BCM 2504

Enzymologie

Inhibition des réactions enzymatiques

Jeffrey W. Keillor
Université de Montréal
Faculté des arts et des sciences
Département de chimie

© 2005
 Tableau des matières

INHIBITION DES RÉACTIONS ENZYMATIQUES ....................................1

Inhibition réversible ..........................................................................................................1

Inhibition compétitive.................................................................................................... 1

Exemple de l’inhibition compétitive : ........................................................................... 3

Détermination des valeurs de Ki pour l’inhibition compétitive........................................ 6

IC50 pour inhibition compétitive ................................................................................... 7

Inhibition incompétitive................................................................................................. 8

Exemple de l’inhibition incompétitive : ........................................................................ 9

Détermination des valeurs de Ki pour l’inhibition incompétitive................................... 12

IC50 pour inhibition incompétitive .............................................................................. 13

Inhibition non-compétitive........................................................................................... 14

Exemple de l’inhibition non-compétitive .................................................................... 15

Détermination des valeurs de Ki pour l’inhibition non-compétitive simple .................... 18

Inhibition non-compétitive mixte ............................................................................... 19

Détermination des valeurs de Ki et de Ki' pour l’inhibition non-compétitive mixte......... 20

IC50 pour inhibition non-compétitive simple ............................................................... 21

Graphique sommaire pour la variation de IC50 ............................................................ 22

Graphiques de Dixon................................................................................................... 23

Étude de mécanisme d’inhibition ................................................................................. 25

Inhibition de réaction avec multiples substrats............................................................. 29

Méthodes cinétiques.................................................................................................. 29

Règles de Cleland pour inhibiteurs réversibles ............................................................ 30

 Tableau des matières

A. Dans le cas où I se lie à E avant S ................................................................... 30

B. Dans le cas où I se lie à E après S................................................................... 30

Étapes irréversibles................................................................................................ 32

Règles pour l’inhibition de produit............................................................................ 33

Inhibition de liaison lente............................................................................................. 35

Inhibition de liaison lente de forte affinité.................................................................... 36

Exemple de l’inhibition de forte affinité ..................................................................... 37

Courbes de Ackermann-Potter ................................................................................... 38

IC50 pour inhibition de forte affinité........................................................................... 40

Tableau sommaire des inhibiteurs réversibles.............................................................. 40

Inhibition irréversible ......................................................................................................41

Références................................................................................................................... 41

Mesures d’efficacité..................................................................................................... 41

Réactifs du site actif (Marquage par affinité) ............................................................... 41

Caractéristiques générales......................................................................................... 41

Exemples de marquage par affinité ............................................................................ 42

TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone) ..................................................... 42

DIFP (diisopropyl phosphofluoridate) ....................................................................... 42

PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) ................................................................... 42

Autres exemples .................................................................................................... 43

Marquage par photoaffinité ..................................................................................... 44

 Tableau des matières

Analyse cinétique...................................................................................................... 45

Inhibiteurs basés sur le mécanisme (substrats du type « suicide »)................................ 49

Démonstration de la participation de kcat au mécanisme d’inactivation......................... 49

Exemples de réactions « suicide » .............................................................................. 50

Groupements activés lors de réactions enzymatiques ............................................... 50

Inhibition de la déshydrase de thiolester β-hydroxydécanoyle par un analogue acétylène

............................................................................................................................ 51

Inhibition de la β-lactamase par des analogues de pénicilline..................................... 52

Inhibition des transaminases par un analogue d’acide aminé ..................................... 53

Réaction avec inhibiteur irréversible et formation de produit ....................................... 54

Tableau sommaire des modificateurs chimiques........................................................... 55

Tableau sommaire des modificateurs chimiques (suite) ................................................ 56

Inhibition des réactions enzymatiques
Les enzymes peuvent être désactivées de manière irréversible par la chaleur ou par
l’action des réactifs chimiques, en induisant la dénaturation. Elles peuvent être également
inhibées (sans être dénaturées) par la liaison - réversible ou irréversible - des inhibiteurs naturels
ou synthétiques.

Inhibition réversible

Inhibition compétitive
Si un inhibiteur se lie à l’enzyme et empêche ainsi que le substrat s’y lie, on dit que le
substrat et l’inhibiteur sont en compétition pour le site actif – l’inhibition et l’inhibiteur sont de
type compétitif. Ceci se voit souvent lorsqu’au moins une partie de l’inhibiteur possède une
structure semblable à celle du substrat.

S Enz S

Enz

Enz I

Représentation schématique de l’inhibition compétitive

k1, S k2
E E•S E + P
k-1
k -i ki, I

E•I

Schéma de type Michaelis-Menten de l’inhibition compétitive

1
 Strictement parlant, l’inhibition compétitive a lieu lors de l’exclusion du substrat de son
site de liaison, due à la liaison d’un inhibiteur à l’enzyme libre. Il y a d’autres scénarios de
liaison d’inhibiteur qui donnent lieu à l’inhibition compétitive, à part la compétition directe
qu’on a vu à la page précédente.
Par exemple : a) la liaison de l’inhibiteur à l’enzyme libre, à un site près du site actif,
peut empêcher la liaison du substrat par encombrement stérique;
b) la liaison de l’inhibiteur à l’enzyme libre, à un site éloigné du site
actif, induit un changement de conformation de l’enzyme qui empêche
la liaison mutuelle du substrat (et vice-versa)

a) b)

S S
S Enz Enz
S

Enz Enz
I
I

Enz I Enz
I

Représentations schématiques alternatives de l’inhibition compétitive

2
Exemple de l’inhibition compétitive :

La déhydrogénase de succinate catalyse la formation de l’acide fumarique à partir de

l’acide succinique et elle est inhibée de manière compétitive par l’acide malonique qui ressemble
à l’acide succinique :

HO2C CH2 CH2 CO2H

acide succinique CH CO2H Enz-FADH2

Enz•FAD Enz•FAD•Succ HO2C CH +

acide fumarique

HO2C CH2 CO2H

acide malonique

Enz•FAD•Mal

cf

k1, S k2
E E•S E + P
k-1
k -i ki, I

E•I

3
 Dans le cadre du schéma Michaelis-Menten, l’inhibition compétitive est représentée par
un équilibre additionnel :

k1, S k2
E E•S E + P
k-1
k -i ki, I

E•I

k 2 + k −1 [E][S]
Nous savons encore que = (approximation de l’état stationnaire).
k1 [E • S]
[E ][I]
Maintenant, [E] 0 = [E] + [E•S] + [E•I] et Ki = ,
[E • I]

[E ][I] (k 2 + k −1 )[E • S] [ I] (k 2 + k −1 )[E • S][I]

alors, [E • I] = = ⋅ = .
Ki k1 [S] Ki k1[S]K i

(k 2 + k −1 )[E • S] (k 2 + k −1 )[E • S][I]

Donc, [E] 0 = + [E•S] +
k1[S] k1 [S]K i
 (k + k −1 ) (k + k −1 )[I] 
[E ]0 = [E • S] 2 + 1+ 2
 k 1[S] k1[S]K i 
[E ]0
et [E • S] =
 (k 2 + k −1 ) (k + k −1 )[ I] 
 + 1+ 2
 k1 [S] k1 [S]K i 
k 2 [E ]0 k 2 [E ]0 [S]
donc, v = =
 (k 2 + k −1 )   [I]   (k 2 + k −1 )   [I] 
1 +   ⋅  1 +  [S] +   ⋅  1 + 
 k1[S]   K i   k1   Ki 

 [I] 
Alors on voit que le KM augmente par un facteur de 1 +  .
 Ki 
De plus, Ki représente la concentration d’inhibiteur nécessaire pour doubler le KM .

Par contre, la présence de l’inhibiteur n’affecte pas de tout le V max ; on peut toujours
surmonter l’effet de l’inhibiteur en augmentant la concentration du substrat.

Finalement, lorsque [I] = 0, l’équation se simplifie à l’équation Michaelis-Menten.

