DES de pathologie :

Pathologie moléculaire

Du gène à la fonction

J.F. Emile
Service de pathologie, Hôpital Ambroise Paré, APHP
Faculté de Médecine Paris-Ile de France Ouest, UVSQ
et INSERM U602
 Pathologie moléculaire
• Objectifs du cours :
– Comprendre l’importance de la biologie
moléculaire dans le diagnostic anatomo-
pathologique, notamment en pathologie
tumorale
– Comprendre et critiquer des articles de
pathologie moléculaire
– Notions de base pour pouvoir s’impliquer
dans une activité de pathologie moléculaire
au sein d’un laboratoire
 Plan du cours
• Chomosomes - ADN
– Structure des chromosomes et de l'ADN
– Réplication (ADN Æ ADN)
– Maintien de l'intégrité de l'ADN

• Transcription - traduction
– Transcription (ADN Æ ARN)
– Maturation de l'ARN messager
– Traduction (ARN Æ protéine)

• De la protéine à sa fonction
– Structure des protéines
– Maturations post-traductionnelles
– Trafic intra-cellulaire
 Vocabulaire de base
• Base :
– Adenine, Cytosine, Guanine, Thymidine, Uracil
• Nucléotides :
– (déoxy)adénosine, (déoxy)guanosine,
(déoxy)cytidine, thymidine, Urididine
• Acides nucléiques :
– ADN
– ARN
• Code génétique :
– codon de 3 nucléotides pour 1 acide aminé
 ADN : structure

• Molécule de très grande taille

• Structure en 2 brins anti-parallèles

• Associations spécifiques des 2 brins base/base :
A-T et G-C

• Enroulement en double hélice

• Super-enroulement plus complexe et en
association avec des protéines spécifiques
(histones) Æ nucléosomes, chromosomes
• Localisation nucléaire +++ et mitochondriales
 ADN humain: quelques chiffres
• 3,2x109 paires de bases (x 2)
• 46 Chromosomes :
– 22 paires d'autosomes
– 2 chromosomes sexuels

• Environ 30 000 gènes

• Environ 1,5% de l'ADN correspondent à des
séquences codant pour des protéines
• Chaque gène contient entre 1 et 178 exons
 Chromosome humain
• 1 chromosome = 1 double brin d'ADN

• 1 chromosome, 2 états :
– C. mitotique : état condensé
– C. inter-phasique : ADN déroulé

• Chaque chromosome contient :

– 1 centromère (site de fixation du kinétochore)
– 2 télomères (séquences répétitives)
– De multiples origines de réplication
Appariement des nucléotides
 Structure des chromosomes
• Chromatine = ADN + protéines (histones ou non)
• Organisation en nucléosome : "perles"
constituées par de l'ADN (#200bp) enroulé autour
d'un octamère d'histone (H2A, H2B, H3, H4) et
relié par l'ADN de liaison.
• Dans la cellule inter-phasique :
– Euchromatine : fibre de 30 nm reliées en
boucles
– Hétérochromatine : très compactée
 Condensation de l'ADN
Structure des chromosomes
 ADN : Réplication
• ADN = 2 brins anti-parallèles
• ADN polymérases
– Ajout de nucléotides sens 5'Æ3' uniquement
– Nécessité d'une matrice et d'une amorce
• Donc fourche de réplication asymétrique
– Brin "précoce" : ADN pol 5'Æ3' (matrice
– Brin "tardif" : Fragment d'Okazaki ARN (ADN
primase), puis ADN pol puis ADN ligase
ADN : Réplication
 ADN : Réplication
• Pour maintenir l'ADN pol sur la matrice :
– Protéines clamp
– Protéines d'assemblage du clamp
• L'ouverture de la fourche nécessite un
désenroulement de l'ADN avec :
– ADN hélicases : ouverture de l'hélice
– Protéines SSB ; se fixent à l'ADN simple brin
pour le maintenir ouvert en attendant l'ADNpol
– ADN topo-isomérases : cassent les brins
Cassure sur 1 brin (type I) ou les 2 (type II)
ADN : Réplication
ADN : initiation de la réplication

