGATTATTATCGGCTCTGATCCGATTC
CCGGTGTCGAGAGGCCTCTTTTTGAACTGGTGAGTGCAGCGCAAACGCTGCTGCCGGACAGCCACGGTGCCATCGACGGTCATCTGCGCGAGGTGGGTCT
TACCTTTCATTTGTTAAAAGACGTGCCGGGGCTTATCTCGAAAAATATTGAAAAATCACTAGAAGAGGCATTTAAACCGCTGGGAATTTCCGACTGGAACA
GCTTGTTCTGGATTGCGCACCCGGGTGGCCCAGCTATCTTGGATCAAGTCGAAATCAAATTAGGCCTGAAACCGGAAAAATTAAAAGCCACGCGCAACGT
GCTTAGCGATTATGGCAACATGAGCTCCGCCTGTGTGCTGTTTATCCTCGATGAAATGCGCAAAGCGTCGGCTAAGGAAGGCCTAGGCACGACCGGCGAA
GGTCTGGAATGGGGCGTGCTGTTCGGTTTTGGCCCTGGTCTAACCGTAGAGACTGTCGTGTTGCACTCCGTCGCGACCTAATCGAAGAGACCC

>23_PpCHS

GGTCTCACATATGGCGTCGGCAGGCGATGTGACGCGCGCGGCGCTCCCGCGTGCTCAGCCGCGCGCAGAGGGTCCGGCCTGCGTCCTTGGCATTGG
CACCGCGGTCCCCCCCGCAGAGTTTTTACAGAGCGAATACCCGGATTTCTTTTTCAATATTACCAACTGCGGCGAAAAAGAGGCGCTGAAAGCGAAATTTA
AACGGATTTGCGATAAGAGCGGTATTCGCAAACGCCATATGTTTTTGACGGAAGAAGTCTTAAAAGCCAATCCGGGCATCTGTACCTATATGGAACCGTCG
CTAAACGTGCGTCACGATATTGTGGTGGTTCAGGTGCCGAAACTGGCTGCGGAAGCCGCGCAAAAGGCGATTAAAGAATGGGGCGGCCGAAAAAGCGAT
ATCACGCATATTGTCTTTGCCACCACGTCGGGTGTGAACATGCCGGGCGCTGATCATGCGCTGGCAAAACTACTCGGTCTGAAACCAACCGTGAAGCGGGT
GATGATGTATCAGACAGGCTGCTTCGGTGGTGCATCAGTGCTGCGCGTAGCGAAAGATCTGGCCGAGAACAACAAAGGCGCACGCGTCTTAGCGGTTGC
ATCTGAGGTCACAGCGGTGACATACCGGGCACCCTCTGAAAACCATCTCGACGGTTTAGTAGGTAGTGCACTCTTTGGTGATGGCGCCGGTGTTTATGTTG
TTGGATCCGATCCGAAGCCAGAAGTTGAAAAGCCGCTGTTTGAAGTCCACTGGGCGGGCGAGACTATACTGCCGGAATCTGACGGCGCGATCGATGGTCA
TCTTACTGAAGCGGGCTTGATCTTCCATCTGATGAAAGACGTTCCGGGGCTGATCAGCAAAAACATCGAGAAATTCCTGAACGAAGCACGTAAACCGGTCG
GTAGCCCAGCCTGGAATGAAATGTTCTGGGCAGTGCATCCTGGCGGCCCGGCCATTCTGGACCAGGTCGAAGCTAAACTGAAGTTAACCAAAGATAAAAT
GCAGGGGTCCCGTGATATCCTTTCCGAGTTTGGCAATATGAGTTCAGCTTCGGTCTTGTTTGTGCTGGATCAGATCCGCCATCGCTCCGTGAAAATGGGCG
CATCTACGCTGGGTGAAGGCAGTGAATTTGGTTTTTTTATCGGCTTCGGACCTGGTTTGACCCTGGAAGTGTTGGTACTGCGTGCGGCACCGAACAGTGCG
TAATCGAAGAGACCC

