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hématologie
Livret 4 d'activités technologiques
A+
Mes remerciements vont à tous ceux qui ont permis la réalisation de cet ouvrage, en particulier
certaines de mes collègues, professeurs au lycée La Martinière Duchère de Lyon avec qui j'ai travaillé
avec énormément de plaisir en immuno-hématologie :
Des remerciements aussi pour Gilles et Sangeetha Muller qui m'ont aidé pour la mise en page.
Avant-propos
Ce livret 4 fait partie de quatre livrets relatifs aux enseignements technologiques d'hématologie de la
section technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.
MAI 2012
Sommaire
Introduction à l'immuno-hématologie......................................................................................................... 5
Pré-requis et objectifs................................................................................................................................. 7
Détermination des groupes sanguins-Généralités ..................................................................................... 8
Fiche 1 – Détermination des groupes sanguins du système ABO ............................................................ 11
Fiche 2 – Exercices: groupage ABO ........................................................................................................ 18
Fiche 3 – Recherche de la substance H dans la salive.............................................................................. 21
Fiche 4 – Groupage Rhésus standard........................................................................................................ 23
Fiche 5 – Phénotypage Rhésus complet.................................................................................................... 31
Fiche 6 – Détermination du groupe érythrocytaire dans le système Kell.................................................. 37
Fiche 7 – Phénotype étendu....................................................................................................................... 41
Généralités.................................................................................................................................................. 79
Fiche 1 – Groupage ABO – RH1............................................................................................................... 81
Fiche 2 – Exercices – Interprétations de résultats obtenus en minigel..................................................... 83
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Introduction à l'immuno-
hématologie
1 - Généralités
2 - Prélèvement sanguin
Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou sur citrate de sodium.
Un prélèvement sur tube sec ne permettra pas la réalisation de tests automatisés.
Les procédures qui concernent les groupes sanguins, et les examens immuno-hématologiques en
général, doivent être rigoureuses, en particulier pour ce qui concerne la prescription des examens et
l'identification des prélèvements.
ATTENTION : Deux déterminations du groupe sanguin sont nécessaires pour obtenir une carte de
groupe sanguin.
La législation précise : deux prélèvements effectués à des moments différents.
L'étiquette doit comporter les informations suivantes: nom du patient, nom de jeune fille, prénoms,
sexe et date de naissance.
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Introduction à l'immuno-hématologie
Demande d'examen :
Toute demande comporte les mêmes informations que celles figurant sur l'étiquette ainsi que :
➔les noms du prescripteur et du préleveur,
➔la date et l'heure du prélèvement,
➔et selon les types d'examen, des renseignements complémentaires chaque fois qu'ils sont utiles à la
réalisation correcte de l'analyse et à son interprétation : antécédents d'anticorps anti-érythrocytaires, de
grossesse ou de transfusions, de réactions transfusionnelles.
Le prélèvement doit être stérile, de moins de 7 jours et conservé dans de bonnes conditions à + 4 °C.
Cependant il est souhaitable d'effectuer la détermination du groupe sanguin dès que possible après le
prélèvement. (en aucun cas une hémolyse ne doit être visible).
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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
- Chapitre 1 -
Groupes sanguins
Pré-requis :
– Système Rhésus
Structure des Ag érythrocytaires
Génétique
Propriétés des Ac plasmatiques
Règles de transfusion
– Système Kell
Structure des Ag érythrocytaires
Génétique
Propriétés des Ac plasmatiques
Règles de transfusion
• Objectifs :
– Savoir réaliser les tests de groupages et phénotypages sanguins
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Introduction à l'immuno-hématologie
Ces antigènes :
– sont portés par des glycoprotéines et des glycolipides enchâssés dans la membrane des hématies et
dirigés vers l’extérieur de la cellule.
– sont divisés en deux groupes :
1°) Le groupe appelé « ABO et ses associés », pour lequel l'antigène est une glycoprotéine ou
glycolipide.
Les antigènes sont des polyosides et à ce titre ne peuvent être les produits directs de gènes, ceux-ci
ne sachant synthétiser que des protéines. Ils en sont donc le produit secondaire.
Les anticorps sont naturels (réguliers ou irréguliers), appartiennent à la classe des IgM, Ac froids
et complets.. Ils rarement acquis ou immuns (appartenant plutôt à la classe des IgG).
Ce groupe est principalement composé de ABO, Hh, Lewis.
2°) Le groupe appelé « Rhésus (Rh) et ses associés », dans lequel chaque molécule porte une
spécificité propre.
Les antigènes sont des protéines, (donc produits primaires des gènes).
Les anticorps ne sont pas naturels mais immuns ; ils ne sont présents que s’il a existé une
stimulation antigénique interhumaine (grossesse ou transfusion). Il appartient plutôt à la classe des
IgG, Ac chauds et incomplets.
Ce groupe est principalement composé de Rh, Kell, Duffy, Kidd, et MnSs.
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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Principaux antigènes
Système Symbole
Appellation Nomenclature
courante internationale
A ABO1
ABO ABO
B ABO2
M MNS1
N MNS2
MNS MNS
S MNS3
s MNS4
D RH1
C RH2
Rhésus RH E RH3
c RH4
e RH5
K KEL1
Kell KEL
k KEL2
Fya FY1
Duffy FY
Fyb FY2
Jka JK1
Kidd JK
Jkb JK2
Lea LE1
Lewis Le
Leb LE2
Lua LU1
Luthéran Lu
Lub LU2
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Introduction à l'immuno-hématologie
- un antigène absent chez le receveur (pour éviter que le receveur ne s’immunise à la suite de ces
transfusions).
- un antigène spécifique d' un anticorps présent dans le sérum (plasma) du receveur (pour éviter une
réaction transfusionnelle liée à un conflit Antigène-Anticorps).
En savoir plus
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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
La détermination des groupes ABO est basée sur le principe général de la réaction d’agglutination
directe active.
AGGLUTINATION : réaction sérologique spécifique entre un Ag particulaire et un Ac aboutissant à la
formation d’un immuncomplexe formant un édifice multiparticulaire (appelé agglutinat) visible à l’œil
nu ou à faible grossissement.
ACTIVE : l’antigène fait partie intégrante de la particule
DIRECTE : les anticorps intervenant sont des anticorps agglutinants (complets – IgM –) provoquant
C'est la cohérence de ces 2 épreuves qui permet de conclure du groupe sanguin ABO.
