Master Recherche M2

Domaine Sciences de la Santé

Mention Pathologie Humaine
Spécialité : Oncologie
Année universitaire 2011-2012

Thérapies cellulaires utilisant les cellules souches et

progéniteurs hématopoïétiques
Pr. Christian CHABANNON
27 novembre 2011
Plan de l’exposé

1. Bref rappel sur l’hématopoïèse

2. Les greffes de cellules souches hématopoïétiques
3. La sélection des progéniteurs hématopoïétiques en
situation clinique
4. L’expansion
5. Aspects réglementaires
1. Notion de cellules souches
2. Cytokines et facteurs de croissance de
l’hématopoïèse
3. Facteurs de transcription: la programmation
génétique de la différenciation des cellules
souches et progéniteurs hématopoïétiques
4. La niche hématopoïétique, et les signaux qui
régulent le destin de la cellule souche
hématopoïétique

HÉMATOPOÏESE
Notions de
cellules souches

Eckfeldt et al., 2005

Différenciation hématopoiétique

Orford and Scadden, Nature Review Genetics 2008

Le phénotype des cellules hématopoïétiques aux
différentes étapes de leur différenciation

Weissman and Shizuru, Blood 2008

Facteurs de croissance de l’hématopoïèse et
cytokines

Kaushansky, NEJM 2006

Facteurs de transcription et différenciation
hématopoïétique

Orkin and Zon, Cell 2008

Les niches hématopoïétiques

Wilson & Trumpp, 2005

1. Les thérapies cellulaires les plus utilisées en clinique humaine
2. Evolutions des activités d’autogreffe
3. Evolution des activités d’allogreffe
4. Objectifs thérapeutiques des chimiothérapies intensives
associées à une autogreffe

LES GREFFES DE CELLULES

SOUCHES
HEMATOPOIETIQUES
Prélèvement / production de cellules hématopoïétiques
humaines à des fins thérapeutiques
Cellules souches et progénitrices
Produits de Thérapie
Cellulaire (PTC): autogreffes et
allogreffes
Cellules matures et différenciées
Produits Sanguins Labiles
(PSL): érythrocytes, plaquettes,
leucocytes
Origine des cellules greffées /
administrées
Prélèvement chez un donneur
vivant de produits cellulaires contenant
des cellules souches somatiques, des
progéniteurs ou des cellules matures :
pratiques transfusionnelles et de
transplantation très répandues en
pratique clinique quotidienne, avec une
optimisation continue des procédés.
Différenciation maitrisée in
vitro de cellules possédant des
caractéristiques de totipotence
(cellules souches embryonnaires ou ES,
iPS): recherche et développement, pas
encore au stade des applications
cliniques (« Médicaments de Thérapie
Innovantes », MTI ou « Advanced
Therapy Medicinal Products », ATMPs).
Thérapies cellulaires hématopoïétiques
Greffes autologues
Le patient est son propre
donneur
Thérapie cellulaire
« réparatrice » des dommages
iatrogènes infligés au tissu
hématopoïétique par des agents
cytotoxiques utilisés en
cancérologie
Greffes allogéniques
Le donneur est un individu sain
et volontaire, qui partage
certaines caractéristiques
biologiques avec le patient
receveur (histo-compatible)
Thérapie cellulaire réparatrice
d’un tissu hématopoïétique non
fonctionnel (pathologie
constitutionnelle ou acquise)
Immunothérapie allogénique
(voir présentation par C
Faucher)
Schéma général pour la transplantation de cellules
hématopoïétiques

Barker & Wagner, 2003

Origine des greffons utilisés en transplantation
thérapeutique

Greffes Greffes Greffes

autologues allogéniques allogéniques
apparentées non
apparentées
Greffon ÌÌÌ Ì Ì
médullaire

Greffon ÊÊÊ ÊÊ ÊÊ
sanguin

Unité de sang 0 Anecdotique Ê

placentaire (anecdotique)
(USP)
Les greffes de cellules hématopoïétiques sont
le premier exemple historique de thérapies
cellulaires développées à relativement grande
échelle

