Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
- 4/1973
O)
LU
Of
RADIOIMMUNOASSAYS
Principe
et
Techniques
A. M. REUTER J. C. HENDRICKX P. FRANCHIMONT
AVRIL 1973
I.R.E. does not assume any liability with respect to the use of, or
for damages resulting from the use of any information, apparatus,
method or process disclosed in this document.
Adresse proviioire ( l.R.E, (c/o SCK/CEN) - Boeretang 200 B 2400 MOL Tl. Affalrta courantes j fA ) (02)708238
Voorlopia adres ( B,| o i u m Tel Lopende zaken (> 1 4 >3ia0f (9 L ) Commandai Radioisotop t C 0 2 ) 7 0 9 2 9 3
Baatallingan Rsdloisotopan \ r n 1 4 )32576
I. R. E. - 4 1973
RADIOIMMUNOASSAYS
Principe
et
Techniques
A. M. REUTER (*) J. C. HENDRICKX (**) P. FRANCHIMONT (***)
AVRIL 1973
Rsum
Samenvatting
Summary
Deux grandes techniques sont actuellement utilises : l'une est base sur les antignes
marqus, l'autre sur les anticorps marqus.
I. La technique originale de BERSON reste encore la plus gnrale. Elle est base sur la
comptition entre un antigne marqu Ag* et un antigne non marque Ag pour un anti-
corps spcifique Ab.
Ag* + Ag + Ab ^ Ag* Ab + Ag Ab
Si l'antigne marqu est ajout en quantit constante ainsi que l'anticorps, l'antigne non
marqu dterminera la quantit d'antigne marqu lie aux anticorps.
Aq* Ab
Le rapport ^-t sera d'autant plus faible que la quantit d'hormone non marque
Ag
ajoute au milieu d'incubation sera plus leve.
Pour raliser un dosage il faut donc d'abord tablir une courbe standard en portant en
ordonne l'activit du complexe Ag*Ab et en abscisse la quantit progressivement crois-
sante d'antigne non marque ajoute au milieu d'incubation. Lorsque la solution d'anti-
gne non marque est remplace par un srum ou un milieu biologique dont on dsire
connatre le taux en antigne, il suffit de dduire de la courbe la concentration en antigne
correspondant l'activit du complexe Ag*Ab mesure dans ce cas (fig. 1).
Les conditions indispensables la ralisation d'un dosage radioimmunologique sen-
sible et prcis ont t dcrites par YALOW et BERSON (2). FELBER et coll. (3),
FRANCHIMONT (4). .
Elles sont :
1
2. U possibilit ils marquer l'antigne i hauts activit spcifique
Pour obtenir une sensibilit suffisante, il est vident que la quantit d'antigne marqu
ne doit pas tre trop importante compare la quantit d'antigne non marqu. Il faut
donc marquer l'antigne une activit spcifique suffisante. Le marquage s'effectue
gnralement par l'iode radioactif ' : -l et -) I et la technique la plus utilise est la tech-
nique de GREENWOOD et coll. (5). Le Nal marqu est d'abord oxyd par la chlora-
mine T qui agit comme I'hypochlorite :
La raction suivante consiste en une substitution de l'I cationique sur les groupes
tyrosifes des protines.
Assez rcemment. THORELL et JOHANSSON (6) ont dcrit une technique enzymatique
pour marquer des protines et polypeptides haute activit spcifique en utilisant la
lactoperoxydase. Cette mthode permet de rduire la di turation de protines. Elle
n'est cependant pas applicable en prsence d'azide de sodium souvent prsent dans
les prparations commerciales d'hormones.
3. Una bonne mthode de sparation de l'hormone libre et de l'hormone fixe aux anti-
Diffrentes mthodes ont t proposes pour sparer l'hormone marque libre et l'hor-
mone marque fixe aux anticorps.