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1
2 - Matériel
2.1 - Sang à tester
Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou éventuellement sur citrate de sodium..
Les concentrations des suspensions globulaires dépendent de la technique retenue et des indications
données par le fabricant pour chaque réactif
Techniques sur plaque 10% (V/V)
Techniques en tubes à hémolyse 5% (V/V)
Techniques en microtubes (ou microplaque) 1 à 2 % (V/V)
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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
3 - Mode opératoire
3.1 - Aspect législatif
Le groupage ABO doit être effectué dans des conditions très précises et rigoureuses. Le GBEA (Guide
de bonne exécution des analyses de biologie médicale) impose les conditions suivantes :
• une épreuve plasmatique de Simonin à recherche des Ac anti-A et Anti-B avec les hématies
tests A1 et B. Au moins une de ces hématies doit être de phénotype RH -1
Un groupe sanguin valide doit être réalisé sur 2 prélèvements différents, à des temps réellement
différents, à raison d’une détermination par prélèvement.
Culot de GR
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1
Anti A
GR O+ Sérum AB Anti-A Anti –A1 Anti-B Anti-H GR A1 GR A2 GR B
Anti B
BVp
S
S ang N°….
S uspe nsion 10% Plasma
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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Sang N°…. GR GR
Anti-A Anti- GR B GR O
Suspension 5% Anti-A Anti - B Anti-B
Anti-H
A1 A1 A2 Plasma
BVt
S
Introduire :
Introduire :
1 goutte de suspe nsion
1 goutte de sérum test
globulaire te st à 5%
1 goutte de suspe nsion
2 gouttes de sérum à tester
globulaire à tester à 5%
Modalités de lecture
- « +++ » : le culot se décolle et se dissocie en 3 amas maximum (agglutinat
volumineux non dissocié sur fond clair).
- « ++ » : le culot se dissocie en de nombreux amas volumineux (agglutinat
volumineux sur fond clair).
- « + » : le culot se dissocie en de nombreux petits amas (agglutinat fin sur
fond rosé).
- « - » : suspension homogène (« fumée de cigarette »).
3.5 - Témoins
Le témoin auto est réalisé systématiquement, les témoins AB et allo sont surtout réalisés uniquement
en cas de discordance entre les épreuves globulaires et sériques.
Mais par mesure de sécurité, les 3 témoins seront réalisés systématiquement au cours des groupages
ABO.
➔Témoin « auto » = une goutte de sérum à tester et une goutte de GR à tester
➔Témoin « AB » = une goutte d'un sérum de groupe AB (appelé sérum AB, à ne pas confondre
avec le sérum anti-A + anti-B) et une goutte de GR à tester.
➔Témoin « allo » = 2 gouttes de sérum à tester et une goutte de GR test.
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1
4 - Résultat
Témoin allo : (sérum du sujet et GR O). L’absence d’agglutination garantit l’épreuve sérique.
S’il y agglutination, il peut démonter la présence d’allo anticorps irréguliers. L’emploi
systématique de ce témoin a été préconisé ci-dessus. Ce témoin, permet de vérifier que le sérum
du sujet ne contient pas d’Ac capables de reconnaître les Ag autres que les Ag A et les Ag B
(Milieu albumineux).
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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 2
Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1
Interprétation : Interprétation :
Conclusion
- Interpréter les deux épreuves puis conclure.
Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti A+ B Anti-H Anti-A1
Interprétation : Interprétation :
Conclusion
- Interpréter les deux épreuves puis conclure.
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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti A+B Anti-H Anti-A1
Interprétation : Interprétation :
Conclusion
- Interpréter les deux épreuves puis conclure.
Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ Anti-H Anti-A1
anti-B
Interprétation : Interprétation :
Conclusion
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 2
Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ Anti-H Anti-A1
anti-B
Interprétation : Interprétation :
Conclusion
- Interpréter les résultats déjà obtenus, donner le groupe présumé en le justifiant et
proposer les résultats (cohérents) de l’épreuve de Simonin.
Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1
+++ - +++ + - - -
- Interpréter les deux épreuves puis conclure.
7 - Patient J adulte
Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1
- - - - - +++ +++ +++
- Conclure d’après les résultats obtenus.
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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
R echerche de la substance H
dans la salive
La substance H (ou AgH « tissulaire ») soluble peut être trouvée dans la salive ou autres liquides
physiologiques d'individus appelés « sécréteurs ».
1 - Principe du test
2 - Protocole
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 3
3 - Questions
- Proposer les génotypes possibles d'un sujet O sécréteurs et d'un sujet O non sécréteur.
- Schématiser, au niveau moléculaire et cellulaire, la réaction sérologique dans le cas où il y a :
➔ présence de substance H (Ag H« tissulaire ») soluble
➔ absence de substance H (Ag H« tissulaire ») soluble
- Expliquer l'expression : « inhibition d'agglutination »
- Relier les expressions suivantes:
Les hématies agglutinent L'Ag H « tissulaire » a été secrété dans la
salive
Les hématies n'agglutinent pas L'Ag H « tissulaire » n'a pas été secrété dans
la salive
- Proposer un mode opératoire précis pour préparer 1 mL de suspension d'hématies de groupe O
à 3 % dans une solution saline isotonique.
- Proposer la composition qualitative et quantitative de trois témoins permettant la validation de la
technique. Préciser également le rôle de ces témoins.
- Proposer un tableau récapitulatif présentant la composition de chaque test réalisé et le résultat
attendu des témoins.
22 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Cette recherche s'effectue en association avec la recherche des Ag A (ABO1), B (ABO2) et des Ac
anti-A (anti-ABO1) et anti-B (anti-ABO2) lors du groupage ABO-RH1.
1 - Principes
Recherche des Ag D éventuellement présents à la surface des hématies (épreuve globulaire)
Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-D régulier.
Si une personne Rh- possède des anti-D, ce sont des Ac immuns (irréguliers) – IgG.
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4
Schémas immunologiques
Agglutination active indirecte Agglutination active directe
Hématies D +
(Rhésus +RH1
(GR du patient)
Z
Z
AGGLUTINATION
24 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Rhésuscope : plaque chauffante (40°C) mobile - Sérum témoin Rh contrôle sans anti-D, salin.
autour d’un axe.