Programmes de greffe dans les pays industrialisés

Faisant essentiellement appel à des établissements de santé
(établissements de soins, établissements de transfusion)
Secteur public majoritairement
Souvent restreints à des hôpitaux (universitaires) jouant le rôle
de centres de recours
Activités de plus en plus réglementées
Les succès et les échecs peuvent servir d’éléments de réflexion
pour des thérapies cellulaires s’appliquant à d’autres domaines
médicaux, ou faisant appel à des procédés plus sophistiqués
 Evolution de l'activité de greffe allogénique en
Europe (source : EBMT)

14000
12000
10000
8000
6000
4000
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20
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19

19
 Evolution de l'activité de greffe autologue
en Europe (source : EBMT)

20000

15000

10000

5000

0
83

99

01
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19

19
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20

20

20
19

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19

19

19

19

20
Greffes de cellules hématopoïétiques

Principes
Principes des chimiothérapies intensifiées avec autogreffe

Relation dose-effet (anti-tumoral) pour le ou les agents

cytotoxiques choisis
Vrai pour certains agents cytotoxiques (alkylants +++)
Pas possible pour certains agents qui ont une toxicité extra-
hématopoïétique importante (anthracyclines)
In vitro vs in vivo
Indications qui restent discutées
limitées essentiellement à des néoplasies hématologiques
(myélomes, lymphomes malins non Hodgkiniens …)
concerne peu les cancers d’origine épithéliale les plus fréquents
(prostate, poumon, sein …)
Greffes de cellules hématopoïétiques autologues

Principes
Corriger la myélo-toxicité induite par l’administration de cytotoxiques
(à fortes doses)
Pas d’effet anti-tumoral du greffon: l’autogreffe est un « soin de
support »
Modalités
Ré-injection par voie intra-veineuse – après le conditionnement (radio)-
chimiothérapique – du greffon sanguin (ou médullaire) qui
correspond à une suspension cellulaire contenant une minorité de
cellules souches et progénitrices diluées dans une majorité de
cellules mature
Optimisation
Sélection et ré-injection des seules cellules souches et progénitrices
Expansion des cellules souches et progénitrices
 Exemple de programme thérapeutique en onco-
hématologie

Diagnostic:
Examens cytologique,
histologique, cytogénétique Autogreffe
& moléculaire de cellules ou (Ré-injection du
tissus tumoraux (obtenus par greffon sanguin
cyto-ponction, biopsie, chirurgie … autologue
Cytaphérèses
Prélèvement du Décongelé)
greffon sanguin
autologue

Chimiothérapie
à hautes doses

Chimio n° 1 Chimio n° 2 Chimio n° 3 Chimio n° 4

temps

3-4 semaines
Chimiothérapie à haute dose, autogreffe &
myélome multiple
Chimiothérapie à haute dose, autogreffe &
myélome multiple
Chimiothérapie à haute dose, autogreffe &
lymphome malin non hodgkinien
Chimiothérapie à haute dose, autogreffe &
lymphome malin non hodgkinien
Techniques de prélèvement
Les greffons sanguins comme substituts aux greffons
médullaires
mobilisation des progéniteurs hématopoïétiques dans le sang
circulant
• facteur prédictif de la qualité de la collecte: numération des
cellules CD34+ circulantes
prélèvement des cellules par cytaphérèse
• processeur automatisé
• facilité de la collecte pour le patient
greffon contenant un grand nombre de progéniteurs
hématopoïétiques (et de cellules immuno-compétentes)
• reconstitution hématopoïétique plus rapide (en situation
autologue et en situation allogénique)
• hospitalisations plus courtes
• réduction des coûts
cette évolution technologique a contribué à l’augmentation de
l’activité de greffe dans les années 1990
Méthodes de mobilisation des progéniteurs
hématopoïétiques utilisables en pratique clinique (1)

