BIOTECHNOLOGIE

PHARMACEUTIQUE
De l’éprouvette au produit final

PHA 2501: Sciences Pharmaceutiques II

Alain Garnier, Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB), génie

chimique, PROTEO, Hiver 2010

La totalité du matériel présenté est disponible à l’adresse web:

http://www.gch.ulaval.ca/agarnier/
 Définition et contexte

 Biotechnologie: l’application de la science et de la

technologie aux organismes vivants, à d’autres
matériaux vivants ou non vivants, pour la production
de savoir, biens et services. (source: OCDE)

 Traditionnelle: Utilisation de micro-organismes et

d’enzymes sélectionnés pour produire des agents
d’intérêt; Isolation d'agents à partir de sources
biologiques.

 Contemporaine: Utilisation de micro-organismes et

d’enzymes modifiés, directement ou non, pour
produire des agents d’intérêt.
Les médicaments d'origine biologique

 Traditionnels:
 D'origine animale: produits sanguins, hormones,

stéroïdes, catécholamines, prostaglandines,

anticorps, insuline, vaccins…
 D'origine végétale: alcaloïdes, flavonoïdes,

méthylxanthines, terpénoïdes, glycosides

cardiotoniques et coumarines, ac salicylique…
 D'origine microbienne: antibiotiques, enzymes,

protéases, vaccins, …
 D'origine virale: vaccins
 Les médicaments d'origine biologique (suite)

 Biopharmaceutique: substance utilisée à des fins thérapeutiques

ou diagnostiques, à base d'acides nucléiques ou de protéines,
produites par des moyens autre que l'extraction directe d'une
source biologique non-modifiée.
 Exemples:
 Facteurs sanguins (facteurs VIII et Factor IX)
 Agents trombolytiques (activateur tissulaire du plasminogène)
 Hormones (insuline, hormone de croissance, gonadotrophine, etc)
 Facteurs de croissance (cytokines, interférons (IFN), interleukines
(IL), érythropoïétine (EPO), facteur de croissance des colonies, …)
 Vaccins (méningocoque, influenza, antigène de surface de
l'hépatite B, …)
 Anticorps monoclonaux
 Autres (facteur de nécrose tumorale, plasmides, vecteurs viraux,
microARN, ARNi, …)
 Seulement 12% des nouveaux médicaments
sont produits par synthèse/extraction

35% 34%
30%
25%
21% 22%
20%
%
15%
12% 12%
10%
5%
0%
Cell. Mam. Microbe Vaccins Extr/Synthèse Thérapie
génique

% de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)

Plan
 Cibles
 Sources
 Produits/caractérisques
 Méthodes analytiques
 Développement de systèmes de production
 Construction/sélection

 Procédés de production

 Procédés de séparation
 Cibles des biopharmaceutiques
DIAGNOSTIC/THÉRAPIE

ADN Dépistage/
thérapie génique

Transcriptome/
ARN
ARNi

traduction

Protéome/
PROTÉINE Anticorps,
hormones…
Syst immunitaire/vaccin
Francis Crick, 1958 (source: NCBI) Métabolisme/ Thérapie cellulaire
Sources de biopharmaceutiques
 Virus
 Bactéries
 Levures
 Moisissures
 Cellules animales
 Invertébrés
 Mammifères
 Primates non-humains
 Humaines
 Lignées établies
 Cultures primaires
 Cellules souches
 Les virus

Vaccins ou vecteurs de
thérapie génique

Vaccins - exemples: Influenza

• Influenza (GSK)
• Adénovirus 4 & 7 (Wyeth Pharma
pour DoD, 105-106 doses
• Aussi: variole, rubéole, rougeole, oreillons,
varicelle, hépatite, polio, rage, fièvre jaune,
encéphalite japonaise, cancer, etc
Herpes Adenovirus
Maladies traitées par thérapie génique
Vecteurs utilisés
Type de gènes employés
Phases cliniques
 La thérapie génique

Rétrovirus
Adénovirus

La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel

génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche.
Adénovirus: cycle d’infection
Adénovirus: les gènes

