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Immuno-

hématologie
Livret 4 d'activités technologiques

A+

Chantal Muller (Professeur - Lycée La Martinière Duchère - LYON )


Remerciements

Mes remerciements vont à tous ceux qui ont permis la réalisation de cet ouvrage, en particulier
certaines de mes collègues, professeurs au lycée La Martinière Duchère de Lyon avec qui j'ai travaillé
avec énormément de plaisir en immuno-hématologie :

Stéphanie Darmochod et Caroline Platroz qui


m'ont aidé à améliorer ces fiches techniques
ont réalisé de nombreux schémas (en particulier Stéphanie)
et ont relu l'ensemble des livrets.

Un remerciement aussi à Christiane Robin,


technicienne de laboratoire au lycée La Martinière Duchère de Lyon,
qui a contribué avec compétence et gentillesse à la mise au point de techniques.

Des remerciements aussi pour Gilles et Sangeetha Muller qui m'ont aidé pour la mise en page.
Avant-propos

Ce livret 4 d'activités technologiques s'adresse aux étudiants de première année de section de


technicien supérieur d'analyses de biologie médicale (B1ABM).

Il correspond au module 4 des activités technologiques d'hématologie du référentiel 2008 du brevet de


technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.

Ce livret 4 fait partie de quatre livrets relatifs aux enseignements technologiques d'hématologie de la
section technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.

Livret 1 – Cellules normales du sang et de la moelle rouge des os


Livret 2 – Hémopathies
Livret 3 – Hémostase
Livret 4 – Immuno-hématologie

MAI 2012
Sommaire
Introduction à l'immuno-hématologie......................................................................................................... 5

Chapitre 1 – Groupes sanguins

Pré-requis et objectifs................................................................................................................................. 7
Détermination des groupes sanguins-Généralités ..................................................................................... 8
Fiche 1 – Détermination des groupes sanguins du système ABO ............................................................ 11
Fiche 2 – Exercices: groupage ABO ........................................................................................................ 18
Fiche 3 – Recherche de la substance H dans la salive.............................................................................. 21
Fiche 4 – Groupage Rhésus standard........................................................................................................ 23
Fiche 5 – Phénotypage Rhésus complet.................................................................................................... 31
Fiche 6 – Détermination du groupe érythrocytaire dans le système Kell.................................................. 37
Fiche 7 – Phénotype étendu....................................................................................................................... 41

Chapitre 2 – Anticorps irréguliers


Pré-requis et objectifs................................................................................................................................. 43
Fiche 1 – Recherches des anticorps irréguliers - Généralités ................................................................... 44
Fiche 2 – Test de Coombs indirect ........................................................................................................... 51
Fiche 3 – Test enzymatique à la papaïne................................................................................................... 57
Fiche 4 – Test de Coombs direct ............................................................................................................... 61
Fiche 5 – Procédure d'identification des anticorps irréguliers (AI) et exercices d'application.................. 65
Fiche 6 – Titrage des anticorps irréguliers de type IgM............................................................................. 75
Fiche 7 – Titrage des anticorps irréguliers de type IgG............................................................................. 77

Chapitre 3 – Techniques en gel filtration

Généralités.................................................................................................................................................. 79
Fiche 1 – Groupage ABO – RH1............................................................................................................... 81
Fiche 2 – Exercices – Interprétations de résultats obtenus en minigel..................................................... 83
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Introduction à l'immuno-
hématologie
1 - Généralités

L’immuno-hématologie correspond à l’étude :


- des antigènes portés par les éléments figurés du sang
- de l’immunisation qu’ils peuvent induire.
- des pathologies qui en résultent.

L'immuno-hématologie est donc une partie de la médecine commune à l'hématologie et à


l'immunologie.
Elle concerne l'étude:
– des groupes sanguins
– du système HLA
– des Ac irréguliers (RAI) mis en cause dans les les incompatibilités fœto-maternelles,
transfusionnelles
– d'auto-Ac formés lors de pathologies auto-immunes …

2 - Prélèvement sanguin
Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou sur citrate de sodium.
Un prélèvement sur tube sec ne permettra pas la réalisation de tests automatisés.

Les procédures qui concernent les groupes sanguins, et les examens immuno-hématologiques en
général, doivent être rigoureuses, en particulier pour ce qui concerne la prescription des examens et
l'identification des prélèvements.
ATTENTION : Deux déterminations du groupe sanguin sont nécessaires pour obtenir une carte de
groupe sanguin.
La législation précise : deux prélèvements effectués à des moments différents.

Étiquetage des tubes :


L'étiquetage des tubes doit se faire :
➔par la personne qui a prélevé,
➔immédiatement après le prélèvement,
➔sur le lieu du prélèvement,
➔en contrôlant l'identité du patient et en la lui faisant décliner chaque fois que cela est possible.
Les contrôles doivent être particulièrement vigilants chez les sujets comateux et les nouveaux-nés.

L'étiquette doit comporter les informations suivantes: nom du patient, nom de jeune fille, prénoms,
sexe et date de naissance.

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Introduction à l'immuno-hématologie

Demande d'examen :
Toute demande comporte les mêmes informations que celles figurant sur l'étiquette ainsi que :
➔les noms du prescripteur et du préleveur,
➔la date et l'heure du prélèvement,
➔et selon les types d'examen, des renseignements complémentaires chaque fois qu'ils sont utiles à la
réalisation correcte de l'analyse et à son interprétation : antécédents d'anticorps anti-érythrocytaires, de
grossesse ou de transfusions, de réactions transfusionnelles.
Le prélèvement doit être stérile, de moins de 7 jours et conservé dans de bonnes conditions à + 4 °C.
Cependant il est souhaitable d'effectuer la détermination du groupe sanguin dès que possible après le
prélèvement. (en aucun cas une hémolyse ne doit être visible).

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

- Chapitre 1 -
Groupes sanguins
Pré-requis :

– Système ABO et système H :


 Structure des Ag érythrocytaires et tissulaires
 Génétique
 Propriétés des Ac plasmatiques
 Règles de transfusion

– Système Rhésus
 Structure des Ag érythrocytaires
 Génétique
 Propriétés des Ac plasmatiques
 Règles de transfusion

– Système Kell
 Structure des Ag érythrocytaires
 Génétique
 Propriétés des Ac plasmatiques
 Règles de transfusion

– Système MNS, Duffy, Kidd, Lewis, Luthéran...


 Structure des Ag érythrocytaires
 Génétique
 Propriétés des Ac plasmatiques
 Règles de transfusion

– Réactions immunologiques d'agglutination

– Propriétés antigéniques des anticorps

• Objectifs :
– Savoir réaliser les tests de groupages et phénotypages sanguins

– Savoir valider les tests réalisés

– Savoir interpréter les tests réalisés

– Connaître les règles de la transfusion

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Introduction à l'immuno-hématologie

Détermination des groupes sanguins

1 - Présentation générale des groupes sanguins


Un certain nombre d’antigènes (plus de 250 connus à ce jour codés par 29 systèmes) sont présents
sur les membranes des hématies humaines.
Ces antigènes sont codés par des gènes correspondants à des systèmes dont la connaissance est
nécessaire dans plusieurs domaines : transfusion sanguine, allo immunisation fœto-maternelle,
transplantation ou études génétiques.

Ces antigènes :
– sont portés par des glycoprotéines et des glycolipides enchâssés dans la membrane des hématies et
dirigés vers l’extérieur de la cellule.
– sont divisés en deux groupes :

1°) Le groupe appelé « ABO et ses associés », pour lequel l'antigène est une glycoprotéine ou
glycolipide.
Les antigènes sont des polyosides et à ce titre ne peuvent être les produits directs de gènes, ceux-ci
ne sachant synthétiser que des protéines. Ils en sont donc le produit secondaire.
Les anticorps sont naturels (réguliers ou irréguliers), appartiennent à la classe des IgM, Ac froids
et complets.. Ils rarement acquis ou immuns (appartenant plutôt à la classe des IgG).
Ce groupe est principalement composé de ABO, Hh, Lewis.

2°) Le groupe appelé « Rhésus (Rh) et ses associés », dans lequel chaque molécule porte une
spécificité propre.
Les antigènes sont des protéines, (donc produits primaires des gènes).
Les anticorps ne sont pas naturels mais immuns ; ils ne sont présents que s’il a existé une
stimulation antigénique interhumaine (grossesse ou transfusion). Il appartient plutôt à la classe des
IgG, Ac chauds et incomplets.
Ce groupe est principalement composé de Rh, Kell, Duffy, Kidd, et MnSs.

2 - Principe des tests et validation technique


Les tests mis en œuvre lors des groupages sanguins (ABO/RH) ou lors des phénotypages sanguins sont
tous basés sur des réactions d'agglutination active directe (si Ac=IgM) ou indirecte (si Ac=IgG).

La validation technique (ou analytique)du typage érythrocytaire repose sur :


–des résultats conformes des témoins et des contrôles de qualités internes (CQI),
–une absence de double population érythrocytaire.
–un profil réactionnel cohérent,
–une absence de discordance entre deux réalisations,
–une absence de discordance avec des résultats antérieurs éventuels.

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

3 - Nomenclatures des principaux systèmes et antigènes de


groupes sanguins

Principaux antigènes
Système Symbole
Appellation Nomenclature
courante internationale
A ABO1
ABO ABO
B ABO2

M MNS1

N MNS2
MNS MNS
S MNS3

s MNS4

D RH1

C RH2

Rhésus RH E RH3

c RH4

e RH5

K KEL1
Kell KEL
k KEL2

Fya FY1
Duffy FY
Fyb FY2

Jka JK1
Kidd JK
Jkb JK2

Lea LE1
Lewis Le
Leb LE2

Lua LU1
Luthéran Lu
Lub LU2

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Introduction à l'immuno-hématologie

4 - Principe général des règles transfusionnelles


Avec les groupes ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd, MnS .. dont la connaissance assure la sécurité de la
très grande majorité des transfusions, il est illusoire de penser que la réalisation des transfusions est
« compatibles dans tous les systèmes ».

La sécurité transfusionnelle repose sur le principe général suivant :

Ne pas apporter, par les hématies transfusées :

- un antigène absent chez le receveur (pour éviter que le receveur ne s’immunise à la suite de ces
transfusions).

- un antigène spécifique d' un anticorps présent dans le sérum (plasma) du receveur (pour éviter une
réaction transfusionnelle liée à un conflit Antigène-Anticorps).

En savoir plus

Karl Landsteiner était un biologiste et médecin


autrichien. Il a établit le premier classement des
groupes sanguins, le groupe ABO. (1909)

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 1

D étermination des groupes sanguins


du système ABO
1 - Principe

La détermination des groupes ABO est basée sur le principe général de la réaction d’agglutination
directe active.
AGGLUTINATION : réaction sérologique spécifique entre un Ag particulaire et un Ac aboutissant à la
formation d’un immuncomplexe formant un édifice multiparticulaire (appelé agglutinat) visible à l’œil
nu ou à faible grossissement.
ACTIVE : l’antigène fait partie intégrante de la particule

DIRECTE : les anticorps intervenant sont des anticorps agglutinants (complets – IgM –) provoquant

Cette détermination fait appel à deux épreuves :


 Une épreuve globulaire (de BETH-VINCENT-TZANCK) correspondant à l’identification des
Ag globulaires à l’aide d’anticorps connus (sérums tests).

 Une épreuve sérique (de SIMONIN) correspondant à l’identification des Ac naturels à


l’aide d’Ag connus (globules rouges tests).

C'est la cohérence de ces 2 épreuves qui permet de conclure du groupe sanguin ABO.

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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1

2 - Matériel
2.1 - Sang à tester
Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou éventuellement sur citrate de sodium..

2.2 - Sérums tests


Sérums polvclonaux d'origine humaine provenant de donneurs sélectionnés (= allo-antisérum)
Anticorps monoclonaux d'origine murine (=hétéro-antisérum) :
Sérum test anti-A (coloration bleue)
Sérum test anti-B (coloration jaune)
Sérum test anti-A et anti-B (coloration naturelle du sérum)
« Sérums » d'origine animale ou végétale (= hétérosérum) :
Sérum ou solution test anti-H = sérum d'anguille (xénoantisérum) ou
phytoagglutinine extraite de graines d'Ulex europaeus.
Solution test anti-A1 = phytoagglutinine extraite de graines de Dolichos
biflorus

2.3 - Hématies-tests (hématies étalons lavées et prêtes à l'emploi)


Hématies étalons Al, (Rhésus -)
Hématies étalons A2, (Rhésus -) ne sont plus obligatoires
Hématies étalons B, (Rhésus -)
Hématies étalons 0, (Rhésus +)
Ce sont des hématies humaines prélevées sur anticoagulant. Elles ont été lavées 3 fois en sérum
physiologique puis remises en suspension dans une solution conservatrice.

Les concentrations des suspensions globulaires dépendent de la technique retenue et des indications
données par le fabricant pour chaque réactif
Techniques sur plaque 10% (V/V)
Techniques en tubes à hémolyse 5% (V/V)
Techniques en microtubes (ou microplaque) 1 à 2 % (V/V)

2.4 - Petits matériels


Plaque d’opaline et/ou plaque alvéolée à usage unique.
Pipettes Pasteur ou Psipettes
Agitateur en verre
Tubes de Khan et Portoir.
Centrifugeuse

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

3 - Mode opératoire
3.1 - Aspect législatif
Le groupage ABO doit être effectué dans des conditions très précises et rigoureuses. Le GBEA (Guide
de bonne exécution des analyses de biologie médicale) impose les conditions suivantes :

La réalisation du groupage sanguin nécessite :


• une épreuve globulaire de Beth Vincent à recherche des Ag érythrocytaires A (ABO1) et B
(ABO2) avec les Ac monoclonaux anti-A (anti-ABO1) et anti-B (anti-ABO2) et anti-AB (anti-
ABO3)
L’annexe D II précise que :
... Le réactif anti-B utilisé ne doit pas donner de réaction croisée vis-à-vis de l’antigène B acquis.
L’un des deux réactifs, anti- A ou anti-AB, doit pouvoir reconnaître les hématies Ax.