4
 Graphique Michaelis-Menten d'inhibition compétitive

v = Vmax = k cat [E]0

Vitesse, v

[I] = 0

[I] = Ki
V max[S]
v=
 [I] 
Vmax / 2

[I] = 2 Ki
[S] + K M ⋅  1 + 
 Ki 

KM K Mapp KMapp'

[S]

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition compétitive

[I] = 2 K i

 [I] 
K M  1 + 
[I] = Ki
1  K i  1 1
= ⋅ +
1/ v

v V max [S] V max

-1 / K M app' [I] = 0

-1 / K Mapp
pente = KM / V m a x
-1 / K M

1 / Vm a x

0
1/[S]

Graphique Eadie-Hofstee d'inhibition compétitive

Vm a x

 [I]  v
v = − K M ⋅  1 + ⋅ + Vmax
pente = -K M
 K i  [S]
[I] = 2 K i [I] = K i [I] = 0  [I]  v
v

pente = -K M app
pen

Vm a x / K M
V m a x / K M app' V m a x / KM app
te
=- M
K
app'

v / [S]

5
Détermination des valeurs de Ki pour l’inhibition compétitive
Après avoir vérifié que l’inhibition observée est purement compétitive (c’est à dire,
seulement les valeurs de KM et non les valeurs de V max varient en fonction de la concentration
d’inhibiteur), on peut déterminer la valeur de Ki à l’aide de deux différents graphiques.

Une méthode est basée sur le traitement des données provenant du graphique
Lineweaver-Burk, datant de l’époque où la régression linéaire était plus simple que la régression
non-linéaire actuellement possible à l’aide des ordinateurs. Cette méthode se voit toujours, pour
des raison historiques, et s’agit de la préparation d’un graphique secondaire (parfois appelé un
« re-plot ») des pentes du graphique Lineweaver-Burk versus la concentration d’inhibiteur :
  
 K M 1 + [I]  
K  
app
 Ki   = K M + KM
penteLB =  M  =   [I]
 V max   V max  V max V max K i
 
 

L’abscisse à l’origine donne la valeur de Ki :

KM/Vmax•Ki
pente du graphique LB,
KMapp/Vmax

K M/Vmax

0
[I]
-Ki

app
La deuxième méthode est aussi directe, si on avait déjà calculé les valeurs de K M :
 [I] 
K Mapp = K M 1 +  = K M + K M [I]
 K i  Ki

KM /K i
KMapp

L’abscisse à l’origine donne la valeur de Ki :

KM

0
[I]
-Ki

6
IC50 pour inhibition compétitive
La valeur de IC50 est la concentration d’inhibiteur nécessaire pour dim inuer la vitesse
réactionnelle jusqu’à 50 % de sa valeur maximale non-inhibée. Une valeur de IC50 toute seule ne
permet pas de conclusions mécanistiques, mais peut être utilisée comme un indice d’efficacité
d’inhibition par rapport à d’autres inhibiteurs si les valeurs de IC50 sont déterminées dans les
mêmes conditions réactionnelles.

Alors, dans le cas d’inhibition compétitive,

V max[S] V max[S]
v= et v= 1
quand [I] = IC50 .
[S] + K M
2
 [I] 
[S] + K M ⋅  1 + 
 Ki 

Vmax[S] Vmax[S]
Alors, 1
2 =
[S] + K M  IC 
[S] + K M ⋅ 1 + 50 
 Ki 

1 2
=
+
[S] K M  IC 
[S] + K M ⋅ 1 + 50 
 Ki 

 IC 
[S] + K M ⋅  1 + 50  = 2([S] + K M )
 Ki 

KM
[S] + K M + IC 50 = 2[S] + 2 K M
Ki

KM
IC50 = [S] + K M
Ki

Ki
IC 50 = [S] + K i
KM

Notez que le IC50 s’approche de la valeur de Ki aux très basses concentrations de substrat.

7
Inhibition incompétitive
Si un inhibiteur se lie au complexe enzyme-substrat, mais pas à l’enzyme libre, on a un
cas contraire à l’inhibition compétitive qui s’appelle l’inhibition incompétitive
(« uncompetitive »).

S
S produits
Enz
Enz

Enz
I

Représentation schématique de l’inhibition incompétitive

k1 , S k2
E E•S E + P
k -1
k-i ki, I

E•S•I

Schéma de type Michaelis-Menten de l’inhibition incompétitive

8
Exemple de l’inhibition incompétitive :

Ce type d’inhibition est assez commun pour les enzymes de plus d’un substrat (où la
liaison d’un inhibiteur dans le site de liaison d’un substrat donne lieu à l’inhibition incompétitive
par rapport à l’autre substrat) mais très rare pour les enzymes d’un seul substrat. La phosphatase
alkaline est une enzyme qui est inhibée de façon incompétitive par la L-phénylalanine.

H2O

-2O 5'-ADN Enz -2 O P 5'-ADN•Enz

3P + 3 HO 5'-ADN + HOPO 3-2

L-Phe

-2O P 5'-ADN• Enz•Phe

3

cf

k1 , S k2
E E•S E + P
k -1
k-i ki, I

E•S•I

9
 Encore une fois, dans le cadre du mécanisme Michaelis-Menten, cette inhibition est
représentée par un équilibre additionnel :

k1 , S k2
E E•S E + P
k -1
k-i ki, I

E•S•I

k 2 + k −1 [E][S]
On commence encore avec = (approximation de l’état stationnaire).
k1 [E • S]
[E • S][I]
Maintenant, [E] 0 = [E] + [E•S] + [E•S•I] et Ki = ,
[E • S • I]
(k 2 + k −1 )[E • S] [E • S][I]
alors, [E] 0 = + [E•S] +
k1 [S] Ki

[E] 0 [E] 0 [S]

[E • S] = =
et
(k + k −1 ) + [I]  [I]  ( + )
1+ 2 1 + [S] + k 2 k −1
k1[S] Ki  Ki  k1

k 2 [E] 0 [S]
 [I] 
 1 + 
k 2 [E] 0 [S]  Ki 
v = k 2 [E • S] = =
Donc,
 [I]  (k 2 + k −1 ) (k 2 + k −1 )
 1 + [S] +
 Ki  k1
k1 [S] +
 [I] 
1 + 
 Ki 

 [ I] 
Alors on voit que le V max aussi que le KM sont diminués par le facteur 1 +  .
 Ki 

10
 Graphique Michaelis-Menten d'inhibition incompétitive

v = Vmax = k cat [E] 0

[I] = 0 V max[S]
 [I] 
Vitesse, v

 1 + 
 Ki 
v=
Vmax / 2

[S] + K M
[I] = Ki

 [I] 
V maxapp / 2

 1 + 
[I] = 2 Ki  Ki 
Vmaxapp ' / 2

KMapp KM

KMapp' [S]

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition incompétitive

[I] = 2 Ki

[I] = K i

[I] = 0
1 KM 1 1
= ⋅ +
1/ v

v V max [S] V max

pente = KM / V m a x
-1 / K M  [I] 
 1 + 
K i 
1 / V m a x app '
-1 / KM app
1 / V m a x app

-1 / K Mapp'
1 / Vm a x

0
1/[S]

Graphique Eadie-Hofstee d'inhibition incompétitive

Vm a x

KM v Vmax
pente = -K M v=− ⋅ +
Vm a x app  [ I]  [S]  [I] 
 1 +   1 + 
 Ki   Ki 
[I] = 0
v

pente = -K M app

p e n te [I] = K i
= -K app
M '
Vm a x / K M
app'
Vm a x [I] = 2 K i

v / [S]

11
Détermination des valeurs de Ki pour l’inhibition incompétitive
Après avoir vérifié que l’inhibition observée est purement incompétitive (c’est à dire, les
valeurs de KM et les valeurs de V max diminuent par le même facteur en fonction de la
concentration d’inhibiteur), on peut déterminer la valeur de Ki . Pour ce faire, on prend les
valeurs de 1 app ou de 1 app , soit obtenues directement des axes x et y du graphique
KM V max
Lineweaver-Burk, ou, plus précisément, calculées après la régression non-linéaire des graphiques
Michaelis-Menten. De toute façon, ces valeurs sont utilisées pour construire un deuxième type
de graphique :

KM
KM =
app

 [I] 
 1 + 
 Ki 

 [I] 
 1 + 
et 1 =  K i 
= 1 +
1
[I] : 1/K M•Ki
app 1/KMapp
K M KM KM KMKi

1/KM

0
[I]
-Ki

V
ou bien V max = max
app

 [I] 
1 + 
 Ki 

 [I] 
 1 + 
et 1 app =  K i 
= 1 +
1
[ I] : 1/Vmaxapp 1/Vmax•Ki
V max V max Vmax V max K i

1/Vmax

0
[I]
-Ki

12
IC50 pour inhibition incompétitive
Dans le cas où l’inhibiteur se lie au complexe enzyme-substrat (inhibition incompétitive),
nous savons que :

V max [S] Vmax [S]

v= et v = 12 quand [I] = IC50 .
 [I]  [S] + K M
 1 + [S] + K M
 Ki 

1 2
Alors, =
[S] + K M  IC50 
 1 + [S] + K M
 K i 

[S]
[S] + IC50 + K M = 2[S] + 2 K M
Ki

[S]
IC 50 = [S] + K M
Ki

Ki K M
IC 50 = K i +
[S]

Notez que le IC50 s’approche de la valeur de Ki aux très hautes concentrations de substrat.

