Département : Génie Urbain et Environnement (GUE)

Filière : Génie Bio-Industriel (GBI)

PROJET DE STAGE DE FIN D’ETUDE

Recherche de listeria spp dans le lait de

colportage et ses dérives

RÉALISÉ PAR : ARAICH Mohammed

ENCADRÉ PAR : M. ZIDOUH Atika

Jury :
 Remerciements

Je tiens à exprimer ma gratitude envers toutes les personnes qui nous ont aidé tout au long de la
réalisation de ce projet. Je tiens à remercier dans un premier temps, le doyen de l’école supérieure de
technologie de salé,
Je souhaite remercier M mohamed Rhajaoui. Directeur de l’institut d’hygiène de rabat et M. Abde
El Moula Ourdi, le chef de département microbiologique de INH, de m’avoir accueilli au sein de
leurs locaux industriels et donné l’opportunité de réaliser mon stage de fin d’étude.
Je voudrais remercier principalement mon encadrante pendant le stage , Madame ATIKA ZIDOUH,
ingénieur en chef département de microbiologique des eaux, aliments et environnement de INH, pour
son soutien, ses conseils et son expertise tout au long de la réalisation de ce projet. Ses idées
innovantes et son orientation m’ont été d'une grande aide tout au long du processus.
Merci à tous ceux qui ont contribué à la réalisation de ce projet. Votre aide et votre soutien ont été
grandement appréciés.
Je suis reconnaissant envers tous ceux qui ont contribué à la réalisation de ce rapport, et je suis
heureux de pouvoir partager nos résultats avec vous.
Et je voudrais remercier également notre établissement d'enseignement ECOLE supérieure de
technologie de Sale pour la formation et les ressources mises à Notre disposition pour mener à bien ce
projet de fin d'études
 La Liste d’abréviation

INH : institut national d’hygiène

MHA : microbiologie d’hygiène alimentaire
L : listeria
Palcam : Polymyxine-Acriflavine-Lithium Chloride-Ceftazidime-Aesculin-Mannitol
TSY : Tryptic Soy Broth
Fraser : Fraser broth
Camp : Christie, Atkins, Munch-Petersen
ECS : Entérocoques résistants aux antibiotiques à spectre étendu

(+) : réponse positive ;

(-) : réponse négative
RHA : Rhamnose.
XYL : D-xylose ;
RIB : Ribose ;
Man : Mannitol ;
MDG : α méthyl D.mannoside.
ONPG : l'ortho-nitrophényl-β-D-galactopyranosid
FAO : (Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture)
 Tableau des figures

Figure 1 : agitateur vibrant ..................................................................................................................... 9

Figure 2 : bec bunsen électrique ........................................................................................................... 9
Figure 3 : micropipette ........................................................................................................................... 9
Figure 4 : Embouts de pipette ................................................................................................................ 9
Figure 5 : Anse....................................................................................................................................... 10
Figure 6 : balance analytique ............................................................................................................... 10
Figure 7 : Bagmixer (homogénéisateur) .............................................................................................. 10
Figure 8 : microscope optique .............................................................................................................. 10
Figure 9 : autoclave............................................................................................................................... 11
Figure 10 : fraser dissout dans l’eau distillée....................................................................................... 12
Figure 11 : la pesée de poudre dans la balance ................................................................................... 12
Figure 12 : fraser sélective supplément .............................................................................................. 12
Figure 13 : milieu de culture fraser en poudre .................................................................................... 12
Figure 14 : L'ammonium nitrate et l'acide nalidixique. ....................................................................... 12
Figure 15 : PALCAM AGAR BASE........................................................................................................... 13
Figure 16 : Palcam dans autoclave ....................................................................................................... 13
Figure 17 : Bain marie ........................................................................................................................... 13
Figure 18 : carte de la région sale rabat ............................................................................................... 14
Figure 19 : les échantillons (lait cru et fromage frais ) ....................................................................... 16
Figure 20 : 25g d'échantillon enrichi dans le milieu de culture fraser demi ....................................... 16
Figure 21 : sachet stomacher................................................................................................................ 16
Figure 22: incubation dans l’étuve a 30°C ........................................................................................... 16
Figure 23 : enrichissement secondaire................................................................................................. 17
Figure 24 :les tubes enrichis avec échantillons et milieu de culture fraser ........................................ 17
Figure 25 : incubation des tubes à 37°C .............................................................................................. 17
Figure 26: les tubes après l'agitation ................................................................................................. 18
Figure 27 : les tubes après l’incubation pendant 48 heures ............................................................... 18
Figure 28 : milieux de culture PALCAM gélosé .................................................................................... 18
Figure 29 : isolement primaire ............................................................................................................. 18
Figure 30 : milieu de culture TSY .......................................................................................................... 19
Figure 31 : test ONPG............................................................................................................................ 20
Figure 32 : tube contenant La souche bactérienne ............................................................................. 20
Figure 33 : observation microscopique ................................................................................................ 21
Figure 34 : Les colorants violet de cristal et fushine et lugol .............................................................. 21
Figure 35 : la lame ................................................................................................................................. 21
Figure 36 : l'eau oxygénée H2O2 .......................................................................................................... 22
Figure 37 : suspension bactérienne...................................................................................................... 22
Figure 38 : schéma exemplaire des tubes et cupules .......................................................................... 23
Figure 39 : Galerie API 20e ................................................................................................................... 24
Figure 40 : inoculum ............................................................................................................................. 24
Figure 41 : les colonies des moisissures ............................................................................................... 25
Figure 42 : les colonies des levures dans le milieu PALCAM ............................................................... 25
Figure 43 : la dégradation de de mannitol sur le milieu palcam ......................................................... 25
Figure 44 : résultat de teste catalase ................................................................................................... 26
Figure 45 : résultat de test catalase ..................................................................................................... 27
Figure 46 : test gram de listeria spp ..................................................................................................... 28
Figure 47 des levures sous microscope ............................................................................................... 28
Figure 48 : souche de reference de listeria spp ................................................................................... 28
Figure 49 : résultat de galerie API ........................................................................................................ 29
 La liste des tableaux

Tableau 1 : l’affiche de prélèvement des échantillons ........................................................................ 14

Tableau 2 : la lecture de la Galerie API de listeria spp. ...................................................................... 24
Tableau 3 : la lecture des résultats de la galerie API ........................................................................... 29
 Table des matières
Introduction ................................................................................................................................. 1
Présentation d’organisme d’accueil .............................................................................................. 2
Généralités sur l’INH : ............................................................................................................... 2
1. Présentation générale : ............................................................................................................................................ 2
2. Historique : ............................................................................................................................................................. 2

Département Microbiologie Hygiène Alimentaire : .................................................................... 2

1. Historique : ............................................................................................................................................................. 2
2. Présentation du MHA : ........................................................................................................................................... 3

CHAPITRE Ⅱ ................................................................................................................................ 4
Généralité sur le lait et ses dérives : .......................................................................................... 4
1. Définition de lait cru et ses dérives : ....................................................................................................................... 4
2. La production mondiale et nationale du lait : .......................................................................................................... 4
3. La composition biochimique de lait : ...................................................................................................................... 4
4. Importance de lait sur la santé :............................................................................................................................... 5
5. Les risques liés à la consommation de lait cru et ses dérives : ................................................................................ 5

CHAPITRE Ⅲ ................................................................................................................................ 6
Généralités sur listeria spp : ...................................................................................................... 6
1. Définition de listeria : ............................................................................................................................................. 6
2. Histoire : ................................................................................................................................................................. 6
3. Taxonomie du genre Listeria : ................................................................................................................................ 6
4. Caractéristiques morphologiques : .......................................................................................................................... 7
5. Les risques liés à listeria sur notre organisme : ....................................................................................................... 7
6. Les techniques de détection de listeria spp : ........................................................................................................... 7

CHAPITRE Ⅳ : Matériel et Méthodes ............................................................................................ 9

1. Matériel : .......................................................................................................................... 9
2. Préparations des milieux de cultures ................................................................................ 11
a) Définition et composition des milieux de culture :................................................................................................ 11
b) La méthode de préparation :.................................................................................................................................. 12