• une épreuve plasmatique de Simonin à recherche des Ac anti-A et Anti-B avec les hématies
tests A1 et B. Au moins une de ces hématies doit être de phénotype RH -1

Une détermination du groupe sanguin : deux définitions


– 1er cas : technique totalement automatisée (groupage + contrôles + enregistrement des
échantillons et des prescriptions):
à 1 détermination = 1 réalisation exécutée par un lot de réactif et un technicien

– 2ème cas : technique manuelle ou semi-automatisée :


 1 détermination = 2 réalisations exécutées par 2 techniciens différents.
La saisie manuelle doit aussi être réalisée par une double saisie par 2 personnes différentes.

Un groupe sanguin valide doit être réalisé sur 2 prélèvements différents, à des temps réellement
différents, à raison d’une détermination par prélèvement.

3.2 - Préparation du sang à grouper

Culot de GR

BVt 5 gouttes d’eau


physiologique
2 gouttes de culot
Suspension à 5 %
globulaire
BVp Technique en tube
18 gouttes d’eau
Sang N° physiologique
S Suspension à 10 %
Plasma Technique en
plaque

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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1

3.3 - Technique sur plaque alvéolée


Réalisation du groupage ABO : épreuve de Beth Vincent et épreuve de Simonin
Épreuve globulaire de Beth vincent
 Déposer une goutte des sérums tests anti-A, anti-B, anti-A+anti-B (et
éventuellement anti-H).
 Déposer une goutte de suspension globulaire à tester.
Épreuve globulaire de Simonin
 Déposer une goutte de suspension globulaire à A1, A2, B.
 Déposer 2 gouttes du sérum à tester.
Épreuve complémentaire : à effectuer uniquement si le test révèle un groupe A ou AB.
 Déposer une goutte des sérums tests anti-A1 et anti-H (ou anti-A1 uniquement si l’anti-
H est utilisé systématiquement)
 Déposer une goutte de suspension globulaire à tester.
Animer la plaque d'un mouvement de va et vient afin de faciliter l'agglutination.
Laisser reposer 30 secondes. Lire en imprimant un mouvement de « roulis » à la plaque et
5.
compléter par une seconde lecture au bout de 3 minutes.

Anti A
GR O+ Sérum AB Anti-A Anti –A1 Anti-B Anti-H GR A1 GR A2 GR B
Anti B

Témoins Épreuve globulaire (Beth Vincent) Ép. sérique (Simonin)


auto Allo AB anti-A anti- anti-B anti- anti-H A1 A2* B
A1* A+B
N° …………

BVp
S
S ang N°….
S uspe nsion 10% Plasma

* : épreuves complémentaires (non obligatoires par la législation)


Lecture
D’une manière générale, les agglutinats de l’épreuve sérique apparaissent plus lentement que ceux de
l’épreuve globulaire. Noter l’absence ou la présence d’agglutinats et leur intensité.
- « +++ » 1 à 3 énormes agglutinats sur fond clair.
- « ++ » jusqu’à 10 agglutinats sur fond clair.
- « + » très nombreux agglutinats sur fond clair.
- « (+) » innombrables agglutinats à la limite du visible sur fond clair.
- « - » absence d’agglutinats-suspension rosée homogène.
Signaler aussi la présence éventuelle d’une image de double population (notée ++/--) ou d’une
hémolyse partielle.

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

3.4 - Technique en tube


Les réactions sont effectuées dans 6 ou 8 tubes de la même façon que pour la technique en plaque,
en utilisant les mêmes volumes de réactifs.
Boucher les tubes.
Agiter légèrement les tubes.
Centrifuger 1 minute à 500 g (environ 1000 rpm).
Lire par remise en suspension des culots.

Épreuve globulaire Épreuve sérique

Sang N°…. GR GR
Anti-A Anti- GR B GR O
Suspension 5% Anti-A Anti - B Anti-B
Anti-H
A1 A1 A2 Plasma

BVt
S

Introduire :
Introduire :
1 goutte de suspe nsion
1 goutte de sérum test
globulaire te st à 5%
1 goutte de suspe nsion
2 gouttes de sérum à tester
globulaire à tester à 5%
Modalités de lecture
- « +++ » : le culot se décolle et se dissocie en 3 amas maximum (agglutinat
volumineux non dissocié sur fond clair).
- « ++ » : le culot se dissocie en de nombreux amas volumineux (agglutinat
volumineux sur fond clair).
- « + » : le culot se dissocie en de nombreux petits amas (agglutinat fin sur
fond rosé).
- « - » : suspension homogène (« fumée de cigarette »).
3.5 - Témoins
Le témoin auto est réalisé systématiquement, les témoins AB et allo sont surtout réalisés uniquement
en cas de discordance entre les épreuves globulaires et sériques.
Mais par mesure de sécurité, les 3 témoins seront réalisés systématiquement au cours des groupages
ABO.
➔Témoin « auto » = une goutte de sérum à tester et une goutte de GR à tester
➔Témoin « AB » = une goutte d'un sérum de groupe AB (appelé sérum AB, à ne pas confondre
avec le sérum anti-A + anti-B) et une goutte de GR à tester.
➔Témoin « allo » = 2 gouttes de sérum à tester et une goutte de GR test.

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Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 1

4 - Résultat

4.1 - Validation technique


4.1.1 - Conformité des témoins
La validation du test exige la conformité des témoins

Rôle des témoins :


Témoin auto : (sérum du sujet et GR du sujet) effectué systématiquement. L'absence
d'agglutination témoigne de l'absence d’auto- anticorps (agglutinines froides).

Témoin allo : (sérum du sujet et GR O). L’absence d’agglutination garantit l’épreuve sérique.
S’il y agglutination, il peut démonter la présence d’allo anticorps irréguliers. L’emploi
systématique de ce témoin a été préconisé ci-dessus. Ce témoin, permet de vérifier que le sérum
du sujet ne contient pas d’Ac capables de reconnaître les Ag autres que les Ag A et les Ag B
(Milieu albumineux).

Témoin AB : (sérum « AB » et GR du sujet). L’absence d’agglutination garantit l’absence de


polyagglutinabilité et garantit l’épreuve globulaire. Il n’est pas nécessaire lors de l’emploi
d’anticorps monoclonaux. Ce témoin permet de vérifier que les GR du sujet ne sont pas
reconnus par des Ac autres que les Ac anti-A et Anti-B (Milieu albumineux).

Si un des trois témoins est positif , schématiquement :


-témoin auto + : signifie agglutinines froides ou rouleaux
-témoin allo + : signifie présence d’agglutinines irrégulières
-témoin AB + : signifie polyagglutinabilité

4.1.2 - Conformité des contrôles de qualité internes (CQI)


Des échantillons de contrôle de phénotype garantis sont testés; ces contrôles comprennent au
minimum:
•un échantillon de groupe A
•un échantillon de groupe B
•un échantillon de groupe O

4.1.3 - Conformité des résultats des deux épreuves.


Attention, aucun résultat n’est valable, si la concordance entre les deux épreuves n’est pas
vérifiée.

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Résultats obtenus avec les groupes et sous-groupes du système ABO

ÉPREUVE GLOBULAIRE (BETH VINCENT) ÉPREUVE SÉRIQUE (SIMONIN)


GROUPE Anti-A Anti-B Anti-A Anti- H Anti- Ag GR A1 GR A2 GR B GR O Ac
+ anti-B A1
A1 +++ - +++ - +++ A, - - ++ - Anti B
A1
A2 ++ - ++ ++ - A, - - ++ - Anti B
H (+ rare) (anti A1)
B - +++ +++ - B +++ ++ - - Anti A
(+parfois
)
A1B +++ ++ +++ - +++ A, - - - -
A1,
B
A2B ++ ++ ++ ++ - A, - - - -
H, B (+ parfois) (anti A1)
O - - - +++ H ++ + ++ -
Anti A
Anti B
Mise en évidence des Ag membranaires Mise en évidence des Ac naturels
réguliers

Difficultés du groupage ABO – discordance entre les deux épreuves


Le cas le plus fréquent, et normal, de discordance est l’absence d’Ac naturels chez le nouveau né.
Il existe de nombreuses autres causes de discordance. Il faut alors refaire le groupage après avoir lavé
les hématies du sujet et éventuellement décomplémenté son sérum
(30 minutes à 56°C). Il faut en outre effectuer les témoins AB et allo.

B1ABM CM © 17
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 2

Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 2

Exercices: groupage ABO


1 - Patient (A) adulte

TÉMOINS : Auto Allo AB


Aspect
Préciser la composition et
le rôle des témoins Agglutination :
effectués.

Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1

Interprétation : Interprétation :

Conclusion
- Interpréter les deux épreuves puis conclure.

2 - Patient (B) adulte


Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».

Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti A+ B Anti-H Anti-A1

Interprétation : Interprétation :

Conclusion
- Interpréter les deux épreuves puis conclure.

18 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

3 - Patient (C) adulte


Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».

Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti A+B Anti-H Anti-A1

Interprétation : Interprétation :

Conclusion
- Interpréter les deux épreuves puis conclure.

4 - Patient (D) adulte


Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».

Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ Anti-H Anti-A1
anti-B

Interprétation : Interprétation :

Conclusion

- Interpréter les résultats déjà obtenus, donner le groupe présumé en le justifiant et


proposer les résultats (cohérents) de l’épreuve de Beth-Vincent .

B1ABM CM © 19
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 2

5 - Patient (E) adulte


Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».

Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ Anti-H Anti-A1
anti-B

Interprétation : Interprétation :

Conclusion
- Interpréter les résultats déjà obtenus, donner le groupe présumé en le justifiant et
proposer les résultats (cohérents) de l’épreuve de Simonin.

6 - Nourrisson de 2 mois (F)


Aucune agglutination n’est observée sur les 3 témoins «auto », « AB » et « allo ».

Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1
+++ - +++ + - - -
- Interpréter les deux épreuves puis conclure.

7 - Patient J adulte

Auto Allo AB Témoin :


- +++ -

Épreuve……………................de Épreuve……………................de
……………………………….................................................. ……………………………......….
Sérum Sérum Sérum Sérum Sérum GR A1 GR A2 GR B
Anti-A Anti-B Anti-A+ anti-B Anti-H Anti-A1
- - - - - +++ +++ +++
- Conclure d’après les résultats obtenus.

20 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 3

R echerche de la substance H
dans la salive

La substance H (ou AgH « tissulaire ») soluble peut être trouvée dans la salive ou autres liquides
physiologiques d'individus appelés « sécréteurs ».

1 - Principe du test

Il s'agit d'une inhibition d'agglutination (active directe)

2 - Protocole

2.1 - Préparation de l'échantillon de salive


Collecter environ 2 mL de salive fraîche dans un tube de verre
Placer le tube au bain marie bouillant pendant 10 min
Centrifuger le tube fortement pendant 10 min. Utiliser immédiatement le surnageant pour le congeler
immédiatement pour des tests ultérieurs.

2.2 - Préparation de la suspension d'hématies


Préparer une suspension à 3-5% d'hématies de groupe O dans une solution saline isotonique.

B1ABM CM © 21
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 3

2.3 - Mode opératoire


Dans un tube à hémolyse en verre, verser:
- 3 gouttes (100 µL) de surnageant salivaire
- 1 goutte (100 µL) de anti-H lectin
Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min
- Ajouter 1 goutte (50 µL) de suspension d'hématies
Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min
Bien mélanger et centrifuger pendant 1 min à 1000 rpm.
Remettre délicatement les hématies en suspension et au-dessus d'un éclairage indirect, observer la
présence éventuelle d'agglutinats.

3 - Questions
- Proposer les génotypes possibles d'un sujet O sécréteurs et d'un sujet O non sécréteur.
- Schématiser, au niveau moléculaire et cellulaire, la réaction sérologique dans le cas où il y a :
➔ présence de substance H (Ag H« tissulaire ») soluble
➔ absence de substance H (Ag H« tissulaire ») soluble
- Expliquer l'expression : « inhibition d'agglutination »
- Relier les expressions suivantes:
Les hématies agglutinent L'Ag H « tissulaire » a été secrété dans la
salive

Les hématies n'agglutinent pas L'Ag H « tissulaire » n'a pas été secrété dans
la salive
- Proposer un mode opératoire précis pour préparer 1 mL de suspension d'hématies de groupe O
à 3 % dans une solution saline isotonique.
- Proposer la composition qualitative et quantitative de trois témoins permettant la validation de la
technique. Préciser également le rôle de ces témoins.
- Proposer un tableau récapitulatif présentant la composition de chaque test réalisé et le résultat
attendu des témoins.

22 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 4

Groupage Rhésus standard


Il consiste à rechercher l'Ag D (RH1) à la surface des hématies.

Cette recherche s'effectue en association avec la recherche des Ag A (ABO1), B (ABO2) et des Ac
anti-A (anti-ABO1) et anti-B (anti-ABO2) lors du groupage ABO-RH1.

1 - Principes
Recherche des Ag D éventuellement présents à la surface des hématies (épreuve globulaire)

Par agglutination active indirecte (artificielle) Par agglutination active directe


- à l'aide d’un sérum test contenant des Ac anti- - à l’aide d’un sérum test contenant des Ac an-
D (IgG) enrichi en albumine (=artifice) à ti-D (IgM) en milieu salin.
37°C.