A. L'lectrophorse
B. L'imn' inoprcipitation
W
Ag* + Ab Ag* Ab
Dans !a deuxime faon, on ajoute des y globulines normales et une plus forte
concentration en anti G pour raliser l'quivalence (ta quantit d'Ag* Ab est ngli-
geable devant les y globulines normales et ne modifie pas la zo^e d'quivalence).
\
CH-OH CK-0 R : O, R
| + CN2r | C = NH + H 2 N - 6 - p r o t i n e - > j ^ - - N --protine
CH-OH H-O^ H CH-0 H
/
Cette technique particulirement lgante et rapide (elle peut tre ralise en une
seule tape et ne requiert qu'un jour d'incubation) prsente cependant des inconv-
nients majeurs. Lors du couplage, l'anticorps perd une grande partie de son immu-
noractivit. Ainsi, le rendement de couplage considr, non pas comme la qualit
de protine fixe (qui elle est gale 95 % ) , mais au nombre d'incubations pou-
3
vant tro ralises avec 1 ml d'anticorps, n'est que de 20 % par rapport la
mthode du double anticorps . La sensibilit du dosage est moins grande (fig. 4)
et l'influence des protines sriques est trop importante (30 50 %) (fig. 5).
(A. M. REUTER et coll.) (8).
Les antiserums obtenus ne peuvent tre utiliss que si le corportement des deux
hormones vis--vis de ces antiserums est identique. Il en est de mme lorsqu'on
utilise deux hormones d'une mme espce mais d'un tissu diffrent. Cette situation
se retrouve lors du dosage de la LH hypophysaire en utilisant de la LH chorionique
(HCG pour l'immunisation) (fig. 6).
Pour terminer, nous devons dire quelques mots d'une technique plus rcente de dosage
radioimmunologique qui utilise les anticorps marquas.
Ag + Ab* ^ Ag Ab*
Les anticorps marqus purifis sont incubs avec la solution contenant l'hormone
doser. I! se forme un complexe antigne-anticorps. Les anticorps libres sont limins
par un large excs d'immunosorbant hormone. La radioactivit du surnageant est en
relation directe avec la quantit d'hormone prsente dans le milieu (fig. 8).
Une quantit constante d'un immunosorbant anticorps est incube avec la solution con-
tenant l'hormone doser. L'immunosorbant est alors centrifug et lav puis incub
avec des anticorps marqus purifis. Un complexe se forme avec la phase solide. Aprs
centrifugation et lavage, le prcipit est compt.
Ces mthodes utilisant des anticorps peuvent accrotre nettement la sensibilit du dosage
radioimmunologique. Elles ncessitent un peu plus de manipulations, la stabilit des anti-
corps marqus est parfois moins bonne que celle des antignes et l'influence des proti-
nes sriques n'est pas ngligeable.
Voici en rsum les principaux problmes que nous rencontrons dans la prparation de
trousses pour le dosage radioimmunologique. Ils sont dterminants dans le choix d'une
mthode de dosage adquate mais ils peuvent varier d'un antigne l'autre.
5
BIBLIOGRAPHIE
(4) FRANCHIMONT, P.
Ann. Biol. Clin. 28, 3 (1970)
(10) WIDE, L.
Acta Endocr. (Kbh) Suppl. 142, 207 (1969)
^ ,. STH
I
Fig. 4. Comparaison de deux courbes talon obtenues en utilisant la mme hormone LH marque et froide, le mme
antisrum mais deux mthodes de sparation diffrentes
Il
Fig. 6. La LH et la HCG non marques diminuent de faon identique le pourcentage de LH marque qui se fixe
aux anticorps HCG (fig. de droite) ; il n'en est pas de mme lorsque l'on utilise de la HCG marque
(figure de gauche). Il parait donc exister dans cet antisrum deux populations diffrentes d'anticorps.
reproduit de (4)
III
Fig. 8. Radioactivit compte dans le surnageant en fonction de la concentration en LH standard prsente dans le
milieu d'incubation.
IV
Fig. 10. Radioactivit fixe sur l'immunoadsorbant en fonction de la concentration de PTSH standard prsente
dans le milieu d'incubation.