- vérifier la température de la plaque au moment
de son utilisation. Rhésuscope non indispensable
Une température supérieure à 45°C provoque Température de 20°C ou de 40°C
une dessiccation importante des gouttes de
réactifs (fausse réaction positive ou difficulté de
lecture).
Plasma Suspension à
4 gouttes de 40 % dans son
Culot de GR culot globulaire plasma
TECHNIQUE EN
PLAQUE
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4
Déposer rapidement sur la plaque alvéolée, comme indiqué sur le schéma ci-dessous
Sg Sangs Sg
Sg N° à Sg N° CQI -
CQI + RH1 RH-1
(O,RH-1)
(O,RH1) tester
T R T R T R
Gouttes de T R
suspension
de GR à 40 %
Gouttes de
sérum test
Sérum RH Anti-D*
contrôle
* En laboratoire, deux sérums tests sont parfois utilisés : sérum-test anti-D(VI+) et anti-D(VI-).
26 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
3 - Agglutination en tube
Les hématies à tester sont lavés puis préparés en suspension à 3-5% en milieu sérique (dans leur
propre plasma).
Les témoins effectués sont les mêmes que ceux réalisés au cours de la technique en plaque.
Introduire dans les tubes 50 µL de GR à tester et 50 µL de sérum test. Boucher les tubes.
Si l’agglutination est active indirecte : incuber 45 minutes au bain thermostaté à 37°C ou à l’étuve
à 37°C (tubes bouchés).
B1ABM CM © 27
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4
4.1 - Témoins
CQI (+) : hématies [O, RH1] et sérum test anti-D
L’agglutination témoigne de l’efficacité du sérum test anti-D. ce témoin indique également le moment
de lecture des autres tests.
L’absence d’agglutination (réaction négative) indique que les hématies à tester ne possèdent pas l’AgD ; le
sang est dit Rh négatif (RH-1).
L’absence d’agglutination doit être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessiccation, rajouter une goutte d’eau
physiologique sur la tâche, mélanger avec un agitateur :
le mélange devient homogène, la réaction est négative
une agglutination vraie est observée, les amas d’hématies sont plus nettement perçus, la réaction est positive.
Une agglutination faible et retardée signifie que la réaction est douteuse, une présence d’Ag D faible
est possible.
Toute agglutination douteuse sera contrôlée par une réaction plus sensible : test de Coombs indirect.
28 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Ag D partiel : C'est un Ag D incomplet, auquel il manque des épitopes (ex: DIV, DVII etc ...).
Les patients possédant un Ag D partiel sont considérés comme Rh – s'ils sont receveurs et Rh+ s'ils
sont donneurs.
Remarque : une mère ayant un Ag D partiel peut s'immuniser contre un épitope de l'Ag D qu 'elle ne
possède pas, si son enfant possède l'Ag D complet.
Une technique plus sensible de détection de l’AgD, la réaction de Coombs indirecte ou test indirect à
l'antiglobuline (TIA), est utilisée.
L’arrêté du 26 avril 2002 ne mentionne plus l’obligation d’identifier les sujets RH1
faible à l’aide d’un test indirect à l’antiglobuline. Cette décision se base d’une part sur
l’amélioration des performances des réactifs monoclonaux anti-RH1 utilisés au
laboratoire.
Cependant, si dans de nombreux laboratoires d’immuno-hématologie, la recherche de
RH1 faible n’est plus réalisée chez les patients en vue de transfusion, elle est dans la
plupart des cas encore effectuée chez la femme enceinte et le nouveau-né.
Remarque : On peut effectuer des contrôles de qualité (CQI) positif et négatif à l’aide de suspension
d’hématies témoins [O,RH1] ,[O,RH-1] et [O,RH1 faible].
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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4
Schéma immunologique :
recherche de l'Ag D faible
par la réaction de Coombs indirecte
37°C
30 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
1 - Principes
Ils reposent sur les mêmes principes d’agglutination que le groupage Rhésus standard.
à l’aide d’un sérum test contenant des Ac anti- à l’aide d’un sérum test contenant des Ac anti-
D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e (IgG) enrichi en D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e (IgM) en milieu
albumine (=artifice) à 37°C. salin.
Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-Dou anti-.... régulier.
Si une personne Rh- possède des anti-D, ce sont des Ac immuns (irréguliers) - IgG
B1ABM CM © 31
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5
Schémas immunologiques
Agglutination active indirecte Agglutination active directe
Hématies D +
(RH1))
(GR du patient)
Z
Z
Sérum test
(Ac anti-D ou
anti-C ou … -
IgG)
Sérum-test
(Ac anti-D ou
anti-C ou … - –
IgM)
ADDITION DE L’ARTIFICE
MILIEU ALBUMINEUX Albumine
AGGLUTINATION
32 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Sérum test enrichi en albumine bovine (BSA). Sérum salin contenant des IgM monoclonaux :
Ig G anti-D monoclonale humaine Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c,
Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c, Anti-e
Anti-e
Sérum témoin ou Rh contrôle sans Ac anti-D, Sérum témoin Rh contrôle sans anti-D, salin.
mais enrichi en albumine bovine.
Les sérums tests utilisés : Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c, Anti-e.
B1ABM CM © 33
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5
1 goutte de
sérums tests
Sérum Rh
Anti-DCE
contrôle
2.2.3 - Phénotypage
- Si le Rh standard est connu (cas général), il est inutile de tester les hématies du patient
avec le sérum test anti-D
- Si le Rh standard est positif (individu RH-1), il est inutile d'utiliser le sérum anti-DCE.
Le phénotypage avec les sérums anti-D, anti-C, anti-c, anti-E et anti-e, sont à
effectuer en fonction des résultats obtenus avec le sérum testé précédemment. Il faut
être logique et chronologique.
Il existe un antithétisme, c'est-à-dire que le globule rouge porte soit C, soit c soit les
2 et soit E, soit e, soit les 2. Il faut donc effectuer le phénotypage en tenant compte
de ces données.
34 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Schéma de la plaque :
Sg N°
1 2 3 4 5 6 7
DCE D C c E e
2 gouttes de T Rh
suspension à
40 %
1 goutte de
sérum test
3 - Résultats et interprétation
3.1 - Contrôles de qualité internes (CQI) et témoin
CQI positifs :
Ces contrôles doivent présenter une agglutination. Ils contrôlent l’efficacité des réactifs..