Après une chimiothérapie

Utilisable uniquement chez des patients traités, en vue d’une
autogreffe
Agents efficaces pour la mobilisation: cyclophosphamide,
anthracyclines, etoposide …
Soit une cure du schéma de chimiothérapie d’induction ou de
sauvetage
Soit une « chimiothérapie de mobilisation »
Suivie de l’administration quotidienne de rhG-CSF
Méthodes de mobilisation des progéniteurs
hématopoïétiques utilisables en pratique clinique (2)

Après administration de rhG-CSF

Utilisable soit chez des patients en vue d’une autogreffe (à
planifier dans une intercure par exemple), soit chez des
donneurs volontaires (majeurs) – apparentés ou non
apparentés – en vue d’une allogreffe
Formes natives non pegylées: Durée d’action brève: administration
quotidienne
10 µg/kg/j par voie sous cutanée (AMM)
Monitoring des cellules CD34+ circulantes à partir du 5° jour
• Après la 4° injection
En général schéma d’administration sur 6 jours
Les nouveaux agents pour la mobilisation des
progéniteurs hématopoïétiques

Antagonistes / agonistes des chemokines et de leurs

ligands
AMD3100 (plerixafor, Mozobil®) : antagoniste de CXCR4
Une injection de 160 µg/kg ou 240 µg/kg induit une
augmentation rapide et réversible du nombre des
progéniteurs CD34+ circulants
Bien toléré
Synergie avec rhG-CSF
Évaluation:
Mauvais mobilisateurs
Donneurs sains ?
Prélèvement de cellules sanguines par aphérèse (1)

http://www.gambrobct.com
Prélèvement des CSH circulantes par cytaphérèse (2)
1. Immuno-sélection des cellules CD34+
2. Indications en situation clinique
3. Les dispositifs d’immuno-sélection cellulaire qui
dérivent de la 1° génération de dispositifs
d’immuno-sélection des cellules CD34+

LA SÉLECTION DES
CELLULES SOUCHES
HEMATOPOIETIQUES
Principe des dispositifs de sélection de cellules
CD34+

CD34 = “marqueur” des cellules souches et progénitrices

hématopoïétiques
De nombreux anticorps monoclonaux ont été produits à
partir du milieu des années 1980
Quatre dispositifs d’immuno-sélection ont été
commercialisés, dont un seul reste disponible
CliniMACS (Miltenyi Biotec G.m.b.H.) utilise des billes
magnétiques
Le dispositif offre une certaine flexibilité, et la
possibilité de combiner une sélection CD34 + à une
déplétion additionnelle en lymphocytes (utile pour la
greffe allogénique)
Usages possibles des dispositifs de sélection de
cellules CD34+
Avantages potentiels :
Définition, “standardisation” du produit de thérapie cellulaire.
souhaitable (agences réglementaires) mais pas indispensable
Réduction des effets indésirables liés à l’utilisation de
cryoprotecteur
d’autres possibilités technologiques existent (lavage des greffons
décongelés)
Purge tumorale en situation autologue
voir dia suivante
T-déplétion en situation allogénique
voir plus bas
“enabling technology”
expansion in vitro et manipulation génétique des progéniteurs
sélectionnés
La sélection des cellules CD34+ comme outil pour
la « purge tumorale » des greffons autologues
Postulat: les cellules tumorales contaminant le prélèvement
peuvent contribuer à la rechute après chimiothérapie
intensive et autogreffe
les cellules tumorales n’expriment pas CD34
la sélection des cellules CD34+ comme alternative à des méthodes plus
anciennes
Evaluation biologique de la purge tumorale
outils à définir pour chaque pathologie (cancer du sein, myélomes,
lymphomes ...)
immunocytochimie, cytométrie en flux, biologie moléculaire
Evaluation clinique de la purge tumorale
pour chaque indication
long et difficile (cellules tumorales contaminant le greffon vs cellules
tumorales résiduelles endogènes)
la preuve clinique de l’intérêt de réaliser une purge tumorale manque
toujours
La sélection des cellules CD34+ comme un outil
pour la T-déplétion des greffons allogéniques

