note technique

Virologie 2011, 15 (3) : 205-8

Apport de l’immunocapture-Elisa au diagnostic

de l’infection à virus grippal A(H1N1)pdm09 :
une alternative à la RT-PCR ?

Serge Védy1 Résumé. Objectif. Évaluer la sensibilité de l’immunocapture-Elisa (ICE) par

Martine Valette2 rapport à celle de la RT-PCR (techniques des CNR) pour le diagnostic de
l’infection à virus A(H1N1)pdm09. Patients et méthode. Soixante-sept pré-
Maud Bouscambert Duchamp2
lèvements nasopharyngés négatifs en RT-PCR et 282 positifs obtenus lors
Cyrielle Jacquemet1 de l’épidémie 2009-2010 et conservés à -80 ◦ C ont été analysés en ICE.
Sarah Schillinger1 Résultats. La sensibilité globale de l’ICE par rapport à la RT-PCR est de 31,3 %
Pascale Perez1 avec une spécificité de 100 %. Cette sensibilité est très significativement corrélée
Anne Hollande1 au nombre de cycles au bout duquel la RT-PCR est positive (témoin de la quantité
de virus présent dans le prélèvement et donc de la qualité de ce dernier). Plus
Céline Ragot1
ce nombre est court, plus la sensibilité de l’ICE augmente. Conclusion. L’ICE
Sylvie Bakkouch1 peut constituer une alternative intéressante à la RT-PCR lorsque cette dernière
Jean-Michel Puyhardy1 ne peut être utilisée pour des raisons économiques et/ou épidémiologiques. Sa
1 HIA Legouest, Laboratoire de biologie sensibilité est alors très dépendante de la qualité de réalisation des prélèvements
médicale, 27, avenue de Plantières, BP à visée diagnostique.
90001 57077 Metz Cedex 3, France Mots clés : immunocapture, RT-PCR, A(H1N1)pdm09
<vedy.serge@wanadoo.fr>
2 Groupement hospitalier Est,

Institut de microbiologie CNR du virus

influenza pour la région Sud, Abstract. Aim of the study. To evaluate immunocapture-Elisa (ICE) sensiti-
59, boulevard Pinel, 69677 Bron Cedex, vity versus RT-PCR in diagnosis of influenza A(H1N1)pdm09 virus infection.
France Methods. Sixty-seven RT-PCR-negative and 282 RT-PCR-positive nasopharyn-
geal swabs collected during winter 2009-2010 have been analyzed using ICE.
Results. Among all the samples tested, a sensitivity of 31.3% was found for
ICE. The sensitivity of ICE was directly correlated to the virus load determined
through the number of cycling reactions necessary to reach detection by RT-PCR.
Conclusion. ICE can be a suitable method compared to RT-PCR when RT-PCR
cannot be used for economical or epidemiological reasons. Its sensitivity is largely
dependent of the nasopharyngeal sampling quality.
Key words: immunocapture, RT-PCR, A(H1N1)pdm09

Introduction (SMOG), est également en mesure de pratiquer le diag-

La réactivité des CNR face à l’émergence du variant porcin
du virus grippal lors de l’épidémie 2009-2010 a permis de
doter de nombreux laboratoires d’une technique de diag-
nostic moléculaire : la RT-PCR. Tel fut notre cas. Or notre
doi:10.1684/vir.2011.0408
nostic de l’infection par immunocapture-Elisa (ICE)
(technique du CNR du virus influenza pour le Sud de la
France). Si de nombreuses publications sont parues sur
l’évaluation des tests de diagnostic rapide (immunochro-
matographie) par rapport à la RT-PCR, aucune ne compare

site, habitué à l’analyse des prélèvements rhinopharyngés
dans le cadre du système militaire d’observation de la grippe
Tirés à part : S. Védy
l’ICE à cette dernière. Or il peut s’agir d’une alternative
moins onéreuse à la biologie moléculaire. Quels résultats
auraient été obtenus si nous avions utilisé l’immunocapture
en lieu et place de la RT-PCR lors de l’épidémie ? Afin de
répondre à cette question nous avons mis en place une étude
rétrospective comparative.