Les IgG sont : Les IgM sont :


- non spontanément agglutinant en milieu salin  spontanément agglutinant en milieu salin
- des Ac « chauds », nécessitant une température  des Ac « froids », ne nécessitant pas for-
de 37-40°C. cément une température de 37-40°C.

Pour obtenir une agglutination des hématies par


les Ac anti-D (IgG)
- un artifice est nécessaire la présence
d’albumine provoque la diminution du
potentiel zêta en masquant les charges négatives
entourant les GR.

- la réaction immunologique s’effectue à 37°C


(utilisation d’un Rhésuscope)

Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-D régulier.
Si une personne Rh- possède des anti-D, ce sont des Ac immuns (irréguliers) – IgG.

B1ABM CM © 23
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4

Schémas immunologiques
Agglutination active indirecte Agglutination active directe
Hématies D +
(Rhésus +RH1
(GR du patient)

Z
Z

SENSIBILISATION DES Sérum test Sérum-test


GLOBULES ROUGES À (Ac anti-D - (Ac anti-D –
TESTER. IgG) IgM)

ADDITION DE L’ARTIFICE Albumine


MILIEU ALBUMINEUX

AGGLUTINATION

L’artifice entraîne la diminution du potentiel


zêta (Z), en masquant les charges négatives.
La distance entre les hématies diminue 
agglutination des GR par les IgG anti D.

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

2 - Agglutination sur plaque alvéolée jetable

2.1 - Matériel et réactifs


Agglutination active indirecte Agglutination active directe
(méthode ancienne ) (méthode actuelle)
Sang à tester : recueilli sur EDTA (généralement).
 à tester rapidement (au plus tard 48 h), sinon conserver à 2-8°C.

Contrôles de qualité internes ou GR témoins : GBEA : [O,RH1 (D+)], [O,RH-1 (D-)


et [O, RH1 faible] est préconisé en plus dans la norme iso15189

- Sérum test anti-D enrichi en albumine GBEA : sérum anti-D monoclonal


bovine (BSA). D'autres normes préconisent :
 Ig G anti-D monoclonale humaine -2 sérums anti-D salin contenant des Ac
monoclonaux (IgM) provenant au moins de 2
clones différents.
-1 sérum anti-D ne devant pas détecter l'Ag
- Sérum témoin ou Rh contrôle sans Ac anti- variant DVI :sérums tests D(VI+) et D(VI-)
D, mais enrichi en albumine bovine.

Rhésuscope : plaque chauffante (40°C) mobile - Sérum témoin Rh contrôle sans anti-D, salin.
autour d’un axe.
- vérifier la température de la plaque au moment
de son utilisation. Rhésuscope non indispensable
Une température supérieure à 45°C provoque Température de 20°C ou de 40°C
une dessiccation importante des gouttes de
réactifs (fausse réaction positive ou difficulté de
lecture).

2.2 - Mode opératoire


Annoter correctement la plaque alvéolée.

2.2.1 - Préparation du sang à tester


Dans un tube soigneusement référencé, verser 6 gouttes de plasma et 4 gouttes de culot globulaire à
tester.
37°C
6 gouttes de plasma

Plasma Suspension à
4 gouttes de 40 % dans son
Culot de GR culot globulaire plasma
TECHNIQUE EN
PLAQUE

B1ABM CM © 25
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4

2.2.2 - Technique : agglutination active directe

Déposer rapidement sur la plaque alvéolée, comme indiqué sur le schéma ci-dessous

Sg Sangs Sg
Sg N° à Sg N° CQI -
CQI + RH1 RH-1
(O,RH-1)
(O,RH1) tester

T R T R T R
Gouttes de T R
suspension
de GR à 40 %

Gouttes de
sérum test

Sérum RH Anti-D*
contrôle

* En laboratoire, deux sérums tests sont parfois utilisés : sérum-test anti-D(VI+) et anti-D(VI-).

Mélanger et essuyer l’agitateur entre chaque réaction.


Incliner la boîte chauffante d’un angle juste suffisant pour permettre l’homogénéisation des
gouttes.
Poursuivre l’agitation pendant 3 minutes
Effectuer la lecture des agglutinats.

2.2.3 - Contrôles de qualité internes (CQI)

Utilisation d’échantillons de contrôle de phénotype garantis comprenant au minimum:


 un échantillon d'hématies tests de groupe RH1 (avec AgD)
 un échantillon d'hématies tests de groupe RH-1 (sans AgD)
Les normes iso 15189 préconisent en plus:
 un échantillon d'hématies test de groupe RH1 faible (Ag D présent en faible quantité)

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

3 - Agglutination en tube

Les hématies à tester sont lavés puis préparés en suspension à 3-5% en milieu sérique (dans leur
propre plasma).

Les témoins effectués sont les mêmes que ceux réalisés au cours de la technique en plaque.

Préparer et annoter correctement le nombre de tubes nécessaires.

Introduire dans les tubes 50 µL de GR à tester et 50 µL de sérum test. Boucher les tubes.

Si l’agglutination est active indirecte : incuber 45 minutes au bain thermostaté à 37°C ou à l’étuve
à 37°C (tubes bouchés).

Centrifuger 1 minute à 1000 tours / min (tubes bouchés).


Effectuer la lecture en remettant doucement en suspension le culot d’hématies.

Illustration 1: Résultat d'une agglutination en tube

B1ABM CM © 27
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4

4 - Lecture et interprétation des résultats

4.1 - Témoins
CQI (+) : hématies [O, RH1] et sérum test anti-D
L’agglutination témoigne de l’efficacité du sérum test anti-D. ce témoin indique également le moment
de lecture des autres tests.

CQI (-) : hématies [O, RH-1] et le sérum test anti-D


L’absence d’agglutination témoigne de la spécificité du sérum test anti-D, et de l’absence de rouleaux
d’hématies pouvant provenir de l’addition éventuelle d’albumine.
Ce témoin limite le temps de lecture, au-delà duquel survient la dessiccation.

4.2 - Lecture des tests


4.2.1 - Témoin (T) :
Composition : hématies à tester et sérum Rhésus contrôle sans anti-D

L’absence d’agglutination vérifie l’absence :


 d’auto-agglutination des hématies provoquée par des auto-Ac (anémie hémolytique auto-
immune)
 d’agglutination provoquée par des allo Ac (maladie hémolytique du nouveau né)
 de rouleaux d’hématies.

Si les 3 témoins sont validés  lecture du test R (réaction)

4.2.2 - Test « réaction » (R)


La présence d’une agglutination (réaction positive) atteste de la présence d’AgD à la surface des
hématies à tester ; le sang est alors dit Rh positif (RH1)
L’agglutination doit être nette avec des amas d’hématies bien visibles au centre et en périphérie.

L’absence d’agglutination (réaction négative) indique que les hématies à tester ne possèdent pas l’AgD ; le
sang est dit Rh négatif (RH-1).
L’absence d’agglutination doit être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessiccation, rajouter une goutte d’eau
physiologique sur la tâche, mélanger avec un agitateur :
 le mélange devient homogène, la réaction est négative
 une agglutination vraie est observée, les amas d’hématies sont plus nettement perçus, la réaction est positive.
Une agglutination faible et retardée signifie que la réaction est douteuse, une présence d’Ag D faible
est possible.
Toute agglutination douteuse sera contrôlée par une réaction plus sensible : test de Coombs indirect.

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

5 - Recherche de l’Ag D faible et de l'Ag D partiel


Ag D faible : L'Ag D est présent mais en faible quantité à la surface des hématies; par conséquent il
est faiblement ou pas du tout agglutiné par le sérum anti-D.
Faiblement retrouvé dans la population blanche, cet Ag faible est très fréquent dans la population noire.
Les patients possédant l'Ag faible sont considérés Rhésus +.

Ag D partiel : C'est un Ag D incomplet, auquel il manque des épitopes (ex: DIV, DVII etc ...).
Les patients possédant un Ag D partiel sont considérés comme Rh – s'ils sont receveurs et Rh+ s'ils
sont donneurs.
Remarque : une mère ayant un Ag D partiel peut s'immuniser contre un épitope de l'Ag D qu 'elle ne
possède pas, si son enfant possède l'Ag D complet.

Une technique plus sensible de détection de l’AgD, la réaction de Coombs indirecte ou test indirect à
l'antiglobuline (TIA), est utilisée.

L’arrêté du 26 avril 2002 ne mentionne plus l’obligation d’identifier les sujets RH1
faible à l’aide d’un test indirect à l’antiglobuline. Cette décision se base d’une part sur
l’amélioration des performances des réactifs monoclonaux anti-RH1 utilisés au
laboratoire.
Cependant, si dans de nombreux laboratoires d’immuno-hématologie, la recherche de
RH1 faible n’est plus réalisée chez les patients en vue de transfusion, elle est dans la
plupart des cas encore effectuée chez la femme enceinte et le nouveau-né.

5.1 - Principe de la réaction de Coombs indirecte


Il consiste à rechercher un Ag (ex : Ag Du) à la surface des hématies
 par agglutination active indirecte
 à l’aide d’Ac spécifiques (ex : anti-D) en milieu salin.
Les hématies sensibilisées par les Ac sont lavées pour éliminer les Ac non fixés sur les hématies puis
sont agglutinées en présence d’anti-globulines humaines (AGH).
Si les Ac spécifiques sont des Ac « chauds » (IgG), la réaction de sensibilisation s’effectue à 37-40°C

Schéma immunologique : cf. page 30

5.2 - Technique en tube


Préparer une suspension d’hématies à 3-5% en eau physiologique.
Introduire dans 2 tubes, respectivement une goutte de sérum anti-D et une goutte de sérum Rh
contrôle (sans anti-D).
Verser une goutte de suspension globulaire à tester dans chaque tube
Agiter doucement puis incuber 15 min à 37°C.
Laver les hématies 2 fois en eau physiologique et jeter l’eau du dernier lavage.
Ajouter au culot d’hématies, 2 gouttes d’antiglobulines humaines (AGH) polyvalente ou 2
gouttes d’anti-IgG humaine.
Homogénéiser puis centrifuger 1 min à 1000 tours/min
Effectuer la lecture en remettant doucement en suspension le culot d’hématies.

Remarque : On peut effectuer des contrôles de qualité (CQI) positif et négatif à l’aide de suspension
d’hématies témoins [O,RH1] ,[O,RH-1] et [O,RH1 faible].

B1ABM CM © 29
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 4

Schéma immunologique :
recherche de l'Ag D faible
par la réaction de Coombs indirecte

Hématies porteuses de l'Ag D faible.

37°C

Sensibilisation des hématies par des Ac anti-D


(IgG) polyvalents

Élimination des anti-D non fixés par des cycles


de lavage et centrifugation .

Ajout d'une anti-globuline humaine


polyvalente ou d'une anti-IgG

Agglutination active indirecte


(ou artificielle)

30 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 5

Phénotypage Rhésus complet


Ce phénotypage Rhésus complet s'effectue au laboratoire, en association avec la recherche de l'Ag K :
phénotypage RH-KEL1

1 - Principes
Ils reposent sur les mêmes principes d’agglutination que le groupage Rhésus standard.

Recherche des Ag D,C,E,c,e éventuellement présents à la surface des hématies (épreuve


globulaire)

Par agglutination active indirecte (artificielle) Par agglutination active directe

à l’aide d’un sérum test contenant des Ac anti- à l’aide d’un sérum test contenant des Ac anti-
D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e (IgG) enrichi en D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e (IgM) en milieu
albumine (=artifice) à 37°C. salin.

Les IgG sont : Les IgM sont :


– non spontanément agglutinant en milieu  spontanément agglutinant en milieu salin
salin  des Ac « froids », ne nécessitant pas une
– des Ac « chauds », nécessitant une température de 37-40°C.
température de 37-40°C.

Pour obtenir une agglutination des hématies par


les Ac anti-D (IgG)
- un artifice est nécessaire la présence
d’albumine provoque la diminution du
potentiel zêta en masquant les charges négatives
entourant les GR.

- la réaction immunologique s’effectue à 37°C


(utilisation d’un Rhésuscope)

Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-Dou anti-.... régulier.
Si une personne Rh- possède des anti-D, ce sont des Ac immuns (irréguliers) - IgG

B1ABM CM © 31
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5

Schémas immunologiques
Agglutination active indirecte Agglutination active directe

Hématies D +
(RH1))
(GR du patient)
Z
Z

Sérum test
(Ac anti-D ou
anti-C ou … -
IgG)
Sérum-test
(Ac anti-D ou
anti-C ou … - –
IgM)
ADDITION DE L’ARTIFICE
MILIEU ALBUMINEUX Albumine

AGGLUTINATION

L’artifice entraîne la diminution du potentiel


zêta, en masquant les charges négatives.
La distance entre les hématies diminue :
 agglutination des GR par les IgG anti-D.

32 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

2 - Agglutination sur plaque alvéolée jetable

2.1 - Matériel et réactifs


Agglutination active indirecte Agglutination active directe

Sang à tester : recueilli sur EDTA (généralement).


 à tester rapidement (au plus tard 48 h), sinon conserver à 2-8°C.

CQI : hématies tests phénotypées (cf.§2.2.2)

Sérum test enrichi en albumine bovine (BSA). Sérum salin contenant des IgM monoclonaux :
 Ig G anti-D monoclonale humaine  Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c,
Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c, Anti-e
Anti-e

Sérum témoin ou Rh contrôle sans Ac anti-D, Sérum témoin Rh contrôle sans anti-D, salin.
mais enrichi en albumine bovine.