>24_SbCHS2b

214
 GGTCTCACATATGGTTACGGTGGAAGAATTCCATCGTGCTACCCGCGCCGAAGGTCCTGCGACCGTACTGGCAATTGGCACTGCGAACCCGCCGAAC
TGCGTTGAGCAATCTACCTATGCCGATTACTACTTTCGAATTTGCAAAAGCGAACACCTGACCGATCTCAAGAAAAAATTTGATCGTATGTGCGAAAAGTCC
TGTATTAAAAAACGTTATATGCATTTAACCGAAGAGTTCCTGAAAGAGAACGATAACTTCACCGCCTATGAAGCGCCTTCCCTGGATGCCCGCCAGGATATC
GTTGTAGTAGAAATCCCGAAACTTGGCAAGGAAGCAGCACAGAAAGCCATCAAAGAGTGGGGCCAGCCTAAGAGTAAAATCACCCATGTGATCTTTTGCA
CCACCTCCGGCGTCGATATGCCTGGGGCTGATTATCAAATCACCAAACTGCTCGGTTTACGCCCTTCTGTGAAACGCTTTATGATGTATCAGCAGGGCTGCT
TTGCCGGCGGCACAGTGCTGCGCATGGCGAAAGATCTGGCGGAAAACAACGCCGGAGCGCGGGTCCTGGTGGTGTGTTCTGAAATTACGGCGATTACCTT
CCGCGGTCCGAGCGACACGCACCTCGATTCGCTGGTTGGTCAGGCGCTGTTCGGTGATGGAGCTGCTGCGGTAATTGTGGGGAGCGATCCGATTGTAGG
GGTTGAACGTCCACTCTTCCAGCTTGTATCCGCGGCGCAAACCATCTTGCCAGACTCTGAAGGGGCTATCGATGGCCACGTACGCGAAGTTGGGCTTACTT
TTCATCTGCTGAAAGATGTTCCGGGATTAATCAGCAAAAATATTGAAAAATCGTTGAAAGAAGCCTTTGCGCCACTGGGCATTAGCGACTGGAATTCTCTCT
TCTGGATTGTTCACCCGGGTGGCCCGGCGATCCTTGATCAGGTTGAAGAGAAGCTGGGTTTGAAACCGGAAATTATGGTGCCGACACGTCATGTCTTAAGT
GAGTACGGGAATATGTCGTCAGCTTGTGTCCTTTTTGTGATGGATGAAATGCGCAAAGCGTCGGCAAAAGACGGCTGTACCACTACCGGCGAAGGCAAAG
ACTGGGGTGTGTTATTTGGTTTTGGCCCAGGCTTGACGGTCGAAACGGTTGTGCTGCACAGCGTACCGCTGAACTAATCGAAGAGACCC

215
Annexe 3 : Structure des 18 flavonoïdes actifs

216
 Annexe 4 : Liste des flavonoïdes commandés chez Extrasynthèse :

Name Providerr Reference

Apigenin-7-O-glucoside Extrasynthese 1004 S
7,8 Dihydroxyflavone Extrasynthese 1013
Eupatorin Extrasynthese 1014
3-Hydroxyflavone Extrasynthese 1026
Hyperoside Extrasynthese 1027 S
Dihydrorobinetin Extrasynthese 1037
Flavanone Extrasynthese 1038
7-Hydroxyflavone Extrasynthese 1060
6-Methoxyflavanone Extrasynthese 1079
Pinocembrin-7-methylether Extrasynthese 1095
Acacetin Extrasynthese 1101 S
Diosmetin Extrasynthese 1108 S
Hesperidin Extrasynthese 1116 S
Homoeriodictyol Extrasynthese 1118 S
Isosakuranetin Extrasynthese 1122 S
Luteolin Extrasynthese 1125 S
Naringin Extrasynthese 1129 S
Rhamnetin Extrasynthese 1136 S
Datiscetin Extrasynthese 1141 S
Liquiritigenin Extrasynthese 1150 S
Naringenin-7-O-glucoside Extrasynthese 1160 S
Fisetin Extrasynthese 1167 S
Baicalein Extrasynthese 1171
2'-Hydroxyflavanone Extrasynthese 1180
4'-Hydroxyflavanone Extrasynthese 1181
6-Hydroxyflavanone Extrasynthese 1182
3-Methoxyflavone Extrasynthese 1188
7-Methoxyflavonol Extrasynthese 1194
3',4'-Dihydroxyflavone Extrasynthese 1204
7-Hydroxyflavanone Extrasynthese 1212
Sakuranetin Extrasynthese 1247 S
Resokaempferol Extrasynthese 1251
7-Hydroxyflavonol Extrasynthese 1258
7-Methoxyflavone Extrasynthese 1289
3,7-Dihydroxy-3',4',5'-trimethoxyflavone Extrasynthese 1293
5,7-Dimethoxyflavanone Extrasynthese 1296
3',4'-Dimethoxyflavone Extrasynthese 1297
Wogonin Extrasynthese 1304 S
3',4',7,8-Tetrahydroxyflavone Extrasynthese 1307
3',4',7-Trihydroxyisoflavone Extrasynthese 1309
Isorhamnetin Extrasynthese 1120 S