Ce témoin indique également le temps de lecture. Dès que l’agglutination apparaît pour le sang témoin
positif, on peut lire les sangs à tester.
CQI négatifs :
Ce témoin ne doit pas présenter d’agglutination. Ils contrôlent la spécificité des sérums tests,
l’absence de rouleaux due à l’addition d’albumine et enfin limite le temps de lecture (au-delà de
laquelle survient la dessiccation).
B1ABM CM © 35
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5
Les hématies sont lavées puis mises en suspension à 5 % en eau physiologique et les tubes placés
à température ambiante.
CD e c d e c DE
36 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
1 - Généralités
Le système Kell correspond à un ensemble de couples d'allèles codominants et antithétiques:
• les allèles K et k codant pour 2 Ag principaux K (KEL1) et k (KEL2)
• les allèles Kpa et Kpb codant pour les Ag Kpa (KEL3) de faible fréquence et l'Ag Kpb (KEL4), très
largement répandu.
Dans la pratique courante des laboratoires, la recherche se limite à l’Ag Kell car il est après l'Ag D le
plus immunogène des antigènes de groupes sanguins.
Transfusions:
– Un sujet K+, k+ pourra recevoir tous types de phénotype Kell, puisqu’il ne pourra s’immuniser
contre aucun des deux antigènes.
– Un sujet K-, k+ doit recevoir du sang K-. Dans le cas contraire on prend le risque de l’immuniser et
de lui faire produire un anti-K, ce qui se produira statistiquement dans un tiers des cas.
– Un sujet K+, k- doit déjà être considéré comme un « receveur dangereux » car l’allo anti-k qu’il est
susceptible de développer est un anticorps « anti-public » c’est à dire dirigé contre un antigène de
grande fréquence dans la population (ici 99,98%) c’est à dire qu’il rendra toute transfusion ultérieure
incompatible.
Conséquence : Si le receveur est K+, il faut vérifier qu'il possède aussi l'Ag k (agglutination de ses
hématies avec un sérum anti-k), afin de s’assurer que les deux antigènes sont bien présents et que ce
sujet ne doit pas être considéré comme un « receveur dangereux ».
B1ABM CM © 37
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 6
Conséquences: Ils peuvent donner des hémolyses intra-tissulaires et être responsables d’accidents
hémolytiques de transfusion.
Ils peuvent être aussi à l’origine d’une incompatibilité fœto-maternelle.
2 - Principes
Les principes sont les mêmes que pour la recherche des Ag Rhésus.
Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-K régulier.
Si une personne K- possède des anti-K, ce sont des Ac immuns (irréguliers) – IgG
38 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Dans un tube soigneusement référencé, verser 6 gouttes de plasma et 4 gouttes de culot globulaire à
tester.
37°C
6 gouttes de plasma
Plasma
4-5 gouttes de
Culot de GR Suspension de GR à
culot globulaire 40 % dans son plasma
TECHNIQUE EN PLAQUE
3.1.2 - Technique
• Déposer rapidement sur la plaque alvéolée, comme indiqué sur le schéma ci-dessous.
Sangs
CQI – (O,K-) Sg T- Sg N° Sg N° Sg T+ CQI + (O,K+)
à
tester
T R
T R T R T R
Gouttes de
suspension
de GR à 40 %
Gouttes de
sérum test
B1ABM CM © 39
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 6
L’absence d’agglutination (réaction négative) indique que les hématies à tester ne possèdent pas l’Ag
K ; le sang est dit K négatif (KEL-1).
L’absence d’agglutination doit être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessication, rajouter une
goutte d’eau physiologique sur la tâche, mélanger avec un agitateur :
- le mélange devient homogène, la réaction est négative
- une agglutination vraie est observée, les amas d’hématies sont plus nettement
perçus, la réaction est positive.
40 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Phénotype étendu
1 - Définition de l'analyse
Cette analyse consiste à rechercher un ou plusieurs antigènes érythrocytaires autres que ceux qui sont
définis par le groupage ABO.RH1 et par le phénotypage RH-KEL 1.
Ag recherchés
En général, on se limite aux Ag des systèmes Duffy, Kidd et MNS, mais d'autres Ag peuvent aussi
être recherchés.
– Rhésus Ag Cw (RH8),
– Duffy Ag Fya (FY1), Fyb (FY2)
– Kidd Ag Jka (JK1) ,Jkb(JK2)
– MNS Ag M (MNS1), N (MNS2), S(MNS3), s (MNS4)
– Lewis Ag Lea (LE1), Leb (LE2)
– P Ag P1
Le système analytique doit être contrôlé en utilisant, pour chaque spécificité, deux échantillons de
contrôle de phénotypes garantis (typage obtenu par un processus analytique différent de celui qui doit
être contrôlé par ces échantillons).
L'un de ces échantillons doit être négatif et l'autre d'expression «hétérozygote».
B1ABM CM © 41
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 7
42 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
- Chapitre 2 -
Anticorps irréguliers
Pré-requis :
– Structure et propriétés des IgM et IgG
– Propriétés des Ac des systèmes érythrocytaires Rhésus, Duffy, Kidd ; MNS, Lewis, Luthéran, P
....
– Réactions sérologiques d'agglutination
Objectifs :
– Connaître les risques encourus par un patient possédant des anticorps plasmatiques
– Savoir réaliser une recherche d'anticorps irréguliers dans le plasma
– Savoir interpréter les tests de recherche des anticorps irréguliers
B1ABM CM © 43
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités
1 - Rappel – Définitions
Généralités
Ac naturels Ac immuns
(apparaissent spontanément (sont le produit d'une stimulation
- ne sont pas le immunitaire par des Ag du non soi)
produit d’immunisation par des Ag)
Il s'agit généralement d'IgM Il s'agit généralement d'Ig G
Ac réguliers
(Toujours présents en l'absence de l'Ag Ac irréguliers
spécifique) (pas toujours présents en absence de l'Ag
spécifique)
44 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Ces anticorps dits « froids », ont un optimum thermique situé à basse température. Cependant même à
37°C leur dangerosité est grande, ils se fixent sur l’hématie possédant l'Ag spécifique, activent le
complément, puis peuvent s’éluer (se décrocher) de l’hématie et revenir dans le plasma. L’activation
du complément est en général totale, jusqu’à la fraction C9 perforant la cellule, ce qui entraîne une
hémolyse intra-vasculaire avec libération d’hémoglobine libre dans le plasma. Celui ci aura donc une
couleur rouge « laquée », et les urines seront foncées (voire noires).