B Massie, IRB
Adénovirus: évolution des vecteurs

B Massie, IRB
Adénovirus: construction

R. Gilbert, IRB
Adénovirus: production et utilisation

B Massie, IRB
 Rétrovirus

- Rétrovirus s’insère dans le génome de la cellule hôte

- 3 familles de gènes: gag = capside, pol = polymérase, env = enveloppe
- On manipule la protéine d’enveloppe pour altérer le tropisme du virus
Rétrovirus: cycle de réplication
Rétrovirus: construction de lignée
de production
 Les autres outils génétiques

 Diagnostic
 Patron de digestion par enzymes de restriction
 Séquençage
 Hybridation
 FISH
 Gene chip
 qRT-PCR
 Autres phénomènes
 Épigénétique
 ARNi
 Techniques analytiques:
L’identification de séquences d'ADN

La digestion de l'ADN avec des enzymes de

restriction, suivi d'une électrophorèse permet une
identification par la différence de taille des
Tiré de Microbiology 101, WSU fragments
L’identification de séquences (suite)

En réalisant des PCR sur des

fragments d'ADN en
présence de
désoxynucléotides et une
alternance de
didésoxynucléotides, on
parvient à complètement
séquencer l'ADN
 Hybridation fluorescente in situ (FISH)

LE FISH est une technique de

biologie moléculaire d'hybridation in
situ utilisant des sondes marquées à
l'aide d'un marqueur fluorescent et
utilisées sur des coupes en
microscopie.

Ces sondes peuvent être utilisées

sur de l'ADN ou de l'ARN (sonde
ADN), ou sur des protéines (sonde
anticorps). Le FISH est une
technique de cytogénétique
permettant de voir des éléments à
l'intérieur de la cellule.
 L'expression des gènes: les biopuces

1- Comparaison de l’expression
génétique de 2 échantillons
cellulaires
2- Extraction de l ’ARN
3- Réverse transcription avec des
nucléotides marqués par des
fluorochromes différents
4- Hybridation compétitive sur des
lamelles contenant des milliers
d’oligonucléotides différents
connus
5- Lecture des lamelles
6- Analyse des résultats
Les biopuces (suite)

Joe DeRisi et al., Stanford U., 6116 gènes (cliquez sur les images
pour une explication détaillée).
quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)

Cliquez sur l'image pour un lien vers une simulation de la PCR

quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)
 Épigénétique
• Le terme épigénétique définit les modifications
Phénomènes
transmissibles et réversibles de l'expression des gènes ne
s'accompagnant pas de changements des séquences épigénétiques
nucléotidiques. Les changements peuvent se produire
spontanément, en réponse à l'environnement, à la •Paramutations
présence d'un allèle particulier, même si celui-ci n'est plus •Bookmarking
présent dans les descendants •Imprinting
• Certains caractères épigénétiques hérités pouvaient être •Gene silencing
transmis lors de la réplication cellulaire (méiose), voire •X chromosome
subsister d'une génération à l'autre pour des organismes
inactivation
multicellulaires.
• Les phénomènes épigénétiques constituent un •Position effect
programme qui déciderait quels gènes activer ou inhiber. •Reprogramming
L’environnement influence ces signaux épigénétiques qui •Transvection
peuvent ainsi subir de petits changements. Ces •Effet maternel
épimutations sont plus fréquentes que les mutations
classiques de l’ADN.
L’ARN anti-sens, interférent, micro-ARN

(Pour plus de détails, cliquez ici)

 Exemple 1: Infectio Diagnostic

 Originalement Infectio Diagnostic, puis GeneOhm

Sciences et maintenant Becton Dickinson (BD)
Diagnostics à Québec:
 Identification génétique de bactéries pathogènes,

de gènes de toxines et de gènes de résistance

(Strep B, SARM, …)
 Basé sur la sensibilité, la spécificité et l'ubiquité de

l'amorce PCR
 Temps du test ≈1 hr
 Exemple 2: Diagnocure

La plate-forme technologique PCA3, un gène dont l'ARN messager est détecté dans la majorité des
cancers de la prostate chez l'humain. Le même ARN messager n'est exprimé qu'à un très faible
niveau dans la prostate normale et est absent des autres tissus normaux. PCA3 peut donc servir
de marqueur tumoral et les molécules dérivées de sa séquence, ARN messager ou peptide,
peuvent servir à la mise au point de divers produits de diagnostic ou de thérapie. La découverte
du gène PCA3 est le fruit d'une collaboration entre DiagnoCure et l'Université de Nijmegen et
DiagnoCure détient des droits mondiaux sur cette plate-forme technologique.