Rhésuscope : plaque chauffante (40°C) mobile Rhésuscope non indispensable


autour d’un axe. Température de 20°C ou de 40°C
- vérifier la température de la plaque au moment
de son utilisation.
Une température > 45°C provoque une
dessiccation importante des gouttes de réactifs
(fausse réaction positive ou difficulté de lecture)

Les sérums tests utilisés : Anti-DCE, Anti-D, Anti-C, Anti-E, Anti-c, Anti-e.

2.2 - Mode opératoire


Certains sérums test utilisés comportent des IgG : par conséquent la technique s’effectuera en milieu
albumineux et à 37°C (Rhésuscope) : il s’agit alors d’une agglutination active indirecte.

2.2.1 - Préparation du sang à tester


Préparer dans un tube soigneusement référencé, un échantillon du sang à grouper, en plaçant 6 gouttes
de plasma et 4 gouttes de culot globulaire, de manière à obtenir une suspension à 40 % dans son
plasma. (milieu albumineux).

2.2.2 - Témoins et contrôles de qualité internes


D'après le GBEA, chaque sérum-test doit être validé à l'aide d'hématies tests phénotypées CQI+ et
CQI-.
Un témoin (T Rh) doit être réalisé pour chaque lot d'hématies phénotypées utilisées . Ceshématies ne
doivent pas agglutiner dans le sérum rhésus contrôle (sans Ac du système Rhésus). Ce sérum contrôle
Rh est salin si les sérums tests utilisés sont salins, il est albumineux, si les sérums tests sont
albumineux.

B1ABM CM © 33
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5

Validation du sérum test anti-DCE


à l'aide des hématies tests :GR-CQI (+) [D+,C+,c+,E+,e+] et GR-CQI (-) [D-,C-,c+,E-,e+]

Schéma de la plaque : GR- GR-


CQI+ CQI-

CQI (+) CQI (-)


1 2 3 4
2 gouttes de
suspension de T Rh* R T Rh* R
GR à 40 %

1 goutte de
sérums tests

Sérum Rh
Anti-DCE
contrôle

Validation du sérum test anti-C (anti-RH2)


à l'aide des hématies tests : T+ [C+, c+] ou RH:2,4 et T- [C-, c+] ou RH:-2,4
La technique est la même que précédemment, le sérum test anti-DCE est remplacé par le sérum test
anti-C.

Validation du sérum test anti-E (anti-RH3)


à l'aide des hématies tests : T+ [E+, e+] ou RH:3,5 et T- [E-, e+] ou RH:-3,5

Validation du sérum test anti-c (anti-RH4)


à l'aide des hématies tests : T+ [C+, c+] ou RH:2,4 et T- [C+, c-] ou RH:2,-4

Validation du sérum test anti-e (anti-RH5)


à l'aide des hématies tests : T+ [E+, e+] ou RH:3,5 et T- [E+, e-] ou RH:3,-5

2.2.3 - Phénotypage

- Si le Rh standard est connu (cas général), il est inutile de tester les hématies du patient
avec le sérum test anti-D
- Si le Rh standard est positif (individu RH-1), il est inutile d'utiliser le sérum anti-DCE.

Le phénotypage avec les sérums anti-D, anti-C, anti-c, anti-E et anti-e, sont à
effectuer en fonction des résultats obtenus avec le sérum testé précédemment. Il faut
être logique et chronologique.
Il existe un antithétisme, c'est-à-dire que le globule rouge porte soit C, soit c soit les
2 et soit E, soit e, soit les 2. Il faut donc effectuer le phénotypage en tenant compte
de ces données.

34 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Schéma de la plaque :

Sg N°

1 2 3 4 5 6 7
DCE D C c E e
2 gouttes de T Rh
suspension à
40 %

1 goutte de
sérum test

Sérum Rh Anti-DCE Anti-D Anti-C Anti-c Anti-E Anti-e


contrôle

 Mélanger sans attendre à l'aide d'un agitateur bien propre.


 Agiter en inclinant doucement la plaque sur le rhésuscope par des mouvements lents de balan-
cier pendant 1 à 3 min environ.
 Observer s'il y a agglutination ou pas.

3 - Résultats et interprétation
3.1 - Contrôles de qualité internes (CQI) et témoin
CQI positifs :
Ces contrôles doivent présenter une agglutination. Ils contrôlent l’efficacité des réactifs..
Ce témoin indique également le temps de lecture. Dès que l’agglutination apparaît pour le sang témoin
positif, on peut lire les sangs à tester.
CQI négatifs :
Ce témoin ne doit pas présenter d’agglutination. Ils contrôlent la spécificité des sérums tests,
l’absence de rouleaux due à l’addition d’albumine et enfin limite le temps de lecture (au-delà de
laquelle survient la dessiccation).

Témoin Rh ou témoin effectué avec le sérum test albumineux


Ce témoin doit être négatif, c'est-à-dire, ne doit pas présenter d’agglutination.
Une image de rouleaux ou d’agglutination de cette goutte interdit toute interprétation de la lecture de la
réaction elle-même.

B1ABM CM © 35
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 5

3.2 - Lecture des tests


Lecture de la réaction :
La réaction ne peut être lue que si tous les témoins sont corrects.
- Agglutination : La réaction est positive. L’agglutination doit être nette avec des
amas de globules rouges aussi bien visibles au centre qu’à la périphérie de la tâche.
Cela signifie que le globule rouge porte l’Ag correspondant au sérum utilisé.
- Absence d’agglutination : La réaction est négative. L’absence d’agglutination doit
être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessiccation, rajouter une goutte d’eau
physiologique sur la tâche, mélanger avec l’agitateur.
Cela signifie que le globule rouge ne porte pas l’Ag correspondant au sérum utilisé.

4 - Mode opératoire - technique en tube


La technique se conduira selon le même principe que la technique en tube du groupage Rhésus.

Les hématies sont lavées puis mises en suspension à 5 % en eau physiologique et les tubes placés
à température ambiante.

5 - Fréquence des haplotypes


FRÉQUENTS RARES TRÈS RARES
Haplotype DCe (R1) dce (r) DcE (R2) Dce (R0) dCe (r’) dcE (r’’) DCE (Rz) dCE (ry)

Fréquence 42 39 13 2 1 0,05 0,03 0


en France

Astuces mnémotechniques pour retenir les 3 haplotypes les plus


fréquents : écrire, comme ci-dessous dans les cases, les allèles D,d,C,c,E,e dans l'ordre
alphabétique et en respectant la casse.

CD e c d e c DE

36 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 6

D étermination du groupe érythrocytaire


dans le système Kell
Il est effectué au laboratoire en association avec le phénotypage Rhésus :
RH-KELL1

1 - Généralités
Le système Kell correspond à un ensemble de couples d'allèles codominants et antithétiques:
• les allèles K et k codant pour 2 Ag principaux K (KEL1) et k (KEL2)
• les allèles Kpa et Kpb codant pour les Ag Kpa (KEL3) de faible fréquence et l'Ag Kpb (KEL4), très
largement répandu.

1.1 - Antigènes K et k, deux Ag antithétiques principaux


Les antigènes Kell ou K ou encore KEL1 (nomenclature internationale)
et cellano ou k ou encore KEL2 (nomenclature internationale)
sont codés par des allèles codominants et antithétiques, par conséquent il existe trois phénotypes
courants :
 K- , k+ ou KEL-1,2 (génotype k//k). Ils représentent 91% de la population caucasoïde.
 K+, k+ ou KEL1,2 (génotype K//k). Ils représentent 9 % de la population.
 K+, k- ou KELL1,-2 (génotype K//K). Ils représentent 0,02 % de la population.
Ces derniers ne possèdent donc pas l’antigène de grande fréquence k ou Cellano (possédé
par 99,98% de la population blanche).

Dans la pratique courante des laboratoires, la recherche se limite à l’Ag Kell car il est après l'Ag D le
plus immunogène des antigènes de groupes sanguins.

Transfusions:
– Un sujet K+, k+ pourra recevoir tous types de phénotype Kell, puisqu’il ne pourra s’immuniser
contre aucun des deux antigènes.

– Un sujet K-, k+ doit recevoir du sang K-. Dans le cas contraire on prend le risque de l’immuniser et
de lui faire produire un anti-K, ce qui se produira statistiquement dans un tiers des cas.

– Un sujet K+, k- doit déjà être considéré comme un « receveur dangereux » car l’allo anti-k qu’il est
susceptible de développer est un anticorps « anti-public » c’est à dire dirigé contre un antigène de
grande fréquence dans la population (ici 99,98%) c’est à dire qu’il rendra toute transfusion ultérieure
incompatible.

Conséquence : Si le receveur est K+, il faut vérifier qu'il possède aussi l'Ag k (agglutination de ses
hématies avec un sérum anti-k), afin de s’assurer que les deux antigènes sont bien présents et que ce
sujet ne doit pas être considéré comme un « receveur dangereux ».

B1ABM CM © 37
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 6

1.2 - Anticorps du système Kell


Ce sont, comme les anti-RH des anticorps :
immuns, nécessitant donc une stimulation (lors de transfusion ou lors d'une grossesse)
IgG, Ac incomplet, chaud
à propriétés hémolysantes en présence de complément (hémolysines)
traversant le placenta
n'activant pas le complément.

Conséquences: Ils peuvent donner des hémolyses intra-tissulaires et être responsables d’accidents
hémolytiques de transfusion.
Ils peuvent être aussi à l’origine d’une incompatibilité fœto-maternelle.

2 - Principes
Les principes sont les mêmes que pour la recherche des Ag Rhésus.

• 1er principe : si le réactif anti-KEL1 est d'origine polyclonal (IgG)


La présence d'Ag K est recherchée à la surface des hématies d'un patient par agglutination active in-
directe à l'aide d'un réactif anti-K enrichi en albumine à 37°C. (épreuve globulaire uniquement).

• 2ème principe : si le réactif anti-KEL1 est d'origine monoclonal (IgM)


La présence d'Ag K est recherchée à la surface des hématies d'un patient par agglutination active di-
recte à l'aide d'un réactif anti-K en milieu salin et à température du laboratoire. (épreuve globulaire
uniquement).

Les agglutinations peuvent être réalisées en plaque, en tube, en microplaque ou en gel.

Remarque : pas d’épreuve sérique, car un sujet ne possède pas d’Ac anti-K régulier.
Si une personne K- possède des anti-K, ce sont des Ac immuns (irréguliers) – IgG

38 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

3 - Agglutination active directe en plaque alvéolée

3.1 - Mode opératoire


Annoter correctement la plaque alvéolée.

3.1.1 - Préparation du sang à tester

Dans un tube soigneusement référencé, verser 6 gouttes de plasma et 4 gouttes de culot globulaire à
tester.
37°C
6 gouttes de plasma
Plasma
4-5 gouttes de
Culot de GR Suspension de GR à
culot globulaire 40 % dans son plasma
TECHNIQUE EN PLAQUE
3.1.2 - Technique

• Déposer rapidement sur la plaque alvéolée, comme indiqué sur le schéma ci-dessous.

Sangs
CQI – (O,K-) Sg T- Sg N° Sg N° Sg T+ CQI + (O,K+)
à
tester

T R
T R T R T R
Gouttes de
suspension
de GR à 40 %

Gouttes de
sérum test

Sérum Kell Anti-


contrôle KEL1

• Si nécessaire, allumer le rhésuscope, vérifier la température et poser la plaque


• Mélanger et essuyer l’agitateur entre chaque réaction.
• Incliner la boîte chauffante d’un angle juste suffisant pour permettre l’homogénéisation
des gouttes.
• Poursuivre l’agitation pendant 3 minutes
• Effectuer la lecture des agglutinats.

B1ABM CM © 39
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 6

3.1.3 - Contrôles qualité internes (CQI)

Utilisation d’échantillons de contrôle de phénotype garantis comprenant au minimum:


➢ un échantillon de groupe K + (KEL1)
➢ un échantillon de groupe K - (KEL-1).

4 - Lecture et interprétation des résultats


4.1 - Contrôles de qualité internes
CQI positif : hématies [O, K+] et sérum test anti-K
L’agglutination témoigne de l’efficacité du sérum test anti-K. ce témoin indique également le moment
de lecture des autres tests.

CQI négatif : hématies [O, K-] et le sérum test anti-K


L’absence d’agglutination témoigne de la spécificité du sérum test anti-K, et de l’absence de rouleaux
d’hématies .
Ce témoin limite le temps de lecture, au-delà duquel survient la dessication.

4.2 - Lecture des tests


4.2.1 - Témoin (T) :
Composition : hématies à tester et sérum Kell contrôle sans anti-K

L’absence d’agglutination vérifie l’absence :


- d’auto-agglutination des hématies provoquée par des auto-Ac (anémie
hémolytique autoimmune)
- d’agglutination provoquée par des allo Ac (maladie hémolytique du nouveau né)
- de rouleaux d’hématies.

Si les 3 témoins sont validés  lecture du test R (réaction)

4.2.2 - Test « réaction » (R)


La présence d’une agglutination (réaction positive) atteste de la présence d’AgK à la surface des
hématies à tester ; le sang est alors dit K positif (KEL1)
L’agglutination doit être nette avec des amas d’hématies bien visibles au centre et en périphérie.

L’absence d’agglutination (réaction négative) indique que les hématies à tester ne possèdent pas l’Ag
K ; le sang est dit K négatif (KEL-1).
L’absence d’agglutination doit être très nette. En cas de doute vis-à-vis de la dessication, rajouter une
goutte d’eau physiologique sur la tâche, mélanger avec un agitateur :
- le mélange devient homogène, la réaction est négative
- une agglutination vraie est observée, les amas d’hématies sont plus nettement
perçus, la réaction est positive.