3. Échantillonnage .............................................................................................................. 14
4. Méthode de détection de listeria spp selon la norme iso (11290 -1) V 2017 ....................... 16
 Premier jour : enrichissement primaire ................................................................................................................. 16
 Deuxième jour : Enrichissement secondaire ......................................................................................................... 17
 Troisième jour : isolement primaire ...................................................................................................................... 17
 Isolement secondaire :........................................................................................................................................... 18

5. Test ONPG....................................................................................................................... 19
1 Principe : ............................................................................................................................................................... 19
2 Les étapes de la méthode pour réaliser le test ONPG :.......................................................................................... 19

6. Test de gram : ................................................................................................................. 20

 Principe : ................................................................................................................................ 20
Historique : ..................................................................................................................................................................... 20
Les étapes : ..................................................................................................................................................................... 20

7. Test catalase ................................................................................................................... 21

Principe :......................................................................................................................................................................... 21
Les étapes de la méthode : .............................................................................................................................................. 22

8. Identification Biochimique la galerie API : ........................................................................ 22

Principe :......................................................................................................................................................................... 22
La méthode de préparation : ........................................................................................................................................... 23

CHAPITRE Ⅴ : Résultats et discussion ......................................................................................... 25

1. Isolement ........................................................................................................................ 25
2. TEST CATALASE................................................................................................................ 26
3. Test ONPG....................................................................................................................... 27
4. Test Gram ....................................................................................................................... 27
5. Galerie API ...................................................................................................................... 28
Conclusion ................................................................................................................................. 30
Références bibliographiques ....................................................................................................... 31
 Résumé

Ce rapport de stage détaille la mise en place d'une méthode de recherche efficace pour détecter la
présence de Listeria spp dans les échantillons de lait de colportage et de produits laitiers dans la région
de Rabat-Salé au Maroc. Les différentes étapes, allant de la collecte des échantillons à l'analyse
microbiologique en laboratoire, sont exposées en détail, avec un accent sur les bonnes pratiques
d'hygiène et de sécurité alimentaire.
Les résultats obtenus sont présentés et discutés, permettant de tirer des conclusions quant à la sécurité
alimentaire des produits laitiers dans différentes régions du pays. Enfin, des recommandations sont
proposées pour améliorer la qualité et la sécurité alimentaire des produits laitiers de colportage et de
ses dérivés, ce qui contribue à la sensibilisation de l'importance de la recherche de bactéries
pathogènes dans les produits alimentaires pour garantir la sécurité alimentaire des consommateurs.
Le projet a été mené en collaboration avec l'Institut National d'Hygiène au Maroc, qui est un acteur clé
dans la promotion de la santé publique et de la sécurité sanitaire au Maroc. L'INH mène des activités
de recherche, de formation et de conseil dans les domaines de la microbiologie, de la chimie
analytique, de la toxicologie et de l'hygiène alimentaire, entre autres, et contribue de manière
significative à la prévention et au contrôle des maladies infectieuses et des maladies d'origine
alimentaire.
 Introduction

La Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène présente dans l'environnement et capable de
provoquer des maladies graves chez les humains, en particulier chez les personnes immunodéprimées,
les femmes enceintes et les nouveau-nés. La contamination des aliments par Listeria est donc une
préoccupation majeure pour la sécurité alimentaire.
Au Maroc, le lait et ses dérivés, tels que le fromage, le yaourt et le beurre, font partie intégrante de
l'alimentation quotidienne de la population. Cependant, la présence de Listeria dans ces produits peut
constituer un risque pour la santé publique. La détection précoce de cette bactérie est donc essentielle
pour prévenir les maladies d'origine alimentaire.
Plusieurs études ont été menées pour détecter Listeria dans les produits laitiers dans d'autres pays, tels
que la France (Herbin et al., 2016), l'Espagne (Pérez-Rodríguez et al., 2018) et le Brésil (Reis et al.,
2019). Cependant, très peu d'études ont été réalisées au Maroc sur la présence de Listeria dans les
produits laitiers, et aucune n'a été identifiée pour le lait et ses dérivés au sale. Ainsi, cette étude vise à
évaluer la prévalence de Listeria dans le lait cru et ses dérivés au sale dans différentes régions du
Maroc en utilisant des techniques de détection spécifiques.
Mon stage s’inscrit dans la perspective de recherche de Listeria dans le lait et ses dérivés au Maroc, en
mettant l'accent sur les méthodes de détection et d'identification de Listeria monocytogenes. Nous
expliquerons les différentes étapes du processus de détection, allant de la collecte d'échantillons à
l'identification des colonies suspectes, en détaillant les milieux de culture et les méthodes de
confirmation utilisés pour la détection de Listeria. Nous discuterons également des facteurs de risque
associés à la contamination des produits laitiers par Listeria, ainsi que des mesures de prévention et de
contrôle mises en place pour minimiser ce risque au Maroc.
L'objectif de ce rapport est de fournir une vue d'ensemble complète des procédures de détection de
Listeria dans le lait et ses dérivés au Maroc, tout en soulignant l'importance de cette démarche pour
assurer la sécurité alimentaire. Nous espérons que ce rapport sera utile aux professionnels de
l'industrie alimentaire et aux autorités sanitaires pour renforcer les mesures de contrôle et de
prévention de Listeria dans les produits laitiers au Maroc.

1
 Présentation d’organisme d’accueil

Généralités sur l’INH :

1. Présentation générale :

L'Institut National d'Hygiène (INH) est un établissement public marocain qui a pour mission
principale de contribuer à la promotion de la santé publique en veillant à l'hygiène et à la sécurité
sanitaires des produits, des milieux et des personnes. Cette institution mène des activités de recherche,
de formation et de conseil dans les domaines de la microbiologie, de la chimie analytique, de la
toxicologie et de l'hygiène alimentaire, entre autres. Les principales missions de l'INH sont décrites
dans différentes sources officielles, notamment sur son site internet (https://www.inh.org.ma/).
L'INH assure la surveillance épidémiologique des maladies infectieuses et la lutte contre les
épidémies, ainsi que la prévention et le contrôle des maladies d'origine alimentaire, telles que la
salmonellose, la listériose ou l'hépatite A. L'analyse et le contrôle de la qualité microbiologique,
chimique et physique des produits de santé, des denrées alimentaires et des eaux destinées à la
consommation humaine sont également au cœur des missions de l'INH.
L'INH a développé une expertise reconnue en matière d'hygiène et de sécurité sanitaire, qui lui permet
d'assurer un rôle de conseil et d'expertise auprès des autorités publiques, des professionnels de la santé
et des entreprises. L'INH dispose de laboratoires de pointe équipés des technologies les plus avancées
pour l'analyse des échantillons de produits alimentaires, de l'environnement ou de la santé. L'INH
collabore régulièrement avec d'autres institutions nationales et internationales, ainsi qu'avec des
organisations internationales telles que l'OMS et l'OMC, dans le cadre de programmes de coopération
technique et scientifique.
Les missions et les activités de l'INH sont donc d'une grande importance pour la promotion de la santé
publique et de la sécurité sanitaire au Maroc. Les références principales pour cet article incluent le site
internet de l'INH (https://www.inh.org.ma/)

2. Historique :

L’Institut d’Hygiène du Maroc a été inauguré le 30 décembre 1930 à Rabat par le Professeur Léon
BERNARD, Président du Conseil Supérieur d’Hygiène de France, sous la présidence de Mr Lucien
SAINT, Résident Général de la République Française au Maroc dans le but de prendre en charge les
problèmes d’hygiène et d’épidémiologie des maladies transmissibles du Maroc et de diffuser les
notions élémentaires de l’hygiène et de la prophylaxie pour protéger la santé de la population.
(https://www.inh.org.ma/)

Département Microbiologie Hygiène Alimentaire :

1. Historique :

2
Depuis sa création en 1931, le Département de Microbiologie Hygiène Alimentaire (MHA) est l’un
des piliers des enquêtes épidémiologiques menées par le Ministère de la Santé. Ses objectifs premiers,
tracés déjà en 1958, sont d’assurer et de mener à bien toutes les analyses microbiologiques des eaux et
des denrées alimentaires aussi bien pour les services publiques que pour le secteur privé et de former
les techniciens des laboratoires et les techniciens d’assainissement du Royaume. (https://www.inh.ma)
2. Présentation du MHA :