La technologie DiagnoGeneMC est l'association de technologies pour la détection d'acides nucléiques

et de séquences de gènes spécifiques au cancer. Les produits dérivés de cette plate-forme
technologique contiennent trois trousses utilisées selon un protocole en trois phases. Une trousse
contient des billes de silice pour la purification des acides nucléiques de la préparation cellulaire
analysée. Une autre trousse contient des amorces, des séquences d'acides nucléiques spécifiques
au cancer investigué, et les réactifs nécessaires à l'amplification isothermique des ARNs
messagers isolés avec la première trousse et complémentaires aux amorces fournies. La
troisième trousse sert à la détection immunoenzymatique du produit amplifié. Cette plate-forme
technologique peut donc servir à la mise au point de trousses de détection de tout cancer pour
lequel on connaît une séquence spécifique. Dans le cadre de l'accord de licence avec Organon
Teknika, DiagnoCure détient des droits mondiaux sur les technologies Boom et NASBA, pour tous
les cancers.
Les protéines recombinantes (PR)
 1ère: insuline dans E. coli (1982, Ely Lilly)
 73 sur le marché en 2004, >80 en essais
cliniques
 Croissance de 65% entre 2004 et 2010
(52G$/2010)
 Insuline+EPO+IFN = 57% du marché
 Protéines glycosylées = 60% du marché des
PR, principalement mAb
 Les anticorps

Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec
un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de
polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa
(chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de
l’anticorps pour son antigène
 Anticorps monoclonaux - applications

 37% des nouvelles molécules thérapeutiques

biologiques
 Identification/diagnostic
 Thérapeutique:
 Contre cancer, Crohn, Asthme, Psoriasis, SIDA,...
 Dirigés contre une protéine spécifique, ils peuvent
bloquer une interaction récepteur-ligand ou
déclencher une réponse immunitaire.
 Ils peuvent aussi être liés à un agent
chemothérapeutique, radioactif ou autre pour
augmenter leur effet.
 Exemple: Agent anti-angiogénétique
(Laboratoires Aeterna)

Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux

vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la
tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce
processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron
de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes
responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des
micro-organismes.
 Les cellules thérapeutiques

 Cellules du sang: cellules souches hématopoïétiques, Lymphocytes,

Mégakaryocytes, plaquettes (Hema-Québec)
 Cellules musculaires (myoblastes, Jacques Tremblay, CHUL)
 Cellules épithéliales (peau, vaisseaux sanguins, Hopital du Saint-
Sacrement, LOEX)
 Cellules souches d'adulte et embryonnaire (Réseau canadien sur les
cellules souches, http://www.stemcellnet.ca): travaux sur le
traitement du diabète, la maladie de Parkinson, l'insuffisance
cardiaque, la dystrophie musculaire, la cécité, etc
Les cellules souches hématopoïétiques
Les cellules souches embryonnaires
Les cellules souches adultes
Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD)

• Prévalence: 1 garçon/3500
• Espérance de vie ≈ 20 ans
Thérapie cellulaire de la DMD
 Essais cliniques phase 1
 3x1010 cellules/kg à traiter
 Équivalent: 100g muscle donneur /kg à
traiter
 Multiplication in vitro incontournable
 Volumes de culture: 30L/kg à traiter
 Prérequis:
 Milieu de culture efficace et sécuritaire
 Bioprocédé à grande échelle (en
développement)
 Caractéristiques des protéines: épissage

Exemple: Nyman et al (1998), "Identification of

nine interferon-a subtypes produced by Sendai
virus induced human peripheral blood
leucocytes". Biochem J, 329:295-302.
Source: U Miami, cours BIL150
Caractéristiques des protéines: structure