Virologie, Vol 15, n◦ 3, mai-juin 2011 205

Pour citer cet article : Védy S, Valette M, Bouscambert Duchamp M, Jacquemet C, Schillinger S, Perez P, Hollande A, Ragot C, Bakkouch S, Puyhardy JM. Apport de l’immunocapture-Elisa au
diagnostic de l’infection à virus grippal A(H1N1)pdm09 : une alternative à la RT-PCR ? Virologie 2011; 15(3) : 205-8 doi:10.1684/vir.2011.0408
note technique
Patients et méthode
Prélèvements
Nous avons travaillé sur les prélèvements nasopharyn-
gés reçus par le laboratoire de biologie médicale de
l’HIA Legouest durant l’épidémie grippale de l’hiver
2009-2010 (total de 1784 écouvillons). Ces prélève-
ments ont été réalisés selon les recommandations de la
cellule de crise du ministère chargé de la Santé (dispo-
nibles à l’adresse http://www.pandemie-grippale.gouv.fr/
IMG/pdf/D4.pdf, sur écouvillon avec milieu de transport
pour virus type ELITECH MW935). Les écouvillons ont
été exprimés en milieu essentiel minimum de Eagle. Ces
milieux ont ensuite été conservés à -80 ◦ C (surveillance
métrologique par logiciel LABGUARD) jusqu’à la date de
l’étude (mai 2010).
Techniques d’analyses
Biologie moléculaire
Durant l’hiver 2009-2010, nous avons fait partie des
laboratoires de premier niveau pour le diagnostic de la
grippe A(H1N1)pdm09. Très rapidement après le début
de l’épidémie, le CNR nous a fait bénéficier d’une tech-
nique de RT-PCR. Elle est basée sur la détection du gène
M, spécifique du type viral, associée pour la confirma-
tion du sous-type H1N1sw à une RT-PCR spécifique du
gène codant pour la neuraminidase (PCR N1). Le proto-
cole est disponible sur le site du Ministère chargé de la
santé à l’adresse : http://www.sante-sports.gouv.fr/IMG/
pdf/Protocoles_CNR_03122009.pdf. Elle est adaptée au
thermocycleur Ligthcycler 2.0, Roche® sur lequel nous tra-
vaillons habituellement. L’extraction des acides nucléiques
est réalisée sur EZ1 de Quiagen® (400 ␮L d’échantillon
élués dans 60 ␮L).
Ces techniques ont permis la détection sur site de
544 échantillons positifs sur une totalité de 1784 prélè-
vements nasopharyngés reçus sur la période épidémique.
Un échantillon qualifié de positif en PCR est un échan-
tillon dans lequel la présence du virus A(H1N1)pdm09 a
été confirmée soit par la positivité des deux PCR réalisées
sur site, soit par la positivité de l’une des deux techniques
sur site et la confirmation secondaire après envoi au CNR
Immunocapture-Elisa
La technique utilisée est celle du Centre national de
référence du virus Influenza Région Sud (laboratoire de
virologie HCL, Lyon). Cette technique de détection directe
est pratiquée sur microplaques de 96 puits. La sensibilisa-