Le département de MHA contribue à la protection de la santé publique en limitant le risque de

maladies d’origine alimentaire, hydrique ou environnementale et à la protection des consommateurs
contre des produits alimentaires malsains. Le département de MHA, composé de trois laboratoires : le
Laboratoire de Microbiologie Alimentaire, le Laboratoire des eaux et le Laboratoire de Caractérisation
des Pathogènes d’Origine Alimentaire, constitue le laboratoire national agrée par le Ministère de la
Santé. Il assure également l’expertise technique en matière de microbiologie environnementale.
Le département de MHA est certifié AENOR et IQNet; il est membre de Pulse-Net, Utilisateur de la
plateforme EPIS-FBW et de ECDC. Il participe à l’évaluation externe de qualité EQAST et à
l’élaboration des normes en microbiologie alimentaire, sur la qualité de l’eau, et de l’hygiène.
Le département participe aussi à la préparation des manuels de prélèvement, de la qualité et de la
biosécurité et assure des missions sur le terrain pour les prélèvements et les analyses.
Il détient l’expertise en matière de diagnostic et de conseil en microbiologie des aliments, des eaux et
de l’environnement et assure l’appui technique, la supervision et l’évaluation externe de la qualité des
laboratoires provinciaux ou régionaux de diagnostic épidémiologique et hygiène de milieu (LPDHM
ou LRDHM).
En parallèle avec leurs activités, les cadres du département assurent la formation et l’encadrement des
stagiaires et des étudiants des facultés des sciences pour la préparation de leurs Masters ou Diplômes
nationaux. (https://www.inh.ma)

3
 CHAPITRE Ⅱ

Généralité sur le lait et ses dérives :

1. Définition de lait cru et ses dérives :

Le lait cru est défini comme du lait non pasteurisé, non stérilisé et non traité thermiquement, qui peut
contenir des bactéries pathogènes telles que Listeria monocytogenes. Les produits dérivés du lait cru
comprennent le fromage au lait cru, le yaourt au lait cru, le beurre au lait cru, etc. Ces produits sont
considérés comme des aliments à haut risque en termes de sécurité alimentaire en raison de la
possibilité de contamination par des pathogènes d'origine alimentaire. Les cas de maladies d'origine
alimentaire associées à la consommation de produits laitiers crus ont été rapportés dans le monde
entier. Il est donc essentiel de mettre en place des mesures de prévention et de contrôle appropriées
pour assurer la sécurité alimentaire des produits laitiers crus et de leurs dérivés. (EFSA, 2015; FDA,
2011)

2. La production mondiale et nationale du lait :

Au Maroc, le secteur laitier est également important pour l'économie nationale. Le pays a produit
environ 2,5 milliards de litres de lait en 2020, selon le ministère de l'Agriculture, et compte environ
2,2 millions de vaches laitières. Cependant, la production laitière du pays ne répond pas à la demande
intérieure, ce qui entraîne une augmentation des importations de produits laitiers. FAO. (2021).
La production laitière au Maroc est l'une des plus importantes de la région MENA (Moyen-Orient et
Afrique du Nord) avec une production annuelle de plus de 2,5 milliards de litres de lait cru en 2020
(FAO, 2021). Le Maroc possède un cheptel important de bovins, de caprins et d'ovins, ce qui permet
une production laitière diversifiée. Cependant, la production laitière au Maroc reste dominée par le
secteur informel, où la production de lait cru est vendue directement aux consommateurs locaux sans
passer par une pasteurisation ou une homogénéisation (Azzeddine et al., 2020). Cette pratique peut
présenter des risques pour la santé des consommateurs, notamment en ce qui concerne la
contamination par des pathogènes tels que Listeria monocytogenes

3. La composition biochimique de lait :

Le lait est une source importante de nutriments pour les humains, car il contient une grande variété de
composés biochimiques essentiels pour la croissance et le développement. En général, le lait de vache
est la forme la plus couramment consommée de lait, mais il existe également des laits d'autres
mammifères tels que les chèvres, les brebis et les buffles. La composition biochimique du lait varie en
fonction de l'espèce animale, de la race, de la saison, de l'alimentation et de la santé de l'animal.

Le lait de vache est composé principalement d'eau (environ 87%), de protéines (environ 3,4%), de
matières grasses (environ 3,8%), de lactose (environ 4,9%) et de minéraux (environ 0,7%). Les
protéines du lait sont principalement représentées par la caséine et le lactosérum, tandis que les

4
matières grasses sont composées d'un mélange complexe d'acides gras saturés et insaturés. Le lactose,
quant à lui, est un sucre simple qui donne au lait son goût sucré distinctif.
En plus de ces composants majeurs, le lait contient également une variété de micronutriments tels que
des vitamines, des enzymes et des hormones, qui jouent tous des rôles importants dans la santé
humaine. Le lait est également une source riche en calcium et en phosphore, qui sont essentiels pour la
santé osseuse et dentaire. Park, Y. W., & Haenlein, G. F. W. (2010). Walstra, P., Wouters, J. T. M., &
Geurts, T. J. (2006).

4. Importance de lait sur la santé :

Le lait est une source importante de nutriments essentiels pour l'organisme humain, notamment les
protéines, les vitamines et les minéraux. Sa consommation régulière peut contribuer à la croissance et
au développement sains des os et des dents, à la prévention de l'ostéoporose chez les adultes, ainsi qu'à
la réduction du risque de maladies chroniques telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète et
certains types de cancer. Cependant, les effets bénéfiques du lait dépendent de facteurs tels que la
qualité du lait, le mode de production et de transformation, ainsi que les habitudes alimentaires
individuelles. (Thorning TK, Raben A, Tholstrup T, 2016)
Les bénéfices pour la santé associée à la consommation de lait comprennent notamment la santé
osseuse, la santé cardiovasculaire et la réduction du risque de certains cancers. Les protéines du lait, en
particulier la caséine et le lactosérum, sont également connues pour leur effet satiétogène, ce qui peut
aider à contrôler l'appétit et la prise de poids. Cependant, il est important de noter que certaines
personnes peuvent être intolérantes au lactose ou allergiques aux protéines du lait, ce qui peut causer
des problèmes de santé. Il est donc important de consulter un professionnel de la santé avant
d'augmenter sa consommation de produits laitiers. (Weaver CM. 2014.)

5. Les risques liés à la consommation de lait cru et ses dérives :

La consommation de lait cru est une pratique qui suscite de nombreux débats et controverses. Bien que
certains consommateurs préfèrent cette forme de lait pour ses propriétés nutritionnelles et son goût, il
existe de nombreux risques associés à sa consommation.
Le lait cru peut contenir des bactéries pathogènes telles que la salmonelle, la listeria ou l'E. coli, qui
peuvent causer des infections graves chez les personnes ayant un système immunitaire affaibli ou les
jeunes enfants. De plus, le lait cru peut également contenir des hormones et des antibiotiques qui ont
été administrés aux animaux producteurs de lait, ce qui peut avoir des effets négatifs sur la santé.
Malheureusement, certaines personnes cherchent à profiter de l'engouement pour le lait cru en
proposant des produits dérivés de celui-ci qui ne sont pas soumis à des contrôles sanitaires stricts. Par
exemple, des fromages au lait cru produits de manière artisanale peuvent être contaminés par des
bactéries nocives en raison de pratiques de fabrication inadéquates. Centers for Disease Control and
Prevention. (2021)

5
 CHAPITRE Ⅲ

Généralités sur listeria spp :

1. Définition de listeria :

Listeria est un genre de bactéries pathogènes responsables de la listériose, une infection alimentaire
potentiellement grave chez les humains. Les bactéries Listeria sont des bactéries à Gram positif, non
sporulées, non acido-résistantes, capables de croître à des températures réfrigérées et tolérantes au sel.
Il existe actuellement 17 espèces de Listeria identifiées, dont Listeria monocytogenes est la plus
connue pour causer des infections chez l'homme. Les aliments tels que les produits laitiers, les
viandes, les fruits de mer et les légumes sont souvent associés à des éclosions de listériose. Les
infections à Listeria sont rares mais peuvent être graves, en particulier chez les femmes enceintes, les
personnes âgées et les personnes immunodéprimées. Les symptômes de la listériose comprennent de la
fièvre, des maux de tête, des douleurs musculaires et des vomissements, et peuvent entraîner des
complications neurologiques, des fausses couches et même la mort. Lecuit, M. (2007). Allerberger, F.,
& Wagner, M. (2010).