Thèse PhD, François

GUILLONNEAU, 2002
Caractéristiques des protéines: les
modifications post-traductionnelles
•Clivage
•Pont S
•méthylation, phosphorylation,
glycosilation
•conformation
•ajout de ligands spécifiques (lipid
anchor)

Tiré de PHK
Analyses protéique et cellulaire
 Analyse de protéines
 activité
 ELISA
 Électrophorèse 1D, 2D, capillaire
 Chromatographie liquide (HPLC)
 Spectrométrie de masse
 Analyse cellulaire:
 Immuno-histo-chimie
 Cytométrie en flux
 Imagerie cellulaire en temps réel
 Systèmes robotisés
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
 Électrophorèse sur gel

SDS-PAGE
Transfert sur
membrane de
nitrocellulose et
révélation avec
marqueur spécifique:

Western: EP +
anticorps spécifiques
à protéines

Southern: EP + ADN
marqué

Northern: EP + ARN
marqué
 Électrophorèse SDS-PAGE
Tiré de Segura, Garnier et al
(2007). Figure 2. Fractionation of
purified retroviral vector
preparations by 1D Gel
Electrophoresis
Purified virus preparations with (a) and
without (b) subtilisin treatment were
fractionated on a 4-12% Tris-Glycine
polyacrylamide gel (Invitrogen) run
under reducing conditions and visualized
by silver staining. Protein bands from
gel b were excised and subjected to in-
gel tryptic digestion prior to MS/MS
analysis. Bands containing statistically
significant peptide identifications (A-L)
are indicated on gel b. Figure 2c shows
the protein profiles of samples a (green)
and b (blue) superimposed. The
theoretical migration positions of all
MoMLV viral-encoded proteins are
indicated in figure c.
Gel d’électrophorèse 2-D

(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)

 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

•Automatique •Échange d’ions

•Réfrigéré •Tamis moléculaire
•Interaction hydrophobe
•Phase inverse
Échantilloneur •Électrophorèse
Réservoir de Pompe Colonne Détecteur
Phase mobile

Échantillon Collecteur de fraction

•En fonction •UV/visible

•Fluorescence
de la colonne •Infra-rouge
•Gradient •Indice de réfraction
•Conductivité
•Spectrométrie de
masse
Hydrolysat trypsique de la BSA
 Spectrométrie de masse (MS) - interface

 L'électro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI)

"Make elephants fly", Prix Nobel de Chimie 2002: John B Fenn

 MS – domaines d'application

L'électro-atomisation à pression atmosphérique (API-electrospray) permet l'analyse de protéines

MS - analyseurs

Constitué de:
1) une source d'ionisation
2) un ou plusieurs
analyseurs qui séparent
les ions produits selon
leur rapport m/z
3) un détecteur qui compte
les ions et amplifie le
signal
4) un système informatique
pour traiter le signal

Secteur magnétique
MS - Quadrupole

 m/z 10-4000
 Précision :~m/z 0.1-0.2
 Vitesse de balayage: 5000 m/z
par sec
 Le temps de vie d’un ion de sa
formation à sa détection ~40-
100 μs.

www.bris.ac.uk
 MS - Temps d’envol (TOF)

 L’incorporation d’un
réflectron dans le tube du
TOF ou une extraction
ionique délayée (Cornish et Cotter, 1994;
Cotter et al., 2004)

 TOF est communément

employé avec MALDI, il peut
aussi être utilisé avec un ESI
(Boyle et Whitehouse, 1992)

www.chemistry.adelaide.edu.au
LCMS – exemple d'appareil

Agilent 1100 MSD: API-ES, quadrupole

MS – exemple de résultat

•Myoglobine, MM= 16951 Da

•Le résultat obtenu est un spectre
de masse représentant les rapports
m/z des ions détectés sur l'abscisse
et l'abondance relative de ces ions
sur l'ordonnée
•Le spectre est le résultat de la
distribution de charges sur la
population moléculaire
•Permet d'analyser qualitativement
et quantitativement la protéine
d'intérêt
 Analyse de protéines par MSMS

Nomenclature de la dissociation en
MS spectrum fragments proposée par Roepstorff, 1984

m/z

MS/MS ion
spectrum

m/z

(Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002)

Exemple d'analyse MSMS

 Albumine

Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L), souvent utilisée en

milieu de culture de cellules de mammifères
 Exemple d'analyse MSMS

 Albumine

>P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine).

MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF
DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP
ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY
ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA
RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE
CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR
HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK
LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL
NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP
DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA

Number of amino acids: 594 Molecular weight: 68026.9 Theoretical pI: 5.77

Informations obtenues sur Expasy (www.expasy.org)

 Albumine: fragments trypsiques
position mass peptide sequence position mass peptide sequence

25-28 500,2463 DTHK 300-309 1177,5591 ECCDKPLLEK

29-34 712,3736 SEIAHR 310-318 1015,4877 SHCIAEVEK

37-44 974,4577 DLGEEHFK 319-336 1955,9596 DAIPENLPPLTADFAEDK

45-65 2435,2427 GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK 341-346 752,3573 NYQEAK

66-75 1163,6306 LVNELTEFAK 347-359 1567,7427 DAFLGSFLYEYSR

76-88 1349,546 TCVADESHAGCEK 361-371 1283,7106 HPEYAVSVLLR

89-100 1362,6722 SLHTLFGDELCK 375-386 1388,5708 EYEATLEECCAK

101-105 545,3405 VASLR 387-399 1497,6314 DDPHACYSTVFDK

106-117 1364,4803 ETYGDMADCCEK 402-412 1305,7161 HLVDEPQNLIK

118-122 658,3155 QEPER 413-420 1011,42 QNCDQFEK

123-130 977,4509 NECFLSHK 421-433 1479,7954 LGEYGFQNALIVR

131-138 886,4152 DDSPDLPK 438-451 1511,8427 VPQVSTPTLVEVSR

139-151 1519,7461 LKPDPNTLCDEFK 460-468 1052,4499 CCTKPESER

157-160 537,282 FWGK 469-482 1667,8131 MPCTEDYLSLILNR

161-167 927,4934 YLYEIAR 483-489 841,46 LCVLHEK

169-183 1888,9268 HPYFYAPELLYYANK 490-495 660,3563 TPVSEK

184-197 1633,6621 YNGVFQECCQAEDK 499-507 1024,455 CCTESLVNR

198-204 701,4014 GACLLPK 508-523 1823,8996 RPCFSALTPDETYVPK

205-209 649,3338 IETMR 524-528 609,2878 AFDEK

212-218 703,4097 VLASSAR 529-544 1850,8993 LFTFHADICTLPDTEK

223-228 649,3338 CASIQK 549-557 1014,6193 QTALVELLK

229-232 508,2514 FGER 558-561 509,3194 HKPK

236-241 689,3729 AWSVAR 562-568 818,4254 ATEEQLK

249-256 922,488 AEFVEVTK 569-580 1399,6926 TVMENFVAFVDK

257-263 789,4716 LVTDLTK 581-587 725,2593 CCAADDK

267-280 1578,5981 ECCHGDLLECADDR 588-597 1050,4924 EACFAVEGPK

281-285 517,298 ADLAK 598-607 1002,583 LVVSTQTALA

286-297 1386,6206 YICDNQDTISSK

Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique
ANALYSE MS2, Identification de
cliquez ici protéine, cliquez ici
(Logiciel Mascot, Matrix Science)
 Protéomique du sérum sanguin

•60 à 80 g/L de protéine

(Tirumalai et al., 2003)
•10 000 protéines différentes
•22 protéines = 99% de la
quantité protéinique du
sérum (Zhang et al., 2005)
•12 log de variation de
concentration (Anderson et
Anderson, 2002; Zhang et
al., 2005)
•325 protéines identifiées en
2003 (Pieper et al.,
Proteomics, 3: 1345-1364)
•3020 protéines identifiées en
2005 (Omenn et al.,
Proteomics, 5:…)
Tirumalai et al., 2003
Protéomique du sérum sanguin

Anderson et Anderson, 2002

 Analyse cellulaire
Le compteur de Coulter enregistre un signal provoqué par une
modification du champ électrique établi au travers d’un orifice au travers
duquel un fluide contenant les particules est aspiré. Ce signal est
proportionnel au volume des particules.

