Isolement et l’identification d'une bactérie

Inconnue du sol

Introduction :
Pour identifier et caractériser divers microbes inconnue au niveau de laboratoire de
microbiologie, afin de mener des recherches par exemple, il est nécessaire de passer par les
tests microbiologiques standards.

Puisque Le sol est une excellente source de micro-organismes inconnus, comme les
bactéries, les algues, les protozoaires …etc.on commençant par la procédure d'isolement
d'une bactérie inconnue du sol sur une plaques de culture primaire.

Les expériences de laboratoire qui restent âpres l’isolement :

(a) l'identification d'une bactérie inconnue à l'aide de diverses techniques de coloration

(b) détermination de la motilité d'une bactérie inconnue

(c) détermination des caractéristiques physiologiques d'une bactérie inconnue.

Exercice A : Isolement d'une bactérie inconnue à partir du sol

Expérience 1 : Cultures primaires à partir d'extraits de sol

Procédure :
On transfère de manière aseptique une petite quantité de terre dans un tube qui contient 5
ml de BST ensuite, on Mélange le tube pour mettre en suspension les organismes du sol dans
le bouillon. On laisse le tube reposer à 25°C pendant environ 30 minutes jusqu'à ce que la
plupart des particules de sol se soient déposées.

30 min après, on Utilise le bouillon liquide supérieur pour strier les plaques (T) ensuite, les
Étiqueter en bas et finalement on met les plaques dans l’incubateur pour les incuber à 30°C
Pendant 48 heures.

Expérience 2 : Cultures secondaires à partir de cultures primaires

Procédure :
Dans cette expérience, les élèves vont prélever trois colonies différentes sur leurs plaques de
culture primaire et créer trois plaques de culture secondaire à partir de celles-ci on suivant
la procédure pour la strie T de l'expérience 1. L'une des cultures secondaires pures servira de
bactérie inconnue.

Expérience 3 : Identification d'une bactérie inconnue à partir de cultures

secondaires

Procédure : Dans cette expérience, on doit enregistrer les caractéristiques des colonies de
les trois cultures pures des trois plaques secondaires ensuite on choisit notre bactérie
inconnue sur l'une des plaques et finalement on observe les frottis colorés au cristal violet.

Expérience 4 : stocker de gélose de bactérie inconnue

Procédure : Dans cette expérience, on prépare quatre géloses de notre

bactérie inconnue, Afin de les utiliser dans les 23 autres expériences pour
l'identification, la détermination de la motilité et les caractéristiques
physiologiques de notre inconnu.

Exercice B : Identification d'une bactérie inconnue par Utilisation de

différentes techniques de coloration :

Expérience 1 : coloration de Gram : Dans cette expérience, on détermine si la bactérie

inconnue est gram positif Gm+ (si la bactérie a resté violette) ou négative Gm- (si la bactérie
sera maintenue teintée en rose

Expérience 2 : Tache d'endospore : : Dans cette expérience, on va déterminer si notre

bactérie inconnue est une endosporeuse par la coloration au vert malachite, ( les spores
sont colorés en vert)

Expérience 3: coloration acido-basique : Dans cette expérience, on détermine si notre

bactérie inconnue est acidophile. Après que les frottis aient été fixés sur les lames à la
chaleur, on se suit la procédure pour la coloration acido-fast en utilisant la configuration du
bain-marie, La présence d'acide mycolique dans les bactéries acido-fast fait souvent que les
bactéries s'agglutinent.
Expérience 4 : Tache de capsule : Dans cette expérience, on détermine si notre bactérie
possède une capsule. . On utilisant une coloration de la capsule par la méthode du frottis à
sec qui apparaît claire sur un fond noir

Exercice C : Détermination de la motilité d'une bactérie inconnue

Expérience 1 : Montages humides Dans cette expérience, on détermine la motilité de

notre bactérie inconnue par l'observation microscopique de montages humides.

Expérience 2 : Plaques de gélose molle ; Profondeurs de gélose molle

Dans cette expérience, on confirme nos observations sur la motilité de notre bactérie
inconnue à partir de leurs montages humides (expérience 9).

Exercice D : Caractéristiques physiologiques d'une bactérie inconnue

Expérience 1 : besoins en oxygène

Dans cette expérience, on détermine les besoins en oxygène de notre bactérie inconnue.

Expérience 2 : Croissance sur milieux sélectifs et différentiels

Au cours de cette expérience, on détermine si notre bactérie inconnue se développe sur une
gélose nutritive, une gélose riche en sel et une gélose au mannitol et au sel.

Expérience 3 : Optimum de température

Dans cette expérience, on détermine la température optimale de notre bactérie inconnue.

Expérience 4 : effets osmotiques

Dans cette expérience, on détermine la tolérance de notre bactérie inconnue à des
concentrations croissantes de NaCl.

Expérience 5 e: pH optimal
Dans cette expérience, on détermine le pH optimal pour la croissance de notre bactérie
inconnue.

Expérience 6 : Dégradation des polysaccharides

Dans cette expérience, on détermine si notre bactérie inconnue hydrolyse l'amidon.

Expérience 7 : Dégradation des protéines

Dans cette expérience, on détermine si notre bactérie inconnue hydrolyse la caséine et la
gélatine.
Expérience 8 : Dégradation des lipides
Dans cette expérience, on détermine si notre bactérie inconnue hydrolyse les
phospholipides.

Expérience 9 : Utilisation du Citrate

Dans cette expérience, on détermine si notre bactérie inconnue métabolise le citrate.

Expérience 10 : Production d'indole à partir de Tryptophane

Dans cette expérience, on détermine si notre bactérie inconnue métabolise le tryptophane.

Expérience 11 : Hydrolyse de l'urée

Dans cette expérience, on détermine si notre bactérie inconnue hydrolyse l'urée.

Expérience 12 : Fermentation du sucre

Dans cette expérience, on détermine si notre bactérie inconnue va fermenter le saccharose,
le lactose ou le glucose avec production d'acide ou d'acide et de gaz.

Expérience 13 : Fermentation d'acides mixtes ; Fermentation de butylène

glycol
Dans cette expérience, on détermine le type de fermentation du glucose de notre bactérie
inconnue (si elle fermente le glucose).

Expérience 14 : Production de H2S

Dans cette expérience on détermine si notre bactérie inconnue métabolise des composés
contenant du soufre pour produire du H2S.

Expérience 15 : Activité oxydase et catalase

Dans cette expérience, on détermine la présence de cytochrome C (oxydase +) et de catalase
dans leur bactérie inconnue (qui effectue une respiration aérobie).

Expérience 16 : Réduction du nitrate :

Dans cette expérience, on détermine si notre bactérie inconnue réduit le nitrate.

Expérience 27 : Test du lait de Litmus :

Dans cette expérience on interprète un certain nombre de résultats provenant du
métabolism  de divers composés présents dans le lait.