Ces anticorps dits « chauds », ont un optimum thermique situé autour de 37 - 40°C, se fixant sur
l’hématie possédant l'Ag spécifique. Les hématies ainsi sensibilisées seront phagocytées par les
macrophages, ceux-ci ayant un « récepteur aux IgG ». Il s’agit donc ici d’une hémolyse « intra-
tissulaire » qui aura pour conséquence une dégradation de l’hémoglobine en bilirubine, avec
l’apparition d’un ictère.
B1ABM CM © 45
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités
- Dans le système Kell : Ac irrégulier anti-K et dans les autres systèmes: Duffy, Kidd....
N.B.: des allo-immunisations fœto-maternelles peuvent aussi avoir lieu avec des Ag plaquettaires de
l'enfant.
Remarque :
Dans les 2 cas d’allo-immunisation, la synthèse d’Ac irréguliers ne porte pas à
conséquence dans l’immédiat.
46 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
– Cette analyse complète la RAI , et peut mettre en évidence des Ac anti- “ privés ”, c’est à dire des Ac
dirigés contre des Ag rarement rencontrés dans la population.
– L’EDC s’applique avec un résultat de RAI positif ou douteux et en cas d’antécédent de réaction
hémolytique même mineure.
• le contrôle ultime au lit du malade : épreuve de Beth-Vincent avec le sang du patient et le sang à
transfuser les résultats doivent être identiques.
B1ABM CM © 47
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités
MHNN : anémie hémolytique plus ou moins sévère associé à un ictère prononcé (présence importante
de bilirubine libre dans le sérum) pouvant dans les cas très grave provoquer la mort de l'enfant.
Parfois à la naissance, une exanguinotransfusion avec du sang compatible est nécessaire.
D'autres Ac peuvent être responsables de MHNN : anti-c, anti-C, anti-K
Si l'Ac irrégulier est un Ac anti-plaquettaire fœtale, l'enfant est alors atteint de thrombopénie.
Remarque: seul les IgG irréguliers sont dangereux, car eux seuls traversent la barrière placentaire.
48 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
4.1 - Généralités
D’après les norme iso15189, l’analyse « RAI » consiste à dépister puis à identifier des Ac dirigés
contre les Ag érythrocytaires autres que les Ag A, A1 et B.
Une étape de dépistage est requise et au terme de laquelle le laboratoire pourra répondre « dépistage
positif » ou « dépistage négatif ».
Suite à un dépistage positif une identification doit être mise en œuvre.
- traitement préalable des hématies par une enzyme protéolytique (cette méthode est de
plus en plus abandonnée car les AI mis en évidence par cette technique sont peu dangereux)
puis agglutination.
cf. fiches techniques 2 et 3 du chapitre 2
4.2.1 - Dépistage :
Principe :
B1ABM CM © 49
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités
Les 3 lots d' hématies tests de groupe O doivent permettre la détection des Ac correspondants aux Ag RH1 (D), RH2
(C), RH3 (E), RH4 (c), RH5 (e), KEL 1 (K), KEL 2 (Cellano k), KEL 4 (Kpb), FY1 (Fya), FY 2 (Fyb), JK1 (Jka),
JK2 (Jkb), MNS1 (M), MNS2 (N), MNS3 (S), MNS4 (s), LE1 (Lea), LE2 (Leb), P1, LU1 (Lua) LU2 (Lub).
Les phénotypes RH suivants doivent être obligatoirement représentés sur la gamme de dépistage :
- RH : 1, 2, -3, -4, 5 (DCe)
- RH : 1, -2, 3, 4, -5 (DcE)
- RH : -1, -2, -3, 4, 5 (dce)
Une expression du phénotype « homozygote » doit être respecté pour les Ag FY1, JK1, JK2, MNS3 et recommandée
pour les Ag FY2 et MNS4
Interprétation:
L'absence d'agglutination avec les 3 séries d'hématies (= panel de dépistage) permet de conclure à
l'absence d'AI dans le sérum du patient
La présence d'une agglutination avec une ou plusieurs séries d'hématies permet conclure à la présence
d'une ou plusieurs AI
Dans ce cas, il faut poursuivre la recherche par l'identification précise de l'AI.
4.2.2 - Identification
Si le dépistage d'AI est positif, l'identification de ou des AI selon le même principe que
précédemment, mais en utilisant 10 séries d'hématies phénotypées de groupe O (=panel
d'identification).
L’ensemble de ces hématies de groupe O doit comporter les antigènes suivants : Ag RH1 (D), RH2 (C), RH3 (E),
RH4 (c), RH5 (e), RH8 (Cw), KEL 1 (K), KEL 2 (Cellano k), KEL3 (Kpa), KEL 4 (Kpb), FY1 (Fya), FY 2 (Fyb),
JK1 (Jka), JK2 (Jkb), MNS1 (M), MNS2 (N), MNS3 (S), MNS4 (s), LE1 (Lea), LE2 (Leb), P1, LU1 (Lua) LU2
(Lub).
Les phénotypes suivants doivent être représentés au moins sur 2 hématies : KEL1, FY1 ; -2, JK 1 ; -2, JK-1 ;2, MNS
3, -4, MNS -3 ;4, P-1.
Les AI identifiés pourront ensuite être dosés. (cf fiche technique 7 du chapitre 2)
La présence d'AI maternels déjà fixés sur les hématies fœtales est recherchée
- par la réaction de Coombs directe ou test direct à l'anti-globuline (TDA)
Une agglutination des hématies fœtales en présence d'anti-globuline (anti-IgG et anti-C3d)
atteste de la sensibilisation des hématies fœtales par les AI maternels.
Les AI seront ensuite élués puis identifiés .
cf. fiches techniques 4 et 7 chapitre 2 .
50 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
1 - Principe
La présence d'Ac irréguliers est recherchée dans le sérum d'un patient
-par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant des anti-globulines humaines (AGH)
-à l'aide d'un panel d'hématies phénotypées.