À première vue, il semble bizarre que l’effet d’inhibition incompétitive augmente avec la
concentration augmentant de substrat. Mais ce phénomène s’explique si on considère que la
liaison du substrat, favorisée aux hautes concentrations, favorise la formation du complexe E•S,
qui est susceptible à l’inhibition. Ceci explique aussi pourquoi le KM diminue pour un substrat ;
l’équilibre de liaison est déplacé vers le complexe E•S par la diminution de sa concentration lors
de la formation du complexe E•S•I.

13
Inhibition non-compétitive
Finalement, si un inhibiteur se lie à l’enzyme et au complexe enzyme-substrat, on peut
observer une troisième forme d’inhibition réversible : celle de type non-compétitif.

S
S produits

Enz Enz

Ki I K i' I

S
S
Enz Enz
I I

Représentation schématique de l’inhibition non-compétitive

k1, S k2
E E•S E + P
k-1

Ki I K i' I
k 1', S
E•I E•S•I
k-1'

Schéma de type Michaelis-Menten de l’inhibition non-compétitive

14
Exemple de l’inhibition non-compétitive

Encore une fois, l’inhibition non-compétitive des enzymes de plusieurs substrats est
commune, mais l’inhibition non-compétitive d’une enzyme d’un seul substrat est plutôt rare.
L’inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP est non-compétitive par rapport au
substrat 1,6-bisphosphate de fructose :

fructose-1,6-bisphosphate
H2O
(FBP)
Enz Enz•FBP Enz + fructose-6-phosphate

AMP AMP

Enz•AMP Enz•FBP•AMP

cf

k1, S k2
E E•S E + P
k-1

Ki I K i' I
k 1', S
E•I E•S•I
k-1'

15
 Dans un traitement rigoureux du schéma cinétique, il faut appliquer l’approximation de
l’état stationnaire à tous les espèces enzymatiques, et on arrive à une solution qui est aussi
intuitive : l’inhibition non-compétitive représente une combinaison de l’inhibition compétitive et
l’inhibition incompétitive.

V max[S]
 [I] 
 1 + ' 
 Ki 
v=
 [I] 
1 + 
 K i 
[S] + K M
 [I] 
1 + ' 
 Ki 

Dans ce modèle, comme on peut voir de cette équation, les inhibitions compétitive et
incompétitive représentent des cas particuliers où :

Ki' = ∞ (inhibition compétitive)

Ki = ∞ (inhibition incompétitive)

Lorsque les deux constantes Ki et Ki' ont des valeurs finies, les profils d’inhibition (i.e. les
effets sur les courbes de Lineweaver-Burke) sont intermédiaires entre ceux observés pour les
inhibitions compétitive et incompétitive. En général, l’inhibition non-compétitive dépend des
forces relatives des deux différents modes d’inhibition, tel que résumé dans le tableau ci-
dessous :

Type d’inhibition Effet sur Vmax Effet sur KM

Ki = ∞ incompétitif â â

Ki' = ∞ compétitif - á

Ki = Ki' non-compétitif simple â -

Ki > Ki' mixte â â

Ki < Ki' mixte â á

Dans le cas où l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la présence de substrat (i.e. Ki

= Ki'), le KM n’est pas modif ié par la présence de l’inhibiteur mais le V max est diminué par le
 [I] 
facteur de 1 + '  . C’est l’inhibition non-compétitive « simple ».
 Ki 

16
 Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncompétitive simple

v = Vmax = kcat [E]0

Vitesse, v

[I] = 0 V max[S]
 [I] 
 1 + 
 Ki 
Vmax / 2

v=
[S] + K M
[I] = Ki
Vmaxapp / 2

[I] = 2 Ki
Vmaxapp' / 2

KM

[S]

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition noncompétitive simple

[I] = 2 K i

pente = KM / V m a xapp'

1 KM  [I]  1 1
1 / V m a xapp ' [I] = Ki = ⋅ 1 +  ⋅ +
 K i  [S]
1/ v

v V max V max
pente = KM / V m a xapp
 [I] 
 1 + 
[I] = 0
 K i 
pente = K M / V m a x
-1 / KM

1 / Vm a x app
1 / Vm a x

0
1/[S]

Graphique Eadie-Hofstee d'inhibition noncompétitive simple

Vm a x

pente = -K M
v V max
V m a xapp v = −KM ⋅ +
[S]  [I] 
1 + 
[I] = 0
 Ki 
v

[I] = K i

V m a xapp' / K M
V m a xapp / K M Vm a x / K M
app'
Vm a x
[I] = 2 K i

v / [S]

17
Détermination des valeurs de Ki pour l’inhibition non-compétitive simple
Après avoir vérifié que l’inhibition observée est non-compétitive simple (c’est à dire, les
valeurs de V max et non les valeurs de KM diminuent en fonction de la concentration d’inhibiteur),
on peut déterminer la valeur de Ki . Pour ce faire, on prend les valeurs de 1 app , soit obtenues
V max
directement de l’ordonné à l’origine du graphique Lineweaver-Burk, ou, plus précisément,
calculées après la régression non-linéaire des graphiques Michaelis-Menten. De toute façon, ces
valeurs sont utilisées pour construire un deuxième type de graphique :

V
V max = max
app

 [I] 
1 + 
 Ki 

 [I] 
 1 + 
et 1 app =  K i 
= 1 +
1
[ I] : 1/Vmax•Ki'
V max V max Vmax 1/Vmaxapp
V max K i

1/Vmax

0
[I]
-Ki'

18
Inhibition non-compétitive mixte

Lorsque Ki < Ki' , l’augmentation de [I] augmente aussi la valeur apparente de KM (i.e. le
app
KM ) ce qui représente un cas semblable à l’inhibition compétitive. Les courbes de
Lineweaver-Burk ont alors l’allure suivante :
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition noncompétitive mixte

Ki ' = 2 Ki

[I] = 2 K i

app' app'
pente = K M / Vm a x

[I] = K i
1 / V m a xapp'

1/v
app app
pente = K M / Vm a x

[I] = 0
app'
-1 / K M pente = K M / V m a x
app
-1 / KM
-1 / K M
1 / Vm a xapp
1 / Vm a x

0
1/[S]

app
Par contre, lorsque Ki' < Ki , l’augmentation de [I] entraîne une diminution du KM , ce
qui représente un cas semblable à l’inhibition incompétitive :
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition noncompétitive mixte

Ki = 2 Ki '

[I] = 2 K i

app' app'
pente = K M / Vm a x
1 / Vm a xapp'

[I] = K i
1/v

app app
pente = K M / Vm a x

-1 / K M [I] = 0
-1 / K Mapp
1 / V m a xapp
pente = K M / V m a x
-1 / K Mapp'

1 / Vm a x

0
1/[S]

L’effet sur KM (soit diminution, augmentation ou pas de changement) peut être rationalisé
selon l’efficacité de l’inhibiteur à modifier la liaison entre l’enzyme et le substrat.

Dans tous les cas où les profils d’inhibition se croisent à gauche de l’ordonnée,
l’inhibition est qualifiée de non-compétitive, ou de mixte.