2. Histoire :

L. monocytogenes, espèce type du genre Listeria, doit son nom à la mémoire du Docteur John Lister.
Elle est caractérisée par une élévation anormale du taux de monocytes d’où son nom de
monocytogenes. Décrite en 1926 par Murray et ses collaborateurs lors d’une épizootie chez des lapins
et des cobayes qui présentaient une mononucléose sanguine et des lésions de nécrose au niveau du
foie. Ils lui donnèrent alors le nom de “Bacterium monocytogenes” puis renommée "Listerella
hepatolytica” par Lister en 1927. En 1940, Lister a proposé la nomenclature de L. monocytogenes qui
sera retenue par les Approved Lists of Bacterial Names (Euzèby et Tindall, 2004).

3. Taxonomie du genre Listeria :

Listeria est un petit bacille à Gram positif qui a longtemps été considéré comme une bactérie
corynéforme; il est actuellement admis que les bactéries de ce genre appartiennent à la branche
phylogénétique des Clostridium, voisin des genres Brochothrix, Lactobacillus, Staphylococcus,
Streptococcus et Bacillus (Avril ,2000 ; Rocourt ,1999).
Selon le Bergey’s Manuel (2001) le genre Listeria fait partie de la famille des Listeriaceae, l’ordre des
Bacillales, Classe III des Bacilli et du phylum III des Firmicutes. Dés 1966, la recherche de plus en
plus fréquente de Listeria dans des niches écologiques variées a conduit à l’isolement de souches
atypiques dont l’étude taxonomique a montré qu’il s’agit bien de nouvelles espèces. Compte tenu des
travaux de J. Rocourt (Rocourt ,1999),
on admet aujourd'hui, que le genre Listeria se définit sur le plan de la taxonomie par : (i) un G + C %
DNA compris entre 36 et 46 %, (ii) un peptidoglycane branché en variation A1 Gamma associé à un
type d’acide teichoïque (polyribitol – phosphate),(iii) la présence d’acides lipoteichoïques, (iv)

6
l’absence d’acide mycolique et MK7, comme principal isoprenoid quinone. (Catteau ,1991 ; Avril,
2000)
Actuellement 6 espèces sont reconnues dans ce genre, en plus de Listeria monocytogenes. Listeria
grayi : découverte en 1966 par Larsen et Seeliger à partir d’une coproculture chez un chinchilla ; cette
souche se caractérise par la fermentation du mannitol (Berche, 1999; Rocourt, 1999; Rocourt et al.,
2003). Listeria murrayi : découverte en 1971 par Welshimer et Meredith à partir d’une végétation ; une
fois encore cette souche se caractérise par la fermentation du mannitol et la réduction des nitrates
(Rocourt, 1999; Rocourt et al., 2003). Listeria ivanovii : qui a été découverte en 1984 par le
microbiologiste bulgare Ivanov lors d’avortements chez des brebis dans une ferme; cette souche s’est
caractérisée par une forte hémolyse, montrant qu’il s’agit d’un germe pathogène (Berche, 1999).
Listeria innocua : qui a été découverte en 1981 par Seeliger à partir de l’environnement et de l’intestin
de l’homme et des animaux; cette souche est non hémolytique montrant qu’il s’agit d’un germe non
pathogène (Rocourt, 1999), et Listeria Seeligeri et Listeria welshimeri qui ont été mises en évidence en
1982, lors des hybridations ADN / ADN (Rocourt, 1999).

4. Caractéristiques morphologiques :

Les cellules de Listeria sont des bâtonnets Gram+ courts et réguliers, de 0,4-0,5 µm de diamètre et 0,5-
2 µm de longueur, avec des extrémités arrondies. Quelques cellules peuvent 3 être incurvées. La
longueur de la cellule n’est pas corrélée avec la cinétique de croissance (Zaika et Fanelli, 2003). Les
cellules sont isolées ou regroupées en courtes chaînettes. Bien qu’une capsule a été observée dans des
conditions particulières de culture, certains microbiologistes pensent que L. monocytogenes devrait
être considérée comme une espèce bactérienne non capsulée. La bactérie ne forme pas de spores. Elle
est mobile quand elle est cultivée à 20-25°C grâce à la présence des flagelles péritriches, et immobile
ou faiblement mobile à 37°C.

5. Les risques liés à listeria sur notre organisme :

La contamination par Listeria dans les aliments peut engendrer des infections graves chez les
consommateurs. Les symptômes peuvent varier selon l'état de santé du patient et l'âge. Les personnes
immunodéprimées, les femmes enceintes et les personnes âgées sont les plus vulnérables à l'infection.
Les symptômes peuvent inclure de la fièvre, des maux de tête, des nausées, des vomissements, des
douleurs musculaires et articulaires et parfois même des convulsions. Dans les cas les plus graves, une
méningite ou une septicémie peut survenir, ce qui peut entraîner la mort. Il est donc important de
surveiller la présence de Listeria dans les aliments et de mettre en place des mesures de prévention
pour réduire le risque d'infection. (EFSA, 2018) (WHO, 2018)

6. Les techniques de détection de listeria spp :

La détection de Listeria spp dans le lait est essentielle pour garantir la sécurité alimentaire. Différentes
techniques de microbiologie ont été développées pour détecter la présence de cette bactérie pathogène
dans les échantillons de lait.

7
La méthode la plus courante pour détecter Listeria spp est la culture bactérienne sur des milieux
sélectifs tels que le milieu Oxford ou le milieu PALCAM. Cette méthode permet de déterminer la
présence de Listeria spp à partir de colonies isolées sur les milieux de culture.
Une autre technique de détection est la PCR (Polymerase Chain Reaction), qui permet de détecter des
fragments d'ADN spécifiques de Listeria spp dans les échantillons de lait. Cette technique est plus
rapide et plus sensible que la culture bactérienne, mais nécessite un équipement spécifique et des
compétences techniques en laboratoire.
Des méthodes d'immunodétection telles que l'ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) peuvent
également être utilisées pour détecter Listeria spp dans les échantillons de lait. Ces méthodes utilisent
des anticorps spécifiques pour détecter la présence de la bactérie dans l'échantillon.
Il est important de noter que ces techniques ont chacune leurs avantages et leurs limites. Par
conséquent, il est recommandé d'utiliser plusieurs techniques de détection pour confirmer la présence
de Listeria spp dans les échantillons de lait. European Food Safety Authority. (2018). Wang, L.,
Zhang, W., Zheng, Y., & Luo, Y. (2019).

8
 CHAPITRE Ⅳ : Matériel et Méthodes

1. Matériel :

Un équipement de laboratoire ayant pour but d'assurer l'homogénéisation d'un

milieu (homogénéisation du point de vue des composants du milieu et/ou de la
température).

Figure 1 : agitateur vibrant

Un appareil de laboratoire destiné à produire une flamme ouverte avec

du gaz combustible afin de chauffer des préparations, stériliser du
matériel ou brûler des substances.

Figure 2 : bec bunsen électrique

Une pipette adaptée aux prélèvements de faibles volumes de liquide.

Figure 3 : micropipette

Sont des embouts attachés à une micropipette pour prélever du liquide

puis le transférer d'un endroit à un autre. Des embouts de différentes
tailles sont utilisés pour prélever différents volumes de liquide.

Figure 4 : Embouts de pipette

9
 L'anse de platine est composée d'un fil de platine terminé par une
boucle fermée et monté sur un manche métallique destiné à prélever
une culture de micro-organismes en vue d'un repiquage ou d'un
frottis.

Figure 5 : Anse

Les Balances analytiques sont des instruments hautement sensibles

conçus pour mesurer la masse avec exactitude. Leur lecture a une
plage de 0.1 mg - 0.01 mg. Les balances analytiques ont un paravent
ou une chambre de pesée pour que les petits échantillons ne soient
pas affectés par les courants d'air.

Figure 6 : balance analytique

Malaxeur à pales de laboratoire : silencieux et ultra-robuste. Adapté

à tous types d'application, il garantit une extraction optimale et
permet d'éviter tous risques de contaminations croisées.