Exemple: distribution de tailles de particules

pour deux échantillons différents
 Immuno-histo-chimie

Technique utilisant des

anticorps spécifiques liés à
des fluorochromes pour
mettre en évidence une
protéine présente sur une
cellule ou un tissu.
L'échantillon est par la suite
observé en microscopie à
fluorescence

Distribution d'histones, de peroxisomes, et d'actine dans une culture de cellules

Vero, Olympus
Cytométrie en flux

Technique permettant
d'analyser des cellules à
grande vitesse en les faisant
passer une à une dans le
faisceau d'un laser. La
lumière ré-émise (par
diffusion ou fluorescence)
permet de classer la
population suivant plusieurs
critères et de les trier.

En anglais: Flow cytometry

ou Fluorescence Assisted Cell
Sorting (FACS)
Exemple de cytométrie en flux
Imagerie cellulaire en temps réel

Chambre thermostatée,
humidifiée et à
concentration en CO2
controlée, montée sur la
platine du microscope

Exemple: suivi de la
division et de la
polyploïdisation de cellules
mégakaryocytaires sur 12
hrs (cliquez ici)
 Sytèmes robotisés

 Composés:
 D'unités de gestion des liquides (Liquid
handling stations)
 De bras robotisés
 D'incubateurs automatisés
 De lecteurs
(Système Xiril, cliquez ici)
Développement de systèmes de production

 Établissement de lignées cellulaires

 Construction/sélection
 Procédés de production
 Procédés de séparation
Types de cellules animales
 Culture primaire: Culture initiale de cellules qui
viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée.
Généralement à attachement obligatoire (ADC).
 Culture secondaire: Propagation d’une culture
primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être
cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée
de vie limitée (30-50 divisions).
 Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire
transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée
de vie illimitée.
Différentes lignées

 MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains,

adhérentes, vaccins
 HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes,
recherche
 CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension,
versatile
 Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile
 Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression
baculovirus
 HEK-293: embryon de rein humain, transformée par fragment
d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension
(293S)
Exemple: historique du développement de
la lignée HEK-293

Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977

 La construction d'un système d'expression
– transformation/transfection/transduction
• Introduction d'ADN exogène sous la forme
d'un plasmide dans des cellules procaryotes
(transformation) ou eucaryotes (transfection)
•
Les cellules manipulées pour accepter un
ADN étranger sont dites compétentes

• Différentes méthodes:
• Phosphate de Calcium
• Liposomes
• Polycations (ex: polyéthylène imine,
PEI; DEAE-Dextran)
• Électroporation
• Gene gun
• Transduction: introduction d'ADN exogène
par le biais d'un virus (procaryote)

•STABLE OU TRANSITOIRE

Access Excellence
La cassette d'expression

• Composé de un ou plusieurs gènes et des séquences

contrôlant leur expression
• Promoteur (constitutif; inductible: lac, cumate, T,
etc; tissu spécifique)
• Phase ouverte de lecture (Open reading frame)
• Séquence de polyadénylation (PolyA)
• Transactivateurs
• Gènes de résistance ou reporteur (LacZ, GFP, …)
Des Internal Ribosome Entry Sites (IRES) peuvent être
intercalés entre plusieurs ORFs
Autre exemple: la co-transfection d’un plasmide et d’un
adénovirus dans la lignée cellulaire 293 pour produire un
adénovirus recombinant:

B. Massie, IRB
Sélection (Screening)

• Commencer par une expression transitoire

• Sélectionner en fonction:
• Résistance à l'agent de sélection
• Le niveau d'expression du gène reporteur ou de la
protéine d'intérêt
• La stabilité de l'expression
• La qualité du produit (analyse crystalographique, RMN,
MS, patrons de glycosylation, activité, stabilité,
pharmacocinétique)
 Les systèmes d’expression