40 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 1 – Groupes sanguins – Fiche 7

Phénotype étendu
1 - Définition de l'analyse
Cette analyse consiste à rechercher un ou plusieurs antigènes érythrocytaires autres que ceux qui sont
définis par le groupage ABO.RH1 et par le phénotypage RH-KEL 1.

Ag recherchés
En général, on se limite aux Ag des systèmes Duffy, Kidd et MNS, mais d'autres Ag peuvent aussi
être recherchés.

– Rhésus Ag Cw (RH8),
– Duffy Ag Fya (FY1), Fyb (FY2)
– Kidd Ag Jka (JK1) ,Jkb(JK2)
– MNS Ag M (MNS1), N (MNS2), S(MNS3), s (MNS4)
– Lewis Ag Lea (LE1), Leb (LE2)
– P Ag P1

2 - Indication du phénotypage étendu


Il est indiqué :
- chez tout sujet présentant une allo-immunisation post-transfusionnelle, dans le but de prévenir la
production de nouveaux anticorps qui rendraient difficiles la sélection de culots globulaires
compatibles lors de transfusions ultérieures,
- chez la femme jeune avec antécédent d’immunisation fœto-maternelle,
- dans les hémopathies chroniques (thalassémie, drépanocytose, anémies réfractaires) ou malignes. Il
est important de déterminer le phénotype étendu de ces sujets dès le diagnostic et avant les premières
transfusions, car les transfusions répétées ultérieures vont gêner le phénotypage.

3 - Mise en œuvre et contrôles de qualité internes


La recherche de chaque antigène est basée sur l'utilisation du réactif spécifique et du témoin adéquat.

Le système analytique doit être contrôlé en utilisant, pour chaque spécificité, deux échantillons de
contrôle de phénotypes garantis (typage obtenu par un processus analytique différent de celui qui doit
être contrôlé par ces échantillons).
L'un de ces échantillons doit être négatif et l'autre d'expression «hétérozygote».

B1ABM CM © 41
Chapitre 1 – Groupes sanguins – fiche 7

Illustration 2: Carte de groupe sanguin

42 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

- Chapitre 2 -
Anticorps irréguliers

Pré-requis :
– Structure et propriétés des IgM et IgG
– Propriétés des Ac des systèmes érythrocytaires Rhésus, Duffy, Kidd ; MNS, Lewis, Luthéran, P
....
– Réactions sérologiques d'agglutination

Objectifs :

– Connaître les risques encourus par un patient possédant des anticorps plasmatiques
– Savoir réaliser une recherche d'anticorps irréguliers dans le plasma
– Savoir interpréter les tests de recherche des anticorps irréguliers

B1ABM CM © 43
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités

Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 1

R echerche des Anticorps irréguliers

1 - Rappel – Définitions
Généralités

Anticorps circulant (Ac) : immunoglobuline (Ig) capables de se fixer


spécifiquement à l'antigène (Ag) qui a induit sa formation.
Les classes d'Ig : IgG, IgM, IgE, IgA et IgD

Ac naturels Ac immuns
(apparaissent spontanément (sont le produit d'une stimulation
- ne sont pas le immunitaire par des Ag du non soi)
produit d’immunisation par des Ag)
Il s'agit généralement d'IgM Il s'agit généralement d'Ig G

Ac réguliers
(Toujours présents en l'absence de l'Ag Ac irréguliers
spécifique) (pas toujours présents en absence de l'Ag
spécifique)

Donc : 2 types d'Ac irréguliers


 Ac immuns (toujours irréguliers)
 Ac naturels irréguliers

Caractéristiques sérologiques Ac naturels Ac immuns

Apparition sans pré-immunisation apparente après immunisation (contact


préalable avec l'Ag)
Présence réguliers irréguliers toujours irréguliers
optimum thermique 0 à 20°C (Ac froids) 37°C (Ac chauds)
fixation du complément ++ +
transfert placentaire non oui
classe d'Ig IgM IgG
pouvoir agglutinant agglutination directe agglutination indirecte
(Ac complet) (Ac incomplet)

44 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

2 - Origine de la présence d'Ac irréguliers chez un patient

2.1 - Ac naturels irréguliers


Ces Ac apparaissent sans pré-immunisation apparente chez des sujets de phénotypes particuliers, c'est
à dire ne possédant pas l'Ag correspondant.
Ex: Sujet Le a (–) peut posséder des Ac naturels irréguliers anti-Le a.

Il s'agit le plus souvent d'IgM.


Exemples : anti-Lea , anti-Leb , anti-M, anti-N, anti-P1........

Ces anticorps dits « froids », ont un optimum thermique situé à basse température. Cependant même à
37°C leur dangerosité est grande, ils se fixent sur l’hématie possédant l'Ag spécifique, activent le
complément, puis peuvent s’éluer (se décrocher) de l’hématie et revenir dans le plasma. L’activation
du complément est en général totale, jusqu’à la fraction C9 perforant la cellule, ce qui entraîne une
hémolyse intra-vasculaire avec libération d’hémoglobine libre dans le plasma. Celui ci aura donc une
couleur rouge « laquée », et les urines seront foncées (voire noires).

Les complications majeures à redouter sont la coagulation intra-vasculaire disséminée (CIVD) et


l’oligoanurie puis l’anurie.

2.2 - Ac immuns irréguliers


Dans ce cas, un sujet en contact avec un Ag qu'il ne possède pas, s'immunise vis à vis de cet Ag et
acquière un Ac immun (donc irréguliers).
Ex. sujet Rhésus - qui après contact avec l'Ag D acquière des Ac immuns irréguliers anti-D.

Il s'agit le plus souvent d'IgG


Ex : Ac anti-D, anti-C, anti-c, anti-E, anti-e, anti-Kell, anti-Kidd etc....)

Ces anticorps dits « chauds », ont un optimum thermique situé autour de 37 - 40°C, se fixant sur
l’hématie possédant l'Ag spécifique. Les hématies ainsi sensibilisées seront phagocytées par les
macrophages, ceux-ci ayant un « récepteur aux IgG ». Il s’agit donc ici d’une hémolyse « intra-
tissulaire » qui aura pour conséquence une dégradation de l’hémoglobine en bilirubine, avec
l’apparition d’un ictère.

2 types d'allo-immunisation sont possibles :


– allo-immunisation post-transfusionnelle
– allo-immunisation fœto-maternelle

2.2.1 - Allo-immunisation post transfusionnelle


Un receveur peut s'immuniser contre des Ag provenant du donneur.
Ex: receveur Rhésus standard (-) peut acquérir après transfusion de sang d'un donneur Rhésus (+)
des Ac anti-D.
Dans le système Rhésus, l'Ag D est le plus immunogène, suivi de l'Ag E et c.
Dans les autres systèmes, les Ag peuvent être aussi immunogènes et conduire à la production
d'Ac irréguliers chez le receveur. anti-Rh > anti-Le > anti-Pl > anti-Kell

B1ABM CM © 45
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités

2.2.2 - Allo-immunisation fœto-maternelle

Allo-immunisation fœto-maternelle la plus fréquente :


◊ Mère: Rhésus (-) enceinte d'un enfant Rhésus (+)

En fin de grossesse ou lors de


l'accouchement, il arrive que des hématies de
l'enfant rhésus (+), porteur de l'Ag D passe
dans le sang de la mère.
LB

L'Ag D représente pour la mère un Ag du non-


soi. Le système immunitaire s'active et produit
des anti-D, Ac irréguliers immuns.

D'autres allo-immunisations existent :


- Dans le système Rhésus : Ac irréguliers anti- c, anti-E,...

- Dans le système Kell : Ac irrégulier anti-K et dans les autres systèmes: Duffy, Kidd....

N.B.: des allo-immunisations fœto-maternelles peuvent aussi avoir lieu avec des Ag plaquettaires de
l'enfant.

Remarque :
Dans les 2 cas d’allo-immunisation, la synthèse d’Ac irréguliers ne porte pas à
conséquence dans l’immédiat.

46 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

3 - Conséquences néfastes dues à la présence d'Ac irréguliers

3.1 - Chez les receveurs de sang (ou d'organe)


Les Ac irréguliers du receveur peuvent se fixer sur les hématies (Ag) du donneur :  accident
transfusionnel.
Exemple : Receveur Rh (–) possédant déjà des Ac irréguliers anti-D (acquis lors d’une 1ère
immunisation) recevant du sang d'un donneur Rh (+).
Cette fixation peut avoir 2 conséquences:
✔ Hémolyse intravasculaire aiguë – cf. cours «Les hématies » B1ABM (rares dans le cas des Ac
irréguliers). L'immun complexe formé active le complément jusqu'au stade de formation du
complexe d'attaque membranaire lysant les hématies du donneur dans le système circulatoire.
Exemple: anti-JKa (Ac perfide et dangereux)
✔ Hémolyse intratissulaire – cf. cours « les hématies» B1ABM (le plus souvent avec des Ac
irréguliers de type IgG). Les Ac irréguliers se comportent comme des opsonines et facilitent la
phagocytose des hématies du donneur au niveau du foie ou de la rate.
Exemple : anti-D
L’hémolyse dépend de l’Ac, de l’Ag et de la capacité phagocytaire des phagocytes.
Du fait des 2 possibilités, hémolyse intravasculaire ou intratissulaire, la traduction clinique est très
variable : accident hémolytique immédiat  transfusion sans bénéfice.
La prévention des accidents post-transfusionnels nécessite :
• le groupage du sang du receveur
– groupage ABO et Rh standard (ABO-RH1) pour une transfusion
– phénotypage standard -Rhésus complet et Kell - (RH-KEL1) chez les femmes en âge de
procréer (prévention de la maladie hémolytique du nouveau-né).
– phénotypage étendu à d’autres systèmes (Kidd, Duffy, ...) pour les polytransfusés

• la recherche des anticorps irréguliers anti-érythrocytaires (RAI)

• une épreuve de compatibilité au laboratoire (EDC) (sérum du malade + GR à transfuser +


antiglobuline : test de COOMBS indirect ).

– Cette analyse complète la RAI , et peut mettre en évidence des Ac anti- “ privés ”, c’est à dire des Ac
dirigés contre des Ag rarement rencontrés dans la population.

– L’EDC s’applique avec un résultat de RAI positif ou douteux et en cas d’antécédent de réaction
hémolytique même mineure.

• le contrôle ultime au lit du malade : épreuve de Beth-Vincent avec le sang du patient et le sang à
transfuser  les résultats doivent être identiques.

B1ABM CM © 47
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités

3.2 - Chez les fœtus ou nouveau-né dont la mère possèdent des Ac


irréguliers
Pendant la grossesse, les Ac irréguliers IgG de la mère peuvent traverser le placenta et se fixer sur les
hématies (s'ils possèdent l'Ag spécifique) de son enfant : maladie hémolytique du nouveau-né
(MHNN)
. Exemple: Mère Rhésus (-) possédant des Ac irréguliers anti-D (IgG), enceinte
d'un enfant Rhésus(+).

Les Ac irréguliers anti-D (IgG) traversent le L'enfant est atteint de la


placenta et vont détruire les hématies (AgD) de maladie hémolytique du
l'enfant Rhésus (+) nouveau-né (MHNN)

MHNN : anémie hémolytique plus ou moins sévère associé à un ictère prononcé (présence importante
de bilirubine libre dans le sérum) pouvant dans les cas très grave provoquer la mort de l'enfant.
Parfois à la naissance, une exanguinotransfusion avec du sang compatible est nécessaire.
D'autres Ac peuvent être responsables de MHNN : anti-c, anti-C, anti-K

 Si l'Ac irrégulier est un Ac anti-plaquettaire fœtale, l'enfant est alors atteint de thrombopénie.

Remarque: seul les IgG irréguliers sont dangereux, car eux seuls traversent la barrière placentaire.

Surveillance du conflit fœto-maternel lorsqu'il est décelé :


Recherche et à dosage des Ac immuns irréguliers
 dans le sérum de la mère (épreuve sérique – Réaction de Coombs indirecte)
 dans le sang du fœtus. Les Ac recouvrent les hématies fœtales (épreuve globulaire – réaction de
Coombs directe).
Prévention d'une allo-immunisation fœto-maternelle
Tests obligatoires lors de la déclaration de grossesse:
Groupage sanguin ABO – Phénotype rhésus complet et Kell (K)
Recherche d’agglutinines irrégulières (RAI)
N.B.Toute parturiente Rhésus(-) susceptible de former des Ac irréguliers immuns anti-D par
immunisation fœto-maternelle, reçoit très rapidement une injection d'Ac anti-D après
l'accouchement. Si des hématies fœtales porteuses de l'Ag D sont présentes dans la circulation
maternelle, les Ac anti-D injectés les détruisent et évitent ainsi l'allo-immunisation.

48 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

4 - Recherche des agglutinines irrégulières (RAI)

4.1 - Généralités
D’après les norme iso15189, l’analyse « RAI » consiste à dépister puis à identifier des Ac dirigés
contre les Ag érythrocytaires autres que les Ag A, A1 et B.

Une étape de dépistage est requise et au terme de laquelle le laboratoire pourra répondre « dépistage
positif » ou « dépistage négatif ».
Suite à un dépistage positif une identification doit être mise en œuvre.

Cette recherche est importante:


- chez les receveurs de sang ou d'organe (homme ou femme)
- chez les femmes enceintes
et éventuellement chez les nouveaux-nés chez qui on suspecte une MHNN.

4.2 - Techniques de recherche des agglutinines irrégulières (AI)


Les Ac irréguliers sériques sont pour la plupart incomplets, leur mise en évidence par une réaction
d'agglutination nécessite un artifice  agglutination indirecte (artificielle).