Les lymphocytes T matures présents dans le greffon

allogénique sont responsables de la survenue de formes
aiguës et chroniques de maladie du greffon contre l’hôte
Ces cellules n’expriment pas l’antigène CD34+
Les outils d’immuno-sélection CD34+ sont des outils efficaces pour la T-
déplétion (~ 3 logs), et une étape de déplétion des cellules CD3+
résiduelles peut encore améliorer leur efficacité
La T-déplétion est un outil efficace pour réduire ou abroger
la survenue de GVH dans des modèles pré-cliniques et
en situation clinique
Mais en situation clinique, l’incidence des rechutes abroge le bénéfice associé
à la moindre fréquence / sévérité des GVH
Procédure très peu utilisée sauf pour des modalités de greffes allogéniques
très particulières, telles que les greffes en situation « haplotype-mismatch »
1. Les expériences historiques qui utilisent les
cytokines et facteurs de croissance de
l’hématopoïèse
2. Les expériences modernes basées sur l’utilisation
des signaux régulant le destin des cellules
souches hématopoïétiques

EXPANSION IN VITRO
Expansion in vitro des greffons autologues

La correction de la cytopénie est une fonction inverse de la

quantité de progéniteurs CD34+ qui sont ré-injectés.
Relation non linéaire
Conduit à fixer un nombre minimal, voir un nombre optimal de
progéniteurs à prélever en vue de greffe autologue
L’expansion in vitro peut poursuivre deux objectifs:
Abolir le « nadir » par la transplantation de « mégadoses » de cellules
CD34+, et des cellules en voie de différenciation
• réduire encore la morbidité et le recours aux soins de support pour ce
type de procédures
• faire évoluer ces pratiques vers des modalités d ’hospitalisation
ambulatoires
Corriger les greffons autologues contenant un nombre insuffisant de
progéniteurs hématopoïétiques
• patients « mauvais mobilisateurs » (« poor-mobilizers »)
Améliorer les greffons présentant une quantité insuffisante
de progéniteurs

Mauvais mobilisateurs
< 2x106 cellules CD34+/kg Ñ délai dans la correction de la neutropénie
et de la thrombopénie
• utilisations accrues de ressources de soins, en particulier
transfusionnelles
d ’un point de vue carcinologique: s ’agit-il de bonnes indications ?
Tentative de compléter le greffon « insuffisant » par un greffon
« amplifié »
rares études, non contrôlées
possibilité de corriger la cytopénie dans des délais comparables à ceux
observés après ré-injection de greffons contenant plus de 2x106
cellules CD34+/kg
Alternatives : nouveaux agents pour la mobilisation des
progéniteurs (AMD3100 ou autres)
Utilisation des cytokines et FCH pour l’amplification du
nombre des cellules CD34+

Deux approches possibles:

1) Soit tenter d’amplifier la population des cellules
souches et progéniteurs par l’utilisation pendant la ou
les étapes de culture de cytokines actives aux stades
précoces de l’hématopoïèse
2) Soit tenter d’induire la différenciation maitrisée des
cellules progénitrices en une population homogène de
cellules matures et fonctionnelles, avec des cytokines
et FCH spécifiques d’un lignage
précurseurs et neutrophiles matures
cellules érythroïdes
Abolir le « nadir » succédant à une chimiothérapie à haute
dose et une autogreffe

Nombreuses études pilotes (phase I) conduites:

faible nombre de patients, études non contrôlées
conditions de culture variables s ’efforçant d ’orienter la différenciation plutôt
vers la voir neutrophile, plutôt vers la voie mégacaryocyto-plaquettaire, ou
plutôt de préserver le compartiment des progéniteurs hématopoïétiques les
plus immatures
concluent essentiellement à la faisabilité et à la tolérance de la ré-injection des
cellules amplifiées
Une seule étude conclut à une possible efficacité
étude sur une trentaine de patients atteints de myélomes, et recevant une
chimiothérapie par haute dose de melphalan +/- irradiation corporelle totale
SCF + MGDF + G-CSF
une majorité de patients n ’a pas présenté de neutropénie < 0,5x109/L
Chimérisme hématopoïétique dans des souris
NOD-SCID xéno-transplantées avec des cellules
humaines amplifiées
Incertitudes biologiques sur l’expansion in vitro