19
Détermination des valeurs de Ki et de Ki' pour l’inhibition non-compétitive mixte
Après avoir vérifié que l’inhibition observée est non-compétitive mixte (c’est à dire, les
valeurs de V max et les valeurs de KM varient en fonction de la concentration d’inhibiteur, mais
selon des facteurs différents), on peut déterminer les valeurs de Ki et de Ki'.
Pour déterminer la valeur de Ki', on prend les valeurs de 1 app , soit obtenues
V max
directement des ordonnés à l’origine du graphique Lineweaver-Burk, ou, plus précisément,
calculées après la régression non-linéaire des graphiques Michaelis-Menten. On construit
ensuite un deuxième type de graphique :

V
V max = max
app

 [ I] 
1 + 
 K i′ 
1/Vmaxapp 1/Vmax•Ki'

 [I] 
 1 + 
 K i′  1
et 1 app = = 1 + [I] :
V max Vmax V max Vmax K i′
1/Vmax

0
[I]
-Ki'

app
Pour déterminer la valeur de Ki, on prend les valeurs de K M app , soit obtenues
Vmax
directement des pentes du graphique Lineweaver-Burk, ou, plus précisément, calculées après la
régression non-linéaire des graphiques Michaelis-Menten. On construit ensuite un deuxième
type de graphique :

  [I]  
  1 +  
  Ki  
 KM 
  [I]  
 1 + 
 K app    K ′i   = K M  + [I] 
penteLB =  Mapp
 =   1 K 
 Vmax   V max  V max  i 
  [I]  
  1 + ′   KM/Vmax•Ki
  Ki  
pente du graphique LB,
KMapp /Vmax
 
 
KM KM
= + [I] :
V max V max K i
KM/Vmax

0
[I]
-Ki

20
IC50 pour inhibition non-compétitive simple
Dans le cas rare où l’affinité d’un inhibiteur pour l’enzyme libre est identique à son
affinité pour le complexe enzyme-substrat, c’est à dire Ki = Ki' , l’effet de l’inhibiteur est
manifesté seulement dans la valeur de V max et est indépendant de la concentration de substrat.
Donc, Ki représente la concentration d’inhibiteur nécessaire pour diminuer le V max par un moitié,
ce qui est identique à la définition de la IC50.

Alors, dans le cas d’inhibition non-compétitive simple,

V max[S]
 [I] 
 1 + 
 Ki  Vmax [S]
v= et v = 12 quand [I] = IC50 .
[S] + K M [S] + K M

V max[S]
 IC50 
1 + 
Vmax[S]  Ki 
Alors, 1 =
[S] + K M [S] + K M
2

1 2
=
[S] + K M  
([S] + K M )⋅  1 + IC50 
 Ki 

 IC50 
1 + =2
 K i 

IC50 = K i

21
Graphique sommaire pour la variation de IC50

La valeur de IC50 varie en fonction de la concentration de substrat selon le mode

d’inhibition, comme montré au graphique ci-dessous. Bien que Ki soit constant, la fraction
d’enzyme inhibée peut varier considérablement, dépendant de la concentration de substrat et du
mécanisme d’inhibition.

16

14

12
compétitive
10
IC50 / Ki

8
incompétitive
6

4
non-compétitive
2

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[S] / KM

Rappel :
Mode d’inhibition Équation Rapport
non-compétitif (simple) IC50 = K i Ki = 1
IC 50

Ki
compétitif IC 50 = [S] + K i
IC 50
Ki = [S] + 1
KM KM
KK KM
IC 50 = K i + i M = +1
IC 50
incompétitif Ki
[S] [S]

Notez que le IC50 = Ki dans trois cas :

1. inhibition non-compétitive (simple)
2. inhibition compétitive lorsque [S] à 0
3. inhibition incompétitive lorsque [S] à ∞

22
Graphiques de Dixon
En 1953, Dixon a proposé une façon alternative pour déterminer la valeur de Ki, en
1
utilisant un graphique de vs [I]. Dans un graphique de Dixon, les droites déterminées à
v
différentes concentrations de substrat se croisent à – Ki.

Ceci peut être facilement démontrée dans le cas de l’inhibition compétitive où :

1 K M  [I]  1
= ⋅ 1+ +
v V max [S]  K i  V max
1
Or, la valeur de sera la même, à deux différentes concentrations de substrat [S]' et [S]"
v
lorsque :
1  [I]  1  [I] 
⋅ 1 + = ⋅ 1+
[S]'  K i  [S]"  K i 


Puisque [S]' ≠ [S]", [I] doit égaler –Ki .

Donc, les droites obtenues à différentes concentrations de substrats se croisent

toujours à [I] = -Ki .

23
 Graphique Dixon d'inhibition compétitive

[S] = KM

1  K M  K  1
=  ⋅ [I] +  M + 1 ⋅
1/v

 [S]  V max
[S] = 2 KM
v  K iV max [S] 
[S] = 3 KM

-Ki 0
[I]

Graphique Dixon d'inhibition incompétitive

[S] = KM
[S] = 2 KM
[S] = 3 KM

1  1  K  1
=  ⋅[I] +  M + 1 ⋅
v  Ki Vmax   [S]  Vmax
1/v

lignes parallèles;
impossible à déterminer Ki !!

0
[I]

Graphique Dixon d'inhibition noncompétitive (simple)

[S] = KM

[S] = 2 KM

[S] = 3 KM
1/v

1  1  K M  K  1
=   + 1  ⋅[I] +  M + 1 ⋅
v  Ki Vmax  [S]   [S]  Vmax

-Ki 0
[I]

24
Étude de mécanisme d’inhibition
Considérons le cas où un inhibiteur se lie à une forme de l’enzyme qui est en équilibre
avec celle liant le substrat, selon le mécanisme suivant :

S
k3 k5 k7
E E' E'•S E + P
k4 k6
I
k2 k 1

E•I

La vitesse réactionnelle est donnée par : v = k 7 [E'•S] ,

[E ][I] k 2
et on sait que : [E] T = [E] + [E'] + [E'•S] + [E•I] , et Ki = =
[E • I] k1
d [E' ]
et = k 3 [E] + k 6 [E'•S] – k 4 [E'] – k 5 [E'][S]
dt
d [E]
et = k 2 [E•I] + k 4 [E'] + k 7 [E'•S] – (k3 + k 1[I])[E]
dt
d [E'•S]
et = k 5 [E'][S] – (k 6 + k7)[E'•S] .
dt
d [E'•S] k + k7
Selon l’approximation de l’état stationnaire, = 0 alors [E' ] = 6 [E'•S] .
dt k 5 [S]
En substituant cette équation dans celle ci-dessus, on a :
d [E' ]
= k 3 [E] + k 6 [E'•S] – 6
(k + k 7 )[E'•S](k 4 + k 5 [S])
= 0 (à l’état stationnaire)
dt k5 [S]
k (k + k 7 )[E'•S]
alors, 0 = k 3 [E] + k 6 [E'•S] – 4 6 − k 6 [E'•S] − k 7 [E'•S]
k5 [S]
 k (k + k 7 ) 
et k 3 [E ] =  4 6 + k 7 [E'•S]
 k 5 [S] 
 k (k + k 7 ) + k 5 k 7 [S] 
alors [E ] = [E'•S] 4 6  .
 k3 k 5 [S] 

[E ][I]  k 4 (k 6 + k 7 )[ I] + k 5 k 7 [S][I] 
De plus, [E • I] = alors [E • I] = [ E'•S]  .
Ki  K i k 3 k5 [S] 

25
 Nous pouvons maintenant exprimer [E] T en fonction de [E'], [E], [E'•S] et [E•I] :

[E] T = [E'•S] + [E•I] + [E] + [E']

 K k k [S] + k 4 (k 6 + k 7 )[I] + k 5 k 7 [S][I] + K i k 4 (k 6 + k7 ) + K i k 5 k 7 [S] + K i k 3 (k 6 + k 7 ) 

[E ]T = [ E'•S] i 3 5 
 K i k 3 k 5 [S] 

qui se réarrange pour donner :

 
 
[E'•S]  k 3 k5 [S] 
= 
[E ]T    [I]    [I]  
 [S] k 3k 5 + k 5 k 7 1 + K   + k 4 (k 6 + k 7 ) 1 + K  + k 3 (k 6 + k 7 ) 
 
   i   i  

On peut obtenir l’équation pour la vitesse :

 
 
v k 7 [ E'•S]  k 3 k 5 [S] 
= = k7  
[E ]T [E ]T    [I]    [I]  
 [S] k 3 k 5 + k 5 k 7  1 + K   + k 4 (k 6 + k 7 )1 + K  + k 3 (k 6 + k 7 ) 

   i   i  

En divisant les deux termes (numérateur et dénominateur) de l’équation ci-dessus par le

 [I] 
terme : k 3 k 5 + k 5 k 7  1 +  , on obtient la forme hyperbolique suivante :
 Ki 
k 7 k 3k 5 [S]
[ I]
k3k5 + k5k7 + k5k7
v Ki
=
[E ]T (k 4 + k 3 )(k6 + k 7 ) + k 4 (k 6 + k 7 ) [I]
Ki
[S] +
[ I]
k3k5 + k5k7 + k5k7
Ki

k3k7
Or, lorsque [I] = 0, k cat =
k3 + k7

(k 3 + k 4 )(k 6 + k 7 )
KM =
k 5 (k3 + k 7 )

et on voit que les paramètres sont alors indépendants des valeurs de k 1 et k 2.