tion des puits est effectuée par les anticorps monoclonaux
de capture anti-grippe A T 17 C 2 dilués en tampon
PBS pendant 16 heures à 20 ◦ C en atmosphère humide.
206
Après dépôt des échantillons à tester (90 ␮l), la réaction
Ag viraux-anticorps est révélée par l’addition d’anticorps
polyclonaux de lapin (21-21-750 anti-A H1N1 et 21-21-
748 anti-A H3N2) puis du conjugué (anticorps de chèvre
anti-lapin marqué à la peroxydase). L’ajout du substrat de
l’enzyme (ABTS) entraîne une variation de densité optique
si les antigènes viraux sont présents. Trois témoins négatifs
(PBS) et des antigènes de contrôles positifs sont incorporés
à chaque série afin de la valider (virus H1N1 : A/Solomon
Islands/3/2006). Une réaction est considérée positive si la
variation de densité optique est significative par rapport
à la moyenne de trois « blancs réactifs » (supérieur à la
moyenne + 0,150, afin d’éviter les réactions douteuses ou
zones grises).
Méthodologie
Nous avons procédé en trois étapes.
Étape 1 : l’évaluation des conditions de conservation des
échantillons est estimée en re-testant en PCR M, 20 échan-
tillons positifs et en corrélant la valeur de leur cycle de
détection positive (CT) avec celle trouvée au moment de
leur réception au laboratoire (échantillons répartis entre 16
et 34 CT).
Étape 2 : l’évaluation de la sensibilité et de la spécificité
de l’ICE par rapport à la PCR est conduite sur une pre-
mière série de134 échantillons (67 positifs en RT-PCR et
67 négatifs). Ces échantillons ont été prélevés au moment
du pic épidémique, entre le 21/11/2009 et le 17/01/2010.
Seuls les derniers reçus par le laboratoire sont exploités
afin de travailler sur du matériel conservé le moins de temps
possible.
Étape 3 : la corrélation entre le CT et le caractère positif
ou négatif de l’ICE est ensuite étudiée sur une série de
282 échantillons confirmés positifs initialement (67 positifs
initiaux plus 215 autres confirmés positifs) prélevés dans la
même période.
Résultats
Évaluation des conditions de conservation
des échantillons
Aucune rupture des conditions de conservation n’a été enre-
gistrée durant la période de stockage des prélèvements. Il
existe une corrélation entre les CT initiaux et les CT de mai
2010, formalisée par l’équation de la droite de régression de
la figure 1 (y = 0,77x + 8,37). Ce sont les échantillons détec-
tés le plus précocement initialement qui ont perdu le plus
en nombre de CT (si CT initial égal à 20 alors CT mai 2010
égal à 23,39, si CT initial égal à 30 alors CT mai 2010 égal
à 31,35). La moyenne globale des différences est de deux
Virologie, Vol 15, n◦ 3, mai-juin 2011

