Introduction:

L'électrophorèse est une technique de laboratoire génétique courante utilisée

pour séparer les particules chargées telles que l'ADN en fonction de la taille de
la particule. Pour cette raison, la taille de l'ADN peut être déterminée à l'aide de
l'électrophorèse. Outre leur utilisation dans la séparation des biomolécules, la
technique d'électrophorèse telle que PAGE peut également être utilisée dans le
séquençage d'ADN qui détermine la séquence d'un ADN.

Cependant, le processus est désormais entièrement automatisé. Au début du 19e

siècle, Johann Wilhelm Hittorf et al., Ont déclaré que «sous l'influence du
champ électrique, de plus petits ions organiques peuvent se déplacer à travers la
solution aqueuse et il est également utile pour mesurer les propriétés et le
comportement des ions». Ce fut la première preuve d'électrophorèse rapportée.

Après plusieurs années, Arne Tiselius, un biochimiste suédois a publié un article

sur le processus complet et les ouvertures de l'électrophorèse en 1937. Plus tard
dans l'année 1948, il a reçu le prix Noble.

L'idée générale de l'électrophorèse sur gel d'ADN:

La brève explication est la suivante, les molécules d'ADN se sont séparées en
fonction de leur charge et de leur taille.

À mesure que la concentration d'agarose augmente, la taille des pores diminue

et vice versa. Par conséquent, les plus grosses molécules ne peuvent pas
fonctionner plus rapidement par rapport aux plus petits fragments
d'ADN . Pour cette raison, les plus petits fragments apparaissent plus près de
la charge positive (migrent plus rapidement vers le nœud positif).

Une fois que le courant électrique traverse le gel, l'ADN commence à se

déplacer vers l'électrode opposée.

Un colorant fluorescent marqué tel que EtBr utilisé pour visualiser les bandes
d'ADN. Un autre colorant nommé DNA gel loading dye surveille la migration
de l'ADN en devançant celui-ci.

De plus, un marqueur d'ADN de poids moléculaire connu est utilisé pour

calculer la taille exacte de l'ADN.
Une fois l'ADN atteint à une distance suffisante, le processus est arrêté pour
protéger l'ADN qui s'écoule du gel.

L'électrophorèse sur gel d'agarose, souvent connue sous le nom

d'électrophorèse sur gel horizontal, est utilisée pour séparer l'acide nucléique
(ADN / ARN) entre 50 pb et ~ 15 kb

Qu'est-ce que l'électrophorèse?

Toute molécule biologique chargée peut être caractérisée et séparée en
utilisant la méthode d'électrophorèse.

«Sous l'influence du courant électrique constant, la particule chargée peut se

déplacer en milieu liquide ou fluide, ce processus est appelé électrophorèse».

L'électrophorèse est un processus utilisé dans l'identification, la séparation et

la caractérisation des molécules biologiques.

Types d'électrophorèse:
L'électrophorèse est principalement de deux types: l'électrophorèse sur gel
vertical et l'électrophorèse sur gel horizontal.

L'électrophorèse sur gel vertical fait passer l'échantillon de haut en bas et de

manière discontinue. Généralement, il convient le mieux à la séparation des
protéines et est appelé PAGE (électrophorèse sur gel de polyacryle amide).

Au lieu de l'agarose, le polyacrylamide est utilisé dans l'électrophorèse sur gel

vertical.

L'électrophorèse sur gel horizontal exécute l'échantillon en continu,

parallèlement à la surface et il est largement utilisé pour la séparation de
l'ADN. Au lieu du polyacrylamide, l'agarose est utilisé dans l'électrophorèse sur
gel horizontal.

L'électrophorèse sur gel horizontal est plus facile, plus fiable et donne les
meilleurs résultats. Cependant, pour la séparation de la molécule avec une
différence plus petite, PAGE est plus fiable en comparaison avec
l'électrophorèse sur gel d'agarose.
Par exemple, si nous voulons séparer des fragments d'ADN avec une différence
de 5 à 10 pb, PAGE donne le meilleur résultat, ici l'électrophorèse sur gel
horizontal standard ne peut pas être appliquée.