26
 L’équation de vitesse peut être réarrangée afin de mettre V max et KM en évidence :

k3 k 7
V max
=
k3 k 7
=
(k 3 + k 7 ) V max
=
k cat
;
[E] T k + k + k [I] k7 [I] [E] T [ I]
+ 1+
3 7 7
Ki
1
(k 3 + k 7 ) K i (k 3 + k 7 )
K i
k7

app
On peut définir maintenant l’expression pour le KM à partir de l’équation hyperbolique,
dont le numérateur et le dénominateur sont divisés par k 5(k 3 + k 7) .

k 4 (k 6 + k 7 ) [I]
(k 4 + k 3 )(k 6 + k 7 ) + k 4 (k 6 + k 7 ) [ I] KM +
Ki k5 (k 3 + k 7 ) K i
= =
app
Ainsi, K M
[I] k7 [I]
k3k5 + k5k7 + k5k7 1+
Ki (k 3 + k7 ) K i
(k 3 + k 4 )
et en multipliant le deuxième terme du dénominateur par on obtient :
(k 3 + k 4 )
 k4 [I] 
K M + K M  
 (k 3 + k 4 ) K i 
=
app
KM
k7 [ I]
1+
(k 3 + k 7 ) K i
D’où l’équation de la vitesse, sous la forme de Michaelis-Menten :

k cat [E ]T [S]
[I]
1+
(k 3 + k 7 )
Ki
k7
v =
 [I] 
 1+ 
 ( k3 + k4) 
Ki
 k4 
+
[S] K M  
 1+ [I] 
 (k3 + k 7 ) 
 Ki 
 k7 

L’équation de la vitesse réactionnelle pour ce mécanisme indique que la présence de

l’inhibiteur affecte le V max et le KM. Les profils d’inhibition seront donc semblables à ceux
obtenus pour l’inhibition non-compétitive.

27
 ≠ Ki . La signification des constantes apparentes peut
app
Notez que dans cet exemple, Ki
donc différer selon le mécanisme.

De plus, cet exemple nous permet de réaliser que les profils d’inhibition ne sont pas
exclusifs pour un seul type de mécanisme. La correspondance des profils d’inhibition à un
mécanisme proposé ne nous permet pas de conclure que le mécanisme est exclusivement valable.

28
Inhibition de réaction avec multiples substrats
Il y a de nombreuses méthodes pour déterminer les mécanismes des réactions
enzymatiques. Les profils des courbes de Lineweaver-Burk (entre autres) obtenus en faisant
varier les substrats, les produits et les inhibiteurs peuvent tous contribuer à distinguer les divers
mécanismes.

Méthodes cinétiques

1 1
1) Profils des vitesses initiales : vs en fonction de S2, S3 …
v S1
1 1
vs en fonction de S1, S3 …
v S2
1 1
2) Profils d’inhibition par les produits : vs en fonction de P1, P2 …
v S1
1 1
vs en fonction de P1, P2 …
v S2
1 1
3) Profils d’inhibition par les inhibiteurs réversibles : vs en fonction de I1, I2 …
v S1
1 1
vs en fonction de I1, I2 …
v S2

Les inhibiteurs sont très utiles pour distinguer différents mécanismes de réactions
enzymatiques impliquant la participation de plusieurs substrats. Il est évident que, dans ce cas,
l’inhibition doit être définie par rapport au substrat dont on choisit de faire varier la
concentration.

La notion de Ki doit être nuancée pour les réactions à plusieurs substrats car l’inhibiteur
peut se combiner avec des formes multiples de l’enzyme avec des différentes affinités. Les
effets de l’inhibiteur sur les courbes de Lineweaver-Burk peuvent représenter la combinaison de
différents types d’inhibition.

29
 Considérons le mécanisme ordonné suivant :

A B Q P

E E•A E•A•B E•P•Q E•P E

I2 I1

E•I2 E•A•I1

Dans ce cas : I1 est compétitif avec B et incompétitif avec A.

I2 est compétitif avec A et non-compétitif avec B.

En 1963 Cleland a établie certaines règles pour prédire les profils d’inhibition sans avoir
à dériver les équations pour chacun des mécanismes. Quelques-unes de ces règles pour les
inhibiteurs réversibles (« dead-end inhibitors ») sont décrites ci-dessous. Des règles semblables
existent pour l’inhibition par les produits.

Règles de Cleland pour inhibiteurs réversibles

A. Dans le cas où I se lie à E avant S

Le profil d’inhibition est :
1) Compétitif lorsque : i)
ii)
2) Incompétitif lorsque :
3) Non-compétitif lorsque :
I et S compétitionnent pour la même forme de E
I et S se lient à deux formes de E en équilibre rapide
I et S se lient à des formes différentes de E séparées par
une étape irréversible
I et S se lient à des formes différentes de E reliées par
une réaction réversible ou une séquence de réactions
réversibles

B. Dans le cas où I se lie à E après S

Le profil d’inhibition est incompétitif dans tous les cas.

Notez que certains inhibiteurs peuvent lier plus d’une forme de l’enzyme!

30
 Regardons un exemple d’application de ces règles pour déterminer l’ordre d’addition des
substrats. Considérons le mécanisme ordonné suivant :

A B C

E E•A E•A•B E•A•B•C E•P•Q•R

E + P + Q +R

I1 I2 I3

E•I1 E•A•I2 E•A•B•I3

Il est possible de déterminer l’ordre d’addition des substrats à partir des profils
d’inhibition :

I1 I2 I3
1 1
vs COMP INC INC
v A
1 1
vs NON-COMP COMP INC
v B
1 1
vs NON-COMP NON-COMP COMP
v C

Donc, A se lie en premier, en ayant deux profils incompétitifs où I2 et I3 se lient après ce

substrat. De plus, C se lie en dernier, en ayant deux profils non-compétitifs et pas de profils
incompétitifs, donc aucun cas où I se lie à une forme de E après C.

Exercice :
Considérez une réaction ordonnée à deux substrats A et B. En présence d’un inhibiteur
1 1
réversible I, les profils des courbes d’inhibition de vs indique que :
v S
i) l’inhibiteur est compétitif par rapport au substrat A
ii) l’inhibiteur est incompétitif par rapport au substrat B

Quelle est l’ordre de liaison des substrats?

31
Étapes irréversibles
Dans le cadre des règles de Cleland pour l’inhibition réversible, une étape est considérée
d’être irréversible si :
1) elle implique la dissociation d’un produit dont la concentration est pratiquement nulle
(c’est-à-dire [P] ≈ 0)
2) elle implique la liaison d’un substrat dont la concentration est « saturante » (c’est-à-
dire [S] à ∞)
3) elle implique un grand changement d’énergie libre , de telle sorte que la vitesse de la
réaction inverse est extrêmement faible

Considérons comme un autre exemple le mécanisme suivant où A, B et C sont des

substrats, P, Q et R sont des produits et F est une forme modifiée de l’enzyme.

P Q R
A B C

E E•A E•A•B F•P F F•C E•Q• R E•R E

P Q R
A B C

Les profils d’inhibition, pour des inhibiteurs se liant aux différentes formes de l’enzyme,
sont donnés ci-dessous (par rapport à chacun des substrats, en présence des autres substrats à
concentrations fixes, mais non-saturantes).

Forme de E 1 1 1 1 1 1
vs vs vs
se liant à l’inhibiteur I v A v B v C
E COMP NON-COMP INC
E•A INC COMP INC
E•A•B INC INC INC
F INC INC COMP
E•Q•R INC INC INC
E•R INC INC INC

Notez que la libération du produit P (dont la concentration est très faible) rend cette étape
irréversible et donc l’inhibiteur qui se lie à F est incompétitif par rapport aux substrats A et B.

32
Règles pour l’inhibition de produit
Considérons quelques règles pour l’interprétation des profils d’inhibition par les produits
de la réaction.

1) Le profil d’inhibition est compétitif lorsque P et S compétitionnent pour la même forme

de l’enzyme.

2) Le profil d’inhibition est incompétitif lorsque P et S se lient à des formes différentes de

l’enzyme séparées par une étape irréversible.

3) Le profil d’inhibition est non-compétitif lorsque P et S se lient à des formes différentes de

l’enzyme séparées par une étape réversible ou une séquence d’étapes réversibles.