217
Baicalein-5,6,7-trimethylether Extrasynthese 1323
Genistin Extrasynthese 1325 S
Quercetin-3-O-glucopyranoside Extrasynthese 1327 S
Ipriflavone Extrasynthese 1328
5-Methyl-7-methoxyisoflavone Extrasynthese 1329
Morin Extrasynthese 1344 S
3,6-Dihydroxyflavone Extrasynthese 1345
Dihydromyricetin Extrasynthese 1351
Chrysin Extrasynthese 1362 S
Gossypetin-8-O-glucuronide Extrasynthese 1364 S
Syringetin Extrasynthese 1239 S
Daidzein Extrasynthese 1370 S
Daidzin Extrasynthese 1371 S
Genistein Extrasynthese 1372 S
Bavachin Extrasynthese 1374

218
Titre : Découverte de nouvelles molécules antibiotiques et caractérisation de leurs modes d’action
Mots clés : Bacillus subtilis, Flavonoïdes, Activité antibactérienne, Mécanisme d’action
Résumé : Les flavonoïdes sont des métabolites
secondaires largement répandus chez les plantes et
appartiennent à une grande famille de composés
chimiques d'intérêt industriel. Les flavonoïdes sont
une source importante de nouveaux médicaments et
nutraceutiques en raison de leurs activités anti-
oxydantes, antivirales, antimicrobiennes, anti-
cancéreuses et immunosuppressives. Notre étude se
concentre sur la caractérisation de l'activité anti-
bactérienne des flavonoïdes ciblant spécifiquement
les bactéries à Gram positif. Les objectifs de mon
travail de recherche sont i) de mettre en place des
méthodologies de cribles efficaces et rapides afin
d’évaluer l’activité antibactérienne des flavonoïdes
et ii) de déterminer les mécanismes d'action anti-
bactérien des flavonoïdes. La caractérisation de
l'activité antibactérienne des flavonoïdes a été
réalisée avec des tests de toxicité des flavonoïdes
envers la bactérie modèle à Gram positif B. subtilis
par la méthode du Live Cell Array permettant
d'enregistrer la cinétique de croissance bactérienne
en temps réel. Différentes stratégies ont été
employées pour décrypter le(s) mode(s) d'action des
flavonoïdes ; telles que le crible d'une banque de
flavonoïdes pour l'identification de nouveaux
composés actifs contre la bactérie modèle à Gram
positif Bacillus subtilis, le crible d'une collection de
mutants de B. subtilis pour l'identification de gènes
impliqués dans la réponse de B. subtilis aux flavo-
noïdes, une évolution dirigée en laboratoire de B.
subtilis en présence de flavonoïde pour l'obtention et
la caractérisation de souches résistantes aux
flavonoïdes, et enfin une analyse de la réponse
transcriptionnelle de B. subtilis en présence de
flavonoïdes. Deux flavonoïdes déjà identifiés dans la
littérature pour inhiber la croissance de bactéries à
Gram positif, la pinocembrine et la naringénine, ont
une activité antibactérienne contre B. subtilis. Une
diminution de 50 % du taux de croissance a été
observée en présence de 93 mg.L-1 ou 32 mg.L-1 de
naringénine ou pinocembrine respectivement. Pour
la première fois, nous avons démontré un effet additif
de ces deux composés vis-à-vis de B. subtilis.
Université Paris-Saclay
Espace Technologique / Immeuble Discovery
Route de l’Orme aux Merisiers RD 128 / 91190 Saint-Aubin, France
Pour décrypter les mécanismes d'action des
flavonoïdes, une collection de 63 flavonoïdes a été
criblée et les concentrations minimales inhibitrices
(MICs) déterminées pour chaque flavonoïde en
présence de B. subtilis. 17 flavonoïdes se sont
avérés particulièrement actifs contre B. subtilis,
incluant le résokaempférol, la bavachine et la 2’-
hydroxyflavanone avec des MICs compris entre 20
et 31 mg.mL-1. La tentative d'établir un modèle
QSAR (relation quantitative structure-activité)
avec les 17 flavo-noïdes actifs n'a
malheureusement pas été con-cluante car malgré
l'obtention d'une régression linéaire largement
acceptable (R2≈ 0,9), la validation par exclusion
systématique d'un composé ("leave one out") n'a
pas été obtenue. La seule explication plausible de
cet échec est que le nombre de modes d'action
présents est trop élevé pour un set de 17 composés,
rendant ainsi caduque la modélisation QSAR. Au
cours d'un crible de 67 mutants de B. subtilis, huit
gènes impliqués dans la réponse aux flavonoïdes
(narin-génine et pinocembrine) ont été identifiés,
dont deux appartiennent au régulon LmrA/QdoR,
déjà identifié dans la littérature pour répondre aux
flavonoïdes. Les souches B. subtilis ∆lmrA et
∆qdoI sont respectivement plus sensibles et plus
résistantes vis-à-vis de la naringénine et de la
pinocembrine. Les 17 flavonoïdes précédemment
identifiés et actifs envers B. subtilis induisent une
réponse transcriptionnelle propre à chacun d'après
notre analyse de l'activité de 10 promoteurs avec
l'utilisation de fusions transcriptionnelles avec un
gène rapporteur. Cette analyse est cohérente avec