Comme l'électrophorèse sur gel d'agarose est couramment utilisée pour la

séparation de l'ADN. Nous ne discuterons que de l'électrophorèse sur gel
d'agarose en détail (pas PAGE).

L'électrophorèse sur gel d'agarose est également connue sous le nom

d'électrophorèse sur gel sous-marin car le gel entier reste entièrement
recouvert du tampon en cours d'exécution.

Électrophorèse sur gel d'agarose:

Dans la présente section, nous discuterons des utilités, du principe, de la
durée, de la procédure, de la préparation et du protocole d'électrophorèse sur
gel d'agarose.

Utilitaires:

Produits chimiques:

Poudre d'agarose, tampon TAE ou TBE, bromure d'éthidium et colorant bleu

de bromophénol.

Equipements:

Roulette de gel, chambre d'électrophorèse, source de tension, plateau de gel,

peigne, four, transilluminateur Uv.

Autres utilitaires:

Pipettes, pointes, flacon, balance de poids.

Temps global:

70 minutes à 90 minutes

La représentation hypothétique de l'équipement d'électrophorèse sur gel

d'agarose est indiquée ci-dessous,
Principe de l'électrophorèse sur gel d'agarose :
Les molécules d'ADN chargées négativement migrent vers la charge positive
sous l'influence d'un courant constant, ainsi la séparation dépend de la masse
et de la charge d'ADN. Les molécules d'ADN sont obligées de se déplacer à
travers les pores du gel d'agarose. Le taux de migration dépend,

 La force du domaine
 L'hydrophobicité de l'ADN
 La force ionique du tampon
 La taille et la forme de l'ADN
 La température du tampon

Trois des facteurs importants qui affectent le taux de migration de l'ADN sont,

 Concentration d'agarose
Comme nous l'avons vu précédemment, si la concentration d'agarose est plus
faible, l'ADN peut migrer facilement et plus rapidement et vice versa.

 Confirmation de l'ADN

L'ADN superenroulé migre plus rapidement que l'ADN linéaire et l'ADN

circulaire.

La forme super enroulée de l'ADN est plus compacte que les autres formes et
c'est la raison de sa migration rapide.

 Taille de l'ADN

Si la taille d'un ADN est plus grande, le taux de migration de celui-ci est plus
faible et donc le produit de PCR de plusieurs centaines de paires de bases
migre plus rapidement que l'ADN génomique total.

Composant d'électrophorèse sur gel d'agarose :

 Agarose
 Matériel d'électrophorèse sur gel d'agarose
 Tampon d'électrophorèse sur gel d'agarose
 ADN Gel colorant de chargement
 EtBr
 Bloc d'alimentation
1. Agarose

L'agarose est un polysaccharide extrait des algues. La longue chaîne

d'agarobiose (polymère) crée le sucre d'agarose. L'agaropectine est retirée de
l'agar pour former de l'agarose.

Un polysaccharide d'agarose linéaire est constitué de l'unité monomère de D-

galactose et de 3, 6-anhydro-L-galactopyranose disaccharide.

La poudre d'agarose n'est soluble dans l'eau qu'à l'ébullition. Après

refroidissement, il subit une liaison hydrogène (réticulation) qui se traduit par
une polymérisation. En formant l'hydrogène entre une molécule adjacente, il
crée une matrice tridimensionnelle de pores.

Plus la réticulation est élevée, plus la taille des pores et le verset sont faibles.

La taille des pores varie en fonction de la concentration d'agarose dans le gel.

Les pores créent un canal dans le gel d'où l'ADN peut migrer.