Deux techniques d'agglutination active indirecte sont utilisées en parallèle:

- réaction de COOMBS indirecte : artifice = anti-globuline humaine (AGH)


L'AGH polyvalente utilisée autrefois est actuellement remplacée par une anti-IgG et une anti-
C3d.

- traitement préalable des hématies par une enzyme protéolytique (cette méthode est de
plus en plus abandonnée car les AI mis en évidence par cette technique sont peu dangereux)
puis agglutination.
cf. fiches techniques 2 et 3 du chapitre 2

Les contrôles qualité interne (CQI) :


Le système analytique sera contrôlé en utilisant des échantillons de contrôle comportant des
anticorps (natifs ou réactifs) de spécificité et de titre connus avec au minimum un anticorps de
titre 4 dans la technique d'utilisation et sur une hématie comportant l'antigène correspondant
d'expression « hétérozygote ».

4.2.1 - Dépistage :
Principe :

La présence d'AI est recherchée dans le sérum d'un patient


-par agglutination active indirecte (COOMBS indirect et test enzymatique),
-à l'aide de 3 séries d'hématies de groupe O et de phénotypes connus (les Ag des 3 séries
d'hématies doivent correspondre à l'ensemble des AI recherchés).

B1ABM CM © 49
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Généralités

Les 3 lots d' hématies tests de groupe O doivent permettre la détection des Ac correspondants aux Ag RH1 (D), RH2
(C), RH3 (E), RH4 (c), RH5 (e), KEL 1 (K), KEL 2 (Cellano k), KEL 4 (Kpb), FY1 (Fya), FY 2 (Fyb), JK1 (Jka),
JK2 (Jkb), MNS1 (M), MNS2 (N), MNS3 (S), MNS4 (s), LE1 (Lea), LE2 (Leb), P1, LU1 (Lua) LU2 (Lub).
Les phénotypes RH suivants doivent être obligatoirement représentés sur la gamme de dépistage :
- RH : 1, 2, -3, -4, 5 (DCe)
- RH : 1, -2, 3, 4, -5 (DcE)
- RH : -1, -2, -3, 4, 5 (dce)
Une expression du phénotype « homozygote » doit être respecté pour les Ag FY1, JK1, JK2, MNS3 et recommandée
pour les Ag FY2 et MNS4

Interprétation:
L'absence d'agglutination avec les 3 séries d'hématies (= panel de dépistage) permet de conclure à
l'absence d'AI dans le sérum du patient

La présence d'une agglutination avec une ou plusieurs séries d'hématies permet conclure à la présence
d'une ou plusieurs AI
Dans ce cas, il faut poursuivre la recherche par l'identification précise de l'AI.

4.2.2 - Identification
Si le dépistage d'AI est positif, l'identification de ou des AI selon le même principe que
précédemment, mais en utilisant 10 séries d'hématies phénotypées de groupe O (=panel
d'identification).

L’ensemble de ces hématies de groupe O doit comporter les antigènes suivants : Ag RH1 (D), RH2 (C), RH3 (E),
RH4 (c), RH5 (e), RH8 (Cw), KEL 1 (K), KEL 2 (Cellano k), KEL3 (Kpa), KEL 4 (Kpb), FY1 (Fya), FY 2 (Fyb),
JK1 (Jka), JK2 (Jkb), MNS1 (M), MNS2 (N), MNS3 (S), MNS4 (s), LE1 (Lea), LE2 (Leb), P1, LU1 (Lua) LU2
(Lub).
Les phénotypes suivants doivent être représentés au moins sur 2 hématies : KEL1, FY1 ; -2, JK 1 ; -2, JK-1 ;2, MNS
3, -4, MNS -3 ;4, P-1.

Les AI identifiés pourront ensuite être dosés. (cf fiche technique 7 du chapitre 2)

La durée légale de validité des AI identifiée est le 3 jours.

4.3 - Recherche des agglutinines irrégulières maternelles sur les hématies


fœtales
Principe :

La présence d'AI maternels déjà fixés sur les hématies fœtales est recherchée
- par la réaction de Coombs directe ou test direct à l'anti-globuline (TDA)
Une agglutination des hématies fœtales en présence d'anti-globuline (anti-IgG et anti-C3d)
atteste de la sensibilisation des hématies fœtales par les AI maternels.
Les AI seront ensuite élués puis identifiés .
cf. fiches techniques 4 et 7 chapitre 2 .

50 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 2

T est de COOMBS indirect


ou test indirect à l'antiglobuline (TIA)

1 - Principe
La présence d'Ac irréguliers est recherchée dans le sérum d'un patient
-par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant des anti-globulines humaines (AGH)
-à l'aide d'un panel d'hématies phénotypées.

1ére étape : les GR sont sensibilisés par les AI éventuels présents dans le sérum du patient

2ème étape : lavages → élimination des Ig non spécifiquement fixés à l'Ag érythrocytaire.

3ème étape : agglutination des GR sensibilisés par des AGH

☞ Importance des lavages : la réaction de Coombs n'est spécifique que si les GR sont débarrassées de
toutes traces d'Ig non fixées spécifiquement sur l'Ag.

Remarques :
- Variantes :
 Coombs à basse force ionique (BFI). Augmentation de la fixation des Ac sur les Ag
et diminution du temps de sensibilisation.
 Coombs sur hématies trypsinées. Augmentation de l’accessibilité des Ag.

- Inconvénient :
 Certains Ac irréguliers ne sont pas détectés par cette technique

B1ABM CM © 51
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2

Schéma immunologique

Globules rouges de phénotype connu


panel de dépistage
ou panel d'identification

SÉRUM À TESTER
Les Ac irréguliers (Anti-D, anti-K, anti-Jka etc..)
présent dans le sérum à tester se fixent sur les GR
phénotypés possédant les Ag spécifiques : GR
sensibilisés.

LAVAGES EN EAU PHYSIOLOGIQUE + CENTRIFUGATION


Élimination des Ac non spécifiques, différents des Ac
irréguliers.
Le culot est repris en eau physiologique

AJOUT D’AGH (ANTIGLOBULINE HUMAINE)


Antiglobuline humaine polyvalente
Sérum de cheval anti-Ig humaines (Anti-IgG, IgM …) ,
actuellement remplacée par une anti-IgG+antiC3d

Agglutination active indirecte


(artificielle)

52 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

2 - Technique

2.1 - Réactifs
Hématies phénotypées de groupe O
• panel de dépistage : 3 séries d'hématies dont l'éventail des Ag couvre l'ensemble des AI recherchés :
 dépistage des AI
ou
• panel d’identification: 10 séries d'hématies  identification des AI (si le dépistage est +)

Sérum anti-globuline humaine (AGH) : anti-IgG + anti-C3d

Contrôle de qualité interne (CQI) :


• CQI + : hématies [O, Rh+] (5 % en tampon à basse force ionique)
• CQI - : hématies [O, Rh -] (5 % en tampon à basse force ionique)
• sérum anti-D salin (ne contenant que des IgG anti-D en milieu salin NaCl)

Hématies phénotypées
• panel de dépistage : 3 séries d'hématies dont l'éventail des Ag couvre l'ensemble des AI recherchés :
 dépistage des AI
ou
• panel d’identification: 10 séries d'hématies  identification des AI (si le dépistage est positif)

2.2 - Mode opératoire


Cf. page 54

B1ABM CM © 53
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2

54 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

3 - Résultats et interprétations

3.1 - Contrôles de qualité interne


- CQI (+) : la présence d’une agglutination vérifie que :
* la présence de l’Ag et l’Ac spécifique est bien repérée par un agglutinat
* les différents temps de la réaction (sensibilisation, lavage et action de l’AGH) se déroulent
parfaitement
* la bonne qualité de l’AGH.

- CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs
dues à l’AGH. En absence d’Ag, les Ac ne conduisent pas à une agglutination.

3.2 - Lecture des réactions


- Une agglutination révèle la présence de l’Ac correspondant à l’un des Ag présents sur les hématies
testées.
Avec le panel de dépistage, l’absence de toute agglutination signifie l’absence d’AI.
Dans le cas contraire, la présence d’une ou plusieurs agglutinations permet d’affirmer la présence d’AI
qu’il faut identifier avec le panel d’hématies d’identification (cf. exercices)
En cas de AI présents, la comparaison obtenus avec les hématies de dépistage permet déjà de donner
une orientation de diagnostic.
La lecture du panel de d’identification permet d’identifier le ou les AI probable(s) ou
Attention : l’interprétation doit aussi tenir compte du phénotype du patient. (Ex : un sujet D-, C+, c-,
E+, e- ne peut pas posséder des anti-C)

L’AI identifiée est ensuite titrée. Le sérum est alors conservé par congélation en vue de titrage
ultérieurs.

B1ABM CM © 55
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 2

En savoir plus

ROBERT ROYSTON AMOS ("ROBIN") COOMBS (1921-


2006) : un médecin immunologiste britannique

56 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 3

Test enzymatique (papaïne)


1 - Principe
La présence d'Ac irréguliers est recherchée dans le sérum d'un patient
- par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant un artifice enzymatique (traitement des
hématies par une enzyme protéolytique)
- à l'aide d'un panel d'hématies phénotypées (et traitées).

1ère étape : les GR sont traités par une enzyme protéolytique (papaïne, broméline …) à 37°C.

2ème étape : lavages  élimination des fragments éliminés par le traitement ainsi que les enzymes

3ème étape : les GR traités sont sensibilisés par les AI éventuels présents dans le.sérum du patient.

☞ Importance des lavages :


Le traitement par une enzyme élimine des petits fragments à la surface des hématies. Ces fragments et
les enzymes doivent être éliminés pour éviter toute interférence (éventuelle dénaturation des Ac
présents dans le sérum testé).
Les AI éventuellement présents dans le sérum du patient pourront atteindre beaucoup plus facilement
les Ag portés par les hématies (augmentation de l’accessibilité de certains sites antigéniques,
diminution du potentiel zeta, diminution de l’encombrement stérique.)

REMARQUES :
➢ Avantages :
• Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Rhésus.
• Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Kidd par la papaïne.
• Augmentation de la puissance antigénique des Ag du système Lewis par la ficine.

➢ Inconvénient – altération de la puissance antigénique :


• Ag M N S s Fya Fyb détruits par tout traitement enzymatique.
• Ag Fya Fyb détruits ( S s affaiblis ) par la papaïne.
• Ag M N affaiblis par tout traitement enzymatique.

B1ABM CM © 57
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 3

Schéma immunologique

Globules rouges de phénotype connu


GR panel identification : list I, II, III

37°C
TRAITEMENT ENZYMATIQUE

Papaïne ou Broméline ou Trypsine


Démasquage de certains Ag.
(Destruction de certains Ag)

Globules rouges traités

LAVAGES EN EAU PHYSIOLOGIQUE + CENTRIFUGATION


Élimination des débris et fragments protéiques, et
enzymes

Les GR, une fois lavés sont repris en eau


physiologique.

37°C
SÉRUM À TESTER

Recherche des Ac irréguliers (Anti D, anti K, anti


Jka etc..)
Ac de la classe des IgG (Ac chaud)

Agglutination active indirecte (artificielle)

58 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

2 - Technique

2.1 - Réactifs
Enzyme protéolytique : trypsine ou papaïne ou broméline ou ficine .....

Les hématies des panels sont traitées par les enzymes (en respectant la procédure indiquée par le
fabriquant), lavées en eau physiologique puis remise ne suspension à 40% (test sur rhésuscope) ou à
10 % (test en tube).

Contrôles de qualité (CQI) :


– CQI (+) : hématies [O, Rh+] (40% ou 10% en eau physiologique)
– CQI (+) : hématies [O, Rh -] (40% ou 10% en eau physiologique)
Sérum anti-D salins (ne contenant que des IgG anti-D en milieu salin NaCl)

2.2 - Mode opératoire


Cf. page 60.

3 - Résultats et interprétations

3.1 - Contrôles de qualité


- CQI (+) : la présence d’une agglutination vérifie :
* la présence de l’Ag et l’Ac spécifique est bien repérée par un agglutinat
* les différents temps de la réaction (traitement enzymatique efficace, température de sensibilisation
correcte) se déroulent parfaitement
* la bonne qualité l’enzyme.

- CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs
dues un traitement enzymatique trop important. Les Ac en absence d’Ag ne conduisent pas à une
agglutination.

3.2 - Lecture des réactions


- Une agglutination révèle la présence de l’Ac correspondant à l’un des Ag présents sur les hématies
testées.

Avec le panel de dépistage, l’absence de toute agglutination signifie l’absence d’AI.


Dans le cas contraire, la présence d’une ou plusieurs agglutination permet d’affirmer la présence d’AI
qu’il faut identifier avec le panel d’hématies d’identification (cf exercices)
En cas de AI présents, la comparaison obtenus avec les hématies de dépistage permet déjà de donner
une orientation de diagnostic.

La lecture du panel de d’identification permet d’identifier le ou les AI probable(s) ou


Attention : l’interprétation doit aussi tenir compte du phénotype du patient. (Ex : un sujet D-, C+, c-,
E+, e- ne peut pas posséder des anti-C)

L’AI identifiée est ensuite être titrée Le sérum est alors conservé par congélation en vue de titrage
ultérieurs.

B1ABM CM © 59
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 3

60 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 4

T est de COOMBS direct


ou test direct à l’antiglobuline (TDA)
1 - Principe
La présence d'Ac irréguliers est recherchée sur des hématies déjà sensibilisées par des Ac présents dans
le sérum d’un patient :
-par agglutination active indirecte (artificielle) utilisant des anti-globulines humaines (AGH)
monospécifiques (détectant les IgG et la fraction C3 du complément.