l'étude transcriptomique menée pour la caracté-
risation de la réponse de B. subtilis en présence de
5 flavonoïdes ; la 2’hydroxyflavanone, la bava-
chine, la naringénine, la pinocembrine et le réso-
kaempférol. De ce travail ressort plusieurs modes
d'action des flavonoïdes chez B. subtilis, impli-
quant l'induction de la réponse stringente, l'inhibi-
tion de voies métaboliques pour la synthèse des
membranes et paroi cellulaires et l'inhibition du
métabolisme carboné central.
Title: Discovery of novel antibiotics and characterization of their mode of action
Keywords: Bacillus subtilis, Flavonoids, Antibacterial activity, Mechanism of action
Abstract: Flavonoids are secondary metabolites
widespread in plants and belong to a large family of
chemical compounds of industrial interest.
Flavonoids are an important source of new drugs and
nutraceuticals because of their antioxidant, antiviral,
antimicrobial, anticancer and immunosuppressive
activities. Our study focuses on the characterization
of the antibacterial activity of flavonoids specifically
targeting Gram-positive bacteria. The objectives of
my research work are i) to establish efficient and
rapid screening methodologies to evaluate the
antibacterial activity of flavonoids and ii) to
determine the mechanisms of action of antibacterial
flavonoids. The characterization of the antibacterial
activity of flavonoids was carried out with flavonoid
toxicity tests against the Gram-positive model
bacterium B. subtilis by Live Cell Array method,
which measures the bacterial growth kinetics.
Several strategies were used to decipher the mode(s)
of action of the flavonoids, such as screening a
flavonoid library for new compounds active against
the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis,
screening a collection of B. subtilis mutants for the
identification of genes involved in the flavonoid
response of B. subtilis, an adaptive laboratory
evolution of B. subtilis in presence of flavonoid to
obtain and characterize flavonoid-resistant strains,
and finally an analysis of the transcriptional response
of B. subtilis in the presence of flavonoids.
Two flavonoids already identified in the literature to
inhibit the growth of Gram-positive bacteria,
pinocembrin and naringenin, have antibacterial
activity against B. subtilis. A 50% decrease in growth
rate was observed in the presence of 93 mg.L-1 or 32
mg.L-1 of naringenin or pinocembrin respectively.
Moreover, for the first time, we demonstrated an
additive effect of these two compounds against B.
subtilis. To decipher the mechanisms of action of the
flavonoids, a collection
Université Paris-Saclay
Espace Technologique / Immeuble Discovery
Route de l’Orme aux Merisiers RD 128 / 91190 Saint-Aubin, France
of 63 flavonoids was screened and minimal
inhibitory concentrations (MICs) were determined
for each flavonoid in the presence of B. subtilis. 17
flavonoids were found to be particularly active
against B. subtilis, including resokaempferol,
bavachine and 2'-hydroxyflavanone with MICs
ranging from 20 to 31 mg.mL-1. The attempt to
establish a QSAR (quantitative structure activity
relationship) model with the 17 active flavonoids
was unfortunately not conclusive because, despite
obtaining a high quality linear regression (R2 ≈
0.9), cross-validation by using leave-one-out basic
method was not obtained. The only plausible
explanation for this failure is that the number of
modes of action present is too high for a set of 17
compounds, thus rendering the QSAR model
obsolete. In a screen of 67 mutants of B. subtilis,
eight genes involved in the response to flavonoids
(naringenin and pinocembrin) were identified, two
of which belong to the LmrA/QdoR regulon,
already identified in the literature to respond to
flavonoids. The B. subtilis strains ∆lmrA and ∆qdoI
are respectively more sensitive and more resistant
to naringenin and pinocembrin. The 17 flavonoids
previously identified and active against B. subtilis
induce a flavonoid-specific transcriptional
response according to our analysis of the activity of
10 promoters with the use of transcriptional fusions
with a reporter gene. This analysis is consistent
with the transcriptomic study carried out for the
characterization of the response of B. subtilis in the
presence of 5 flavonoids; 2'hydroxyflavanone,
bavachine, naringenin, pinocembrin and
resokaempferol. Several modes of action of the
flavonoids in B. subtilis were identified, involving
induction of the stringent response, inhibition of
metabolic pathways for cell membrane and cell
wall synthesis, and inhibition of central carbon
metabolism.