• Modifications post-
 Bactéries (1-3 um) traductionnelles + poussées
 Levures • Produit plus stable
• Milieu de culture +
 Fungi
complexe
 Cellules animales (10-20 um) • + grande fragilité des
cellules
• Coûts + élevés
• Produits à + haute valeur
ajoutée
Critère de sélection: choisir le système le plus
simple qui va faire le travail!
 Exemple de milieu de culture de cellules de mammifères:
Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM)

 Sels (mg/L)  Méthionine 30.00

 Phenylalanine 66.00
 CaCl2 200.00
 Serine 42.00
 Fe(NO3)3.9H2O 0.10
 Thréonine 95.00
 KCl 400.00
 Tryptophane 16.00
 MgSO4 97.67
 Tyrosine.2Na.2H2O 104.00
 NaCl 6400.00
 Valine 94.00
 NaHCO3 3700.00
 NaH2PO4.H2O 125.00  Vitamines (mg/L)
 Acides aminés (mg/L)  Ca.pantothénate 4.00
 Chlorure de choline 4.00
 Arginine 84.00
 Acide folique 4.00
 Cystine.2HCl 63.00
 Inositol 7.20
 Glutamine 584.00
 Niacinamide 4.00
 Glycine 30.00
 Riboflavine 0.40
 Histidine 42.00
 Thiamine.HCl 4.00
 Isoleucine 105.00
 Pyridoxine.HCl 4.00
 Leucine 105.00
 Lysine.HCl 146.00  Autres (mg/L)
 Méthionine 30.00  Glucose 4500.00
 Phenylalanine 66.00  Rouge de phénol 15.00
 Sérine 42.00  Na.Pyruvate 110.00
+ composants non-définis: sérum sanguin (5-15%), cocktail de facteurs de croissance, etc.
 Comparaison des différents
systèmes d’expression

X (densité Oxygen Vitesse Coût du milieu

cellulaire) respiration rate d’agitation
(OUR, mM/L)
Bactéries 5-50 gMS/L 50-500 500-700 rpm 1-5$/L

Cellules 1-50 x106 0.1-10 20-120 rpm 25-1500$/L

animales cells/mL
(≈0,2-10 gMS/L)
 Difficulté supplémentaire
 Temps de division augmente avec la taille:
 Les cellules animales nécessitent des conditions d’asepsie très

strictes
 Adhésion obligatoire:
 Certaines lignées de cellules de mammifères nécessitent un

support pour être viables. Cela:

 pose un problème de mise à l ’échelle
 les rend particulièrement susceptibles au cisaillement

Ex: tapis cellulaire de myoblastes Culture sur microporteurs

 Exemple: Culture de myoblastes
- test de différents microporteurs

Comparaison de différents types de microporteurs

2,00E+06
# cellules/ml

Cytodex 1
1,50E+06
Cytodex 3
1,00E+06 Texcel
Autosuture
5,00E+05

0,00E+00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Temps (jour)

Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001),

"Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91
(1):63-74.
Culture de myoblastes - transfert
de particule à particule
1.0

Myoblast density [x 10 cells/mL]

6

0.5

100-mL spinner flasks

500-mL spinner flasks
0.0
0 5 10
Time [d]

Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001),

"Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91
(1):63-74.
La production

 Le bioréacteur
 Les paramètres
 Les cinétiques de croissance des
micro-organismes et de production
 Les modes de production
 Bioréacteurs

Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB, U. Laval) Gracieuseté B.Braun

Bioréaction: les paramètres

 Température
 pH
 composition du milieu
 Agitation
 Aération
 Asepsie
Contrôle des paramètres

F
p
H O
2
N
2
CO2
T Air
pH
O
2
Lecture
T
RPM Contrôle
Optimisation des paramètres
Effet de la température sur la production
d’adénovirus recombinant en 293S

100

80

60
Relative titer

40

20

0 20 40 60 80

time (hpi)
T=32°C T=35°C T=37°C T=39°C

Jardon et Garnier, 2000

 Les cinétiques de croissance et de
production
Le modèle le plus simple:
dX
 X (bilan sur les cellules)
dt
 S
  MAX (cinétique de Monod)
Ks  S
dS 
 X (bilan sur le substrat)
dt Yx / s
dP dX (modèle de Luedeking-Piret pour le produit)
  X
dt dt
 K S  YX / S  X MAX   X   K S  YX / S   ( X MAX  X ) 
   ln       ln     MAX  t La solution
 X MAX   X 0   X MAX   ( X MAX  X 0 ) 