La température de fusion de l'agarose est proche de la température

d'ébullition (~ 95 ° C) tandis que la température de gélification est de ~ 37 ° C -
43 ° C.

À mesure que la concentration d'agarose augmentait, la taille des pores

diminuait. En fonction de l'exigence du type d'échantillons d'ADN, la
concentration d'agarose est répertoriée dans le tableau:
Si le gel est hautement concentré et que les fragments d'ADN sont plus gros, le
fragment d'ADN ne peut pas migrer dans le gel et il crée un type de
cisaillement de motifs de bande.

Les molécules plus petites migrent plus rapidement que les molécules plus
grosses et donc des motifs distincts de bandes d'ADN en fonction de leur taille
sont produits.

2. Équipement d'électrophorèse sur gel d'agarose

L'équipement d'électrophorèse sur gel d'agarose contient la chambre

d'électrophorèse, le lanceur de gel, le peigne à gel, les électrodes et les pinces
(étiquetés sur la figure ci-dessus). La chambre d'électrophorèse sur gel est
composée d'acrylique de haute qualité. Le tampon d'électrophorèse sur gel
d'agarose est introduit dans la chambre d'électrophorèse.

Le lanceur de gel est un composant important qui est utilisé pour couler le gel.
La pince aide à placer le plateau de gel dans le lanceur de gel afin que le gel ne
puisse pas s'échapper.

Après décantation du gel, les pinces sont retirées et le plateau de gel est
transféré dans la chambre d'agarose (qui est remplie de tampon
d'électrophorèse sur gel d'agarose).

Les puits sont formés à l'aide d'un peigne en gel dans lequel l'échantillon
d'ADN sera chargé. Les électrodes positives et négatives sont fixées de chaque
côté de la chambre d'électrophorèse sur gel.

Le placement du peigne est illustré dans la figure ci-dessous,

3. Tampon d'électrophorèse sur gel d'agarose

Le tampon d'électrophorèse facilite le milieu liquide pour la migration de

l'ADN dans le gel. TAE et TBE sont les deux tampons les plus couramment
utilisés dans l'électrophorèse sur gel d'agarose

Le tampon d'électrophorèse maintient également un pH constant pendant

l'analyse.

Le tampon TAE est plus préférable au TBE car le borate présent dans le
tampon TBE réagit avec le glycérol du colorant de chargement de gel d'ADN.

Préparation du tampon 10X TAE (pour 250 ml)

 400mM Tris
 200mM d'acide acétique
 10mM EDTA
 Ajouter D / W pour faire le volume final de 250 ml

Remarque: utilisez un seul type de tampon pour la préparation du gel ainsi que
pour le remplissage du réservoir.
4. Colorant de chargement de gel d'ADN:

Le colorant de chargement de gel d'ADN contient du bleu de bromophénol et

du glycérol.

Le BPB devance l'ADN. Nous pouvons surveiller la migration par gel de

chargement de colorant.

De plus, le glycérol présent dans le colorant de chargement de gel d'ADN

donne de la densité à l'ADN qui a déposé l'ADN au fond du puits.

La composition du colorant de chargement 1X,

 0,042% (W / V) Bleu de bromophénol en poudre

 2,5% de ficoll
 0,042% (W / V) Xylène cyanol FF (facultatif)
 Maquillage final avec D / W

5. EtBr:

Le bromure d'éthidium est un colorant fluorescent utilisé pour le marquage de

l'ADN. L'ADN n'a pas sa propre couleur, l'EtBr s'intercale avec les bases de
l'ADN et donne une couleur fluorescente sous la lumière UV.

Attention: alerte mutagène !! L'EtBr est mutagène. Portez des gants, un

bonnet et un verre de protection UV avant de le manipuler.

6. Powerpack

Les deux électrodes sont fixées au bloc d'alimentation. Nous pouvons exécuter
l'ADN sur 50v, 100v ou 120v selon le type d'échantillon d'ADN.