• Origines de réplications :
– Multiples chez l'homme
– Séquences riches en A-T

• Limitation dans le temps

– Phase S uniquement
 ADN : réplication des extrèmités
• Pas de fourche de réplication
• Séquence GGGTTA répétée sur 10000 bp
• Télomèrase
• Synthèse 5'Æ3' grâce à une matrice d'ARN
• Les télomèrases sont inactives dans les
tissus adultes, donc raccourcissement
progressif du télomère jusqu'à ce que la
réplication ne soit plus possible (sénescence
cellulaire).
 ADN : Correction des
mésappariements pdt la synthèse

• Activité 3'-exonucléotidase de l'ADN pol : avant

d'ajouter le nucléotide suivant

• MMR (mismatch repair) :

– Identification du brin néo-synthétisé par les cassures
simple brin
• par MSH2 associé MSH6 ou MSH3,
• puis par MLH1 associé à PMS1 ou PMS2
– Coupure à distance (environ 1 kb)
– Synthèse d'un nouveau brin
 Altérations de l'ADN
• Dégradation spontanée
dépurination, désamination
• Mutagènes environnementaux (UV,…)
• Erreurs de réplication, télomères

• Evènements génétiques
– Recombinaison générale
– Recombinaison spécifique de site
 Réparation de l'ADN
• Altération d'une base :
– Identification et marquage de la base altérée par une ADN
glycosidase
– Excision par l'AP endonucléase
– Remplacement par ADN pol
– Fermeture par ADN ligase
• Altération de 2 ou qq bases
– Coupure de part et d'autre par endonucléase
– Excision par hélicase
– Remplacement par ADN pol
– Fermeture par ADN ligase
• Cassure double brin
– Réparation par jonction non-homologue (mutagène)
– Réparation par la voie de recombinaison homologue (BRCA1,
BRCA2, Rad51)
 Crossing over par recombinaison
homologue
• Il existe plusieurs
recombinases (ex : Rad51),
qui fonctionnent avec des
protéines accessoires
(ex : BRCA1 et BRCA2).
• Effets génétiques de la RH
pdt la méiose
– Crossing over
– Conversion
 Crossing over par
recombinaison homologue
 Rétrotransposon
• Transposition = cassure puis insertion au hasard
• Rétrotransposon
– Type rétroviral (flanqué de séquence LTR)
– Type non rétroviral (ex : séquence LINE)

• Mécanisme :
– ARNpolÆARN
– transcriptase inverseÆADN
– ligaseÆinsertion
 Plan du cours
• Chomosomes - ADN
– Structure des chromosomes et de l'ADN
– Réplication (ADN Æ ADN)
– Maintien de l'intégrité de l'ADN

• Transcription - traduction
– Transcription (ADN Æ ARN)
– Maturation de l'ARN messager
– Traduction (ARN Æ protéine)

• De la protéine à sa fonction
– Structure des protéines
– Maturations post-traductionnelles
– Trafic intra-cellulaire
 Le code génétique

• ADN = support de l’information génétique

• Code génétique : 3 bases Æ 1 acide aminé

• 1 gène Î 1 protéine (mais isoformes…)

• 1 gène = exons (codants) et introns
• 2n chromosomes Æ 2 allèles/gène
Le code génétique (eucaryotes)
 Les familles d'ARN
• ARNm (messagers)
– Intermédiaires entre ADN et protéines
– Adressage cytoplasmique
– Epissage (excision des introns +/- qq exons)
• ARNr (ribosomaux)
• ARNt (de transfert)
• Petits ARN
– ARNsno (nucléolaire)
– ARNsn
• Autres ARN non codants
Régions fonctionnelles de l'ADN
• Unité de transcription (Exons, Introns et UTR)
• Promoteur (TATA box, CCAAT box, AUG,…)
• Séquences régulatrices
 Transcription des séquences codantes

• ARN pol II (les I et III transcrivent les ARN

non codants)
• Séquences du promoteur permettent la
fixation du complexe
 Modifications de l'ARNm
• Commencent pendant
la transcription

• Modifications 5' et 3'