Considérons le cas du mécanisme ordonné suivant, pour lequel P et Q se lient

spécifiquement aux formes de E indiquées :

P Q
A B

E E•A E•A•B E•P•Q E•Q E

P Q
A B

Inhibition par Substrat

Profil [A] saturante [B] saturante
le produit : variable
Q A COMP - COMP

Q B NON-COMP pas d’inhibition -

P A NON-COMP - INC

P B NON-COMP NON-COMP -

Notez que les étapes impliquant les liaisons de A et de B sont rendues irréversibles en
présence de concentrations saturantes de A et B.

33
 Voyons maintenant comment l’inhibition par les produits permet de distinguer entre le
mécanisme ordonné (cas précédant) et un mécanisme ping-pong avec un intermédiaire covalent
(E-X) :

P Q
A B

E E•A E-X•P E-X E-X•B E•Q E

P Q
A B

Inhibition par Substrat

Profil [A] saturante [B] saturante
le produit : variable
Q A COMP - COMP

Q B NON-COMP pas d’inhibition -

P A NON-COMP - pas d’inhibition

P B COMP COMP -

Notez qu’en présence de concentrations saturantes de l’un ou l’autre des substrats, les
seuls résultats que l’on observe sont soit inhibition compétitive ou pas d’inhibition. Ceci
s’explique par le fait que les substrats et les produits se lient tous au même site.

Ce type de profil est observé, par exemple, pour les transaminases utilisant le phosphate
de pyridoxale comme cofacteur. Dans ce cas, le complexe E-X correspond à la base de Schiff
formée entre l’aldéhyde du phosphate de pyridoxale et le groupement ε-aminé d’une lysine du
site actif de l’enzyme :
Lys
Lys
(CH2)4
NH2 (CH2)4
H2O N
H O
O O
P O P O
O O O O
O O
N CH3 N CH3
E + PLP E-PLP

Certaines enzymes qui donnent des cinétiques de type ping-pong possèdent des sites de
liaisons différents pour chacune des paires substrat-produit. Les profils d’inhibit ion par les
produits sont alors différents.

34
Inhibition de liaison lente
Dans le cas de certains inhibiteurs réversibles, il se peut que l’équilibre entre l’enzyme,
l’inhibiteur et le complexe E•I soit lent à atteindre. Pour ces inhibiteurs (« slow binding
inhibitors » ), l’intervalle de temps que ça prend pour atteindre l’état stationnaire peut être des
secondes ou des minutes, plutôt que des millisecondes dans le cas des inhibiteurs classiques.

Pour l’équilibre suivant, Ki peut être faible (haute affinité) mais les constantes de vitesse
pour atteindre l’équilibre peut être faibles aussi :

k1 k2
E + I E•I Ki =
k2 k1

L’effet cinétique qui peut être observé est montré au graphique ci-dessous :

sans I
+I Sans pré-incubation avec inhibiteur;
réaction initiée avec enzyme

[P] Enzyme pré-incubée avec inhibiteur;

+I
Formation réaction initiée avec substrat
de E•I

Dissociation
de E•I

Temps

Notez que la vitesse de la réaction (inhibée) est la même après un certain temps, à l’état
stationnaire; il ne s’agit pas d’inhibition irréversible.

Cet effet cinétique peut être également observé s’il y a une transformation lente en un
complexe E•I, ou s’il y a une modification lente de l’inhibiteur lui-même en espèce active.

35
Inhibition de liaison lente de forte affinité
Parfois les inhibiteurs qui se lient lentement à l’enzyme s’y lient fortement (« slow, tight-
binding inhibitors »).

Dans le cas des inhibiteurs classiques, le rapport de l’inhibiteur à la concentration totale

d’enzyme doit être élevé :

Inhibition classique : [I] et [S] >> [E]

[I] ≈ [I] ajoutée (équilibre rapide et constant)
v ∝ [E], en absence et en présence de l’inhibiteur

Par contre, dans le cas des inhibiteurs de forte affinité, l’équilibre de liaison de
l’inhibiteur peut être atteint lorsque la concentration d’inhibiteur est similaire à celle de
l’enzyme. Par définition, un inhibiteur de forte affinité est efficace à une concentration
approchant celle de l’enzyme :

Inhibition de forte affinité : [I] ≈ [E]

[I] ≠ [I] ajoutée (la formation de E•I réduit [I] libre)
Ki
E + I E•I
v vs [E] n’est pas linéaire

Typiquement l’inhibition de ce type est identifié lorsque :

1) les concentrations (mesurées) de l’enzyme et de l’inhibiteur sont similaires
2) le Ki est très faible et/ou la régénération de l’enzyme est lente
3) l’inhibiteur est difficile à séparer de l’enzyme (par dialyse ou filtration de gel)
4) le degré d’inhibition varie avec la concentration d’enzyme (IC50 ↑ avec [E])
5) les courbes de Ackermann-Potter (v vs [E]) ne sont pas linéaires

36
Exemple de l’inhibition de forte affinité

Le methotrexate est un analogue de l’acide folique qui inhibe très fortement et de manière
-11
compétitive la réductase de dihydrofolate (DHFR). Le Ki est de 6 × 10 M et la demi-vie du
complexe E•I est de plusieurs heures in vivo. Le methotrexate est utilisé en chimiothérapie pour
inhiber le prolifération cellulaire (pour laquelle le DHFR est nécessaire)

H
H2N N N

N O
N
HN C CO2H
O
NH CO2H

acide folique

H2N N N

N O
N
N C CO2H
NH2
CH3 NH CO2H

methotrexate

DHF

DHFR DHFR•DHF DHFR + THF

MTX MTX
Ki k2 k1

DHFR•MTX

Exercice: En sachant le Ki et la demi-vie qui correspond à k 2 (approximativement), calculez

la valeur de k 1 .

37
Courbes de Ackermann-Potter

K i élevé K i très faible

[I]=x [I]=x
vi
[I]=0
[I]<[E]

perte d'activité due

à la formation de E•I

Ki
E + I E•I
[I]≈[E]

[I]>[E]

x [E]T

Inhibition classique Inhibition de forte affinité

[I]>>[E] ; [I]≈[E] ;
à [I] constante, v ∝[E] à [I] constante, v vs [E] non-linéaire
à cause du déplacement de l'équilibre

Dans le cas de l’inhibition de forte affinité, la concentration d’inhibiteur varie de manière

significative lors de la formation du complexe E•I dont la concentration est comparable avec
celle de l’inhibiteur et celle de l’enzyme.

38
 La déviation de la linéarité des graphiques de Ackermann-Potter est observée lorsque Ki
est très faible et la concentration de l’inhibition est plus élevée. Les graphiques ci-dessous
montrent comment la valeur du Ki peut influencer l’allure des graphiques.

100 100

90 Ki = 6 nM 90 Ki = 0.6 nM

80 80

[I] = 0 nM 1.5 nM [I] = 0 nM

70 70

3.0 nM 1.5 nM
v normalisée

v normalisée
60 60

4.5 nM
50 50

40 40

30 30 3.0 nM

20 20 4.5 nM

10 10

0 0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

[E] T (nM) [E] T (nM)

100 100

90 Ki = 0.06 nM 90 Ki = 0.006 nM

80 80

[I] = 0 nM [I] = 0 nM
70 70
v normalisée

v normalisée

60 1.5 nM 60 1.5 nM

50 50

40 40

30 3.0 nM 30
3.0 nM

20 20

4.5 nM
10 10
4.5 nM

0 0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

[E] T (nM) [E] T (nM)

Les graphiques de Ackermann-Potter sont basés sur la supposition qu’à l’état

stationnaire, l’équilibre entre E, I et S est suffisamment rapide pour permettre la mesure des
vitesses. Alors, la concentration effective de l’enzyme est simplement décalée lors du « titrage »
d’une portion de sa concentration totale par la liaison forte avec l’inhibiteur.

Notez que le troisième graphique correspond approximativement des valeurs observées

pour l’inhibition de la DHFR par le methotrexate. En fait, la concentration de DHFR dans un
échantillon peut être déterminée par le titrage avec le methotrexate pour produire un complexe
qui est observé par fluorimétrie.