1ére étape : les GR sont sensibilisés par les AI éventuels présents dans le sérum du patient
2ème étape : lavages → élimination des Ig non spécifiquement fixés à l'Ag érythrocytaire.
☞ Importance des lavages : la réaction de Coombs n'est spécifique que si les GR sont débarrassées de
toutes traces d'Ig non fixées spécifiquement sur l'Ag.
Remarques :
- Variantes :
Coombs à basse force ionique (BFI). Augmentation de la fixation des Ac sur les Ag
et diminution du temps de sensibilisation.
Coombs sur hématies trypsinées. Augmentation de l’accessibilité des Ag.
- Inconvénient :
Certains Ac irréguliers ne sont pas détectés par cette technique
B1ABM CM © 51
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2
Schéma immunologique
SÉRUM À TESTER
Les Ac irréguliers (Anti-D, anti-K, anti-Jka etc..)
présent dans le sérum à tester se fixent sur les GR
phénotypés possédant les Ag spécifiques : GR
sensibilisés.
52 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
2 - Technique
2.1 - Réactifs
Hématies phénotypées de groupe O
• panel de dépistage : 3 séries d'hématies dont l'éventail des Ag couvre l'ensemble des AI recherchés :
dépistage des AI
ou
• panel d’identification: 10 séries d'hématies identification des AI (si le dépistage est +)
Hématies phénotypées
• panel de dépistage : 3 séries d'hématies dont l'éventail des Ag couvre l'ensemble des AI recherchés :
dépistage des AI
ou
• panel d’identification: 10 séries d'hématies identification des AI (si le dépistage est positif)
B1ABM CM © 53
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2
54 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
3 - Résultats et interprétations
- CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs
dues à l’AGH. En absence d’Ag, les Ac ne conduisent pas à une agglutination.
L’AI identifiée est ensuite titrée. Le sérum est alors conservé par congélation en vue de titrage
ultérieurs.
B1ABM CM © 55
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2
En savoir plus
56 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
1ère étape : les GR sont traités par une enzyme protéolytique (papaïne, broméline …) à 37°C.
2ème étape : lavages élimination des fragments éliminés par le traitement ainsi que les enzymes
3ème étape : les GR traités sont sensibilisés par les AI éventuels présents dans le.sérum du patient.
REMARQUES :
➢ Avantages :
• Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Rhésus.
• Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Kidd par la papaïne.
• Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Lewis par la ficine.
B1ABM CM © 57
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 3
Schéma immunologique
37°C
TRAITEMENT ENZYMATIQUE
37°C
SÉRUM À TESTER
58 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
2 - Technique
2.1 - Réactifs
Enzyme protéolytique : trypsine ou papaïne ou broméline ou ficine .....
Les hématies des panels sont traitées par les enzymes (en respectant la procédure indiquée par le
fabriquant), lavées en eau physiologique puis remise ne suspension à 40% (test sur rhésuscope) ou à
10 % (test en tube).
3 - Résultats et interprétations
- CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs
dues un traitement enzymatique trop important. Les Ac en absence d’Ag ne conduisent pas à une
agglutination.
L’AI identifiée est ensuite être titrée Le sérum est alors conservé par congélation en vue de titrage
ultérieurs.
B1ABM CM © 59
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 3
60 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
1ére étape : lavages des hématies sensibilisées en solutions salines (élimination des Ig non
spécifiquement fixés à l'Ag érythrocytaire).
☞ Importance des lavages : la réaction de Coombs n'est spécifique que si les GR sont débarrassées de
toutes traces d'Ig non fixées spécifiquement sur l'Ag.
À savoir
Cette technique permet de révéler la présence :
•d’agglutinines irrégulières (AI) d’origine maternelle sur les GR fœtaux (cf MHNN)
•d’auto-Ac sur les GR d’un patient atteint d'anémie hémolytique auto-immune – cf cours
hématologie B2ABM)
B1ABM CM © 61
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 4
Schéma immunologique
Ajout d’AGH
62 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
2 - Technique
Le sang à examiner peut être:
-du sang du cordon ou du nouveau né, recueilli sur anticoagulant, déposé au froid et porté au
laboratoire immédiatement après le prélèvement
- du sang d'un patient possédant des allo-Ac (cas d'une transfusion incompatible) ou des auto-Ac (cas
d'une maladie auto-immune provoquant une anémie hémolytique=AHAI).
GR du patient sont mis en suspension saline à 50 %.
2.1 - Réactifs
Sérum anti-globuline humaine (AGH) : sérum polyspécifique ou monospécifique.
Contrôles de qualité :
– CQI (+) : hématies O Rh+ ( 50 % en eau physiologique)
– CQI (-) : hématies O Rh -
– sérum anti-D salins (ne contenant que des IgG anti-D)
3 - Résultats et interprétations
- CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs
dues à l’AGH. Les Ac en absence d’Ag ne conduisent pas à une agglutination.
B1ABM CM © 63
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 4
Réaction de Coombs
Dans 4 tubes à hémolyse, verser :
directe
Réaction T contrôle CQI (+) CQI (-)
Sérum anti-D - - 2 gouttes 2 gouttes
Sensibilisation des
1 goutte de 1 goutte de
GR témoins GR témoins - -
GR [O, Rh +] GR [O, Rh -]
Incuber à 37°C – 30 min
GR du
patient 1 goutte 1 goutte - -
50 % eau Ψ
Eau Ψ 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL
Lavage Centrifuger 3 min à 800g
Jeter l’eau du lavage dans la Javel et décoller le culot en grattant le tube sur
le portoir
Refaire ainsi 2 autres lavages dans 4 mL d'eau physiologique
Puis déposer sur chaque culot du dernier lavage :
Eau Ψ 3 gouttes 3 gouttes 3 gouttes 3 gouttes
Suspension à
20 % de GR pour
Poursuivre comme indiqué dans le tableau jaune (Technique en plaque)
technique en
ci-dessous.
plaque
Suspension à 5 % Eau Ψ 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL
de GR pour Poursuivre comme indiqué dans le tableau bleu (Technique en tubes)
technique en tube ci-dessous.