Figure 7 : Bagmixer (homogénéisateur)

Un instrument d'optique composé de plusieurs lentilles

superposées permettant d'augmenter le pouvoir grossissant. Le
nom microscope (du grec mikros : très petit et skopein : observer)
évoque la mesure du millimètre, la vision et l'observation par l'œil.

Figure 8 : microscope optique

10
 Un autoclave est un appareil de laboratoire permettant de réaliser la
stérilisation, sous pression, d'objets de forme pleine, creuses,
poreuse, emballée ou non emballée. Il permet alors d'utiliser l'objet
stérilisé en microbiologie sans aucun risque de contamination.

Figure 9 : autoclave

2. Préparations des milieux de cultures

a) Définition et composition des milieux de culture :

Le milieu de culture Fraser : également appelé Fraser Broth, est un milieu de culture sélectif utilisé
pour l'enrichissement et la détection de Listeria spp. Dans les aliments et les échantillons
environnementaux. Il a été développé par le Dr Fraser en 1982 pour améliorer la récupération de
Listeria spp. À partir d'échantillons alimentaires. Le milieu contient des nutriments pour la croissance
bactérienne, ainsi que des inhibiteurs pour supprimer la croissance d'autres micro-organismes qui
pourraient être présents dans l'échantillon. Les inhibiteurs incluent l'azide de sodium, le nalidixique et
la colistine, qui agissent contre les bactéries gram-négatives, et le lithium chlorure, qui agit contre les
bactéries gram-positives autres que Listeria spp. Le milieu de culture Fraser est utilisé en combinaison
avec d'autres méthodes de détection, telles que la coloration de Gram et la confirmation biochimique
pour une identification précise de Listeria spp. Dans les échantillons. (Fraser, M. L., & Farrell, E. G.
(1982))
Le milieu de culture Fraser Demi : est un milieu de culture sélectif et différentiel utilisé pour la
détection de Listeria monocytogenes dans les échantillons alimentaires. Il est composé d'un mélange
de peptones, de sel et d'agents de sélection, y compris l'acide nalidixique, le cycloheximide et les sels
biliaires. Le Fraser Demi a été initialement développé par le microbiologiste canadien William D.
Fraser et est devenu un outil important pour la détection de Listeria dans les produits alimentaires. Il
est utilisé en combinaison avec d'autres méthodes de détection pour assurer une détection efficace de
cette bactérie pathogène. Fraser, W.D., Murray, E.G.D., and Colwell, R.R. (1979).
PALCAM : Le milieu de culture PALCAM (Polymyxin-Acriflavine-LiCl-Céfalotine-Aesculine-
Mannitol) est un milieu de culture sélectif utilisé pour la détection de Listeria spp. dans les
échantillons alimentaires et environnementaux. Il contient des ingrédients spécifiques qui inhibent la
croissance d'autres bactéries, tandis que favorisant la croissance de Listeria spp. Les cristaux
d'aesculine et le mannitol sont également ajoutés pour faciliter l'identification des colonies de Listeria
spp. qui fermentent le mannitol et hydrolysent l'aesculine, produisant des colonies brunes
caractéristiques. ISO 11290-1:2017 Microbiology of the food chain

11
 b) La méthode de préparation :

Fraser :

Pour la détection de Listeria, le milieu de culture Fraser et Fraser Demi est préparé pour
l'enrichissement. Pour cela, 28,7 g du milieu de culture Fraser poudre sont dissous dans un litre d'eau
distillée et stérilisés à 121°C pendant 15 minutes dans l’autoclave avec l’ajout d’un supplément

Figure 13 : milieu de culture Figure 12 : fraser sélective Figure 10 : fraser dissout

Figure 11 : la pesée de
fraser en poudre supplément dans l’eau distillée
poudre dans la balance

Pour fraser demi on ajout un autre supplément sélectives L'ammonium nitrate et l'acide nalidixique

Figure 14 : L'ammonium nitrate et

l'acide nalidixique.

12
 Palcam :
Dissoudre 35g grammes de poudre dans un 500 ml d’eau distillée et mélanger jusqu’à l’obtention
d’une suspension homogène chauffer lentement en agitant fréquemment puis porter à bain marie pour
éliminer les petites particules et puis déplacé à l’autoclave pour stérilisation a 121°C pendant 15
minutes et 100 ml de Palcam supplément ont été ajoutes à la solution
Le pH a été ajusté à 7,2 ± 0,2 en utilisant une solution de NaOH (1M) ou de HCl (1M) stérilisée. Le
volume final a été ajusté avec de l'eau distillée stérilisée pour atteindre 1L. Le milieu de culture a été
agité vigoureusement pour assurer une dissolution complète des ingrédients. La solution a ensuite été
stérilisée en autoclave à 121°C pendant 15 minutes. Après refroidissement à température ambiante, le
milieu de culture Palcam a été utilisé pour la recherche de Listeria spp dans des échantillons
alimentaires.

Figure 15 : PALCAM AGAR BASE Figure 17 : Bain marie Figure 16 : Palcam dans
autoclave

13
 3. Échantillonnage

Les échantillons ont été prélevés auprès de différents points de vente de la région de SALÉ RABAT.
Les échantillons de lait cru, de fromage frais, ont été collectés en utilisant un protocole
d'échantillonnage stérile pour éviter toute contamination croisée. Tous les échantillons ont été
transportés dans un sac isotherme dans une voiture afin de préserver leur température.
Dans la région de Salé Rabat, le lait cru est souvent vendu par des colporteurs qui le transportent dans
des bidons en métal depuis les zones rurales environnantes, sans respecter les normes d'hygiène et de
sécurité alimentaire. Ce mode de distribution expose les consommateurs à un risque élevé de
contamination bactérienne, ce qui peut avoir des conséquences graves sur la santé publique. C'est
pourquoi il est essentiel de mettre en place des mesures de contrôle de la qualité pour garantir la
sécurité alimentaire des produits laitiers et protéger la santé des consommateurs.

Figure 18 : carte de la région sale rabat

Tableau 1 : l’affiche de prélèvement des échantillons

14
 Aliment Lot lieux de Ville de La date de L’origine de
prélèvement prélèvement prélèvement et l’aliment
l’heure
Lait cru 1 Medina BAB sbta Salé 11/04/2023 Sehoul
10 :55h
Lait cru 2 Sidi moussa Salé 11/04/2023 Sehoul
15:45h
Lait cru 3 Avenue de oujada Salé 11/04/2023 Sale ajadida
16 :00h
Lait cru 4 Alouad Salé 11/04/2023 Tifelt
17 :15 h
Fromage 5 EL Akkari Rabat 11/04/2023 Tifelt
frais 15 :00h
Fromage 6 Yaukoub Rabat 11/04/2023 Alkhmissat
frais Almansour 15 :10h
Fromage 7 Bab sbta Salé 11/04/2023 Sehoul
frais 10 : 55h
Fromage 8 Rabat ville Rabat 11/04/2023 Inconnue
frais 13 :45h
Fromage 9 Sidi Moussa Salé Salé 11/04/2023 ALghorb
frais 15 :55h
Fromage 10 El mkinsiya Salé 15/04/2023 sehoul
frais 16 :05h
Fromage 11 Dar elhamra Salé 15/04/2023 taounat
frais 16 :50h
Fromage 12 Hay rahma Salé 15/04/2023 Bouknadel
frais 17 :20h
Fromage 13 Hay inbiaat Salé 15/04/2023 sehoul
frais 17 :48h
Fromage 14 maza Salé 15/04/2023 maza
frais 22 :45h
Lait cru 15 Hay chikh mfadel Salé 16/04/2023 bouknadel
10 :11h
Lait cru 16 Hay rahma Salé 16/04/2023 sehoul
10 :20h
Lait cru 17 Hay inbiaat Salé 16/04/2023 sehoul
10 : 45h
Lait cru 18 maza Salé 16/04/2023 maza
9 :50h
Lait cru 19 Bab sabta Salé 16/04/2023 inconnue

Lait cru 20 Sidi mousa Salé 16/04/2023 inconnue

15
 4. Méthode de détection de listeria spp selon la norme iso (11290 -1) V 2017

 Premier jour : enrichissement primaire

25g de lait, fromage cru enrichis dans 100 ml du milieu de culture sélectifs spécifiques pour Listeria,
Fraser Demi FD et On les introduit dans le sachet stomacher