La différenciation induite par les cytokines peut-elle

compromettre le potentiel des cellules souches et
progénitrices initialement contenues dans le greffon ?
Expansion des greffons allogéniques

Greffes de sangs placentaires

le principal facteur pronostique est la dose de cellules
la cytopénie succédant à une greffe de sang placentaire est
prolongée
solutions envisageables:
• Augmenter la taille des greffons conservés dans les banques
(critères de sélection / qualification plus stricts)
• Utiliser simultanément plusieurs greffons (« doubles greffes »)
• Amplifier tout ou partie d ’un seul greffon
– « banquer » les greffons en deux parties au moins
– quelques études cliniques pilotes:
» pas de gain en terme de reconstitution hématopoïétique
Production massive d’érythrocytes par différenciation
maîtrisée de cellules CD34+ placentaires (cellules souches
somatiques)
 CD34+
CliniMacs 8 jours

CSMO, CSSP,
CSSC 3 jours
95 à 98%
d’érythroblastes

Lignée murine
1 à 5% 10 jours stromale MS5
d’érythrocytes Lignée humaine
stromale
Cellules souches
mésenchymateuses
humaines

Représentation schématique du protocole

d’expansion utilisé
Amplification des cellules CD34+

J15 = x 16 500 pour CSSP et CSMO

x 29 000 pour CSSP mobilisées par G-CSF
x 140 000 pour CSSC
Expansion in vitro: état des lieux

Difficulté aujourd’hui à obtenir des cytokines de grade

clinique
peu de cytokines avec une A.M.M. (Epo, G-CSF, GM-CSF)
Difficulté à obtenir un accord des autorités réglementaires
Beaucoup de projets cliniques abandonnés
compétition entre différentes approches thérapeutiques
• « thérapeutiques ciblées » vs chimiothérapie
« conventionnelle » (incluant HDCT + autogreffe)
bénéfice marginal dans le contexte de la chimiothérapie à haute
dose et des autogreffes ?
• le bénéfice attendu porte sur les soins de support plus que sur
le contrôle de la maladie tumorale
Mais des projets précliniques innovants
Manipuler les signaux régulant le destin des cellules
souches hématopoïétiques ?

Evaluation aujourd’hui d’autres approches:

1) manipuler le programme génétique des cellules
souches hématopoïétiques (HoxB4, cibles épigénétiques
…)
2) reproduire le microenvironnement – ou une partie des
signaux émis par le microenvironnement - de la cellule
souche hématopoïétique
Développements pré-cliniques

Nouveaux facteurs susceptibles de controler

l’amplification des CSH dans un contexte clinique
Facteurs transcriptionnels: HoxB4
Molécules impliquées dans la transmission du signal
• Cytokines hématopoïétiques (historique)
• Récepteurs Wnt et Notch
Molécules impliquées dans la régulation du cycle
cellulaire: p18, p21
Données essentiellement collectées dans le modèle
murin
Expansion in vitro: état des lieux (2)
1. Les réglementations applicables dépendent de la
modification « substantielle » ou « non
substantielle » de la population cellulaire de
départ, de l’échelle de production
2. Hypothèses pour le futur

ASPECTS RÉGLEMENTAIRES
 Matériel cellulaire reproductible issu d’une banque

Prélèvement individuel

Cellules Sélection Amplification ou

« manipulées de cellulaire différenciation
façon (immuno- maîtrisée
minimale » sélection)
Cellules souches Progéniteurs
somatiques

Cellules souches
multipotentes

Cellules souches
embryonnaires
ou iPS
Production d’érythrocytes par différenciation
maitrisée de cellules souches embryonnaires