Eau Ψ : Eau physiologique
Technique en plaque
Réaction T contrôle CQI (+) CQI (-)
Suspensions
1 goutte 1 goutte 1 goutte 1 goutte
Agglutination des à 20 %
GR sensibilisés et AGH 1 goutte - 1 goutte 1 goutte
lavés
par l’AGH Eau Ψ - 1 goutte - -
Mélanger à l’aide d’un agitateur
Laisser reposer 5 min sur la paillasse et observer la présence éventuelle
d’agglutination.
• S’il s’agit d’une femme multipare (plusieurs enfants) ou s’il s’agit d’une personne
polytransfusée il y a une probabilité non négligeable de trouver plusieurs agglutinines
irrégulières.
La fréquence des agglutinines irrégulières : Ac irréguliers les plus fréquemment rencontrés : Anti-D,
anti-E, anti-c, anti-Jka, anti-K (En général les Ac anti Ag du système Rhésus, Kell, Duffy et Kidd).
B1ABM CM © 65
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
Papaïne * 37°C
Rhésus Kell Duffy Kidd MNs Lewis P Cw Luthéran
Lots
de
GR
2.2 - Interprétation
2.2.1 - Auto-contrôle
Un autocontrôle positif signale la présence d’un auto-anticorps qui doit être confirmée par
la réalisation d’un test de Coombs direct. (cf. fiche 4 )
Il est alors nécessaire d’adsorber l'auto-anticorps (incubation du sérum avec les hématies du
patient) pour déceler et identifier un éventuel allo-anticorps masqué en renouvelant la RAI
après adsorption ;
→ Des résultats négatifs [absence (-) d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la
papaïne), avec les 3 lots d'hématies, prouvent l'absence d'agglutinine irrégulière (AI).
→ Des résultats positifs [présence (+) d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la
papaïne), avec un lot au moins d'hématies, prouveraient la présence d'agglutinines irrégulières,
qu'il faudra identifier puis titrer.
66 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Présence (+) ou absence (-) des Ag à la surface des hématies du lot Résultat
Papaïne* 37°C
Rhésus Kell Duffy Kidd MNs Lewis P Cw Luthéran
Lots
de
GR
01 + + - - + + + + + + + + - + - - + + + - + -
02 + + - - + - + - + + - + - - + - + + - - + -
03 + - + + - - + - + - + + + + + - + - - + + -
04 - + + - + - + - + - + + - - + + - - - - + -
05 - - + + + - + + - + + - + - + - + S - - + -
06 - - + - + + + - + + + - + - + + - - - - + -
07 - - + - + - + + - - + + - + - - - - - - + -
08 + - + - + - + - - + - + + - + + - + - - W -
09 - - + - + - + + - + - + - + - - + + - - + -
10 - - + - + - + - + + - + + - + + - - - + + -
11 - - + - + + W + + + - + - + - - + S - - + +
Auto
con-
trôle
B1ABM CM © 67
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
3.2 - Interprétation
3.2.1 - Auto-contrôle
➔ Un autocontrôle positif signale la présence d’un auto-anticorps, qu'il faudra confirmer
puis éliminer (cf. 2.2.1) pour refaire une RAI.
➔ Un auto-contrôle négatif et des résultats positifs à tous les lots d'hématies [présence (+)
d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la papaïne) doit orienter vers la recherche
d’un anticorps dirigé contre un antigène de grande fréquence, dit « public ».
Si l'auto-contrôle est négatif, et si tous les résultats aux tests de Coombs indirect (et papaïne) ne
sont pas tous positifs, procéder à l'identification des AI.
Cependant, dans certains cas, il faut tenir compte des éventuelles disparités de réaction entre les deux tests
(Coombs indirect ou papaïne), qui peuvent alors s’expliquer par des disparitions ou affaiblissements des Ag par
le traitement à la papaïne.
68 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
B1ABM CM © 69
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
70 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
B1ABM CM © 71
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
72 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
B1ABM CM © 73
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5
Illustration 3: Agglutination en
tube. A: négatif - B: positif
74 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
1 - Généralités
Les anticorps irréguliers peuvent être de type IgM (immun ou naturels) ou IgG.
Les Ac de type IgM sont généralement des Ac complets.
Leur mise en évidence repose alors sur une réaction d’agglutination active directe.
Ce titrage est mis en œuvre en particulier pour vérifier le titre en Ac d'un sérum test.
2.1 - Principe
Les Ac naturels (IgM) irréguliers du système ABO sont titrés par une technique de dilution en série
d’un sérum et à l’aide d’une agglutination directe active.
Le titre en Ac anti-A1 est exprimé en UI/mL. Dans ce cas, le titrage des anticorps du sérum à titrer
nécessite une comparaison avec un sérum étalon de titre connu
1 Attention : les Ac de type IgM peuvent être naturels réguliers (ex : anti-A), naturels irréguliers (ex:anti-A1) ou encore
immuns.
B1ABM CM © 75
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 6
2.2.2 - Technique
deux titrages seront entrepris : sérum Sx et sérum étalon de titre ..........UI/mL
Réaliser 2 séries de dilution : 1 série de dilution par sérum
– Dilution de base de 1 et de raison 1/2
– -Diluant : eau physiologique.
– Volume final après dilution du sérum : 50 µL
– Volume de suspension érythrocytaire : 25 µL
Compléter le tableau suivant
Cupule n° 1 2 3 4 5 6 7 8
Diluant (µL)
50
Sérum étalon ou -
sérum x (µL)
Volume à -
redistribuer (µL)
Dilution -
1/1
Hématies A1 (µL) 25 25
Lecture de la plaque
S étalon
Résultats S étalon
Lecture de la plaque
Sx
Résultats Sx
2.3 - Interprétation
Rôle de la cupule 8 : ................................................................
Le titre d'Ac anti-A1 d'un sérum correspond à la plus grande dilution du sérum donnant encore
un voile d'agglutination .
Titre d'Ac anti-A1 en dilution (d) et en inverse (Fd)
• du sérum étalon : ....................
• du sérum inconnu :.................
76 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
1 - Généralités
Les Ac irréguliers sont en majorité incomplets (IgG), leur mise en évidence par une réaction
d'agglutination nécessite un artifice agglutination indirecte (artificielle).
Le GBEA et les normes ISO 15189 préconisent d'utiliser le test indirect à l'antiglobuline (TIA) ou test
de Coombs indirect.