Figure 21 : sachet stomacher Figure 19 : les échantillons (lait Figure 20 : 25g d'échantillon enrichi
cru et fromage frais ) dans le milieu de culture fraser demi

Incubation à 30°C pendant 24 heures

Figure 22: incubation dans l’étuve a 30°C

16
  Deuxième jour : Enrichissement secondaire

0,1 ml de milieu sélectif FD enrichi dans le tube contenant 10 ml de milieu sélectif fraser en utilisant
micropipette et incubé à 37°C pendant 48 heures,

Figure 23 : enrichissement secondaire

Figure 24 :les tubes enrichis avec échantillons et

milieu de culture fraser Figure 25 : incubation des tubes à 37°C

 Troisième jour : isolement primaire

Après l'incubation des tubes pendant 48 heures, les tubes sont agités à l'aide d'un agitateur vibrant.
Ensuite, l'étape d'isolement sur milieu gélosé sélectif PALCAM est effectuée en prélevant une petite
quantité de la suspension bactérienne avec une anse et en l'étalant sur un milieu PALCAM. Les boîtes
de culture sont ensuite incubées à 37°C pendant 24 à 48 heures. conformément à la norme ISO 11290-
1:2017
Cette étape est importante car le milieu PALCAM permet de sélectionner les colonies de Listeria tout
en inhibant la croissance des autres bactéries présentes dans l'échantillon. Cette méthode d'isolement
permet de détecter efficacement la présence de Listeria dans le lait et ses dérivés.

17
 Figure 26: les tubes après l'agitation
Figure 27 : les tubes après l’incubation
pendant 48 heures

Les colonies suspectes ont été testées pour leur capacité à hydrolyser l'esculine en milieu sélectif
conformément à la norme ISO 11290-1:2017. Les colonies qui ont hydrolysé l'esculine ont été testées
pour leur réaction positive à la catalase. Les colonies catalase-positives ont été testées pour leur
réaction positive à la sérologie, conformément à la norme ISO 11290-1:2017.

Figure 28 : milieux de culture PALCAM Figure 29 : isolement primaire

gélosé

 Isolement secondaire :

Le deuxième isolement de la souche Listeria dans le milieu TSY est une étape importante dans la
procédure de détection et d'identification de cette bactérie pathogène. Le milieu TSY, abréviation de
Tryptic Soy Broth, est un milieu de culture liquide riche en nutriments, couramment utilisé pour la
culture des bactéries. Dans cette étape, après une première culture de la souche Listeria, un échantillon
est prélevé et transféré dans un nouveau tube contenant du milieu TSY. Ce deuxième isolement permet
d'obtenir une culture pure de la souche listeria, sans la présence d'autres micro-organismes qui
pourraient interférer avec les résultats des tests de confirmation.

18
 Figure 30 : milieu de culture TSY

5. Test ONPG

1 Principe :

Le test ONPG (Orthonitrophényl-β-D-galactopyranoside) est un test biochimique utilisé en

microbiologie pour détecter la présence de l'enzyme β-galactosidase chez les bactéries.
Le test ONPG est basé sur la détection de la production d'ortho-nitrophénol (ONP), un produit jaune,
lors de la dégradation de l'ONPG par l'enzyme β-galactosidase. L'ONPG est un analogue de lactose
qui peut être hydrolysé par l'enzyme β-galactosidase, libérant de l'ortho-nitrophénol (ONP) qui est
facilement détectable par sa couleur jaune.

2 Les étapes de la méthode pour réaliser le test ONPG :

Inoculation : La souche bactérienne est inoculée dans un tube contenant un milieu de culture contenant
l'ONPG
Incubation : Le tube est incubé à une température appropriée pour permettre la croissance bactérienne
et la production de l'enzyme β-galactosidase.
Interprétation des résultats : Si le milieu de culture devient jaune, cela indique la présence de l'enzyme
β-galactosidase et donc la capacité de la bactérie à utiliser le lactose comme source de carbone. Si le
milieu de culture reste incolore, cela indique que la bactérie ne possède pas l'enzyme β-galactosidase.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H., & Stahl, D.A. (2018). Brock Biology of
Microorganisms (15th ed.). Pearson.

19
 Figure 31 : test ONPG Figure 32 : tube contenant La souche bactérienne

6. Test de gram :

Principe :

Le test de Gram est une technique de laboratoire utilisée en microbiologie pour différencier les
bactéries en fonction de la structure de leur membrane cellulaire. Il s'agit d'une coloration différentielle
qui utilise un colorant cristal violet suivi d'une solution d'iode, d'alcool et de fuchsine de base pour
colorer les cellules bactériennes.
Après la coloration, les bactéries peuvent être classées en deux groupes en fonction de la couleur de
leur membrane cellulaire lors de l'observation au microscope. Les bactéries qui apparaissent violettes
au microscope sont appelées "Gram-positives", tandis que celles qui apparaissent roses sont appelées
"Gram-négatives".
Cette classification est importante car elle peut aider à orienter le choix d'antibiotiques pour traiter les
infections bactériennes. Les bactéries Gram-positives sont souvent sensibles à certains types
d'antibiotiques, tels que la pénicilline, tandis que les bactéries Gram-négatives peuvent être plus
difficiles à traiter en raison de leur structure cellulaire plus complexe. Gram, HC. (1884). "Über die
isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten." Fortschr. Med. 2: 185-189.
Historique :

Cette technique a été développée par le médecin danois Hans Christian Gram en 1884, alors qu'il
travaillait sur la classification des bactéries. par le médecin danois Hans Christian Gram en 1884 et est
maintenant largement utilisé dans les laboratoires de microbiologie du monde entier.
Les étapes :

Préparation d'une préparation microscopique : Une petite quantité de la culture bactérienne est
prélevée et déposée sur une lame de verre propre. Elle est ensuite séchée à l'air.

20
Fixation : La préparation microscopique est ensuite fixée en la passant à plusieurs reprises au-dessus
d'une flamme.
Coloration : La préparation est ensuite immergée dans une solution de colorant cristal violet pendant
une minute.
Rinçage : La préparation est ensuite rincée à l'eau pour éliminer l'excès de colorant.
Ajout de l'iode : La préparation est ensuite immergée dans une solution d'iode pendant une minute.
Rinçage : La préparation est à nouveau rincée à l'eau.
Décoloration : La préparation est ensuite immergée dans de l'alcool à 95% pour décolorer les
bactéries.
Rinçage : La préparation est de nouveau rincée à l'eau.
Coloration de contraste : La préparation est ensuite immergée dans une solution de fuchsine de base
pendant une minute.
Rinçage : La préparation est enfin rincée à l'eau, séchée à l'air et observée au microscope.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H., & Stahl, D.A. (2018). Brock Biology of
Microorganisms (15th ed.). Pearson.

Figure 34 : Les colorants violet Figure 35 : la lame Figure 33 : observation

de cristal et fushine et lugol microscopique

7. Test catalase

Principe :

Le test de catalase est une méthode couramment utilisée en microbiologie pour identifier la présence
de l'enzyme catalase chez les bactéries. Cette enzyme est responsable de la dégradation de l'eau
oxygénée (H2O2) en eau (H2O) et en oxygène (O2).
Le test de catalase est largement utilisé pour différencier les bactéries aérobies des bactéries
anaérobies facultatives, car les bactéries aérobies produisent généralement de grandes quantités
d'oxygène gazeux lors de la dégradation de l'eau oxygénée. Ce test est également utilisé dans
l'identification de certaines bactéries pathogènes, telles que Staphylococcus aureus, qui sont catalase-

21
positives. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H., & Stahl, D.A. (2018). Brock
Biology of Microorganisms (15th ed.). Pearson.

Les étapes de la méthode :

Préparation de la suspension bactérienne : Une petite quantité de la culture bactérienne est prélevée et
suspendue dans une solution physiologique stérile.
Ajout de l'eau oxygénée : Une goutte d'eau oxygénée à 3% est ajoutée à la suspension bactérienne.
Observation : Si la bactérie contient l'enzyme catalase, une réaction exothermique se produira,
générant de l'oxygène gazeux qui se manifeste sous forme de bulles. Les bulles indiquent la présence
de l'enzyme catalase, ce qui signifie que la bactérie est capable de dégrader l'eau oxygénée en eau et en
oxygène.
Interprétation des résultats : Si des bulles sont observées, cela indique que la bactérie contient
l'enzyme catalase et est donc catalase-positive. Si aucune bulle n'apparaît, cela indique que la bactérie
ne contient pas l'enzyme catalase et est catalase-négative.