   X  X 
P  P0    X  X 0  K S  Yx / s  ln  MAX      X  X 0 
 MAX   MAX
X  X 0 

X: concentration cellulaire; S: concentration en substrat limitant; P: concentration en produit d’intérêt; : taux spécifique de
croissance; max et Ks: paramètres de l ’expression de Monod; Yx/s: coefficient de rendement cellule/substrat; , : coefficient de la
relation de Luedeking-Piret. S0 et X0, sont les concentrations en substrat et en cellules initialement. Xmax = Yx/s * S0+X0.
 Simulation à partir d’un modèle simple

X, S et P vs t
concentration (g/L)

25
20 X
15
S
10
5 P
0
0 2 4 6 8
temps (h)

Cuvée, MAX = 1,16h-1, KS = 4 g/L, YX/S = 0,5 g/g,  = 0,4 g/g,  = g/(g.h)
 Autres cinétiques

 Inhibition par le substrat:

 MAX  S
 2
KS  S  S
Ki

 Inhibition par le produit:

 MAX  S

K S  S 1  P 
 Ki 

 ...
 Les modes d’opération

Cuvée (batch)

Cuvée-alimentée
(fedbatch)

Chemostat filtrat

X, P
Perfusion
Culture en perfusion
1000

Relative Fluorescence Unit

800

[ RFU ]
600

400

200

0
0 20 40 60 80
Time [ hpi ]

Figure 4. Fluorescence of 293S cells during

infection with adenovirus: , Control; ,
B1 Perfusion 35oC; , B2 Perfusion 35oC; ,
B3 Perfusion 37oC; X, T-flask.
Cortin et al., 2002
Le traitement en aval (downstream processing)

 Les étapes
 séparation
 homogénéisation
 concentration
 purification
 Séparation/Clarification

Objectif: séparer les cellules du surnageant et conserver la

fraction d’intérêt selon que le produit est intracellulaire ou
extracellulaire
Les méthodes usuelles:
centrifugation
micro-filtration (0,1-0,45 um)

Filtres à fibres creuses (AG tech)

Grande échelle = filtration tangentielle

Principe de centrifugation en continu

 Homogénéisation

 Objectif: briser les cellules pour récupérer un

produit intra-cellulaire
 Moyen:
 Gel/dégel
 Ultrason
 contraintes (stress) hydrodynamiques
 Concentration

Objectif: réduire le volume

Moyens:
Précipitation
Ultra-centrifugation
Ultra-filtration (5kDa - 500kDa)

AG technologies
 Purification

Objectif: Isoler le
produit d’intérêt

Moyen:
chromatographie

Access Excellence
 Purification (suite)
3 types de chromatographie:

Access Excellence
 Le contrôle de qualité

 Les molécules biopharmaceutiques sont soumises aux

mêmes normes que la fabrication de molécules de
synthèse:
 Bonnes pratiques de fabrication (GMP)

 Protocoles d’opération normalisés (SOP)

 Validation des procédés
 Documentation
 Ces normes sont appliquées de façon encore plus stricte
pour les produits biologiques étant donné que les
réactions menant à la formation du produit (le
métabolisme cellulaire) ne sont pas bien définies.
 Le contrôle de qualité (suite)

 Toute une série de normes, lignes directrices et de «points à

considérer » sont émis par le « Center for Biologics Evaluation
and Research » (CBER) de la Food &Drug Administration »
(FDA) http://www.fda.gov/cber/
 Les sections 210, 211 et 600 du titre 21 du "Code of Federal
Regulations" (CFR)
 "Guidelines" et "point to consider » particulièrement pertinents:
 "Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy"
 "Point to consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventative
Infectious Disease Indications"
 A proposed Approach to the Regulation of Cellular and Tissue-
based Products
 Le contrôle de qualité (suite)

 Classent le processus de production GMP en 7

catégories:

 Installation
 Équipement
 Personnel
 Matériels
 Protocoles
 Tests
 Documentation