• Epissage par le
Splicéosome

• Exportation à travers
les pores nucléaires
Transcription : Initiation - Régulation
 Contrôle de la transcription
• Promoteur :
– Situé qq dizaines de bp en amont du gène
– Site d'ancrage du complexe de l'ARN pol II
• Séquences régulatrices
– Activatrices, répresseurs
– Peuvent être très loin en amont ou aval, ou dans un intron.
 Méthylation de l'ADN
• Sur une cytosine d'un -CG-
• Permet l'inactivation d'un gène

• Impliqué dans des phénomènes d'empreinte

parentale (épigénétique)
• Epigénétique = caractéristique transmissible
non liée à la séquence primaire de l'ADN
 Régulations post-transcriptionnelles
• Atténuation transcriptionnelle
• Epissage alternatif
• Variation du site de poly adénylation (ex : Ig
membranaires ou sécrétées)
• Dégradation intra-nucléaire par l'exosome
• Régulation du transport intra-nucléaire
• Scan 7-87 p 43
Epissage alternatif
 Traduction
• ARNm, ARNt
• Ribosome (su 28S et 18S)

• Début : codon AUG

• Fin : codon « stop » (UAA, UAG, UGA)

• Repliement pdt la synthèse (spontané ou

protéine chaperone)
• Dégradation éventuelle par le protéasome, qui
découpe en plusieurs petits peptides les
protéines marquées par de multiple copies
d'ubiquitine.
Traduction
 Régulation de la traduction
• Fixation de protéines régulatrice en 5'
• Initiation sur différents AUG
• Séquences IRES d'entrée dans le ribosome
• Dégradation de ARNm
– Racourcissement du polyA, décaping,
dégradation
– Endonucléases spécifiques
• Dégradation des ARNm non sens
• RNA interférence
 Plan du cours
• Chomosomes - ADN
– Structure des chromosomes et de l'ADN
– Réplication (ADN Æ ADN)
– Maintien de l'intégrité de l'ADN

• Transcription - traduction
– Transcription (ADN Æ ARN)
– Maturation de l'ARN messager
– Traduction (ARN Æ protéine)

• De la protéine à sa fonction
– Structure des protéines
– Maturations post-traductionnelles
– Trafic intra-cellulaire
 Protéines : structure
• On distingue quatre niveaux stades structuraux
chez les protéines, .
– Structure primaire: ordre des acides aminés le long de la
chaîne polypeptidique.
– Structure secondaire: repliement local des acides
aminés en hélices, en feuillets, ou en d'autres formes
similaires.
– Structure tertiaire: agencement stable dans l'espace de
ces hélices et feuillets.
– Structure quaternaire: agencement des sous-unités
entre elles, quand la protéine est constituée de plusieurs
sous-unités indépendantes (comme l'est par exemple
l'hémoglobine).
Protéines : structure
Modifications protéiques post-traductionnelles :
Ajout ou retrait de divers petits groupements

• acétylation (ex : histones)

• amidation (ex : gastrine)
• biotinylation (ex : pyruvate carboxylase)
• carboxylation (ex : prothrombine)
• hydroxylation (ex : collagène)
• méthylation (ex : calmoduline, cytochrome C)
• phosphorylation (ex : récepteur tyrosine kinase)
• sulfatage (ex : gastrine)
 Modifications protéiques post-traductionnelles :
Acylation, ou ajout d'acides gras divers

• Glypiation: liaison entre une protéine destinée à la surface

extracellulaire et une ancre de glycophosphatidylinositol (ou GPI).
• Isoprénylation: liaison entre un résidu cystéine C-terminal et l'un de
deux composés isoprènes, le farnésyl ou le géranylgéranyl (ex : RAS)
• S-ou O-acylation: liaison avec acide gras (acide palmitique ou acide
myristique). S-acylation sur cystéine, ou O-acylation sur sérine
• Myristoylation N-terminale: Modification co-traductionnelle d'une glycine
N-terminale par formation d'un lien amide amide avec l'acide myristique
sous forme de myristoyl-CoA (ex : cytochrome b5)
• Ancrage à la membrane par protéolyse contrôlée et ajout de cholestérol
 Modifications protéiques post-traductionnelles :
Ajout polypeptides, de glucides