40
35
30
CT Mai 2010
25
20
15
10
5 0
0
15 17 19 21 23 25 27
CT Initial
Figure 1. Corrélation entre les cycles de détection positive des
PCR réalisées initialement et celles réalisées en mai 2010, pour
20 échantillons.
CT. Aucun échantillon positif en PCR M initialement n’a
été retrouvé négatif. Les conditions de conservation sont
donc validées.
Évaluation de la sensibilité et de la spécificité de
l’immunocapture-Elisa par rapport à la RT-PCR
Parmi les 67 échantillons confirmés positifs en virus
A(H1N1)pdm09, 67 sont positifs en PCR M, 66 sont posi-
tifs en PCR N1 et 21 sont positifs en ICE. Toutes les séries
sont validées sur leurs témoins positifs et négatifs. Aucun
négatif en PCR M ou PCR N1 n’est positif en immuno-
capture. Ainsi, par rapport à la PCR M, l’ICE a une sen-
sibilité de 31,3 % et une spécificité de 100 % pour le
diagnostic d’infection à virus A(H1N1)pdm09. Par rap-
port à la PCR N1, l’ICE a une sensibilité de 31,8 % et une
spécificité de 100 % pour le diagnostic d’infection à virus
A(H1N1)pdm09. La PCR N1 a une sensibilité de 98,5 % et
une spécificité de 100 % par rapport à la PCR M.
Corrélation entre le cycle de détection positive
et le caractère positif ou négatif
de l’immunocapture-Elisa
Les 281 échantillons confirmés positifs pour le virus
A(H1N1)pdm09 sont tous positifs en PCR M. Il est pos-
sible de répartir en fonction de leur CT ces échantillons
trouvés positifs et de comparer cette répartition à celle des
positifs en ICE (figure 2). Il existe un lien très significatif
entre le caractère ICE positive et le nombre de CT où la
RT-PCR a été détectée positive. Plus ce CT est bas, plus la
probabilité que l’ICE soit positive est élevée.
Discussion
On sait que la RT-PCR est une technique très sensible pour
le diagnostic de la grippe, voire même la plus sensible qui
existe actuellement [1]. Des études comparatives menées
Virologie, Vol 15, n◦ 3, mai-juin 2011
note technique
Probabilité que ICE soit POS quand CT ≤ seuil (%) (sensibilité)
120
100
80
Probabilité que ICE soit POS
%
60 quand CT ≤ seuil (%) (sensibilité)
40
20
18
20
24
26
28
30
32
34
36
29 31 33 35
≤
CT
Figure 2. Évolution de la sensibilité de l’immunocapture-Elisa en
fonction du cycle de détection positive de la RT-PCR.
entre les tests de diagnostic rapide (TDR) et RT-PCR pour
le diagnostic d’infection à virus A(H1N1)pdm09 avaient
déjà mis en évidence les performances plus faibles de ces
techniques immunologiques [2-5]. Des sensibilités de 39 à
76 % et des spécificités de 82,6 à 100 % selon les études,
leur avaient déjà été attribuées [2, 3]. Nos résultats étaient
donc prévisibles. Toutefois, la sensibilité retrouvée ici pour
l’ICE est beaucoup plus faible que celle décrite par ailleurs
par d’autres auteurs. Que ce soit comparativement à la
culture cellulaire dont la sensibilité est proche de celle de
la PCR ou comparativement à la RT-PCR [6, 7]. Si nous
l’avions utilisée durant la période épidémique, 170 prélè-
vements auraient été positifs au lieu des 544 effectivement
retrouvés.
Les conditions de conservation des échantillons auraient
pu être mises en cause si nous ne les avions validées. Un
défaut d’affinité des anticorps utilisés pour les antigènes
viraux testés peut être évoqué. Les anticorps AT17C sont
dirigés contre la protéine virale M non spécifique du type
A(H1N1)pdm09 et leur performance a déjà été éprouvée
[6, 7]. Par contre, les anticorps de révélation polyclonaux
sont produits sur lapin contre un virus A(H1N1) complet
purifié. Dans cette réaction, la spécificité est apportée par
des anticorps dirigés contre des protéines internes (pro-
téines NP). On ne peut écarter un manque de sensibilité
de ces immunoglobulines vis-à-vis du virus variant contre
lequel elles n’ont pas été spécifiquement synthétisées. Cette
hypothèse n’est toutefois pas confortée par la sensibilité
élevée de l’ICE sur des prélèvements détectés positifs pré-
cocement en RT-PCR.
Par contre, ces derniers résultats font ressortir probablement
le principal écueil aux performances de l’ICE : la qualité des
prélèvements nasopharyngés. L’utilisation d’un témoin de
quantification cellulaire dans les réactions de PCR aurait
permis d’évaluer de façon précise la qualité des prélève-
ments reçus. Ce type de témoin n’a malheureusement pas
pu être mis en place au moment où la technique a été adap-
tée sur site. Toutefois, la qualité des prélèvements peut être
207
note technique
appréhendée de manière semi-quantitative. En effet, nous