1ére étape : lavages des hématies sensibilisées en solutions salines (élimination des Ig non
spécifiquement fixés à l'Ag érythrocytaire).

2ème étape : agglutination des GR sensibilisés par des AGH

☞ Importance des lavages : la réaction de Coombs n'est spécifique que si les GR sont débarrassées de
toutes traces d'Ig non fixées spécifiquement sur l'Ag.

À savoir
Cette technique permet de révéler la présence :
•d’agglutinines irrégulières (AI) d’origine maternelle sur les GR fœtaux (cf MHNN)
•d’auto-Ac sur les GR d’un patient atteint d'anémie hémolytique auto-immune – cf cours
hématologie B2ABM)

B1ABM CM © 61
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 4

Schéma immunologique

Lavages des hématies déjà sensibilisées


par des Ac en eau physiologique + centrifugation

Élimination des Ac non spécifiques, différents des


Ac irréguliers.
Le culot est repris en eau physiologique

Ajout d’AGH

AGH = Antiglobuline humaine monospécifique:


Sérum de cheval anti-Ig humaines
(Anti-IgG, anti-C3…)

Agglutination active indirecte


(artificielle)

62 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

2 - Technique
Le sang à examiner peut être:
-du sang du cordon ou du nouveau né, recueilli sur anticoagulant, déposé au froid et porté au
laboratoire immédiatement après le prélèvement
- du sang d'un patient possédant des allo-Ac (cas d'une transfusion incompatible) ou des auto-Ac (cas
d'une maladie auto-immune provoquant une anémie hémolytique=AHAI).
 GR du patient sont mis en suspension saline à 50 %.

2.1 - Réactifs
Sérum anti-globuline humaine (AGH) : sérum polyspécifique ou monospécifique.

Contrôles de qualité :
– CQI (+) : hématies O Rh+ ( 50 % en eau physiologique)
– CQI (-) : hématies O Rh -
– sérum anti-D salins (ne contenant que des IgG anti-D)

2.2 - Mode opératoire


Cf. page 64

3 - Résultats et interprétations

3.1 - Contrôles de qualité internes et témoin


- CQI (+) : la présence d’une agglutination vérifie :
* la présence de la présence de GR sensibilisés par des Ac est bien repérée par un agglutinat
* les différents temps de la réaction (lavage et action de l’AGH) se déroulent parfaitement
* la bonne qualité de l’AGH.

- CQI (-) : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction et élimine les faux positifs
dues à l’AGH. Les Ac en absence d’Ag ne conduisent pas à une agglutination.

- Témoin contrôle : l’absence d’agglutination vérifie la spécificité de la réaction. Les GR sensibilisés


ne doivent pas agglutiner en absence d’AGH.

3.2 - Lecture des réactions


Si les témoins sont corrects :
•Une agglutination pour le test R signifie que les GR sont recouvertes par un Ac que le contexte
biologique identifiera comme un Ac d’origine maternelle.

B1ABM CM © 63
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 4

Réaction de Coombs
Dans 4 tubes à hémolyse, verser :
directe
Réaction T contrôle CQI (+) CQI (-)
Sérum anti-D - - 2 gouttes 2 gouttes
Sensibilisation des
1 goutte de 1 goutte de
GR témoins GR témoins - -
GR [O, Rh +] GR [O, Rh -]
Incuber à 37°C – 30 min
GR du
patient 1 goutte 1 goutte - -
50 % eau Ψ
Eau Ψ 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL
Lavage Centrifuger 3 min à 800g
Jeter l’eau du lavage dans la Javel et décoller le culot en grattant le tube sur
le portoir
Refaire ainsi 2 autres lavages dans 4 mL d'eau physiologique
Puis déposer sur chaque culot du dernier lavage :
Eau Ψ 3 gouttes 3 gouttes 3 gouttes 3 gouttes
Suspension à
20 % de GR pour
Poursuivre comme indiqué dans le tableau jaune (Technique en plaque)
technique en
ci-dessous.
plaque
Suspension à 5 % Eau Ψ 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL
de GR pour Poursuivre comme indiqué dans le tableau bleu (Technique en tubes)
technique en tube ci-dessous.
Eau Ψ : Eau physiologique

Technique en plaque
Réaction T contrôle CQI (+) CQI (-)
Suspensions
1 goutte 1 goutte 1 goutte 1 goutte
Agglutination des à 20 %
GR sensibilisés et AGH 1 goutte - 1 goutte 1 goutte
lavés
par l’AGH Eau Ψ - 1 goutte - -
Mélanger à l’aide d’un agitateur
Laisser reposer 5 min sur la paillasse et observer la présence éventuelle
d’agglutination.

Technique en tubes (dans 4 nouveaux tubes identifiés)


Réaction T contrôle CQI (+) CQI (-)
Suspensions
1 goutte 1 goutte 1 goutte 1 goutte
Agglutination des à 5%
GR sensibilisés et AGH 1 goutte - 1 goutte 1 goutte
lavés
par l’AGH Eau Ψ - 1 goutte - -
Agiter pour mélanger
Laisser reposer 5 min sur la paillasse et observer la présence éventuelle
d’agglutination.
64 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 5

P rocédure d'identification des


anticorps irréguliers (AI)
et exercices d'application

1 - Importance des informations préalables


Les informations concernant le contexte de la recherche ou l’identification des agglutinines irrégulières
chez le patient permettront d’identifier au mieux la ou les agglutinines irrégulières les plus probables.

Avant tout dépistage, il faut connaître si possible :


• le groupe ABO-RH1, le phénotype standard RH-KEL1 et éventuellement le phénotype
étendu précisant la présence des Ag érythocytaires appartenant aux autres systèmes
érythocytaires (ex: Duffy, Kidd, Lewis...).

• s’il s’agit d’une personne non transfusée ou sans enfant


à absence d’AI immuns
 présence éventuelles d’AI naturels (agglutinine froide, auto-Ac ou autres Ac naturels
irréguliers).
• s’il s’agit d’une femme avec 1 enfant, il y a une probabilité non négligeable de trouver 1
agglutinine irrégulière, en général (non systématique).

• S’il s’agit d’une femme multipare (plusieurs enfants) ou s’il s’agit d’une personne
polytransfusée il y a une probabilité non négligeable de trouver plusieurs agglutinines
irrégulières.

La fréquence des agglutinines irrégulières : Ac irréguliers les plus fréquemment rencontrés : Anti-D,
anti-E, anti-c, anti-Jka, anti-K (En général les Ac anti Ag du système Rhésus, Kell, Duffy et Kidd).

B1ABM CM © 65
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5

2 - Dépistage des agglutinines irrégulières (DSAI)

2.1 - Technique (cf. fiches n°2 et 3 )


Un panel de dépistage est utilisé. Ce panel est constitué généralement 3 lots d'hématies, l'ensemble de
ces lots d'hématies devant posséder l'ensemble des Ag spécifiques des Ac irréguliers recherchés.
Le sérum du patient est testé sur chacun de ces lots d'hématies : test de Coombs indirect et
éventuellement test à la papaïne*(* non obligatoire -GBEA arrêté 26 avril 2002).
Exemple :
Présence (+) ou absence (-) des Ag à la surface des hématies du lot Résultat

Coombs indirect 37°C

Papaïne * 37°C
Rhésus Kell Duffy Kidd MNs Lewis P Cw Luthéran
Lots
de
GR

D C c E e K k Fya Fyb Jka Jkb M N S s Lea Leb P1 Cw Lua Lub Kpa


Panel 1 + + - - + - + + - - + + + + + + - + + + + -
de 2 + - + + - - + - + + + + - + - - + + - - + +
dépis 3 - - + - + + + + + + + + - - + - + S - - + -
-tage Auto
contrô
-le

2.2 - Interprétation

2.2.1 - Auto-contrôle
Un autocontrôle positif signale la présence d’un auto-anticorps qui doit être confirmée par
la réalisation d’un test de Coombs direct. (cf. fiche 4 )
Il est alors nécessaire d’adsorber l'auto-anticorps (incubation du sérum avec les hématies du
patient) pour déceler et identifier un éventuel allo-anticorps masqué en renouvelant la RAI
après adsorption ;

2.2.2 - Dépistage des agglutinines irrégulières (AI)

Si l'auto-contrôle est négatif :

→ Des résultats négatifs [absence (-) d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la
papaïne), avec les 3 lots d'hématies, prouvent l'absence d'agglutinine irrégulière (AI).

→ Des résultats positifs [présence (+) d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la
papaïne), avec un lot au moins d'hématies, prouveraient la présence d'agglutinines irrégulières,
qu'il faudra identifier puis titrer.

66 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

3 - Identification des agglutinines irrégulières

3.1 - Technique (cf. fiches n°2 et 3 )


Un panel d'identification comprenant 10 lots d'hématies est utilisé.
L'ensemble de ces lots doit posséder l'ensemble des Ag spécifiques des Ac irréguliers recherchés.
Cependant chaque lot possède moins d'Ag que le panel de dépistage.
Exemple :

Présence (+) ou absence (-) des Ag à la surface des hématies du lot Résultat

Coombs indirect 37°C

Papaïne* 37°C
Rhésus Kell Duffy Kidd MNs Lewis P Cw Luthéran
Lots
de
GR

D C c E e K k Fya Fyb Jka Jkb M N S s Lea Leb P1 Cw Lua Lub Kpa


PANEL D’IDENTIFICATION

01 + + - - + + + + + + + + - + - - + + + - + -
02 + + - - + - + - + + - + - - + - + + - - + -
03 + - + + - - + - + - + + + + + - + - - + + -
04 - + + - + - + - + - + + - - + + - - - - + -
05 - - + + + - + + - + + - + - + - + S - - + -
06 - - + - + + + - + + + - + - + + - - - - + -
07 - - + - + - + + - - + + - + - - - - - - + -
08 + - + - + - + - - + - + + - + + - + - - W -
09 - - + - + - + + - + - + - + - - + + - - + -
10 - - + - + - + - + + - + + - + + - - - + + -
11 - - + - + + W + + + - + - + - - + S - - + +
Auto
con-
trôle

Importance des techniques employées pour l’identification des agglutinines irrégulières


Il faut savoir que la majorité des Ag érythrocytaires peuvent êtres reconnus par Ac
irréguliers par le test de Coombs indirect, alors que certains Ag érythrocytaires sont
détruits ou affaiblis par la réaction à la Papaïne et donc ne peuvent être reconnus par les Ac
irréguliers correspondants.
Par exemple :
Ag Fya et Fyb sont détruits par la papaïne.
Ag M et N ainsi que S et s peuvent éventuellement être affaiblis.

B1ABM CM © 67
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5

3.2 - Interprétation
3.2.1 - Auto-contrôle
➔ Un autocontrôle positif signale la présence d’un auto-anticorps, qu'il faudra confirmer
puis éliminer (cf. 2.2.1) pour refaire une RAI.
➔ Un auto-contrôle négatif et des résultats positifs à tous les lots d'hématies [présence (+)
d'agglutination] aux tests de Coombs indirect (et à la papaïne) doit orienter vers la recherche
d’un anticorps dirigé contre un antigène de grande fréquence, dit « public ».

Si l'auto-contrôle est négatif, et si tous les résultats aux tests de Coombs indirect (et papaïne) ne
sont pas tous positifs, procéder à l'identification des AI.

L'identification des AI est alors un jeu logique qui s'effectue en 3 temps.

3.2.2 - Premier temps : identification de tous les AI possibles


• Tenir compte des résultats négatifs obtenus avec les GR du panel d’identification en éliminant les
Ac correspondant aux Ag présents sur les GR tests.
Procéder par élimination, en rayant les Ag des hématies n’ayant pas réagit avec le sérum du
patient. Les Ac spécifiques de ces Ag sont ainsi éliminés.
 Noter le ou les Ac spécifiques des Ag restants : AI possibles

Remarques particulières : En général,


on peut éliminer les Ac anti-Fya et/ou Fyb et Jka et/ou Jkb uniquement si on dispose d’hématies homozygotes.
on peut éliminer les Ac anti-M et/ou N et Set/ou s uniquement si on dispose d’hématies homozygotes.
On peut se servir des résultats obtenus avec les hématies de dépistage pour l’identification.

3.2.3 - Deuxième temps : identification des AI les plus probables


• Tenir compte des résultats positifs obtenus avec les GR du panel d’identification en recherchant
l’Ag commun aux GR ayant donné des résultats positifs.
L’Ac le plus probable correspond à l’Ag commun aux GR tests donnant un résultat
positif. (Ă confronter aux renseignements concernant le patient)

Cependant, dans certains cas, il faut tenir compte des éventuelles disparités de réaction entre les deux tests
(Coombs indirect ou papaïne), qui peuvent alors s’expliquer par des disparitions ou affaiblissements des Ag par
le traitement à la papaïne.

3.2.4 - Troisième temps : élimination des Ac spécifiques aux Ag du patient


Si et seulement si l'absence d'auto-Ac a été démontré, il est alors possible d'éliminer les Ac
spécifiques aux Ag du patient.
Ex: Si le patient présente le phénotype : D+; C+, c- ; E- , e+ , éliminer les Ac anti-D, anti-C, anti-e.

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5

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Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5

72 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

B1ABM CM © 73
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 5

Illustration 3: Agglutination en
tube. A: négatif - B: positif

74 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 6

T itrage des anticorps irréguliers


de type IgM1

1 - Généralités
Les anticorps irréguliers peuvent être de type IgM (immun ou naturels) ou IgG.
Les Ac de type IgM sont généralement des Ac complets.
Leur mise en évidence repose alors sur une réaction d’agglutination active directe.