• Polypeptides:
– ubiquitination (couplage à l'ubiquitine) : histones, et toute protéine
appelée à être dégradée par la voie du protéasome.
– sumoylation (couplage du small ubiquitin-like modifier, ou SUMO

• Glucides, simples ou complexes:

– c-mannosylation - poly-ADP-ribosylation – acétylglucosamination
chez p53, I?B?, PML; sur une lysine).
 Modifications protéiques post-traductionnelles :
Glycosylation
Les glycoprotéines sont composées de protéines liées de façon covalente à des sucres.
La plupart des protéines sécrétées ou attachées à la membrane plasmique sont glycosylées.

Les chaînes glucidiques sont dites liées en N ou en O selon leur site d'ancrage.
• La glycosylation en N
– Commence avec la traduction, dans le réticulum endoplasmique, et se continue
jusque dans le Golgi.
– Sucres ancrés sur l'azote du groupement amide de l'asparagine.
– Les chaînes en N peuvent former de véritables arborisations. Selon la nature de ces
autres glucides, on divise les arborisations glucidiques liées en N en trois familles :
riche en mannose, hybride, et complexe, qui ressemble au type hybride mais
contient aussi de l'acide N-acétylneuraminique (NANA).
• La glycosylation en O
– Commence dans le Golgi.
– Sucres ancrés sur l'oxygène du groupement hydroxyl la sérine ou la thréonine
– Les chaînes liées en O sont plus courtes et plus variables que celles en N, et ne
contiennent la plupart du temps qu'un, deux ou trois résidus glucidiques.
Modifications protéiques post-traductionnelles :
N-Glycosylation
 Modifications protéiques post-traductionnelles :
Maturation protéolytique, dégradation

• Maturation protéolytique (ex : Proinsuline Æ insuline)

• Dégradation
– Le protéasome : gros complexe protéique ressemblant à
l'empilement de quatre anneaux, contenant plusieurs protéases.
L'unité régulatrice reconnaît les chaînes d'ubiquitine (et donc les
protéines marquées pour la destruction par ce système).
– Les lysosomes : vésicules d'origine golgienne à contenu à pH
acide avec une grande variété d'enzyme de dégradation. Les
enzymes lysosomiques sont glycolsylés et portent un mannose-6-
phosphate, qui est reconnu à la surface interne du réticulum trans
golgien par un récepteur qui dirige ces enzymes vers les lysosomes
en maturation.
 Rôles des modifications protéiques
post-traductionnelles

• adressage pour qu'elles se rendent au bon endroit dans la

cellule
• ancrage dans une membrane
• étiquettage pour qu'elles soient reconnues par des
partenaires métaboliques ou par des systèmes de
dégradation
• régulation de l'activité des protéines
 Synthèse puis traffic intra-cellulaire
des protéines
• Reticulum endoplasmique (RE)
– REL : lisse, périphérique
– REG : rugueux, recouvert de ribosomes
• Appareil de Golgi
– Ensemble de dictyosomes (saccules empilés)
 Synthèse puis trafic intra-cellulaire
des protéines
• Les séquences protéiques comportent des signaux
de routage, qui les adresse spécifiquement vers
les différents compartiements
• Aucun signal : cytosol
• Signal peptidique en N-term : voie de sécrétion par
RE, puis Golgi puis mb plasmique
• Signal peptidique C-terminaux : exemples
– NLS : synthèse dans le cytosol puis transport vers le
noyau
– Lys-Asp-Glu-Leu : protéines résidentes du RE
– Lys-Lys : passage dans Golgi puis retour dans RE
Synthèse puis traffic intra-cellulaire
des protéines
 Remerciements
• La plupart des illustrations de ce diaporama
proviennent :

– Soit du site de l'université de Sherbooke

http://pages.usherbrooke.ca/bcm-514-bl/index.php

– Soit du livre "Biologie Moléculaire de la cellule" Alberts,

et al. Médecine-Sciences Flammarion

– Soit du site de luniversité P.&M. Curie

http://www.edu.upmc.fr/sdv/docs_sdvbmc/Licence/biocel
/lv103denoul/4trafic.pdf