39
IC50 pour inhibition de forte affinité

Dans le cas de forte affinité, la valeur de IC50 dépend de la concentration d’enzyme :

Mode d’inhibition Équation

K
compétitif IC 50 = 12 [E ]T + i [S] + K i
KM
K K
incompétitif IC 50 = 12 [E ]T + K i + i M
[S]
non-compétitif (simple) IC50 = 2 [E]T + K i
1

Notez que les équations sont identiques à celles déterminées pour l’inhibition classique
avec le terme ½ [E] T en plus. La valeur de IC50 est augmentée parce que la concentration
d’inhibiteur requise pour donner 50% d’inhibition est augmentée à cause de la diminution
significative de la concentration d’inhibiteur lors de la formation du complexe E•I.

Tableau sommaire des inhibiteurs réversibles

Relation entre Atteint de l’équilibre

Classe d’inhibiteur Traites caractéristiques
[E] T et [I]T entre E, I et E•I

• IC50 ne dépend pas de [E] T ;

classique [I]T >> [E] T rapide v vs [E] T linéaire
• [P] vs temps linéaire
• IC50 dépend de [E] T ;
« tight-binding » [I]T ≈ [E]T rapide v vs [E] T non-linéaire
• [P] vs temps linéaire
• IC50 dépend de [E] T ;
« slow-binding » [I]T >> [E] T lent v vs [E] T linéaire
• [P] vs temps non-linéaire
• IC50 ne dépend pas de [E] T ;
« slow, tight-
[I]T ≈ [E]T lent v vs [E] T non-linéaire
binding »
• [P] vs temps non-linéaire

40
Inhibition irréversible

Références
Walsh, C. Tetrahedron 1982, 38, 871-909.
Rando, R. Pharmacol. Rev. 1984, 36, 111-142.
Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism, W.H. Freeman, New York, 1985.

Mesures d’efficacité

Pour des inhibiteurs réversibles, on utilise souvent le Ki comme un indice de l’efficacité

de l’inhibition.

Par contre, pour les inhibiteurs irréversibles, on utilise le k inact (et parfois le KI).

Il y a deux types d’inhibiteurs irréversibles :

1) les réactifs du site actif (marquage par affinité)

2) l’inhibition basée sur le mécanisme (substrat « suicide »)

Réactifs du site actif (Marquage par affinité)

Caractéristiques générales
• Les réactifs du site actif démontrent la spécificité envers un groupement fonctionnel des
acides aminés du site actif. Ils peuvent être des analogues de substrat pour favoriser sa
liaison dans les site actif, qui comprennent aussi un groupement réactif (pharmacophore)
– typiquement un électrophile qui réagit avec un nucléophile dans le site actif.
• Ces inhibiteurs possèdent un seul site saturable et réagissent de manière stœchiométrique
(1 mol de I/mol de E).
• L’enzyme est protégée contre cette inhibition par le substrat (ou co-facteur).
• La perte d’activité suit une cinétique de premier ordre, parce que l’enzyme est
consommée comme un réactif pendant la réaction.
• L’inhibition est accompagnée de la modification covalente de l’enzyme :
o L’enzyme demeure inactive après la séparation de l’inhibiteur.
o L’inhibiteur reste lié à la protéine après dialyse ou filtration sur gel (ou sur
membrane) même après la dénaturation de l’enzyme.

41
Exemples de marquage par affinité

TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone)

Le TPCK ressemble les amides et les esters de la phénylalanine, mais le groupement
chlorométhyle effectue une alkylation, par exemple, de la His57 de la chymotrypsine :

O O

Cl
CH2 CH2 Cl

NH NH N N
H
O S O N NH O S O
Enz
Enz

CH3 CH3

Le TPCK réagit aussi avec la Cys25 de la papaïne.

DIFP (diisopropyl phosphofluoridate)

Le DIFP réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de sérine :

O O
O P O O P O
F
F O
HO Enz
H
Enz

PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)

Le PMSF est souvent utilisé pour inhiber des protéases et réagit de manière similaire :

O O
S CH3 S CH3
F
F O
HO Enz
H
Enz

42
Autres exemples

Enzyme Substrat Marqueur par affinité

O O
Triosephosphate isomerase HO OPO3-2 I OPO3-2
H2C CH2 H2C CH2

OH O
Triosephosphate isomerase CH OPO3-2
O CH OPO3-2 H2C CH2
CH CH2

CH2OH O
CH2OH
O OR O OCH2CH CH2
Lysozyme OH OH
RO RO
NHAc NHAc

O
Isoleucyl-tRNA synthetase
Ile-tRNAIle Br H2C C Ile-tRNAIle

43
Marquage par photoaffinité
On peut aussi utiliser des inhibiteurs qui sont stables en absence de lumière qui sont
activés par la photolyse après association avec l’enzyme. Les deux groupements réactifs les plus
utilisés sont :

1) Les groupes diazo qui génèrent des carbènes :

O O
hv
R CH N2 R CH

carbone à six électrons

2) Les azotures qui génèrent des nitrènes :

hv
R N3 R N

azote à six électrons

Les espèces produites par photolyse sont très réactives et réagissent au site de liaison de
l’enzyme. Le groupement nitrène a une demie-vie extrêmement courte et n’a pas besoin de
groupement fonctionnel particulier pour réagir :

Type de réaction Réaction

R N + H C R NH + C
abstraction

insertion R N + H C R NH C

addition R N + R N

condensation R N + R N R N N R

R'
insertion R N + R'2N H R NH N
R'

réarrangement R N produits de réarrangement

44
Analyse cinétique

En général, l’inhibition irréversible de type marquage par affinité figure la liaison rapide
à l’équilibre de l’inhibiteur suivie de la formation lente et irréversible d’un complexe in actif :

k1 kinact
E + I E•I E I
k-1
complexe
k-1 covalent
KI = inactif
k1

La proportion d’enzyme sous forme E•I augmente avec la concentration de I. E•I

s’inactive avec le temps suivant une cinétique du premier ordre (lors de la consommation de
l’enzyme comme un réactif). La valeur de k inact peut être déterminée expérimentalement en
mesurant tout d’abord la perte d’activité en fonction du temps à différentes concentrations
d’inhibiteur :
100
[I] = 0
90

80 constante de vitesse = kobs

70
% activité

60
[I] = 0.2 × KI
50
[I] = 0.5 × KI
40
[I] = K I
30
[I] = 2 × KI
20

10

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temps (min)

La constante de vitesse d’inactivation (k obs) est déterminée pour chaque concentration

d’inhibiteur.
[I] = 0
-0

[I] = 0.2 × KI
-1
ln (activité / activité 0)

[I] = 0.5 × KI

-2
[I] = KI
pente = -kobs

-3
[I] = 2 × KI

-4

-5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temps (min)

45
 L’activité enzymatique qui reste en fonction du temps est proportionnelle à la
concentration totale des formes d’enzyme qui ne sont pas inactivées :
ε = [E] + [E•I]
Or, [E] 0 = [E] + [E•I] + [E-I]

k −1 [ E ][I] [E • I]K I
et KI = = , et [E ] = ,
k 1 [E • I] [I]

[E • I]K I  K  ε
alors ε= + [E • I] = [E • I]1 + I  et [E • I] = .
[I]  [I]   KI 
 1 + 
 [I] 
La vitesse de l’inactivation (c’est-à-dire de la disparition des formes actives de l’enzyme)
est donnée par :
dε
− = k inact [E • I]
dt
ε dε  K I 
− d = k inact dt 1 + −
 = k inactdt
ε  [I] 
alors, et
[E • I]
dε k inact
et − = dt .
ε  KI 
1 + 
 [I] 
En faisant l’intégrale de cette équation entre t = 0 (où ε = [E]T ) et t (où ε = ε) on obtient :
dε
− (ln ε − ln[ E ]T ) = (t - 0 )
ε kinact t k inact
− ∫[ E] = ∫ dt alors
ε  KI  0  KI 
 1 +  1 + 
T

 [I]   [I] 
 ε  k inact
alors − ln   = ⋅t
 [E ]T   1 + K I 

 
 [I] 
d’où on voit que pour la disparition d’activité, la constante de vitesse de la réaction au
premier ordre est :

kinact
k obs = .
 KI 
 1 + 
 [I] 

46
 1 1  K  1
De plus, = +  I 
k obs k inact  k inact  [ I]

1 1  K 
d’où on voit que le graphique de vs donne une ligne droite dont la pente est  I  et
k obs [I]  k inact 
 1 
l’ordonné à l’origine est   :
 k inact 

90

80

70
pente = KI / kinact
60
1/kobs (min)

50

40

30

-1/KI 20

10 1/kinact

0
-1 0 1 2 3 4 5
1/[I]

Le k inact est donc la constante de vitesse maximale d’inaction (lorsque la totalité de

l’enzyme est sous forme E•I) et le KI est la concentration de l’inhibiteur qui donne une moitié de
la vitesse maximale d’inactivation.