2.1 - Principe
Les Ac immuns irréguliers anti-D (IgG) sont titrés par une technique de dilution en série d’un sérum et
à l’aide d’une agglutination indirecte active (antiglobuline humaine).
Le titre en Ac anti-D est exprimé en UI/mL. Dans ce cas, le titrage des anticorps du sérum à titrer
nécessite une comparaison avec un sérum étalon de titre connu
B1ABM CM © 77
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 7
2.2.2 - Technique.
Réaliser une série de dilution du sérum à tester de base de 1 et de raison ½
– Diluant : eau physiologique.
– Volume final après dilution du sérum : 50 µL
Cupule n° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Diluant (µL) 75 50 50
Sérum - 50 -
sérum x (µL)
Volume à - - -
redistribuer
(µL)
Dilution 1/1 -
Hématies 25 25 25 25
Rh+ (µL)
Recouvrir d’un parafilm. Agiter 1 min et incuber à 37°C pendant 20 min.
AGH (µL) 50 - - 50
2.3 - Interprétation
Donner le rôle des cupules 8, 9 et 10
Donner le titre d'Ac anti-D en dilution (d) et en inverse (Fd) du sérum à tester.
78 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
- Chapitre 3 -
Techniques en gel filtration
Généralités
Ces techniques ont l'avantage d'être automatisables.
1 - Principe
Le mélange hématies-sérum se déroule au sein d’un gel.
– Les hématies n’ayant fixé aucun Ac traversent et sédimentent au fond du micro tube (Le diamètre des
hématies est inférieur aux mailles et pores du gel utilisé).
– Les immun complexes correspondant à des agglutinats (édifice multiparticulaire d’Ag réunis par des
ponts d’Ac) spécifiques aux Ag) restent bloqués dans les mailles du gel.
• Une réaction négative se traduit par une sédimentation des GR libres dans le fond du micro tube.
• Une réaction fortement positive se traduit par une rétention des hématies agglutinées, dans la partie
supérieure du micro tube.
• Une réaction faiblement positive se traduit une dissémination des hématies agglutinées, à l’intérieur
du micro tube.
La réaction Ag-Ag est accélérée et révélée après centrifugation.
B1ABM CM © 79
Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – Généralités
Avantages et inconvénients.
•Grande sensibilité.
•Petite quantité de réactif nécessaire.
•Nombre de manipulation réduit.
80 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
1 - Matériel et réactifs
− Carte « ID ABO/Rh » possédant six microtubes contenant des gels A, B, AB, D, DCE et ctl :
è gel A contenant des Ac anti-A
è gel B contenant des Ac anti-B
è gel AB contenant des Ac anti A+anti-B
è gel D contenant des Ac anti-D
è gel DCE contenant des Ac anti-D+anti-C+anti-E
è gel ctl neutre immunologiquement.
− un tube à hémolyse contenant environ 1mL de diluent ID2 (basse force ionique)
− 2 tubes à hémolyse
− 2 pastettes et 1 pipette automatique de 10 µL
− gants.
2 - Mode opératoire
A partir du tube de sang fourni, recueilli sur EDTA et centrifugé :
− préparer une suspension globulaire à environ 5 % (soit environ 1/20) en tampon ID2 dans un
tube à hémolyse.
− mélanger et incuber 10 min à température ambiante.
− enlever la pellicule d’aluminium de la carte délicatement de manière à ne pas souiller les
microtubes entre eux.
− déposer à la surface de chaque gel, 10 µL de suspension globulaire à 5%.
Attention : ne pas toucher le bord des microtubes avec la pointe de pipette.
− centrifuger la carte dans la centrifugeuse ID spécifique.
3 - Lecture et interprétation
Réaliser un tableau de résultat, dans lequel seront schématisé l'aspect des gels et l'interprétation
correspondante.
Interpréter l'ensemble des résultats et proposer des tests complémentaires.
B1ABM CM © 81
Chapitre 23– Techniques en gels filtration – fiche 1
82 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
E
1 - Étude du cas 1
xercices – Interprétations de
résultats obtenus en minigel
Système Diamed®
Analyser les gels suivants, concernant une patiente, 32 ans, déjà mère de 3 enfants et enceinte d'un
4ème enfant.
Pour chaque gel, indiquer la présence ou non de composés additionnels et préciser la composition du
dépôt versé sur chaque gel.
B1ABM CM © 83
Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – fiche 2
2 - Étude du cas 2
Un patient doit subir seconde transfusion sanguine. .
Interpréter les résultats obtenus sur les cartes de groupage et phénotypage correspondantes.
Analyser les résultats obtenus pour le dépistage des agglutinines irrégulières, ainsi que pour
l’identification.
Coombs Enzyme
1 2 3 1 2 3 4 5 6 4 5 6
7 8 9 7 8 9 10 11 Ctl 10 11 Ctl
Coombs Enzyme Coombs Enzyme
84 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques
Panel d'hématies Rhésus Kell Duffy MNs Lewis P Cw Luthéran Coombs Papaï-
n°00689 D C c E e K k Fya Fyb M N S s Lea Leb P1 Cw Lua Lub 37°C ne
37°C
Panel 1 + + - - + - + + - + + + + + - + + + +
de 2 + - + + - + + - + + - + - - + + - - +
dépista 3 - - + - + - + + + + - - + - + S - - +
ge
PANEL D’IDENTIFICATION
01 + + - - + - + + + + - + - - + + + - +
02 + + - - + - + - + + - - + - + + - - +
03 + - + + - - + - + + + + + - + - + + +
04 - + + - + - + - + + - - + + - - - - +
05 - - + + + + + + - - + - + - + S - - +
06 - - + - + - + - + - + - + + - - - - +
07 - - + - + - + + - + - + - - - - - - +
08 + - + - + - + - - + + - + + - + - - W
09 - - + - + - + + - + - + - - + + + - +
10 - - + - + - + - + + + - + + - - - + +
11 - - + - + - W + + + - + - - + S - - +
contrôle
3 - Étude du cas 3
Dépistage d'une maladie hémolytique chez un nouveau-né :
– recherche des Ag érythrocytaires A,B et D
– test de Coombs direct (ou test direct à l'antiglobuline).
• Pour chaque gel utilisé ci-dessous, indiquer la présence ou non de composés additionnels et préciser
la composition du dépôt versé sur chaque gel.
• Analyser les résultats obtenus et conclure.
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