Ce titrage est mis en œuvre en particulier pour vérifier le titre en Ac d'un sérum test.

2 - Application : titrage des Ac naturels irréguliers anti-A1

2.1 - Principe
Les Ac naturels (IgM) irréguliers du système ABO sont titrés par une technique de dilution en série
d’un sérum et à l’aide d’une agglutination directe active.

Le titre en Ac anti-A1 est exprimé en UI/mL. Dans ce cas, le titrage des anticorps du sérum à titrer
nécessite une comparaison avec un sérum étalon de titre connu

2.2 - Mode opératoire


2.2.1 - Matériel et réactifs

 Suspension de globules rouges A1 à 2% en eau physiologique.


 Sérum à titrer (Sx) : 120 µL en tube à hémolyse
 Sérum étalon anti-A1(anti-A1 étalon) : 120 µL en tube à hémolyse.
Le titre de ce sérum est connu et donné par l’OMS.
 Microplaque à fond conique
 Tubes à hémolyse
 Pissette d’eau physiologique
 Distributeur de particules calibrées 25µL.
 Pipette automatique.

1 Attention : les Ac de type IgM peuvent être naturels réguliers (ex : anti-A), naturels irréguliers (ex:anti-A1) ou encore
immuns.

B1ABM CM © 75
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 6

2.2.2 - Technique
 deux titrages seront entrepris : sérum Sx et sérum étalon de titre ..........UI/mL
Réaliser 2 séries de dilution : 1 série de dilution par sérum
– Dilution de base de 1 et de raison 1/2
– -Diluant : eau physiologique.
– Volume final après dilution du sérum : 50 µL
– Volume de suspension érythrocytaire : 25 µL
Compléter le tableau suivant
Cupule n° 1 2 3 4 5 6 7 8
Diluant (µL)
50
Sérum étalon ou -
sérum x (µL)
Volume à -
redistribuer (µL)
Dilution -
1/1
Hématies A1 (µL) 25 25
Lecture de la plaque
S étalon
Résultats S étalon

Lecture de la plaque
Sx
Résultats Sx

Recouvrir d’un parafilm et mélanger. Centrifuger 3 minutes à 1 500 rpm.


Observer les voiles d'agglutination ou les boutons de sédimentation.
Remettre en suspension par agitation. Noter la présence de voile d'agglutination ou de bouton de
sédimentation.

2.3 - Interprétation
Rôle de la cupule 8 : ................................................................
Le titre d'Ac anti-A1 d'un sérum correspond à la plus grande dilution du sérum donnant encore
un voile d'agglutination .
Titre d'Ac anti-A1 en dilution (d) et en inverse (Fd)
• du sérum étalon : ....................
• du sérum inconnu :.................

Le titre en Ac anti-A1 d'un sérum peut aussi s'exprimer en UI/mL


Titre d'Ac anti-A1 en UI/mL du sérum inconnu :
– sachant que le sérum étalon a un titre d'Ac anti-A1 de ……… UI/mL (cette valeur sera donnée
en TP)
– à l’aide de la formule suivante (à démontrer) [titre étalon] = [titre X]
Fd étalon Fd X

76 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – Fiche 7

T itrage des anticorps irréguliers


de type IgG

1 - Généralités
Les Ac irréguliers sont en majorité incomplets (IgG), leur mise en évidence par une réaction
d'agglutination nécessite un artifice  agglutination indirecte (artificielle).
Le GBEA et les normes ISO 15189 préconisent d'utiliser le test indirect à l'antiglobuline (TIA) ou test
de Coombs indirect.

2 - Titrage des Ac irréguliers anti-D

2.1 - Principe
Les Ac immuns irréguliers anti-D (IgG) sont titrés par une technique de dilution en série d’un sérum et
à l’aide d’une agglutination indirecte active (antiglobuline humaine).

Le titre en Ac anti-D est exprimé en UI/mL. Dans ce cas, le titrage des anticorps du sérum à titrer
nécessite une comparaison avec un sérum étalon de titre connu

2.2 - Mode opératoire


2.2.1 - Matériel et réactifs.
 Suspension de globules rouges O Rh+ à 2% en eau physiologique.
 Sérum du patient à titrer (Sx) : 120 µL en tube à hémolyse
 Sérum étalon anti-D (anti-D étalon) : 120 µL en tube à hémolyse.
Le titre de ce sérum est connu et donné par l’OMS.
 Anti-globuline humaine (AGH)
 Microplaque à fond conique
 Tubes à hémolyse
 Pissette d’eau physiologique
 Distributeur de particules calibrées 25µL.
 Pipette automatique.

B1ABM CM © 77
Chapitre 2 – Anticorps irréguliers – fiche 7

2.2.2 - Technique.
Réaliser une série de dilution du sérum à tester de base de 1 et de raison ½
– Diluant : eau physiologique.
– Volume final après dilution du sérum : 50 µL

Compléter le tableau suivant

Cupule n° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Diluant (µL) 75 50 50

Sérum - 50 -
sérum x (µL)
Volume à - - -
redistribuer
(µL)
Dilution 1/1 -

Hématies 25 25 25 25
Rh+ (µL)
Recouvrir d’un parafilm. Agiter 1 min et incuber à 37°C pendant 20 min.

AGH (µL) 50 - - 50

Recouvrir d’un parafilm et mélanger. Centrifuger 3 minutes à 1 500 rpm.


Observer les voiles d'agglutination ou les boutons de sédimentation.

2.3 - Interprétation
Donner le rôle des cupules 8, 9 et 10
Donner le titre d'Ac anti-D en dilution (d) et en inverse (Fd) du sérum à tester.

78 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

- Chapitre 3 -
Techniques en gel filtration
Généralités
Ces techniques ont l'avantage d'être automatisables.

1 - Principe
Le mélange hématies-sérum se déroule au sein d’un gel.
– Les hématies n’ayant fixé aucun Ac traversent et sédimentent au fond du micro tube (Le diamètre des
hématies est inférieur aux mailles et pores du gel utilisé).
– Les immun complexes correspondant à des agglutinats (édifice multiparticulaire d’Ag réunis par des
ponts d’Ac) spécifiques aux Ag) restent bloqués dans les mailles du gel.
• Une réaction négative se traduit par une sédimentation des GR libres dans le fond du micro tube.
• Une réaction fortement positive se traduit par une rétention des hématies agglutinées, dans la partie
supérieure du micro tube.
• Une réaction faiblement positive se traduit une dissémination des hématies agglutinées, à l’intérieur
du micro tube.
La réaction Ag-Ag est accélérée et révélée après centrifugation.

GR non agglutinés GR agglutinés

Gel avec un certain


« maillage »

B1ABM CM © 79
Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – Généralités

2 - Différents types de gel


– Gels neutres immunologiquement : Dextran préparé dans un tampon neutre.
– Gels contenant des Ac connus :
• Ac anti-A ou Ac anti-B ou Ac anti-D (système ABO et Rhésus).
• Ac anti-D, anti-E, anti-e, anti-C, anti-c (phénotypage Rhésus et Kell).
Dans ce type de gel, la formation de l’agglutinat se fait au cours de la centrifugation.
– Gels contenant un artifice :
• Anti-globuline humaine (test de Coombs)

3 - Procédures standardisées Diamed®


Groupage ABO – Épreuve globulaire uniquement.
•Carte ID ABO/Rh.
•Gel contenant des Ac agglutinants anti-A, anti-B et anti-A + B.
•Suspension d’hématies à grouper, préparées à 5% en tampon ID diluent 1 (broméliné).
•Réalisation du test à température ambiante.

Groupage ABO – E preuve sérique uniquement.


•Carte ID NaCl/enz.
•Gel neutre.
•Suspension d’hématies tests (ID diacell A1, A2, B et O préparées à 5%.)
•Mélange des GR tests + sérum à tester à la surface du gel.
•Réalisation du test à température ambiante.

Détermination du phénotype Rhésus complet et Kell.


•Carte ID Diaclon Rh.
•Gel contenant des Ac agglutinant anti-C, anti-c et anti-E etc … (Ac monoclonaux en général).
•Suspension d’hématies à grouper, préparées à 5% en tampon ID diluent 2 (Eau physiologique).
•Réalisation du test à température ambiante.

Recherche d’agglutinines irrégulières.


•Carte combinée AGH/Enz (3 micro tubes contenant le gel + AGH et 3 micro tubes contenant le gel neutre).
•Carte combinée ID liss/Coombs.
•Carte Enz NaCl/Enz.
•Utilisation du sérum à tester.
•Utilisation de GR de panels de dépistage et / d’identification (ID diacell List I, II et III pour le tests de Coombs
et ID diacell list Ip, IIp, IIIp pour le test à la papaïne).

Avantages et inconvénients.
•Grande sensibilité.
•Petite quantité de réactif nécessaire.
•Nombre de manipulation réduit.

•Nécessité de standardiser les gels.

80 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – Fiche 1

G roupage ABO - RH1


Système en minigel – Système Diamed®

1 - Matériel et réactifs
− Carte « ID ABO/Rh » possédant six microtubes contenant des gels A, B, AB, D, DCE et ctl :
è gel A contenant des Ac anti-A
è gel B contenant des Ac anti-B
è gel AB contenant des Ac anti A+anti-B
è gel D contenant des Ac anti-D
è gel DCE contenant des Ac anti-D+anti-C+anti-E
è gel ctl neutre immunologiquement.
− un tube à hémolyse contenant environ 1mL de diluent ID2 (basse force ionique)
− 2 tubes à hémolyse
− 2 pastettes et 1 pipette automatique de 10 µL
− gants.

2 - Mode opératoire
A partir du tube de sang fourni, recueilli sur EDTA et centrifugé :
− préparer une suspension globulaire à environ 5 % (soit environ 1/20) en tampon ID2 dans un
tube à hémolyse.
− mélanger et incuber 10 min à température ambiante.
− enlever la pellicule d’aluminium de la carte délicatement de manière à ne pas souiller les
microtubes entre eux.
− déposer à la surface de chaque gel, 10 µL de suspension globulaire à 5%.
Attention : ne pas toucher le bord des microtubes avec la pointe de pipette.
− centrifuger la carte dans la centrifugeuse ID spécifique.

3 - Lecture et interprétation
Réaliser un tableau de résultat, dans lequel seront schématisé l'aspect des gels et l'interprétation
correspondante.
Interpréter l'ensemble des résultats et proposer des tests complémentaires.

B1ABM CM © 81
Chapitre 23– Techniques en gels filtration – fiche 1

Illustration 4: Un automate permettant la réalisation


des groupages sanguins en gel filtration (Classic Plus
ID-GelStation -Diamed)

Illustration 5: Un exemple de résultats -


Groupe ABO1 - RH1

82 CM © B1ABM
Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Chapitre 3 – Techniques de gel filtration – Fiche 2

E
1 - Étude du cas 1
xercices – Interprétations de
résultats obtenus en minigel
Système Diamed®

Analyser les gels suivants, concernant une patiente, 32 ans, déjà mère de 3 enfants et enceinte d'un
4ème enfant.
Pour chaque gel, indiquer la présence ou non de composés additionnels et préciser la composition du
dépôt versé sur chaque gel.

A B AB D DCE ctl C c E e Kell ctl

A1 A2 B I II III I II III IP IIP IIIP

Simonin Coombs Coombs Papaïne

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Chapitre 3 – Techniques en gel filtration – fiche 2

2 - Étude du cas 2
Un patient doit subir seconde transfusion sanguine. .
Interpréter les résultats obtenus sur les cartes de groupage et phénotypage correspondantes.
Analyser les résultats obtenus pour le dépistage des agglutinines irrégulières, ainsi que pour
l’identification.

A B AB D DCE ctl C c E e Kell ctl

A1 A2 B I II III I II III IP IIP IIIP

Coombs Enzyme

1 2 3 1 2 3 4 5 6 4 5 6

Coombs Enzyme Coombs Enzyme

7 8 9 7 8 9 10 11 Ctl 10 11 Ctl
Coombs Enzyme Coombs Enzyme

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Module 4 – Immuno-hématologie Activités technologiques

Panel d'hématies Rhésus Kell Duffy MNs Lewis P Cw Luthéran Coombs Papaï-
n°00689 D C c E e K k Fya Fyb M N S s Lea Leb P1 Cw Lua Lub 37°C ne
37°C
Panel 1 + + - - + - + + - + + + + + - + + + +
de 2 + - + + - + + - + + - + - - + + - - +
dépista 3 - - + - + - + + + + - - + - + S - - +
ge
PANEL D’IDENTIFICATION

01 + + - - + - + + + + - + - - + + + - +
02 + + - - + - + - + + - - + - + + - - +
03 + - + + - - + - + + + + + - + - + + +
04 - + + - + - + - + + - - + + - - - - +
05 - - + + + + + + - - + - + - + S - - +
06 - - + - + - + - + - + - + + - - - - +
07 - - + - + - + + - + - + - - - - - - +
08 + - + - + - + - - + + - + + - + - - W
09 - - + - + - + + - + - + - - + + + - +
10 - - + - + - + - + + + - + + - - - + +
11 - - + - + - W + + + - + - - + S - - +
contrôle

Proposer des examens complémentaires éventuels.

3 - Étude du cas 3
Dépistage d'une maladie hémolytique chez un nouveau-né :
– recherche des Ag érythrocytaires A,B et D
– test de Coombs direct (ou test direct à l'antiglobuline).

• Pour chaque gel utilisé ci-dessous, indiquer la présence ou non de composés additionnels et préciser
la composition du dépôt versé sur chaque gel.
• Analyser les résultats obtenus et conclure.

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