savons que les prélèvements détectés précocement en RT-
PCR sont ceux qui contiennent le plus de particules virales
et donc ceux qui ont été réalisés dans les meilleures condi-
tions [8], c’est-à-dire en évitant un simple écouvillonnage
nasal, mais en allant racler les cellules du nasopharynx à
l’écouvillon, en les acheminant le plus rapidement possible
au laboratoire dans un milieu de transport tel que celui pré-
conisé et en les conservant le moins de temps possible avant
analyse.
Les performances de l’ICE sur des prélèvements de mau-
vaise qualité sont médiocres. L’importance de la maîtrise
de la phase pré-analytique, essentielle pour toute analyse
de biologie médicale, est particulièrement bien illustrée ici.
La place de l’ICE dans le diagnostic de l’infection à virus
A(H1N1)pdm09 dépend de l’objectif recherché. S’il s’agit
de diagnostiquer une infection dans une population à risque
en vue de mettre en place un traitement prophylactique,
alors il faut une technique sensible. L’ICE n’a pas sa place,
il est préférable d’utiliser la RT-PCR. Par contre, il est
impératif de cibler la population à prélever car la tech-
nique est onéreuse. C’est la stratégie qui a été adoptée
durant la dernière épidémie. Si le but est l’emploi d’une
technique pour surveiller la circulation d’une souche virale
au sein d’une population, alors on peut utiliser une tech-
nique moins sensible, qui tolère les faux négatifs, et qui
sera surtout moins onéreuse que la biologie moléculaire.
En effet, le coût de cette dernière a été estimée à 11 euros
par patient (estimation faite sur l’ensemble des prélève-
ments reçus durant la période épidémique) contre 0,5 euro
par patient pour l’ICE (estimation faite sur la base d’une
plaque de 96 puits permettant de tester 89 patients). L’ICE
peut alors avoir sa place, a fortiori si l’on parvient à dévelop-
per des anticorps monoclonaux plus spécifiques du variant
et surtout, si les prélèvements nasopharyngés sont réali-
sés dans de bonnes conditions. L’intérêt de fonctionner en
réseau de surveillance trouve toute sa valeur ici. Ces réseaux
comprennent des professionnels formés et habitués à ce
type de prélèvement.
208
En conclusion, l’ICE utilisant les anticorps anti-grippe
A T 17 C 2 et anti-A(H1N1) 21-21-750 peut détecter le
virus A(H1N1)pdm09 dans les prélèvements nasopharyn-
gés. Toutefois, il s’agit d’une technique moins sensible que
la RT-PCR mise au point par le CNR de la grippe. Cette
technique demeure intéressante pour la surveillance de la
circulation de la souche virale, lorsque le grand nombre
de prélèvements ou les conditions locales empêchent
l’utilisation de méthodes plus sensibles mais plus oné-
reuses. Elle est dépendante de la qualité de réalisation de la
phase pré-analytique.
Conflits d’intérêts : aucun.
Références
1. Vabret A, Dina J, Cuvillon-Nimal D, et al. La grippe saisonnière. Pathol
Biol 2010 ; 58 : e51-7.
2. Balish A, Warnes CM, Wu K, et al. Evaluation of rapid influenza diag-
nostic tests for detection of novel influenza A (H1N1) Virus. MMWR
Morb Mortal Wkly Rep (United States). 2009 ; 58 : 826-9.
3. Huart AC, Baas C, Deng YM, et al. Performance of influenza
rapid point of care tests in the detection of swine lineage A (H1N1)
influenza viruses. Influenza and other Respiratory viruses 2009 ; 3 :
171-6.
4. Chan KH, Lai ST, Poon LL, et al. Analytical sensitivity of rapid
influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1).
J Clin Virol 2009 ; 45 : 205-7.
5. Reina J, Plasencia V, Leyes M, Nicolau A, Galmes A, Arbona G. Com-
parison study of a real time reverse transcription polymerase chain reaction
assay with an enzyme immunoassay and shell vial culture for influenza
A and B virus detection in adult patient. Enferm Infecc Microbiol Clin
2010 ; 28 : 95-8.
6. Akoua-Koffi C, Kouakou B, Kadjo H, Elia G, Koffi SP, Adjogoua E.
Bilan de deux années de surveillance de la grippe à Abidjan. Med Trop
2007 ; 67 : 259-62.
7. Plakokefalos E, Markoulatos P, Ktenas E, Spyrou N, Vamvakopoulos
NC. A comparative study of immunocapture Elisa and RT-PCR for scree-
ning clinical samples from Southern Greece for human influenza virus
types A and B. J Med Microbiol 2000 ; 49 : 1037-41.
8. Cheng PK, Wong KK, Mak GC, et al. Performance of laboratory diag-
nostics for the detection of influenza A(H1N1)v virus as correlated with
the time after symptom onset and viral load. J Clin Virol 2010 ; 47 :
182-5.
Virologie, Vol 15, n◦ 3, mai-juin 2011