Notez aussi que l’inactivation de l’enzyme par une réaction du premier ordre in dique la
formation d’un complexe intermédiaire (E•I), tandis que l’inactivation selon une réaction du
deuxième ordre indiquerait la réaction entre E et I libres en solution.

47
 La protection de l’enzyme par le substrat indique que l’inhibiteur se lie au site actif de
l’enzyme (en compétition avec le substrat) :

100

90

80

70
en présence de substrat
% activité

60

50

40

30

20

10 en absence de substrat

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temps (min)

Cependant, la protection par le substrat n’est que partielle parce que la formation du
complexe covalent E-I est irréversible et celle de E•S est réversible. La présence du substrat
retarde donc la formation de E-I mais ne l’élimine pas complètement.

Finalement, la formation d’un complexe stoechiométrique (1:1) entre E et I montre que la

modification est sélective. Une correspondance entre les cinétiques d’inhibition et le degré
d’incorporation covalente de l’inhibiteur sur l’enzyme (typiquement déterminé par spectrométrie
de masse électro-spray) suggère que la modification covalente est responsable de la perte
d’activité :
100

90
% activité restante après réaction

80

70

60

50

40

30

20

10

0
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
mole de I par mole de E

48
Inhibiteurs basés sur le mécanisme (substrats du type « suicide »)

Ces inhibiteurs sont caractérisés par la nécessité d’une activité catalytique de l’enzyme
pour générer l’espèce réactive. L’inhibiteur fonctionne en partie comme un substrat :

k cat rapide
E + I E•I E•I* E I

3 5
La plupart de ces inhibiteurs ne sont pas de très bons substrats avec des k cat de 10 – 10
fois plus faibles que le substrat naturel. De façon générale, l’étape limitante est au niveau de k cat .

Les caractéristiques de l’inhibition sont les mêmes que celles des réactifs du site actif
(marqueurs par affinité), en incluant notamment la cinétique de saturation et la réaction
d’inactivation du premier ordre. La différence des mécanismes d’inactivation se situe au niveau
de la participation de l’activité catalytique de l’enzyme (k cat ) au processus d’inactivation (le
besoin de transformation enzymatique).

Démonstration de la participation de kcat au mécanisme d’inactivation

Il y a principalement deux critères pour impliquer le mécanisme d’action d’une enzyme
au mécanisme d’inactivation :

1. L’inactivation de l’enzyme est dépendante de la présence de cofacteur ou d’un

deuxième substrat, selon le mécanisme de la réaction normale.

2. D’autres informations mécanistiques de la réaction d’inactivation concordent avec

celles déterminées pour la réaction normale du substrat naturel. Par exemple,
l’observation des effets isotopiques peut signaler que le même mécanisme est suivi
dans les deux cas. Un effet isotopique est causé par la réduction de la vitesse d’une
réaction lors de la substitution d’un lien C-H par un lien C-D. Ceci suggère que le
lien C-H est brisé lors de l’étape limitante de la réaction (le lien C-D étant plus fort
que le lien C-H) et démontre que l’activité de l’enzyme participe à la formation de E-I
(le même parcours réactionnel est suivi dans les deux cas).

49
Exemples de réactions « suicide »

Groupements activés lors de réactions enzymatiques

Classe Structure

acétylène R R

oléfines (alcènes) R CH CH R

substrats contenant des halogènes R X

cyclopropanes
R R

quinones O O

H H CH3
R S

analogues de pénicilline CH3

N
O
COONa

S S
composés thiono (=S) C P
R R R R

50
Inhibition de la déshydrase de thiolester β-hydroxydécanoyle par un analogue acétylène

Voici la réaction normale qui a lieu pendant la synthèse des acides gras :

B
réarrangement
H H H O H H O allylique H O
- H2 O
R C C C C SR' R C C C C SR' R C C C C SR'

H OH H H H H H H
thiolester
B H
trans-α ,β-décènoyle

Dans la réaction suicide avec un analogue acétylène, un résidu histidine est modifié de
manière covalente :

B
H B

H O O O

R C C C C SR' R C C C C SR' R C C C C SR'

H H H H H
B H
acétylène allène N
NH N
N

Enz
Enz
histidine du site actif
H O

R C C C C SR'

H H

N
N

Enz enzyme inactive

H
Notez qu’on observe un effet isotopique sur la cinétique d’inhibition (k inactD = 2)
kinact
lorsque l’inhibiteur acétylène contient un deutérium en position α , ce qui suggère que l’enzyme
reconnaît l’analogue et catalyse la formation du groupement allène réactif.

51
Inhibition de la β-lactamase par des analogues de pénicilline

Enz
Nuc
B
O O O O B H O
H H CH3 H H CH3 H O
S S CH3
H H H S
CH3 CH3 CH3
N O HN O HN
O
CO 2 O CO2 O CO2
OH
Enz Enz Enz piégeage
hydrolyse covalent
sérine du site actif
normale

O O Enz
H H CH3
H S Nuc
O O
H CH3
CH3 H HS
O HN
CH3
O CO2 O HN
OH O CO 2
Enz
Enz enzyme inactive

52
Inhibition des transaminases par un analogue d’acide aminé

Après réaction avec le phosphate de pyridoxale, la vinylglycine peut réagir avec un résidu
nucléophile dans le site actif de l’enzyme :

Enz
Nuc Enz
Nuc

CO2- CO2-

N N

CH CH2
Enz•pyr pyr•Enz
CO2- CO2- pyr•Enz

H
+NH NH
3
CH
pyr•Enz CO2-
CO2-

N
Nuc Nuc NH
Enz CH2 Enz
CH2
pyr•Enz
pyr•Enz

formes inactives

53
Réaction avec inhibiteur irréversible et formation de produit
Dans la plupart des cas où l’inhibition est reliée au mécanisme de la réaction native, une
certaine quantité d’inhibiteur est transformée en produit, sans inactivation de l’enzyme.
Considérons le schéma mécanistique suivant :

k1 k2 k3
E + S E•S E•I E + P
k -1
k4

E I

k3
Le rapport r = (ce qui représente la proportion molaire pour l’inactivation) définit le
k4
nombre de fois que le substrat suicide est transformé en produit analogue pour chaque réaction
menant à l’inactivation. La valeur de r est constante et indépendante de la concentration de
substrat ou d’enzyme puisqu’elle représente le partage d’un intermédiaire commun.

54
Tableau sommaire des modificateurs chimiques

Résidu modifié
Réactif Produit Commentaires
(forme active)
R N C N R
CO2H CONHR • carboxyles sur
+ RNH2 la surface
O O

CO2H • marqueur par

N2CH NH R CO2 CH2 NH R affinité
(diazoamide ou –ester)
O
CO2 CH2 CH R
CO2 • marqueur par
R
OH affinité
(époxyde)
O
O
CO2 X • marqueur par
R CO2
R affinité
(haloacétate)
CH3CO2COCH3
NH2 NHCOCH3 • groupes amino
(anhydride acétique) sur la surface

O
O O
NH2 NHCOCH2CH2CO2 • groupes amino
sur la surface
(anhydride succinique)
R2CO + NaBH4
NH2 NHCHR2 • piégeage des
(sodium borohydride) bases de Schiff

NH2 CH3
NH2 CH3OCCH3 NH C
NH2
(acétimidate de méthyle)
NH2 NH2
NH2 CH3OC HN C
(CH2)n • réticulation des
et (CH2)n
protéines
NH2 CH3OC HN C

NH2 NH2

55
Tableau sommaire des modificateurs chimiques (suite)

Résidu modifié
Réactif Produit Commentaires
(forme active)

NH2 NH dansyle • marqueur

chlorure de dansyle
fluorescent
O O
S
• marqueur
S NEt NEt sélectif des
thiols
O O
O S CH2 CH R
• marqueur par
S
R OH affinité

O O
S • réagit vite même
X S
R R en solution

NO2
C(NO2)4
O • marqueur
(tétranitrométhane) O chromophore

O I3 O • marqueur
radioactif

(I)

O O O
N • relativement
EtO O OEt OEt
N stable au pH
N
H (pyrocarbonate de neutre
diéthyle) N

O • 100 × moins
N O réactif que
N S
N X R
R
H N • marqueur par
affinité

56