Figure 36 : l'eau oxygénée H2O2 Figure 37 : suspension bactérienne

8. Identification Biochimique la galerie API :

Principe :

La galerie API Listeria est une méthode biochimique utilisée pour l'identification des bactéries du
genre Listeria. Cette galerie est composée de 10 tests biochimiques différents, |DIM|, ESC, αMAN,
DARL, XYL, RHA, OMD, COTE, G1P, TAG qui permettent d'obtenir des résultats fiables et précis
pour l'identification des différentes espèces de Listeria.
En utilisant ces tests, les résultats peuvent être interprétés et utilisés pour identifier les différentes
espèces de Listeria. Les résultats peuvent être comparés avec une table de résultats fournie avec la
galerie API Listeria pour une identification précise. API Listeria, https://www.biomerieux-
industry.com/products/api-listeria

22
 La méthode de préparation :

 Préparation de de l’inoculum :

Ouvrir une ampoule d’API de suspension (2ml), ouvrez soigneusement les ampoules
A l’aide d’une pipette ou d’une PSIpette prélever quelques colonies bien isolées, il est recommandé
d’utiliser des cultures jeunes
Préparer une suspension avec une turbidité a 1 Mcfarland
 Inoculation de la bandelette :

Réunir fond et couvercle d’une boîte d’incubation et répartir de l’eau dans les alvéoles pour créer une
atmosphère humide. Puis déposer stérilement la galerie dans la boîte d’incubation
Prenez une pipette pasteur et remplissez ces compartiments avec la suspension bactérienne en évitant
la formation des bulles
Remplir le tube et la cupule du |FIABLE| test (environ 100µl), évitant la formation d’un ménisque
convexe
Remplir uniquement la partie tube des tests ESC a TAG (environ 50 µl),

Figure 38 : schéma exemplaire des tubes et cupules

Fermer la boite d’incubation

Incuber pendant 18 à 24 heures à 36°C en conditions aérobies.

23
 Tableau 2 : la lecture de la Galerie API de listeria spp.

ESSAI ACTIF INGREDIENTS QTE REACTIONS / RESULTATS

S (mg/cuple ENZYMES NEGATIF POSITIF
)
|FIABLE| Enzymatique substrat 0.106 Différenciation L Orange Orang
innocua/L pale / e
moncytogénes gris-
beige
ESC ESCULINE CITRATE 0.16 0.024 Hydrolyse Jaune noir
FERRIQUE (esculine) pale
&MAN 4- 0.045 &-mannosidase incolor jaune
Nitrophényl&Dmannopyranosid e
e
DARL D-arabitol 0.4 Acidification
(Darabitol )
XYL D-xylose 0.4 Acidification
(xylose)
RHA L-Rhamnose 0.4 Acidification
(rhamnose)
OMD Méthyl-&Dglucpyranoside 0.4 Acidification Rouge Jaune
(méthyl- /rouge /jaune-
&dglucopyranoside orangé orangé
)
COTE D-ribose 0.4 Acidification
(ribose)
G1P Glucose-1phosphate 0.4 Acidification
(glucose-
1phosphate)
ETIQUTE
D-tagatose 0.4 Acidification
(tagateux )

Figure 40 : inoculum Figure 39 : Galerie API 20e

24
 CHAPITRE Ⅴ : Résultats et discussion

1. Isolement

Dans le cadre de ce stage, 20 échantillons de lait de colportage et de ses dérivés ont été analysés pour
détecter la présence de Listeria spp. Les résultats obtenus ont révélé une absence totale de ces bactéries
dans tous les échantillons testés, ce qui est une bonne nouvelle en termes de sécurité alimentaire.
Cependant, lors de l'analyse des échantillons, des colonies de moisissures ont été identifiées par les
tests de Gram et de catalase. Ces colonies étaient capables de dégrader l'esculine, un indicateur
couramment utilisé pour identifier la présence de Listeria spp. Cela signifie que la présence de ces
moisissures peut potentiellement fausser les résultats des tests de détection de Listeria spp. De plus,
d'autres micro-organismes tels que les levures et les staphylocoques ont également été identifiés par
les tests de Gram et de catalase. Bien que la présence de ces micro-organismes ne soit pas
nécessairement nocive pour la santé humaine, leur présence dans les échantillons alimentaires peut
indiquer une contamination environnementale ou une mauvaise manipulation des aliments.

Figure 42 : les colonies des levures Figure 41 : les colonies des

dans le milieu PALCAM moisissures

La dégradation du mannitol a également été observée dans l'échantillon 3, confirmée par le

changement de colleur en jaune orange.

Figure 43 : la dégradation de de mannitol

sur le milieu palcam

25
La dégradation du mannitol dans le milieu PLACAM, plusieurs espèces de bactéries lactiques sont
connues pour avoir cette capacité. Parmi les bactéries lactiques hétérofermentatives qui peuvent
dégrader le mannitol, on peut citer :
Lactobacillus brevis : Cette espèce de lactobacille est capable de métaboliser le mannitol en acide
lactique et en éthanol. Elle est souvent utilisée dans la production de boissons fermentées telles que la
bière et le cidre
Leuconostoc mesenteroides : Cette bactérie lactique hétérofermentative est également capable de
métaboliser le mannitol, en produisant de l'acide lactique, de l'éthanol et du dioxyde de carbone.
Pediococcus pentosaceus : Cette espèce de bactérie lactique est également connue pour être capable
de métaboliser le mannitol, en produisant de l'acide lactique et de l'éthanol.
En effet, la présence de colonies de moisissures, de levures et de staphylocoques dans les échantillons
de lait de colportage et ses dérivés peut indiquer une contamination fongique et bactérienne, ce qui
peut ne pas être conforme aux normes de sécurité alimentaire. Il existe des normes de référence pour la
quantité maximale autorisée de bactéries et de moisissures dans les aliments, afin de garantir leur
sécurité pour la consommation humaine
Par exemple, selon les normes de l'Union européenne, la quantité maximale autorisée de bactéries
viables dans le lait cru est de 100 000 UFC/ml, tandis que la quantité maximale autorisée de levures et
de moisissures dans le lait pasteurisé est de 100 UFC/ml. De même, la quantité maximale autorisée de
staphylocoques dans le lait pasteurisé est de 100 UFC/ml.

2. TEST CATALASE

Effectivement, le test de catalase est utilisé pour détecter la présence d'enzymes catalase dans les
bactéries. Si le test est positif, cela indique la présence d'une enzyme catalase dans la bactérie testée.
Cette enzyme est capable de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2) en eau et en oxygène,
produisant ainsi des bulles d'oxygène.
Dans le cas présent, le test de catalase est positif par ce que des bulles d'air apparaissent après l'ajout
de la solution de H2O2, cela indique la présence petites colonies noire de staphylococcus ures dans la
boite des moisissures.. En effet, les staphylocoques produisent naturellement de l'enzyme catalase et
sont capables de décomposer le peroxyde d'hydrogène pour produire des bulles d'oxygène.

Figure 44 : résultat de teste catalase

26
 3. Test ONPG

Le test ONPG est utilisé pour détecter la présence de Listeria spp. Dans la boite de E14 les moisissures
qui se trouve dans ces échantillons il est capable d’hydrolyser l’esculine c’est pour ça en effet le teste
ONPG. Si le résultat du test est négatif, cela signifie que la bactérie Listeria spp. N’est pas présente
dans l'échantillon de lait et ses dérives analysées. Cependant, il est important de noter que ce test ne
peut détecter que la présence de Listeria spp. Et non d'autres bactéries potentiellement pathogènes. Par
conséquent, il est souvent utilisé en conjonction avec d'autres tests pour évaluer la qualité et la sécurité
du lait et des produits laitiers. La détection rapide et précise de la présence de Listeria spp. Est
essentielle pour prévenir les risques pour la santé publique et assurer la qualité des produits laitiers

Figure 45 : résultat de test catalase

4. Test Gram

Le test de Gram a été effectué sur certains échantillons, tels que celui contenant des colonies de
levures, afin de vérifier leur présence et leur nature microbienne. Ce test de coloration est basé sur les
différences de composition de la paroi cellulaire des bactéries et permet de différencier les bactéries en
deux grandes catégories : les bactéries à paroi cellulaire épaisse, appelées "gram-positives", et les
bactéries à paroi cellulaire fine, appelées "gram-négatives". Les levures, quant à elles, ne sont pas des
bactéries et ne possèdent pas de paroi cellulaire différenciable par le test de Gram. Mais les levures
sont bien différenciables par leurs tailles dans microscope par rapport aux bactéries
Par ailleurs, un test Gram a également été effectué sur une souche de référence de Listeria spp. Ce test
permet de confirmer l'identification de la souche de Listeria spp. en la classant comme une bactérie à
paroi cellulaire gram-positive. Cette souche de référence est souvent utilisée comme contrôle positif
dans les analyses microbiologiques pour s'assurer que les méthodes de culture et d'identification sont
fiables et précises.