Protocole d'électrophorèse sur gel d'agarose :

L'ensemble de la procédure d'électrophorèse sur gel d'agarose est divisé en 6
parties :
1. Préparation du gel
2. Coulée de gel
3. Chargement d'échantillon
4. Faire fonctionner le gel
5. Visualiser le gel
6. Interprétation des résultats ou purification de l'ADN.
1. Préparation du gel d'agarose:

Pour préparer un gel à 2,0% pour des fragments de PCR, pesez 2,0 grammes
de poudre d'agarose et mettez-le dans une fiole.

Ajouter 100 ml de tampon TAE 1X (ou TBE) dans le ballon et bien agiter jusqu'à
ce que la poudre d'agarose se mélange dans le tampon.

Pour la préparation du tampon de base 10X et du tampon de travail 1X, lisez

notre article précédent: Tampon d'électrophorèse sur gel d'agarose.

Maintenant, chauffez le mélange dans le four à une température de 95 ° C

jusqu'à ce que l'agarose se dissolve dans le tampon (ou 3 à 5 minutes). Une fois
qu'elle a atteint sa température d'ébullition, la solution devient limpide indique
que la poudre d'agarose est dissoute dans le tampon.

Attention surface chaude!! Des précautions doivent être prises lors du

chauffage du gel dans un four à micro-ondes. Si possible, suivez la formation
nécessaire avant de le faire.

Retirez délicatement le ballon du four et placez-le pendant un certain temps

jusqu'à ce qu'il devienne palpable.
Maintenant, ajoutez 0,5 μg / ml d'EtBr et agitez bien pour bien mélanger
(agitez-le doucement pour éviter la formation de bulles).

2. Coulée sur gel:

Placez le plateau de gel sur la roulette de gel et serrez-le à l'aide de pinces.

placez le peigne de gel sur le plateau de gel.

Versez le gel dans la roulette de gel et attendez qu'il devienne solide.

Placez-le sous un environnement frais ou vous pouvez également le placer

dans le gel pour le régler plus rapidement.

Remplissez la chambre d'électrophorèse avec le tampon d'électrophorèse sur

gel et placez soigneusement le plateau de gel dans la chambre.

Remplissez maintenant le tampon restant jusqu'à ce que le gel soit recouvert

par le tampon.

3. Chargement de l'échantillon:

Prélever des échantillons d'ADN et les placer dans un ordre séquentiel et y

ajouter du BPB ou le mélanger sur le parafilm.

Maintenant, prenez soigneusement 10 μl d'un échantillon et versez-le dans le

puits. N'oubliez pas, ne cassez pas le gel pendant le chargement de
l'échantillon.

Chargez chaque échantillon dans un ordre et, enfin, chargez l'échelle d'ADN.
Vous pouvez également charger le marqueur ADN ou l'échelle en première
position.
 4. Exécution du gel:

Connectez les électrodes au bloc d'alimentation et faites fonctionner le gel à

100 V pendant 45 à 60 minutes. Exécutez les échantillons jusqu'à ce que l'ADN
couvre une distance de 75% vers le nœud positif.

Le rouge est un nœud positif et le noir est un nœud négatif.

Après la fin de la course, retirez soigneusement le gel

5. Visualisation du gel:

Exécutez le gel jusqu'à ce que le bleu de bromophénol (colorant de chargement de

gel d'ADN) atteigne les bords du gel. Coupez l'alimentation électrique et
soigneusement, retirez le gel de la chambre d'électrophorèse et vidangez le tampon.

L'EtBr est utilisé pour visualiser l'ADN.

Maintenant, placez soigneusement le gel sur la plate-forme du transilluminateur et

fermez le fil du transilluminateur.
Rappelles toi!! n'oubliez pas de porter des gants et des lunettes de protection
oculaire, le transilluminateur Uv émet une lumière UV qui peut nuire à nos cellules
cutanées.

The image represents DNA bands under UV transilluminator. Image credit:

http://enfo.agt.bme.hu/drupal/en/node/8929

Allumez la lumière UV et le résultat sera observé comme indiqué dans la figure ci-
dessus. EtBr s'intercale entre les bases d'ADN et émet une lumière fluorescente. Des
bandes d'ADN de couleur orange sont observées sous la transillumination UV.

6. Interprétation des résultats:

Un groupe est une compilation d'un fragment d'ADN de type similaire. Le marqueur
moléculaire Know, connu sous le nom d'échelle d'ADN, est utilisé pour déterminer
la taille du fragment.

voir la figure ci-dessous ,

The graphical representation of DNA and DNA ladder bands into the agarose gel.

Le taux de migration de l'ADN est directement proportionnel à sa taille tandis

que la migration de l'ADN est inversement proportionnelle à la concentration de
gel d'agarose.

Application de l'électrophorèse sur gel d'agarose

L'électrophorèse sur gel d'agarose est largement utilisée en génétique moléculaire,
en particulier dans les techniques de PCR et de PCR telles que les empreintes
génétiques d'ADN, les analyses RFLP, AFLP et RAPD, l'analyse des marqueurs
génétiques, l'analyse VNTR.

L'électrophorèse sur gel d'agarose est couramment utilisée dans le diagnostic de

plusieurs maladies telles que la thalassémie, l'anémie falciforme, l'hémophilie, la
fibrose kystique et d'autres analyses de mutations.

En outre, il est utilisé dans des études basées sur la digestion de restriction telles que
la cartographie de restriction, la cartographie génomique et la digestion de
restriction de l'ADNc, etc.

De plus, il permet la purification de fragments d'ADN et la séparation de fragments

d'ADN pour le séquençage et d'autres applications en aval.
L'électrophorèse sur gel d'agarose est applicable à l'étude de la topologie de l'ADN.
L'ADN super enroulé, circulaire, entaillé et linéaire peut être identifié en utilisant
l'électrophorèse sur gel d'agarose.

Limites de l'électrophorèse sur gel d'agarose

La présente méthode d'interprétation est tellement utile mais elle a plusieurs limites.

Le facteur de risque est très élevé en électrophorèse sur gel en raison de l'utilisation
de procédures actuelles, de lumière UV, de produits chimiques cancérigènes et de
chauffage.

De plus, la taille de fragment d'ADN déterminée n'est pas précise (ce n'est qu'une
hypothèse).

Le processus prend du temps et est long.

De plus, les informations de séquence ne peuvent pas être obtenues en les utilisant.

Mon guide ultime sur l'électrophorèse sur gel d'agarose

J'ai déjà mentionné le protocole d'électrophorèse sur gel d'agarose. Vous pouvez
utiliser le protocole d'électrophorèse sur gel d'agarose dans votre laboratoire de
routine et c'est notre protocole standardisé.

Certaines précautions sont nécessaires pour effectuer une électrophorèse sur gel
d'agarose:

 La poudre d'agarose est dangereuse, donc portez toujours des gants, un

masque facial et des lunettes de protection lors de la préparation d'un gel
d'agarose.
 Pendant l'ébullition de l'agarose, porter des gants de cuisine (résistants à la
chaleur). N'utilisez pas de gants en plastique, cela vous brûlerait la main.
 EtBr est un cancérigène et mutagène donc prendre les précautions
nécessaires.
Conclusion:
L'électrophorèse sur gel d'agarose est une technique inégalée et non remplaçable
jusqu'à présent. Cependant, certaines des autres options rapides et plus précises sont
maintenant disponibles mais sont si coûteuses.

L'ensemble du processus d'électrophorèse est simple mais chaque étape comporte

un type de risque différent, par conséquent, des précautions doivent être prises à
chaque fois lors de la préparation ou de la réalisation de l'électrophorèse sur gel
d'agarose.