27
 Figure 47 des levures sous Figure 46 : test gram de listeria spp
microscope

5. Galerie API

Dans le cadre de cette étude, une souche de référence de Listeria spp. Disponible dans le laboratoire
sera utilisée pour évaluer l'utilisation de la galerie API. La galerie API est une méthode d'identification
microbienne basée sur des tests biochimiques. Elle permet d'identifier rapidement et avec précision
une grande variété de micro-organismes, y compris les bactéries pathogènes, en fonction de leurs
caractéristiques biochimiques.
L'utilisation de la galerie API permettra de confirmer la validité des méthodes utilisées dans cette
étude, tout en offrant une opportunité de développement de compétences supplémentaires en matière
d'identification des souches microbiennes. Cette approche avancée permettra également d'obtenir des
résultats plus précis et plus fiables, ce qui est essentiel pour garantir la sécurité alimentaire et prévenir
les risques pour la santé publique.

Figure 48 : souche de reference de listeria

spp

28
La lecture de résultat de Galerie API s effectuer selon le tableau de lecture suivant

Tableau 3 : la lecture des résultats de la galerie API

FAIB ETIQUTER
ESC MAN DARL XYL RHA OMD COTE GIP
LE
1. Listeria + + + + - + + - - -
innocuaATCC 33090.
2. Listeria ivanovii + + - + + - V - +* -
ATCC BAA-139 .
3. Listeria - + + + - + + - - -
monocytogenese
ATCC19115 .

Figure 49 : résultat de galerie API

La galerie API a permis d'obtenir un résultat positif pour Listeria monocytogenes dans la souche
référentielle, confirmant ainsi la présence de cette bactérie. Cette identification précise de la souche
permet de prendre des mesures de contrôle et de prévention adaptées pour garantir la sécurité
alimentaire. Les résultats obtenus grâce à la galerie API témoignent de l'efficacité de cette méthode
d'identification avancée, qui permet de renforcer les compétences dans ce domaine.

29
 Conclusion

Au terme de ce stage de deux mois, j'ai acquis une solide expérience en microbiologie alimentaire et
en sécurité alimentaire, en mettant en pratique les méthodes d'analyse microbiologique pour détecter la
présence de Listeria spp dans les produits laitiers de colportage. Grâce à la mise en œuvre de bonnes
pratiques d'hygiène alimentaire et au respect des réglementations en matière de sécurité alimentaire,
j'ai compris l'importance de la prévention de la contamination bactérienne pour garantir la sécurité des
produits alimentaires et des consommateurs.
Grâce à l'utilisation de méthodes d'analyse microbiologique, conformément à la norme ISO 11290-
1:2017, j'ai pu évaluer la présence de Listeria spp dans les échantillons testés. Bien que la présence de
cette bactérie n'ait pas été détectée, j'ai pu acquérir une compréhension approfondie des bonnes
pratiques d'hygiène alimentaire et des réglementations en matière de sécurité alimentaire. Cela m'a
permis de mieux comprendre l'impact de la contamination bactérienne sur les produits alimentaires et
les consommateurs, ainsi que les mesures à prendre pour prévenir les maladies d'origine alimentaire et
protéger la santé des consommateurs.
En travaillant en équipe, j'ai également amélioré mes compétences en communication et en gestion de
projet en apprenant à coordonner efficacement avec les différentes parties prenantes de l'industrie
alimentaire pour garantir la sécurité alimentaire.
. J'espère que cette étude contribuera à améliorer les normes de sécurité alimentaire dans l'industrie
laitière, en aidant à prévenir les maladies d'origine alimentaire et à protéger la santé des
consommateurs. Ce stage a été une expérience enrichissante et je suis reconnaissant d'avoir eu cette
opportunité de développer mes compétences professionnelles dans un domaine aussi important.

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 Références bibliographiques

EFSA (European Food Safety Authority). (2015). Scientific opinion on the public health risks
associated with the consumption of raw drinking milk. EFSA Journal, 13(1), 3940
FAO. (2021). Production de lait - Quantités totales en 2020. Ministère de l'Agriculture et de la Pêche
Maritime. (2021).
FDA (Food and Drug Administration). (2011). Standards for the growing, harvesting, packing, and
holding of raw sprouts. Federal Register, 76(6), 1524-1585.
Azzeddine, M., Boukraa, L., & El Allaoui, A. (2020). Traditional milk production and its challenges
in Morocco: Review. Moroccan Journal of Chemistry, 8(4), 746-758.
Park, Y. W., & Haenlein, G. F. W. (2010). Milk and dairy products in human nutrition: Production,
composition and health. John Wiley & Sons.
Walstra, P., Wouters, J. T. M., & Geurts, T. J. (2006). Dairy science and technology (2nd ed.).
CRC press.
Thorning TK, Raben A, Tholstrup T, et al. Milk and dairy products: good or bad for human health?
An assessment of the totality of scientific evidence. Food Nutr Res. 2016;60:32527.
doi:10.3402/fnr.v60.32527.
Weaver CM. Lait et produits laitiers : perspectives sur la santé des os et du corps. J Am Coll Nutr.
2014;33(3):209-217. doi:10.1080/07315724.2014.870023
Centers for Disease Control and Prevention. (2021). Raw Milk Questions and Answers.
Lecuit, M. (2007). Human listeriosis and animal models. Microbes and infection, 9(10), 1216-1225.
doi: 10.1016/j.micinf.2007.05.009
Allerberger, F., & Wagner, M. (2010). Listeriosis: a resurgent foodborne infection. Clinical
microbiology and infection, 16(1), 16-23. doi: 10.1111/j.1469-0691.2009.03109.x
Berche, P., Bingen, E., & Mouton, Y. (1999). Microbiologie médicale. Flammarion Médecine-
Sciences.
Rocourt, J. (1999). Le genre Listeria. Bulletin de la Société française de microbiologie, 14(3), 151-
162.
Rocourt, J., Cossart, P., & Samson, A. (2003). Listeria, Listeriosis, and Food Safety. CRC Press.
Catteau, M. (1991). Généralités sur le genre Listeria. Annales de l'Institut Pasteur / Microbiologie,
142(2), 157-175.
Avril, J. L. (2000). Microbiologie alimentaire. Dunod.
Zaika, L. L., & Fanelli, M. (2003). Listeria monocytogenes: A foodborne pathogen. Academic Press.
Wang, L., Zhang, W., Zheng, Y., & Luo, Y. (2019). Detection of Listeria monocytogenes in food
samples: A review. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf., 18(6), 1832-1852.
. Fraser, M. L., & Farrell, E. G. (1982). A selective medium for the isolation of Listeria
monocytogenes. Journal of Clinical Microbiology, 15(5), 768-771.

31
ISO 11290-1:2017 Microbiology of the food chain -- Horizontal method for the detection and
enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. -- Part 1: Detection method.
Aureli P, Fiorucci GC, Caroli D, Marchiaro G, Novara O, Leone L. An overview of the official
methods of microbiological analysis of foodstuffs in Italy. Int J Food Microbiol. 1995;26(1):11-26.
doi:10.1016/0168-1605(94)00132-h
International Organization for Standardization. Microbiology of the food chain -- Horizontal
method for detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. -- Part 1:
Detection method. ISO 11290-1:2017. Geneva: International Organization for Standardization; 2017.

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